DK175671B1 - Anvendelse af lysin fra Lactococcus-bakteriofag til ostefremstilling - Google Patents

Description

DK 175671 B1

Bakteriofagen ΦνΜί3, der anvender Streptococcus lactis ML3 som vært, producerer et bakteriofaglysin, der frembringer tydelige "ringe" omkring virale plaquer. Dette lysin er ansvarligt for nedbrydning af cellevæggen og lysis af værtscellerne. Streptococcus lactis er fomylig blevet omdøbt til Lactococcus 5 lactis subsp. lactis.

Bakteriofaglysinet af ΦνΜΙ.3 er blevet delvist oprenset og dets evne til at lysere | andre bakterier end Lactococcus lactis subsp. lactis ML3 er blevet undersøgt tidligere. Det blev fundet, at lysinet lyserede stammer af Lactococcus lactis 10 subsp. lactis og subsp. cremoris, og at det havde en svag virkning på gruppe D streptococcer. Andre testede bakterieslægter blev ikke påvirket (J.D. Oram og B. Reiter (1965), J. Gen. Micorbiol. 40, 57-70, B. Reiter og J.D. Oram (1963), J.

Gen. Microbiol. 32, 29-32).

15 Lysis af oste-fremstillende bakterier med bakteriofager eller på anden måde har tidligere vist sig at være problematisk. Det har nu vist sig, at et i det væsentlige rent lysinenzym faktisk kan anvendes med fordel ved fremstilling af ost.

I et første aspekt tilvejebringer opfindelsen et i det væsentlige rent præparat af 20 ΦνΜί3 lysin eller en variant deraf, der er fri for aktiv bakteriofag.

I et andet aspekt tilvejebringer opfindelsen en formulering omfattende lysinet af en Lactococcus bakteriofag eller en variant af et sådant lysin, der er egnet til tilsætning til oste eller til en osteprækursorblanding. En formulering er egnet til 25 tilsætning til ost eller til en prækursor, hvis den ikke med det samme eller senere gør osten uegnet til fortæring eller forhindrer dannelsen af fortærbar ost ud « fra prækursorblandingen. Formuleringen er fri for levedygtig (aktiv) bakteriofag. Fortrinsvis er bakteriofagen en bakteriofag med prolathoved.

30 I et tredje aspekt tilvejebringer opfindelsen ΦνΜί3^βη eller DNA-kodnings-sekvens for lysin, isoleret fra generne, der normalt ville befinde sig umiddelbart ovenstrøms eller umiddelbart nedenstrøms for dette gen i øvML3, kendetegnet ved, at nævnte gen eller kodningssekvens ligger inden for det omtrentlige 0,84

I DK 175671 B1 I

I

kb fragment af φνΜL3-bakteriofagets genom, som er flankeret af sekvenserne ; I

5'-TTTAAAACAGACTG-GACTTGTTCCGC-3’ og 5’-AGTGAAATAGGAGGAAGTGAA- ; I

TGAG-3', og hvor øvML3-bakteriofaget i overensstemmelse med Budapest- ! I

Traktaten er deponeret i den skotske nationalsamling af industrielle bakterier I

5 og marinebakterier i Aberdeen (National Collections of Industrial and Marine I

I Bacteria, Aberdeen, Scotland, UK) under accessionsnummer 40160, eller en I

variant heraf, som indkoder et lysin, som bibeholder mindst 10% af den bakte- I

I rielle cellevægsnedbrydende aktivitet i nævnte lysin. | I

I 10 I en konservativ variant adskiller DNA-sekvensen sig fra den naturligt fore- I

I ; kommende DNA-sekvens, men koder for samme polypeptidfragment som den I

I naturidentiske sekvens p.g.a. degeneration af den genetiske kode. Andre vari- I

anter omfatter kodningssekvenser, der koder for polypeptider med aminosyre- I

sekvenser, der er lidt forskellige fra lysinets, men bibeholder mindst 10%, for- I

I 15 trinsvis mindst 50%, 90%, 95% eller 99% af lysinets bakteriecellevægnedbry- I

I dende aktivitet. Denne aktivitet kan måles ved at iagttage ændringen af den I

I optiske densitet i en cellesuspension, fx. af Lactococcus lactis subsp. lactis, der I

udsættes for lysinet. Polypeptidvarianteme kan omfatte sådanne, der er lidt I

længere eller kortere end lysinet eller har konservative aminosyresubstitutioner. I

20 For eksempel kan en serin erstatte en threonin og omvendt, og en glutamin kan I

I erstatte en asparagin og omvendt. Generelt påvirker substitutioner, deletioner I

I og additioner ved N-terminalen funktionen i mindre grad end ved C-terminalen. I

I I et fjerde aspekt tilvejebringer opfindelsen en DNA-kodningssekvens som I

I 25 ovenfor beskrevet i et ekspressionsvehikel, der er egnet til transformation af en I

I mikrobiel vært. Ekspressionsvehiklet kan have et kontrolområde for kodnings- I

I sekvensen, idet kontrolområdet omfatter en startkodon ovenstrøms for genet, * I

I og genet befinder sig i en passende læseramme i forhold til startkodonen eller I

I ekspressionsvehiklet, kan sørge for indføjelse af kodningssekvensen i en en- I

I 30 dogent arvelig enhed, således at kodningssekvensen er under kontrol af et så- I

I dant kontrolområde deri. Kontrolområdet kan omfatte det naturlige virale kon- I

I trolområde, et kontrolområde for lactostreptococcer (såsom lactoseoperonen) I

I DK 175671 B1 eller et andet kontrolområde, der, fortrinsvis inducerbart, kontrollerer ekspression af genet i den mikrobielle vært. I E. coli kan der fx. anvendes lac-kontrolelementerne eller kontrolelementerne af arabinose, colicine E1, galactose, alkalisk phosphatase, tryptophan eller lambda-operonerne. I gær (fx. Sac-5 charomyces cerevisiae) kan der anvendes promotorerne for phosphoglyceroki-nase eller for galactose.

