DK176020B1

DK176020B1 - Monoklonale antistoffer og fragmenter deraf, hybridomaceller til fremstilling af monoklonale antistoffer, fremgangsmåder til diagnosticering af tumorceller, anvendelse af antistoffer samt farmaceutiske præparater indeholdende samme

Info

Publication number: DK176020B1
Application number: DK200300468A
Authority: DK
Inventors: Timothy Alan Springer; Robert Rothlein
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 1987-05-04
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2005-12-12
Also published as: DK200300468A

Description

i DK 176020 B1

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistoffer samt fragmenter deraf, der er i stand til at binde til intercellulære adhæsionsmolekyler. Opfindelsen angår yderligere celler til at producere sådanne • 5 antistoffer, I et andet aspekt angår opfindelsen en » fremgangsmåde til diagnosticering af tumorceller eks- primerende intercellulære adhæsionsmolekyler, et farmaceutisk præparat indeholdende antistofferne eller fragmenterne deraf samt anvendelse af antistofferne eller 10 fragmenterne til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af inflammation eller undertrykkelse af tumorvækst.

Leukocytter skal være i stand til at fæstne til cellesubstrater for på rette måde at forsvare værten 151 mod fremmede invaderende, såsom bakterier eller vira.

Et udmærket overblik over forsvarssystemet er angivet af Eisen, H.W., (Microbiology, 3. udg.. Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), s 290-295 og 381-418).

De skal kunne fæstnes til endotelceller, således at de 20 kan migrere fra kredsløbet til steder med fortsat inflammation. Yderligere skal de være i stand til at fæstne til antigenpresenterende celler, således at en normal specifik immunreaktion kan forekomme, og endelig skal de fæstne til egnede målceller, således at 25 lysis af virus-inficerede celler eller tumorceller kan ske.

For nylig identificeredes leukocytoverflade- molekyler, som er involveret i formidlingen af sådanne ύ* fæstnelser, under anvendelse af hybridoma-teknologi.

» 30 Kort fortalt identificeredes monoklonale antistoffer rettet mod humane T-celler (Davignon, D. et al., Proc.

Natl. Acad. Scl. USA 78:4535-4539 (1981)) og musemilt-celler (Springer, T. et al. Eur. J. Immunol. 9:301-306 — --- - _____i i 2 DK 176020 B1 (1979)), hvilke bandt til leukocytoverflader og inhibe-rede de fæstnelsesrelaterede funktioner beskrevet ovenfor (Springer, T. et al.. Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985)). Molekylerne, der identificeredes med disse 5 antistoffer, kaldtes Mac-1 og lymfocyt-funktions-associeret antigen-1 (LFA-1). Mac-1 er en heterodimer, ø som findes hos makrofager, granulocytter og store granulære lymfocytter. LFA-1 er en heterodimer, som findes hos de fleste lymfocytter (Springer, T.A., et 10 al. Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982)). Disse to molekyler plus et tredje molekyle, pl50,95 (som har en vævsfordeling svarende til Mac-1) spiller en rolle ved cellulær adhæsion (Keizer, G. et al., Eur. J. Immunol.

15:1142-1147 (1985)).

15 Ovennævnte leukocytmolekyler har vist sig at væ re medlemmer af en beslægtet familie af glycoproteiner (Sanchez-Madrid F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol.

15:1142-1147 (1985)). Denne glycoproteinfamilie består j 20 af heterodimerer med én α-kæde og én β-kæde. Skønt i hver af antigenernes α-kæde var forskellige fra hinanden, viste β-kæden sig at være bevaret i høj grad (Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med.

158:1785-1803 (1983)). Glycoproteinfamiliens (somme- 25 tider omtalt som "CD18") β-kæde viste sig at have en molekylvægt på 95 kd, hvorimod α-kædernes molekylvægt varierede fra 150 kd til 180 kd (Springer, T., Fed.

Proc. 44:2660-2663 (1985)). Skønt membranproteinernes α-underenheder ikke har den samme vidtstrakte homologi 4i 30 som β-underenheder,viste nærmere analyse af glycoprot-einernes α-underenheder, at der er væsentlige ligheder mellem dem. Undersøgelser over lighederne mellem a- og β-underenhederne i de LFA-1-relaterede glycoproteiner i________________ ______—____________ 3 DK 176020 B1 er angivet af Sanchez-Madrid, F. et al., (J. Exper.

Med. 158:586-602 (1983); J^. Exper. Med. 158:1785-1803 j

(1983)). I

Man har identificeret en gruppe af personer, 1 5 som ikke er i stand til at eksprimere normale mængder af ethvert medlem af denne adhæsionsproteinfamilie på * deres leukocytcelleoverflade (Anderson, D.C., et al.,

Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Lymfocytter fra 10 disse patienter udviste in vitro defekter svarende til normale modparter, hvis LFA-l-familie af molekyler var blevet antagoniseret af antistoffer. Disse personer var yderligere ude af stand til at opnå en normal immunrespons på grund af deres cellers manglende evne til 15 at hæfte til cellesubstrater (Anderson, D.C., et al., Fred. Proc. £4:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Disse data viser at immunreaktioner dæmpes når lymfocytter ikke er i stand til at fæstne på normal måde på grund 20 af de manglende funktionelle adhæsionsmolekyler af

LFA-l-familien. I

Lymfocytternes evne til at bevare et dyrs helbred og levedygtighed kræver således summarisk at lymfocytterne er i stand til at hæfte til andre celler 25 (såsom endotelceller). Denne hæftning har vist sig at kræve celle-cellekontakter, som involverer specifikke receptormolekyler, der findes på lymfocytternes celle-, overflade. Disse receptorer gør det muligt for en lymfocyt at fæstne sig til andre lymfocytter eller til . 30 endotelceller, og andre ikke-vaskulære celler. Celle- overfladereceptormolekylerne har vist sig at være yderst beslægtede med hinanden. Personer, hvis lymfocytter mangler disse celleoverfladereceptormolekyler, j II ----- --- — - - ..... . — i 4 DK 176020 B1 udviser kroniske og tilbagevendende infektioner og andre kliniske symptomer, herunder defekte antistofreaktio-ner.

Da lymfocytadhæsionen er involveret i processen 5 gennem hvilken fremmed væv identificeres og afvises, er en forståelse af denne proces af væsentlig værdi indenfor organtransplantationen, vævstransplantationen, al- %> lergi og onkologi.

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale 10 antistoffer og fragmenter af antistoffer, der er i stand til at inhibere funktionen af ICAM-l, og andre inhibitorer af ICAM-l-funktionen. Opfindelsen angår desuden diagnostiske fremgangsmåder for alle de ovennævnte molekyler, samt farmaceutiske præparater inde-15 holdende antistofferne eller fragmenterne deraf, samt anvendelse af disse til fremstilling af farmaceutiske præparater.

Opfindelsen angår nærmere angivet et monoklonalt antistof, R6-5-D6, som er i stand til at binde til et 20 molekyle valgt blandt ICAM-l og funktionelle derivater af ICAM-l eller molekyler, der er i stand til at binde til en receptor, der findes på overfladen af en lymfocyt. Opfindelsen omfatter også en hybridoma-celle, der er i stand til at produceree et sådant antistof.

25 Opfindelsen omfatter yderligere fragmenter af antistoffet, der er i stand til at binde til molekylet, og endvidere antistoffet og fragmenter deraf på mærket form.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til dia-30 gnostisering og lokalisering af en ICAM-l eksprimerende tumorcelle i et pattedyr eller menneske, som man formoder indeholder en sådan celle, hvilken fremgangsmåde omfatter: 5 DK 176020 B1 (a) administrering af et middel indeholdende en detekterbart mærket bindingsligand, der er i stand til at binde til ICAM-1, til individet, idet liganden vælges blandt et antistof og et fragment af et antistof, 5 hvor fragmentet er i stand til at binde til ICAM-l, og (b) detektering af bindingsliganden.

* Endvidere angår opfindelsen et farmaceutisk præ parat indeholdende et antistof eller toxinafledt antistof, der er i stand til at binde til et molekyle valgt 10 blandt ICAM-l og et funktionelt derivat af ICAM-1, eller et fragment af et antistof eller toxin-afledt fragment af et antistof, idet fragmentet er i stand til at binde til et molekyle valgt blandt ICAM-1 og et funktionelt derivat af ICAM-1, sammen med en inert farma-15 ceutisk bærer.

Yderligere angår opfindelsen anvendelse af antistoffet eller et fragment deraf, der er i stand til at binde til ICAM-l og et funktionelt derivat af ICAM—l til fremstilling af et farmaceutisk præparat til be-20 handling af inflammation, der stammer fra en reaktion fra det specifikke forsvarssystem hos et pattedyr eller menneske, eller til undertrykkelse af væksten af en ICAM-l-eksprimerende tumor eller en LFA-l-eksprimerende tumor.

25 På tegningen viser: fig. 1, på diagramform, adhæsionen mellem en normal og en LFA-1 mangelfuld celle.

Fig. 2 viser, på diagramform, normal/normal celle-adhæsion-processen.

30 Fig. 3 viser kinetikken af cellulær aggregation x i fravær (X) eller nærværelse af 50 ng/ml PMA (0).

Fig. 4 viser coaggregation mellem LFA-1*· og LFA-l+-celler. Carboxyfluoresceindiacetatmærkede EBV- 6 DK 176020 B1 transformerede celler (104), som angivet i figuren blandedes med 105 umærkede autologe celler (sorte søjler) eller JY-celler (ufarvede søjler) i nærværelse af PMA.

Efter 1,5 timer optaltes de mærkede celler, i aggrega-5 ter eller frie, idet den kvantitative prøve fra eksempel 2 benyttedes. Procentdelen af mærkede celler i aggregater er vist. Et repræsentativt eksperiment ud af to er vist.

Fig. 5 viser immunopræcipitationen af ICAM-l 10 og LFA-1 fra JY-celler. Triton X-100 lysater fra JY-celler (bane 1 og 2) eller kontrollysispuffer (bane 3 og 4) immunopræcipiterede med antistof, der er i stand i til at binde til ICAM-l (bane 1 og 3) eller antistof fer, der er i stand til at binde til LFA-1 (bane 2 og 15 4). Panel A viser resultater under reducerende betingelser: Panel B viser resultater opnået under ikke- reducerende betingelser. Molekylvægtstandarder bestemtes i bane S.

Fig. 6 viser kinetikken af IL-1 og y-interferon-20 virkninger på ICAM-l-ekspression på humane, dermale fibroblaster. Humane, dermale fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x 104 celler/0,32 cm2/brønd. IL-1 (10 U/ml, sorte cirkler) eller rekombinant y-interferon (10 U/ml, farvede firkanter) tilsattes og på det angi-! 25 vne tidspunkt afkøledes prøven til 4°C og en indirekte j bindingsprøve gennemførtes. Standardafvigelsen oversteg 1 ikke 10 procent.

Fig. 7 viser koncentrationsafhængigheden af IL-1- og y-interferonvirkninger på ICAM-l. Humane, der- 30 male fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x 104 celler/0,32 cm2/brønd. IL-2 (ufarvede cirkler), rekombinant human IL-l (ufarvede firkanter), rekombinant muse IL-1 (sorte firkanter), rekombinant human y-interferon (sorte cirkler), og rekombinant β-interferon DK 176020 B1 i j 7 (ufarvede trekanter) tilsattes ved den angivne fortynding og inkuberedes i 4 timer (IL-1) eller 16 timer (β-og γ-interferon). De viste resultater er middelværdier fra firedobbelte bestemmelser; standardafvigelsen 5 overskred ikke 10%.

Fig. 8 viser nukleotld- og aminosyresekvensen af ICAM-l-cDNA. Det første ATG er ved position 58. Translaterede sekvenser svarende til ICAM-l tryptiske peptider er understreget. Det hydrofobe putative 10 signalpeptid og transmembransekvenser har en kraftig understregning. N-koblede glycosyleringssteder er indrammet. Polyadenyleringssignalet AATAAA ved position 2976 er angivet ved en streg ovenover signalet. Den viste sekvens er for HL-60 cDNA-klonen. Endotelcelle-15 cDNA'en sekvensbestemtes over det meste af dens længde og viste kun mindre forskelle.

Fig. 9 viser de ICAM-l homologe domæner og forbindelse til den immunoglobuline supergene familie.

(A) opstilling af 5 homologe domæner (Dl-5). To eller flere 20 identiske rester, som er opstillet er indrammet. Rester bevaret to eller flere gange i NCAM-domæner samt rester i bevaret i domæner af sættene C2 og Cl opstilledes sammen med de ICMA-1 interne gentagelsesenheder. Lokaliseringen af de forudsagte β-strenge i ICAM-l-domænet er 25 markeret med kraftige streger og små bokstaver ovenover ! opstillingerne og den kendte lokalisering af β-strenge i immunoglobulin C domæner er markeret med kraftig streger og store bokstaver nedenunder opstillingen. j

Positionen af den putative disulfidbro indenfor ICAM-l- j 30 domæner er angivet med S-S. (B-D) optilling af proteindomæner homologe til ICAM-l domæner; proteiner opstilledes til at begynde med ved søgning i NBRF-databaser under anvendelse af FASTP-programmet. Proteinsekvenser- 8 DK 176020 B1 ne er MAG, NACM, T-cellereceptor-a-underenhed-V-domæne,

IgMy-kæde og α-1-B-glycoprotein.

Pig. 10 er en skematisk sammenligning mellem de sekundære strukturer af ICAM-1 og MAG.

5 Fig. li viser LFA-l-positive EBV-transformerede B-lymfoblastoide cellers binding til ICAM-1 i plane membraner.

Fig. 12 viser LFA-l-positive T-lymfoblaster og T-lymfomacellers binding til ICAM-1 i plast-bundne 10 vesikler.

Fig. 13 viser inhiberingen af binding af JY B-lymfoblastoidcellebinding til ICAM-1 i plast-bundne vesikler ved prebehandling af celler eller vesikler med monoklonale antistoffer.

15 Fig. 14 viser virkningen af temperatur på bin ding af T-lymfoblaster til ICAM-1 i plast-bundne vesikler.

Fig. 15 viser nødvendigheden af divalente kationer til binding af T-lymfoblaster til ICAM-1 i 20 plast-bundne vesikler.

Fig. 16 viser anti-adhæsion-antistoffers virkning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen af det T-celle-associerede antigen OKT3. "OKT3" angiver tilsætningen 25 til antigen.

Fig. 17 viser anti-adhæsion-antistoffers virk ning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen af det ikke- specifikke T-cellemitogen, concanavalin A. "CONA" 30 angiver tilsætnigen af concanavalin A.

Fig. 18 viser anti-adhæsion-antistoffers virkning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen af det "keyhole DK 176020 B1 i 9 limpet-"hæmocyaninantigen. Tilsætningen af "keyhole limpet-"hæmocyanin til cellerne er angivet ved "KLH".

Fig. 19 viser anti-adhæsion-antistoffers virkning på perifere mononukleære blodcellers evne til 5 proliferation som svar på genkendelsen af tetanustoxo-idantigenet. Tilsætningen af tetanustoxoidantigen til cellerne er angivet ved "AGN".

Fig. 20 viser ekspressionen af ICAM-1 på humane, perifere monocytter. (A) ikke dyrkede responderceller; 10 (B) ikke dyrkede responder X stimulatorceller; (C) re sponderceller dyrker i 24 timer: (D) responder X stimulator celler dyrket i 24 timer.

(Tekst:- - - intet monoclonalt antistof; .......

Muse-immunoglobulin; _ Muse-anti-ICAM-1).

15 Molekyler, såsom dem i LFA-l-familien, der er involveret i cellulær adhæsionsprocessen omtales som "adhæsionsmolekyler".

Den omhandlede naturlige bindingsligand betegnes "intercellulær Adhæsionsmolekyle-1" eller "ICAM-l".

20 ICAM-1 er et 76-97 Kd glycoprotein. ICAM-1 er ikke en heterodimer. Et "funktionelt derivat af" ICAM-1 er en forbindelse, som har en biologisk aktivitet (enten funktionelt eller strukturelt) som i det væsentlige er lig en biologisk aktivitet af ICAM-1. Udtrykket 25 "funktionelle derivater" har til hensigt at omfatte "fragmenter", "varianter", "analoge" eller "kemiske derivater" af et molekyle. Et "fragment" af et molekyle, såsom ICAM-1 har til hensigt at betegne enhver polypep-tiddel af molekylet. En "variant" af et molekyle, såsom 30 ICAM-1 har til hensigt at betegne et molekyle, der i det væsentlige har samme struktur og funktion som enten hele molekylet eller et fragment deraf. Et molekyle siges at være "i det væsentlige lig med" et andet moleky- 10 DK 176020 B1 le, hvis begge molekyler har i det væsentlige ens strukturer, eller hvis begge molekyler har omtrent samme biologiske aktivitet. Forudsat at to molekyler har omtrent samme aktivitet betragtes de således som va-5 rianter, sådan som udtrykket benyttes heri, selvom strukturen af et af molekylerne ikke findes i det andet, eller hvis aminosyresekvensresterne ikke er identiske. En "analog" af et molekyle, såsom ICAM-1, har til hensigt at betegne et molekyle, der i det væ-10 sentlige er ens i funktionen enten til hele molekylet eller til et fragment deraf. Sådan som det benyttes heri, siges et molekyle at være et "kemisk derivat" af et andet molekyle, når det indeholder yderligere kemiske dele, som normalt ikke er en del af molekylet. Sådanne 15 dele kan forbedre molekylets opløselighed, absorption og biologisk halveringstid, osv. Delene kan alternativt mindske molekylets toxicitet, eliminere eller dæmpe enhver uønsket bivirkning hos molekylet, osv. Dele, der i stand til at mediere sådanne virkninger er angi-20 vet i Reminton's Pharmaceutical Sciences (1980). "Toxin-afledte"-molekyler udgør en speciel klasse af "kemiske derivater". Et "toxin-afledte" molekyle er et molekyle (såsom ICAM-i eller et antistof), som indeholder en toxindel. Bindingen af et så-25 dant molekyle til en celle bringer toxindelen i umiddelbar nærhed med cellen og fremmer derved celledød.

Enhver egnet toxindel kan anvendes; det foretrækkes imidlertid at anvende toxiner, såsom ricintoxi-net, diehtheriatoxinet, radioisotope toxiner; membran-30 kanal-formende toxiner, osv. Fremgangsmåder til kobling af sådanne dele til et molekyle er velkendt indenfor teknikken.

Et antigent molekyle, såsom ICAM-1 eller medlemmer af LFA-l-familien af molekyler eksprimeres natur- 11 DK 176020 B1 ligvis på overfladen af lymfocytter. Introduktionen af sådanne celler i egnede dyr, som ved intraperitoneal injektion, osv., vil således resultere i produktionen af antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1 5 eller medlemmer af LFA-l-familien af molekyler. Serummet fra et sådant dyr kan, om ønsket, fjernes og benyttes som en kilde for polyklonale antistoffer, der er i stand til at binde til disse molekyler. Det foretrækkes imidlertid at fjernes splenocytter fra sådanne dyr, at 10 sammensmelte sådanne miltceller med en myelomacelleli-nie og lade sådanne fusionsceller danne en hybridoma-celle som secernerer monoklonale antistoffer, der er i j stand til at binde til ICAM-1 eller medlemmer af LFA-1 familien af molekyler.

15 Hybridomacellerne, opnået på samme måde som be skrevet ovenfor kan underkastes screening ved en række fremgangsmåder til identificering af ønskede hybrido-maceller, som sekreterer antistof, der er i stand til at binde enten til ICAM-1 eller til medlemmer af LFA-1-20 familien af molekyler. Ved en foretrukket screeningsprøve, identificeres sådanne molekyler ved deres evne til at inhibere aggregationen af Epstein-Barr virustransformerede celler. Antistoffer, der er i stand til at inhibere sådanne aggregationer, underkastes dernæst 25 yderligere screening for at bestemme hvorvidt de in-hiberer sådan aggregation ved binding til ICAM-1, eller ved at binde til et medlem af LFA-l-familien af molekyler. Ethver middel, der er i stand til at skelne ICAM-1 fra LFA-l-familien af molekyler kan anvendes i 30 en sådan screening. Antigenet bundet af antistoffet kan således f.eks. analyseres ved immunfældning og polyacrylamidgelelektroforese. Hvis det bundne antigen er et medlem af LFA-l-familien af molekyler vil det 12 DK 176020 B1 immunofældede antigen således vise sig at være en dimer, hvorimod en enkelt molekylvægtdel vil være blevet immunofældet, hvis det bundne antigen er ICAM-i. Det er desuden muligt at skelne mellem disse antistoffer, som 5 binder til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler fra dem som binder til ICAM-1 ved screening for antistoffets evne til at binde til celler, såsom granulocytter, som eksprimerer LFA-1, men ikke ICAM-1. Et antistofs (som vides at inhibere cellulær aggregation) evne til 10 at binde til granulocytter indikerer, at antistoffet er i stand til at binde til LFA-1. Fraværet af sådan binding viser, at et antistof er i stand til at genkende ICAM-1. Et antistofs evne til at binde til en celle, såsom en granulocyt, kan påvises ved metoder, der 15 sædvanligvis anvendes af en fagmand. Sådanne metoder omfatter immunoassays, cellulær agglutination, filterbindingsstudier, antistoffældning, osv.

De omhandlede anti-aggregationsantistoffer kan alternativt identificeres ved måling af deres evne til 20 differentielt at binde til celler, som eksprimerer ICAM-1 (såsom aktiverede endotelceller), og deres manglende evne til at binde til celler, som ikke eksprimerer ICAM-1. Som det vil være klart for en fagmand, kan ovennævnte prøver modificeres, eller udføres 25 i en anden rækkefølge til opnåelse af en række potentielle screeningsprøver, som hver er i stand til at identificere og skelne mellem antistoffer, der er i stand til at binde til ICMA-1 kontra medlemmer af LFA-l-familien af molekyler.

30 De omhandlede anti-inflammatoriske midler kan opnås ved naturlige (såsom ved at få et dyr, en plante, svamp, bakterie, osv. til at producere en ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1, eller ved at få et 13 DK 176020 B1 dyr til at producere polyklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1); ved syntetiske metoder (såsom under anvendelse af Merrifield's metode til syntetisering af polypeptider til syntetisering af 5 ICAM-l, funktionelle derivater af ICAM-1, eller proteinantagonister af ICAM-1 (enten immunoglobulin eller ikke-immunoglobulin)); ved hybridomateknologi (såsom fremstilling af monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1); eller ved rekombinant-10 teknologi (såsom fremstilling af de omhandlede anti-inflammatoriske midler i forskellige værter (dvs. gær, bakterier, svampe, dyrkede pattedyrsceller, osv.), eller fra rekombinante plasmider eller virusvektorer).

Valget af den fremgangsmåde, der skal benyttes vil af-15 hænge af faktorer, såsom anvendelighed, ønsket udbytte, osv. Det er ikke nødvendigt kun at benytte én af ovennævnte fremgangsmåder, metoder eller teknologier til fremstilling af et særligt antiinflammatorisk middel; de ovennævnte metoder, fremgangsmåder og teknologier 20 kan kombineres for at opnå et særligt antiinflammatorisk middel.

A. Identifikation af LFA-l-bindingspartneren (ICAM-1).

25 1. Prøver for LFA-1-afhængig aggregation.

Mange Epstein-Barr virustransformerede celler udviser aggregation. Denne aggregation kan øges i nærværelse af phorbolestere. En sådan homotype aggrega-30 tion (dvs. aggregation, der kun involverer en celletype) har vist sig at blive blokeret af anti-LFA-1-antistoffer (Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)), hvilken reference er inkorporeret 14 DK 176020 B1 heri ved henvisningen dertil). udstrækningen af LFA-l-afhængig binding kan således bestemmes ved at prøve udstrækningen af spontan eller phorbolesterafhæn-gig aggregatdannelse.

