DK176007B1 - Farmaceutisk præparat indeholdende deoxyribonucleosider til sårheling - Google Patents

Description

i DK 176007 B1

Opfindelsens område

Opfindelsen angår alment anvendelsen af hidtil ukendte forbindelser indeholdende 2’-deoxyribonucleosider og 2’-deoxyribonucleotider samt 5 anvendelsen af disse forbindelser i farmaceutiske bærestoffer til fremme af sårheling. Mere specifikt angår opfindelsen hidtil ukendte forbindelser indeholdende to eller flere af 2'-deoxyadenosin, 2'-deoxyguanosin, 2'-deoxycytidin og 2'-deoxythymidin og/eller de dertil svarende nucleotider samt anvendelsen deraf, lokalt eller topisk i tilblanding med 10 bærestofforbindelser for at forøge tilførslen af de aktive forbindelser til i ί dyrevæv og derved understøtte cellulære metaboliske funktioner. Mere i specifikt angår opfindelsen anvendelsen af blandinger af disse forbindelser i ! bærestoffer til at befordre og fremskynde heling af sår, kirurgiske snit, læsioner eller sår i mavetarmkanalen, brandsår forårsaget af varme, ultraviolet lys eller 15 kemiske midler, samt overfladiske vævsbeskadigelser forårsaget af infektioner.

Opfindelsens baggrund i 20 Heling af sår eller beslægtede former for vævsbeskadigelse afhænger generelt af celleproliferering og dannelse af nyt binde-, endothel- og epithelvæv. Et stof, der stimulerer eller fremskynder de cellulære processer i forbundet med sårheling, ville være af stor værdi inden for lægepraksis og kunne bruges til at forbedre eller fremskynde heling af mange typer af sår eller 25 læsioner, herunder kirurgiske snit, brandsår forårsaget af varme, kemiske stoffer eller bestråling, hudafskrabninger, flænger, amputeringer, iskæmiske sår eller liggesår, læsioner eller sår i mund, mave eller tarm, donorsteder ved hudtransplantation samt læsioner af cornea. Sådanne stoffer kan også være vigtige ved, at de forbedrer accept af hud- eller corneatransplantationer, samt i 30 ved at fremme heling af beskadiget brusk eller knogle.

Stoffer, der fremskynder eller forbedrer sårheling, ville være særligt værdifulde under fysiologiske betingelser med nedsat sårheling, såsom hos diabetespatienter eller hos personer, der gennemgår cancerkemoterapi (f.eks.

35 med adriamycin eller cyclophosphamid) eller corticosteroidbehandling, eller ! i 2 DK 176007 B1 hos patienter, der enten terapeutisk eller ved et ulykkestilfælde har været udsat for ioniserende stråling.

Der er rapporteret om adskillige stoffer, som har en gunstig indvirkning på de 5 cellulære processer involveret i sårheling, f.eks. polypeptidvækstfaktorer, allantoin, vitamin A (og derivater), zink, exogent DNA og aloe vera-præparater.

Disse forbindelser virker gennem forskellige dårligt definerede mekanismer og udviser varierende grader af effektivitet ved særlige anvendelser.

10 Deoxyribonucleinsyre (DNA) er blevet anvendt til at fremskynde cicatrixdannelse eller heling af sår. Dumont, Ann. Surg. 150:799 (1959) omtaler, at exogent DNA påført eksperimentelle sår i kaninører fremskyndede væksten af granulationsvæv i sårene. En blanding af DNA plus deoxyribonuclease (det enzym, der primært er ansvarligt for DNA-nedbrydning) var 15 mere effektivt til fremskyndelse af fibroplasi end både DNA og deoxyribonuclease alene. Den samlede mængde granulationsvæv dannet efter behandling med DNA var ikke større end i ubehandlede kontroller; begyndelsen af og hastigheden af dets vækst var imidlertid signifikant fremskyndet. Forfatterne foreslår, at lavpolymere DNA-fragmenter er de 20 egentlige aktive stoffer.

Nicolau og Badanoiu, Der Hautarzt, 17:512 (1966) behandlede eksperimentelle hudsår på rotters ryg dagligt med intralæsionsinjektion af en 1% DNA-opløsning i fysiologisk saltopløsning. Sårene behandlet med lokal 25 injektion af DNA blev cicatrixeret inden for 4-8 døgn, mens dem, der kun var behandlet med saltopløsning blev cicatrixeret efter 10-15 døgn. En 2% DNA-opløsning injiceret i sårene på lignende måde forårsagede vævsnekrose.

v

Marshak og Walker, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58:62 (1945) påførte DNA til 30 eksperimentelle hudsår hos rotter og fandt signifikant fremskyndelse af væksten af granulationsvæv i såret i sammenligning med ubehandlede kontroller. Skønt granulationsvævet fremkom tidligere i behandlede sår, var den endelige mængde granulationsvæv ikke større end i ubehandlede sår.

i i i ! 3 DK 176007 B1

Ranson (US patentskrift nr. 4 560 678) beskriver et topisk præparat indeholdende DNA og allantoin, som blev anvendt til behandling af ulcus af venøs oprindelse på benet. Flecchia (FR patentskrift nr. 2 556 727) beskriver et præparat indeholdende DNA og bakteriocide kvatemære 5 ammoniumforbindelser til behandling af sår. US patentskrift nr. 4 657 896 beskriver anvendelsen af DNA til behandling af symptomer på ulcer i fordøjelseskanalen, især ved parenteral administrering. Selv om lokal administrering af DNA kan være effektiv til fremme af sårheling, er der adskillige væsentlige uheldige forhold ved anvendelsen af DNA som sådan i 10 farmaceutiske præparater, der kan være begrænsende for dets kliniske anvendelighed eller accept. Da DNA er ekstraheret fra dyrevæv, indeholder det andre biologiske materialer, f.eks. histoner eller andre proteiner, som kan være antigene. Det er svært at fjerne disse andre biologiske materialer, og som følge heraf indeholder kommerciel DNA af høj renhed typisk 0,5% protein.

15 Hertil kommer, at DNA fra naturlige kilder måske ikke er ensartet fra portion til portion. DNA kan også have uønsket biologisk aktivitet ud over sin rolle som et sårhelende middel. For eksempel inducerer dobbeltstrengede nucleinsyrer dannelse af interferon, måske gennem interaktion med udefinerede steder på overfladen af fibroblaster eller lymfocyter. Sådanne virkninger er måske ikke 20 gavnlige og kan endog være skadelige for sårheling eller andre biologiske processer.

DNA indeholder også phosphat (ækvimolært med nucleosidindholdet), og topisk påføring på sår kan føre til høje lokale phosphatkoncentrationer, 25 efterhånden som DNA metaboliseres. Dette kan være skadeligt for sårhelings-processen og kan være årsag til den vævsnekrose, der sås efter administrering af 2% DNA i undersøgelserne udført af Nicolau et al. Endelig kan exogen DNA indbygges i cellulær DNA og derved indføre exogene funktionelle gener i celler. Dette er helt klart uønsket, især hvis den indførte 30 DNA-sekvens er fra et virus eller oncogen.

UK patentansøgning nr. 2 152 814A indleveret af Ogoshi svarende til US patent nr. 4 758 533 angår præparater til ernæringssupplement, som indeholder mindst to nucleinsyreforbindelser valgt blandt: (a) nucleinsyrebaser, 35 (b) nucleosider og (c) nucleotider eller salte deraf. Præparaterne, som kan 4 DK 176007 B1 f administreres parenteralt eller enteralt, siges at være i stand til at fremme den effektive udnyttelse af aminosyrer i kroppen og sikre tilfredsstillende ernæringskontrol og opretholdelse af nitrogenbalance.