I et femte aspekt tilvejebringer opfindelsen en mikrobiel vært, der er transformeret med et sådant ekspressionsvehikel og i stand til at udtrykke lysinkod-10 ningssekvensen. Den mikrobielle vært kan vaere en hvilken som helst mikroorganisme, der har vist sig at være i stand til at udtrykke dette lysingen, og den kan være en bakterie (såsom E. coli eller Bacillus subtilis), en svamp (såsom S. cerevisiae eller Aspergillus nidulans), en plantecelle, en planteprotoplast eller en dyrecelle. Fortrinsvis er værten B. subtilis eller Lactobacillus.

Under forudsætning af at værtens cellevæg ikke selv nedbrydes med lysin, kan den lysin-udskillende, transformerede vært være anvendelig til undertrykkelse af bakteriepopulationer, der er modtagelige over for lysis med lysinet.

20 I et sjette aspekt tilvejebringer opfindelsen et polypeptid stammende fra ekspressionen af lysinkodningssekvensen i en egnet mikrobiel vært, der er transformeret med et sådant ekspressionsvehikel. Opfindelsen angår også klonings-vehikler, der omfatter sådanne kodningssekvenser.

!' 25 I et syvende aspekt tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til i det mind ste delvis isolering af lysingenet fra en bakteriofag med prolathoved ved ud fra dens DNA at fremstille restriktionsfragmentet EcoRV-EcoRI i fig. 7 eller et til-l svarende fragment deraf, fortrinsvis isoleret fra ved siden af beliggende bakte- riofagsekvenser. (EcoRI-restriktionsstedet er faktisk blevet kunstigt skabt ved 30 addition af en EcoRI-linker til et Ajul-sted.) Lysingenet af andre bakteriofager end <t>vML3 kan i almindelighed opnås ved identificering af det bakteriecelle-væg-lyserende proteolytiske enzym deraf, sekvensbestemmelse deraf, fremstilling af en mDNA-probe og isolering af genet, altsammen på kendte måder.

I DK 175671 B1 I

I I

I et ottende aspekt tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling I

af ost, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man lyserer bakteriestarterkulturen I

på et forud fastlagt tidspunkt under fremstillingen af osten ved tilsætning af et I

5 Lactococcus bakteriofaglysin. Egnede starterkulturbakterier omfatter Lactococ- I

cus lactis subsp. lactis og cremoris. Fortrinsvis tilsættes iysinet ved slutningen I

I af mælkefermentationen, således at fermentationens starterceller bliver lyseret I

og de intracellulære enzymer således frigøres. Nogle af disse enzymer kan så I

sørge for udviklingen af ostens modne smag, og således kan fremgangsmåden I

10 ifølge opfindelsen anvendes til fremskyndelse af ostens modning. Lysinet, i det I

mindste i de påkrævede mængder, gør ikke den resulterende ost uegnet til I

I human fortæring og kan let fjernes fra ostefremstillingsbeholderen eller uska- I

I deliggøres før tilsætning af den næste starterkultur. I

I 15 I et niende aspekt tilvejebringer opfindelsen ost, der er fremstillet ved en sådan I

I fremgangsmåde. I

Bakteriofager med prolathoved omfatter følgende bakteriofager af Lactococcus I

lactis: I

20 Bakteriofaa Underart I

c2 lactis c2 I

c6a lactis c6 eller d 0 I

c6B lactis c6 eller c10 I

c6D lactis c6 eller c10 I

25 C10I lactis c10 I

C10w lactis c10 I

drc1 lactis DRC1 'I

643 lactis C8 I 1

I alle de ovenfor beskrevne aspekter af opfindelsen er lysinet fortrinsvis lysinet I

fra bakteriofag (pvML3. Bakteriofagen er velkendt, men for at udelukke enhver I

tvivl er den blevet deponeret hos The National Collection of Industrial and Ma- I

5 ; DK 175671 B1 rine Bacteria, Aberdeen, iht. til Budapest-traktatens bestemmelser. Deponeringsdagen var den 5. juli 1989, og løbenummeret er NCIMB 40160.

Den naturlige vært for ΦνΜΙ_3, nemlig Lactococcus lactis subsp. lactis ML3, 5 blev ligeledes deponeret d. 5. juli 1989 som NCIMB 40161.

