DK175663B1 - Fremgangsmåde til opnåelse af beskyttende antigener mod Bordetalla-infektioner og toxiske processer - Google Patents

Description

i DK 175663 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til opnåelse af adenylatcyklasepræparater, som kan anvendes mod Bordetella-infektioner og toxiske processer.

Det er velkendt, at B. pertussis og B. parapertussis begge forårsager kighosteudbrud.

Undersøgelser af de virulensfaktorer, der spiller en fremtrædende rolle i kighostes patogenese, har ført til, at to B. perti/ss/s-hovedprodukter, det filamentøse hemggluti-nin (FHA) og pertussistoxinet (Ptx) betragtes som betydningsfulde determinanter for patogenese og som effektive immunogener.

I et tidligere arbejde (FR 8615968) har nærværende opfindere anvendte antistoffer, der er dannet mod et andet produkt, adenylatcyklasen (AC), der syntetiseres af B. pertussis, til påvisning af dette molekyles rolle som et betydningsfuldt toxin ved det pulmonære cytopatiske syndrom, således som det er påvist ved induktion af en akut ødematøs hæmoragisk alveolitis (AEHA) i mus, og således som potentielt beskyttende antigen.

Nærværende opfindere har nu undersøgt den rolle, som en adenylatcyklase, der fremstilles og frigives of en anden Bordetella-art, spiller i patogenesen og for immuniteten i en forsøgsinfektion i musen.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe adenylatcyklasepræparater, der er anvendelige som beskyttende antigener mod kighoste, under anvendelse of en Bordetella-art, der er forskellig fra B. pertussis.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til opnåelse af adenylatcyklasepræparater, hvor adenylatcyklase (AC)-præparateme omfatter en aktiv adenylatcyklase med en molekylvægt (Mr) på ca. 43 ± 4,3 - 45 ±4,5 kDa, bestemt med hensyn bl ovalbumin som standard, hvilken adenylatcyklase genkendes specifikt af specifikke polyklonale og monoklonale anti-fl. pertussis-AC-antistoffer, og som er i stand til anbgenisk at krydsreagere med B. pertussis-AC, og/eller et inaktivt protein med en molekylvægt Mr på ca. 43 ± 4,3 kDa, hvilket protein genkendes specifikt af polyklonale anti-AC-anbstoffer, der er dannet mod oprenset AC-præparater, og som er fri for adenylatcyklase-calmodulin-aktiverbar aktivitet og for affinitet for calmodulin, hvilket protein er i stand bl at krydsreagere med B. pertussis-ACen, hvilken fremgangsmåde omfatter anvendelse af ~B. parapertussis.

Det skal bemærkes, at udtrykkene "aktivt" eller "inakbvt", som anvendt i nærværende beskrivelse og krav, henviser bl adenylatcyklasens enzymatiske aktivitet.

«

I 2 DK 175663 Bl I

Adenylatcyklasen, som er et cytotoxin, der er ansvarlig for de lokale lungelæsioner, der finder sted I

ved kighoste, er fordelagtigt udstyret med immunogene egenskaber. I

Det inaktive protein er omtalt i den EP-patentansøgning, der er indleveret den samme dag af I

I nærværende ansøgere, og som angår "Immunoprotective antigenic protein against I

pathogenic bacteria" (Immunbeskyttende antigenisk protein mod patogene bakterier). I

I Det inaktive protein genkendes specifikt af polyklonale anti-AC-antistoffer, der er dannet mod I

I oprensede AC-præparater, og er frit for adenylatcyklase-CaM-aktiverbar aktivitet og affinitet for H

CaM. Det er også i stand til at reagere antigenisk med 8. pertussis-AC’en. H

I I

I Et kompleks, der forbinder den aktive adenylatcyklase med det inaktive krydsreaktive protein, I

I kan således opnås fra B. parapertussis eller varianter, der udtrykker proteiner med kryds- I

I reaktivitet. I

I De aktive og de inaktive former kan således isoleres ved sædvanlige oprensningsteknikker. I

I Adenylatcyklase-præparateme kan overraskende opnås fra B. parapertussis, medens det må I

påpeges, at der ikke findes krydsimmunitet mellem 8. pertussis- og B. parapertussis-

infektioner. I

I Dette aspekt af opfindelsen er særdeles interessant, idet 8. parapertussis, som det er I