5 Japansk patentskrift nr. 60 028 929 beskriver anvendelsen af peroralt administreret deoxyguanosin til forebyggelse af dannelsen af stress-inducerede mavesår hos rotter. Der angives ikke nogen data angående virkningen (dersom der var nogen) af deoxyguanosin på heling af mavesår.

10 US patentskrift nr. 4 208 406 tilhørende Lapinet beskriver anvendelse af cyclisk S’.S’-adenosinmonophosphat (cyclisk AMP) som et topisk antiinflammatorisk og helende middel.

Mens strategien, der anvender indgivelse af helende midler blandt andet 15 indeholdende DNA til sår med henblik på at fremskynde sårheling, er erkendt, så består der stadig et behov for mere effektive præparater til heling af sår, brandsår og andre læsioner, som ikke forårsager uønskede bivirkninger.

Opfindelsens formål 20

Opfindelsens primære formål er at angive hidtil ukendte forbindelser og farmaceutiske produkter, som på effektiv vis kan befordre hurtigere heling af sår, ulcus, brandsår og andre læsionstyper.

25 Et yderligere formål med opfindelsen er at angive en gruppe af effektive sårhelende midler, som er non-antigene og ikke bærer genetisk information.

Endnu et formål med opfindelsen er at angive en gruppe af effektive sårhelende midler, som er billige, ensartede og stabile.

30

Endnu et formål med opfindelsen er at angive sårhelende midler, som på effektiv vis kan administreres lokalt, som ikke har nogen uønskede toxiske virkninger, og som kan administreres til dyr og mennesker til på effektiv vis at fremme heling af sår, ulcus, brandsår og andre læsionstyper.

35 5 DK 176007 B1

Et yderligere og beslægtet formål med opfindelsen er at angive effektive sårhelende midler, som i en række indgivelsesvehikler kan påføres lokalt eller topisk.

5 Sammenfatning af opfindelsen I store træk forekommer opfindelsen som blandinger af 2-deoxy-ribonucleosider i bestemte forhold, der er opløst eller suspenderet i passende farmaceutiske bærere. Medens påføring af enkelte 2'-deoxyribonucleosider 10 alene på eksperimentelle sår er fundet at frembringe lille eller ingen fremskynding af sårheling, er specifikke blandinger af to eller flere forskellige 2'-deoxyribonucleosider fundet at fremskynde heling af eksperimentelle sår.

Hver specifik blanding frembringer et karakteristisk helingsrespons.

15 Navnlig har man fundet, at kombinationen af 2’-deoxyribonucleosiderne 2’-deoxycytidin og 2'-deoxyguanosin frembringer en betydelig forbedring i helingshastigheden af eksperimentelle sår sammenlignet med kontroller og andre dobbeltkombinationer. Præparaterne kan indeholde (a) en større mængde 2’-deoxycytidin og en effektiv mængde af 2’-deoxyguanosin eller (b) 20 en større mængde 2-deoxyguanosin og en effektiv mængde 2-deoxycytidin.

Det er ønskeligt, at det binære præparat indeholder 10-90% (efter mol) 2-deoxycytidin og 90-10% 2'-deoxyguanosin. Foretrukne præparater indeholder 25-75% af de to bestanddele.

25 Tre-komponentkombinationer af 2-deoxycytidin, 2-deoxyguanosin og 2-deoxyadenosin, såvel som tre-komponentkombinationer af 2'-deoxycytidin, 2-deoxyguanosin og 2’-deoxythymidin frembringer også betydelig forøgelse i helingshastigheden af eksperimentelle sår sammenlignet med kontroller og andre tre-kombinationer. Fire-komponentkombinationer af 2'-deoxycytidin, 30 2-deoxyguanosin, 2'-deoxyadenosin og 2'-deoxythymidin er de mest effektive til forbedring af helingshastigheden af eksperimentelle sår.

Tre- og fire-komponentpraeparateme indeholder effektive mængder af 2'-deoxycytidin og 2-deoxyguanosin, typisk 50% eller derover af de binære 35 blandinger som beskrevet ovenfor.

6 DK 176007 B1

Blandingerne af 2-deoxyribonucleosider, fortrinsvis i farmaceutiske bærere, fremskynder sårhelingshastigheden ved at tilføre 2’-deoxyribonucleosider til områder med beskadiget væv. Præparaterne ifølge opfindelsen kan indgives i 5 kombination med enhver af en række konventionelle farmaceutiske bærere, salver, geler, pastaer, suppositorier, sprays eller udskylningsopløsninger, eller de kan være inkorporeret i bærere, herunder liposomer, polymerer eller bionedbrydelige polymerer med henblik på gradvis frigivelse eller i imprægnerede bandager, suturer og lignende materialer.

10

Præparaterne ifølge opfindelsen kan anvendes til at fremme heling af enhver sårtype, herunder snitsår, kirurgiske snit, afskrabninger, brandsår og lignende, som kan behandles ved administrering af et præparat til lokal, især topisk, anvendelse, eller ved påføring af ethvert andet materiale, som kan indeholde 15 og frigive en mængde af den passende blanding af 2’-deoxyribonucleosider.

Kort beskrivelse af tegningen

Opfindelsen, såvel som andre formål, egenskaber og fordele derved, vil 20 fremgå mere klart ud fra den efterfølgende detaljerede beskrivelse, når denne læses med henvisning til tegningen, hvori: 1

Figur 1 viser skalaværdierne for fire sårhelende parametre, grad af angiogenese (A), makrofagdensitet (M), fibroblastdensitet (F) og 25 epithelial dækning (E), i kontrolrotter og rotter behandlet med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin i én uge. Alle rotter var forbehandlet med dexa-methason for at forsinke sårheling. Skalaværdierne er: 0=fraværende, 1=minimal, 2=mild, 3=moderat og 4=udtalt. * i 30 indikerer statistisk signifikant forskel sammenlignet med kontrol værdier i denne og alle efterfølgende figurer.

Figur 2 viser skalaværdierne for tre tegn på inflammation, nekrose (N), densitet af polymorfonukleære lymfocyter (P) og fibrinholdigt ekssu-35 dat (FE), i kontrolrotter og rotter behandlet med kombinationen af i 7 DK 176007 B1 deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin i én uge. Alle rotter var forbehandlet med dexamethason for at forsinke sårheling. Skalaværdierne er: 0=fraværende, 1=minimal, 2=mild, 3=moderat og 4=udtalt.

5

Figur 3 viser den procentdel af det oprindelige sårområde hos rotter, som er dækket af nyt epithel 5 og 7 døgn efter starten af behandling med vehikel alene (kontrol) og med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin.

10

Figur 4 viser længden af det nye epithel hos rotter, der vokser ind fra sårkanterne (i histologisk tværsnit) 5 og 7 døgn efter starten af behandling med vehikel alene (kontrol) og med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin.

15

Figur 5 viser dybden af granulationsvævet hos rotter (i histologisk tværsnit) i sårene 5 og 7 døgn efter starten af behandling med vehikel alene (kontrol) og med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin.

20

Figur6 viser arealet af mavesåret (det areal af mavesåret, der forbliver ikke-epithelialiseret) hos kontrolrotter og rotter behandlet med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin 10, 20 og 30 døgn efter behandlingens start.