Fagmanden vil let være i stand til at bestemme de bedste anvendelsesbetingelser for lysinet, fx. tilsætningstidspunktet for lysinet, mængden, der skal tilsættes, arten af præparatet, der skal tilsættes, osv. Disse betingelser kan varie-10 re alt efter, hvilken type ost der fremstilles. I almindelighed tilsættes lysinet ! imidlertid som et lille volumen, fortrinsvis ikke over 5% eller 1 % af ostekulturens volumen) steril opløsning til opnåelse af en koncentration på mellem 0,01 pg/l » og 1500 mg/l i ostefermentationskulturen, eller lysinet kan indkapsles i kapsler, eksempelvis liposomer (som i Kirby et al. (1987) Int. J. Food Sci. Tech. 22, 15 355-375) og tilsættes ved starten for forsinket afgivelse.

Foretrukne udførelsesformer af opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler og under henvisning til tegningen, hvor 20 fig. 1 (på to ark) er et skema over genkloningstrinnene, der anvendes til isolering af 4>vML3-lysingenet, fig. 2 er et fotografi af vektor g.gt10 plaquer og kloner, der udtrykker lysingenet af bakteriofag ΦνΜ13, 25 fig. 3 er et fotografi af en E. coli stamme, der bærer klonet pFI106, der udtrykker bakteriofag ΦνΜΙ_3 lysin, fig. 4 er et restriktions- og deletionskort over et fragment af bakteriofag ΦνΜΙ_3, 30 der koder for lysingenet,

I DK 175671 B1 I

I 6 I

I fig. 5 er en fluorograf af proteiner, der udtrykkes af pUC13 plasmidvektor DNA, H

I af piasmid pFI106, der udtrykker lysin, og af plasmid pFI115, der ikke udtrykker ; I

I ' lysin, I

fl 5 fig. 6 er et skema, der viser den anvendte DNA-sekvensbestemmelsesstrategi, fl

B og I

B fig. 7 viser hele sekvensen af et 1,2 kb fragment af bakteriofag ΦνΜΙ_3 DNA, I

I der koder for lysingenet, der blev klonet i g.gt10-lysin 4, inklusive DNA- I

I 10 sekvensen og den deraf afledte aminosyresekvens for bakteriofaglysingenet. I

fl EKSEMPEL 1 I

I Kloning af Ivsinaen etc. I

fl 15 Fremstilling af bakteriofag ΦνΜί3 DNA I

fl Højtiter bakteriofag øvML3 lysater fremstilledes ved at inokkulere 500 ml lacto- I

I i se M17 næringssubstrat (Terzagh & Sandine, 1975) med 2% lactose M17 næ- I

I ringssubstratkultur af Lactococcus lactis subsp. lactis ML3, der var blevet dyr- I

fl 20 ket natten over. Den kan frit opnås fra The National Collection of Food Bacte- I

I ria, Shinfield, Reading, Berks., U.K. Kulturen dyrkedes til en O.D. 600 på 1,00 ± I

fl 0,05, og 5 ml 0,05 M calciumborgluconat og 10 ml <J>vML3 bakteriofaglysat med H

I en koncentration på 3,3 x 1010 plaque-dannende enheder pr. ml tilsattes. H

I 4>vML3 kan også frit opnås fra NCFB. inkubation fortsattes, indtil der optrådte H

I 25 komplet lysis og der ikke iagttoges et yderligere fald i den optiske densitet (den H

I optiske densitet faldt til en O.D. 600 på 0,34). Celleaffald fjernedes ved centri- I

I fugering ved 8000 x g i 15 minutter. H

I Bakteriofager koncentreredes ved centrifugering af lysatet ved 125.000 x g i 3

I 30 timer. Supernatanten fjernedes, og bakteriofagpelleten resuspenderedes ved H

I henstand natten over ved 40C i 8 ml puffer med sammensætningen 0,01 M Tris H

I hydrochlorid, 0,1 mM EDTA, 1 mM magnesiumsulfat, pH 8,0. H

7 DK 175671 B1

Bakteriofagsuspensionen centrifugeredes ved 1.600 x g i 5 minutter, og 4 ml af supernatanten aflejredes på en trinvis gradient fremstillet ud fra 2 ml portioner af cæsiumchloridopløsninger i puffer (som ovenfor), med en specifik gravitet på hhv. 1,6,1,5, 1,4 og 1,3. Gradienterne centrifugeredes ved 92.000 x g i 2 timer ! 5 ved 50C i en udsvingbar centrifugerotor. Det resulterende bakeriofagbånd fjer nedes fra gradienten med en lille hypodermisk sprøjte i et volumen på ca. 0,5 ml og blandedes med et lige så stort volumen mættet cæsiumchloridopløsning i puffer (som ovenfor). Blandingen anbragtes på bunden af en ligeledes trinvis gradient og centrifugeredes som før, og igen fjernedes bakteriofagbåndet og 10 anbragtes i et 1,5 ml Eppendorf-rør.

Højtiter-bakteriofagsuspensionen lyseredes til frigørelse af DNA ved at erstatte toppen af Eppendorf-røret, med en dialysemembran, holdt på plads med et stramt gummibånd, og udføre dialyse i 18 timer ved stuetemperatur mod 50% 15 formamid i en puffer med sammensætningen 0,1 M Tris hydrochlorid, 0,01 M EDTA, pH 8,5. Formamid fjernedes ved dialyse i 24 timer ved 40C over for en puffer med sammensætningen 0,1 M Tris hydrochlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,5.

