EA001075B1

EA001075B1 - Способ получения сбраживаемого сусла и способ производства алкоголя или содержащего алкоголь напитка

Info

Publication number: EA001075B1
Application number: EA199800711A
Authority: EA
Inventors: Мари-Поль Ларуа; Жером Супп
Original assignee: Гист-Брокейдс Б.В.
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 2000-10-30
Also published as: HK1018625A1; HUP9901003A3; JP2000504571A; BG102684A; AP9801316A0; HUP9901003A2; EA199800711A1; KR19990082497A; PL328304A1; AU1873197A; EE9800240A; UY24458A1; CZ250398A3; YU33998A; EP0896613A1; WO1997029179A1; CN1285396A; CN1064398C; BR9707404A; SK108698A3

Description

Изобретение касается способа получения сбраживаемого сусла, а именно сусла, получаемого из зерен злаковых культур, особенно из несоложенных зерен. Другим объектом изобретения является способ производства алкоголя и содержащего алкоголь напитка, использующий данный способ получения сусла.

Пиво производят при сбраживании либо соложенных, либо несоложенных зерен. В последнем случае зерна разжижают и осахаривают с помощью коммерческих ферментных препаратов, получая сусло, которое содержит ферментируемые сахара и аминокислоты или другие формы азота (вместе называемые как формы «свободно доступного азота» (СДА)), необходимые для ферментации дрожжей.

Так, например, МакФадден с соавт. (МасРаббеп Ό.Ρ., с1 а1. апб С1ау1оп. М. Втеитпд апб Веуетаде 1пби51пе5 1п1егпаПопа1 (1989), 1, 7781) предлагают при варке пива вносить ферменты из неосоложенного сорго, такие как альфаамилаза, протеаза, бета-глюканаза, целлюлаза, альфа-амилаза грибов, аминоглюкозидаза и др. Кроме того, МакФадден с соавт. рекомендуют также при использовании несоложённого сорго добавлять для ферментации пекарские дрожжи.

Байомо с соавт. (Ва.)ото, М.Р. апб Уоипд, Т.А., 1. 1п§1. В геи. (1992) 98, 515-523; Ва.)ото, М.Р. апб Уоипд, Т.А., 1. 1п51.Вге\у. (1994) 100, 79-84 3) приводят данные о варке пива из 100% несоложенных зерен сорго, несмотря на то, что уровень СДА в сусле из несоложенного сорго (51 мг/л) ниже значения, необходимого для сбраживания сусла, полученного из соложенного ячменя.

В международной патентной заявке АО 92/20777 описан способ получения этанола, включающий разжижение зернового материала из несоложенных зерен кукурузы или сорго с помощью амилазы, осахаривание затора с применением глюкоамилазы и кислой протеазы грибов. Способ предусматривает добавление протеазы на стадии ферментации и на стадии осахаривания. Значение рН в сбраживаемой среде варьирует в диапазоне 4-5, что означает, что экзопептидазы грибов неактивны (ЬаЬЬе, Ι.Ρ., КеЬеутоПе, Р., ВюсЫт1е (1974) 56, 839-844; Ьейтап, К. ипб ИНИд, Н. Норре 8еу1ег'5 2.РЬу51оЬСйет. (1969) 350, 99-104). Недостаток указанного способа состоит в том, что в этих условиях используемые протеазы грибов осуществляют только эндопротеолиз, приводя к выходу, главным образом, олигопептидов и небольшого количества свободных аминокислот.

В качестве основного источника для получения общего представления в данной области следует упомянуть обзор Палмера (О.Н. Ра1тег, Сегеа1 8с1епсе апб ТесНпо1оду. 1п: Сегеа1 8с1епсе апб ТесНпо1оду, (1989) еб. АЬегбееп ишуегейу Рте55, АЬегбееп, §со11апб, 61-242).

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способу изготовления сусла из несоложенных зерен злаковых, которое, как выяснилось, обладает неожиданно хорошими свойствами, такими как высокий уровень свободно доступного азота (обозначаемый далее как СДА), хорошая фильтруемость и хороший выход сусла. Указанный способ может также применяться в производстве сусла из соложенных зерен зерновых, но особенно заметны его достоинства при использовании в производстве сусла из несоложенных зерен, таких как несоложенное сорго или смесь несоложенного сорго и кукурузы. Преимущества заметны также при использовании сусла, полученного из так называемой «смешанной бражки», которая представляет собой сочетание соложённых злаковых (таких как соложенный ячмень) и несоложенных злаковых (таких как кукуруза, рис или сорго).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения сбраживаемого сусла, предусматривающему стадии:

(а) разжижения злакового материала с помощью вещества, имеющего альфа-амилазную и/или эндопротеазную активность с получением ожиженного затора, (б) осахаривания ожиженного затора в присутствии альфа-амилазы, и (в) фильтрования ожиженного и осахаренного затора с получением сбраживаемого сусла, причем, по меньшей мере, одну из стадий (а) или (б) проводят в присутствии фермента, имеющего экзопептидазную активность.

Применимы в качестве таких ферментов с экзопептидазной активностью экзопептидазы, предпочтительно термостабильные экзопептидазы, такие как аминопептидазы грибов, однако, могут использоваться и термостабильные карбоксипептидазы. Особенно предпочтительными по настоящему изобретению являются аминопептидазы, эндогенные для грибов из рода АкретдШик и более предпочтительны среди них А.шдет, А.огу/ае или А.5о.)ае.