5 Et middel som interfererer med LFA-l-afhængig aggregation kan identificeres ved anvendelsen af en prøve, der er i stand til at bestemme hvorvidt et middel interfererer med den spontane eller den phorbole-ster-afhængige aggregation af Epstein-Barr virus-10 transformerede celler. De fleste Epstein-Barr virustransformerede celler kan anvendes i en sådan prøve så længe cellerne er i stand til at eksprimere LFA-l-receptormolekylet. Sådanne celler kan fremstilles i overensstemmelse med teknikken angivet af Springer, 15 T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984), hvilken reference er inkorporeret heri i kraft af henvisninger dertil. Skønt enhver sådan celle kan anvendes i den LFA-1-afhængige bindingsprøve ifølge opfindelsen, foretrækkes det at benytte celler fra JY cellelinien 20 (Terhost, C.T. et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 22:910 (1976)). Cellerne kan dyrkes i erhvert egnet dyrkningsmedium; det foretrækkes imidlertid at dyrke cellerne i RMPI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% fetal kalveserum og 50 yg/ml gentamycin (Gibco Labora-25 tories, NY). Cellerne bør dyrkes under betingelser, der er egnet for pattedyrcelleproliferation (dvs. ved en temperatur på sædvanligvis 37°C og i en atmosfære med 5% C02, ved en relativ fugtighed på 95%, osv.).

15 DK 176020 B1 2. LFA-1 binding til ICAM-1.

Man har fundet mennesker, hvis lymfocytter mangler familien af LFA-l-receptormolekyler (Anderson, D.C.

5 et al.. Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Sådanne mennesker siges at lide af leukocytadhæsionsmangel (LAD). EBV-transformerede celler fra sådanne mennesker samles hverken spontant eller i nærværelse af phorbol-10 estere i ovennævnte aggregationsprøve. Når sådanne celler blandes med LFA-l-eksprimerende celler obser- j veredes aggregation (Rothlein, R. et al., J. Exper.

Med. 163:1132-1149 (1986)) (fig. 1). Det er af stor vigtighed, at disse aggregater ikke dannes, hvis disse 15 celler inkuberedes i nærværelse af anti-LFA-1 antistoffer. Skønt aggregationen krævede LFA-l indikerede LFA-l-mangelfulde cellers evne til at danne aggregater med LFA-l-holdige celler således at LFA-l bindingspartneren ikke var LFA-l, men snarere et hidtil ukendt 20 celleadhæstionsmolekyle. Fig. 1 viser den cellulære adhæs ionsmekanisme.

B. Intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1).

25

Det omhandlede intercellulære adhæsionsmolekyle ICAM-1 blev først identificeret og delvis beskrevet i overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al. (J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)). Til påvisning 30 af ICAM-1-molekylet fremstilledes monoklonale antistoffer ud fra miltceller fra mus, immuniseret med celler i j 16 DK 176020 B1 fra mennesker med genetisk defekt i LFA-l-ekspression.

De opnåede antistoffer underkastedes screening for deres evne til at inhibere aggregationen af LFA-l-ekspri-merende celler (fig. 2). Nærmere angivet immuniseredes 5 mus med EBV-transformerede B-celler fra LAD-patienter, som ikke eksprimerer LFA-1-antigenet. Milceller fra disse dyr fjernedes dernæst, sammensmeltedes med myelo-maceller og fik lov til at blive monoklonale antistofproducerende hybridomaceller. EBV-transformerede ΒΙΟ celler fra normale mennesker, som eksprimerer LFA-1, inkuberedes dernæst i nærværelse af det monoklonale antistof fra hybridomacellen til identificering af ethvert monoklonalt antistof, som var i stand til at inhibere den phorbolester-medierede, LFA-l-afhængige, i 15 spontane aggregation af de EBV-transformerede B-celler.

Eftersom hybridomacellerne stammede fra celler, som aldrig havde støt på LFA-lantigenet, produceredes der intet monoklonalt antistof mod LFA-1. Ethvert antistof, som viste sig at inhibere aggregation må således være i 20 stand til at binde til et antigen som, skønt det ikke er LFA-1, deltager i LFA-l-adhæsionsprocessen. Skønt enhver fremgangsmåde til opnåelse af sådanne monoklonale antistoffer kan benyttes, foretrækkes det at opnå ICAM-l-bindingsmonoklonale antistoffer ved immunisering ^ 25 af BALB/C-mus, idet metoder og planer beskrevet af Rothlein, R. et al♦, (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)) benyttes med Epstein-Barr virustransformerede, perifere mononukleære blodceller fra mennesker med en LFA-l-defekt. Sådanne celler er angivet af Springer, 30 T.A., et al·., (J. Exper. Med. 160; 1901-1918 (1984)).

Ved en fremgangsmåde til frembringelse og påvisning af antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-l, immuniseres mus med enten EBV-transformerede B- ! 17 DK 176020 B1 celler, som eksprimerer både ICAM-1 og LFA-1 eller flere, fortrinsvis med TNF-aktiverede endotelceller, der eksprimerer ICAM-l, men ikke LFA-1. Ved den mest foretrukne fremgangsmåde til frembringelse af hybridomacel-5 ler, som producerer anti-ICAM-l-antistoffer, sekvensimmuniseredes en Balb/C-mus med JYceller og med differen- i .

tierede U937-celler (ATCC CRL1593). Miltcellerne fra sådanne dyr fjernedes, sammensmeltedes med myelomacel-! ler og fik lov til at udvikle i antistofproducerende I 10 hybridomaceller. Antistofferne underkastes screening for deres evne til at inhibere den LFA-l-afhængige, phorbolester-inducerede aggregation af en EBV-trans-j formeret celleline, såsom JY-celler, der eksprimerer både LFA-l-receptoren og ICAM-1. Som vist af Rothlein, I 15 R., et al., (J. Immunol. 137; 1270-274 (1987)), testes antistoffer, der er i stand til at inhibere en sådan aggregation, dernæst for deres evne til at inhibere den phorbolesterinducerede aggregation af en cellelinie, såsom SKW3 (Dustin, M., et al., J. Exper. Med.

20 165:672-692 (1987)) hvis evne til spontan aggregation i nærværelse af en phorbolester inhiberes af antistof, der er i stand til at binde LFA-l, men inhiberes ikke af anti-ICAM-l-antistoffer. Antistoffer, der er i stand til at inhibere den phorbolester-inducerede aggregation 25 af celler, såsom JY-celler, men som ikke er i stand til inhibere den phorbolesterinducerede aggregation af celler, såsom SKW3 celler er sandsynligvis anti-ICAM-l-antistoffer. Alternativt kan antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-l identificeres ved scree-30 ning for antistoffer, som er i stand til at inhibere den LFA-l-afhængige aggregation af LFA-ekspressionsceller (såsom JY-celler), men som ikke er i stand til at binde til celler, der eksprimerer LFA-l, men lidt DK 176020 B1

18 I

eller intet ICAM-1 (såsom normale granulocytter), eller som er i stand til at binde til celler, som eksprimerer ICAM-1, men ikke LFA-1 (såsom TNF-aktivierede endotelceller). Et andet alternativ er immunofældning 5 fra celler, der eksprimerer ICAM-1, LFA-1, eller begge, under anvendelse af antistoffer, der inhiberer den LFA-l-afhængige aggregation af celler, såsom JY-celler, og bestemmelse af nogle molekylegenskaber af molekylet, der udfældede med antistoffet gennem SDS-PAGE eller en 10 ækvivalent metode. Hvis egenskaberne er de samme som for ICAM-1, formodes det, at antistoffet er et · anti-ICAM-l-antistof.

Idet man benytter monoklonale antistoffer, der er fremstillet analogt med ovennævnte, rensedes ICAM-15 1-celleoverflademolekylet, og dets egenskaber bestemtes. ICAM-1 rensedes fra humane celler eller væv, idet monoklonal antistof affinitetschromatogra-fi benyttedes, ved en sådan fremgangsmåde kobles et monoklonalt antistof, der er reaktivt med ICAM-1 til en 20 inert kolonnematrix. Enhver fremgangsmåde til opnåelse af en sådan kobling kan benyttes; det foretrækkes imidlertid at benyttet fremgangsmåden beskrevet af Oettgen, H.C. et al., J. Biol. Chem. 259:12034 (1984)). Når et cellelysat passerer gennem matrixen adsorberes det til- i 25 stedeværende ICAM-1-molekyle og tilbageholdes af matrixen. ved at ændre pH-værdien eller ionkoncentrationen i kolonnen kan de bundne ICAM-l-molekyler elueres fra kolonnen. Skønt enhver egnet matrix kan benyttes, foretrækkes det, at anvende sepharose (Pharmacia) som ma-30 trixmaterialet. Fremstillingen af kolonnematricer, og deres anvendelse indenfor proteinrensning er velkendt indenfor teknikken.

På en måde som forstås af en fagmand, kan ovennævnte prøver benyttes til identificering af forbindel- 19 DK 176020 B1 ser, der er 1 stand til at dæmpe eller inhibere graden ! eller udstrækningen af cellulær adhæsion.

ICAM-1 er et celleoverfladeglycoprotein ekspri-meret på ikke-hematopoietiske celler, såsom vaskulære 5 endotelceller, thymusepitelceller, visse andre epitelceller, og fibroblaster, og på hæmatopoietiske celler, såsom vævsmakrofager, mitogen-stimulerede T-lymfocyt-blaster, og germinale, centrerede B-celler og dendrit-celler i tonsiler, lymfeknuder og "Peyer's-patches".

10 ICAM-1 eksprimeres stærkt på vaskulære endotelceller i T-celleområder i lymfeknuder og tonsiler, hvilken udviser reaktiv hyperplasia. ICAM-1 eksprimeres i små mængder på perifere blodlymfocytter. Phorbolester-stimuleret differentiering af nogle myelomonocytiske 15 cellelinier øger ICAM-l-ekspressionen kraftigt. ICAM-1 eksprimeres således fortrinsvis på steder med inflammation og eksprimeres generelt ikke af passive celler. ICAM-l-ekspression på dermale fibroblaster øges 3-5 gange med enten interleukin 1 eller γ-interferon i 20 koncentrationer på 10 U/ml i løbet af henholdsvis 4 eller 10 timer. Induktionen er afhængig af protein- og mRNA-syntese og er reversibel.

ICAM-1 udviser molekylvægtuensartethed i forskellige celletyper med en molekylvægt på 97 kd i fibro-25 blaster, 114 kd i den myelomonocytiske celleline U937 og 90 kd i B-lymfoblastoidcellen JY. ICAM-I-biosyntese har vist sig at involvere en ca. 73 kd intercellulær precursor. Den ikke-N-glycosylerede form, der stammer fra tunicamycinbehandling (som inhiberer glycosylering) 30 har en molekylvægt på 55 kd.

ICAM-1 isoleret fra phorbolesterstimulerede U937-celler eller fra fibroblastceller giver et tilsvarende stort produkt med en molekylvægt på 60 kd ef- 20 DK 176020 B1 ter kemisk deglycosylering. ICAM-l monoklonale antistoffer interfererer med adhæsionen af phytohæmaglu-tininblaster til LFA-l-mangelfulde celleliner. Prebe-handling af fibroblaster, men ikke lymfocytter, med 5 monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde ICAM-l, inhiberer lymfocyt-fibroblastadhæsion. Pre-behandling af lymfocytter, men ikke fibroblaster, med ! antistoffer mod LFA-1 har desuden vist sig at inhibere lymfocyt-fibroblastadhæsion.

10 ICAM-l er således CD 18 kompleksets bindings ligand på leukocytter. Det er inducerbart på fibroblaster og endotelceller in vitro ved inflammatoriske mediatorer, såsom IL-1, y-intérferon og tumornecrosis-faktor indenfor en tidsramme, der er i overensstemmelse 15 med infiltrationen af lymfocytter i inflammatoriske læsioner in vivo (Dustin, M.L., et al., J. Immunol 137:245-254, (1986); Prober, J.S., et. al., J♦ Immunol 137:1893-1896, (1986)). ICMA-1 eksprimeres yderligere på ikke-hæmatopoietiske celler, såsom vaskulære endotel-20 celler, thymusepitelceller, andre epitelceller, og fibroblaster og på hæmatopoietiske celler, såsom vævsmakrofager, mitogen-stimulerede T-lymfocytblaster, og germinalcenter-B-celler og dendritceller i tonsiler, lymfeknuder og "Peyer's patches" (Dustin, M.L. et.

25 al., Immunol 137:245-254, (1986)). ICAM-l eksprimeres på keratinocytter i godartede inflammationsskader såsom allergisk eksem, lichen ruber, exanthema, urticaria og sygdomme med blæredannelse. Allergiske hudreaktioner, provokeret ved påførsel af et hapten på huden 30 overfor hvilket patienten er allergisk, viste også en kraftig lCAM-1-ekspression på keratinocytter. På den anden side viste toxiske lapper på huden ikke icam-1-ekspression på keratinocytterne. ICAM-l findes på kera- 21 DK 176020 B1 tinocytter fra biopsier af hudskader fra forskellige dermatologiske sygdomme og ICAM-1-ekspression induceres på skader fra allergiske laptests, medens keratinocyt-ter fra toxiske laptestskader ikke eksprimerede 5 ICAM-1.

ICAM-1 er derfor et cellesubstrat til hvilket lymfocytter kan fæstnes, således at lymfocytterne kan ! migrere til steder med en inflammation og/eller gennemføre forskellige effektorfunktloner som bidrager 10 til denne inflammation. Sådanne funktioner omfatter produktionen af antistof, lysis af virusinficerede målceller, osv. Udtrykket "inflammation", sådan som det benyttes heri, har til hensigt kun at omfatte reaktioner fra det specifikke forsvarssystem. Sådan som 15 det benyttes heri har udtrykket "specifikt forsvarssystem" til hensigt at referere til den bestanddel i immunsystemet, som reagerer i nærværelse af specifikke antigener. Inflammation siges at opstå som en reaktion fra det specifikke forsvarssytem, hvis inflammationen 20 er forårsaget af, medieret af, eller knyttet til en reaktion fra det specifikke forsvarssytem. Eksempler på inflammationer, som opstår fra en reaktion fra det specifikke forsvarssystem omfatter reaktionen overfor antigener, såsom rubellavirus, autoimmunsygdomme, 25 forsinket type af hypersensitivitetreaktion medieret af T-celler (som det f.eks. ses hos mennesker, hvis test er "positiv" i Mantaux-testen), osv.

22 DK 176020 B1 C. Kloning af ICAM-1-genet.

Enhver af en række forskellige metoder kan benyttes til kloning til ICAM-l-genet. En sådan frem-5 gangsmåde medfører analyse af et shuttelvektorbibliotek af cDNA-indføjeiser (stammende fra en ICAM-l-eksprime-rende celle) for tilstedeværelsen af en indføjelse, som indeholder ICAM-l-genet. En sådan analyse kan gennemføres ved transfektions af celler med vektoren og dernæst 10 prøvning for ICAM-l-ekspression. Den foretrukne fremgangsmåde til kloning af dette gen medfører bestemmelse af ICAM-1-molekylets aminosyresekvens. Til gennemførsel af denne opgave skal ICAM-l-protein renses og analyseres af automatiserede sekvenatorer. Molekylet kan al-15 ternativt underkastes fragmentering med cyanogenbromid eller med proteaser, såsom papain, chymotrypsin eller trypsin (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257:9751-9758 (1982); Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein

Res. 21:209-215 (1983)).

20 Skønt det er muligt at bestemme ICAM-1's hele aminosyresekvens, foretrækkes det at bestemme molekylets peptidfragmentsekvens. Hvis peptidet er mere end 10 aminosyrer lang, er sekvensinformationen sædvanligvis tilstrækkelig til at man kan klone et gen, såsom 25 genet for ICAM-1.

Sekvensen af aminosyrerester i et peptid betegnes heri enten gennem anvendelsen af deres sædvanlige anvendte 3-bogstavsbetegnelser eller ved deres enkelt-bogstavsbetegnelser. En liste af disse 3-bog-30 stavs- og l-bogstavsbetegnelser kan findes i tekstbøger såsom Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY (1970). Når en sådan sekvens opføres lodret, er det hensigten at amino-terminal-resten skal 23 DK 176020 B1 stå øverst på listen og carboxy-terminal-resten af peptidet skal stå nederst på listen. Når sekvensen opføres vandret er det på samme måde hensigten at amino-terminal-resten skal stå til venstre, hvorimod 5 carboxy-terminal-resten skal stå til højre. Aminosyre-resterne i et peptid kan adskilles med bindestreger.

Sådanne bindestreger har alene til hensigt at lette en sekvenspræsentation. Som et rent illustrativt eksempel indikerer aminosyresekvensen betegnet: 10 -Gly-Ala-Ser-Phe- at en Ala-rest er bundet til Gly's carboxygruppe, og at i en Ser-rest er bundet til Ala-restens carboxygruppe og 15 til en Phe-rests aminogruppe. Betegnelsen indikerer yderligere at aminosyresekvensen indeholder tetrapepti-det Gly-Ala-Ser-Phe. Det er ikke hensigten at betegnelsen skal begrænse amiosyresekvensen til dette ene te-trapeptid, men det er hensigten at inkludere (1) tetra-20 peptidet indeholdende en eller flere aminosyrerester, bundet til enten dets amino- eller carboxyende, (2) tetrapeptidet indeholdende en eller flere aminosyrerester, bundet til begge dets amino- og carboxyender, (3) tetrapeptidet, som ikke indeholder yderligere ami-25 nosyrerester.

Når et eller flere egnede peptidfragmenter er blevet sekvenseret, undersøges DNA-sekvenser, der er i stand til at kode for dem. Fordi den genetiske kode er degenereret, kan mere end et codon benyttes til at 30 kode for en bestemt aminosyre (Watson, J.D., I: Molecular Biology of the Gene, 3. udg., W.A. Benjamin,

Inc., Menlo Park, CA (1977), s. 356-357). Peptidfragmenterne analyseres til identificering af sekvenser 24 DK 176020 B1 af aminosyrer, som kan kodes af oligonukleotider med den laveste grad af degenerering. Dette gennemføres fortrinsvis ved identificering af sekvenser, som indeholder amiosyrer, der kun kodes af et enkelt codon.

5 Skønt sådanne aminosyresekvenser en gang imellem kan kodes af kun et enkelt oligonucleotid kan amino-syresekvensen ofte kodes af et vilkårlig nucleotid fra et sæt af lignende oligonucleotider. Medens alle medlemmer af sættet indeholder oligonucleotider, som 10 er i stand til at kode for peptidfragmentet, og således potentielt indeholder den samme nucleotidsekvens som genet, der koder for peptidfragmentet, er det væsentligt at kun et medlem af sættet indholder en nucleotidsekvens, der er identisk med dette gens nukleotid-15 sekvens. Fordi dette medlem findes i sættet og er i stand til at hybridisere til dna, selv i nærværelse af andre medlemmer i sættet, er det muligt at benytte det ufraktionerede sæt af oligonucleotider på samme måde som man ville anvende en enkelt oligonucleotid til 20 kloning af genet, som koder for peptidet.

På en måde analogt med ovennævnte kan man anvende et oligonucleotid (eller sæt af oligonucleotider), som indeholder en nucleotidsekvens, som er komplementær til oligonucleotidsekvensen eller sættet 25 af sekvenser, der er i stand til at kode for peptidfragmentet.

Et egnet oligonucleotid eller sæt af oligonucleotider, som er i stand til at kode for et fragment af ICAM-l-genet (eller som er komplementær til 30 et sådant oligonucleotid, eller sæt af oligonucleotider) identificeres (idet ovennævnte fremgangsmåde benyttes), syntetiseres og hybridisers, ved metoder der er velkendte indenfor teknikken, overfor et DNA eller, 25 DK 176020 B1 mere foretrukket, et cDNA-præparat, som stammer fra humane celler, der er i stand til at eksprimere ICAM-1-gensekvenser. Metoder til nucleinsyrehybridisering er angivet af Maniatis, T. et al., I: Molecular Cloning, 5 a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982), og af Haymes, B.D. et al., I: Nucleic Acid Hybrizatlon, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), hvilke referencer er inkorporeret heri ved henvisning.

Den benyttede DNA eller cDNA kilde vil fortrinsvis være 10 blevet beriget for ICAM-l-sekvenser. En sådan be-rigeles kan meget nemt opnås ud fra cDNA opnået ved ekstraktion af RNA fra celler dyrket under betingelser som inducerer ICAM-l-syntese (såsom U937 dyrket i nærværelse af phorbolestere, osv.).

15 Teknikker såsom, eller svarende til dem, der er beskrevet ovenfor, har med succes muliggjort kloning af gener til human aldehyd-dehydrogenaser (Hsu, L.C.

et_al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 82:3771-3775 (1985)), fibronectin (Suzuki, S. et al., Eur. Mol.

20 Biol. Organ. J. £:2519-2524 (1985)), det humane estrogen-receptorgen (Walter, P. et al., Proc, Natl.

Acad. Sci. USA 82:7889-7893 (1985)), vævstype plasmino-gen-aktivator (Pennica, D. et al.. Nature 301:214-221 (1983)) og humant ende-placental-basisk-phosphatase-25 komplementært-DNA (Kam, W. et al♦, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 82:8715-8719 (1985)).

Ved en foretrukken alternativ fremgangsmåde til kloning af ICAM-l-genet fremstilles et bibliotek af ekspressionsvektorer ved kloning af DNA eller, mere fore-30 trukket cDNA, fra en celle, der er i stand til at eksprimere ICAM-1 ind i en ekspressionsvektor. Biblioteket screenes dernæst for medlemmer, der er i stand til at eksprimere et protein, som binder til anti- i i 26 DK 176020 B1 ICAM-l-antistof, og som har en nueleotidsekvens, der er i stand til at kode for polypeptider, som har den samme aminosyresekvens som ICAM-1 eller fragmenter af ICAM-l.

5 Det klonede ICAM-l-gen, opnået gennem ovennævnte fremgangsmåder, kan operabelt bindes til en ekspressionsvektor og introduceres i bakterie- eller eukaryo-tiske celler til produktion af ICAM-l-protein.

Teknikker for sådanne manipulationer er angivet af 10 Maniatis. T. et al., supra, og er velkendte indenfor teknikken.

D. Anvendelser af LFA-l-afhænqlqe aqqreqationsprøver. r 15

Ovennævnte prøve, hvor man er i stand til at måle LFA-l-afhængig aggregation kan benyttes til identifikation af mdiler, der virker som antagonister til inhibering af omfanget af LFA-l-afhængig aggregation.

20 sådanne antagonister kan virke ved at svække LFA-1 eller ICAM-11s evne til at formidle aggregation. Sådanne midler omfatter således immunoglobuliner, såsom et antistof der er i stand til at binde til enten LFA-1 eller ICAM-1. Ikke-immunoglobuline (dvs. kemiske) midler 25 kan yderligere undersøges under anvendelse af ovennævnte prøve, for at bestemme om de er antagonister til LFA-l-aggregation.

27 DK 176020 B1 E. Anvendelser af antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1 receptorproteiner.

I. Antl-lnflammatorlske midler.

5

Monoklonale antistoffer til medlemmer af CD 18-komplekset inhiberer mange leukocytters adhæsionsafhængige funktioner, herunder binding til endothelium (Haskard, D., et al., J ♦ Immunol. 137;2901-2906 10 (1986)), homotypiske adhæsioner (Rothlein, R., et al ♦, J. Exp. Med. 163:1132-1149 (1986)), antigen- og mitoge-ninduceret proliferation af lymfocytter (Davignon, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:4535-4539 (1981)), antistofdannelse (Fischer, A., et al., J.

15 Immunol. 136:3198-3203 (1986)), og alle leukocytters effektorfunktioner, såsom cytotoxiske T-cellers lytiske : aktivitet (Krensky, A.M., et al ♦ J ♦ Immunol. 132: 2180-2182 (1984)), makrofager (Strassman, G., et al.

J. Immunol. 136:4328-4333 (1986)), og alle celler in-20 volveret i antistof-afhængige cellecytotoxiske reaktioner (Kohi, S., et al., J. Immunol. 133:2972-2978 (1984)). I alle ovennævnte funktioner inhiberer antistofferne leukocyttens evne til at hæfte til det passende cellesubstrat, som på sin side inhiberer det en-25 delige resultat.

Som omtalt ovenfor er bindingen af ICAM-l-mole-kyler til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler af stor vigtighed ved cellulær adhæsion. Gennem adhæsionsprocessen er lymfocytter i stand til kontinuert at un-30 dersøge et dyr for nærværelsen af fremmede antigener.

Skønt disse processer normalt er ønskelige, er de også årsagen til organtransplantationafvisning, vævstransplantationafvisning og mange autoimmune sygdomme. Et- 28 DK 176020 B1 hvert middel, der er i stand til at dæmpe eller inhibe-re cellulær adhæsion, vil således være meget ønskværdigt hos patienter, der underkastes organtransplantationer, vævstransplantationer eller hos autoimmune 5 patienter.

Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1 er særdeles egnede som anti-inflammatoriske midler hos et pattedyr. Sådanne midler adskiller sig i væsentlig grad fra sædvanlige anti-10 inflammatoriske midler, idet de er i stand til selektiv inhiberende adhæsion og ikke giver andre bivirkninger såsom nephrotoxicitet, som findes hos sædvanlige midler. Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1 kan derfor benyttes til at hindre 15 organ- eller vævsafvisning, eller modificere autoimmune reaktioner uden frygt for sådanne bivirkninger hos pattedyret.

Det er af stor vigtighed, at anvendelsen af monoklonale antistoffer, der er i stand til at genkende 20 ICAM-1 muliggør gennemførsel af organtransplantationer selv mellem individer med stort HLA-uensartethed.

29 DK 176020 B1 2. Suppressorer af forsinket-type-hypersensitlvi-tetsreaktion.

Da ICAM-l-molekyler oftest eksprimeres på 5 steder med inflammation, såsom de steder, der er involveret i forsinket-type-hypersentitivitetsreaktion har antistoffer (især monoklonale antistoffer), der er i stand til at binde til ICAM-l-molekyler terapeutisk mulighed for at dæmpe eller eliminere sådanne 10 reaktioner. Denne mulige terapeutiske anvendelse kan udnyttes på to måder. For det første kan et middel indeholdende et monoklonalt antistof overfor ICAM-1 administreres til en patient, der lider af forsinket-type-hypersensitivitetsreaktion. Sådanne midler kan 15 f.eks. gives til et individ, som har været i kontakt med antigener såsom giftig efeu, giftig eg, osv. Ved en anden udførelsesform administreres det monoklonale antistof, der er i stand til at binde til ICAM-1, til en patient sammen med et antigen, for at hindre en 20 efterfølgende inflammationsreaktion. Denne co-administrering af et antigen og et ICAM-1-bindende monoklonalt antistof kan således midlertidigt få et individ til i det efterfølgende at tolerere udsættelse for dette gen.

25 3. Behandling af kronisk lnflammationssyqdom.

Eftersom LAD-patienter som mangler LFA-l ikke 30 opnår en inflammatorisk reaktion, formodes det at antagonisme af LFA-l's naturlige ligand, ICAM-l også vil inhibere inflammatorisk reaktion. Antistoffers evne til overfor ICAM-1 at inhibere inflammation tilvejebringer 30 DK 176020 B1 det grundlæggende for deres terapeutiske anvendelse ved behandlingen af kroniske inflammationssygdomme og autoimmune sygdomme, såsom lupus erythematosus, autoimmune thyroiditis, ekperimental allergisk encephalomyelitis 5 (EAE) multipel sclerosis, nogle former for diabetes Reynaud’s syndrom, rheumatoid arthritis, osv. De mono-klonale antistoffer, der er i stand til at binde ICAM-1, kan sædvanligvis anvendes til behandingen af disse sygdomme, der for tiden behandles gennem steroid-10 terapi.

4. Diagnostiske og prognostiske anvendelser.

15

Da ICAM-l oftes eksprimeres på steder med inflammation kan monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, anvendes som et middel til at beskrive eller visualisere steder med infektion og 20 inflammation hos en patient, ved en sådan anvendelse mærkes de monoklonale antistoffer detekterbart gennem anvendelsen af radioisotoper, affinitetsmærker (såsom biotin, avidin, osv.) fluorescerende markører, para-magnetiske atomer, osv. Fremgangsmåder til gennemførsel 25 af en sådan mærkning er velkendt inden for teknikken.

Klinisk anvendelse af antistoffer til diagnostisk beskrivelse er angivet af Grossman, H.B., Urol. Clin.

North Arner. 13::465-474 (1986)), Unger, E.C. et al..

Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)), og Khaw, B.A. et 30 al., Science 209:295-297 (1980)).

Tilstedeværelsen af inflammationen kan desuden påvises gennem anvendelsen af bindingsligander, såsom mRNA, cDNA eller DNA, som binder til ICAM-l- 31 ' DK 176020 B1 gensekvenser eller til ICAM-l-mRNA-sekvenser hos celler som eksprlmerer ICAM-1. Teknikker og gennemførelse af sådanne hybridiseringsprøver er beskrevet af Maniatais, T. (supra).

5 Påvisningen af fod af sådanne detekterbart mær kede antistoffer er angivende for et sted med inflammation eller tumorudvikling. Ved en udførelses form gennemføres denne undersøgelse for inflammation ved at fjerne vævsprøver eller blod og inkubere sådanne prøver 10 i nærværelse af detekterbart mærkede antistoffer. Ved en foretrukken udførelsesform gennemføres denne teknik på en ikke-invasiv måde gennem anvendelse af magnetisk billedoptagelse, fluorografi, osv. En sådan diagnostisk test kan benyttes ved overvågning af organtransplanta-15 tionsafvisninger for tidlige tegn på potentiel vævsafvisning. Sådanne prøver kan desuden gennemføres i forsøg på at bestemme et individs predilektion for rheumatoid arthritis eller andre kroniske inflammationssygdomme.

20 5. Supplement til introduktionen af antlqent materiale administreret til terapeutiske og diagnostiske formål.

25

Immunreaktioner overfor terapeutiske eller diagnostiske midler, såsom bovin insulin, interferon, ' vævstype-palsminogen-aktivator eller murine monoklonale antistoffer, svækker i det væsentlige den terapeutiske 30 eller diagnostiske værdi af sådanne midler, og kan faktisk forårsage sygdomme såsom serumsygdom. En sådan situation kan afhjælpes gennem anvendelsen af de omhandlede antistoffer. Ved denne udførelsesform vil så- 32 DK 176020 B1 danne antistoffer blive administreret sammen med et terapeutisk eller diagnostisk middel. Tilsætningen af antistofferne hindrer modtageren i at genkende midlet og hindre derfor modtageren i initiering af immun-5 reaktion overfor dette. Fravær af en sådan immunreaktion gør det muligt for patienten at modtage yderligere administreringer af det terapeutiske eller diagnostiske middel.

i 10 F. Anvendelser af intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1).

ICAM-i er en bindingspartner af LFA-1. ICAM-1 15 eller dets funktionelle derivater kan som sådan anvendes ombytteligt med antistoffer, der er i stand til at binde til LFA-1, ved behanding af sygdom. I opløst form kan sådanne molekyler således anvendes til in-hibering af inflammation, organafvisning, vævsafvis-20 ning, osv. ICAM-1 eller dets funktionelle derivater kan benyttes på samme måde som anti-ICAM-l-antistoffer til at mindske immunogeniciteten af terapeutiske eller diagnostiske midler.

ICAM-1, dets funktionelle derivater og dets 25 antagonister kan benyttes til blokering af metastasis eller proliferation af tumorceller, som eksprimerer enten ICAM-1 eller LFA-1 på deres overflader. En lang række fremgangsmåder kan benyttes til opnåelse af et sådant mål. Migreringen af hæmatopoietiske celler kræ-30 ver f.eks. LFA-l-ICAM-1-binding. En sådan bindingsantagonist undertrykker derfor denne migrering og blokerer metastasis af tumorceller af leukocyt-herkomst. Toxin-derivatiserede molekyler, der er i 33 .

DK 176020 B1 stand til at binde til enten ICAM-1 eller et medlem af LFA-l-familien af molekyler kan alternativt administreres til en patient. Når sådanne toxinafledte molekyler binder til tumorceller, der eksprimerer ICAM-1 eller et 5 medlem af LFA-l-familien af molekyler, dræber tilstedeværelsen af toxinet tumorcellerne, hvorved proliferation af tumoren inhiberes.

^ G. Anvendelser af ikke-immunoglobuline antagonister af ICAM-1-afhængig adhæsion.

ICAM-l-afhængig adhæsion kan Inhiberes ved ikke-immunoglobuline antagonister, der er i stand til at binde til ICAM-l eller LFA-1. Et eksempel på en ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1, er LFA-1. Et eksempel på en ikke-immunoglobulin antagonist, som binder til LFA-1, er ICAM-1. Gennem anvendelsen af de ovennævnte prøver, kan ikke-immunoglobuline antagonister 20 yderligere identificeres og renses. Ikke-immunoglobuline antagonister af ICAM-l-afhængig adhæsion kan benyttes til det samme formål som antistoffer til LFA-1 eller antistoffer til ICAM-1.

25 H. Administrering af de omhandlede midler.

De terapeutiske virkninger af ICAM-1 kan opnås ved at forsyne en patient med hele ICAM-1-molekylet el-30 ler ethvert terapeutisk aktivt peptidfragment deraf.

ICAM-1 og dets funktionelle derivater kan opnås enten syntetisk, gennem anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi eller ved proteolysis. De terapeutiske forde- ' 34 DK 176020 B1 le ved ICAM-l kan øges gennem anvendelsen af funktionelle derivater af ICAM-l, der indeholder yderligere tilsatte aminosy rerester, for at øge koblingen til bærere eller øge aktiviteten af ICAM-l. Opfindelsen 5 omfatter yderligere funktionelle derivater af ICAM-l, som mangler visse aminosyrerester, eller som indeholder ændrede aminosy rerester, så laenge sådanne derivater besidder evnen til celluæradhæsionspåvirk-ning.

10 Både de omhandlede antistoffer og det nævnte ICAM-l-molekyle siges at være "i det væsentlige uden naturlig forurening", hvis præparaterne, som indeholder disse, 1 det væsentlige ikke indeholder materialer, som normalt og naturligt findes i disse produkter.

15 Når man giver en patient antistoffer, eller fragmenter deraf, der er i stand til at binde til ICAM-l, eller når man giver ICAM-l (eller i fragment, variant eller derivat deraf) til en.modtagende patient, vil dosis af administreret middel variere afhængigt af 20 faktorer såsom patientens alder, vægt, højde, køn, generel medicinsk tilstand, tidligere medicinsk historie, osv. Det er sædvanligvis ønskeligt at forsyne modtageren med en dosis antistof, som ligger indenfor området fra ca. 1 pg/kg til ca. 10 mg/kg 25 (patientens kropsvægt), skønt en mindre eller større dosis kan administreres. Når man til en patient fører ICAM-l-molekyler eller deres funktionelle derivater, foretrækkes det at administrere sådanne molekyler i en dosis, som også ligger indenfor fra ca. 1 pg/kg til 10 30 mg/kg (patientens kropsvægt) skønt en mindre eller større dosis også kan administreres.

Som omtalt nedenfor kan den terapeutiske virkningsfulde dosis mindskes, hvis anti-ICAM-l-anti- DK 176020 B1 . 35 · stoffet co-administreres med et anti-LFA-l-antistof.

Som benyttet heri siges to antistoffer (eller deres funktionelle derivater) at blive co-administreret til en patient, hvis de har været administreret til patien-5 ten indenfor et tidsrum, således at begge forbindelser kan påvises i patientens serum.

Både antistoffet, der er i stand til at binde til ICAM-l, og ICAM-1 i sig selv kan administreres til ! patienter intravenøst, intramuskulært, subkutant, en- 10 teralt eller parenteralt. Når antistof eller ICAM-1 administreres ved injektionen kan administreringen ske ved kontinuær infusion, eller ved enkel eller mange boli.

Det er med de omhandlede anti-inflammatoriske 15 midler tilsigtet at give dem til modtagende individer i en mængde, der er tilstrækkelig til at undertrykke inflammation. En mængde siges at være tilstrækkelig til at "undertrykke" inflammation, hvis dosis, administrationsmåde, osv af midlet, er tilstrækkelig til at dæmpe 20 eller hindre inflammation.

De omhandlede anti-inflammatoriske midler kan tilføres enten før eller ved indtrædelse af inflammation (for at undertrykke den forventede inflammation) eller efter start af inflammation.

25 Et middel siges at være "farmakologisk accepta belt" hvis dets administrering kan tolereres af en modtagende patient. Et sådant middel siges at blive administreret i en "terapeutisk virkningsfuld mængde", hvis den administrerede mængde er fysiologisk signifi-30 kant. Et middel er fysiologisk signifikant, hvis dets tilstedeværelse resulterer i en påviselig ændring i fysiologien hos en modtagne patient.

Antistoffet og ICAM-lmolekyler kan formuleres i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder til frem- 36 DK 176020 B1 stilling af farmaceutisk nyttige midler, hvor disse materialer eller deres funktionelle derivater kombineres i en blanding med en farmaceutisk acceptabel bærevehikel. Egnede vehikler og deres formulering, herunder , 5 andre humane proteiner, f.eks. humant serum albuminer beskrevet f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences (16. ud., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1980)). For at danne et farmaceutisk acceptabelt middel, der er egnet til effektiv administrering, vil sådanne midler 10 indeholde en virkningsfuld mængde af anti-ICAM-l-anti-stof eller ICAM-1-molekyle eller deres funktionelle derivater, sammen med en egnet mængde af et bærevehikel.

Yderligere farmaceutiske fremgangsmåder kan anvendes til at kontrollere virkningsvarigheden. Præpara-15 ter med kontrolleret frigivelse kan opnås ved anvendelsen af polymere til kompleksdannelse eller absorption af anti-lCAM-l-antistof eller ICAM-1 eller deres funktionelle derivater. Den kontrollerede tilførsel kan gennemføres ved at vælge passende makromolekyler 20 (f.eks. polyestere, polyaminosyrer, polyvinyl, pyrroli-don, ethylenvinylacetat, methylcellulose, carboxymet-hylcellulose eller protamin, sulfat) og koncentrationen af makromolekyler samt fremgangsmåderne til inkorporering, for at kontrollere frigivelse. En anden egnet 25 fremgangsmåde til at kontrollere virkningsvarighed hos præparater med kontrolleret frigivelse er inkorporering af anti-ICAM-l-antistof eller ICAM-1-molekyler, eller deres funktionelle derivater, i partikler af et polymert materiale, såsom polyestere, polyaminosyrer, hy-30 drogeler, poly(mælkesyre)- eller ethylenvinylacetatco-polymerer. I stedet for inkorporering af disse midler i de polymere partikler er det alternativt muligt at omslutte disse materialer i mikrokapsler fremstillet 37 · DK 176020 B1 f.eks. ved coacerveringsteknikker eller ved interfaci-al polymerisation, f.eks. henholdsvis hydroxymethyl-cellulose- eller gelatinemikrokapsler og poly(methyl-methacrylat)mlkrokapsler eller 1 kolloide medikament-5 tilførselssystemer, f.eks. llposomer, albumin mikro-spherer, mikroemulsioner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsioner. Sådanne teknikker er beskrevet i Reminton's Pharmaceutical Sciences (1980).

Opfindelsen belyses nu nærmere ved hjælp af de 10 efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Dyrkning af pattedyrceller.

De omhandlede EBV-transformerede og hybridoma-15 celler opbevaredes sædvanligvis i RMPI 1640 dyrkningsmedium, suppleret med 20 mM L-glutamin, 50 yg/ml gentamicin og 10% fetal bovin- (eller fetal kalve-) sera. Cellerne dyrkedes ved 37°C i en atmosfære med 5% C02, 95% luftfugtighed.

20 Til etablering af Epstein-Barr virus-(EBV-) transformanter inkuberedes 106 T-celle-fattige perifere mononukleære blodceller/ml i RPMI 1640 medium, suppleret med 20% fetal kalveserum (PCS), og 50 yg/ml gentamicin i 16 timer med EBV-holdig supernatant af 25 B95-8-celler (Thorley-Lawson, D.A. et al., J. Exper.

Med. 146:495 (1977)). Celler i 0,2 ml aliquot anbragtes i 10 mikrotiter brønde. Mediet erstattedes med RPMI 1640 medium (suppleret med 20% fetal kalveserum og 50 yg/ml gentamicin) indtil cellervækst konstateredes.

30 cellerne voksede i de fleste brønde og ekspanderes i det samme medium. Phytohæmagglutinin (PHA)-blaster etableredes ved 106 celler/ml i RPMI 1640 medium (suppleret med 20% fetal kalveserum) indeholdende en 38 DK 176020 B1 1:800 fortynding af PHA-P (Difco Laboratories, inc., Detroit, Ml). PHA-linler ekspanderedes med interleukin 2 (IL-2)-konditioneret medium og pulseredes ugentlig med pha (Cantrell, D.A. et al., J. Exper. Med.

5 158:1895 (1983)). Ovennævnte fremgangsmåde er angivet af Springer, T. et al., J. Exper. Med♦ 160:1901-1918 (1984). Celler opnået gennem ovennævnte fremgangsmåde screenes dernæst med anti-LFA-l-antistoffer til bestemmelse af hvorvidt de eksprimerer LFA-1-antigenet.

10 sådanne antistoffer er angivet af Sanches-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785 (1983).

Eksempel 2.

Prøver for cellulær aggregation og adhæsion.

15 For at prøve udstrækningen af cellulær adhæsion anvendtes aggregationsprøver. De i sådanne prøver benyttede cellelinier vaskedes 2 gange med RPMI 1640 medium indeholdende 5 mM Hepes-puffer (Sigma Chemical Co., St. Louis) og genopslæmmedes til en koncentration 20 på 2 x 106 celler/ml. Til fladbundede, 96-brøndes mikrotiterplader (no. 3596; Costar, Cambridge, MA) sattes 50 μΐ af passende monoklonalt antistof-supernatant eller 50 yl komplet medium med eller uden rensede monoklonale antistoffer, 50 μΐ fuldstændigt medium in-25 deholdende 200 ng/ml af phorbolesteren, phorbolmyrista-tacetat (PMA) og 100 yl celler i en koncentration på 2 x 106 celler/ml i fuldstændigt medium. Dette gav en endelig koncentration på 50 ng/ml PMA og 2 x 105 celler/brønd. Cellerne fik lov *til spontant at sætte 30 sig, og graden af aggregationen registreredes på forskellige tidspunkter. Resultater lå på fra 0-5+, hvor 0 indikerer at i det væsentlige ingen celler fandtes i klynger; 1+ indikerede at højst 10% af cellerne 39 DK 176020 B1 var i aggregater; 2+ indikerede at højst 50% af cellerne var samlet; 3+ indikerede at op til 100% af cellerne var i små, løse klynger; 4+ indikerede at op-til 100% af cellerne var samlet i større klynger; 5 og 5+ indikerede at 100% af cellerne var i store meget kompakte aggregater. Til opnåelse af et mere kvantitativt estimat af cellulær adhæsion sattes reagenser og celler til 5 ml polystyrenrør på samme måde som ovenfor. Tuberne anbragtes i et stativ på en rotations-10 ryster ved 37°C. Efter en time ved ca. 200 omdr./min. anbragtes 10 μΐ cellesuspensionen i et hæmocytometer og antallet af frie celler bestemtes. Procent aggregation betemtes ved den følgende ligning: χ15 % aggregation = 100 x (1 - antal frie celler \ antal tilførte celler /

Antallet af tilførte celler i ovennævnte formel er antallet af celler per ml i et kontrolrør, der kun 20 indeholder celler og fuldstændigt medium som ikke er blevet inkuberet. Antallet af frie celler i ovennævnte ligning svarer til antallet af ikke-aggregerede celler per ml fra eksperimentalrør. Ovennævnte fremgangsmåde er beskrevet af Rothlein, R., et al., J.Exper. Med.

25 163:1132-1149 (1986).

Eksempel 3.

LFA-l-afhængig cellulær aggregation.

Den kvalitative aggregationsprøve beskrevet i 30 eksempel 2 gennemførtes med anvendelse af den Epstein-Barr-transformerede cellelinie JY. Ved tilsætning af PMA til dyrkningsmediet i mikrotiterpladerne observeredes aggregation af celler. Tidsforkortede videooptagel- 40 DK 176020 B1 ser viste, at JY-celler på bunden af mikrotiterbrøndene var bevægelige og udviste aktiv membrankrusning og pseudopodiabevægelse. Kontakt mellem nabocellers pseu-dopodia resulterede ofte i celle-celleadhærence. Hvis 5 adhærence fastholdtes bevægede området med cellekontakt sig til uropodet. Kontakt kunne opretholdes til trods for kraftige cellebevægelser og cellernes trækken i forskellige retninger. Den primære forskel mellem PMA-behandlede og ubehandlede celler viste sig at være 10 stabiliteten af disse kontakter når de først var dan net. Med PMA udvikledes klynger af celler, der voksede i størrelse efterhånden som yderligere celler hæftedes til deres periferi.

Som et andet middel til måling af adhæsion be-15 nyttedes den kvantitative prøve beskrevet i eksempel 2. Cellesuspensioner rystedes rystedes ved 200 omdr./min. i 2 timer, overførtes til et hæmocytometer, og celler, der ikke var i aggregater optaltes. 1 fravær af PMA var 42% (standardafvigelse = 20%, N = 6) af JY-cellerne i 20 aggregater efter 2 timer, medens JY-celler inkuberet under identiske betingelser med 50 ng/ml PMA havde 87% (standardafvigelse = 8%, N = 6) af cellerne i aggrega-j ter. Kinetiske studier af aggregation viste at PMA øge- \ de hastigheden og størrelsen på alle testede tidspunk- 25 ter (fig. 3).

Eksempel 4.

Inhlbering af aggregation af celler under anvendelse af anti-LFA-l-monoklonale antistoffer.

30 Por at undersøge virkningen af anti-LFA-1 mono- klonale antistoffer på PMA-induceret cellulær aggregation sattes sådanne antistoffer til celler inkuberet i overensstemmelse med den kvalitative aggregationsprøve 41 DK 176020 B1 fra eksempel 2. De monoklonale antistoffer viste sig at inbibere dannelsen af celleaggregater enten i nærværelse eller fravær af PMA. Både F(ab* )2- og Fab' -fragmenterne af monoklonale antistoffer var overfor 5 LFA-l's α-kæde i stand til at inhibere cellulær aggregation. Hvor i det væsentlige 100% celler dannede aggregater fravær af anti-LFA-l-antistof viste det sig at højst 20% af cellerne var i aggregater når antistof tilsattes. Resultaterne af dette forsøg er beskrevet af 10 Rothlein, R, et_al. (J. Exper. Med. 163:1132-1149 (19Θ6).

Eksempel 5.

Cellulær aggregation behøver LFA-1-receptoren.

15 EBV-transformerede lymfoblastoidceller frem stilledes fra patienter analogt med metoden beskrevet i eksempel l. Sådanne celler underkastedes screening over for monoklonale antistoffer, der er i stand til at genkende LFA-l og cellerne viste sig at være LFA-1-mangel-20 fulde.

Den kvalitative aggregationsprøve beskrevet i eksempel 2 anvendtes, idet de ovennævnte LFA-1-mangelfulde celler benyttedes. Sådanne celler var ikke i stand til spontant at danne aggregater, selv i nær-25 værelse af PMA.

Eksempel 6

Optagelsen af ICAM-1.

De LFA-l-mangelfulde celler fra eksempel 5 mær-30 kedes med carboxyfluoresceindiacetat (Patarroyo, M. et al., Cell. Immunol. 63^:237-248 (1981)). De mærkede celler blandedes i et forhold på 1:10 med autologe eller JY-celler, og procentdelen af fluorescein-mærkede i ·' 42 DK 176020 B1 celler i aggregatet bestemmes 1 overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., J♦ Exper. Med. 163:1132-1149 (19Θ6). De LFA-l-mangelfulde celler viste sig at være i stand til at coaggregere med LFA-1 5 eksprimerende celler (fig. 4).

For at afgøre om LFA-1 kun var vigtig ved dannelse af aggregater eller ved deres bevarelse sattes antistoffer, der er i stand til.at binde til LFA-1, til de ovennævnte præformede aggregater. Tilsætningen af antistof viste sig kraftigt at sprænge den præformede aggregation. Tidsforkortet videooptagelse bekræftede at tilsætningen af de monoklonale antistoffer til præformede aggregater startede sprængning indenfor 2 timer (Tabel. l). Efter tilsætning af monoklonale antistoffer 15 mod LFA-1, fortsatte pseudopodiale bevægelser og formændringer hos individuelle celler indenfor aggregatet uændret. Individuelle celler disassocierede gradvis fra aggregatets periferi; efter 8 timer var de fleste celler dispergerede. ved baglæns kørsel af tidsforkortet 20 videooptagelse viste sprængningen af præformede aggregater med LFA-1-monoklonale antistoffer at være ækvivalent med aggregationsprocessen i fravær af LFA-i-monoklonalt antistof.