Det resulterende bakteriofag-DNA rensedes ved cæsiumchlorid-ethidium-bromid ligevægtsdensitetscentrifugering i 60 timer ved 125.000 x g. DNA-20 båndet synliggjordes under ultraviolet lys og fjernedes med en lille hypodermisk sprøjte. Ethidiumbromid ekstraheredes med cæsiumchloridmættet isoamylal-kohol, og cæsiumchlorid fjernedes ved dialyse i 24 timer ved 40C over for en puffer med sammensætningen 0,1 M Tris hydrochlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,5.

25 Kloning af bakteriofaq ΦνΜΙ.3 Ivsinqenet

Bakteriofag ΦνΜΙ_3 DNA’et var et 23,3 kb molekyle med 3 genkendelsessteder for restriktionsendonuklease EcoRI. Et restriktionskort over bakteriofagen er vist i fig. 1. Bakteriofag ΦνΜΙ_3 DNA blev delvist nedbrudt med restriktionsen-30 donuklease Ajul i en reaktionspuffer til fremstilling af vilkårlige stumpendede DNA-fragmenter. Disse fragmenter adskiltes ved elektroforese ved 40C i agarose med lavt smeltepunkt (Sigma), og området med adskilte DNA-holdige fragmenter i størrelsesintervallet 0,5 til 4,0 kb blev udskåret fra gelen. Agarose- Η

I DK 175671 B1 I

I I

I blokken blandedes med 5 vol. puffer med sammensætningen 20 mM Tris hy- I

I drochlorid, 1 mM EDTA, pH 8,0, og smeltedes ved opvarmning til 650C i 5 mi- I

I nutter. Ved stuetemperatur ekstraheredes DNA'et og agaroseopløsningen sue- I

I cessivt med lige store volumener af phenol, phenol-chloroform og chloroform, I

I 5 og DNA'et fjernedes ved ethanoludfældning og resuspension i TE-puffer. 8 bp I

I phosphorylerede linkere med DNA-sekvensen 5'-GGAATTCC-3' (Pharmacia), I

I der omfatter genkendelsesstedet for restriktionsendonuklease ECORI, ligere- I

I des til de rensede stumpendede fragmenter af bakteriofag ΦνΜΙ_3 DNA. Lige- . I

I ringen udførtes natten over ved 150C i en reaktionsblanding bestående af I

I 10 stumpendede <1>vML3 DNA fragmenter, linker DNA og 5 enheder DNA- I

ligaseenzym (Boehringer Mannheim) i 50 pi puffer med sammensætningen 70 I

I mM Tris hydrochlorid, 7 mM magnesiumchlorid, 0,07 mM ATP, pH 7,5. Reakti- I

I onen standsedes ved inkubation i 10 minutter ved 650C, og linkerne blev trim- ' I

I met ved nedbrydning ved 370C i 2 timer med restriktionsendonuklease EcoRI i I

I 15 100 μΙ puffer med sammensætningen 100 mM Tris hydrochlorid, 50 mM natri- I

umchlorid, 10 mM magnesiumchlorid, pH 7,5. Reaktionen standsedes ved I

phenolekstraktion, og fragmenterne af bakteriofag <t>vML3 rensedes ved kro- I

I matografi over en NENSORB 20 kolonne (DuPont). I

I 20 Rensede, EcoRI-nedbrudte og dephosphorylerede DNA-arme af bakteriofag I

lambda-vektor g.gt10 indkøbtes hos Northumbria Biologicals Ltd. og ligeredes I

I med rene DNA-fragmenter af 4>vML3 DNA ved inkubation natten over ved 40C I

I med 1 enhed DNA-ligase pr. 10 μΙ i en reaktionspuffer indeholdende 50 mM I

Tris hydrochlorid, 7 mM magnesiumchlorid, 1 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, pH

25 8. Ligeret DNA pakkedes in vitro i lambda-bakteriofag under anvendelse af rå I

celleekstrakter fremstillet som beskrevet af Scalenghe et al. (1981) og Hohn I

I (1979). Nedfrosne/optøede lysater (FTL) fremstilledes ud fra E. coli stamme I

I BHB2688, og soniske ekstrakter fremstilledes ud fra E. coli stamme BHB 2690. I

I In vitro pakningsreaktionen udførtes ved sekventiel tilsætning af 350 μΙ puffer I