Указанный способ особенно полезен в том случае, когда применяются зерна злаковых, включающие, по меньшей мере, 20% несоложенных злаковых, предпочтительно более чем 50% несоложенных злаковых, таких как зерна сорго с добавками из несоложенных целых початков кукурузы, риса или других несоложенных злаковых. Было обнаружено, что в соответствии с настоящим изобретением очень благоприятно сказывается наличие экзопептидазы при разжижении зерен злаковых.

Совместно с экзопептидазой используют эндопротеазу, предпочтительно, полученную из ВасШик атуЫкщеГааепъ

Предпочтительно, указанная экзопептидаза, т.е. фермент, имеющий экзопептидазную активность, представляет собой экзопептидазу из грибов, предпочтительно из грибов рода АкретдШик, а именно АкретдШик ко) ае.

Предпочтительно, экзопептидаза представляет собой аминопептидазу.

В соответствии с другим объектом, изобретение относится к способу производства алкоголя или содержащего алкоголь налитка, предусматривающего стадию сбраживания сусла в присутствии дрожжей, способных продуцировать этиловый спирт, причем используют сусло, полученное вышеописанным способом.

Предпочтительно, содержащим алкоголь напитком является пиво, однако понятно, что из сусла может быть получен и другой алкоголь содержащий напиток, например, питьевой спирт.

Ниже приводится описание фигур, иллюстрирующих настоящее изобретение.

Описание фигур

На фиг. 1 показан профиль рН для лейцинамикопептидазы из АкретдШик тдег;

На фиг. 2 показан профиль рН для фенилаланин-аминопептидазы из АкретдШик тдег;

На фиг. 3 показан температурный профиль для обеих аминопептидаз.

Ниже дано более детальное описание изобретения.

Подробное описание изобретения

Способ разработан для изготовления сбраживаемого сусла из злаковых, отличительной чертой которого является то, что в используемых условиях хотя бы один имеющийся белок обладает экзопептидазной активностью. Применяются аминопептидазы, эндогенные для грибов, в особенности для грибов рода АкрегдШи8, поскольку они достаточно стабильны при значениях рН от 5 до 8, что совпадает с тем диапазоном значений, до которого падает рН на стадии разжижения. В условиях таких значений температуры и рН карбоксипептидазы менее полезны. На стадии осахаривания преобладают несколько более кислые условия, чем на стадии разжижения, и поэтому на данной стадии может с успехом применяться и карбоксипептидаза, при условии, что она обладает достаточной стабильностью в диапазоне температур 50-60°С, предпочтительно 50-70°С.

Использование экзопептидаз по способу настоящего изобретения ведет не только к повышению уровня свободно доступного азота (СДА) в сусле, но также сказывается на улучшении фильтруемости и повышении выхода сусла в сравнении с вариантом осуществления процесса без добавления экзопептидаз.

Способ по настоящему изобретению особенно выгодно использовать при получении сбраживаемого сусла из несоложенных злаковых, еще более предпочтительно из несоложенного сорго с необязательными добавками других злаков, таких как кукуруза, пшеница, овес или рис. В контексте настоящего описания термин «злаковые» включает сорго, пшеницу, ячмень, овес, рис, кукурузу и др.

Использование экзопептидаз по настоящему изобретению дает преимущества также в случае применения смешанной бражки, в которой используется, как правило, соложенный злаковый материал, а также несоложенный материал из злакового сырья (содержащий, например, до 80% или даже до 90% соложенных злаковых, тогда как остаток включает несоложенные злаковые), поскольку было показано, что экзопептидазы оказывают положительное воздействие на органолептические показатели (вкус и/или запах). Было показано в соответствующих исследованиях, что указанные преимущества проявляются при использовании в пивоварении как несоложенных, так и соложенных злаковых, а также их смесей.

Те злаковые, на которых особенно очевидны преимущества использования экзопептидаз, такие как уровень СДА, фильтруемость, выход и органолептические показатели, относятся к злаковым с относительно высоким содержанием фракций белков глютелина и проламина. К этой категории, кроме сорго, относится также рис (около 80% глютелина). При использовании сорго нужно обращать внимание на сорта с тем, чтобы использовать те из них, которые содержат сравнительно мало полифенола.

За исключением добавления экзопептидаз, процесс изготовления сусла, например пивного сусла, осуществляется обычным способом. В основном, он включает разжижение необработанного злакового материала с получением затора, затем осахаривание указанного затора с получением сусла. Важно провести фильтрование перед сбраживанием сусла.

Стадия разжижения обычно включает размалывание необработанного злакового материала с получением муки с частицами приемлемого размера, гидратирование их добавлением от примерно 1 до примерно 4, предпочтительно примерно 3 частей воды и необязательно, в зависимости от вида используемой эндопротеазы, добавление от примерно 50 до примерно 300 частей на миллион кальция, предпочтительно 200 частей на миллион Са²⁺. При этом ферменты из ВасШик 81еаго1йегторИ1и8 считаются менее зависимыми от кальция. И, следовательно, в этом случае нет необходимости добавлять Са²+. Размер частиц измельченных злаковых не должен превышать 3 мм; не более 3,5% могут превышать 1,3 мм; не более 1,5% должны быть меньше чем 0,25 мм. В дополнение к ним могут использоваться ферменты, такие как целлюлазы, β-глюканазы и/или другие ферменты, разрушающие растительные клеточные стенки.