I velkendt, ikke udtrykker Ptx'et, medens toxinet kunudtrykkes af 8. pertussis. I

I Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til opnåelse af antigeniske adenylat- I

cyklase-præparater, der er fri for de bivirkninger, der er forbundet med Ptx såsom risiko

I for allergisk encephalitis. I

I Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan antigeniske AC-præparater, der er fri for I

Ptx, opnås fra 8. parapertussis hly+-kloner. Klonerne selekteres enten in vitro eller I

isoleres fra lungehomogenater efter challenge og er i stand til at inducere en akut ødematøs I

I hæmoragisk alveolitis. I

I En specifik hly+-klon, der fordelagtigt udtrykker store mængder aktiv AC, blev isoleret fra I

I lunger og består af den 63-2S-klon, der er deponeret under nr. 1-749 hos Collection Nationale de I

I Culture de Microorganismes (CNCM) den 15. april 1988.

. Kultursupernatanterne af 63-2S, der svarer til standardiserede bakterielle suspen-sioner I

I på 109 CFU/ml, har en enzymatisk AC-aktivitet på ca. 20-25 enheder. I

H

3 DK 175663 B1

Hly+-kloner med en lavere spontan-AC-ekspression kan injiceres ad den intranasale vej i mus og reisoleres fra lunger for at øge AC-aktiviteten.

De afledte kloner, der har bibeholdt hly+, AC+-fænotypeekspression, ligger inden for opfindelsens rammer. Fx er klonen 63-2TCS (tryptocasein-soya) opnået fra 63-2S-stammen, der gror pi et ikke-specifikt medium, hvad angår Bordetellae, med samme udbytte og under bevarelse af hly+, AC+-ekspression.

En krydsimmunitet mellem B. pertussis og B. parapertussis blev påvist ved passiv krydsbeskyttelse med anti-8. pertuss/s-adenylatcyklaseantistoffer. Det arbejde, der er ud-ført med adenylatcyklase-præparater opnået ifølge opfindelsen, har vist, at molekylerne er beskyttende antigener.

Adenylatcyklase-præparateme anvendes således fordelagtigt ifølge opfindelsen til fremstilling of vaccinepræparater med det forbehold, at de ikke krydsreagerer med værtsadeny-latcyklasen. Adenylatcyklasepræparaterne omfatter bade aktive og inaktive proteiner eller 1 kun ét af disse proteiner.

Sådanne vacciner, som således er opbygget fra adenylatcyklase-præparater, der er opnået fra B. parapertussis, er molekylærvacciner og er i stand til at forhindre Bor- detella-infektioner og toxiske virkninger hos mennesker og dyr. De sædvanlige doserings- og administrationsformer anvendes fordelagtigt. Vaccinerne er fortrinsvis i form af intranasale, orale eller parenterale præparater.

I vaccinepræparaterne kan adenylatcyklase-præparateme være forbundet med FHA i det samme inoculum eller ikke. FHA Vil derefter blive administreret på det samme tidspunkt som adenylatcyklase-præparatet eller på andre tidspunkter. FHA-præparateme opnås fordelagtigt under anvendelse af den metode, der fx er givet af Sato et al., Infect. Immun, 1983, 41, 313-320 eller Imaizumi et al., Journal of Microbiol. Metods, 2, 334-347 (1984).

Adenylatcyklase-præparateme kan også være forbundet med de oprensede AC-præparater, der er omtalt i FR-8615963, og eventuelt med FHA.

Vaccinepræparateme forhindrer fordelagtigt den infektion, der forårsages af Bordetella såsom B. pertussis, B. parapertussis, B. brochispetica og B. avium.