I 30 med sammensætningen 20 mM Tris hydrochlorid, 3 mM magnesiumchlorid, I

I 0,05% (l-mercaptoethanol, 1 μΜ EDTA, pH 8,0; 50 μΙ ligeret DNA; 50 μΙ puffer I

I bestående åf 30 mM spermine-trihydrochlorid, pH 7,0, 30 mM putrescine- I

I dihydrochlorid, pH 7,0,18 mM magnesiumchlorid, 15 mM ATP, 1,2% β- I

DK 175671 B1 ! 9 mercaptoethanol; 175 pi sonisk ekstrakt (SE); 250 μΙ nedfrosset/optøet ekstrakt (FTL). Blandingen inkuberedes i 90 minutter ved stuetemperatur, og 11,5 ml lambda-puffer med sammensætningen 6 mM Tris hydrochlorid, 10 mM magne-siumchlorid, 100 mM natriumchlorid, 0,5 mg/ml gelatine, pH 8,0, tilsattes sam-5 men med i50 μΙ chloroform. Bakteriofag lambda-suspensionen udpletteredes på E. coli værtsstammen C600 hfl under anvendelse af NZY agarplader. Lambda-' plaquer, der udtrykte bakteriofag <t>vML3 lysingenet, påvistes ved overlejring med en suspension af Lactococcus lactis subsp. cremoris NCDO 1196 celler i 0,1 M kaliumphosphatpuffer, pH 6,7, med 0,7% agarose. Plader inkuberedes 10 ved 300C i 6 timer, og kloner, der udtrykte bakteriofag ΦνΜΙ_3 lysin, frembragte et klaringsområde over lambda-plaquen som vist i fig. 2. En samling på 50 kloner, der hver især udtrykte lysin, oprensedes ved enkelt-plaque isolering og gemtes.

15 I fig. 2 vises plaquer af g.gt10 med vilkårligt klonede fragmenter af bakteriofag ΦνΜΙ_3 DNA. Plaquerne overlejres med Lactococcus lactis subsp. cremoris celler. Lambda-kloner, der udtrykker et klonet lysingen (forsynet med pil), har frembragt et klart vindue i denne plet og fremtræder mørke, hvorimod andre lambda-plaquer bibeholder et uklart udseende.

20

Karakterisering af bakteriofag ΦνΜ13 Ivsinqen

En bakteriofag lambda-klon, der udtrykker bakteriofag ΦνΜί3 lysingenet (g.gtl 0-lysin 4), blev karakteriseret mere detaljeret. Bakteriofag lambda-lysat 25 fremstilledes i stor målestok, og DNA ekstraheredes som beskrevet ovenfor for bakteriofag ΦνΜί3. Nedbrydning med restriktionsendonuklease EcoRI afslørede tilstedeværelsen af et 1,2 kb DNA-fragment fra bakteriofag ΦνΜί3, der var blevet klonet i EcoRI-stedet af lambda-vektor 2.gt 10.

30 Dette fragment re-klonedes i EcoRI-stedet af E. coli plasmid vektor pUC13.

Både vektor DNA og g.gtl 0-lysin 4 DNA blev nedbrudt med restriktionsendonuklease EcoRI under anvendelse af en puffer med sammensætningen 100 mM Tris hydrochlorid, 50 mM natriumchlorid, 10 mM magnesiumchlorid, pH

'^Η

DK 175671 B1 I

| 7,5. Reaktionen standsedes ved phenolekstraktion, og en blanding af de spal- ι I

tede DNA'er inkuberedes natten over ved 15°C med 1 enhed DNA-ligase i en I

reaktionspuffer med sammensætningen 50 mM Tris hydrochlorid, 7 mM mag-

nesiumchlorid, 1 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, pH 8. Ligeret DNA transforme- I

5 redes i kompetente celler af E. coli stamme TBI, og ampicillin-resistente koloni- I

er udvalgtes på B-agar indeholdende IPTG og "Bluogal" (BRL). Vektorer med

klonet DNA identificeredes ved deres hvide farve. Deres evne til at producere I

bakteriofag d>vML3-lysin testedes ved overlejring af kolonier med en suspensi- I

on af Lactococcus lactis subsp. cremoris NCDO 1196 celler i 0,1 M kalium- I

10 phosphatpuffer, pH 6,7, med 0,7% agarose. Der påvistes klarede zoner, som I

vist i fig. 3, for én isoleret klon. (I fig. 3 overlejres kolonier af Escherichia coli, I

der bærer plasmid pF1106, med Lactococcus lactis subsp. cremoris celler. I

Ekspression af lysin giver en klar lysinzone i den uklare plet af Lactococcus I

celler). Plasmidet fra denne klon, betegnet pFI106, isoleredes og analyseredes I

15 ved restriktionsendonukleasekortlægning. Det havde den i fig. 4 viste struktur. I

I fig. 4 bekræftes det uafhængigt fremstillede restriktionskort af data stammen- I

de fra DNA-sekvensen. (RI: EcoRI, M: Mlul, RV: EcoRV. Hil: Haell, Mb: Mboll, I

D: Pral. H: Hindi. Dd: Ddel. Hill: Haelll. B: Banl. C: Cfol. N: Narl. T: Tagl). De I

20 nøjagtige beliggenheder af lysingenet og ORF1 bliver udledt af sekvensanaly- I

sen. Den brudte linie for ORF1 viser dens mulige udstrækning ovenstrøms for I

methioninrester påvist ved sekvensanalyse. I deletionsanalysen vises områder I

med DNA bevaret i sub-kloner med fuldt optrukne linier. Tilstedeværelse eller I

fravær af lysinaktivitet i disse konstruktioner er vist med + eller -. I

25 I

1,2 kb fragmentet af bakteriofag <J>vML3 DNA, der udtrykte lysinaktivitet, re- I

klonedes under anvendelse af den ovenfor for vektor pUC13 beskrevne strate- I

gi, men i Streptococcus lactis vektorerne pCK1, pCK536 og pTG262. Kloner I

udvalgtes iht. deres resistens over for chloramphenicol og påvistes ved deres I

30 evne til at producere lysin, når de overlejredes med Lactococcus lactis subsp. I