25

Figur 7 viser arealet af mavesåret hos kontrolrotter og rotter behandlet med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin efter 10 og 16 døgns behandling.

30 Figur 8 viser arealet af mavesåret hos kontrolrotter, rotter behandlet med cimetidin (Cim), rotter behandlet med kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin (N) samt rotter behandlet med både cimetidin og deoxyribonucleosideme (N-Cim) 14 døgn efter behandlingen begyndte. * indikerer statistisk 35 signifikante forskelle sammenlignet med kontrolværdier, mens ** 8 DK 176007 B1 indikerer statistisk signifikante forskelle sammenlignet med Cim- og N-behandlede værdier.

Figur 9 viser arealet af mavesåret hos kontrol rotter, rotter behandlet med 5 kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin (N) og rotter behandlet med deoxyguanosin alene (dG).

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen 10

Mens andre sårhelende materialer kan indeholdes i præparaterne ifølge opfindelsen, består det aktive sårhelende middel i det væsentlige af de binære blandinger af 2’-deoxycytidin og 2-deoxyguanosin.

15 2,-Deoxyribonucleosiderne kan forefindes i deres frie form eller i form af de tilsvarende nucleotider, d.v.s. et 3’-, 5'- eller 3',5'-phosphatesterderivat. Alternativt kan deoxyribonucleosiderne forefindes som substituerede derivater af enten den frie form eller nucleotidformen. De substituerede derivater af 2’-deoxycytidin og 2-deoxyguanosin omfatter forbindelser, hvori én eller beg-20 ge hydroxylgrupper i deoxyribosedelen, den exocycliske amin på purinringen af 2'-deoxyguanosin eller den exocycliske amin på pyrimidinringen af 2'-deoxycytidin er substitueret med et radikal valgt blandt biokompatible acyl-radikaler indeholdende 2-20 carbonatomer. Hvor der er mere end én substituent, kan substituenteme være ens eller forskellige. De aktive 25 bestanddele kan også forefindes som farmaceutisk acceptable salte af 2’-deoxyribonucleosider eller derivater deraf. I denne sammenhæng er de substituerede derivater efter påføring på væv fortrinsvis enzymatisk konverteret tilbage til nucleosider. Derivaterne kan således tjene som et vehikel for forlænget indgivelse af nucleosider i væv, eller de kan besidde 30 andre fordele i farmaceutiske præparater.

De effektive binære blandinger beskrevet ovenfor kan indeholdes i præparater indeholdende materiale tilpasset til fremme af sårheling, som indeholder en farmaceutisk acceptabel bærer og, om ønsket, andre sårhelende midler.

35 Typisk er bæreren tilpasset til lokal eller topisk administrering.

i 9 DK 176007 B1 j ' De beskrevne binære blandinger kan kombineres med 2'-deoxyadenosin, 2-deoxythymidin eller blandinger af 2’-deoxyadenosin og 2'-deoxythymidin.

Der opnås gode resultater med sårhelingspræparater indeholdende materiale, 5 der omfatter en effektiv mængde af den binære blanding af 2'-deoxycytidin og 2'-deoxyguanosin som beskrevet, og yderligere enten 2'-deoxyadenosin eller 2’-deoxythymidin eller begge to. Det er ønskeligt, at den binære blanding af 2’-deoxycytidin og 2-deoxyguanosin forefindes i mindst 50 mol-% af det samlede præparat, og 2'-deoxycytidinen og 2-deoxyguanosinen forefindes i 10 denne binære blanding i 25-75% deraf.

De substituerede derivater af 2'-deoxyadenosin omfatter forbindelser, hvori én eller begge hydroxylgrupper i deoxyribosedelen og/eller den exocycliske amin på purinringen deraf er substitueret med et radikal valgt blandt biokompatible 15 acylradikaler indeholdende 2-20 carbonatomer. Hvor der er mere end én substituent, kan substituenteme være ens eller forskellige.

De substituerede derivater af 2-deoxythymidin omfatter forbindelser, hvori én eller begge hydroxylgrupper i deoxyribosedelen er substitueret med én eller 20 flere biokompatible acylradikaler indeholdende 2-20 carbonatomer, som kan være ens eller forskellige.

De aktive bestanddele kan også foreligge i form af farmaceutisk acceptable salte.

25 Sårhelende præparater indeholdende den binære blanding og henholdsvis 2'-deoxyadenosin eller 2'-deoxythymidin kan med fordel fremstilles under anvendelse af farmaceutisk acceptable bærere tilpasset til lokal eller topisk administrering.

30

De bedste resultater opnås med kvatemære blandinger indeholdende en effektiv mængde, fortrinsvis mindst 50 mol-% af det samlede præparat, af en blanding af 10-90 mol-% 2'-deoxycytidin og 90-10 mol-% 2’-deoxyguanosin I

samt 2'-deoxyadenosin og 2'-deoxythymidin. 2'-Deoxyribonucleosideme, som 35 i de binære og temære blandinger beskrevet ovenfor, kan være til stede i form i 10 DK 176007 B1 af deres farmaceutisk acceptable salte. Det er ønskeligt, at den binære blanding af 2-deoxycytidin og 2-deoxyguanosin indeholder mindst 25 mol-% af hver af disse to bestanddele.

5 Blandingerne af aktive bestanddele kan fremstilles ved at blande individuelle bestanddele, der forefindes på fri form, i form af nucleotider eller som derivater, eller de kan fremstilles ved hydrolyse af DNA uden at adskille de indgående nucleosid- eller nucleotidbestanddele.

10 Det, at man har fundet, at deoxyribonucleosider er effektive til fremme af sårheling, åbner for adskillige vigtige muligheder for administrering af disse midler. I den efterfølgende diskussion skal deoxyribonucleosider for nemheds skyld forstås som omfattende den frie form, nucleotidformen, substituerede derivater samt blandinger deraf.

15

En foretrukken fremgangsmåde er at administrere disse forbindelser lokalt eller topisk i geler, salver, opløsninger, imprægnerede bandager, liposomer, bionedbrydelige mikrokapsler eller kunstig hud indeholdende de naturlige nucleosider. Ulig DNA indeholder deoxyribonucleosider ingen genetisk 20 informtion og er ikke antigene. De er også kemisk stabile og kan let oprenses og inkorporeres i en række præparater. DNA derimod er labil og nedbrydes let til oligonucleotidfragmenter med tilfældige molekylmasser og er som følge heraf uegnet til inkorporering i farmaceutiske præparater, der kræver standarder for ensartethed og stabilitet.

25

Præparater eller doseringsformer til topisk anvendelse kan omfatte opløsninger, lotioner, salver, cremer, geler, suppositorier, sprays, aerosoler, suspensioner, pudder, imprægnerede bandager og forbindinger, liposomer, .bionedbrydelige polymerer og kunstig hud. Typiske farmaceutiske bærere, der 30 indgår i de foregående præparater, omfatter alginater, carboxymethylcellulose, methylcellulose, agarose, pektiner, gelatiner, kollagen, planteolier, mineralolier, stearinsyre, stearylalkohol, vaseline, polyethylenglycol, polysorbat, polylactat, polyglycolat, polyanhydrider, phospholipider og polyvinylpyrrolidon.

