DK2087106T3 - Muterende delta8-desaturasegener konstrueret ved målrettet mutagenese og anvendelse heraf i fremstillingen af flerumættede fedtsyrer - Google Patents

Claims (15)

1. MUTERENDE DELTA8-DESATURASEGENER KONSTRUERET VED MÅLRETTET MUTAGENESE OG ANVENDELSE HERAF I FREMSTILLINGEN AF FLERUMÆTTEDE FEDTSYRER PATENTKRAV

   1. Isoleret polynukleotid omfattende en nukleotidsekvens, der er udvalgt fra gruppen bestående af: (a) en nukleotidsekvens, der koder for et muterende polypeptid med delta-8 desaturaseaktivitet, hvor peptidet har en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 198, der mindst omfatter én mutation, der er udvalgt fra gruppen bestående af: (i) 4S til A og 5K til S; (ii) 12T til V; (iii) 16T til K og 17T til V; (iv) 59K til L; (v) 66P til Q og 67S til A; (vi) 407A til S og 408V til Q; (vii) 416Q til V og 417P til Y; (viii) 422L til Q; (ix) 108S til L; (x) 122V til S; (xi) 125Q til H og 126M til L; (xii) 127Y til Q; (xiii) 293L til M; (xiv) 54A til G og 55F til Y; (xv) 641 til L og 65N til D; (xvi) 69E til D og 70L til V; (xvii) 75A til G og 76V til L; (xviii) 117G til A og 118Y til F; (xix) 132V til L og 133L til V; (xx) 297F til V og 298V til L; (xxi) 3091 til V og 310V til I; (xxii) 3471 til L og 348T til S; (xxiii) 9L til V; (xxiv) 19D til E og 20V til I; (xxv) 65N til Q; (xxvi) 279T til L og 280L til T; (xxvii) 162L til V og 163V til L; (xxviii) 170G til A og 17IL til V og (xxix) 418A til G og 419G til A; hvor delta-8 desaturaseaktiviteten for det imiterende polypeptid er mindst funktionelt ækvivalent med delta-8 desaturaseaktiviteten for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 10; og (b) et komplement af nukleotidsekvensen fra del (a), hvor komplementet og nukleotidsekvensen består af samme antal nukleotider og er 100 % komplementære.
2. 2. Isoleret polynukleotid ifølge krav 1, hvor det imiterende polypeptid har en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 2 omfattende mindst én mutation, der er udvalgt fra gruppen bestående af: (i) 4S til A og 5K til S; (ii) 12T til V; (iii) 16T til K og 17T til V; (iv) 66P til Q og 67S til A; (v) 407A til S og 408V til Q; (vi) 422L til Q; (vii) 108S til L; (viii) 125Q til H og 126M til L; (ix) 293L til M; (x) 54A til G og 55F til Y; (xi) 117G til A og 118Y til F; (xii) 132V til L og 133L til V; (xiii) 3471 til L og 348T til S; (xiv) 279T til L og 280L til T; (xv) 162L til V og 163 V til L; (xvi) 170G til A og 171L til V og (xvii) 418A til G og 419G til A; hvor delta-8 desaturaseaktiviteten for det imiterende polypeptid er mindst funktionelt ækvivalent med delta-8 desaturaseaktiviteten for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 10.
3. 3. Isoleret polynukleotid ifølge krav 1, hvor nukleotidsekvensen omfatter sekvensen fra SEQ ID NO: 197, der koder for SEQ ID NO: 198 omfattende den mindst ene mutation.
4. 4. Isoleret polynukleotid ifølge krav 2, hvor nukleotidsekvensen omfatter sekvensen fra SEQ ID NO: 1, der koder for SEQ ID NO: 2 omfattende den mindst ene mutation.
5. 5. Isoleret polynukleotid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, hvor nukleotidsekvensen koder for et polypeptid omfattende aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 4.
6. 6. Polypeptid kodet for af det isolerede polynukleotid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5 med delta-8 desaturaseaktivitet.
7. 7. Rekombinant konstrukt omfattende det isolerede polynukleotid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, der er operativt forbundet med mindst én regulatorisk sekvens.