cremoris NCDO 1196 celler som beskrevet ovenfor. Eksempler på klonkon- I

struktioner bestående af Streptococculs lactis vektorer, der er i stand til at ud- I

trykke lysingenet af bakteriofag OvML3, er vist i fig. 1. I

11 DK 175671 B1

Ud fra pFI106 fremstilledes en række deleterede derivater af det klonede 1,2 kb fragment af bakteriofag <t>vML3 DNA under anvendelse af restriktionsendonu-kleasenedbrydning og enten re-ligation eller re-kloning i en anden vektor. Kon-5 struktionsdetaljerne og strukturerne af disse derivater er vist i fig. 4. Alle derivater testedes for deres evne til at fremstille bakteriofag ΦνΜΙ_3 lysin, og resultaterne er også vist i fig. 4. Ud fra resultaterne var det muligt at definere området af bakteriofag ΦνΜΙ.3, der koder for lysingenet. Det befinder sig mellem koordinat 0,37 (Pral-sted) og koordinat 1,2 (EcoRI-sted) på restriktionsendonu-10 kleasekortet i fig. 4. DNA-området mellem koordinat 0,565 (Hincll-sted) og koordinat 0,71 (Hincll-sted) er essentielt for ekspressionen af lysin, og dette område er deleteret i plasmidderivatet pFI115 som vist i fig. 4.

Proteinerne, der kodes for af plasmid pFI106, der udtrykker bakteriofag ΦνΜΙ_3 15 lysinet, og derivatplasmidet pFI115, der ikke udtrykker lysin, sammenlignedes under anvendelse af in vitro transkriptions- og translationsteknikken. Radioaktivt mærket 35S L-methionin inkorporeredes i proteiner, der udtryktes af disse plasmid DNA'er, under anvendelse af reagenser fra et kommercielt tilgængeligt sæt og de deri anviste metoder (Amersham). Radiomærkede proteiner, der 20 blev udtrykt, adskiltes ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og påvistes ved fluorografi. Som vist i fig. 5 udtrykte plasmid pFI106 et protein på 23 kd, der hverken blev udtrykt af vektoren pUC13 eller af det deleterede derivatplasmid pFI115. Lysinenzymet af bakteriofag ΦνΜΙ_3 er blevet påvist at være et protein på 23 kd.

25 I fig. 5 består fluorografen af radioaktivt mærkede proteiner, udtrykt af plasmid-vektorer og kloner under in vitro transkription/translaton og adskilt ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Der er vist 35S-mærkede proteiner udtrykt med pAT 153 kontrol-DNA (spor A), intet DNA (spor B), pUC19 vektor DNA (spor C), 30 pFI106 DNA, der udtrykker klonet lysin (spor D), og pFT 115 DNA, hvori en del af lysingenet er deleteret (spor E). Proteinmolekylvægtstandarder mærket med 14C er vist på venstre side.

Η

I DK 175671 B1 I

I I

H Som vist i fig. 6 blev 1,2 kb EcoRI-fragmentet, der indeholder ΦνΜΙ_3- I

lysingenet, og derivatfragmenter klonet i M13mp18. Klonerne anvendtes som | I

kilde for DNA-templater til DNA-sekvensbestemmelse ved Sanger dideoxy- ! I

I kædetermineringsmetoden. De bestemte DNA-sekvenser er vist ved pilenes ' I

5 retning og udstrækning. Sekvenser, der er vist ved pile med kasser, blev primet I

I med syntetiske oligonukleotider udformet på grundlag af allerede bestemte se- I

I kvensdata. Disse syntetiske primere er også vist i fig. 6. I

Udover sekvenser bestemt ved initiering ud fra M13 DNA under anvendelse af I

I 10 kommercielt tilgængelige M13 primere blev et antal syntetiske primere frem- I

I stillet ud fra ΦνΜΙ_3 DNA sekvenser, der allerede var blevet bestemt. De er li- I

I geledes vist i fig. 7. Den komplette DNA-sekvens for begge strenge af 1,2 kb I

I DNA-fragmentet af bakteriofag ΦνΜ1_3 bestemtes. Den er vist i fig. 7. Sekven- I

I : sen analyseredes under anvendelse af Stadens "Analseq"-program, der afslø- I

I 15 rede en åben læseramme, der stemte overens med beliggenheden af lysinge- I

I net som fastslået ved deletionskortlægning og lysinekspressionsbestemmelse

I (fig. 4) og med molekylvægten af lysinenzymet bestemt ved in vitro transkripti- I

I on og translation of plasmiderne pFI106 og pFI115. DNA-sekvensen for lysin- I

I genet af bakteriofag ΦνΜΙ_3 og den deraf udledte aminosyresekvens er vist i I

I , 20 fig. 7. I

I I fig. 7 vises restriktionsendonukleasesteder, der anvendes til opbygning af I

M13mp18 kloner til sekvensbestemmelse. Fuldt optrukne linier viser de ved I

sekvensbestemmelsesstrategien anvendte syntetiske primere (fig. 4). Primerne

I 25 1 og 3 var som vist, hvorimod primerne 2,4 og 5 var den komplementære se- I

I . kvens. Det strukturelle lysingen befinder sig mellem position 593 og 1153. Dets I

I aminosyresekvens og sekvensen af ORF1 er vist. For ORF1 er methioninrester I

I inden for rammen indrammet. Den mulige Streptococcus lactis promotor (posi- I

I tion 550 til 580) og ribosombindingsstedet (position 585) for lysingenet er også I

I 30 indrammet.

