DK2729482T3 - Fremgangsmåde til oprensning af fc-fusionsprotein - Google Patents

Claims (15)

1. FREMGANGSMÅDE TIL OPRENSNING AF FC-FUSIONSPROTEIN

   1. Fremgangsmåde til oprensning af et Fc-fusionsprotein fra én eller flere urenheder i en prøve, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: a) tilvejebringelse af en prøve, der omfatter et Fc-fusionsprotein, der er produceret i et eukaryotisk ekspressionssystem; b) binding af det Fc-fusionsprotein, der er til stede i prøven, til en Protein A affinitetskromatografiharpiks; c) eluering af Fc-fusionsproteinet fra Protein A-harpiksen ved anvendelse af en gradient af 50 mM citrat pH 5,0 til 100 mM citrat pH 4,0, hvor det eluerede produkt tilvejebringer en anden prøve, eventuelt henvist til som et Protein A-PRODUKT (PAP); d) binding af PAP’et til en kationbytter- (CEX) kromatografiharpiks; e) eluering af den anden prøve fra CEX-harpiksen med en 25 mM natriumphosphatbuffer, pH 4,0, der omfatter 25 mM arginin, som en lineær ionisk styrkegradient, hvor det eluerede produkt tilvejebringer en tredje prøve, eventuelt henvist til som et CEX-Produkt (CEXP); f) binding CEXP’et til en anionbytter- (AEX) kromatografiharpiks; og g) eluering af den tredje prøve fra AEX-harpiksen, hvor det eluerede produkt tilvejebringer en oprenset F c-fusionspro teinsammensætning.
2. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor Fc-fusionsproteinet er p75 TNFR:Fc.
3. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor trin b) endvidere omfatter: b') vask af det bundne Fc-fusionsprotein med en buffer med et pH, der ligger i intervallet fra 3 til 7, og en ledeevne i intervallet fra 10 ms/cm til 50 ms/cm.
4. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor trin d) endvidere omfatter: d') vask af det bundne Fc-fusionsprotein med en buffer med et pH, der ligger i intervallet fra 3 til 7, og en ledeevne i intervallet fra 10 ms/cm til 50 ms/cm.
5. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor elueringen i trin g) udføres med en 12,5 mM natriumphosphatbuffer, pH 8,0, som lineær ionisk styrkegradient.
6. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor trin d) endvidere omfatter: d') vask af det bundne Fc-fusionsprotein med en buffer, der har et pH, der ligger i intervallet fra 3 til 7, og en ledeevne i intervallet fra 10 ms/cm til 50 ms/cm.
7. 7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor Protein A kromatografiharpiksen er POROS MabCapture A.
8. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor CEX-kromatografitrinnet udiøres på en kraftig kationbytterharpiks, der er udvalgt fra Poros HS, Poros XS, SP Sepharose, Toyopearl SP, SP Sepharose BB, Source 30S, TSKGel SP-5PW-HR20 og Toyopearl SP 650, og AEX-kromatografitrinnet udføres på en kraftig anionbytterharpiks, der er udvalgt fra Poros HQ, Q-Sepharose, Q-Ceramic Hyper D, Toyopearl Q, UNO Q.
9. 9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor CEX-kromatografiharpikser er Poros HS kraftig kationbytterharpiks og AEX kromatografiharpiksen er Poros HQ kraftig anionbytterharpiks.
10. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor prøven, der omfatter Fc-fusionsproteinet, er pattedyrecelledyrkningsbouillon eller gærfermenteringsbouillon.
11. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor prøven, der omfatter Fc-fusionsproteinet, er gærfermenteringsbouillon og trin a) endvidere omfatter: a') justering af pFI’et for prøven, der omfatter Fc-fusionsproteinet, til et pH mellem 8 til 9, og etablering af kontakt mellem prøven og et genfoldningsmidlet og et disaggregeringsmiddel.
12. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, hvor genfoldningsmidlet er udvalgt fra arginin, glycerol, EDTA, TMAO, PEG-3500 eller en redox-reagens og disaggregeringsmidlet er udvalgt fra urea eller guanidinhydrochlorid.
13. 13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, hvor pH’et for den prøve, der omfatter Fc-fusionsproteinet, justeres til 8,6.
14. 14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den oprensede Fc-fusionsproteinsammensætning opnået i trin g) tilvejebringer et produkt med en renhed på > 99 %.
15. 15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den oprensede Fc-fusionsproteinsammensætning, der er opnået i trin g), er kendetegnet ved et TSA-niveau på > 18 mMol.