EA009302B1 - Система обнаружения полинуклеотидов - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида. Полинуклеотид, аналог мишеневой нуклеиновой кислоты и краситель объединяют для образования смеси. Оптическая характеристика красителя сравнивается с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, для определения относительной скорости изменения оптической характеристики. Относительная скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируется с присутствием или количеством определённого мишеневого полинуклеотида в образце.

Description

Связанные заявки

Заявка на данное изобретение заявляет преимущество предварительной заявки США № 60/471827, поданной 20 мая 2003 г., которая включена здесь полностью посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам, композициям и системам анализа для обнаружения полинуклеотидов.

Уровень техники

Существует большая потребность в идентификации и количественном определении полинуклеотидов. Существующие способы идентификации мишеневых полинуклеотидов, таких как полинуклеотиды, связанные с патогенами, с патогенной инфекцией, со связанными с болезнями и нарушениями генами человека, с генетически модифицированными организмами (ГМО) (ОМО), со средствами биологической борьбы, с применениями в ветеринарии и сельском хозяйстве, в настоящее время основаны на таких способах, как полимеразная цепная реакция (РСК), ΝΑ8ΒΑ, ТМА или 6ΌΝΑ. Эти способы требуют квалифицированного персонала и специализированного оборудования. Соответственно, существует большая потребность в удобных и экономичных методах обнаружения, идентификации и количественного определения мишеневых полинуклеотидов. Данное изобретение удовлетворяет эту и другие потребности.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в образце. В следующем аспекте один способ включает в себя следующие стадии.

Аналог нуклеиновой кислоты, который связывается специфичным образом с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида в одну последовательность, и краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, объединяют так, чтобы получилась смесь. Скорость изменения оптической характеристики красителя в этой смеси сравнивают с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определённого мишеневого полинуклеотида в образце.

В другом аспекте способ включает в себя следующие стадии: пептидная нуклеиновая кислота (ΡΝΑ), которая связывается специфичным образом с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида в одну последовательность, и краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/ΡΝΑ, объединяют так, чтобы получилась смесь. Скорость изменения оптической характеристики красителя в этой смеси сравнивают с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/ΡΝΑ, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определённого мишеневого полинуклеотида в образце.

В других аспектах аналог нуклеиновой кислоты может представлять собой замкнутую нуклеиновую кислоту (ΕΝΑ), треозовую нуклеиновую кислоту (ΤΝΑ) или сцепленную с металлом нуклеиновую кислоту.

Скорость изменения оптической характеристики красителя может быть различной в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты и когда на смесь воздействуют световым стимулом.

Образец может представлять собой ткань, совокупность клеток, клеточный лизат, очищенный полинуклеотид, или выделенный полинуклеотид, вирус, пробу окружающей среды, промышленную пробу, медицинскую пробу, пищевую пробу, агротехническую пробу, ветеринарную пробу, животноводческий образец, пробу воды, почвенную пробу, пробу воздуха, пробу, связанную со средством биологической борьбы, или пробу, связанную со средством сельскохозяйственной борьбы.

В одном аспекте мишеневый полинуклеотид может представлять собой ДНК. В некоторых случаях мишеневый полинуклеотид может быть получен из тотальной клеточной ДНК, ядерной ДНК, митохондриальной ДНК, рибосомной ДНК, хлоропластной ДНК, или вирусной ДНК, плазмидной ДНК, искусственной ДНК, эпигеномной ДНК, эпигенетической ДНК, ίη νίίτο амплифицированной ДНК или из химерной ДНК.

В другом аспекте мишеневый полинуклеотид может представлять собой РНК. В некоторых случаях РНК может быть получена из рибосомной РНК (γΡΝΑ), матричной РНК (тКNΑ), транспортной РНК (1ΡΝΑ), защищенной РНК, вирусной РНК, микроРНК, 6РНК, искусственной РНК или из химерной РНК.

Мишеневый полинуклеотид может быть получен из организма. В одном варианте осуществления организмом может быть человек. В другом варианте осуществления организм может представлять собой патоген. В ещё одном варианте осуществления мишеневый полинуклеотид может происходить из пато

- 1 009302 гена, такого как вирус, бактерия или грибок. Неограничивающие примеры таких вирусов или бактерий включают в себя ВасШик аиШтаск, С1о8йт6шт Ьо1и1шит, Вгисе11ае, νώτίο с1ю1ега. С1о8йт6шт регГппдеч вирус Эбола, Уетыша реык, Сох1е11а ЬитиеШ, вирус оспы, вирус гепатита С, вирус гепатита В и вирус иммунодефицита человека.

Аналог нуклеиновой кислоты может быть частично комплементарным мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты. Альтернативно, аналог нуклеиновой кислоты может быть полностью комплементарным мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты.

Аналог нуклеиновой кислоты может иметь более чем примерно 4 нуклеотидных основания в длину и (или) менее чем примерно 24 нуклеотидных основания в длину. В следующем варианте аналог нуклеиновой кислоты может также иметь примерно 12 нуклеотидных оснований в длину.

Аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид могут быть иммобилизованными на твёрдом субстрате. Иммобилизация может осуществляться через нековалентное взаимодействие, такое как между биотином и стрептавидином. В следующем варианте аналог нуклеиновой кислоты может быть ковалентно связан с биотином. В ещё одном варианте нековалентное взаимодействие может представлять собой взаимодействие антиген-антитело. Аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид могут также быть ковалентно связаны с твёрдым субстратом.

В следующем аспекте краситель является цианиновым красителем. Примерами цианиновых красителей являются 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодид, 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид и 3',3'диэтилтиатрикарбоцианин йодид.

Краситель может иметь более высокую скорость изменения оптической характеристики в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид. Альтернативно, краситель может иметь меньшую скорость изменения оптической характеристики в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид.