DK 176020 B1 43

Tabel 1

Antl-LFA-l-monoklonale antistoffers evne til at sprænge præformede PMA-inducerede JY-celler-aggregater.

5

Forsøg Aqqreqatlonsreqistrerinq 18 timer _2 timer8_-mAb_+mAb_ 10 14+ 4+ l+b 2 3+ 4+ 1+c 3 _5+_5+ 1+^_

Aggregation i den kvalitative mikrotiter-pladeprøve re-15 gistreredes visuelt. Med anti-LFA-1 tilstede gennem prøveperioden var aggregationen højst 1+.

20 aMængden af aggregation lige før tilsætning af mono-klonalt antistof efter 2 timer.

hTSl/ie + TS1/22.

CTS1/18.

25 dTSl/22.

DK 176020 B1 44

Eksempel 7.

Nødvendigheden af divalente Ioner til LFA-l-afhænqlg aggregation.

LFA-l-afhængige adhæsioner mellem cytotoxiske 5 τ-celler og målceller kræver tilstedeværelsen af magnesium (Martz, E. J. Cell. Biol♦ 84:584-598 (1980)).

PMA-induceret JY-celleaggregation testedes for divalent kationafhængighed. JY-celler dannede ikke aggregater (idet prøven fra eksempel 2 benyttedes ) i medium 10 uden calcium- eller magnesiumioner. Tilsætningen af divalent magnesium understøttede aggregation ved koncentrationer helt ned til 0,3 mM. Tilsætningen af calciumioner alene havde ringe effekt. Calciumioner viste sig imidlertid at øge magnesirunioners evne til 15 at understøtte PMA-induceret aggregation. Når 1,25 mM calciumioner sattes til mediet, viste magnesium-ionkoncent rat ioner helt ned til 0,02 mM at støtte aggregationen. Disse data viser at den LFA-1 afhængige aggregation af celler kræver magnesiumioner, og at 20 calciumioner, skønt de i sig selv er utilstrækkelige, kan virke synergistisk med magnesiumioner til at give mulighed for aggregation.

Eksempel 8 25 isoleringen af hybrldomaceller, der er 1 stand til at eksprlmere antl-ICAM-l-monoklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, isoleredes i overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al♦, J. Immunol.

30 137:1270-1274 (1966). 3 BALC/C-mus immuniseredes intra-peritonealt med EBV-transformerede perifere blod-mononukleære celler fra et LFA-1-mangelfuldt individ (Springer, T.A. et al♦, J. Exper. Med. 160:1901 45 DK 176020 B1 (1984)). Ca. 107 celler i i ml RPMI 1640 medium benyttedes for hver immunisering. Immuniseringerne administreredes 45, 29 og 4 dage før miltceller fjernedes fra musene til produktion af de ønskede hybridoma-5 cellelinier. På dag 3 før fjernelsen af miltcellerne modtog musene yderligere 107 celler i 0,15 ml medium (intravenøst).

Isolerede miltceller fra ovennævnte dyr fusioneredes med P3X7 3Ag6.653 myelomaceller i et forhold på 10 4:1 i overensstemmelse med Galfre, G. et al♦, Nature 266:550 (1977). Aliquoter af de opnåede hybridomaceller introduceredes i 96-brønde mikrotiterplader.

Hybridomasupernatanterne underkastedes screening for inhibering af aggregation og én inhiberende hybridoma 15 (af over 600 testede brønde) klonedes og subklonedes ved grænsefortynding. Denne subklon betegnede RRl/l.l.i (herefter betegnet "RR1/1").

Monoklonalt antistof RR1/1 viste sig i det væsentlige at inhibere den LFA-l-eksprimerede celle-20 linile . JY's PMA-stimulerede aggregation. Det RRl/l-monoklonale antistof inhiberede aggregation tilsvarende, eller en smule mindre end visse monoklonale antistoffer til LFA-1-α eller -β-underenheder. Kontrol-monoklonalt antistof over for HLA, som eksprimeres rl-25 geligt på JY-celler inhiberede i modsætning hertil ikke aggregation. Antigenet bundet af monoklonalt antistof RR1/1 defineres som det intercellulære adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1).

DK 176020 B1 46

Eksempel 9.

Anvendelse af anti-lCAM-l-monoklonale antistoffer til karakterisering af ICAM-1 molekylet.

For at bestemme ICAM-l's natur og Især hvorvidt 5 iCAM-i var forskellig fra LFA-1, lmmunofældedes celleproteiner under anvendelse af monoklonalt antistof rri/1. Immunopræcipitationen gennemføres i overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)). JY-celler lyseredes 10 ved 5 x 107 celler/ml i 1% Triton X-100, 0,14 m NaCl,

10 mM Tris, pH 8,0, med frisk tilsat 1 mM phenylmethyl-sulfonylfluorid, 0,2 enheder per ml trypsin-inhibitor-aprotinin (lysis puffer) i 20 minutter ved 4°C. Lysatet centrifugeredes ved 10.000 x g i 10 min. og præklaredes 15 med 50 yl af en 50%'s suspension af CNBr-aktiveret, glycin-quenched Sephrose C1-4B i 1 time ved 4eC. 1 ml lysat immunopræcipiteredes med 20 yl af en 50%' s suspension af monoklonalt antistof RRl/i koblet til Sepharose C1-4B (1 mg/ml) natten over ved 4eC

20 (Springer, T.A. et al♦, J. Exper. Med. 160:1901 (1984)). Sepharose-bundet monoklonalt antistof fremstilledes, idet CNBr-aktivering af Sepharose CL-4B i carbonat-puffer benyttedes, i overensstemmelse med fremgangsmåden af March, S. et al. (Anal. Blochem. 60:149 (1974)).

25 vaskede immunopræcipitater underkastedes SDS-PAGE og sølvfarvning i overensstemmelse med fremgangsmåden af Morrissey, J.H. Anal. Biochem. 117:307 (1981).

Efter eluering af proteiner med SDS-prøvepuffer (Ho, M.K. et al., J. Biol. Chem. 258-636 (1983)) ved 30 ioo*C, halveredes prøverne og udsattes for elektrofore-se (SDS-8% PAGE) under reducerende (fig. 5A) eller ikke-reducerende betingelser (fig. 5B). Bånd med molekylvægte på 50 kd og 25 kd svarede til de tunge og let- 47 DK 176020 B1 te kæder af immunoglobuliner fra det monoklonale antistof Sepharose (fig. 5A, bane 3). Varierende mængder af andre bånd i 25-50 kd vægtområdet observeredes desuden, men ikke i præcipitater fra lodne leukemiaceller, som 5 kun gav et 90 kd molekylvægtbånd. LFA-l's I77kd a-underenhed og 95 kg β-underenhed viste sig at migrere forskelligt fra ICAM-l under både reducerende (fig. 5A, bane 2) og ikke-reducerende (fig. 5B, bane 2) betingelser.

10 For at bestemme monoklonalt antistof RRl/l's virkning på PHA-lymfoblast-aggregation anvendtes den kvantitative aggregationsprøve beskrevet i eksempel 2. T-celle-blastceller stimuleredes således i 4 dage med PHA, vaskedes grundigt og dyrkedes dernæst i 6 dage 15 i nærværelse af il-2 konditioneret medium. PHA viste sig at blive internaliseret under denne 6 dages dyrkning og bidrog ikke til aggregationsprøven. I tre forskellige prøver med forskellige T-celle-blastpræparat inhiberedes ICAM-l monoklonale antistoffer aggregation 20 ensartet (Tabel 2).

DK 176020 B1 48

Tabel 2

Inhibering af PMA-stimuleret PHA-lymfoblast aggregation af RR1/1 monoklonalt antistof8 5 % %

Forsøg PMA Mab_Aggregation Inhibering - Kontrol 9 --- + Kontrol 51 0 10 + HLA-A,B 58 -14d + LFA-1-α 31 39 + ICAM-1 31 39 2e - Kontrol 10 --- + Kontrol 78 0 15 + LFA-l-p 17 78 + ICAM-1 50 36 3f - ----- 7 + Kontrol 70 + HLA-Α,Β 80 -14 20 + LFA-3 83 -19 + LFA-1-α 2 97 + LFA-1-β 3 96 + ICAM-1 34 51 25

Aggregation af PHA-inducerede lymfoblaster stimuleret med 50 ng/ml PMA mængdebestemtes indirekte ved mikroskopisk tælling af antallet af ikke-aggregerede celler som beskrevet i eksempel 2.

30 bProcent inhibering i forhold til celler behandlet med PMA og X63 monoklonalt antistof.

Aggregation måltes 1 time efter den samtidige til- 49' DK 176020 B1 sætning af monoklonalt antistof og PMA. Celler rystedes ved 175 omdr./min.

^Et negativt tal indikerer procent aggregationsfor-5 øgelse.

Aggregation måltes 1 time efter den samtidige tilsætning af et monoklonalt antistof og PMA. Celler pelleteredes ved 200 x G i 1 min., inkuberedes ved 10 37°C i 15 min., resuspenderedes forsigtigt og rystedes i 45 min. ved 100 omdr./min.

^Celler præbehandledes med PMA i 4 timer ved 37°C. Efter at monoklonalt antistof var tilsat inkuberedes rør-15 ene ved 37°C stationært i 20 min. og rystedes ved 75 omdr./min. i 100 min.

50 DK 176020 B1 LFA-1-monoklonale antistoffer var konsekvent me-re inhiberende end iCAM-l-monoklonale antistoffer, hvorimod HLA-A, B og LFA-3 monoklonale antistoffer var uden virkning. Disse resultater indikerer at af de te-5 stede monoklonale antistoffer var kun dem, der var i stand til at binde til LFA-1 eller ICAM-1, i stand til at inhibere cellulær adhæsion.

Eksempel 10 10 Fremstilling af monoklonalt antistof mod ICAM-1.

Immunisering.

En Balb/C mus immunisredes intraperitonealt (i.p) med 0,5 ml 2 x 107 JY-celler i RPMI medium 103 15 dage og 24 dage før fusion. På 4. og 3. dagen før fusion immuniseredes mus i.p. med 107 celler af PMA-differentlerede U937-celler i 0,5 ml RPMI medium.

Differentiering af U937-celler.

20 U937-celler (ATCC CRL-1593) differentierede ved inkubering af disse ved 5 x 105/ml i RPMI med 10% fetal bovin serum , 1% glutamin og 50 yg/ml gent amyin (fuldstændigt medium) indeholdende 2 ng/ml phorbol-12-myristatacetat (PMA) i en steril polypropylenbeholder.

25 på 3. dagen af denne inkubering fjernedes halvdelen af volumenet af mediet og erstattedes med frisk, fulstæn-dlgt medium indeholdende PMA. På dag 4 fjernedes celler, vaskedes og præpareredes til immunisering.

30 Fusion.

Miltceller fra de immuniserede mus fusioneredes med P3x63 Ag8.653 myelomaceller i et forhold på 4:1 i overensstemmelse med Galfre et al. > (Nature 266:550 51 DK 176020 B1 (1977)). Efter fusionen udpladedes cellerne i en { 96 brøndes fladbundet mikrotiterplade med 510 milt- celler/brønd.

5 Selektion af antl-ICAM-1 positive celler.

Efter én uge underkastedes 50 yl supernatant screening ved den kvalitative aggregationsprøve ifølge eksempel 2, idet både JY og SKW-3 benyttedes som aggregerende cellelinier. Celler fra supernatanter, 10 der inhiberer JY-celleaggregat ion, men ikke SKW-3, udvalgtes og klonedes to gange linder anvendelse af begrænsende fortynding.

Dette forsøg resulterede i identifikationen og kloningen af tre separate hybridomallnier, som 15 frembragte anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer. Antistofferne produceret af disse hybridomallnier var henholdsvis IgG2a, IgG2b og IgM. Hybridomacellelinien, som producerede IgG2a anti-ICAM-l-antistoffet tildeles betegnelsen R6 5 D6 E9 B2. Antistsoffet produce-20 ret af den foretruken hybridomacellelinie betegnedes R6 5 D6 E9 B2 (herefter omtalt som "Re-S-De"). x Hybridomacellelinie R6 5 D6 E9 B2 deponeredes hos the American Type Culture Collection den 30. oktober 1987 og fik tildelt betegnelsen ATCC HB 9580.

25

Eksempel 11 ! Ekspressionen og reguleringen af ICAM-1.

For at måle ICAM-l-ekspressionen udvikledes en radioimmunprøve. I denne prøve ioderedes renset -30 RRl/1 under anvendelse af lodogen til en specifik aktivitet på 10 uCi/yg. Endotelceller dyrkedes i 96 brøndes plader og behandledes som beskrevet for hvert forsøg. Pladerne afkøledes til 4°C ved an- 52 DK 176020 B1 bringelse i et koldt rum 1 0,5-1 time, Ikke direkte på ls. Monolagene vaskedes 3 gange med kolde, fuldstændige medier og Inkuberedes dernæst 30 min. ved 4°C med 125I RR1/1. Monolagene vaskedes dernæst 3 gange 5 med fuldstændige medier. Det bundne frigjordes under anvendelse af 0,1 N NaOH og taltes. Den specifikke aktivitet af 125I RR1/1 indstilledes, ved hjælp af ikke-mærket RH1/1, til opnåelse af et linært signal indenfor de antigentætheder man støter på under dette 10 studium. Ikke-specifik binding bestemtes i nærværelse af et tusind gange overskud af ikke-mærket RRl/l og substraheredes fra den totale binding til opnåelse af den specifikke binding.

XCAM-1-ekspression, målt under anvendelse af 15 ovennævnte radloimmunprøve, øges på humane umbilical-vene-endotelceller (HUVEC) og humane saphenevene-endotelceller (HSVEC) af IL-1, TNF, LPS og IPN-y (Tabel 3). Saphenevene-endotelceller anvendtes i dette studium til bekræftelse af resultaterne fra umbilicalvene-20 endotelceller i dyrkede store vene-endotelceller fra fuldt udviklet væv. Den basale ekspression af ICAM-1 er 2 gange højere på saphenevene-endotelceller end på umbilicalevene-endotelceller. Udsættelse af umbilicalvene-endotelcelle . for rekombinant-IL-1-25 a, ιι,-1-β og TNF-y øger ICAM-l-ekspression 10-20 gange.

IL-1-α, TNF og LPS var blandt de mest potente inducere og IL-1 var mindre potent på en vægtbasis og desuden ved mætningskoncentrationer for respons (Tabel 3).

IL-1-β ved 100 ng/ml øgede ICAM-l-ekspression 9 gange 30 på HUVEC og 7,3 gange på HSVEC med halv-maksimal øgning forekommende ved 15 ng/ml. rTNF ved 50 ng/ml øgede lCAM-1-ekspressionen 16 gange på HUVEC og 11 gange på HSVEC med halv-maksimale virkninger ved 0,5 ng/ml.

53 DK 176020 B1

Interferon-y frembragte en signifikant øgning i ICAM-l-ekspression på 5,2 gange på HUVEC eller 3,5 gange på HSVEC ved 10.000 U/ml. Virkningen af LPS ved 10 yg/ml var af tilsvarende størrelsesorden som rTNF.

5 Parvise kombinationer af disse mediatorer resulterede i yderligere eller lidt mindre end yderligere virkninger på ICAM-1 ekspression (Tabel 3). Kryds-titrering af rTNF med rIL-1-β eller rIFN-y viste ingen synergisme mellem disse ved suboptimale eller optimale koncentra-10 tioner.

Eftersom LPS øgede ICAM-l-ekspression på endo-telceller i koncentrationer, der somme tider findes i dyrkningsmedier, undersøgtes den mulighed at den basale ICAM-l-ekspression kan skyldes LPS. Når adskillige 15 serumbatches testedes viste det sig, at lav endotoxin-serum gav lavere ICAM-l-basal-ekspression ved 25%. Alle de heri angivne resultater var for endotelceller dyrket i lav endotoxinserum. Inkluderingen af det LPS-neutraliserende antibiotikum polymyxin B ved 10 yg/ml 20 mindskede imidlertid kun ICAM-l-ekspressionen yderligere 25% (Tabel 3). Øgningen i ICAM-1-ekspresion ved behandling med IL-1 eller TNF påvirkedes ikke ved nærværelse af 10 yg/ml polymyxin B, som er i overensstemmelse med de lave endotoxinkoncentrationer i disse 22fpræparater (Tabel 3).

DK 176020 B1 54 ’

Tabel 3

Anti-iCAM-l-monoklonale antistoffer.

5 ’Tilstand (16 timer) ^"*1 Specifik bundet (CPM)

HSVEC HSVEC

l-Kontrol 603 + 11 - 1132 + 31 - 100 ng/ml rIL-1 beta ·. 5680~± 633 9x 8320 + 766 7.3x _ 10 50 ng/ml rIL-1 alpha 9910 + 538 16x 50 ng/ml rTNF alpha 1 9650 + 1500 16x 12690 + 657 11.2x .

10 pg/ml LPS 9530 ± 512 16x 10459 ± 388 9.2x 10 ng/ml rlFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 + 664 3.5x ‘rIL-1 beta + rTNF 1469 + 1410 24x 16269 + 660 14x · rIL-1 beta + LPS 13986"+ 761 23x 10870 + 805 lOx 15 rIL-1 beta + rlFN gamma 7849 + 601 13x 8401 + 390 7.4x rTNF + LPS 15364'+ 1241 24x 16141 + 1272 14x rTNF + rlFN gamma 13480 + 1189 22x 13238 + 761 12x , LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 + 668 lOx polymyxin B (10 pg/ml) 480+23 polymyxin B + rIL-1 15390 + 97 lix - ,λ polymyxin B + rTNF .9785 + 389 20x 1 ^g/ml LPS 17598 + 432 13x polymyxin B + LPS Ϊ510 + 44 l.lx

I M

i

Opregulering af ICAM-l-ekspression på HVEC og HSVEC-25 HUVEC eller HSVEC podedes i plader med 96-brønde ved en 1:3 fra et flydende monolag og fik lov til at gro til sammenløb. Cellerne behandledes dernæst med de angivne materialer eller medier i 16 timer, og RIA som ved fremgangsmåder. Alle punkter gennemførtes 4 30 gange.

i DK 176020 B1 55

Eksempel 12

Kinetik af Interleukin 1 og y-interferon-induktion af ICAM-1.

Kinetikken af interleukin 1 og y-interferon-5 virkninger på ICAM-l-ekspression på dermale fibro-blaster bestemtes under anvendelse af den 125I gede-anti-muse-IgG-bindingsprøve af Dustin, M.L. et al.

(J. Immunol. 137:245-254 (1986). Til gennemførelse af denne bindingsprøve, dyrkedes humane, dermale fibrobla-10 ster i en 96-brøndes mlkrotiterplade til en tæthed på 2-8 x 104 celler/brønd (0,32 cm2). Cellerne vaskedes 2 gange med RPMI 1640 medium suppleret som beskrevet i eksempel l. Cellerne vaskedes yderligere en gang med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), 10 mM HEPES, 15 0,05% NaN3 og 10% varmeinaktiveret fetal bovin serum, vaskning med denne bindingspuffer gennemførtes ved 4°C.

Til hver brønd sattes 50 μΐ af ovennævnte bindingspuffer og 50 μΐ af den passende hybridoma-supernatant med X63 og W6/32 som henholdsvis de negative og positive 20 kontroller. Efter inkubering i 30 minutter ved 4eC under forsigtig omrøring vaskedes brøndene to gange med bindingspuffer, og det andet antistof 125I-gede-anti-muse-IgG, tilsattes ved 50 nCi i 100 μΐ. 125I-gede-anti-muse-antistoffet fremstilledes under anvendelse af 25 iodogen (Pierce) i overensstemmelse med fremgangsmåden af Fraker, P.J. et al. (Biochem. Blophys. Res. Commun.

80:849 (1978)). Efter 30 min. ved 4°C vaskedes brøndene to gange med 200 μΐ bindingspuffer og cellelaget opløstes ved tilsætning af 100 μΐ 0,1 N NaOH. Dette og en 30 loo μΐ vask taltes i en Beckman 5500 γ-counter. Det specifikke antal counts per min. beregnedes som [cpm med monoklonalt antistof]-[cpm med X63]. Alle trin, herunder induktion med specifikke reagenser, gennemførtes 4 gange.

56 DK 176020 B1

Virkningen af interleukin 1 med en halverings-i tid for I CAM-1-induktion på 2 timer var hurtigere end virkningen af γ-interferon med en halveringstid på 3,75 timer (fig. 6). Tidsforløbet til returnering til reste-5 rende koncentrationer af ICAM-1 viste sig at være afhængig af cellecyklusen eller hastigheden af cellevækst . I hvilende celler er interleukin 1 og y-interferonvirkninger stabile i 2-3 dage, hvorimod ICAM-l-ekspressionen afbildet som logfasekulturer er 10 nær grundlinien 2 dage efter fjernelsen af disse inducerende midler.

Dosis-responskurver for induktionen af ICAM-1 ved rekombinant muse- og human interleukin 1 og for rekombinant human y-interferon er vist i fig. 7. y-15 interferon og interleukin 1 viste sig at have ens koncentrationsafhængigheder med næsten identiske vir-1 kninger ved 1 ng/ml. Humant og rekombinant muse-inter- leukin 1 havde desuden ens kurver, men er mindre virkningsfulde end human interleukin l-præparater ved 20 inducering af ICAM-1-ekspression.

Cyclohexamid, en inhibitor for proteinsyntese, og actinomycin-D, en inhibitor for mRNA-syntese, ophæver virkningerne af både interleukin 1 og y-interferon på ICAM-l-ekspression på fibroblaster (Tabel 4).

25 Tunicamycin, en inhibitor for N-bundet glycosylering, inhiberede yderligere kun interleukin 1-virkningen med 43%. Disse resultater indikerer at protein- og mRNA-syntese, men ikke N-bundet glycosylering er nødvendig for interleukin 1- og y-interferon-stimulerede 30 øgninger i ICAM-l-ekspression.

DK 176020 B1 57 TABEL 4

Virkninger af cycloheximid, actinomycin D og tunica-mycin på ICAM-1-induktion med IL-1 og y-lFN på humane, dermale fibroblaster®.

5 125, Ged-Anti-Mus IgG _Specifikt bundet icpm)

Behandling_anti-ICAH-1_antl-HLA-A.B.C

i ^ Kontrol (4 timet) 1524 4 140 11928 ♦ 600 t cycloheximid 1513 ± 210 10678 ± 471 4 actinomycin 0 1590 ± 46 12276 4 608 4 tunlcamycln 1461 ± 176 12340 4 940 IL 1 (10 0/ml) (4 timer) 4264 4 249 12155 4 510 4 cycloheximid: 1619 4 381 12676 4 446 15 4 actinomycin D 1613 4 88 12294 ± 123 4 tunicamycin 3084 4 113 13434 4 661 I FN-γ (10 U/ml) (18 timer) 4659 4 109 23675 ± 500 4 cycloheximid 1461 4 59 10675 4 800 4 actinomycin D 1326 ± 186 12089 4 550 20 aHumane fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x lo4 celler/0,32 cm2 brønd. Behandlinger gennemførtes i et slutvolumen på 50 μΐ indeholdende de angivne reagenser.

25 cycloheximid, actinomycin D og tunicamycin tilsattes i henholdsvis 20 yg/ml, 10 yM og 2 yg/ml samtidig med cytokinerne. Alle punkter er middelværdier fra fire bønde + standardafvigelse.

·.

DK 176020 B1 58

Eksempel 13 ICAM-11 s vævsfordeling.

Histokemiske studier gennemførtes på frossen væv fra menneskeorganer til bestemmelse af fordelingen af 5 ICAM-1 i thymus, lymfeknuder# tarm, hud, nyrer og lever. Til gennemførsel af en sådan analyse fikserede frosne vævsstykker (4 pm tyk) af normalt, humant væv i acetone i 10 min. og farvedes med det monoklonale antistof RR1/1 ved en immunoperoxidaseteknik, linder anven-10 delse af avidin-biotin-kompleksmetoden (Vector Laboratories, Burlingame, CA) beskrevet af Cerf-Bensussan, N. et al. (J. Immunol. 130:2615 (1983)). Efter inkubering med antistoffet, inkuberedes stykkerne fortløbende med biotinylerede heste-anti-muse-IgG og avidin-15 biotinylerede peroxidasekomplekser. Stykkerne dyppedes til sidst i en opløsning indeholdende 3-amino-9-ethyl-carbazol (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wl) til udvikling af en farvereaktion. Stykkerne fikseredes dernæst i 4% formaldehyd i 5 min. og modfarvedes med 20 hematoxylin. Kontroller omfattede stykker Inkuberet med ikke-relaterede monoklonale antistoffer i stedet for RRl/l-antistoffet.

