DK3019621T3

DK3019621T3 - Fremstilling af glycoproteiner med forhøjet n-glycolyseringsstedudnyttelse

Info

Publication number: DK3019621T3
Application number: DK14738496.0T
Authority: DK
Inventors: Jari Natunen; Christopher Landowski; Markku Saloheimo; Christian Ostermeier; Benjamin Patrick Sommer; Ramon Wahl
Original assignee: Glykos Finland Oy
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2019-03-04
Also published as: CA2916899C; SG11201600098RA; EP3019621A1; US20160153019A1; US20190276867A1; PL3019621T3; CA2916899A1; WO2015004239A1; EP3019621B1; HRP20190218T1; CN105492620A; SI3019621T1; ES2711165T3

Claims

1. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle omfattende 1. en eller flere mutationer, der reducerer eller eliminerer en eller flere endogene proteasers aktivitet sammenlignet med en Trichoderma- eller Myceliophthora-modercelle, der ikke har mutationen (mutationerne), ii. et polynukleotid, der koder for en heterolog katalytisk subunit af oligosaccharyltransferase, og iii. et polynukleotid, der koder for et heterologt glycoprotein, hvor den katalytiske subunit af oligosaccharyltransferase er udvalgt fra katalytiske subunits af Leishmania-oligosaccharyltransferase, hvor N-glycosyleringsstedudnyttelsen for det heterologe glycoprotein, der udtrykkes i Trichoderma- eller Myceliophthora-cellen er mindst 90 %, og hvor Trichoderma- eller Myceliophthora-cellen har en mindst to gange reduceret total proteaseaktivitet sammenlignet med en Trichoderma- eller Myceliophthora-modercelle, der ikke har mutationen (mutationerne), der reducerer eller eliminerer proteaseaktivitet, og hvor det heterologe glycoprotein er et pattedyr-glycoprotein, og hvor udbyttet af pattedyr-glycoproteinet er mindst 1 gram pr. liter.

2. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle ifølge krav 1, hvor polynukieotidet, der koder for den heterologe katalytiske subunit af oligosaccharyltransferase, omfatter en nukleinsyre, der er udvalgt fra gruppen bestående af SEQ. ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 88 og SEQ ID NO: 90 eller et polynukleotid, der koder for et funktionelt variant-polypeptid, der er mindst 50 %, mindst 60 %, mindst 70 % identisk, mindst 80 % identisk, mindst 90 % identisk eller mindst 95 % identisk med SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 89 eller SEQ ID NO:91, hvilket funktionelt variant-polypeptid har oligosaccharyltransfera seaktivitet.

3. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor N-glycosyleringsstedudnyttelsen af det heterologe glycoprotein er mindst 95 %, og glycoformerne Man3, Man5, GO, GI og/eller G2 repræsenterer mindst 50 % af de samlede neutrale N-glycaner af det heterologe glycoprotein.

4. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor cellen er, for eksempel, Trichoderma reesei, og cellen omfatter mutationer, der reducerer eller eliminerer aktiviteten af • de tre endogene proteaser pepl, tspl og si pi; • de tre endogene proteaser gapl, slpl og pepl; • de tre endogene proteaser udvalgt fra gruppen bestående af pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep9, pepil, pepl2, tspl, slpl, slp2, slp3, slp7, gapl og gap2; • tre til seks proteaser udvalgt fra gruppen bestående af pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, tspl, slpl, slp2, slp3, gapl og gap2 eller, • syv til ti proteaser udvalgt fra gruppen bestående af pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tppl, gapl og gap2.

5. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvorTrichoderma-cellen endvidere omfatter en mutation i genet, der koder for ALG3, som reducerer eller eliminerer den tilsvarende ALG3-ekspression sammenlignet med niveauet af ekspression af ALG3-genet i en modercelle, der ikke har en sådan mutation.

6. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, der endvidere omfatter et polynukleotid, der koder for N-acetylglucosaminyltransferase I katalytisk domæne og et N-acetylglucosaminyltransferase II katalytisk domæne.

7. Trichoderma- eller Myceliophthora-celle ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, der endvidere omfatter et eller flere polynukleotider, der koder for et polypeptid udvalgt fra gruppen bestående af: i. al,2-mannosidase; ii. N-acetylglucosaminyltransferase I katalytisk domæne; iii. α-mannosidase II; iv. N-acetylglucosaminyltransferase II katalytisk domæne; v. pi,4-galactosyltransferase og, vi. fucosyltransferase.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et heterologt glycoprotein med forhøjet N-glycosyleringsstedudnyttelse omfattende a) tilvejebringelse af en Trichoderma- eller Myceliophthora-celle med et Leishmania STT3D-gen, der koder for en katalytisk subunit af oligosaccharyltransferase, og et polynukleotid, der koder for det heterologe glycoprotein, b) dyrkning af cellen under betingelser, der er hensigtsmæssige for ekspression af STT3D-genet og produktion af det heterologe glycoprotein; og, c) genfinding og eventuelt oprensning af det heterologe glycoprotein, hvor Trichoderma- eller Myceliophthora-cellen omfatter en eller flere mutationer, der reducerer eller eliminerer en eller flere endogene proteasers aktivitet sammenlignet med en Trichoderma- eller Myceliophthora-modercelle, der ikke har mutationen (mutationerne), og hvor N-glycosyleringsstedudnyttelsen af det heterologe glycoprotein, der udtrykkes i Trichoderma- eller Myceliophthora-cellen er mindst 90 %, og hvor det heterologe glycoprotein er et pattedyr-glycoprotein, og hvor udbyttet af pattedyr-glycoproteinet er mindst 1 gram pr. liter.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor glycoproteinet er et antistof.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 8 til 9, hvorTrichoderma-eIler Myceliophthora-værtscellen er cellen, som er defineret i et hvilket som helst af kravene 1-7.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 8 til 10, hvor Leishmania STT3D-genet, der koder for en katalytisk subunit ef oligosaccharyltransferase, omfatter en nukleinsyresekvens udvalgt fra gruppen bestående af SEQ. ID NO:2, SEQ. ID NO:9, SEQ. ID NO: 88 og SEQ. ID NO: 90 eller et polynukleotid, der koder for et funktionelt variant-polypeptid, der er mindst 50 %, mindst 60 %, mindst 70 % identisk, mindst 80 % identisk, mindst 90 % identisk eller mindst 95 % identisk med SEQ. ID NO:1, SEQ. ID N0:8, SEQ. ID NO: 89 eller SEQ ID NO: 91, hvilket funktionelle variant-polypeptid har oligosaccharyltransfera seaktivitet.