35 11 DK 176007 B1

Koncentrationerne af deoxyribonucleosider i farmaceutisk acceptable bærere kan variere fra 0,1 til 20%. Den i et særligt præparat eller til en særlig anvendelse anvendte dosis fastlægges ud fra behovet ved den særlige type vævslæsion samt ud fra krav påtvunget af bærematerialernes egenskaber og 5 kapaciteter. Til en sololie kan tilsættes 0,1-5 vægt-% af de ovennævnte bestanddele.

De ovenfor beskrevne præparater kan kombineres eller bruges sammen eller i koordination med et antibiotisk, antifungalt eller antiviralt stof eller stoffer, der 10 fremskynder helingen af sår eller andet infektionsbeskadiget væv samtidigt, eller i koordination med behandlingen af den til grund liggende infektion. Yderligere kan 2'-deoxyribonucleosiderne ifølge opfindelsen kombineres med eller anvendes samtidigt eller i koordination med andre vævshelingsfremmende stoffer, såsom epidermal vækstfaktor, 15 fibroblast-vækstfaktor, blodpladeafledt vækstfaktor, transformerende vækstfaktor a, transformerende vækstfaktor β samt insulinlignende vækstfaktor 1 (Brunt, J.V. og Tilansner, A., Biotechnology 6:25-30 (1988)) til fremme af hurtigere heling af beskadiget væv.

20 Det er også nyttigt at administrere 2’-deoxyribonucleosideme ifølge opfindelsen samtidigt med topiske corticosteroid- og antiinflammatoriske midler for at fremskynde helingen af læsioner hos patienter, der lider af allergiske eller inflammatoriske reaktioner, da steroider er kendt for at forsinke sårheling.

25

Præparaterne ifølge opfindelsen er især nyttige ved tilstande, hvor normal sårheling er svækket. Eksempler på sårtyper, der heler dårligt eller langsomt, omfatter venøs stase ulcus, liggesår samt sår eller ulcus i hud og fordøjelseskanal, eller ulcus hos patienter med diabetes, og patienter, der har 30 været udsat for bestråling, cancerkemoterapi (f.eks. med adriamycin eller cyclophosamid) og topiske eller systemiske antiinflammatoriske glucocorticosteroider.

De efterfølgende forbindelser kan også være nyttige til kombinering eller 35 koordination med 2'-deoxyribonucleosideme ved sårbehandling. Disse 12 DK 176007 B1 forbindelser kan anvendes parallelt med eller i serie med 2-deoxy-ribonucleosiderne. De omfatter, men er ikke begrænset til: allantoin, retinonsyre, aloe vera, glycin, A-vitamin, B-vitamineme, især nicotinamid, C-og E-vitaminer, antibakterielle midler (f.eks. kvaternære 5 ammoniumforbindelser, bacitracin, neomycin og polymyxin), kulsukkerrodpræparater, blodplader og/eller blodpladeekstrakter, ribonucleosider, kollagen, prolin, lysin, elastin, fibronectin, glycosaminglycaner, spermidin (og andre polyaminer), angiogene faktorer, zink, saccharose og forskellige peptid-vækstfaktorer, såsom somatomedinerne, lamin, EGF, 10 IGFerne, PDGF, FGF, EDGF, TGF, CDGF, MDGF og NGF. Præparaterne ifølge opfindelsen kan også anvendes sammen med syntetisk hud ved behandling af brandsår og andre sår samt til understøttende medvirken ved heling af hud- eller comeatransplanter.

15 Til behandling af mave- eller duodenale sår kan 2'-deoxyribonucleosiderne ifølge opfindelsen administreres sammen med andre midler mod mavesår. Sådanne midler omfatter, men er ikke begrænset til, cimetidin, ranitidin, omeprazol, sukralfat (et ulcusadhærende kompleks), misoprostil (et cytoprotektivt prostaglandin) eller antacida.

20

Præparatet bestående af 2'-deoxyribonucleosid og bærer kan formuleres som en del af en sololie, der kan påføres før eller efter udsættelse for sollys. Sololien kan også omfatte ét eller flere sollysblokerende stoffer, såsom PABA, PABA-estere og andre ikke-PABA kemiske solfiltre. Præparater til behandling 25 eller udbedring af aldersbetingede skader kan påføres lokalt i form af en hudlotion.

Deoxyribonucleosider inkorporeret i en passende ophthalmisk salve, opløsning eller indlæg kan også anvendes til behandling af hornhindelæsioner 30 eller -ulcus opstået ved kemisk beskadigelse, operation, skader, forbrændinger eller infektion. Sådanne præparater kan også anvendes til at forbedre helingen mellem transplanterede hornhinder og recipientsteder.

13 DK 176007 B1

Deoxyribonucteosidpræparater kan inkorporeres i rumudfyldende kirurgiske implanteringer eller knoglematriximplanteringer for at fremskynde eller forbedre indvæksten af granulations- eller bindevæv.

5 Lægelige eller veterinære indikationer for anvendelsen af opfindelsen omfatter, men er ikke begrænset til, de efterfølgende tilfælde. Præparaterne kan anvendes til at fremskynde helingen af mekanisk opståede sår eller afskrabninger af hud eller andet væv, som ved mekanisk beskadigelse af kroppens hud eller den gastrointestinale slimhinde er blevet blotlagt.

10 Opfindelsen kan anvendes til at fremskynde helingen af brandsår bibragt huden og ethvert underliggende væv, som kan være blotlagt ved en sådan beskadigelse. Brandsår kan forårsages af varme, ioniserende stråling, ultraviolet stråling herunder sollys, elektricitet eller kemiske stoffer.

15 Endvidere kan præparaterne anvendes til at fremskynde heling af kirurgiske snit ethvert ydre eller indre sted på kroppen, i hvilke kan indføres en opløsning eller andet bærestofpræparat indeholdende deoxyribonucleosiderne ifølge opfindelsen. Præparaterne kan anvendes til at fremskynde heling af iskæmiske ulcus, tryksår, liggesår eller ulcus forårsaget af diabetes eller andre 20 sygdomsprocesser. De kan også anvendes til behandling af slimhindelæsioner eller -ulcus (f.eks. i munden, maven eller tarmene). Dette kan indebære inkorporering af deoxyribonucleosiderne i en passende slimagtig eller kolloidal dispersion eller lindrende base, som kan administreres peroralt, hvorved opnås lokal indgivelse af nucleosiderne til de ønskede steder i 25 fordøjelseskanalen.

Til fremme af heling af hudsår, herunder kirurgiske snit, er det bedst af tilføre forbindelserne ifølge opfindelsen lokalt, enten som en salve eller i en sårforbinding. Der kan samtidigt administreres et topisk antibiotisk eller antiviralt 30 middel. Den molære ækvivalent af 0,1 - 20 mg af en blanding af deoxyribonucleosider ifølge opfindelsen bør påføres pr. cm2 sårareal, eller 0,1 -10 mg pr. cm lineært snit.

De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen nærmere, men skal ikke 35 opfattes som begrænsende.

14 DK 176007 B1

Eksempel 1

Otteogfyrre F344 hanrotter med en vægt på ca. 150 g blev ved i.p. injektion 5 bedøvet med en forbindelse indeholdende ketamin (100 mg/kg) og xylazin (13 mg/kg). Ryggen på hver rotte blev barberet, og man lavede et dorsalt lumbalt cirkulært snitsår (fuld dybde) med en diameter på 8 mm til blotlæggelse af den underliggende overfladiske skeletmuskulatur. En 8 mm agarose (1%) skive, som indeholdt én eller en kombination af de fire vigtigste 10 2'-deoxyribonucleosider, eller forblev blank (kontrol), blev anbragt i hvert sår. Koncentrationen af hvert nucleosid var 30 mg/ml fysiologisk saltopløsning.