ICAM-1 viste sig at have en fordeling, der i det væsentlige er lig med den hos størstedelen af 25 histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II antigenerne. De fleste blodkar (både små og store) i alt væv viste farvning af endotelceller med ICAM-1-antistof.

Den vaskulære endotelfarvning var mere intens i de interfollikulære (paracorticale) områder i lymfeknuder, 30 tonsiler og Peyer's "patches" i sammenligning med kar i nyre, lever og normal hud. I leveren var farvningen i det væsentlige begrænset til sinusformede beklædningsceller; hepatocytterne og endotelcellerne, 59 DK 176020 B1 som indvendigt beklæder de fleste portalvener, og arterierne var ikke farvede.

I thymusmarven observeredes difus farvning af store celler og et dentritisk farvningsmønster. I cort-5 ex var farvningsmønsteret focalt og i det væsentlige dentritisk. Thymocytter var ikke farvede. I det perifere lymfoide væv var de sekundære lymfoide folliklers germinale centerceller intenst farvede. I nogle lymfoide follikler var farvningsmønstret i det væsentlige 10 dentritisk uden genkendelig farvning af lymfocytter.

Der observeredes desuden svag farvning af celler i kappezonen. Dendritiske celler med cytoplasmiske udstrækninger (interdigiterende reticulumceller) og et lille antal lymfocytter i de interfollikulære eller .

15 paracorticale områder var yderligere farvet med ICAM-1-bindingsantistof.

Celler, der lignende makrofager var farvet i lymfeknuderne og tyndtarmens lamina propria. Fibro-blast-lignende celler (spindelformede celler) og den-20 dritiske celler spredt i stroma og de fleste af de undersøgte organer farves med iCAM-l-bindingsanti-stoffet. Der konstateredes ingen farvning i de Langerhanske/indeterminante celler i epidermis. Der konstateredes ingen farvning i glat muskelvæv.

25 Farvningen af epitelceller kunne tilsvarende ses i tonsilernes mucosa. Skønt hepatocytter, galdekanal-epitelium, intestinale epitelceller og rørformede epitelceller i nyrer i de fleste tilfælde ikke farves, viste stykker af normal nyrevæv, opnået fra et nephrek-30 tomisk stykke med nyrecellecarcinoma, farvning af mange proximale rørformede . celler for ICAM-1. Disse rørformede epitelceller farves desuden med et anti-HLA-DR-bindingsantistof.

60 DK 176020 B1

Summarisk , eksprimeres ICAM-1 på ikke-hemato-poietiske celler, såsom vaskulære endotelceller og på hæmatopoletiske celler, såsom vævsmakrofager og mitogen-stimulerede T-lymfocytbaster. ICAM-1 viste sig 5 at blive eksprimeret i små mængder på perifere blodlymfocytter.

Eksempel 14

Rensningen af ICAM-1 ved monoklonal antistof afflnltetschromatografl 10

Generelt rensningsskema.

ICAM-1 rensedes fra humane celler eller væv under anvendelse af monoklonalt antistof affinitetschro-matografi. Monoklonalt antistof, RRI/1, reaktivt over-15 for ICAM-1 rensedes først og kobledes til en inert ko-lonnematrix. Dette antistof er beskrevet af Rothlein, R Si· J· Immunol. 137:1270-1274 (1986), og Dustin, M.L. et al. (J. Immunol. 137:245 (1986). ICAM-1 solubi-liseredes fra cellemembraner ved lysering af cellerne 20 i et ikke-ionisk detergent, Triton X-100, nær en neutral pH-værdi. Cellelysatet indeholdende opløst ICAM-1 dernæst gennem prækolonner bestemt til fjernelse af materialer, der binder ikke-specifikt til kolonnema-trixmaterialet, og dernæst gennem den monoklonale 25 antistof-kolonnematrix, der gør det muligt for ICAM-1 at binde til antistoffet. Antistofkolonnen vaskedes dernæst med en serie af detergentvaskepuffere med stigende pH-værdi op til pH 11,0. Under disse vasknin-ger forblev ICAM-1 bundet til antistofmatrixen, medens 50 ikke-bindende og svagt bindende forurenende materialer fjernedes. Det bundne ICAM-1 elueredes dernæst specifikt fra kolonnen ved tilførsel af en detergentpuffer på pH 12,5.

61 DK 176020 B1

Rensning af monoklonalt antistof RR1/1 og covalent kobling til Sepharose CL-4B.

Det anti-lCAM-l monoklonale antistof RRi/l rensedes fra ascltesvæske fra hybridoma-bærende mus, el-5 ler fra hybridoma-kultursupernatanter ved standardteknikker for ammoniumsulfatudfældnings- og protein A-afflnitetschromatografi (Ey et al., Immunochem. 15: 429 (1978)). Det rensede IgG, eller rotte-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kobledes covalent til I 10 Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Sverige) under an- vendelse af en modifikation af fremgangsmåden af March et al. (Anal. Blochem. 60:149 (1974)). Kort fortalt vaskedes Sepharose CL-4B i destilleret vand, aktiveret med 40 mg/ml CNBr i 5 M K2HP04 (pH ca. 12) i 15 5 min. og vaskedes dernæst ekstensivt med 0,1 mM HC1 ved 4°C. Det filtrerede, aktiverede Sepharose resuspen-deredes med en tilsvarende mængde renset antistof (2-10 mg/ml i 0,1 M NaHCOj, 0,1 M NaCl). Suspensionen inkuberedes i 18 timer ved 4°C under nænsom "end-over-20 end"-rotation. Supernatanten kontrolleredes dernæst for ubundet antistof ved absorbans ved 280 nm, og resterende reaktive steder på aktiveret Sepharose blev mættet ved tilsætning af glycin til 0,05 M. Koblingsvirkningsgraden var sædvanligvis over 90%.

25

Detergentsolublllserlng af membraner fremstillet ud fra human milt.

Alle fremgangsmåder gennemlførtes ved 4°C. Frossen, human milt (200 g fragmenter) fra patienter med 30 hårcelleleukemi optøedes på is i 200 ml Tris-saltop-løsning (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4 ved 4°C) indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,2 U/ml aprotinin og 5 mM iodacetamid. Vævet blev skåret 62· DK 176020 B1 i små stykker og homogeniseret ved 4°C med en Tekmar power homogenisator. Voluminet øgedes dernæst til 300 ml med Tris-saltopløsning, og 100 ml 10% Tween 40 (polyoxyethylensorbitanmonopalmitat) i Tris- 5 saltopløsning tilsattes til opnåelse af en endelig koncentration på 2,5% Tween 40.

Til fremstilling af membraner, ekstraheredes homogenat et med tre slag fra en Dounce eller, mere. foretrukket, en Teflon Potter Elvejhem' homogenisator 10 0g centrifugeredes dernæst ved 1000 x g i 15 min. Supernatanten bevaredes og pelleten reekstraheredes med 200 ml 2,5% Tween 40 i Tr is-sal topløsning. Efter centrifugering ved 1000 x g i 15 min., samledes superna-tanterne fra begge ekstraktioner og centrifugeredes ved 15 150.000 x g i 1 time til pelletering af membranerne.

Membranerne vaskedes ved genopløsning i 200 ml Trissaltopløsning, centrifugeredes ved 150.000 x g i 1 time. Membranpelleten genopslæmmedes i 200 ml Tris-salt-opløsning og homogenisteredes med en motoriseret homo-20 genisator og en teflonstøder indtil suspensionen vår i jævnt grumset, voluminet øgedes dernæst til 900 ml med

Tris-saltopløsning og N-lauroylsarcosin tilsattes til en slutkoncentration på 1%. Efter omrøring ved 4°C i 30 min. fjernedes uopløseligt materiale i detergentlysatet 25 ved centrifugering ved 150.000 x g i 1 time. Triton X-100 sattes dernæst til supernatanten til en slutkoncentration på 2%, og lysatet omrørtes ved 4*C i 1 time.

30 Detergentsolubiliserinq af JY B-lymfoblastoldceller.

Den EBV-transformerede B-lymfoblastoidcelle-linie JY dyrkedes i RPMI-1640 indeholdende 10% fetal kalveserum (FCS) og 10 mM HEPES til en tæthed på 63 .

DK 176020 B1 ca. 0,8-1,0 x 106 celler/ml. For at øge celleoverfladeekspressionen af ICAM-1 sattes phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) i 25 ng/ml 8-12 timer før høst af cellerne. Natriumvanadat (50 μΜ) sattes desuden 5 til kulturerne på dette tidsrum. Cellerne pelleteredes ved centrifugering ved 500 x g i 10 min., og vaskedes 2 gange i Hank's balanceredes saltopløsning (HBSS) ved genopslæmning og centrifugering. Cellerne (ca. 5 g per 5 1 kultur) lyseredes 1 50 ml lysispuffer (0,14 M NaCl, 1Θ 50 mM Tris pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,2 U/ml aprotinin, 1 mM PMSF, 50 μΜ natriumvandat) under omrøring ved 4°C i 30 min. Ikke-lyserede kærner og uopløseligt materiale fjernedes ved centrifugering ved 10.000 x g i 15 min. efterfulgt af centrifugering af supernatanten 15 ved 150.000 x g i 1 time og filtrering af supernatanten gennem Whatman 3 mm filterpapir.

Affinitetschromatoqrafl af ICAM-1 til strukturunder-søqelser.

20 Til rensning i stor skala af ICAM-1, som skal benyttes ved strukturstudier, benyttedes en kolonne med 10 ml RRl/l-Sepharose CL-4B .{koblet ved 2,5 mg antistof/ml gel), og to 10 ml præ-kolonner med CNBr-aktiveret, glycin-quenched Sepharose CL-4B, og rotte-2^ IgG koblet til Sepharose CL-4B (2 mg/ml) benyttedes. Kolonnerne blev serieforbundet og præ-vasket med 10 kolonne-voluminer lysispuffer, 10 kolonnevoluminer puffer på pH 12,5 (50 mM triethylamin, 0,1% Triton X-100, pH 12,5 ved 4eC, efterfulgt af ligevægtsindstilling med ^ 10 kolonnevoluminer lysispuffer. En liter af detergent- lysat af human milt tilførtes med en strømhastighed på 0,5-1,0 ml per min. De to præ-kolonner benyttedes til fjernelse af ikke-specifikt bindingsmateriale fra lysa-tet før passage gennem RRl/l-Sepharose-kolonnen.

64 DK 176020 B1

Efter tilsætningen vaskedes RRl/l-Sepharose-kolonnen og bundet ICAH-l fortløbende med en strømhastighed på 1 ml/min. med mindst 5 kolonnevoluminer af hver af de efterfølgende: 1) lysispuffer, 2) 20 mM 5 Tris pH 8,0/0,14 M NaCl/0,1% Triton X-100, 3) 20 mM glycin pH 10,0/0,1% Triton X-100, og 4) 50 mM tri- ethylamin pH 11,0/0,1% Triton X-100. Alle vaskpuffere p indeholdt 1 mM PMSF og 0,2 U/ml aprotinin. Efter vas- i kningen elueredes det resterende bundne icam-i med 10 5 kolonnevoluminer elueringspuffer (50 mM triethyl-amin/0,1% Triton X-100/pH 12,5 ved 4°C) med en strømningshastighed på 1 ml/3 min. Det eluerede ICAM-1 opsamledes i 1 ml fraktioner og neutraliseredes straks ved tilsætning af 0,1 ml 1 M Tris, pH 6,7. Fraktionerne 15 indeholdende ICAM-l identificeredes ved SDS-polyacryl-amidelektroforese af 10 μΐ aliquoter (Springer et al., J. Exp. Med. 160:1901 (1984)), efterfølgt af sølvfarvning (Morrissey, J.H., Anal. Blochem. 117:307 (1981)).

Under disse betingelser var mængden af ICAM-1 elueret 20 i ca. 1 kolonnevolumen mere end 90% rent bedømt ud fra sølvfarvede elektropherogrammer (en lille mængde IgG, udvasket fra affinitetsmatrixen, var den største forurener). Fraktionerne indeholdene ICAM-1 samledes i en pulje og koncentreredes ca. 20 gange ved hjælp af 25 Centricon-30-mikrokoncentratorer (Amicon, Danvers, MA). Det rensede ICAM-1 mængdebestemtes ved Lowry-proteinprøve af en ethanol-præcipiteret aliquot fra puljen: Ca. 500 yg rent ICAM-1 produceredes ud fra 200 g human milt.

30 Ca. 200 yg renset ICAM-1 udsattes for en

andentrins rensning ved præparativ SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese. Båndet, der repræsenterer ICAM-l, blev gjort synligt ved gennemblødning af gelen i 1 M

DK 176020 B1 | 65 · j KCl. Det gelområdet som indeholdt ICAM-1 blev dernæst udskåret og elektroelueret i overensstemmelse med fremgangsmåden af Hunkapiller et al., Meth. Enzymol. 91: 227-236 (1983). Det rensede protein var mere end 98% 5 rent bedømt ved SDS-PAGE og sølvfarvning.

Affinitetsrensnlnq af ICAM-1 til funktionelle studier.

ICAM-1 til anvendelse i funktionelle studier rensedes fra detergentlysater af JY-celler som be-10 skrevet ovenfor, men i mindre målestok (en 1 ml kolonne af RRl/i-Sepharose) og med følgende modifikationer.

Alle opløsninger indeholdt 50 μΜ natriumvanadat. Efter vaskning af kolonnen med pH li,O-puffer indeholdende 0,1% Triton X-100, vaskedes kolonnen igen med fem 15 kolonnevoluminer af den samme puffer indeholdende 1% n-actyl-p-D-glucopyranosid (octylglucosid) i stedet for 1,0% Triton X-100. Octylglucosid-detergentet fortrænger Triton X-100 bundet til ICAM-1 og modsat Triton X-100 kan det senere fjernes ved dialyse.

20 ICAM-1 elueredes dernæst med pH 12,5-puffer indeholdende 1% octylglucosid i stedet for 0,1% Triton X-100, og analyseredes og koncentreredes som beskrevet ovenfor.

Eksempel 15 25 Karakteristika af renset ICAM-1.

ICAM-l renset fra human milt migrerer i SDS-polyacrylamid-geler som et bredt bånd med Mr på 72.000 til 91.000. ICAM-1 renset fra JY-celler migrerer også som et bredt bånd med Mr på 76.500 til 97.000. Disse Mr 30 ligger indenfor det angivne område for ICAM-1 immuno-præcipiteret fra forskellige cellekilder: Mr=90.000 for JY-celler, 114.000 på den myelomonocytiske cellelinie U937 og 97.000 på fibroblaster (Dustin et al., J.

DK 176020 B1 I 66 ! Immunol. 137:245 (1986)). Dette brede område i Mr til skrives en extensiv, men variabel grad af glyco-sylering. Den ikke-glycosylerede precursor har en Mr på 55.000 (Dustin et al.). Proteinet renset enten fra 5 JY-celler eller human milt bevarer dets antigene virkning som godtgøres af dets evne til at genbinde til den oprindelige affinitetskolonne og ved immunopræcipita-tion med RRl/l-Sepharose og SDS-polyacrylamidelektro-forese.

10 Til fremstilling af peptidfragmenter af ICAM-l reduceredes ca. 200 pg med 2 mM dithiothreitol/2% SDS, efterfulgt af alkylering med 5 mM iodeddikesyre. Proteinet udfaeledes med ethanol og genopløstes i 0,1 M NH4CO3/O,1 mM CaCl2/0,l% zwittergent 3-14 (Calbio-13 chem), og underkastedes digestion med 1 vægt% trypsin ved 37°C i 4 timer, efterfulgt af yderligere digestion med 1% trypsin i 12 timer ved 37°C. De tryptiske peptider rensedes ved omvendt-fase HPLC under anvendelse af en 0,4 x 15 cm C4-kolonne (Vydac). Peptiderne elueredes 20 roeå en lineær gradient på 0% til 60% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre. Udvalgte peptider underkastedes sekvensanalyse på en gasfasemikrosekvenator (Applied Biosystems). Sekvensinformationen opnået fra dette studium er vist i Tabel 5.

DK 176020 B1 67

Tabel 5

Aminosyresekvenser af ICAM-l-tryptlske peptider.

Amtno- Peptid 5 syre-____

Sfi8*-...... 50a SOb 46a 46b X 4S K AA J U 0 Ml

1 (T/V) A (V/A) E VS LE A L V L

2F SQ P-EFNLSITl/E

3 1 IT ALPPDS6L P/(6)

4 7 $ F AATLV1 P

10 SVIP P P V R l E G/Y

6Y GL LNTP VT N/L

7 P W P P V Y Q T P (N) .

8 T P 1 I T/l G G C P/V (Q) 8 S F G (G) I - I S K (E) ! E i (Q) - DE T (0)

11 A S D/P K $ L S

15 12 G/S V V P F F C

I 13 A T O Q S E D

14 G V V V/L A - Q

15 I K T P

16 S K

17 A

18 p

19 X

20 20 O

21 L

( ) s Lav konfldenssekvens.

[ ] - Meget lav konfldenssekvens.

25 /s indikerer flertydelighed i sekvensen; den mest sandsynelige aminosyre er angivet først, a s Større peptid, b = Mindre peptid.

DK 176020 B1 ; 68

Eksempel 16

Kloning af ICAM-1-genet.

Genet for ICAM-1 kan klones tinder anvendelse af en lang række fremgangsmåder. F.eks. kan amino-5 syresekvensinformationen, opnået gennem sekvenseringen af de tryptiske fragmenter af ICAM-1 (Tabel 5), benyttes til identificering af en oligonucelotidsekvens, som vil svare til ICAM-l-genet. lCAM-1-genet kan alternativt klones under anvendelse af anti-ICAM-l-antistof 10 til detektering af kloner, som producerer ICAM-1.

Kloning af genet for ICAM-1 gennem anvendelsen af oliqonucleotldprober♦

Under anvendelse af den gentiske kode (Watson, 15 J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3. udg. Ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), kan et eller flere forskellige oligonucleotider identificeres, som hver især vil være i stand til at kode for de ICAM-1 tryptiske peptider. Sandsynligheden for at et særligt 20 oligonucleotid i virkeligheden udgør den aktuelle ICAM-1-kodende sekvens kan estimeres ved betragtning af abnorme baseparforhold og hyppigheden med hvilken et særligt codon faktisk benyttes (for at kode for en særlig aminosyre) i eukaryotiske celler. Sådanne "codon 25 kutymeregler" er angivet af Lathe, R., et al♦, J.

Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Ved anvendelse af "codon kutymereglerne" af Lathe, identificeres et enkelt oligonucleotid, eller et sæt af oligonucelotider, som indeholder en teoretisk "mest sandsynlig" nucleo-30 tidsekvens (dvs. den nudeotidsekvens, der har det mindste overskud), som er i stand til at kode for de ICAM-1 tryptiske peptidsekvenser.

Oligonucleotidet eller sættet af oligonucleotider, der indeholder den teoretiske "mest sandsynlige" 69 DK 176020 B1 sekvens, der er i stand til at kode for ICAM-1 fragmenterne benyttes til identificering af sekvensen af et komplementært oligonucleotid eller sæt af oligonucleo-tider, som er i stand til at hybridise den "mest 5 sandsynlige" sekvens, eller sæt af sekvenser. Et oligonucleotid indeholdende en sådan komplementær sekvens kan anvendes som en probe til Identificering og isolering af ICAM-l-genet (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning A Laboriatory Manual, Cold Spring Harbor Press, 10 Cold Spring Harbor, NY (1982).

Som beskrevet i afsnit C ovenfor, er det muligt at klone ICAM-l-genet fra eukaryoetiske DNA-præparater, som formodes at indeholde dette gen. Til identificering og kloning af genet, som koder for ICAM-1-proteinet, 15 underkastes et DNA-bibliotek for dets evne til at hybridisere med de ovennævnte oligonucleotidprober.

Da det er sandsynligt at der kun vil være to kopier af genet for ICAM-1 i en normal diploid celle, og fordi det er muligt at dette ICAM-l-gen kan indeholde store 20 ikke-transkriberede mellemliggende sekvenser (introner), hvis kloning ikke er ønsket, er det ønskeligt at isolere ICAM-1-kodende sekvenser fra et cDNA-bibliotek fremstillet ud fra mRNA fra en ICAM-1-producerende celle fremfor fra genomisk DNA. Egnede 25 DNA eller cDNA præparater spaltes enzymatisk eller klippes tilfældigt og ligeres i rekombinant vektorer.

Disse rekombinante vektoreres evne til at hybridisere til ovennævnte oligonucleotidprober måles dernæst. Fremgangsmåder til hybridisering er angivet f.eks. i 30 Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) eller i Haymes, B.T., et al., Nucleic Acid Hybridization a Practiclal Approach, IRL Press, Oxford, England i 70 DK 176020 B1 (1985). Vektorer, som viste sig at være i stand til en sådan hybridisering analyseres dernæst til bestemmelse af udstrækningen og naturen af de ICAM-l-sekvenser som de indeholder. Baseret på rent statistiske betragtnin-5 ger, kunne et gen, såsom det der koder for ICAM-1-molekylet, identificeres entydigt (via hybridiserings-screening) under anvendelse af en oligonucleotidprobe med kun 18 nucleotider.

Den aktuelle identifikation af iCAM-l-peptid-10 sekvenser tillader således kort fortalt identifikationen af en teoretisk "mest sandsynlig” DNA-sekvens eller et sæt af sådanne sekvenser, der er i stand til at kode for et sådant peptid. Ved konstruktion af et oligonu-cleotid komplementært til denne teoretiske sekvens 15 (eller ved konstruktion af et sæt af oligonucleotider komplementære til sættet af de "mest sandsynlige" oligonucleotider ), opnås et DNA-molekyle (eller sæt at DNA-molekyler), der er i stand til at fungere som en probe til identifikation og isolering af ICAM-l-genet.

20 Under anvendelse af de i tabel 5 angivne ICAM-1- peptidsekvenser, bestemtes sekvensen af den "mest sandsynlige" sekvens af et oligonucleotid, der er i stand til at kode for AA- og J-peptider (henholdsvis Tabel 6 og 7). Oligonucleotider komplementære til disse sekven-25 ser syntetiseredes og rensedes til anvendelse som prober til isolering af lCAM-1-gensekvenser. Egnede størrelse-selekterede cDNA-biblioteker produceredes ud fra poly(A)+ RNA fra begge PMA-inducerede HL-60 celler og fra PS-stimulerede umbilcalveneendotelceller. Et 30 størrelse-selekteret cDNA-bibliotek fremstilledes under anvendelse af poly(A)+ RNA fra PMA-inducerede HL-60 celler i overensstemmelse med fremgangsmåden af Gubier, U., et al. ((Gene 25:263-269 (1983)) og Corbi, A-, et al. (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)).

i DK 176020 B1 i 71 ·

Et sted-selekterende cDNA-bibliotek fremstilledes under anvendelse af poly(A)+ RNA fra umbilicalvene-endotelceller, som havde været stimuleret i 4 timer med PS 5 yg/ml. RNA ekstraheredes ved homogenisering af 5 cellerne i 4 M guanidiniumisothiocyanat og supernatan-ten udsattes for ultracentrifugering gennem en CsCl gradient (Chirgwin, J. M., et al., Blochem. 18:5294-5299 (1979)). Poly(A)+ RNA isoleredes fra blandingen af totale RNA-stykker via anvendelsen af oligo-10 (dT)-cellulosechromatografi (Type 3, Collaborative Research ) Aviv, H., et al., Proc. Natl. Acad. Scl. (USA) 69:1408-1412 (1972).

i i ! 72 DK 176020 B1

Tabel 6

Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er 1 stand til at kode for ICAM-l-AA-peptidet.

5 _

Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der koder sekvens af ICAM-1 for AA-peptid T ' 5» y

in 162 GI u G C

υ A T

G C

163 Leu C G

T A

G C

164 Asp G C

15 A T

15 i C G

165 Leu C G

T A

G C

, 166 Arg C G

G C

i G C

20 167 Pro C G

C G

168 Gin C G

A T

G C

i 169 Gly G C

25 I j j

I c G

: 170 Leu C G

T A

G C

: 171 Glu G C

AT G C

30 : 172 Leu C G

! T A

G C

173 Phe T A

T A

174 Glu G C

A T

G C

I ~ ....... 3' 5' 73 DK 176020 B1

Tabel 6 (forsat)

Oligonuceltid komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er 1 stand til at kode for ICAM-l-AA-peptidet.