Среду для ожижения обычно доводят до значения рН от примерно 5 до 8, предпочтительно от примерно 6 до 7, с использованием для этого, например, гидроксида кальция. Важ5 но к среде для ожижения добавить α-амилазу, предпочтительно термостабильную α-амилазу, а также эндопротеазу, в дозировке, достаточной для того, чтобы провести, по меньшей мере, частичное разжижение крахмала зерна и вызвать, по меньшей мере, частичную деградацию белка. Подходящие дозировки α-амилазы при использовании Β.Ά.Τ.δ. составляют от примерно 0,5 до примерно 2,0, предпочтительно в диапазоне примерно 1-1,5 кг на тонну. Подходящие дозировки протеаз, в случае использования Вгс\усг5 протеазы 2000, составляют более, чем 0,5 кг/т зерна (кг/т), предпочтительно больше чем 1 кг/т. При использовании Раийктаке 400 ее следует добавлять в дозе более 2 кг/т, предпочтительно более чем 5 и еще более предпочтительно более чем 1 0 кг/т.

В процессе разжижения множество стадий осуществляют при повышенной температуре: после добавления α-амилазы и протеазы смесь выдерживают при температуре от примерно 40°С до примерно 65°С, предпочтительно от примерно 45 до 55°С и наиболее предпочтительно при 50°С, до тех пор, пока не будет достигнута достаточная степень разжижения. Нужное для этого время зависит от того, какое злаковое или какая смесь злаковых используется, и обычно период от примерно 30 мин до примерно 2 ч является удовлетворительным в этом отношении. После этого температуру постепенно повышают до примерно 90-95°С, при этом скорость повышения не является существенным фактором, и выдерживают при указанной температуре от примерно 30 мин до примерно 1 ч. Затем смесь охлаждают до температуры, при которой осуществляется осахаривание: обычно она составляет от примерно 50°С до примерно 70°С, предпочтительно от 55°С до 65°С, и наиболее предпочтительно около 60°С. Возможно применение несколько более высоких температур, чем 70°С, что зависит от термостабильности ферментов, используемых на стадии осахаривания. По достижению предпочтительной температуры добавляют осахаривающие ферменты, такие как Вге\уегк Реттех (α-амилаза) или Νοναιηνί (рекомбинантная β-амилаза), в количествах, которые обычно варьируют от примерно 400 г/т до примерно 1 кг/т в случае Вге\уегк Регтех. Часто также используют глюкоамилазы. Процесс осахаривания занимает от примерно 30 мин до примерно 2 ч, после чего температуру повышают до 75°С-85°С, в частности для того, чтобы инактивировать ферменты и нежелательные микроорганизмы, и выдерживают смесь при указанной предпочтительной температуре в течение примерно 10 мин; время выдерживания не является решающим фактором.

Полученный таким образом затор далее фильтруют с использованием для этого известного в технике оборудования; удовлетворительные результаты дает воронка с фильтровальной бумагой БсЫеюйет & §сйие11. После фильтрования проводят сбраживание сусла с использованием подходящих дрожжей, при этом условия выбирают в зависимости от используемого штамма дрожжей и от конечной цели процесса; кроме использования в пивоварении, в настоящем изобретении рассматривается применение способа в производстве спирта в качестве биотоплива или в качестве алкогольного напитка. Подходящие штаммы и подходящие условия известны каждому специалисту в данной области.

Было показано, что использование экзопептидазы при получении сусла, например, с целью изготовления пива, дает особенно хорошие результаты на стадии разжижения зернового материала. Однако, в сравнении со случаем отсутствия экзопептидазы добавление ее на стадии осахаривания также ведет к появлению уже упомянутых положительных результатов, таких как повышение уровня форм СДА, улучшение фильтруемости и повышение выхода сусла.

Способ по изобретению позволяет выбрать фазу, которая имеет рН и температурные условия, способствующие проявлению активности экзопептидаз. Подходящими являются экзопептидазы, эндогенные для грибов в целом, особеннно представителей рода АкретдШик. Было показано, что особенно полезны аминопептидазы из рода АкретдШик, включая А.пщег. А.5о.)ае и А.оту/ае.

Как будет ясно из приведенного описания, добавление ферментов, проявляющих экзопептидазную активность, на стадии разжижения и/или осахаривания при изготовлении сусла приводит к получению сусла с хорошей фильтруемостью, высоким выходом и высоким уровнем СДА. В свою очередь, это позволяет в пивоварении, в производстве алкогольных напитков (жидкостей) и в производстве спирта (в качестве биотоплива) использовать значительный процент несоложенных злаковых или даже исключительно несоложённые злаковые. Последнее обстоятельство особенно выгодно для пивоварения в тех странах, где импорт солода ограничен или экономически менее выгоден. Особенно это существенно для Африки, где пиво производят из (смеси) злакового сырья, которое включает большой процент сорго.

Кроме того, было показано улучшение органолептических характеристик (вкуса и запаха) пива, произведенного из сусла, в процессе получения которого на стадии разжижения или осахаривания (или на обеих) использовались экзопептидазы. Исследованиями было установлено, что указанное преимущество может быть достигнуто при производстве пива из соложенных злаковых, таких как обычный ячменный солод или смешанная пивная бражка (например, при использовании сочетания соложенных и несоложенных злаковых).