Sårene blev derpå dækket med en forbinding af flydende plastic.

Efter to døgn blev såret afdækket, agaroseskiven fjernet, såret fotograferet og 15 helingsgraden bedømt. En alginatgel (2%) indeholdende samme nucleosid eller kombination af nucleosider blev derpå påført hvert sår og sårene igen dækket med en flydende plastic. På fjerdedagen efter læsion blev sårene igen afdækket, alginatgelen fjernet og sårenes helingsgrad bedømt. Der blev brugt tre dyr i hver af 16 grupper. Hver gruppe fik enten en, to, tre eller alle fire af 20 2'-deoxyribonucleosideme deoxythymidin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxyadenosin i alle de mulige kombinationer.

15 DK 176007 B1 TABEL 1 Sårhelinqsskala: 0 = intet bindevæv i sårområdet.

5 1 = under 50% af såret dækket af bindevæv.

2 = 50-100% af såret dækket af bindevæv.

3 = sårområdet helt dækket af bindevæv.

4 = hele såret udfyldt af bindevæv, helt opakt.

10 Bedømmelse

Behandling Dag 2 Dag 4 1 Kontrol 0 2,33 2 dA 0 3,00 3 dC 0 0 15 4 dG 0 2,00 5 dT 0 0 6 dT,dC 0 2,00 7 dG.dA 1,50 2,50 8 dT.dA 0,33 1,66 20 9 dT.dG 0,66 1,80 10 dC.dG 3,33 3,33 11 dC.dA 0,66 2,50 12 dC,dG.dA 2,00 3,66 13 dT,dG.dA 0,33 2,66 25 14 dT,dC.dG 3,00 3,00 15 dT,dC.dA 0,66 2,50 16 dA,dC,dG,dT 4,00 4,00

Ud af de seks forskellige kombinationer af to 2‘-deoxyribonucleosider er kun 30 kombinationen af dC og dG mere effektiv til at fremme udvikling af bindevæv efter 48 og 96 timer i sammenligning med kontrollerne. Ud af de fire forskellige kombinationer af tre 2’-deoxyribonucleosider var kun kombinationerne indeholdende dC og dG (dC,dG.dA og dC.dG,dT) mere effektive til at fremme sårheling end kontrollerne efter 48 og 96 timer. Ingen af de individuelle 35 2'-deoxyribonucleosider eller kombinationer af to eller tre i ! DK 176007 B1 j j 16 2'-deoxyribonucleosider var så effektive til at fremme udviklingen af bindevæv eller granulationsvæv, som det var tilfældet for kombinationen af alle fire af de vigtigste 2’-deoxyribonucleosider efter 48 eller 96 timer.

5 Eksempel 2

Der blev udført en undersøgelse for at sammenligne de helende virkninger af de fire vigtigste deoxyribonucleosider (dA, dC, dG og dT) med de tilsvarende monophosphat-deoxyribonucleotider.

10

Otte F344 hanrotter med en vægt på ca. 200 g hver blev bedøvet med en forbindelse indeholdende ketamin (100 mg/kg) og xylazin (13 mg/kg) og deres rygge barberet. Man lavede standard 8 mm sår af fuld dybde på ryggen af hver rotte. En agaroseskive, der enten indeholdt alle fire 2’-deoxyribonucleosider 15 (dA, dC, dG og dT) (n=3) eller alle fire tilsvarende deoxyribonucleotider (dAMP, dCMP, dGMP og dTMP) i en koncentration på 30 mg/ml fysiologisk saltopløsning (n=4) eller en blank agaroseskive (n=2) blev placeret i hvert sår. Alle sår blev derpå dækket med methacrylat. På dag 2 efter læsion blev hvert sår behandlet med en alginatgel indeholdende enten nucleosider, nucleotider eller 20 ikke noget. Sårene blev afdækket, undersøgt og bedømt for helingsgrad på dagene 2 og 4. På dag 4 blev endvidere den hud, der omgiver såret, samt selve sårområdet fjernet og anbragt i 10% formalin med henblik på histologisk undersøgelse.

25 Resultat efter 2 døgn

Begge kontroller fik bedømmelsen 0. Alle de nucleosidbehandlede sår fik bedømmelsen 3+ (fuldstændig dækket og opakt i nogle områder). Alle fire sår behandlet med nucleotiderne fik også bedømmelsen 3+. Alle de behandlede 30 sår var ret svære at skelne fra hinanden efter 48 timer.

Resultater efter 4 døgn

Begge kontroller fik bedømmelsen 2-3 (fuldstændig dækket, men vævet var 35 meget tyndt og skrøbeligt). De nucleosidbehandlede sår fik bedømmelsen 3+ 17 DK 176007 B1 og 4. Alle fire nucleotidbehandlede sår fik bedømmelsen 2-3. De kunne ikke skelnes fra kontroller. De synes ikke at være såveludviklede som på dag 2.

Bindevævet, der dækkede disse sår, var bemærkelsesværdigt tyndere og mindre holdbart end det bindevæv, der dækkede de nucleosidbehandlede sår.

5

Eksempel 3

Akut toxicitetstest af deoxvribonucleosidblandina 10 En blanding af ækvimolære mængder af deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytidin og deoxythymidin blev suspenderet i vand og ved oral intubation administreret til grupper af F344 hanrotter med en vægt på 200 g. Under observationsperioden på en uge efter administreringen observeredes der , ingen tegn på toxicitet eller død ved nogen af doserne, herunder 10 g/kg, som 15 var den højeste afprøvede dosis. Følgelig er 50% letaldosis (LD50) vist at være højere end 10 g/kg.

Eksempel 4 20 Glucocorticosteroider, som er almindeligt anvendt i den kliniske terapi, er kendt for at forsinke den sårhelende proces hos mennesker og dyr. Corticosteroidbehandling er også en standardmodel for svækket sårheling.

Formålet med dette forsøg var at teste virkningsgraden og sikkerheden ved kombinationen af de fire vigtigste deoxyribonucleosider ved overvindelse af 25 steroidinduceret forringelse af heling af dermale ulcus.

Fjorten F344 hanrotter med en vægt på ca. 200 g hver (8 uger gamle) blev behandlet med dexamethason (5 mg/kg i.p.). Fireogtyve timer senere blev der lavet et standard 8 mm cirkulært midtlinje snitsår i det dorsale halsområde. 50 30 pi af en kombination af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin (0,025/ml af hver) i et hydrogelvehikel eller vehiklet alene blev påført sårene på operationsdagen og derefter én gang hvert andet døgn.

Sårene blev dækket med en flydende plasticforbinding som beskrevet af Marshak [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58:63-65 (1945)]. Efter makroskopisk 35 undersøgelse og fotografering blev sårene og de omgivende væv indsamlet 7 18 DK 176007 B1 dage efter læsion med henblik på mikroskopisk og histopatologisk evaluering. Vævssnit og evaluering blev udført af Pathology Associates Inc., Frederick, MD.