13 DK 175671 B1 EKSEMPEL 2

Model for ostefremstillingsprocessen ,

Startercellelvsis med klonet bakteriofaqlvsin 5

En E. coli stamme, der bærer plasmid pFI106, dyrkedes til stationær fase i L-næringssubstrat og vaskedes og resuspenderedes i 1/10 volumen puffer bestående af 0,1 M kaliumphosphat, pH 6,7. Celler blev sprængt med 4 ultrasoniske stød på hver 30 sekunder under anvendelse af en MSE-ultrasonikator.

10 Celleaffald fjernedes ved centrifugering i 30 minutter ved 40C og 20.000 x g.

Supematanten anvendtes som et råt lysinpræparat. En negativ kontrolprøve fremstilledes på samme måde ud fra en E. coli stamme med plasmid pFI115, der ikke udtrykker bakteriofag <t>vML3-lysin. Celler af underarten cremoris sus-15 penderet i puffer bestående af 0,1 M kaliumphosphat, pH 6,7, lyseredes hurtigt af det rå lysinpræparat: med lysin faldt Οϋβοο fra 1,2 til 0,19 på 7 minutter, hvorimod OD6oo uden lysin kun faldt til ca. 1,19. En ostestarterstamme af underarten cremoris dyrkedes i mælk i 6 timer i et forsøg, dér dannede model for en mælkefermentation. Råt lysinpræparat, et lignende præparat fra den negati-20 ve kontrolprøve og puffer sattes til tre separate portioner fermenteret mælk og opbevaredes ved 40C. Antallet af levedygtige celler af underarten cremoris kontrolleredes, og som vist i tabel 1 jagttoges p.g.a. lysis et hurtigt tab af levedygtige celler i mælkefemnentationen, der var blevet behandlet med råt lysinpræparat, men ikke i den negative kontrolprøve eller i pufferen.

DK 175671 B1 I

Tabel 1 I

6 timers mælkefermentation under anvendelse af Lactococcus lactis subsp. H

cremoris NCDO 1196 starter H

5 (oprindeligt antal levedygtige celler 3,45 x 109) H

Antallet af levedygtige celler % levedygtighed H

24 timer 48 timer 72 timer 24h 48h 72h I

10 Ingen tilsætning 2,9x109 2,8x109 1,6x109 81 81 46 I

Ekstrakt af lysin- H

producerende klon 1,5x106 1,5x106 1,3x105 0,04 0,01 0,04 I

Ekstrakt af lysin- H

negativ kontrol-

15 prøve 3,0x109 3,3x109 1,5x109 87 96 44 I

EKSEMPEL 3 I

Fremstilling af Ivsinpræparat til ostefremstillina I

20 I

En bakteriekultur, der udtrykker bakteriofaglysinet (fx. E. coli, der bærer plas- H

mid pF1106), dyrkes natten over i næringssubstrat. En kultur (400 ml) centrifu- H

geres, og cellerne resuspenderes i 1/10 volumen TE-puffer. Lysin frigøres fra H

cellerne, fx. ved tilsætning af chloroform og centrifugering. Den lysinrige super- H

25 natant præcipiteres med 45% ammoniumsulfat, og pelleted resuspenderes i 3 I

ml 0,1 m kaliumphosphatpuffer, pH 6,7, og ledes gennem en PD10-kolonne til I

afsaltning af prøven. Yderligere rensning udførtes ved F.P.L.C. under anven- H

delse af en anionbytterkolonne og en Sepharose, 6 gelfiltreringskolonne. I

15 DK 175671 B1 EKSEMPEL 4

Anvendelse af bakteriofaqtvsin ved fremstilling af cheddarost

Der følges en konventionel fremstillingsproces for cheddarost. Efter omrøring 5 og saltning tilsættes et præparat af klonet bakteriofaglysin. Det inkorporerede lysin sikrer en hurtig lysis af starterkulturen og fremskynder ostens modning ved frigørelse af en smagsdannende blanding af starterenzymer.

Alternativt indkapsles lysinet, således at tidspunktet for dets tilsætning ikke er 10 af betydning. Indkapslingsmidlet opløses efter afslutning af ostefremstillingsprocessen, således at det ikke påvirker starterbakterierne, før deres rolle ved syrningen er udspillet.

Referencer 15 B. Hohn (1979), Methods in Enzymology (ed., R. Wu), bind 68, 299-309, F. Scalenghe, E. Turco, J.E. Edstrom, V. Pirrotta og M. Melli (1981), Chromo-soma 32, 205-216, B.K. Terzaghi og N.E. Sandine (1975), Applied Microbiology 29, 807-813.

