DK2670846T3 - Fremgangsmåder til udvikling af terpensyntasevarianter - Google Patents

Claims (14)

1. Fremgangsmåde til testning af en terpensyntasevariant for forbedret in wVo-ydeevne, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) opdeling af en population af værtsceller i en kontrolpopulation og en testpopulation; (b) ekspression i kontrolpopulationen af en kontrolterpensyntase og en sammenligningsterpensyntase, hvor kontrolterpensyntasen kan omdanne et polyprenyldiphosphat til en første terpen, og hvor sammenligningsterpensyntasen kan omdanne polyprenyldiphosphatet til en anden terpen; (c) ekspression i testpopulationen af en testterpensyntase og sammenligningsterpensyntasen, hvor testterpensyntasen er en variant af kontrolterpensyntasen og kan omdanne polyprenyldiphosphatet til den første terpen, og hvor sammenligningsterpensyntasen udtrykkes i samme niveauer i testpopulationen og i kontrolpopulationen; og (d) måling af et forhold mellem den første terpen og den anden terpen både i testpopulationen og i kontrolpopulationen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor testpopulationen identificeres som omfattende en terpensyntasevariant med forbedret in wVo-ydeevne i sammenligning med kontrolterpensyntasen via en stigning i forholdet mellem den første terpen og den anden terpen i testpopulationen i sammenligning med det i kontrolpopulationen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor kontrolterpensyntasen og testterpensyntasen er: (i) sesquiterpensyntaser, og polyprenyldiphosphatet er farnesyldiphosphat (FPP); eller (ii) monoterpensyntaser, og polyprenyldiphosphatet er geranyldiphosphat (GPP).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor sammenligningsterpensyntasen er en trichodiensyntase.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor kontrol- og testterpensyntaserne er syntaser med farnesensyntaseaktivitet.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor værtscellen omfatter et eller flere heterologe enzymer fra MEV-reaktionsvejen valgt fra gruppen bestående af ERG8, ERG10, ERG12, ERG13, ERG19 og HMG1.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor testterpensyntasen afviger fra kontrolterpensyntasen med 1 til 10 aminosyrer.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor testterpensyntasen udtrykkes i samme niveau i testpopulationen som det, kontrolterpensyntasen udtrykkes i i kontrolpopulationen.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor kontrolterpensyntasen og testterpensyntasen er identiske, men udtrykkes i forskellige niveauer i kontrolpopulationen og testpopulationen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor populationen af værtsceller er en population af gærceller eller en population afE. coli-celler.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor forholdet mellem den første terpen og den anden terpen er mindst 1:3.

12. Sammensætning, som omfatter to celle-subpopulationer, som en fælles population af værtsceller er blevet opdelt i, hvor: (a) den første subpopulation omfatter en kontrolterpensyntase og en sammenligningsterpensyntase, hvor kontrolterpensyntasen omdanner et polyprenyldiphosphat til en første terpen, og hvor sammenligningssesquiterpensyntasen omdanner polyprenyldiphosphatet til en anden terpen; og (b) den anden subpopulation omfatter en testterpensyntase og sammenligningsterpensyntasen, hvor testterpensyntasen omdanner polyprenyldiphosphatet til den første terpen, hvor testterpensyntasen er en variant af kontrolterpensyntasen, og hvor sammenligningsterpensyntasen udtrykkes i samme niveauer i den første subpopulation og i den anden subpopulation.

13. Sammensætning ifølge krav 12, hvor forholdet mellem den første terpen og den anden terpen er større i den anden subpopulation i sammenligning med det i den første subpopulation.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller sammensætning ifølge krav 12, hvor den første terpen eller den anden terpen er valgt fra gruppen bestående af β-farnesen, α-farnesen, trichodien, patchoulol, amorphadien, valencen, farnesol, nerolidol, nootkaton, limonen og myrcen.