Экспериментальные данные

A. Термостабильная α-амилаза (стадия разжижения).

Используемая на стадии разжижения в процессе по способу настоящего изобретения аамилаза в общем представляет собой фермент, который расщепляет в крахмале а-1,4-глюкозаглюкозные связи. Ее выбирают из числа термостабильных α-амилаз. Очень хорошие результаты дает α-амилаза из ВасШиз Нсйет-Гогш15, коммерчески доступная от О151-Вгосабе5 под торговой маркой Вгемег'з АшуНц ТИегто 81аЫе (Б.А.Т.8.).

Б. Эндопротеаза (стадия разжижения).

Используемая на стадии разжижения в процессе по способу настоящего изобретения эндопротеаза в общем представляет собой фермент, который расщепляет в белках пептидные связи в условиях рН и температуры, имеющихся в начале стадии разжижения (рН 5-6; 1° 4555°С). Очень хорошие результаты могут быть получены с использованием нейтральной пептидазы из БаеШиь ашу1оНдиеГас1еп8, коммерчески доступной от О18!-Бгосабеь под торговой маркой Вгемег'з Рго1еазе 2000. Может быть также использован протеолитический фермент из 81гер1ошусез ГгаФае, коммерчески доступный от Рапьйшаье 8АКЕ под торговой маркой Рапьйтазе 400.

B. Экзопептидазы (стадия разжижения и/или осахаривания).

Используемые на стадии разжижения в процессе по способу настоящего изобретения экзопептидазы в общем представляют собой ферменты, которые расщепляют Ν-концевые связи в пептидах или белках. Очень хорошие результаты могут быть получены с использованием препаратов из видов АьрегдШиь. Ниже приведен способ получения аминопептидаз из АьрегдШиь пщег.

В.1 Определение энзиматической активности.

Экзопептидазную активность выражают в единицах лейцин-аминопептидазы или единицах фенилаланин-аминопептидазы:

Ьеи-АР единица обозначает количество фермента, необходимое для получения 1 мкмоля п-нитроанилина в минуту при рН 7,2 и при 20°С из Ь-лейцин-п-нитроанилида.

* Фенилаланинаминопептидазная единица.

Фенилаланинаминопептидазная единица обозначает количество фермента, необходимое для получения 1 мкмоля п-нитроанилина в минуту при рН 7,2 и при 20°С из Ь-фенилаланинп-нитроанилида.

В.1.1 Фениланинаминопептидаза (РДе-АР).

Фенилаланинпаранитроанилид растворяют в 7,5 мМ НС1 до концентрации 0,9 мМ. 1 мл такого раствора субстрата смешивают с 1,5 мл 0,1М фосфатного буфера, рН 7,2. В момент времени 1=0 добавляют 0,5 мл фермента и оставляют смесь для прохождения реакции при 20°С.

Через 15 мин добавляют 1 мл 1Ν НС1. Слепую пробу ставят с 1Ν НС1, вводимой в момент времени 1=0. Измеряют при 400 нм величину оптической плотности слепой пробы (ОП_сл._пр) и исследуемого образца (ОП_тест). Активность вычисляют по следующей формуле:

(ОП_теСф) ~ (ОП_сл._Пр) 4

А =- X - РЬе-АР/мл

9,8 х 15 0,5

В. 1.2 Лейцин-аминопептидаза (Ьеи-АР). Лейцинпаранитроанилид растворяют в воде до концентрации 9 мМ. 1 мл такого раствора субстрата смешивают с 1 ,5 мл 0,1М фосфатного буфера, рН 7,2. В момент времени 1=0 добавляют 0,5 мл фермента и оставляют смесь для прохождения реакции при 20°С. Через 1 5 мин добавляют 1 мл 1 Ν НС1. Слепую пробу ставят с 1 Ν НС1, вводимой в момент времени 1=0. Измеряют при 400 нм величину оптической плотности слепой пробы (ОП_сл._пр) и исследуемого образца (ОП_тесг). Активность вычисляют по следующей формуле:

(ОП_тест) - (ОП_сл._пр) 4

А =- х - Ьеи-АР/мл

9,8 х 15 0,5

В. 1.3 Эндопротеаза (РИ).

Указанную активность измеряют при проведении гидролиза казеина при рН 6,0 и 40°С в течение 1 ч. Одна единица РИ обозначает количество фермента, которое необходимо для того, чтобы высвободить эквивалент 1 мкмоля тирозина в минуту после осаждения оставшихся белков трихлоруксусной кислотой.

В.2 Скрининг штаммов АзрегдШиз пщег. 200 штаммов АзрегдШиз пщег, выделенных из различных источников или полученных из коллекции культур, растят в среде, содержащей 15 г/л картофельной муки, 20 г/л бактопептона, 7 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л дигидрофосфата калия, 0,5 г/л сульфата магния, 0,5 г/л хлорида кальция и 0,5 г/л хлорида цинка. рН среды составляет 4,8. Супернатанты, полученные при центрифугировании при 30°С 24-часовой прекультуры при 240 об/мин и 96-часовой культуры при 275 об/мин (и той же температуре) собирают и анализируют на наличие лейцин-, фенилаланин- и валинаминопептидазной активностей, как было описано ранее. Как следует из приведенной ниже таблицы 1, ряд штаммов АзрегдШиз пщег обладают высоким потенциалом по продуцированию, по крайней мере, одной из указанных ферментативных активностей (каждое из значений представляет собой среднюю величину из четырех индивидуальных результатов):

Таблица 1

Номер штамма	Аминопептидазная активность в супернатантах	Эндопептидаза, РИ/мл
Ьеи-АР/л	РДе-АР/л	Уа1-АР/л
1053	25	170	32	<0,1
1085	23	135	48	0,1
1103	37	285	40	0,1
1108	60	435	29	0,1
1444	40	192	50	0,1
1497	25	105	75	0,1
1502	16	44	63	0,1

Из указанных штаммов штаммы 1108 и 1502 были получены из коллекции культур и были депонированы под номерами, соответственно, \НН1. 3112 и СВ8 115.39. Штамм \НН1. 3112 использовался для получения амилоглюкозидазы, α-амилазы и глюкоамилазы. Штамм СВ8 115.39 использовался для продуцирования амилазы.