Ifølge et andet aspekt udformes bakterielle helcellevacciner fra 8. parapertussis. Sådanne vacciner har en beskyttende virkning både mod B. parapertussis og B. pertussis. [ i

J

4 DK 175663 B1 I

Andre karakteristiske egenskaber og fordele ifølge opfindelsen er anført i det følgende eksem-pel I

med henvisning til tegningen, hvor: I

Rgur 1 viser kinetikken for lungeinfektion med B. parapertussiskloner, I

Figur 2 viser immunblots af AC-holdige ekstrakter fra B. parapertussis og B. pertussis med I

polyklonale anti-6. pertuss/s-AC-antistoffer. I

H Materialer og metoder anvendt i eksemplet er som følger: I

a) Bakterielle stammer og dyrkningsbetingelser: I

B. pertussis 18323 (ATCC 9797) og B. parapertussis (CIP63-2) blev udpladet på Bordet I

I Gengou agarmedium, der var tilført hestedefibrineret blod (15% slut) (BG) til selektion af hæmo- I

I lytiske (hly) eller ikke-hæmolytiske kloner, som blev subdyrket i Stainer Scholte-medium. I

I b) Assays for AC og Ptx: I

I Metoder til påvisning af AC og Ptx enten ved enzymatiske eller biologiske aktiviteter eller ved I

I western blot-analyse er blevet beskrevet af White A.A. et al., Methods Enzymol., 38C, 41-46, I

1974 such as modified by Hanoune et al., J. Biol. Chem., 252, 2039-2046,1977. I

I c) Infektion af mus: I

3 uger gamle Swiss OFl-hunmus, der var angivet at være patogenfrie og som vejede 16 g + 1, I

blev tilvejebragt fra ferme expérimentale de Rennemoulin (Institut Pasteur, 78 Villepreux, Fran- I

krig) og holdt i grupper pi 5 i bure, der på toppen var forsynet med filterkapper (Techniplast, I

UAR, Frankrig) på sterilt strøelse og fodret med gammastråle-steriliseret foder (granulés I

R03, UAR, Frankrig) og autoklaveret drikkevand. Musene blev 4 uger gamle inficeret efter kort I

etheranesthesi ved intranasal injektion af standardiseret bakterielt inocula (i et volumen på 50 . I

microliter) fra B. pertussis-stammen Kendrick 18323 (stammetype ATCC 9797) eller B. I

parapertussis CIP 63-2. I

d) Histopatologi: I

Lunger fra inficerede mus blev samlet på udvalgte tidspunkter, fixeret i 10% formaldehyd, ned- I

dykket i paraffin og inddelt i sektioner i rækkefølge før farvning med hematoxilin og eosin eller I

Giemsa til lysmikroskopi-undersøgelse. I

5 DK 175663 B1

Resultater:

Kinetik for lungeinfektion med B. parapertussis - To grupper mus blev inficeret intranasalt med inocula, der var fremstillet enten fra en hly+- klon selekteret på BG (63-2H) eller den hly+-k!on, der er deponeret under nr. 1-749, og som er isoleret fra muselungehomogenat 3. dag efter challenge (63-2S).

Dosiseffekteme af den intranasale infektion er vist i figur 1, som viser variationen af logi0CFU/lunger (kolonidannende enheder) med 63-2H (kurve »...*) og 63-2S (kurve ▲_A) som en funktion af dage. De lodrette stykker er aritmetiske middelværdier for 5 mus.

± SEM.

I Som vist i figur 1 udviste begge inocula omtrent samme virulens (udtrykt som bakterie- vækst/overievelsesgrad), hvorimod klonen 63-2S var signifikant mere patogen end klonen 63-2H. Den intranasale injektion på 103 CFU svarede til LD50% i tilfælde af 63-2S og kun til LD25% i tilfælde af 63-2H.

Histopatologiske resultater

Lungerne fra mus, der var døde 24 timer efter challenge, udviste den typiske AEHA, der observeres med en hly+AC+-klon afledt fra B. pertussis 18323, som omtalt af Brézin C. et al., FEMS Microbiol. Lett. 42, 75-80, 1987.

AC-aktiviteter AC-doseringer i kultursupematanter af 63-2 og 63-2H, der svarer til standardiserede bakterielle suspensioner med 10 CFU/ml, viste, at enzymatiske AC-aktiviteter var på henholdsvis 20-25 enheder og 4-7 enheder.

Krydsimmunitet mellem B. pertussis og B. parapertussis Immunrespons af B. parapertussis-Miærede mus over for AC:

Western blot-analyse af B. parapertussis-urinstofekstrakter med specifikke polyklonale anti-AC-antistoffer blev udført.