5 ·_ i 1 ♦ - Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der koder sekvens af ICAM-1 for AA-peptid 10

175 Asn A T

A T

C 6

176 Thr A T

C 6 C 6

15 177 Ser U A

C G

A

3' 5' i DK 176020 B1 74

Tabel 7

Oligonucleotld komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er 1 stand til at kode for ICAM-1-J-peptidet.

5______

Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der koder sekvens af ICAM-1 for AA-peptid 5' 3'

10 19 Val 6 C

T A

G C

20 Thr A T

C G

21 Cys T A

G C

15 CG

22 Ser T A

C G

23 Thr AT

C G

20 24 Ser T A

C G

I 25 Cys T A

G C

T A

26 Asp G C

25 AT

C G

27 Gin C G

A T

G C

28 Pro C G

C G

30 29 Lys A T

A T

3' 5' 75 · DK 176020 B1 Første cDNA streng syntetiseredes under anvendelse af 8 yg poly(A)+ rna, avian myeloblastosis virus revers transkriptase (Life Sciences) og en oligo(dT) primer. DNA-RNA-hybridet underkastedes digestion med 5 RNase H (BRL) og den anden streng syntetiseredes under anvendelse af DNA-polymerase I (New England Biolabs). Produktet methyleredes med Eco Rl-methylase (New England Biolabs), blunt-end ligeredes til Eco

Rl-linkere (New England Biolabs), underkastedes dige-10 stion med Eco RI og størrelse-selekteredes på en med lavt smeltepunkt agarosegel. cDNA større end 500bp li-geredes til XgtlO, som i forvejen havde været underkastet digestionen med Eco RI og dephosphory leret (Stratagene). Ligeringsproduktet pakkedes dernæst 15 (Stratagene gold).

Umbilicalveneendotelcellen og HL-60 cDNA-biblioteker udpladedes dernæst på 20.000 PFU/150 mm plade. Rekombinant DNA dobbeltoverførtes til nitrocellulosefiltre, denatureredes i 0,5 M NaOH/l,5M NaCl, 20 neutraliseredes i 1M Tris, pH 7,5/l,5M NaCl og bagtes ved 80°C i 2 timer (Benton, W.D., et al., Science 196; 180-182 (1977)). Filtre præhybridiseredes og hybridi- seredes i 5X SSC indeholdende 5X Denhardt's opløsning, 50 mM NaP04 og 1 yg/ml laksesperm DNA. Præhybridise-25 ring gennemførtes ved 45°C i 1 time.

Hybridiseringen gennemførtes under anvendelse af 32bp ( 5-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) eller 47bp (5 -GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC) anti-sense oligonucleotider baseret på, analogt med 30 ovennævnte, henholdsvis de ICAM-l-tryptiske peptider J og AA (Tabel 6 og 7) (Lathe, R., J. Molec. Blol., 183:1-12 (1985)). Oligonucleotider endemærkedes med y-(32P)ATP under anvendelse af T4 polynucleotid- 76 DK 176020 B1 kinase og konditioneredes, anbefalet af fabrikanten (New England Biolabs). Efter hybridisering natten over vaskedes filtrene to gange med 2X SSC/0,1% SDS i 30 min. ved 45°C. Fager isoleredes fra disse plagues, 5 hvilke udviste hybridisering og rensedes ved efterfølgende genudpladning og rescreening.

Kloning af genet for IGAM-1 gennem anvendelsen af antl-ICAM-antistof.

10 Genet for ICAM-1 kan alternativt klones gennem anvendelsen af anti-lCAM-l-antistof. DNA eller mere foretrukket cDNA ekstraheres og renses fra en celle, som er i stand til at eksprimere ICAM-1. Det rensede cDNA underkastes fragmentering (ved klipning, endo-15 nuclease digestion, osv.) til frembringelse af en pulje af DNA- eller cDNA-fragmenter. DNA- eller CDNA-fragmenter fra denne pulje kloner dernæst 1 en ekspressionsvektor til produktion af et genomisk bibliotek af ekspressionsvektorer, hvis medlemmer hver indeholder 20 et unikt klonet DNA- eller cDNA-fragment.

Eksempel 17

Analyse af cDNA-klonerne.

Fag DNA fra positive kloner underkastedes dige-25stion med Eco RI og undersøgtes ved Southern analyse under anvendelse af et cDNA fra en klon, som en probe. Maksimale størrelse-cDNA-indføjninger som kryds-hybridiserede, subklonedes i Eco Rl-stedet i plasmid-vektor pGEM 4Z (Promega). HL-60 subkloner indeholdende 30CDNA i begge orienteringer slettedes ved exonuclease

Ill-digestion (Henikoff, S., Gene 28:351-359 (1984)) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger (Erase-a-Base, Promega). Progressivt slettet cDNA klonedes 77 DK 176020 B1 dernæst og udsattedes for dideoxynucleotidkædetermine-ringssekvensering (Sanger, F. et al., Proc. Natl♦

Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467 (1977) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger (Sequenase, U.S.

5 Biochemical). HL-60 cDNA 5 og kodende områder sekven-seredes komplementært til begge strenge og 3'-området sekvenseredes ca. 70% på begge strenge. En representativ endotel cDNA sekvenseredes og det meste af dens længde ved shotgun kloning af 4bp-genkendelsesrestri-10 ktlonsenzymfragmenter.

cDNA-sekvensen af en HL-60 og en endotelcelle cDNA etableredes (flg. 8). 3023 bp-sekvensen Indeholder et kort 5 -ikke translateret område og et 1,3 kb 3 -ikke-translateret område med et consensus polyadenyle-15 ringssignal i position 2966. Den længst åbne læseramme bebynder ved det første ATG 1 position 58 og slutter ved en TGA terminerende triplet i position 1653. Iden- i titet mellem den translaterede aminosyresekvens og sekvenser bestemt ud fra otte forskellige tryptiske pep-20 tider med i alt 91 aminosyrer (understreget i fig. 8) bekræftede at autentiske ICAM-1 cDNA-kloner var blevet isoleret. Baseret på sekvensanalyse, er der i tab. 8 vist mulige peptider indenfor ICAM-1-sekvensen genkendt af LFA-l.

25 DK 176020 B1 ! | 78

Tabel 8

Aminosyresekvenser af ICAM-l tryptlske peptider.

Peptid Rester Sekvens

1 5 J 14-29 X G S V L VTCSTSCDQPK

U 30- 39 L L G I E T P L <P) (K)

50 78-85 (T) F L T V Y X T

X 89- 95 VELAPLP

AA 161-182 X ELDLRPQ, GLE —

10 L F E X T S A P X Q L

K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK

45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) 15 — Indikerer at sekvensen fortsætter på næste linile. Understregede sekvenser benyttedes til fremstilling af oligonucleotidprober.

Hydrofobisitetsanalyse (Kyte, J. et al., J.

20 Molec. Blol., 157:105-132 (1982)) foreslår tilstedeværelsen af en 27 restsignalsekvens. Udpegelsen af +1 glutaminet er i overensstemmelse med vores manglende evne til at opnå N-terminalsekvens på 3 forskellige ICAM-l-proteinpræparater; glutamin kan cyclisere til 25 pyroglutaminsyre, hvilket resulterer i en blokkeret li-terminus . Den translaterede sekvens fra 1-453 er i det væsentlige hydrofil, efterfulgt af et 24 resthydrofo-bisk formodentligt transmembranområde. Transmembranområdet efterfølges af adskillige ladede rester indeholde 30 i et 27 rest formodentligt cytoplasmisk område.

Den forudsatte størrelse af den fulgt udviklede polypeptidkæde er 55.219 daltons, hvilket er i udmærket overensstemmelse med den observerede størrelse på i DK 176020 B1 79 55.000 for deglycosylerede ICAM-1 (Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Otte N-linkede glyco-syleringssteder er forudsagt. Manglende asparagin i de tryptiske peptidsekvenser af to af disse steder be-5 kræfter deres glycosylering og deres ekstracellulære orientering. Antages 2.500 daltons per høj-mannose N-bundet carbohydrat, forudsiges en størrelse på 75.000 daltons for ICAM-l-precursoren i sammenligning med de observerede seks på 73.000 daltons (Dustin, M.L., et 10 al.. J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Efter omdannelse af høj-mannose til kompleks carbohydrat, ligger det fuldt udviklede ICAM-1 glycoprotein på 76 til 114 kd, afhængig af celletype l(Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). ICAM-1 er således en kraftig 15 glycosyleret, men ellers et typisk integralmembran-protein.

Eksempel 18 ICMA-l er et lntegrln-bindinqsmedlem af immunoglobulin 20 supergenfamilien.

Kopiering af ICAM-1-interne gentagelser gennemføres under anvendelse af "Microgenie protein alignment programmet" (Queen, C., et al., Nacl. Acid. Res., 12: 581-599 (1984)) efterfulgt af inspektion. Kopiering af 25 ICAM-1 overfor IgM, N-CAM og MAG gennemførtes under anvendelse af "Microgenie and the ALIGN programmet" (Day-hoff, M.O., et al., Meth. Enzymol. £1:524-545 (1983)).

Fire proteinsekvensdatabaser, opbevaret ved the National Biomedical Research Foundation, gennemsøgtes for 30 proteinsekvensligheder under anvendelse af FASTP-pro-grammet af Williams og Pearson (Llpman, D.J., et al.,

Science 227:1435-1439 (1985)).

Eftersom ICAM-1 er en ligand af et integrin, var det ikke forudset af det ville være et medlem af 80 DK 176020 B1 immunoglobulinsupergenfamilien. Inspektion af ICAM-1-I sekvensen viser imidlertid at den opfylder alle kri terier, der foreslås for medlemsskab af immunoglobulin-supergenfamilien. Disse kriterier omtales efter tur i 5 det efterfølgende.

Hele det ektracellulære område af ICAM-1 er konstrueret ud fra 5 homologe immunoglobulin-lignende områder, som er vist opstillet i fig. 9A. Områder 1-4 er henholdsvis 88, 97, 99 og 99 rester lang og er så-10 ledes af typiske Ig område størreis; område 5 er afkortet indenfor 68 rester. Søgninger i NBRF-databasen under anvendelse af FASTP-programmet afslørede signifikante homologier mellem medlemmer af immunoglobulin-supergenfamilien, herunder IgM og igG C områder, ΤΙ 5 cellereceptor-a-underenhed variabelt område og α-1-β-glycoprotein (fig. 9B-D).

Under anvendelse af ovennævnte information sammenlignedes aminosyresekvensen af ICAM-1 med aminosyre-sekvenser af andre medlemmer af immunoglobulinsupergen-20 familien.

I Tre typer af Ig superfamilieområder, V, Cl og C2 er differentieret. Både V- og C-områder er konstrueret ud fra 2 β-plader bundet sammen ved intraområde-disulfidbindingen; v-områder indeholder 9 anti-25 paralelle β-strenge, mens C-områder indeholder 7. Konstante områder deltes i Cl- og C2-sæt baseret på karakteristiske rester vist i fig. 9A. Cl-sættet omfatter proteiner, der er involveret i antigen-genkendelse. C2-sættet omfatter adskillige Fc-receptorer og protei-30 ner indvolveret i call-adhæsion herunder CD2, LFA-3, MAG og NCAM. ICAM-1-områder viste sig at være kraftigst homologe med områder fra C2-sættet anbringende ICAM-1 i dette sæt; dette afspejles i stærkere lighed til be- 81 DK 176020 B1 varede rester i C2- énd i Cl-områder som vist for β-strengene B-F i fig. 9. ICAM-områder står således meget bedre på linie med β-strenge A og G i C2-områder end med disse strenge i V- og Cl-områder, hvilket muliggør 5 gode grupperinger på tværs af hele C2 område-styrken. Opstilling af C2-områder fra NCAM, MAG og α Ι-β-glyco-protein er vist i fig. 9B og 9C; identitet varierer fra 28 til 33%. Opstilling af T-cellereceptor Va, 27% identitet og igM C-område 3 34% er desuden vist (fig. 9B, I 10 9D)·

En af de vigtigste karakteristika for immuno-globulinområder er de disulfid-bundne cysteinbrobindin-ger mellem B og F β-strenge, som stabiliserer β-lag-sandwichen; i ICAM-1 er cysteiner bevaret i alle til-15 fælde undtagen i streng f i område 4, hvor et leucin findes, som kan være rettet mod sandwichen og stabilisere kontakten som foreslået for visse andre B- og i C2-sæt områder. Afstanden mellem cysteinerne (43, 50, 52 og 37 rester) er som beskrevet for C2-sættet.

20 Til test for tilstedeværelsen af intrakæde- disulfidbindinger i ICAM-1, udsattes endotelcelle-ICAM-1 for SDS-PAGE under reducerende og ikke-reduce-rende . betingelser. Endotelcelle-ICAM-1 benyttedes fordi det udviser mindre glycosyleringsheterogenitet 25 end for JY eller hårcellemilt-ICAM-1 og tillader større følsomhed overfor skift i Mr. ICAM-1 rensedes derfor fra 16 timer LPS (5 yg/ml) stimulerede umbilicalvene-endotelcellekulturer ved immunoaffinltetschromatografi som beskrevet ovenfor. Acetoneudfældet ICAM-1 genop-30 slammedes i prøvepuffer (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970)) med 0,25% 2-mercaptoethanol eller 25 mM lodacetamid og bragtes til 100°C i 5 min. Prøverne underkastedes SDS-PAGE 4670 og sølvfarvning 4613. Endo- 82 DK 176020 B1 telcelle-ICAM-1 havde et tydeligt Mr på 100 Kd under reducerende betingelser og 96 Kd under ikke-reducerende betingelser, hvilket i høj grad tyder på nærværelsen af intrakædedisulfider i nativ ICAM-1.

5 Anvendelsen af den primære sekvens til forud sigelse af den sekundære struktur (Chou, P.Y., et al., Blochem. 12:211-245 (1974)} viste de 7 forventede β-strenge i hvert ICAM-1-område, mærket a-g øverst i fig. 9A, hvilket præcis opfylder forudsigelsen for et j 10 immunoglobulinområde og svarer til positionerne af strenge A-H i immunoglobuliner (nederst fig. 9A). Område 5 mangler A- og C-strengene, men da disse danner rammer om lagene, kan lagene stadig formes, f.eks. hvor streng D ersattes med streng C, som foreslået for 15 andre C2 områder; og den karakteristiske disulfidbinding mellem B- og F-strengene ville være upåvirket.

Kriterierne for område-størrelse, sekvenshomologi, be- < varelse af cysteindannelse af den formodede intra-område-disulfidbinding, tilstedeværelse af disulfidbin-20 dinger, og forudsagt β-lagstruktur opfyldes således alle til inkludering af ICAM-1 i den immunoglobuline supergene famille.

ICAM-1 viste sig at være yderst stærkt homolog med NCAM- og MAG-glycoproteiner fra C2-sættet. Dette er 25 af særlig interesse efter som både NCAM og MAG medierer celle-celleadhæstion. NCAM er vigtig i neuron-neuron og neuro-muskulære interaktioner (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)), medens MAG er vigig i neuron-oligodendrocyt og oligodendrocyt-oligodendro-30 cyt interaktioner under myelinering (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987)). Celleover fladeekspressionen af NCAM og MAG reguleres udviklingsmæssigt under henholdsvis nervesystemdannelse og 83' ' DK 176020 B1 myelinering analogt med den regulerede introduktion af ICAM-1 ved inflammation (Springer, T.A., et al., Ann.

Rev. Immunol. 5;223-252 (1987)). ICAM-1, NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)) og MAG (Salzer, J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957-965 5 (1987)) er ens i hovedstrukturen samt homologe eftersom hver er et integralmembranglycoprotein konstrueret ud fra 5 C2-områder, idet de danner det N-terminale ekstracellulære område, skønt nogle yderligere ikke-Ig-lignende sekvenser findes i NCAM mellem det sidste C2-10 område og det transmembrane område. ICAM-1 står over hele dets længde, herunder i transmembran og cyto-plasmiske områder på linie med MAG med 21%'s identitet; den samme % identitet findes ved sammenligning af 5 områder mellem ICAM-1 og NCAM-1. En skematisk sammen-15 ligning mellem den sekundære struktura af ICAM-1 og MAG er vist i fig.10. Område-for-område-sammenlignin- : ger viser at homologiniveauet mellem områderne indenfor ICAM-1 og NCAM-molekyler (x + standardafvigelse, henholdsvis 21 + 2,8% og 18,6 + 3,8%) er det samme som 20 homologiniveauet ved sammenligning af ICAM-1 områder med NCAM- og MAG-områder (henholdsvis 20,4 + 3,7 og 21,9 + 2,7). Skønt der er tegn på alternativ spaltning i de C-termlnale områder i NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al..

25 EMBO J. 6:907-914 (1987)) og MAG (Lai, C., et al♦,

Proc. Natl. Acad. Scl. (USA) 84 4377-4341 (1987)), har man ikke fundet noget tegn på dette ved sekvenseringen af endotel- eller HL-60 ICAM-l-kloner eller i de undersøgelser af ICAM-1-proteinrygraden og precursoren i en 50 lang række celletyper (Dustin M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)).

ICAM-1 fungerer som en ligand for LFA-1 i lymfo-cytinteraktioner med forskellige celletyper. Lymfo- 84 DK 176020 B1 cytter binder til ICAM-1 inkorporeret i kunstige membranbilag, og dette kræver LFA-1 på lymfocytten, hvilket direkte påviser LFA-l-interaktion med ICAM-1 (Marlin, S.D., et al., cell 51:813-819 (1987)). LFA-1 5 er et leukocytintegrin og har ingen immunoglobulin-lignende træk. Leukocytintegriner omfatter én integrin subfamilie. De andre to underfamilier medierer celle-i matrix interaktioner og genkender sekvensen RGD inden- I for deres ligander, som omfatter fibronetin, vitronec- 10 tin, collagen og fibrinogen (Hynes, R.O., Cell 48:549- 554 (1987); Ruoslahti, E., et al., Science 238:491-497 (1987)). Leukocytintegrinerne eksprimeres kun på leuko-cytter, er involveret i celle-celleinteraktioner og de eneste kendte ligander er ICAM-1 og iC3b, et frag-15 ment på den komplementære komponent C3, som ikke ud viser immunoglobulin-lignende træk, og som genkendes af Mac-1 (Kishimoto, T.K., et al., In: Leukocyt Typing III, McMichael, M. (ud.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A., et al., Ann♦ Rev. Immunol. 5: 20 223-252 (1987); Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med. 38^:175-194 (1987)). Baseret på sekvensanalyse er mulige peptider indenfor ICAM-l-sekvensen, genkendt af LFA-1, vist i Tabel 9.

DK 176020 B1 85

Tabel 9

Peptider inden i ICAM-1-sekvensen, som muligvis genkendes af LFA-1.

5 -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- 10 -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- ICAM-1 er det første eksempel på et medlem af den immunoglobuline supergene familie, som binder til et integrin. Skønt begge disse familier spiller en vigtig rolle ved celleadhæsion, har interaktioner mellem dem ikke tidligere været forventet. I modsætning hertil 20 er interaktioner indenfor immunoglobulingensuperfamili-en ganske almindelig. Det er meget sandsyneligt at yderligere eksempler på interaktioner mellem integrinet og immunoglobulinfamilierne vil kunne findes. LFA-1 genkender en ligand, forskellig fra ICAM-1 (Springer, 25 T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)), og leukocytintegrinet Mac-1 genkender en ligand, for-; skellig fra C3bi i neutrofil-neutrofiladhæsion (Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med. 36:175-194 (1987)). Rensede MAG-holdige vesikler binder yderlige-30 re til neuritter, som er MAG, og MAG må således være i stand til heterofil interaktion med en særskilt receptor (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987)).

86 DK 176020 B1 NCAM's rolle i neural-neural og neural-muskulære celleinteraktioner har været foreslået at skyldes de homofile NCAM-NCAM-interaktioner (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)). MAG's vigtige 5 rolle i intéraktioner mellem tilstødende, omdrejende loops i Schwann-celler omsluttende axoner under myelin-omslutningsdannelse kan skyldes interaktion med en særskilt receptor eller homofile MAG-MAG interaktioner. Homologien mellem NCAM og den hyppige forekomst af om-10 rådeområde-interaktioner indenfor den immunogobuline supergene familie rejser muligheden for at ICAM-1 kunne engageres i homofile interaktioner samt ICAM-l-LFA-1-heterofile interaktioner. Binding af B-lymfobastceller I som co-eksprimerer lignende tætheder af LFA-1 og ICAM-1 j 15 til ICAM-1 i kunstige eller cellulære monolag kan imid- I lertid fuldstændig inhiberes ved præbehandling af B- lymfoblasten med LFA-l-MAb, mens adhærence er upåvirket af B-lymfoblast-præbehandling med ICAM-l-MAb. Præbehandling af monolaget med ICAM-1-Mab ophæver fuldstan-20 dig binding (Dustin, M.L., et. al., J. Immunol.

]J7:245-254 (1986); Marlin, S.D., et_al., cell 51^:813-819 (1987)). Disse erkendelser viser at hvis ICAM-1 homofile interaktioner overhovedet forekommer, må de være meget svagere end heterofile interaktioner 25 med LFA-1.

Muligheden for at leukocytintegrinerne kender ligander på en fundamental anden måde stemmer overens med nærværelsen af en 180 restsekvens i deres a-under-enheder, der kan være vigtig i ligandbinding og som ik-30 ke findes i RGD-genkendelsesintegrinerne (Corbi, A., et al. (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)). Skønt man har foreslået at Mac-1 genkender RGD sekvens, som findes i iC3b 5086, er der ingen RGD-sekvens i ICAM-l (fig. 8).

87 DK 176020 B1

Dette er i overensstemmelse med det fibronetiske peptid GRGDSP og kontrolpeptidet GRGESP's manglende evne til at lnhibere ICAM-l-LPA-l-adhæsion (Marlin, S.D., et al., cell 51:813-819 (1987)). Beslægtede sekvenser, så-5 som PRGGS og RGEKE findes imidlertid i ICAM-l i områder, som siges at danne sløjfe mellem henholdsvis β-strenge a og b i område 2 og c og d i område 2 (fig.

9), og skulle således have mulighed for genkendelse.

Det er af interesse at det homologe MAG-molekyle inde-10 holder en RGD-sekvens mellem område 1 og 2 (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987); Salzer, J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957965 (1987)).

Eksempel 19 15 Southern og Northern Blots.

Southern blots gennemførtes under anvendelse af 5 yg genomisk DNA ekstraheret fra tre cellelinier; BL2, t en Burkitt lymfomacellelinie (en gave fra Dr. Gilbert Lenoir); JY og Er-LCL, EBV-transformerede B-lymfo-20 blastoidcellelinier.

DNA underkastedes digestion med 5X af den af fabrikanten anbefalet mængde af Bam Hl og Eco Ri endo-nucleaser (New England Biolabs). Efter elektroforese gennem en 0,8% agarosegel, overførtes DNA til en nylon-25 membran (Zeta Probe, BioRad). Filteret præhybridisere-des og hybridiseredes idet standardfremgangsmåderne fulgtes under anvendelse af ICAM cDNA fra HL-60 mærket x med a-(32P)d XTP's ved vilkårlig priming (Boehringer Mannheim). Northern blots gennemførtes under anvendelse 30af 20 yg total RNA eller 6 yg poly(A)+ RNA. RNA denatureredes og underkastedes elektroforese gennem en 1% agarose-formaldehydgel og elektro-overførtes til Zeta probe. Filtre præhybridiseredes og hybridiseredes som DK 176020 B1 88 beskrevet tidligere (Staunton, D.E., et al., Embo J.

6_: 3695-3701 (1987)) under anvendelse af HL-60 cDNA- proben af 3^P-mærkede oligonudeotidprober (beskrevet ovenfor).

5 Southern blots, hvor man benytter 3 kb cdna- proben og genomisk DNA underkastet digestion med Bam Hl og Eco Ri viste enkle dominerende hybridiserings-fargmenter på henholdsvis 20 og 8 kb, hvilket tyder på et enkelt gen og på at det meste af den kodende infor-10 mation findes indenfor 8 kb. I blots med tre forskellige cellelinier var der ikke tegn på restriktionsfragment polymorfisme.