В.3 Получение экзопептидазы в лабораторных масштабах.

Несколько штаммов из набора для скрининга в примере 1 использовали для сбраживания в лабораторных ферментерах (10 л). В Примере ниже представлены полученные при этом результаты.

Споры Л8регдй1и8 шдег штамм № 1502 собирают на чашках с ПДА (парафениламиндиамидом) после инкубации в течение 7-10 дней при 30°С. Инокулирование осуществляют в качалочной колбе, которая содержит среду, включающую глюкозу (20 г/л) и кукурузный экстракт (20 г/л) при рН 4,8, в течение 24 ч.

Основную ферментацию проводят в периодическом режиме. Для этого используют следующие питательные ингредиенты: 1 00 г/л мальтодекстрина, 40 г/л соевой муки, 40 г/л гидролизованного казеина, 5 г/л кукурузного экстракта, 2 г/л желатина, 2 г/л дигидрофосфата калия, 1,3 г/л нитрата натрия, 1 г/л хлорида аммония, 0,01 г/л сульфата железа и 0,5 г/л пеногасителя. Вначале все питательные ингредиенты, за исключением мальтодекстрина, смешивают друг с другом. Доводят значение рН до 4,8±0,1. Затем ферментер стерилизуют при температуре 125°С в течение 40 мин. Раствор мальтодекстрина стерилизуют отдельно и добавляют к стерильной и охлажденной среде.

Основную ферментацию осуществляют в лабораторном ферментере, заполненном 6 литрами описанной выше среды и инокулируют в нее культуру из колбы. Проводят перемешивание и аэрирование, с тем чтобы поддерживать как можно более высокую концентрацию растворенного кислорода. Температуру поддерживают на уровне 30°С. Как только все питательные компоненты будут потреблены, примерно через 130 ч, останавливают процесс ферментации.

Бульон после сбраживания фильтруют для удаления микроорганизмов. В фильтрате измеряют аминопептидазную и эндопротеазную активности:

0,15 Ьеи-АР/мл

1,0 Рйе-АР/мл <0,05 Уа1-АР/мл <0,1 Ри/мл

Для получения препарата жидкой аминопептидазы с глицерином (50%) в качестве стабилизирующего агента используют концентрации после ультрафильтрации. Полученный раствор так называемой «Пептидазы Ь2» имеет следующие активности:

0,5 Ьеи-АР/мл

3,2 Рйе-АР/мл <0,05 Уа1-АР/мл <0,1 Ри/мл

Приведенные результаты показывают, что выбранный штамм АкрегдШик шдег при выращивании в указанных условиях продуцирует аминопептидазы, не содержащие в значительных количествах эндопротеазу.

В.4 рН профили ферментативных активностей.

Активности Ьеи-АР и Рйе-АР определяют исходя из пептидазы Ь2 (см. пример 2), но с использованием разных буферов для скрининга активности в диапазоне рН от 2,5 до 9,0.

рН профиль лейцинаминопептидазы из Л8регдй1и8 шдег показан на фиг. 1.

рН профиль фенилаланинаминопептидазы из Л8регдй1и8 шдег показан на фиг. 2.

Приведенные фигуры демонстрируют, что Ьеи-АР активна в диапазоне рН от 5 до 8,5, тогда как Рйе-АР активна в диапазоне рН от 5,5 до 9, что соответствует данным, полученным для аминопептидаз из других видов АкрегдШик.

В.5 Температурные профили ферментативных активностей.

Активности Ьеи-АР и Рйе-АР определяют исходя из пептидазы Ь2 (см. пример 2), но с использованием различных температур инкубации для скрининга активности в диапазоне температур от 5 до 70°С.

Температурные профили приведены на фиг. 3. Результаты показывают, что каждый фермент имеет оптимальную для активности температуру, т.е. 50°С для Ьеи-АР и 60°С для Рйе-АР.

Ниже раскрывается способ продуцирования аминопептидаз из культуры АкрегдШик πίдег. Указанные аминопептидазы имеют оптимальную активность в диапазоне рН 6-8 и в диапазоне температур 50-60°С; более того, в рассматриваемых условиях культивирования можно получать аминопептидазы, которые не содержат заметные или значительные количества эндопротеазы. Этот метод позволяет добиться превышения активности аминопептидазы над активностью эндопротеазы, предпочтительно первая из них в 1 0 раз выше, более предпочтительно в 30 раз выше.

Г. Мальтогенная амилаза (стадия осахаривания).

Амилаза, используемая на стадии осахаривания по способу настоящего изобретения, представляет собой фермент, расщепляющий связи а-1,4-глюкоза-глюкоза в декстринах или крахмале с получением в качестве основных продуктов мальтозы и/или глюкозы. Очень хороших результатов можно достичь при использовании α-амилазы из АкрегдШик огу/ае, коммерчески доступной от Сй1-Вгосайе5 под торговой маркой Вге^ег'8 Регтех, или при использо11 вании рекомбинантной β-амилазы из ВасШик ату1о1к|исГас1СП5. коммерчески доступной от Νονο под торговой маркой Νοναιηνί.