20

Nøgle til fig. 1A og 1B

Fig. 1 A: A er et restriktionskort over <bvML3, der, ved pil 1, er delvist Alul-nedbrudt. Stumpended fragmenter på 0,5^4,0 kb isoleres, ligeres med EcoR1-25 linkeré og trimmes ved nedbrydning med EcoR1. B er et kort over vektor lambda.gt 10, hvor pil 2 repræsenterer EcoR1-nedbrydning og dephosphoryle-ring deraf til lambda.gt 10 arme. Ved pil 3 bliver produktet ligeret, pakket in vitro i lambda-fag og udpletteret på E. coli C6000 hfl" for påvisning af lysinprodukti-on. I trin 4 kombineres produkterne af trin 1 og 3 til dannelse af en lysin-30 producerende klon lambda gt.10-lysin 4, vist ved C. Denne nedbrydes (5) med EcoR1 og ligeres (6) med EcoR1-nedbrudt og dephosphoryleret vektor pUC13, vist ved D. Produktet transformeres i E. coli TB1 under anvendelse af agar med ampicillin, IPTG og Bluogal. Hvide, lysin-producerende kolonier udvælges.

I DK 175671 B1 I

I I

I Fig. 1B: Klon pFI106 (E) nedbrydes med EcoR1 og ligeres (7) med EcoRI- I

I nedbrudt Streptococcus lactis vektor pCK536 (vist ved F) og (8) med EcoR1- I

H nedbrudt vektor pCK1 (ved G). E. coli 1106 transformeres med produkterne af I

5 trin 7 og 8, chloramphenicol-resistente kolonier udvælges, og der opnås to am- I

picillin-følsomme lysin-producerende kloner, pFI136 (vist ved H) og pFI137 (vist I

I ved I). I

Claims (15)

17 DK 175671 B1

1. Formulering omfattende lysinet af en Lactococcus bakteriofag eller en variant af et sådant lysin, som bibeholder mindst 10% af omtalte lysins 5 bakteriecellevæg-nedbrydendé aktivitet, hvilken formulering er egnet til tilsætning til ost eller til en osteprækursorblanding og er fri for bakteriofagen i aktiv j form. !

2. Formulering ifølge krav 1, hvori bakteriofagen er en bakteriofag med 10 prolathoved.

3. Formulering ifølge krav 1 eller 2, hvori bakteriofagen er ΦνΜΙ_3. ;

4. Formulering ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, der er ind-15 kapslet i kapsler, der under en ostefremstillingsproces frigiver deres indhold på et forudbestemt tidspunkt.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af ost, kendetegnet ved, at starterkulturen lyseres med lysin fra en Lactococcus bakteriofag eller en variant af et 20 sådant lysin, der er fri for bakteriofagen i aktiv form.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor bakteriofagen er en bakteriofag med prolathoved fortrinsvis <J>vML3.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor bakteriofagen er <J>vML3.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5-7, hvor lysinet tilsættes ved slutningen af mælkefermentationen.

9. Ost fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 5-8. I DK 175671 B1 I I I

10. Præparat af <J>vML3-lysinet, kendetegnet ved, at det i det væsentli- . I I ge er rent og er frit for aktiv <PvML3-bakteriofag, og hvor øvML3-bakteriofagen i I I overensstemmelse med Biidapest-Traktaten er deponeret i den skotske natio- I I nalsamling af industrielle bakterier og marinebakterier i Aberdeen (National I I 5 Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland, UK) under I I accessionsnummer 40160. I 11. øvML3-gen eller DNA-kodningssékvens for lysin, isoleret fra gener- I I ne, der normalt ville befinde sig umiddelbart ovenstrøms eller umiddelbart ne- I I 10 denstrøms for dette gen i <t>vML3, kendetegnet ved, at nævnte gen eller kod- I I ningssekvens ligger inden for det omtrentlige 0,84 kb fragment af ΦνΜΙ_3- I I bakteriofagens genom, som er flankeret af sekvenserne 5-TTTAAAACAGACTG- I I GACTTGTTCCGC-3* og 5-GAAGTGAAATAGGAGGAAGTGAATGAG-3', og hvor I I (pvML3-bakteriofaget i overensstemmelse med Budapest-Traktaten er depone- I I 15 ret i den skotske nationalsamling af industrielle bakterier og marinebakterier i . I Aberdeen (National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, I I Scotland, UK) under accessionsnummer 40160, eller en variant heraf, som ind- . I I koder et lysin, der bibeholder mindst 10% af den bakterielle cellevægsnedbry- I I : dende aktivitet i nævnte lysin. I 1 20 I

12. DNA-kodningssekvens, omfattende DNA-kodningssekvensen i fig. 7 I I eller varianter deraf, som indkoder <pvML3 lysin eller en variant af cpvML3- I I lysinet, som indkoder et lysin, der bibeholder mindst 10% af den bakterielle I cellevægsnedbrydende aktivitet i nævnte lysin. I I I

13. DNA-konstruktion omfattende en kodningssekvens ifølge krav 11 I I eller 12 i et ekspressionsvehikel, der er egnet til transformation af en mikrobiel I vært. I I 30 14. DNA-konstruktion ifølge krav 13, hvor ekspressionsvehiklet omfatter I I et ekspressionskontrolområde for kodningssekvensen omfattende det naturlige I bakteriofagkontrolområde eller et Streptococcus lactis kontrolområde. I 19 DK 175671 B1

15. Mikrobiel vært, der er transformeret med en konstruktion ifølge krav 13 eller 14, og som er i stand til at udtrykke lysinkodningssekvensen.

16. Lysin stammende fra dyrkningen af en vært ifølge krav 15. 5 i i j