DK 175663 B1 I

6 I

H Urinstofekstrakterne blev opnået som følger: I

Bakterielle bundfald blev homogeniseret i buffer A (Tris HC1 25mM, MgCl2 6mM, NP40 I

0,1% pH 8), {1/3; vægt/vægt), og den samme mængde 8M urinstof i buffer A blev tilsat. Me- I

H diet blev omrørt i 40 minutter ved 30°C. Der blev dialyseret i buffer A og efterfølgende I

H centrifugeret (5000 x g) i 30 minutter ved 6°C. Supematanten isoleres og udgør urinstof- I

ekstrakten. I

H De polyklonale anti-AC opnås ved at immunisere dyr med oprensede AC-præparater, der I

er opnået fra B. pertussis, og ved at isolere de antistoffer, der er fremstillet mod I

præparaterne, fra immunsera. I

H Foretrukne AC-præparater til anvendelse ved fremstilling af antistofferne er de oprensede I

AC-præparater, der er omtalt i fransk patentansøgning 86/15963. I

i Sådanne præparater er ejendommelige ved, at de har en høj renhedsgrad og praktisk taget er I

helt fri for kontaminerende bakterielle substanser, især pertussistoxiner, lipopolysaccharid (eller I

LPS) og filamentøs hemagglutinin (eller FHA). AC'en er således tilgængelig i en homogen form, I

idet den sedimenterer med en S-koefficient, der er lig med 3,6, i en sucrosedensitetsgra-dient, I

I hvilken AC Findes i to strukturelt beslægtede molekylærformer på henholdsvis 45 og 43 kDa. I

Ifølge et andet aspekt er AC-præparateme karakteriseret ved, at de har en aktivitet, som kan I

I nå op på eller endog overskride 1600 pmol cAMP min'1 x mg'1. I

I De oprensede AC-præparater kan opnås ved at bringe en forud-koncentreret super- I

I natant af bakteriekulturer, der udtrykker adenylatcyklase, eller en ekstrakt af disse bak- I

I terier i kontakt med calmodulin. I

De monoklonale antistoffer kan opnås ved at fusionere en musemyelomcelle med miltlymfo- I

cytter, der er afledt fra mus, der er immuniseret med oprenset adenylatcyklase. I

De polyklonale antistoffer fremstilles ved fx at immunisere dyr såsom kaniner eller mus ved I

hjælp af de pågældende AC-præparater, i hvilke ACen er fri eller er i form af et kompleks I

med eucaryotiske proteiner, særlig med calmodulin, og ved at isolere det antisera, der I

indehol-der antistofferne og derefter antistofferne selv ved standardmetoder. I

7 DK 175663 B1

Monoklonale antistoffer (8-25) anvendes især. De immunprecipiterer en triplet på 50,45 og 43 kDa såvel som et protein med en molekylvægt, der er højere end 100 kDa, i råekstrakter og præparater af enzymet, der er oprenset fra bakterieceller.

Hybridomcellestammen, der producerer de monoklonale antistoffer, blev deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) med deponeringsnummer 1-610 den 9. oktober 1986.

Resultaterne er angivet i figur 2, hvor baner 1-4 svarer til henholdsvis: 1. S. parapertussis-ekstrakter påvist med anti-S. pertuss/s-AC-antistoffer, 2. Oprenset B. pertussis-AC påvist af serum fra B. parapertussis-inficerede mus, 3. B. parapertussis-ekstrakt påvist med serium fra 6. parpertussis-inficerede mus, 4. B. parapertussis-AC påvist /' B. parapertussis-ekstrakt med anti-S. pertussis-AC-antistoffer.

Western blot-analysen viste nærværelsen af et antigen med en Mr på 43-45 kDa, hvilket antigen krydsreagerede med 8. pertussis-AC en (figur 2).

Derudover viste sammenlignede immunblots af det oprensede B. pertussis-AC med serum fra S. parapertussis mus, som var i bedring, hvilket serium var opsamlet på dag 127 efter intranasa! challenge (figur 1), nærværelsen af anti-S. pertussis-AC-antistoffer.