Eksempel 20 15 Ekspression af ICAM-l-genet.

En "ekspressionsvektor" er en vektor, som (på grund af tilstedeværelsen af passende transkriptions-og/eller translationskontrolsekvenser) er i stand til at eksprimere et DNA- (eller cDNA)-molekyle, som har 20 været klonet i en vektor og derved producere et poly-peptid eller protein. Ekspression af klonede sekvenser forekommer, når ekspressionsvektoren introduceres i en passende værtscelle. Hvis en prokaryotlsk ekspressionsvektor benyttes vil den passende værtcelle således en-25 hver prokaryotlsk celle, der er i stand til at eksprimere de klonede sekvenser. Hvis man på lignende måde benytter en eukaryotisk ekspressionsvektor, ville den passende værtscelle være enhver eukaryotisk celle, der er i stand til at eksprimere de klonede sekvenser.

30 Da eukaryotisk DNA kan indeholde intervenerende sekvenser, og da sådanne sekvenser ikke kan fremstilles korrekt i prokaryotiske celler, foretrækkes det at anvende cDNA fra en celle, som er i stand til at eksprimere 89 DK 176020 B1 ICAM-l til opnåelse af et prokaryotisk genomisk ekspressionsvektorbibliotek. Fremgangsmåder til fremstilling af cDNA, og fremstilling af et genomisk bibliotek er angivet af Maniatis, T., et al. (Molecular Cloning: 5 A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,

Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Det ovennævnte ekspressionsvektors genomiske bibliotek benyttes til at frembringe en bank af værtceller (som hver indeholder et medlem af biblioteket).

10 Ekspressionsvektoren kan introduceres i værtcellen ved en række forskellige midler (dvs. transformation, transfektion, protoplastsammensmeltning, elektropore-ring osv.). Banken med ekspressionsvektor-holdige celler formeres klonisk, og dets medlemmer prøves indivi-15 duelt (under anvendelse af en immunoprøve) for at bestemme om de producerer et protein, der er i stand til at binde til antiICAM-1-antistof.

Ekspressionsvektorerne fra de celler, som producerer et protein, der er i stand til at binde til 20 anti-ICAM-antistof, analyseres dernæst yderligere for at bestemme om de eksprlmerer (og således indeholder) hele ICAM-l-genet, om de kun eksprlmerer (og indeholder) et fragment af lCAM-1-genet, eller om de eksprlmerer (og indeholder) et gen, hvis produkt ikke 25 er ICAM-l, skønt det immunologisk er beslægtet med ICAM-l. Skønt en sådan analyse kan gennemføres med ethvert egnet middel, foretrækkes det at bestemme nucleotidsekvensen af DNA- eller cDNA-fragmentet, som er klonet i ekspressionsvektoren. Sådanne nucleotld-30 sekvenser undersøges dernæst for at bestemme om de er i stand til at kode for polypeptider, som har den samme aminosyresekvens som ICAM-l's tryptiske digestionfragmenter (Tabel 5).

90 DK 176020 B1

En ekspressionsvektor som indeholder et DNA- eller cDNA-molekyle, der koder for ICAM-l-genet, kan således genkendes ved : (i) Evnen til direkte ekspression af et protein, som et i stand til at binde til anti-5*ICAM-1-antistof; og (ii) tilstedeværelsen af en nucleo-tidsekvens, der er i stand til at kode for hver af de tryptiske fragmenter af ICAM-1. Det klonede DNA-molekyle af en sådan ekspressionsvektor kan fjernes fra ekspressionsvektoren og isoleres på ren form.

10

Eksempel 21

Funktionelle aktiviteter af renset ICAM-1.

I celler fungerer ICAM-1 normalt som et overfladeprotein knyttet til cellemembranen. Funktionen af 15 renset ICAM-1 testedes derfor, efter at molekylet var rekonstitueret, i kunstige lipidmembraner (liposomer eller vesikler) ved opløsning af proteinet i detergent-solubiliserede lipider, efterfulgt af fjernelse af detergentet ved dialyse. ICAM-1 renset fra JY-celler og elueret i detergentet octylglucosid, som beskrevet 20 ovenfor, rekonstitueredes i vesikler, og ICAM-l-inde-hoIdende vesikler fusioneredes til dskglas eller plastkul tur brønde, som tillod påvisningen af cellebinding til proteinet.

7 5 Fremstilling af plane membraner og plast-bundne vesikler.

Vesikler fremstilledes ved fremgangsmåden af Gay et al. (J. Immunol. 136:2026 (1986)). Kort fortalt opløstes æggephosphatidylcholin og cholesterol 30 i trichlormethan og blandedes i et molært forhold på 7:2. Lipidblandingen tørredes til en tynd film under rotering under en strøm af nitrogengas og lyofilisere- 91 DK 176020 B1 des dernæst i 1 time for at fjerne alle spor af tri-chlormethan. Lipidfilmen opløstes dernæst i 1% oetyl-glucosid/0,14 M Nacl/20 mM Tris (pH 7,2) til en slut-koncentration af phosphatidylcholin på 0,1 mM. Ca.

5 10 yg renset ICAM-l eller human glycophorin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) som en kontrolmembran glycoprotein, sattes til hver af de opløste lipider. Protein-lipid-detergentopløsningen dialyseredes dernæst ved 4°C mod 3 hold af 200 voluminer af 20 mM 10 Tris/0,14 M NaCl, pH 7,2, og et hold af HBSS.

Plane membraner fremstilledes ved fremgangsmåden angivet af Brian et al., Proc. Watl. Acad. Sci. 81:6159 (1984). Dækglas (med en diameter på 11 mm) kobles i 15 min. i en 1:6 fortynding af 7X detergent (Linbro), vas-15 kedes natten over i destilleret vand, henstod neddyppet i 70% ethanol og lufttørredes. En 80 μΐ dråbe af en ve-sikelsuspension indeholdende enten ICAM-l eller glycop-i horln anbragtes på bunden af brøndene i en 24-brøndes klyngetestplade og de præparerede dækglas flød let på 20 toppen. Efter 20-30 min. inkubering ved stuetemperatur fyldtes brøndene med HBSS og dækglasset vendtes om for at bringe den plane membran opad. Brøndene vaskedes i dernæst omhyggeligt med HBSS for at fjernes ubundne ve- sikler. Den plane membranoverflade udsattes aldrig for 25 luft.

Under forsøgene med plane membraner smeltet til glasoverflader viste det sig, at vesikler indeholdende ICAM-l binder direkte til plastoverfladen af multi-brønde vævskulturplader og bevarer funktionel virkning 30 som bevist ved specifik cellebinding. Sådanne vesikler omtales herefter som "plast-bundne vesikler" (PBV), eftersom naturen af lipidvesikeler bundet til plast ikke er bestemt. Plast-bundne vesikler fremstilledes 92 DK 176020 B1 ved tilsætning af 30 μΐ vesikelsuspension direkte til bunden af brøndene i 96-brøndes vævskulturbakker (Falcon) efterfulgt af inkubering og vaskning, som beskrevet for plane membraner.

5

Celleadhæsionsprøver.

Celleadhæsionsprøver ved anvendelse af plane membraner eller plast-bundne vesikler gennemførtes begge to på 1 det væsentlige samme måde, med undtagelse af 10 at celleantallet og voluminer for PBV-prøver reduceredes til en femtedel af det, der benyttedes ved plane membranprøver.

T-lymfocytter fra normale kontroller og en patient med leukocytadhæsionsdefekt (LAD), hvis 15 celler ikke eksprimerer LFA-1 (Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668 (1985)) fremstilledes ved dyrkning af perifere mononukleære blodceller med 1 pg/ml Concanavalin-A (Con-A) i RPMI-1640 plus 20% FCS med 5 x 105 celler/ml i 3 dage. Cellerne vaskedes dernæst 20 to gange med RPMI og en gang med 5 mM methyl-a-D-mannopyranosid til fjernelse af resterende lectin fra celleoverfladen. Cellerne dyrkedes i RPMI/20% FCS indeholdende l ng/ml rekombinant IL-2, og benyttedes mellem 10 og 22 dage efter initieringen af kultur.

25 Til påvisning af cellebinding til plane membra ner eller PBV, radiomærkedes Con-A blaster, T-lymfoma SKW-3 og de EBV-transformerede B-lymfoblastoidcelle-linier JY (LFA-1 positive) og den LFA-1 defekte lymfoblastoidcellelinie (BBN) (som stammer fra patient 30 nr. 1, Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160; 1901-1918 (1986)) ved inkubering af 1 x 107 celler i 1 ml RPMI-1640/10% FCS med 100 uCi Na51Cr04 i 1 time ved 37°C efterfulgt af 4 vaskninger med RPMI-1640 til 93 DK 176020 B1 fjernelse af Ikke-Inkorporerede mærker. I monoklonalt antistofblokeringsforsøg præbehandledes celler eller plast-bundne veslkler med 20 yg/ml renset antistof 1 RPMI-l640/10% FCS ved 4°C i 30 min., efterfulgt af 54 vasknlnger til fjernelse af ubundet antistof. I forsøg for divalente kationers virkning på celle-binding, vaksedes cellerne en gang med Ca2+-, Mg2+-frit HBSS plus 10% dialyseret FCS, og CaCl og MgCl sattes til de indikerede koncentrationer. 1 alle forsøg præ-10 afbalanceredes celler og plane membraner eller PBV ved passende temperatur (4°C, 22°C eller 37°C) i den passende prøvepuffer.

Til måling af cellebinding til renset ICAM-1 centrifugeredes 51Cr-mærkede celler (5 x 105 EBV-15 transformanter 1 plane membranprøver; 1 x 105 EBV-transformanter eller SKW-3-celler, 2 x 105 Con-A-bla-ster i PBV-prøver). i 2 min. ved 25 x g på plane mem- braner eller PBV, efterfulgt af inkubering ved 4°C, 22°C eller 37eC i 1 time. Efter inkubering fjernedes 20 ubundne celler ved otte cycler med påfyldning og aspiration med puffer præindstillet til den passende temperatur. Bundne celler bestemtes ved solubilisering af brøndindholdet med 0,1 N NaOH/1% Triton x-100 og tælling på en y-tæller. Procent cellebinding bestemtes 25 ved at dividere cpm fra bundne celler med input celleassocieret cpm. 1 plane membranprøver korrigeredes input cpm for forholdet mellem dækglassets overfladeareal og dyrkningsbrøndenes overfladeareal.

I disse prøver bandt EBV-transformerede B-30 lymfoblastoidceller, SKW-3 T-lymfomaceller og Con-A T-lymfoblaster specifikt til ICAM-1 i kunstige membraner (fig. 11 og 12). Bindingen var specifik, eftersom cellerne bandt meget svagt til kontrol plane membraner 94 DK 176020 B1 eller vesikler Indeholdende ækvivalente mængder af et andet humant celleoverfladeglycoprotein, glycophorln. Yderligere bandt LFA-l-positive EBV-transformanter og Con-A blaster medens deres LFA-1-negative modparter ik-5 ke bandt 1 nogen signifikant udstrækning, hvilket viser at bindingen var afhængig af tilstedeværelsen af LFA-l på cellerne.

Både specifiteten af cellebinding og afhængighed af cellulær LFA-1 bekræftedes i monoklonale antistof-10 blokeringsforsøg (fig. 13). Bindingen af JY-celler kunne inhlberes med 97%, når ICAM-1 indeholdende PBV præbehandledes med anti-ICAM-1 monoklonalt antistof RR1/1. Præbehandling af cellerne med det samme antistof havde ringe virkning. Omvendt inhlberedes det 15 anti-LFA-l-monoklonale antistof TS1/18 binding med 96%, men kun når cellerne, men ikke PBV, var præbehandlet.

Et kontrolantistof T$2/9 reaktivt med LFA-3 (et andet lymfocytoverfladeantigen) havde ingen signifikant inhi-berende virkning, hverken når celler eller PBV præbe-20 handledes. Dette forsøg viser, at ICAM-1 i sig selv og ikke visse mindre forurenende materialer i de kunstige membraner, medierer den observerede cellulære adhæsion, og at adhæsionen er afhængig af LFA-l på bindingscellen.

25 Bindingen af celler til ICAM-1 i kunstige mem braner viser desuden to andre egenskaber hos det LFA-1 afhængige adhæsionssystem: Temperaturafhængig og nødvendigheden af divalente kationer. Som vist i fig. 14 bandt Con-A blaster til ICAM-1 i PBV mest effektivt ved 30 37°C, delvis ved 22°C og meget svagt veed 4°C. Som vist i fig. 15 var bindingen fuldstændig afhængig af tilstedeværelsen af divalente kationer. Ved fysiologiske koncentrationer var Mg2+ alene tilstrækkelig for maksi- 95 ‘ DK 176020 B1 mal cellebinding, mens Ca2+ alene giver meget lave niveauer af binding. En tiendedel Mg2'1’ af den normale koncentration sammen med Ca2+ var Imidlertid synergi-stlsk og frembragte maksimal binding.

5 Summarisk viser specifiteten af cellebinding til renset ICAM-1, inkorporeret i kunstige membraner, den specifikke inhibering med monoklonale antistoffer, og temperaturen og det divalente kationbehov viser, at ICAM-1 er en specifik ligand for det LFA-1 afhængige 10 adhæsionsystem.

Eksempel 22

Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR 1 allergiske og toxlske laptestreaktloner.

15 Hudbiopsier fra fem normale individer under søgtes for deres ekspression af ICAM-1 og HLA-DR. Det viste sig at medens endotelcellerne i nogle blodkar sædvanligvis eksprimerede ICAM-1, eksprimeredes der ingen ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud. Ingen 20 farvning for HLA-DR på nogle keratinocytter fra normale hudbiopsier observeredes. Kinetikken af ekspression af ICAM-1 og klasse Il-antigener undersøgtes dernæst på celler i biopsier fra allergiske og toxlske hudlæsioner. Det viste sig at halvdelen af de seks undersøgte 25 individer havde keratinocytter, som eksprimerede ICAM-1, fire timer efter anvendelse af hapten (Tabel 10). Der var en øgning i procentdelen af individer, der eksprimerer ICAM-1 på deres keratinocytter med tiden for udsættelse af hapten, samt en øgning af inten-30 siteten af farvning, hvilket indikerer mere ICAM-1 ekspression per keratinocyt op til 48 timer. Faktisk er der på dette tidspunkt en del keratinocytter i alle biopsier farvet positivt for ICAM-1. Ved .72 timer (24 95 DK 176020 B1 i timer efter hapten fjernedes) havde 7 ud af 8 individer stadigvæk ICAM-1 eksprimeret på deres keratinocytter, mens ekspressionen af ICAM-1 på et individ vandrede mellem 48 og 72 timer.

DK 176020 B1 97

Tabel 10

Kinetik af introduktion af ICAM-1 og HLA-DR på kerati-I nocytter fra allergiske labtestbiopsler.

5 _

Tid efter Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og lappåførsel af alene alene HLA-DR

(timer)_blopsier_;____

Normal hud_5_0_0_0_ 10 Allergisk laptest 4 6 3a 0 0 ! 8 9 3 0 0 24 8 7 0 0 15 48b 8 5 0 3 72 8 6 0 .1 20 25 a Prøver betragtedes som værende positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes. b Alle lapper fjernedes på dette tidspunkt.

i DK 176020 B1 98

Histologisk var farvningsmønsteret for ICAM-1 på keratinocytter fra blopsier taget fire timer efter påføring af hapten sædvanlig i små klynger. Ved 48 timer eksprimeredes ICAM-1 på overfladen af størstedelen af 5 keratinocytterne, idet der ikke sås nogen forskel mellem skadens center og periferi, intensiteten af farvningen aftog som keratinocytterne nærmedes stratum corneum. Dette konstateredes hos biopsier taget fra centrum og periferien af skaderne. På dette tidspunkt j 10 var laptesten også positiv (infiltration, erythema og vesikler). Der observeredes ingen forskel 1 ICAM-1 ekspression når forskellige haptener påførtes følsomme individer. Foruden keratinocytterne eksprimeredes ICAM-1 desuden på nogle mononukleære celler og endotel-15 celler på stedet med skaden foruden keratinocytterne.

Ekspressionen af HLA-DR på keratinocytter på de allergiske hudskader var mindre hyppige end ekspressionen af ICAM-1. Ingen af de undersøgte individer havde skader med keratinocytter, som farvede positivt for 20 HLA-DR op til 24 timer efter påførsel af hapten. Fak-I tisk havde kun fire biopsiprøver keratinocytter, som eksprimerede HLA-DR og ingen biosier havde keratinocytter, der var positive overfor HLA-DR og ikke ICAM-1 (Tabel 10).

25 I modsætning til den allergiske laptestskade havde den toxiske laptestskade, induceret med kroton-olie eller natriumlaurylsulfat, keratinocytter, der udviste ringe, hvis nogen, ICAM-1 på deres overflader på alle testede tidspunkter (Tabel 11). Faktisk havde kun 30 én af de 14 individer, der var udsat for den toxiske laptest keratinocytter, der eksprimerede ICAM-1 i deres skader 48 timer efter lappåførslen, hvilket tidspunkt er det optimale tidspunkt for ICAM-l-ekspression 99 DK 176020 B1 hos de allergiske laptestindivider. I modsætning til de allergiske laptestbiopsier eksprimeredes der desuden ikke HLA-DR på keratinocytter af toxiske laptest-skader.

5 Disse data indikerer at ICAM-1 eksprimeres i immunbaseret inflammation og ikke i toxisk baseret inflammation, og ekspressionen af ICAM-1 kan således benyttes til at skelne mellem immunobaseret- og toxisk baseret inflammation, såsom akut nyresvigt hos nyre-10 transplantationspatienter, hvor det er vanskeligt at bestemme hvorvidt svigtet skyldes afvisning eller nephrotoxicitet af det immunoundertrykkende terapeutiske middel. Nyrebiopsi og vurdering af opregulering af ICAM-1 ekspressionen vil tillade differentiering mellem 15 immunbaseret afvisning og ikke-immunbaseret toxicitets-reaktion.

* DK 176020 B1 100

Tabel ll

Kinetik af introduktion af ICAM-l og HLA-DR på kerati-nocytter fra toxiske laptestbiopsier.

5 _

Tid efter Antallet ICAM-l HLA-DR ICAM-l og

lappåførsel af alene alene HLA-DR

(timer)_blopsler_ 4 4 0 0 0 8 3 la 0 0 10 24 3 1 0 0 48b 14 10 0 72 3 1 0 0 a Prøver betragtedes som værende positive, hvis i det 15 mindste små klynger af keratinocytter farvedes.

b Alle lapper fjernedes på dette tidspunkt._ DK 176020 B1 101

Eksempel 23

Eksprimerlng af ICAM-1 og HIA-PR i godartede kutane sygdomme«

Celler fra hudbiopsler med skader fra patienter 5 med forskellige typer af inflammatoriske hudsygdomme undersøgtes for deres ekspression af ICAM-1 og HLA-DB.

En del keratinocytter 1 biopsier med allergisk kontakteksem, pemphigoid/pemphigus og lichen planus eksprime-rede ICAM. Lichen planus-biopsler viste den mest inten-10 se farvning med et mønster svarende til eller endog stærkere end dem, der konstateredes hos de 48 timer allergiske laptestbiopsier (Tabel 12). 1 overensstemmelse med resultaterne, der sås ved den allergiske laptest konstateredes den mest intensive iCAM-l-farvning på I 15 steder med kraftig mononuklesr celleinfiltration. 8 ud af de 11 testede lichen planus-biopsier var yderligere positive for HLA-DR ekspression på keratinocytter.

Ekspressionen ' af ICAM-1 på keratinocytter fra hudbiopsler fra patienter med exanthema og urticaria 20 var mindre udtalte. Kun fire ud af de syv testede patienter med disse sygdomme havde keratinocytter, der eksprimerede ICAM-1 på læsionsstedet. HLA-DR ekspressionen viste sig kun på én patient, og dette var i konjunktion med ICAM-1.

25 Endotelceller og en del af de mononukleære cel- leinfiltrater fra alle de testede godartede inflammato-’. riske hudsygdomme eksprimerede ICAM-1 i forskellig udstrækning.

DK 176020 B1 102

Tabel 12

Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR på keratlnocytter fra godartede kutane sygdomme.

5 Diagnose Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og _af tilfælde alene alene HLA-DR_

Allergisk kontakteksem 5 3a 0 2

Lichen Planus 11 30 θ 10 Pemhigoid/

Pemhigus 2 200

Exanthema 3 2 0 0

Urticaria 4 1 01 15 » i Λ

Prøver betragtedes som værende positive, hvis mindst 20 små klynger af keratlnocytter farvedes.

i i i DK 176020 B1 103

Eksempel 24

Ekspression af ICAM-1 på keratlnocytter fra hudskader hørende til psoriasis.

Ekspressionen af ICAM-1 i hudsbiopsler fra 5 pa-5 tienter med psoriasis undersøgtes før initieringen og periodisk under et forløb med PUVA-behandling. Biopsier opnåedes fra fem patienter med klassisk psoriasis bekræftet ved histologi. Biopsier blev udtaget i rækkefølge før og under indikeret tid for PUVA-behandling.

PUVA tilførtes 3-4 gange om ugen. Biopsier blev taget 10 fra periferien af psoriasis plagues hos fem patienter og yderligere biopsier blev taget fra klinisk normal hud fra fire af patienterne.

Friske hudbiopslstykker blev frosset og opbevaret i flydende nitrogen. Seks ymm cryostatsektioner luft-15 tørredes natten over ved stuetemperatur, fikseredes i acetone 1 10 min. og farvedes enten straks eller ind-vikledes i aluminiumfolie og opbevaredes ved -B0°C ind-I til farvning.

Farvning gennemførtes på den efterfølgende måde.

20 Sektioner inkuberedes med monoklonale antistoffer og farvedes ved en 3-trlns immunoperoxidasemetode (Stein, H., et al., Adv. Cancer Res 42:67-147, (1984)), under anvendelse af diaminobenzidin H202~substrat. Tonsiler og lymfeknuder benyttedes som en positiv kontrol på 25 anti-ICAM-1- og HLA-DR-farvning. Væv farvet i fra-, vær af et primært antistof var negative kontroller.

De monoklonale antistoffer mod HLA-DR erhveredes fra Becton Dickinson (Mountainview, California). Det monoklonale anti-ICAM-l-antistof var R6-5-D6. Peroxida-30 se-konjugeret kanin-anti-muse-Ig og peroxidase-konju-geret svine-anti-kanin-Ig erhvervedes fra DAKAPATTS, København, Danmark. Diamlnobenzidin-tetrahydrochlorid opnåedes fra Sigma (St. Louis, Mo.).

104 - DK 176020 B1

Resultaterne af undersøgeisen viste at endotel-cellerne i nogle blodkar eksprimerer ICAM-1 1 både syg og normal hud, men intensiteten af farvning og antallet af blodkar, der eksprimerer ICAM-1 øgedes i psoriasis-5 hudskaderne. Mønsteret af ekspression af ICAM-1 varierede yderligere i keratinocytter fra ubehandlet psoriasis-hudskader fra de fem patienter, fra kun små klynger med cellefarvning til at mange farvede keratinocytter.

Under forløbet med PUVA-behandling viste ICAM-l-eks-10 pressionen på to af patienterne (patient nr. 2 og 3) udbredt reduktion, som gik forud eller var samstemmende med klinisk remission (Tabel. 13). Patienterne nr. 1, 4 og 5 havde formindskelse og øgning af ICAM-1ekspression vinder PUVA-behandlingen, hvilket korrelerer til hen-15 holdsvis kliniske remissioner og tilbagefald. Der var ingen ICAM-l-ekspression på keratinocytter fra normal hud før eller efter PUVA-behandling. Dette indikerer, at PUVA ikke inducerer ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud.

20 Observationen af at densiteten af det mononukl- eære celleinfiltrat korrelerede med mængden af ICAM-1-ekspression på keratinocytter var af betydning. Dette vedrører både et aftagende antal mononukleære celler i skader under PUVA-behandling, når ICAM-l-ekspression 25 desuden vandrede, og et øget antal af mononukleære celler under PUVA-behandling, når ICAM-l-ekspression på keratinocytter var mere fremtrædende. Endotelceller og dermale mononukleære celler er desuden ICAM-l-positive.

I klinisk normal hud, var ICAM-1-ekspressionen be-30 grænset til endotelceller uden mærkning af keratinocytter.