8. 8. Celle omfattende det rekombinante konstrukt ifølge krav 7, hvor cellen er en gær, hvor fortrinsvis gæren er en olieholdig gær, der frembringer mindst 25 % af sin tørcellevægt som olie, mere fortrinsvis hvor den olieholdige gær er udvalgt fra gruppen bestående af: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon og Lipomyces.
9. 9. Fremgangsmåde til fremstilling af langkædede flerumættede fedtsyrer i en gærcelle omfattende: a) tilvejebringelse af en gærcelle ifølge krav 8 og b) dyrkning af gærcellen fra (a) på betingelser, hvor der frembringes langkædede flerumættede fedtsyrer.
10. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvor gæren er en Yarrowia-art, der frembringer mindst 25 % af sin tørcellevægt som olie.
11. 11. Olieholdig gær, der frembringer mindst 25 % af sin tørcellevægt som olie, hvilken gær omfatter: a) et rekombinant DNA-konstrukt omfattende et isoleret polynukleotid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, der er operativt forbundet med mindst én regulatorisk sekvens; og b) mindst ét supplerende rekombinant DNA-konstrukt omfattende et isoleret polynukleotid, der er operativt forbundet med mindst én regulatorisk sekvens, hvilket konstrukt koder for et polypeptid, der er udvalgt fra gruppen bestående af: delta-4 desaturase, delta-5 desaturase, delta-6 desaturase, delta-9 desaturase, delta-12 desaturase, delta-15 desaturase, delta-17 desaturase, delta-9 elongase, Ci4/i6 elongase, Ci6/i8 elongase, Ci8/2o elongase og C20,22 elongase, hvor fortrinsvis gæren er udvalgt fra gruppen bestående af: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon og Lipomyces, eller mere fortrinsvis gærcellen er af arten Yarrowia og olien omfatter en langkædet flerumættet fedtsyre, der er udvalgt fra gruppen bestående af: arachidonsyre, eicosadiensyre, eicosapentaensyre, eicosatetraensyre, eicosatriensyre, dihomo-gamma-linolensyre, docosapentaensyre og docosahexaensyre.
12. 12. Fremgangsmåde til fremstilling af en flerumættet fedtsyre, der er udvalgt fra gruppen bestående af dihomo-gamma-linolensyre og eicosatetraensyre, hvilken fremgangsmåde omfatter: a) tilvejebringelse af en olieholdig gær omfattende: (i) et rekombinant konstrukt omfattende det isolerede polynukleotid ifølge et hvilket som helst af kravene 2 og 4, der er operativt forbundet med mindst én regulatorisk sekvens; og (ii) en kilde af eicosadiensyre eller eicosatriensyre; b) dyrkning af gæren fra trin (a) på betingelser, hvor det rekombinante konstrukt udtrykkes for at omdanne enten eicosadiensyren til dihomo-gamma-linolensyre eller eicosatriensyren til eicosatetraensyre; og c) eventuelt genvinding af dihomo-gamma-linolensyren eller eicosatetraensyren fra trin (b).
13. 13. Fremgangsmåde til fremstilling af dihomo-gamma-linolensyre, hvilken fremgangsmåde omfatter: a) tilvejebringelse af en gærcelle omfattende: i) et første rekombinant DNA-konstrukt omfattende det isolerede polynukleotid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, der er operativt forbundet med mindst én regulatorisk sekvens, og ii) mindst ét supplerende rekombinant DNA-konstrukt omfattende et isoleret polynukleotid, der koder for et delta-9 elongasepolypeptid, der er operativt forbundet med mindst én regulatorisk sekvens; b) tilvejebringelse af gærcellen fra (a) med en kilde af linolsyre og c) dyrkning af gærcellen fra (b) på betingelser for at danne dihomo-gamma-linolensyre.
14. 14. Polypeptid ifølge krav 6, hvor polypeptidet har mindst 10 til 18 aminosyremutationer ved sammenligning med SEQ ID NO: 10, eller fortrinsvis hvor polypeptidet har mindst 19 til 25 mutationer ved sammenligning med SEQ ID NO: 10.
15. 15. Polypeptid ifølge krav 14, hvor polypeptidet omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 4.