5 Resultaterne er vist i fig. 1 og 2. En semikvantitativ metode blev brugt til evaluering: omfanget af angiogenese og re-epithelialisering, antallet af makrofager og fibroblaster i hvert sår, graden af vævs- og cellenekrose, infiltrering af polymorfonukleære leukocyter (PMNer) samt mængden af fibrinholdigt ekssudat. Tegnene på sårheling i sårene behandlet med 10 deoxyribonucleosideme var alle signifikant større (P 0,001) end i sårene behandlet med vehiklet alene (fig. 1). Der var ikke forskel på omfanget af vævsnekrose, akkumulering af fibrinholdigt ekssudat samt infiltrering af såret med PMNer mellem kontroller og behandlede grupper (fig. 2), hvilket indikerer, at deoxyribonucleosideme ikke udløser mere inflammation i disse sår.

15 Histopatologisk analyse viste normal celle- og vævsmorfologi i alle sårprøver.

Forskellen i helingsgraden af de deoxyribonucleosidbehandlede sår sammenlignet med sår behandlet med vehikel alene var slående på det makroskopiske niveau. Kontrolsårenes udseende på dag 7 var meget lig ud-20 seendet på læsionstidspunktet med, i bedste fald, meget små områder med granulationsvæv og minimal udvikling af nyt epithel. Derimod var alle de nucleosidbehandlede væv fuldstændig dækket med et tykt lag granulationsvæv. Nyt epithel dækkede mere end 50% af det oprindelige område af disse sår.

25 Således overvinder påføring af kombinationen af de fire vigtigste deoxyribonucleosider på sår af fuld dybde den sårhelende svækkelse induceret af dexamethason uden nogen tilsyneladende skadelig virkning, idet sårhelingshastigheden i høj grad fremskyndes.

30

Eksempel 5

Formålet med dette forsøg var at evaluere virkningsgraden og sikkerheden af kombinationen af de fire vigtigste deoxyribonucleosider til at fremskynde DK 176007 B1 ! ' 19 sårhelingsprocessen hos unge, normale rotter, som vides at hele hurtigt uden indgriben.

Seksogtredive F344 hanrotter, der vejede ca. 200 g hver (8 uger gamle), fik 5 hver et standard 8 mm cirkulært midtlinje snitsår af fuld dybde i det dorsale halsområde. Halvtres μΙ af en kombination af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin (0,025/ml af hver) i et hydrogelvehikel eller vehiklet alene blev påført sårene på operationsdagen og derefter en gang hvert andet døgn. Sårene blev dækket med en flydende plasticforbinding som 10 . beskrevet af Marshak [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58:63-65 (1945)]. Efter makroskopisk undersøgelse og fotografering blev sårene og det omgivende væv indsamlet 5 (n = 8 pr. gruppe) og 7 (n = 10 pr. gruppe) dage efter læsion med henblik på mikroskopisk og histopatologisk evaluering. Vævssnit og evaluering blev udført af Pathology Associates Inc., Frederick, MD.

15 Både på dag 5 og 7 udviste det makroskopiske udseende af de nucleosidbehandlede sår en markant højere grad af dannelse af granulationsvæv og re-epithelialisering end de vehikelbehandlede kontrolsår. Resultaterne af den mikroskopiske og histopatologiske evaluering er vist i fig.

20 3,4 og 5 og bekræfter de makroskopiske observationer. På dagene 5 og 7 var procentdelen af sår med nyt epithel signifikant større (henholdsvis P 0,001 og P 0,01) i den nucleosidbehandlede gruppe end i de vehikelbehandlede kontroller. Ligeledes var det nye epithels absolutte længde fra sårkanteme signifikant større i den nucleosidbehandlede gruppe både på dag 5 (P 0,001) 25 og dag 7 (P 0,005) end i kontrolgruppen. Granulationsvævets dybde (fig. 5) var også signifikant større (P = 0,001) i den nucleosidbehandlede gruppe end i kontrolgruppen på dag 5. På dag 7 havde granulationsvævet i kontrolsårene nået en dybde, der var ækvivalent med dybden for forsøgsgruppen på dag 5. Granulationsvævets dybde i den nucleosidbehandlede gruppe var ikke 30 forskelligt fra det, man så på dag 5 i denne gruppe. Histopatologisk evaluering viste normal celle- og vævsmorfologi og normale inflammationsniveauer i både kontrolsårene og de nucleosidbehandlede sår samt det omgivende væv.

Disse data indikerer, at behandling af dermale sår af fuld dybde i unge, 35 normale rotter med en kombination af deoxyadenosin, deoxycytidin, 20 DK 176007 B1 deoxyguanosin og deoxythymidin signifikant fremskynder den normale helingshastighed. På dag 5 var behandlede sår så godt heléde, som kontroller var på dag 7. Dette repræsenterer en 28,6% forøgelse i helingshastigheden over et tidsrum på én uge hos unge, normale dyr. '

5 I

Eksempel 6 i | 1. Fremstilling af liposomér indeholdende deoxyribonucleosider 10 Liposomér eller andre bionedbrydelige vesikler indeholdende deoxyribonucleosider kan med fordel anvendes for at give forlænget tilførsel af deoxyribonucleosider til sårvæv.

Den efterfølgende fremgangsmåde til fremstilling af liposomér er adapteret fra 15 Szoka og Papahadjopoulos (PNAS 75:4194-4198 (1978)). Andre fremgangsmåder til fremstilling af liposomér (og forskellige andre lipid-komponenter) kan også bruges til at fremstille vesikler indeholdende deoxyribonucleosider.

20 Cholesterol (50 pmol), phosphatidylcholin (40 μιτιοΙ) og phosphatidylglycerol (10 pmol) blev opløst i chloroform (5 ml) og diethylether (5 ml) i en 50 ml rundbundet kolbe. Kolben blev tilproppet og skyllet med nitrogen. 1,5 ml af en vandig opløsning indeholdende deoxyribonucleosider (f.eks. 10 mg/ml deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin i 15 mM NaCI) I

25 blev sat til den organiske fase. Blandingen blev ultralydsbehandlet i 5 minutter ved 0-5 °C i et bad-ultralydsapparat, indtil 2-fasesystemet bliver en homogen dispersion. Der kan også bruges et sonde-ultralydsapparat. De organiske opløsningsmidler blev fjernet med en roterende inddamper under reduceret tryk (f.eks. en vandstrålepumpe) ved 35-40 °C med en omdrejningshastighed på 30 ca. 200 rpm. Blandingen skummede først, blev derpå en viskøs gel, og endelig blev den en vandig suspension. På dette tidspunkt tilsattes 2 ml saltopløsning, og suspensionen blev evaporeret i yderligere 15 minutter til fjernelse af i resterende spor af ether eller chloroform. Præparatet blev derpå centrifugeret i for at adskille liposomerne fra ikké-indkapslet materiale. 35-40% af den 35 oprindelige deoxyribonucleosidopløsning blev indkapslet i liposomerne. Efter 21 DK 176007 B1 oprensning blev liposomerne koncentreret ved centrifugering og suspenderet i 3 ml fysiologisk saltopløsning til topisk påføring på sår.

De deoxyribonucleosidholdige liposomer kan også suspenderes i salver, 5 cremer eller andre tilførselsvehikler til topisk påføring på sår, beskadiget hud eller ulcus.

2. Virkning på sårheling af liposomer indeholdende deoxvribonucleosider 10 Liposomer kan være effektive vehikler for tilførsel af en række farmaceutiske forbindelser. Formålet med dette forsøg var at evaluere liposomer som potentielle tilførselsvehikler til topisk påføring af deoxyribonucleosideme på dermale sår.