Ekspressionen af HLA-DR på keratinocytter var variabel. Der var ingen HLA-DR-positiv blopsi, der ikke også var ICAM-l-positiv.

105 DK 176020 B1

Summarisk viser disse resultater at før behandling er ICAM-1-ekspression udtalt på keratinocytter-ne og korrelerer til et tæt mononukleær celleinfiltrat.

Under PUVA-behandling ses en udtalt mindskelse af 5 ICAM-l-farvning parallelt med den kliniske forbedring. Histologisk mindskedes det dermale infiltrat også. Når et klinisk tilbagefald var tydelig under behandling øgedes ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytterne og tætheden af dermal infiltrat. Når en klinisk remission 10 konstateredes under behandling var der en samtidig aftagelse i ICAM-l-farvning på keratinocytterne og en mindskelse i det dermale infiltrat. Ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytter svarer således til tætheden af mononukleær celleinfiltrat på dermis. Disse data viser 15 at klinisk reaktion overfor PUVA-bebandling resulterer i en udtalt mindskelse af ICAM-l-ekspression på keratinocytter parallelt med en mere moderat aftagelse af de t mononukleære celler. Dette Indikerer at lCAM-1-ekspres-sion på keratinocytter er ansvarlig for initering og 20 opretholdelse af det dermale infiltrat og at PUVA-behandling nedregulerer ICAM-1, som på sin side mindsker det dermale infiltrat og den inflammatoriske reaktion.

Dataene indikerer desuden at der var en variabel HLA-DR-ekspression på keratinocytter under PUVA-behandling.

25 Ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytter med psoriasisskader korrelerer med den kliniske alvorlighed af skaden samt størrelsen af dermal infiltrat. ICAM-l spiller således en central rolle ved psoriasis og inhibering af dets ekspression og/eller inhibering af 30 dets interaktion med CD 18 komplekset på mononucleare celler vil være en virkningsfuld behandling af sygdommen. Registrering af ICAM-l-ekspression på keratinocytter vil yderligere være et effektivt værktøj til 106 DK 176020 B1 dlagnostisering og prognose, samt evaluering af terapiforløbet for psoriasis.

i 107 DK 176020 B1

Tabel 13

Sekventiel ICAM-1-ekspression af keratlnocytter 1 hudskader med psoriasis (PS) og klinisk normal hud (N) før og under PUVA-behandling.

5 _ patient nr.

Tid før og 1 2 3 4 5 under

PUVA-behandling PS PS N PS N PS N PS N

10 0 + + -++-++· ♦++ -1 dag + 1 uge + + - -++- + . I ® 2 uger ++ 3 uger -H- * 0 15 4 uger ++ + - ++ * * 5-6 uger ’ - ~ 0 7 uger (++) (+) +++ " * - * 10 uger (+) 20 _ +++ Mange positive keratlnocytter.

++ En del positive keratlnocytter.

+ Fokalt positive keratlnocytter.

(+) Meget få, spredte positive keratlnocytter.

30 - ingen positiv farvning, x Klinisk remission, o Klinisk tilbagefald.

DK 176020 B1 108

Eksempel 25

Ekspression af ICAM-l og HLA-DR i maligne kutane sygdomme.

Modsat læsioner fra godartede kutane tilstande 5 var ekspressionen af ICAM-l på keratinocytter fra maligne hudskader meget mere variable (Tabel 14). Af de 23 undersøgte kutane T-cellelymfomas, Identificeredes ICAM-lpositive keratinocytter kun i 14 tilfælde. Der var en tendens til at keratinocytter fra blopsier med 10 mycosis fungoide skader taber deres ICAM-l-ekspression ved udvikling af sygdommen til mere fremskridne trin. ICAM-l-ekspression observeredes imidlertid på en varierede del af det mononucleare celleinflltrat fra de fleste af de kutane T-cellelymfomaskader. Blandt de re-15 sterende undersøgte lymfoma havde fire ud af otte keratinocytter, der eksprimerede ICAM-l. Af de 29 patienter f med maligne kutane sygdomme, som undersøgtes havde 5 keratinocytter, som eksprimerede HLA-DR uden at eksprlmere ICAM-l (Tabel 14).

t . DK 176020 B1 109

Tabel 14

Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR på keratinocytter fra maligne kutane sygdomme.

5

Diagnose Antal af ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og

_tilfælde alene alene HLA-DR

CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 10 CTCL, SS 3 10 2 CTCL, Stor celle 2020 CBCL 2 0 0 1

Leukemia Cutis 3111

Histiocytosis XI 00 0 15 _ i aPrøver betragtedes som værende positive, hvis små klynger af keratinocytter farvedes.

s.

110 DK 17602Θ B1

Eksempel 26

Virkning af antl-ICAM-l-antlstoffer på prollferatlonen af humane perifere mononukleare blodceller.

Humane perifere mononukleære blodceller induce-5 redes for at proliferere ved tilstedeværelsen og genkendelsen af antigener eller mitogener. Visse molekyler , såsom mitogenet concanavalin A, eller det T-celle-| bindende antistof 0KT3 forårsager en ikke-specifik I proliferation af perifere mononukleære blodceller.

! 10 Humane perifere mononukleære blodceller er heterogene, idet de består af subpopulationer af celler, som er i stand til at genkende specifikke antigener. Når en perifer mononukleær blodcelle, som er 1 stand til at genkende et særligt specifikt antigen, 15 møder dette antigen induceres proliferationen af denne subpopulation af mononukleær celle. Tetanus toxoid og "keyhole limpet" hæmocyanin er eksempler på antigener, som genkendes af subpopulationer af perifere mononukleære blodceller, men som ikke genkendes at alle pe-20 rifere mononukleære celler hos sensibiliserede individer.

Anti-ICAM-l-momoklonalt antistof R6-5-D6's evne til at inhibere prolifererende reaktioner fra humane perifere mononukleære blodceller i systemer, der vides 25 at kræve celle-celleadhæsioner testedes.

Perifere mononukleære blodceller rensedes på Ficoll-Paque (Pharmacia) gradienter ifølge fabrikantens instruktioner. Efter opsamling af grænsefladen vaskedes cellerne tre gange med RPMI 1640 medium og dyrkedes i 30 fladbundede, 96-brøndes mikrotiterplader i en koncentration på 106 celler/ml i RPMI 1640 medium suppleret med 10% fetal bovin serum, 2 mM glutamin og gentamicin (50 pg/ml).

DK 176020 B1 111 i i

Antigen, enten T-cellemitogenet, concanavalin A (0,25 yg/ml), det T-celle-bindende antistof, OKT3 (0,001 yg/ml), "keyhole limpet” hæmocyanin (10 g/ml) eller tetanus toxoid (1:100 fortynding fra kilde) sat-5 tes til celler, som dyrkedes som beskrevet ovenfor enten i nærværelse eller fravær af anti-ICAM-antistof (R6-5-D6; slutkoncentration på 5 g/ml). Cellerne dyrkedes i 3,5 dage (concanavalin A forsøg), 2,5 dage (OKT3-forsøg) eller 5,5 dage ("keyhole limpet" hæmocyanin j 10 og tetanus toxoid-forsøg) før prøverne afsluttedes.

18 timer før afslutningen af prøven sattes 2,5 yCi 3H-thymidin til kulturerne. Cellulær proliferation prøvedes ved at måle inkorporereingen af thymidin i dna ved de perifere mononukleære blodceller, inkor-15 poreret thymidin opsamledes og taltes i en flydende scintilationstæller (Merluzzi et al., J. Immunol.

139:166-168 (1978)). Resultaterne af disse forsøg er vist i fig. 16 (concanavalin A-forsøg), fig. 17 (OKT3-forsøg), fig. 18 ("keyhole limpet" hæmocyanin-forsøg) 20 og fig. 19 (tetanus toxoid-forsøg).

Det viste sig, at anti-ICAM-l-antistof inhiberer proliferative reaktioner overfor det ikke-specifikke T-cellemitogen, ConA; det ikke-specifikke T-celleassocierede antigen, OKT-3; og de specifikke anti-25 gener, "keyhole limpet" hæmocyanin og tetanus toxoid, i mononukleære celler. Inhiberingen af anti-ICAM-1-antistof var sammenlignelig med det anti-LFA-i-anti-stof, der antyder at ICAM-1 er en funktionel ligand af ICAM-1, og at antagonisme af ICAM-1 vil inhibere speci-30 fikke forsvarssystemreaktioner.

DK 176020 B1 112

Eksempel 27 virkning af anti-lCAM-1-antistof p& den blandede lymfocytreaktion.

Som omtalt ovenfor er ICAM-1 nødvendig for ef-5 fektive cellulære interaktioner under en immunreaktion medieret gennem LFA-1-afhængig celleadhæsion. Introduktionen af ICAM-1 under immunreaktioner eller inflammatorisk sygdom tillader interaktionen af leukocytter med hinanden og med entodelceller.

* 10 Når lymfocytter fra to ikke-relaterede individer dyrkes i hinandens nærværelse observeres blasttransfor-mation og celleproliferation af lymfocytterne. Denne reaktion af én population af lymfocytter overfor nærværelsen af en anden population af lymfocytter er kendt 15 som en blandet lymfocytreaktion (MLR), og den er analog med reaktionen af lymfocytter overfor tilsætningen af mitogener (Immunology The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, j., John Wiley & Sons, NY (1982), S. 453-4581).

20 Der gennemførtes forsøg til bestemmelse af vir kningen af anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer på human MLR. Disse forsøg gennemførtes som følger. Perifert blod opsamledes fra normale raske donorer ved vene-punktur. Blodet opsamledes i heparinisrede rør og for-25 tyndes 1:1 ved stuetemperatur med Puck's G (GIBCO) balancerede saltopløsning (BSS). Blodblandingen (20 ml), anbragtes ovenpå 15 ml af en Ficoll/Hypaque densitets gradient (Pharmacia, tæthed = 1,078 stuetemperatur) og centrifugeredes ved 1000 x g i 20 min. Grænsefladen op-30 samledes og vaskedes 3X i Puck's G. Cellerne taltes på et hæmacytometer og genopslæmmedes i RPMI-1640 dyrkningsmedium (GIBCO) indeholdende 0,5% gentamicin, 1 mM Lglutamin (GIBCO) og 5% varmeinaktiveret (56°C, 30 . 113 DK 176020 B1 min.) human AB sera (Flow Laboratories) (herefter omtalt som RPMI-dyrkningsmedium).

Muse-anti-lCAM-l (R6-5-D6) benyttedes i disse forsøg. Alle monoklonale antistoffer (fremstillet fra 5 ascites af Jackson immunoResearch Laboratories, Boston, MA) benyttedes som rensede IgG-præparater.

Perifere mononucleare blodceller (PBMC) dyrkedes i medium med 6,25 x 103 celler/ml i Linbro rund-bundede mikrotiterplader (# 76-013-05). Stimulator- 10 celler fra en adskilt doner bestråledes ved 1000 R og dyrkedes med respondercellerne ved den samme koncentration. Det totale volumen per kultur var 0,2 ml. Kontroller omfattede responderceller alene og stimulatorceller alene. Dyrkningspladerne inkuberedes ved 37°C i 15 en 5% C02-fugtet luftatmosfære i 5 dage. Brøndene pulseredes med 0,5 pCi tri..... thymidin (3HT) (New Eng land Nuclear) i mindst 18 timer per kultur. I nogle tilfælde gennemførtes en 2-vejs MLR. Protokollen var den samme med undtagelse af at den anden donors celler I 20 ikke inaktiveredes ved bestråling.

i Cellerne høstedes på glasfiberfiltre under an vendelse af et automatiseret multiprøvehøstapparat (Skatron, Norge), idet der rensedes med vand og methanol. Filtrene ovntørredes og taltes i Aquasol i en Bec-25 kman (LS-3801) flydende scintillatortæller. Resultaterne er angivet som middelværdien af CPM + middelfejl for 6 individuelle kulturer.

Tab. 16 viser at rensede anti-ICAM-1 monoklonale antistoffer inhiberer MLR på en dosisafhængig måde med 30 signifikant undertrykkelse synlig ved 20 ng/ml. Renset muse-IgG havde ringe eller ingen undertrykkende virkning. Undertrykkelse af MLR med det anti-ICAM-1 monoklonale antistof forekommer når antistoffet tilsættes indenfor de første 24 timers dyrkning (Tabel 17).

DK 176020 B1 114

Tabel 16

Virkning af anti-ICAM-l-antistof på én-vejs lymfocyt-reaktionen.___ 5 b * 3 *

Responderæller3 'stimriatoræller 'Antistof0 iff · Inkorporation (CM) 445d ± 143 + - 148 i 17 ! + - - 698+72 10_____ + + 42,626 i 1,579

. - I

+ + nilgG (10.0 ug) 36,882 ± 1,823 (14%) + + mlgG ( 0.4 ug) 35,500 i 1,383 (17%) 15 + + mlgG ( 0.02 ug) 42,815 + 1,246 ( 0%) i + .+ R6-5-D6 (10.0.ug) .-8,250 ± 520 (81%) + + R6-5-D6 (0.4 ug) 16,142 ± 858 (62%) + + R6-5-D6 ( 0.03 ug) 28,844 ± 1,780 (32%) 20 a. Responderceller (6,25 X 105/ml) b. Stlmulatorceller (6,25 X 105/ml, bestrålet ved 10000R).

c. Renset monoklonalt antistof til ICAM-1 (R6-5-D6) eller renset muse IgG (mlgG) ved slutkoncentra- 25 tioner (pg/ml).

cl. Middelværdi + middelfejl af 5-6 kulturer, an tallet i parentes indikerer procent inhibering __af MLR.__ DK 176020 B1 ! 115

Tabel 17

Tilsætningstidspunkt af anti-ICAM-1.

5 Ra Sb Tilsætninger0 3HT Inkorporering (CPM)

Tilsxtningstidspunkt for medium eller antistof - - - ♦ ♦ - - * - " * *

Dag 0 Oag 1 Dag 2 10 - - medium 205di 14 476 i 132 247 t 75 + medium 189 ± 16 nde nd + - medium 1,860 i 615 nd nd + + medium 41,063 i 2,940 45,955 i 2,947 50,943 i 3,072 + + R6-5-D6 17,781 ± 1,293 38,409 ± 1,681 47,308 ± 2,089 (57%)' (16%) (7%) a. Resonderceller(,25 x l05/ml).

20 b. Stimulatorceller (6,25 x 105/ml, bestrålet ved 1000 R).

c. Dyrkningsmedium eller renset monoklonalt anti stof til ICAM-l (R6-5-D6) ved 10 pg/ml tilsattes på dag 0 med 24 timers intervaller.

25 d. Middelværdi + middelfejl af 4-6 kulturer.

e. nd = ikke udført.

f. Procent inhibering DK 176020 B1 116

Antistofs evne til overfor ICAM-1 at inhibere MLR viser at ICAM-1 monoklonale antistoffer har terapeutisk anvendelse ved akut transplantationsafvisning.

ICAM-1 monoklonale antistoffer har desuden terapeutisk 5 virkning hvad angår immunmedierede sygdomme, der afhænger af LFA-l/ICAM-1 regulerede celle til celle interaktioner.

De her beskrevne forsøg viser at tilsætningen af j monoklonale antistoffer til ICAM-1 inhiberer den blan- 10 dede lymfocytreaktion (MUR), når de tilsættes under de første 24 timer af reaktionen. ICAM-1 bliver yderligere opreguleret på humane perifere blodmonocytter under in vitro dyrkning.

Det har yderligere vist sig, at ICAM-1 ikke 15 eksprimeres på hvilende humane perifere blodlymfocytter eller -monocytter. ICAM-1 opreguleres på monocytterne af dyrkede celler alene eller celler, der er codyrket med ikke-relaterede donorceller i en blandet lymfo-cytreaktion under anvendelse af almindelige flowcyto-20 metriske analyser (fig. 20). Denne opregulering af ICAM-1 på monocytter kan anvendes som en indikator for inflammation, især hvis ICAM-1 eksprimeres på friske monocytter fra individer med akut eller kronisk inflammation .

25 ICAM-1's specificitet for aktiverede monocytter og antistoffets evne overfor ICAM-1 til at inhibere en MLR antyder at ICAM-1-monoklonale antistoffer må have en diagnostisk og terapeutisk mulighed ved akut transplantationsafvisning og relaterede immunmedierede 30 sygdomme, der kræver celle til celle interaktioner.

OK 176020 B1 117

Eksempel 28

Synergistlske virkninger af den kombinerede administrering af anti-lCAM-l- og antl-LFA-i-antistoffer.

Som vist i eksempél 27 inhiberes MLR af anti-5 ICAM-l-antistof. MLR kan desuden inhiberes af anti-LPA-l-antistoffet. For at bestemme hvorvidt den kombinerede administration af anti-lCAM-1- og anti-LFA-l-antistoffer ville have en forbedret eller synergistisk virkning gennemførtes en MLR-prøve (gennemført som be-10 skrevet i eksempel 27) i nærværelse af forskellige koncentrationer af de to antistoffer.

Denne MLR-prøve viste at kombinationen af anti-ICAM-1 plus ' anti-LFA-1, i koncentrationer hvor intet antistof alene dramatisk inhiberer MLR, er signifikant 15 mere potente i inhibering af MLR-reaktionen (Tabel 18).

Dette resultat indikerer at terapier som involverer j coadministreringen af anti-iCAM-i-antistof (eller frag-

I I

! menter deraf) og anti-LFA-l-antistof (eller fragmenter deraf) har kapaciteten til at bibringe en forbedret 20 anti-inflammatorisk terapi. Sådan en forbedret terapi muliggør administrering af lavere doser af antistof, end der ellers ville være terapeutisk effektivt, og dette er af vigtighed, hvor høje koncentrationer af individuelle antistoffer inducerer en antiidiotyptisk re-25 aktion.

DK 176020 B1 118

Tabel 18 virkning af forskellige doser af anti-ICAM-l og (R3.1) anti-LFA-1 på blandet lymfocytreaktIon.

5 % inhlbering

Koncentration (pg/ml)

Anti-ICAM-1 (R6-5-D6)

Anti-LFA-1 0 0,004 0,02 0,1 0,5 2,5 100,0 0 7 31 54 69 70 0,0008 1 7 28 48 62 71 0,004 0 13 30 50 64 72 0,02 29 38 64 75 84 86 0,1 92,5 90 91 92 92 92 150,5 93 90 90 92 93 91

Eksempel 29

Virkning af antl-ICAM-1-antistof ved undertrykkelse af 20afvisningen af transplanterede alloqene organer.

For at vise virkningen af anti-ICAM-l-antistof ved undertrykkelse af afvisningen af et allogenisk transplanteret organ, transplanteredes Cynomolgus aber med allogene nyrer 1 overensstemmelse med fremgangs-25måden beskrevet af Cosimi et al. (Transplant. Proc. 13; 499-503 (1981)) med dem ændring at valium og ketamin benyttedes som anasthesla.

Nyretransplantationen gennemførtes således i det væsentlige som følger. Heterotropisk nyreallotransplan-30tation gennemførtes i 3-5 kg Cynomolgus aber, i det væsentlige som beskrevet af Marquet (Marguet et al ♦,

Medical Primatology, Part II, Basel, Karger, s. 125 (1972)) efter induktion af anasthesla med valium og 119.

DK 176020 B1 ketamin. Ende-tll-side anastomoser af donor nyrekar på et stykke af aorta eller vena cava konstrueredes linder anvendelse af 7-0 Prolene sutur. Donorureter spa-tuleredes og Implanteredes Ind 1 blæren ved hver ek-5 straveslale adgang (Taguchi, Y., et al., 1 Dausset et al. (eds). In: Advances In Transplantation, Baltimore, Williams & Wilkins, s. 393 (196Θ)). Nyrefunktion evalueredes ved ugentlig eller to gange ugentlig serum-creatinin-bestemmelser. Yderligere skaffedes hyppige 10 allotransplantationsblopsier til histopatologiske undersøgelser, og fuldstændige autopsier gennemførtes på alle ikke-overlevende modtagere. Hos de fleste modtagere gennemførtes bilateral nephrectomi på transplantationstidspunktet og efterfølgende uremisk død be-15 tragtedes som slutpunktet for allotransplantationsoverlevelse. Hos nogle modtagere gennemførtes unilateral nativ nephrectomi og kontralateral ureteral ligation på transplantationstidspunktet. Når allotrans-plantationsafvisning forekom fjernedes ligaturen på den 20 autologe ureter, hvilket resulterede i restituering af normal nyrefunktion og muligheden for at fortsætte immunologisk registrering hos det modtagne dyr.

Monoklonalt antistof R6-5-D6 administreredes dagligt i 12 dage, startende to dage før transplanta-25 tlon, i en dosis på 1-2 mg/kg/dag. Serumkoncentrationer af creatinin testedes periodisk for at registrere afvisning. Virkningen af anti-ICAM-l-antistof på immuno-systemets afvisning af de allogeniske nyrer er vist i Tabel 15.

DK 176020 B1 120

Tabel 15

Overlevelsestid for allogene nyremodtagere.

Kontrol- Overlevelses- R6-5-D6 be- Overlevelses- 5 .abe~#_tid (dage)_handlet abe tid (dage)5 1 8 1 20 2 11 2 8 3 11 3 30 10 4 10 4 31 5 9 5 11 6 10 6 23b 15 a Dyrene tildeltes 1-2 mg/kg/dag i 12 dage startende 2 dage før transplantationen. b Stadig 1 live den 8. april 1988._

Resultaterne viser at R6-5-D6 var effektiv ved 20 forlængelse af livet hos aber, der modtog allogene nyretransplanteringer .

Claims

121 DK 176020 B1

1. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det er R6-5-D6, der er i stand til at binde til et molekyle, valgt fra gruppen bestående af ICAM- 5. og funktionelle derivater af ICAM-1.

2. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at molekylet er i stand til at binde til en receptor, der findes på overfladen af en lymfocyt, og at bindingen af antistoffet til molekylet svækker mo- 10 lekylets evne til at binde til lymfocyttens receptormolekyle .

3. Antistof ifølge et vilkårligt af kravene 1-2, kendetegnet ved, at det er på mærket form.

4. Hybridomacelle, kendetegnet ved, at 15 den er i stand til at producere det monoklonale antistof ifølge et vilkårligt af kravene 1, 2 eller 3.

5. Hybridomacelle, kendetegnet ved, at den er i stand til at producere det monoklonale antistof R6-5-D6, idet cellen er ATCC HB 9580.

6. Fragment af antistoffet ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det er i stand til at binde til molekylet.

7. Fragment af antistoffet ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er på mærket form.

8. Fremgangsmåde til diagnosticering af tilstede værelsen og lokaliseringen af en ICAM-1-eksprimerende tumorcelle i et pattedyr eller menneske, som man formoder indeholder en sådan celle, kendetegnet ved, at den omfatter: 30 (a) inkubering af en vævsprøve fra individet, med en blanding indeholdende en detekterbart mærket bindingsligand, der er i stand til at binde til ICAM-1, idet liganden vælges fra gruppen bestående af et an- 122 DK 176020 B1 tistof ifølge et vilkårligt af kravene 1-3 og et fragment af et antistof ifølge et vilkårligt af kravene 6 eller 7, hvor fragmentet er i stand til at binde til ICAM-1, og 5 (b) detektering af bindingsliganden.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder et antistof eller toxinafledt antistof ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, der er i stand til at binde til et molekyle valgt blandt

10 ICAM-1 og et funktionelt derivat af ICAM-1, eller et fragment af et antistof eller toxin-afledt fragment af et antistof ifølge et vilkårligt af kravene 6 eller 7, idet fragmentet er i stand til at binde til et molekyle valgt blandt ICAM-1 og et funktionelt deri-15 vat af ICAM-1, sammen med en inert farmaceutisk bærer .

10. Anvendelse af et antistof eller toxinafledt antistof ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, der er i stand til at binde til et molekyle valgt blandt

20 ICAM-1 og et funktionelt derivat af ICAM-1, eller et fragment af et antistof eller toxinafledt fragment af et antistof ifølge et vilkårligt af kravene 6 eller 7, hvilket fragment er i stand til at binde til et molekyle valgt blandt ICAM-1 og et funktionelt deri-25 vat af ICAM-1, til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af inflammation, der stammer fra en reaktion fra det specifikke forsvarssystem hos et pattedyr eller menneske, eller til undertrykkelse af væksten af en ICAM-l-eksprimerende tumor eller en 30 LFA-l-eksprimerende tumor.