Пример 1.

Сорго (сорт РАРА РАКА) и кукурузные початки растирают в соответствии со стандартным методом производства пива. Одну часть зерен (60% сорго + 40% кукурузных початков) гидратируют 3 частями воды. Добавляют хлорид кальция так, чтобы гарантировать наличие в жидкой среде 200 частей на миллион Са²+. С помощью гидроксида кальция доводят рН до значения 6,5. Затем добавляют В.А.Т.8. в дозе 1,5 кг на тонну зерен. Добавляют также другие ферменты в количествах, указанных ниже в таблице 2:

Таблица 2

Тест №	Ферменты	Доза на тонну зерен
1	Отсутствует	0
2	Вгехуегк Рго1еаке 2000	1,2 кг
3	Вгехуегк Рго1еаке 200 Экзопептидаза из А.ко\|ае	1,2 кг 73000 Ьеи-АР
4	Раийтаке 400	10 кг
5	Раийтаке 400 Экзопептидаза из А.ко\|ае	10 кг 73000 Ьеи-АР

Смесь выдерживают при температуре 50°С в течение 1 ч; затем температуру поднимают до 95°С (скорость повышения температуры 1° С/мин) и выдерживают при температуре 95°С в течение 45 мин. После этого смесь в течение 5 мин охлаждают до 60°С. Затем добавляют Вгс\усг5 Регтех (600 г/т). В течение 45 мин проводят осахаривание затора при 60°С. Температуру повышают до 76°С и выдерживают при этой температуре 10 мин. Затор вливают в воронку, содержащую бумажный фильтр ЗсЫеюйет апб 8с1ше11. Затем измеряют объем и удельный вес отфильтрованного сусла. На основании этих данных вычисляют характеристики экстракта и выход. При помощи нингидринового реагента с использованием в качестве стандарта глицина измеряют уровень аминокислот. Соответствующим образом корректируют полученные значения концентрации аминокислот для сравнения характеристик сусла при одном и том же содержании сахара (12° Р1а1о).

Полученные результаты представлены ниже в таблице 3.

Таблица 3

Тест №	Отфильтрованный объем (мл)	Выход (%)	Аминокислоты при 12° (Р1аТо) (мг/л)
1	310	85,4	26,9
2	370	86,9	54,7
3	382	90,2	119,5
4	365	86,9	76,2
5	372	91,0	102,3

Приведенные результаты показывают, что использование эндопротеазы в сочетании с экзопептидазой в способе по настоящему изобретению позволяет повысить не только количество аминокислот, но также выход и фильтруемость.

Пример 2.

В этой серии испытаний проводится то же сбраживание, что и в примере 1 , но с использованием сочетания нейтральной протеазы из ВасШик ату1о1|циеГас1еп5 (1,8 кг Вте^етк Рто1еаке 2000 на 1 тонну зерна) с различными экзопептидазами из видов АкретдШик в соответствии со схемой исследования, показанной на таблице 4.

Таблица 4

Тест №	Применяемые экзопептидазы
Биологическое происхождение	Ьеи-АР/Т	Рйе-АР/Т
1	Не биологич. происхожд.	0	0
2	АкрегдШик ко\|ае	73000	49000
3	АкрегдШик огу/ае	73000	53000
4	АкрегдШик ш§ег	25000	100000

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Тест №	Отфильтрованный объем (мл)	Выход (%)	Аминокислоты при 12° (Р1а!о) (мг/л)
1	340	86,1	61,4
2	400	90,0	116,0
3	385	87,9	95,7
4	382	89,8	99,8

Все сочетания эндопротеаза + экзопептидазы работают лучше, чем одна эндопротеаза, независимо от биологического происхождения применяемой экзопептидазы. И в этом случае, также кроме повышения содержания аминокислот, удается достичь повышения выхода и улучшения фильтруемости.

Пример 3.

Для того, чтобы проконтролировать применимость полученного сусла в производстве пива, сорго и кукурузные початки сбраживают по способу примера 1 ; одновременно проводят другое сбраживание, в котором не используют фермент и полностью заменяют сорго на солод. В таблице 6 проиллюстрирована схема проведения исследования:

Таблица 6

Тест №	Ферменты	Доза
1	Солод	Заменил сорго
2	Вгехуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза .\.ко\|ае	1,8 кг/т 42000Реи-.\Р Т
3	Вгехуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза . Уогу/ае	1,8 кг/т 40000 Ьеи-АР/Т
4	Вгехуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза А.шдег	1,8 кг/т 25000 Ьеи-АР/Т

Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Тест №	Отфильтрованный объем (мл)	Выход (%)	Аминокислоты при 12° (Р1а!о) (мг/л)
1	400	82,3	222,0
2	395	89,5	127,0
3	390	87,9	109,0
4	375	91,1	113,1

Точный аминокислотный состав каждой бражки был определен с помощью ВЭЖХ. Аминокислоты классифицируются на группы в зависимости от скорости их ассимиляции представителями рода 8ассйатотусек:

Группа А: быстрая ассимиляция;

Группа Б: средняя ассимиляция;

Группа В: медленная ассимиляция. Результаты представлены в таблице 8: (Примечание: значения в мг/л не совпадают с общим количеством аминокислот, приведенным в таблице 6, в связи с тем, что приведенные в таблице 7 данные были получены с использованием глицинового стандарта, тогда как калибровка при для ВЭЖХ осуществлялось иным способом.)