Beskyttende virkninger af anti-S. pertussis-AC-antistoffer mod den respiratoriske lethale infektion af mus med S. parapertussis a) S. parapertuss/s-inoculum blev præinkuberet med polykionale eller monoklonale anti- S. pertussis-AC-antistoffer. Resultaterne er angivet i tabel 1 nedenfor:

I DK 175663 B1 I

I

I Tabel 1 I

H Normalt Polyklonalt Monoklonalt I

H Antistoffer serum anti-AC anti-AC I

log10-for- I

tynding -1 -1 -2 -3 -1 -2 -3 I

H Antal over I

I levende/total 2/12 8/12 6/12 5/12 11/12 9/12 7/12 I

H Som vist i tabellen inhiberede det B. parapertussis-inoculum, der var inkuberet med poly- I

klonale eller monoklonale anti-B. perfuss/'s-AC-antistoffer, den lethale challenge på en I

dosisafhængig måde. I

Krydsimmunogeniciteten mellem B. parapertussis og B. pertussis blev vist ved kryds- I

I vaccineringseksperimenter som vist i tabel 2., I

I Tabel 2 I

Krydsvaccinering mod B. pertussis eller B. parapertussis I

I Immunogen8 BP AC+ BP A C BPP Kontrol I

I Challenge15 BPAC+Bpp BPAC+bpp BPAC+BPp BP AC+bpp I

I Antal over- 9/12 4/12 7/12 0/12 I

I levende/total 7/12 1/12 9/12 1/12 I

I a Bakteriesuspensioner opvarmet ved 56°C i 20 minutter; to sc-injektioner med 5 dages I

I intervaller på 1,2 x 108 B. pertussis-AC+ (BPAC+), 2,5 x 108 B. pertussis-AC (BPAC) eller I

I 2,2 x 109 B. parapertussis 63-2S (BPP). I

Claims (10)

1. 9 DK 175663 B1 b Intranasal injektion af 5 x 107 CFU of BPAC+ eller 8 x 108 CFU af BPP.
2. 1. Fremgangsmåde til opnåelse af adenylatcyklase-præparater, hvilke adenylatcyklase-AC-præparater omfatter en aktiv adenylatcyklase med en molekylvægt (Mr) på ca. 43±4,3 -45±4,5 kDa, som bestemt med hensyn til ovalbumin som standard, hvilken adenylatcyklase genkendes specifikt af specifikke polyklonale og monoklonale anti-β. pertussis-AC-antistoffer, og hvilken adenylatcyklase er i stand til at kryds-reagere antigenisk med B. pertussis-AC'en, og/eller et inaktivt protein med en molekylvægt Mr på ca. 43±4,3 kDa, hvilket protein genkendes specifikt af polyklonale anti-AC-antistoffer, der er dannet mod oprensede AC-præparater, og som er fri for adenylatcyklase-calmodulin-aktiverbar aktivitet og for affinitet for calmodulin, hvilket protein er i stand til at krydsreagere med B. I pertussis- AC'en, kendetegnet ved, at der anvendes B. parapertussis.
3. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter det yderligere trin at adskille og isolere henholdsvis det inaktive protein og den aktive adenylatcyklase.
4. 3. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst of kravene 1-2, kendetegnet ved, at adenylatcyklase-præparaterne opnås fra hly+-kloner of S. parapertussis, der er i stand til at inducere en akut ødematøs hæmoragisk alveolitis, hvilke kloner især selekteres enten in vitro eller fra lungehomogenat efter challenge. 1
5. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at hly+-klonen er den 63-2S-klon, der er deponeret under nr. 1-749 den 15. april 1988 og afledede kloner, der har bevaret hly+, AC+-fænotypekspression. DK 175663 B1 I I 10 I
6. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, I kendetegnet ved, at kultursupernatanter, der svarer til standardiserede I bakterielle suspensioner ved 109 CFU/ml, har en enzymatisk AC-aktivitet på ca. I 20-25 enheder. I Is . I
7. 6. Fremgangsmåde til fremstilling af vaccinepræparater til at forhindre infektioner, I der forårsages af Bordetella, I kendetegnet ved, at der anvendes adenylatcyklase-præparater, der er I opnået ifølge fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, eventuelt for- I 10 bundet med FHA og/eller oprenset AC i det samme inoculum eller et andet. I
8. 7. Bakteriel helcellevaccine, I kendetegnet ved, at den er fremstillet ud fra B. parapertussis-kloner, I der indeholder adenylatcyklaser ifølge definitionen i krav 1. I I 15 I
9. 8. Hly+-klon af B. parapertussis deponeret under nr. 1-749 hos Collection Nationale I I de Culture de Microorganismes (CNCM), 15. april 1988. I I 20 I
10. 25 I