DK3036324T3 - Reguleret PepC-ekspression - Google Patents

Claims (15)

1. Rekombinant filamentøs svampeværtscelle, der omfatter: a) mindst et første polynukleotid, der koder for et polypeptid af interesse, og b) et eller flere andet polynukleotid, der koder for en svampe-PepC-protease, hvor det ene eller flere andet polynukleotid er operabelt forbundet til en reguleret heterolog promotor, hvor den regulerede heterologe promotor er induceret under tilstedeværelse af nitrat og represseret under tilstedeværelse af ammonium, eller hvor den regulerede heterologe promotor er induceret under tilstedeværelse af sorbitol og represseret i fravær af sorbitol.

2. Værtscelle ifølge krav 1, som er af slægten Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes eller Trichoderma.

3. Værtscelle ifølge krav 2, som er en celle af Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei eller Trichoderma viride.

4. Værtscelle ifølge ethvert af de foregåene krav, hvor det mindst ene første polynukleotid er til stede i værtscellens kromosom.

5. Værtscelle ifølge krav 4, hvor det mindst ene første polynukleotid er til stede i to eller flere kopier i værtscellens kromosom.

6. Værtscelle ifølge ethvert af de foregående krav, hvor polypeptidet af interesse er et enzym valgt fra gruppen bestående afen hydrolase, en isomerase, en ligase, en lyase, en oxidoreduktase og en transferase.

7. Værtscelle ifølge krav 6, hvor polypeptidet af interesse er et enzym valgt fra gruppen bestående af en alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amylase, asparaginase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xylosidase, carbohydrase, carboxypeptidase, katalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin-glycosyltransferase, deoxyribonuklease, endoglucanase, esterase, glucoamylase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pektinolytisk enzym, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytisk enzym, ribonuklease, transglutaminase eller xylanase.

8. Værtscelle ifølge ethvert af de foregående krav, hvor PepC-proteasen er valgt fra gruppen bestående af: a) et polypeptid, der omfatter en aminosyresekvens, der er mindst 80% identisk med den mature sekvens vist i positionerne 1 til 380 af SEQ ID NO:2 eller i position 1 til 418 af SEQ ID NO: 4. b) et polypeptid, der kodes af et polynukleotid, som hybridiserer under mellemhøje stringensbetingelser med (i) den mature polypeptidkodende sekvens i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO:2, eller (ii) fuldlængde-komplementet af (i); c) et polypeptid, der kodes af et polynukleotid, der omfatter en nukleotidsekvens, der er mindst 80% identisk med den mature polypeptidkodende sekvens i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 3; d) en variant af det mature polypeptid i SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 4 omfattende en substitution, deletion og/eller insertion ved en eller flere positioner; og e) et fragment af polypeptidet i (a), (b), (c), eller (d) som har proteaseaktivitet.

9. Værtscelle ifølge ethvert af de foregående krav, hvor PepC-proteasen er udtrykt med et propeptid valgt fra gruppen bestående af: a) et propeptid omfattende en aminosyresekvens, der er mindst 80% identisk med det, der er vist i positionerne -99 til -1 i SEQ ID NO: 2 eller i positionerne -99 to -1 i SEQ ID NO: 4. b) et propeptid, der kodes af et polynukleotid, som hybridiserer under mellemhøje stringensbetingelser med (i) den propeptidkodende sekvens i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO:2, eller (ii) fuldlængde-komplementet af (i); eller c) et propeptid, der kodes af et polynukleotid, der omfatter en nukleotidsekvens, der er mindst 80% identisk med den propeptidkodende sekvens i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 3.

10. Værtscelle ifølge ethvert foregående krav, hvor PepC-proteasen er udtrykt med et signalpeptid valgt fra gruppen bestående af: a) et signalpeptid omfattende en aminosyresekvens, der er mindst 80% identisk med det, der er vist i positionerne -115 til -100 i SEQ ID NO: 2 eller i positionerne -115 til -100 i SEQ ID NO: 4. b) et signalpeptid, der kodes af et polynukleotid, som hybridiserer under mellemhøje stringensbetingelser med (i) den signalpeptidkodende sekvens i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO:2, eller (ii) fuldlængde-komplementet af (i); eller c) et signalpeptid, der kodes af et polynukleotid, der omfatter en nukleotidsekvens, der er mindst 80% identisk med den signalpeptidkodende sekvens i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 3.

11. Værtscelle ifølge ethvert af de foregående krav, hvor den regulerede heterologe promotor er en filamentøs svampe-nitratreduktase-promotor; mere fortrinsvis er den regulerede heterologe promotor en nitratreduktase-promotor fra en Aspergillus- eller en Trichoderma-celle; endnu mere fortrinsvis er den regulerede heterologe promotoren nitratreduktasefra Aspergillus niger, Aspergillus oryzae eller Trichoderma reeser, mest fortrinsvis er den regulerede heterologe promotor niaD-nitratereductase-promotoren fra Aspergillus niger, Aspergillus oryzae eller Trichoderma reesei.

12. Værtscelle ifølge krav 11, hvor den regulerede heterologe promotor omfatter en nukleotidsekvens, der er mindst 80% identisk med SEQ ID NO: 41.

13. Værtscelle ifølge ethvert foregående krav, hvor den regulerede heterologe promotor er en filamentøs svampe-sorbitol-transportør-promotor eller en sorbitol-dehydrogenase-promotor fra en Aspergillus- eller Trichoderma-ceWe', endnu mere fortrinsvis er den regulerede heterologe promotor en sorbitol-transportør-promotor eller en sorbitol-dehydrogenase-promotor fra Aspergillus niger, Aspergillus oryzae eller Trichoderma reeser, mest fortrinsvis er den regulerede heterologe promotor sorA- eller sorS-promotoren fra Aspergillus niger, Aspergillus oryzae eller Trichoderma reesei.

14. Værtscelle ifølge krav 13, hvor den regulerede heterologe promotor omfatter en nukleotidsekvens, der er mindst 80% identisk med SEQ ID NO: 42 eller SEQ ID NO: 43.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid af interesse, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: a) dyrkning af en værtscelle ifølge ethvert af de foregående krav, under betingelser, der er egnet til fremstilling af polypeptidet af interesse, hvor den regulerede heterologe promotor er represseret under tilstedværelse af ammonium, og hvor den regulerede heterologe promotor er represseret i fravær af sorbitol, og valgfrit b) indvinding af polypeptidet af interesse.