Таблица 8

Аминокислоты (мг/л)	Тест №
1	2	3	4
Группа А
Ош	36	38	30	39
Акр	53	29	26	29
8ег	143	64	51	56
ТЪг	54	28	21	22
1,ук	95	65	45	47
Агд	133	114	67	74
Всего	513	340	260	268
Группа Б
Уа1	102	36	32	28
Ме1	26	37	30	28
Ьеи	158	216	205	166
11е	75	41	42	28
Ηίδ	58	26	16	15
Всего	418	356	325	265
Группа С
О1у	29	19	13	17
РНе	134	89	85	95
Туг	107	67	58	57
Тгр	55	11	11	12
А1а	97	80	66	73
Всего	421	265	233	253

Каждое сусло кипятят в течение 45 мин; асептически к каждому суслу добавляют кипяченую дистиллированную воду до получения содержания сахара 12° Р1а1о. В стерильные колбы вливают асептически по 350 мл каждого стандартного сусла и затем в каждую колбу инокулируют дрожжи из бражки (5 г/л). Сбраживание длится в течение 8 дней при 11 °С. После 8 дней отмечается явное сбраживание, определяемое по плотности.

Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Тест №	Отмечаемое сбраживание к 8 дням (%)
1	82,0
2	81,0
3	80,4
4	Не определяли

Сочетание эндопротеаза + экзопептидаза по настоящему изобретению, использованное в случае сорго, позволяет получать сусло с более удачными характеристиками для целей сбраживания в производстве пива, по сравнению с суслом, получаемым из солода.

Было обнаружено, что сочетание эндопротеазы из ВасШик ату1окцисГас1сп5 с экзопептидазой из АкрегдШик ко)ае позволяет достичь существенного повышения содержания аминокислот Группы А + Группа Б.

Пример 4.

Данный пример иллюстрирует преимущество введения экзопептидаз по способу настоящего изобретения на стадии разжижения, а не на стадии осахаривания. Сбраживают по методу примера 1 сорго + кукурузные початки. Во все бражки на стадии разжижения добавляют фермент Вге\\сг5 Рго1еаке 2000 (1,8 кг/т). Экзопептидазу из АкрегдШик ко)ае (40000 Ьеи-АР/Т) добавляют либо на стадии разжижения (тесты п° 1-2), либо на стадии осахаривания (тесты п° 34). Результаты представлены в таблице 1 0.

Таблица10

Тест №	Отфильтрованный объем (мл)	Выход (%)	Аминокислоты при 12° (Р1а!о) (мг/л)
1	380	89,3	115,1
2	385	89,5	119,8
3	370	89,4	109,1
4	370	89,8	112,0

Значения стандартного отклонения для отфильтрованного объема, выхода и содержания аминокислот определяют при повторении идентичных тестов. Они были установлены в следующем виде: 10 мл, 0,5% 0,9 мг/л, соответственно.

Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что введение экзопептидаз на стадии разжижения дает значительный положительный вклад, прежде всего, с точки зрения продуцирования аминокислот и способности к фильтрованию.

Пример 5.

Данный пример иллюстрирует влияние повышения доз экзопептидаз из А.огу/ае на характеристики бражки.

Сорго + кукурузные початки сбраживают в соответствии с методом, описанным в примере

1. На стадии разжижения добавляют Вге^егк Рго1еаке 2000 и экзопептидазу (таблица 11).

Таблица 11

Тест №	Ферменты	Доза
1	Без фермента	0
2	Вгеуегк Рго1еаке 2000	1,0 кг/т
3	Вгеуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 62000 Ьеи-АР/Т
4	Вгеуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 109000 Ьеи-АР/Т
5	Вгеуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 155000 Ьеи-АР/Т
6	Вгеуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 234000 Ьеи-АР/Т
7	Вгеуегк Рго1еаке 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 313000 Ьеи-АР/Т

Полученные результаты представлены в таблице 1 2.

Таблица 1 2

Тест №	Отфильтрованный объем (мл)	Выход (%)	Аминокислоты при 12° (Р1а!о) (мг/л)
1	188	88,4	39,1
2	275	88,9	59,8
3	280	89,1	81,5
4	280	89,6	90,5
5	280	89,7	95,3
6	280	90,4	101,0
7	280	89,5	114,0

Чем больше вносится экзопептидазы, тем более высокий выход и более высокие количества свободных аминокислот удается получить. Тогда как эффект фильтруемости достигает оптимального значения уже при низком уровне экзопептидазы.

Пример 6.

Данный пример иллюстрирует действие повышающихся доз экзопептидаз из А гиде г на сбраживание.

В соответствии с методикой примера 1 проводят сбраживание сорго + кукурузные початки. Фермент Вге\уег8 Рго1еа8е 2000 добавляют на стадии разжижения.