15 Fjorten F344 hanrotter, der hver vejede ca. 200 g (8 uger gamle), fik hver et standard 8 mm cirkulært midtlinje snitsår i det dorsale halsområde. En kombination af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxy-thymidin (0,010/ml af hver) blev inkorporeret i liposomer som beskrevet.

Blanke liposomer (fremstillet med kun saltopløsning) eller liposomer 20 indeholdende deoxyribonucleosideme blev påført sårene på operationsdagen og én gang hvert andet døgn derefter. Sårene blev dækket med en flydende plasticforbinding som beskrevet af Marshak [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58:63-65 (1945)]. Syv dage efter læsion blev sårene makroskopisk undersøgt for graden af granulationsvævsdannelse og omfanget af re-epithelialisering.

25 Mængden af tilstedeværende granulationsvæv og omfanget af nyt epithel, som var begyndt at dække sårene behandlet med de nucleosidholdige liposomer, var signifikant større end i de sår, der kun var behandlet med de blanke liposomer. Disse resultater viser, at liposomer indeholdende 30 deoxyribonucleosider er nyttige udførelsesformer for opfindelsen.

Eksempel 7

For at teste virkningsgraden af kombinationen af de fire vigtigste 35 deoxyribonucleosider ved helingen af slimhindesår, gjorde man brug af den 22 DK 176007 B1 kroniske mavesårsmodel hos rotter ifølge Okabe et al. [Digestive Diseases 16:227-284(1971)]

Otteogfyrre F344 hanrotter med en vægt på ca. 190 g blev bedøvet med en 5 kombination af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (13 mg/kg) administreret ved i.p. injektion. Hver rottes ventrale overflade blev barberet og behandlet med en antibakteriel opløsning. Maven blev derpå blotlagt ved et ventralt snit, en 7 mm (indvendig diameter) plasticcylinder anbragt på den serøse overflade på grænsen mellem mavens corpus og antrum og 0,07 ml eddikesyre påført i 1 10 minut. Det syrebehandlede område blev derpå grundigt skyllet med steril saltopløsning og det ventrale snit lukket. Behandling påbegyndtes 5 dage senere.

Behandlingspræparatet blev fremstillet ved at blande 1,25 g (af hver) 15 deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin i en lindrende base indholdende 0,27 g (af hver) carboxymethylcellulose og xanthangummi i 50 ml sterilt vand. Kontrolpræparatet bestod af carboxymethylcellulose- og xanthangummivehiklet. Rotterne fik 1 ml af enten behandlings- eller kontrolpræparatet to gange daglig (morgen og sen eftermiddag) ved oral 20 intubation. Dyrene blev fodret med standard laboratorie rottefoder. Mad og vand var tilgængelige ad libitum. På dagene 10, 20 og 30 blev otte dyr fra hver gruppe slået ihjel og deres mave fjernet. Efter let fiksering i 1% formalin blev mavesårsarealet (det mavesårsareal, der forblev uden nyt epithelialt dække) målt og registreret for hvert mavesår.

25

Resultaterne af dette forsøg er vist i figur 6. Til hvert tidspunkt var mavesårsarealet signifikant mindre i den behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Disse data viser deoxyribonucleosidpræparatets effektivitet til at fremskynde sårhelingen i den gastriske slimhinde.

30

Eksempel 8

Standard laboratorie rottefoder anvendt i de første mavesårsforsøg (se eksempel 7 ovenfor) indeholder en stor del fibre og grovkost, som vides at 35 irritere helende mavesår hos rotter, hvorved helingsprocessen kompliceres.

23 DK 176007 B1

Derfor undersøgte man virkningen af deoxyribonucleosider på helingen af mavesår hos rotter, der fik et blødt, agarbaseret rottefoder, som eliminerede enhver potentiel komplikation forårsaget af kosten bestående af standard laboratorie rottefoder.

5

Tres F344 hanrotter blev bibragt mavesår på samme måde som beskrevet i eksempel 7 ovenfor. Dyrene blev fodret med en diæt bestående af Bioserv Basal Gel Diet (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ). Mad og vand var tilgængelige ad libitum. Dyrene blev behandlet med vehikel alene (carboxymethylcellulose 10 og xanthangummi) eller en kombination af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin i xanthangummi og carboxymethylcellulose som beskrevet i eksempel 7. Femten dyr i hver gruppe blev slået ihjel på behandlingsdagene 10 og 16. Det mavesårsareal, der forblev ikke-epithelialiseret i hver mave, blev målt og registreret.

15

Som det ses af figur 7, viser resultaterne, at mens helingshastigheden af såvel kontrolmavesår som behandlede mavesår var større end den, man så ved anvendelse af standard laboratorie rottefoder (figur 6), så fremskyndedes helingsprocessen signifikant ved behandling af disse slimhindesår med 20 deoxyribonucleosidpræparatet samirienlignet med vehikelbehandlede kontrolmavesår på såvel dag 10 som dag 16 (henholdsvis P 0,002 og P 0,001). Mikroskopisk undersøgelse og histopatologi bekræftede de makroskopiske resultater med signifikant større epithelialisering af de behandlede mavesår og viste, at celle- og vævsmorfologi var normal i såvel kontrolmavesår som 25 behandlede mavesår.

Eksempel 9

Cimetidin er kendt for at være et effektivt middel mod mavesår. Cimetidins 30 virkningsmekanisme er primært hæmning af mavesyresekretion gennem dets indvirkning på gastriske histamin (H2) receptorer. Dette tilvejebringeret mindre agressivt gastrisk miljø for mavesåret til at hele i, men stimulerer ikke nødvendigvis direkte selve helingsprocessen. Midler, der direkte fremskynder helingsprocesseme, skulle frembringe virkninger på heling af mavesår, som er 35 større end de virkninger, der opnås ved behandling med cimetidin alene.

24 DK 176007 B1

Derfor undersøgte man virkningerne af cimetidin og et deoxyribonucleosid-præparat, hver for sig og i kombination, på heling af mavesår.

Enoghalvtreds F344 hanrotter blev bibragt mavesår på samme måde som 5 beskrevet i eksempel 7. Behandling blev påbegyndt 5 dage derefter. Dyrene fik 1 ml af enten vehikel alene (carboxymethylcellulose og xanthangummi, se eksempel 7), en kombination af deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin og deoxythymidin (0,025 g/ml af hver) i vehiklet, cimetidin (15 mg/ml) i vehiklet eller cimetidin plus deoxyribonucleosideme i vehiklet. Behandlingerne blev 10 administreret to gange daglig, om morgenen og sent på eftermiddagen, ved peroral intubation.

Rotterne blev behandlet i 14 dage og derpå slået ihjel. Maverne blev fjernet og fikseret let med 1 % formalin. De tilbageværende mavesårvæv og omgivende 15 væv blev derpå skåret ud, og de mavesårsarealer, der forblev ikke-epithelialiseret, blev bestemt. Prøverne blev opbevaret i 10% formalin.

Resultaterne af dette forsøg er vist i figur 8. Arealet af såvel de cimetidinbehandlede som de deoxyribonucleosidbehandlede mavesår var 20 signifikant reduceret i sammenligning med de vehikelbehandlede (kontrol) mavesår (henholdsvis P 0,001 og P 0,002). Mavesårene behandlet med cimetidin plus deoxyribonucleosideme var ikke blot signifikant mindre end kontrollerne (P 0,001), men var også signifikant mindre end mavesårene behandlet med cimetidin (P 0,05) eller med deoxyribonucleosidpræparatet (P 25 0,05). Det lader således til, at deoxyribonucleosideme virker ved en anden mekanisme end cimetidin, og at de kombinerede behandlinger har additive virkninger til fremme af heling af kroniske mavesår.

Eksempel 10 30

Japansk patentskrift J 60 028 929-A, tilhørende Hokuriku Pharm. KK påberåbes at beskrive et middel mod mavesår, omend der kun angives data for delvis forebyggelse af akutte stress-inducerede mavesår. Dette middel indeholder 2-deoxyguanosin. Formålet med nærværende forsøg var at 35 sammenligne virkningsgraden af deoxyguanosin alene med virkningsgraden 25 DK 176007 B1 af kombinationen af 2'-deoxyribonucleosideme af adenin, cytidin, guanin og thymin til behandling af kroniske mavesår.

Otteogfyrre F344 hanrotter med en vægt på ca. 210 gram hver blev bibragt 5 mavesår ved eddikesyremetoden beskrevet i eksempel 7 ovenfor. Behandling blev påbegyndt 5 dage efter initiering af mavesårene og udført i henhold til den tidligere beskrevne metode og tidsplan. Dyrene fik 1 ml af enten vehiklet alene (kontrol), de fire deoxyribonucleosider i vehiklet (0,025 g/ml af hver) eller deoxyguanosin (0,025 g/ml) om morgenen og sent på eftermiddagen hver dag 10 i 14 dage. På den sidste behandlingsdag blev alle 16 dyr i hver gruppe slået ihjel, deres maver fjernet og fikseret let i formalin, og de mavesårsområder, der forblev ikke-epithelialiseret, blev målt og registreret.

Resultaterne af dette forsøg er vist i figur 9. Mavesårsarealet i de 15 vehikelbehandlede kontroller var 12,6 ± 1,5, mens arealet af mavesårene behandlet med alle fire deoxyribonucleosider var 7,7 ± 0,87 (P 0,01) og for dem, der var behandlet med deoxyguanosin alene, 16,3 ±1,5 (P 0,05). Deoxyguanosin alene lader således til at være ineffektivt til behandling af kroniske mavesår, mens kombinationen af deoxyadenosin, deoxycytidin, 20 deoxythymidin og deoxyguanosin er effektiv til fremskynding af helingen af sår på slimhinden.

Claims (18)

1. Farmaceutisk præparat omfattende specificerede nucleosider og en farmaceutisk acceptabel bærer, kendetegnet ved, at de specificerede 5 nucleosider omfatter 10-90 mol-% 2'-deoxycytidin og 90-10 mol-% 2’-deoxyguanosin, idet både 2’-deoxycytidin og 2-deoxyguanosin forefindes som (a) den frie form deraf, 10 (b) et 3’-, 5’ eller S'.S’-phosphatesterderivat deraf, eller (c) et acylderivat deraf, eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

2. Præparat ifølge krav 1 yderligere omfattende 2’-deoxyadenosin, hvilken 2-deoxyadenosin forefindes som (a) den frie form deraf, (b) et 3'-, 5' eller 3\5'-phosphatesterderivat deraf, eller 20 (c) et acylderivat deraf, eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

3. Præparat ifølge krav 2 omfattende mindst 50 mol-% af en blanding 25 omfattende 10-90 mol-% 2’-deoxycytidin og 90-10 mol-% 2’-deoxyguanosin.

4. Præparat ifølge krav 1 yderligere omfattende 2’-deoxythymidin, hvilken 2’-deoxythymidin forefindes som 30 (a) den frie form deraf, (b) et 3’-, 5' eller S’.S'-phosphatesterderivat deraf, eller (c) et acylderivat deraf, eller farmaceutisk acceptable salte deraf. 35 27 DK 176007 B1

5. Præparat ifølge krav 4 omfattende mindst 50 mol-% af en blanding omfattende 10-90 mol-% 2’-deoxycytidin og 90-10 mol-% 2’-deoxyguanosin.

6. Præparat ifølge krav 2 yderligere omfattende 2’-deoxythymidin, hvilken 5 2’-deoxythymidin forefindes som (a) den frie form deraf, (b) et 3-, 5' eller 3',5*-phosphatesterderivat deraf, eller (c) et acylderivat deraf, 10 eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

7. Præparat ifølge et vilkårligt af de foregående krav omfattende mindst 50 mol-% af en blanding omfattende 10-90 mol-% 2’-deoxycytidin og 90-10 15 mol-% 2’-deoxyguanosin.

8. Præparat til heling af mavesår eller duodenalsår omfattende (1) en blanding af 20 (a) 10-90 mol-% 2’-deoxycytidin og 90-10 mol-% 2’-deoxyguanosin; (b) 2’-deoxyadenosin og (c) 2’-deoxythymidin; 25 idet både 2’-deoxycytidin, 2’-deoxyguanosin, 2’-deoxyadenosin og 2’-deoxythymidin forefindes som (i) den frie form deraf, 30 (ii) et 3’-, 5’ eller S’.S’-phosphatesterderivat deraf, eller (iii) et acylderivat deraf, t eller farmaceutisk acceptable salte deraf, og 35 (2) et anti-ulcusmiddel valgt blandt: 28 DK 176007 B1 (a) mavesyresekretionsantagonister, (b) cellebeskyttende prostaglandiner, (c) antacida, og 5 (d) ulcusad hærerende komplekser.

9. Præparat til heling af mavesår eller duodenalsår ifølge krav 8, hvori komponent (1 )(a) omfatter mindst 50 mol-% af en blanding omfattende 10-90 mol-% 2’-deoxycytidin og 90-10 mol-% 2’-deoxyguanosin. 10

10. Farmaceutisk præparat ifølge et vilkårligt af de foregående krav i en form egnet til topisk administrering til et sår.

11. Farmaceutisk præparat ifølge et vilkårligt af de foregående krav i form af 15 en salve, en gel, en pasta, en lotion, en creme, et suppositorium, en spray, en irrigationsopløsning eller en suspension.

12. Farmaceutisk præparat ifølge et vilkårligt af kravene 1-10 inkorporeret i liposomer, polymere, bionedbrydelige polymere, bandager eller suturer. 20

13. Anvendelse af 2’-deoxycytidin (a) på fri form, (b) i form af et 3’, 5’ eller 3',5’-phosphatesterderivat deraf, eller 25 (c) et acylderivat deraf ved fremstilling af et farmaceutisk præparat til sårheling ifølge et vilkårligt af kravene 1-12.

14. Anvendelse af 2’-deoxyguanosin (a) på fri form, (b) i form af et 3’, 5’ eller 3',5’-phosphatesterderivat deraf, eller (c) et acylderivat deraf 35 29 DK 176007 B1 ved fremstilling af et farmaceutisk præparat til sårheling ifølge et vilkårligt af kravene 1-12.

15. Anvendelse ifølge krav 13 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til 5 heling af en mucosalæsion, et hudsår, en forbrænding, et kirurgisk snitsår eller et ulcus.

16. Anvendelse ifølge krav 13 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til heling af et mucosa ulcer, et kutant ulcer, et venøst bensår eller et liggesår. 10

17. Anvendelse ifølge krav 14 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til heling af en mucosalæsion, et hudsår, en forbrænding, et kirurgisk snitsår eller et ulcus.

18. Anvendelse ifølge krav 14 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til heling af et mucosaulcer, et kutant ulcer, et venøst bensår eller et liggesår.