Таблица 13

Тест №	Ферменты	Доза
1	без фермента	0
2	Вге^егз Рго1еа§е 2000	1,0 кг/т
3	Вге^егз РгсЯеазе 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 51000 Рйе-АР/Т
4	Вге\уег8 РгсИеазе 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 90000 Рйе-АР/Т
5	Вге\уег8 Рго1еа8е 2000 Экзопептидаза А.огу/ае	1,0 кг/т 127000 Рйе-АР/Т

Полученные результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14

Тест №	Отфильтрованный объем (мл)	Выход (%)	Аминокислоты при 12° (Р1а!о) (мг/л)
1	188	88,4	39,1
2	240	88,6	60,1
3	246	89,7	63,7
4	258	89,5	64,2
5	232	89,7	65,7

И здесь также, чем больше вносится экзопептидазы, тем более высокий выход и более высокие количества свободных аминокислот удается получить. Эти результаты показывают, что экзопептидаза из А.огу/ае работает несколько лучше, чем экзопептидаза из А.шдет.

Пример 7.

Ячмень (сорт ΡΤΑΙδΑΝΤ) размельчают в тонкую муку, пригодную для поступления на фильтр-пресс в варочном цеху. Суспендируют при 50°С 57 мг муки в 30 мл воды, содержащей:

мг Β.Α.Τ.8.

мг РШтаке Ь3000(+) β-глюканаза из ВаеШи8 атуЫкщеГасаещ. коммерчески доступная от С181-Вгосабе8);

мг Вге\\ег8 Рго1еа8е 2000; и соответствующее количество экзопептидазы из А8ретдШи8 8о)ае. Затем температуру поднимают до 63 °С (скорость повышения температуры 1°С/мин) и выдерживают при 63 °С в течение 30 мин. После этого температуру повышают до 90°С (скорость повышения температуры 1°С/мин) и выдерживают при 90°С в течение 20 мин. Затем бродильную смесь охлаждают до 25°С и центрифугируют при 7000§ в течение 1 5 мин. Супернатант анализируют на содержание растворимых белков и свободных аминокислот.

Полученные результаты представлены в таблице 15.

Таблица 1 5

Тест №	Доза экзопептидазы (Ьеи-АР/Т)	Уровень аминокислот при 1 2° Р1а!о (мг/л)	Уровень растворимых белков (% от сухого вещества
1	0	77.9	4,21
2	25000	95.3	4,75
3	50000	118.4	4,99
4	100000	133.2	5,42
5	200000	203.6	6,63
6	400000	295.0	7,55

Приведенные результаты показывают, что применение экзо-пептидазы из АкретдШик 8о.)ае, в том случае, когда ее вносят на стадии разжижения, позволяет достичь такого же высокого уровня свободных кислот в ячменной бражке, как и при работе с солодовой бражкой.

Пример 8.

Ячмень сбраживают, как описано в примере 7, но с заменой экзопептидазы из АкретдШик 8о)ае экзопептидазой из АкретдШик ищет.

Полученные результаты представлены в таблице 1 6.

Таблица 1 6

Тест №	Доза экзопептидазы (Ьеи-АР/Т)	Уровень аминокислот при 1 2° Р1а!о (мг/л)	Уровень растворимых белков (% от сухого вещества
1	0	68,2	4,37
2	10000	69,8	4,20
3	50000	75,2	4,25
4	200000	78,0	4,16
5	500000	89,1	4,50
6	1000000	101,0	4,18

Даже несмотря на то, что экзопептидаза из АкретдШик ищет, по всей видимости, работает несколько менее эффективно, чем фермент из АкретдШик огу/ае, она позволяет получать в ячменном сусле до 1 00 мг/л аминокислот при 1 2° Р1а!о, что вполне достаточно для брожения.

Депонирование микроорганизмов

Штаммы, использованные как продуценты экзопептидаз, депонированы в Коллекции культур в Нидерландах (Сеп1гаа1 Вигеаи уоот §сЫтте1си11ите8, ОоЧегЧгаа! 1, Ваагп, ТНе №1Нег1апЙ8) под депозитными номерами СВ δ 115.39 (государственная коллекция), СВ8 209,96 (Л.5о)ае (Όδ 8351); дата депонирования 12 февраля 1996 г.) и СΒδ 210.96 (А.оту/ае (ϋδ 23617); дата депонирования 12 февраля 1996 г.).

Claims

1 . Способ получения сбраживаемого сусла, предусматривающий стадии:

(а) разжижения злакового материала с помощью вещества, имеющего альфа-амилазную и/или эндопротеазную активность с получением ожиженного затора, (б) осахаривания ожиженного затора в присутствии альфа-амилазы, и (в) фильтрования ожиженного и осахаренного затора с получением сбраживаемого сусла, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну из стадий (а) или (б) проводят в присутствии фермента, имеющего экзопептидазную активность.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что злаковый материал содержит, по меньшей мере, 20% несоложенных злаков.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что злаковый материал содержит, по меньшей мере, 20% несоложенного сорго.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что злаковый материал содержит, по меньшей мере, 50% несоложенного сорго.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что используют эндопротеазу, полученную из ВасШиз ашу1о11диеГас1епз.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что фермент, имеющий экзопептидазную активность, используют на стадии разжижения злакового материала.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что фермент, имеющий экзопептидазную активность, представляет собой экзопептидазу из грибов.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что грибы представляют собой грибы рода Азрег§Шиз.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что грибы рода АзрегдШиз представляют собой АзрегдШиз зо]ае.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что экзопептидаза представляет собой аминопептидазу.

11 . Способ производства алкоголя или содержащего алкоголь напитка, предусматривающий стадию сбраживания сусла в присутствии дрожжей, способных продуцировать этиловый спирт, отличающийся тем, что используют сусло, полученное способом по любому из пп.1-10.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что содержащим алкоголь напитком является пиво.