Скорость изменения оптической характеристики красителя может быть определена измерением оптической характеристики красителя. Примеры таких оптических характеристик включают в себя спектральную поглощающую способность, флуоресценцию, отражательную способность или хемилюминесценцию. Оптическая характеристика может определяться за один или за несколько раз.

В другом аспекте оптическую характеристику красителя измеряют множество раз. В следующем аспекте оптическая характеристика измеряется однократно.

В дальнейшем аспекте изобретение направлено на способ обнаружения организма в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество организма в образце.

В следующем аспекте изобретение направлено на способ обнаружения класса организмов в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество класса организмов.

В ещё одном аспекте изобретение направлено на способ обнаружения штамма организма в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество штамма.

В следующем аспекте изобретение направлено на способ обнаружения генетически модифицированного организма (ОМО) в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество генетически модифицированного организма.

Настоящее изобретение также направлено на способ обнаружения наличия болезненного состояния у субъекта посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на болезненное состояние.

Настоящее изобретение также направлено на способ обнаружения наличия генетической вариации у субъекта посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на генетическую вариацию.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на обнаружение заражения хозяина патогеном посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида, причём мишеневая нуклеиновая кислота является рибонуклеиновой кислотой (ΚΝΑ) и присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на заражение хозяина патогеном.

В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения сингулярного нуклеотидного полиморфизма (8ΝΡ) в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество 8ΝΡ.

В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения генетической последовательно- 2 009302 сти в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество генетической последовательности.

В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения амплифицированной ίη νίΐτο последовательности в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество амплифицированной ίη νίίτο последовательности.

В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения изменений пар оснований в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причём присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество изменений пар оснований.

Данное изобретение также направлено на способ обнаружения мишеневого полинуклеотида в двух или более образцах посредством обнаружения мишеневого полинуклеотида в первом образце в первом сайте мультисайтной конструкции с помощью первой молекулы аналога нуклеиновой кислоты и обнаружения мишеневого полинуклеотида во втором образце во втором сайте мультисайтной конструкции с помощью второй молекулы аналога нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулы аналога нуклеиновой кислоты иммобилизованы на твёрдом субстрате. Способ включает в себя обнаружение двух или более последовательностей мишеневого полинуклеотида в двух или более образцах. Альтернативно, образцы могут быть иммобилизованы на твёрдом субстрате.

Настоящее изобретение также направлено на наборы для обнаружения мишеневого полинуклеотида. Набор может включать в себя один или более образцов, которые включают в себя мишеневый полинуклеотид, один или более аналогов нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, частично комплементарных мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида, и один или несколько красителей. Опционально, набор может включать в себя источник стимула. Набор может включать в себя инструкции по его использованию.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена схематическая версия системы анализа с использованием ΡΝΑ.

На фиг. 2 показано структурное различие между молекулой ДНК и молекулой ΡΝΑ образца.

На фиг. 3 схематически представлена активируемая светом основанная на ΡΝΑ система анализа.

На фиг. 4 показана активируемая светом анализируемая реакция.

Фиг. 5 изображает временной ход эмиссии 3',3'-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя после экспозиции ΡΝΑ и световому стимулу для различных концентраций мишеневого полинуклеотида.

Фиг. 6 показывает процентное изменение эмиссии 3',3'-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя для различных концентраций ДНК.

На фиг. 7 сравнивается процентное изменение эмиссии 3',3'-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя в тестируемом образце, когда для стимуляции использовались световые стимулы с различной длиной волны.

На фиг. 8 сравнивается процентное изменение эмиссии красителя в образце ДНК из ОМО сои и ДНК из не-ОМО сои.

На фиг. 9 изображен чувствительность анализа при изменении концентрации тестируемой ДНК с использованием источника света со смешанными длинами волн. Каждая линия показывает процентное изменение эмиссии красителя после экспозиции световому стимулу при различных концентрациях ДНК. В качестве ΡΝΑ использовалась последовательность Ν' САСТбСТбССТССССОТАб-Ьук (8ЕО ΙΌ N0: 1). Полинуклеотидной последовательностью являлась 5' СТАС666А66СА6СА6Т0 3' (8Е0 ΙΌ Ν0: 2).

На фиг. 10 показано время, за которое наступает 20%-ное изменение эмиссии 3',3'диэтилтиакарбоцианин йодида при различных концентрациях мишеневого полинуклеотида.

Фиг. 11 показывает процентное изменение эмиссии красителя в образце ДНК и образцах с различными концентрациями РНК.

На фиг. 12 сравнивается процентное изменение эмиссии для 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодида в образце, содержащем ΡΝΑ, и ДНК либо в отсутствие загрязнений в приготовляемой среде, либо в присутствии загрязнений в приготовляемой среде.

Фиг. 13 показывает дополнение ΡΝΑ «клиньями».

На фиг. 14Α-Ό сравнивается эмиссия после применения волн различной длины для серий образцов.

Фиг. 15 изображает иммобилизованные реакции во времени с помощью универсального бактериального ΡΝΑ-зонда.

На фиг. 16 показано обнаружение 8Κ.Υ человека.

На фиг. 17 схематически представлено обнаружение аналогов нуклеиновой кислоты с использованием иммобилизации на поверхности и активирования светом.

На фиг. 18Α-Ό изображены различные схемы интродуцирования гибридов полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты.

На фиг. 19 показано действие светового стимула с различными длинами волн.

- 3 009302

На фиг. 20 показано обнаружение различных концентраций ДНК сои.

На фиг. 21 показано процентное изменение оптической характеристики от числа геномов СМОположительной сои.

На фиг. 22 показано действие различных концентраций Тетееп-20.

На фиг. 23 показано процентное изменение эмиссии при различных концентрациях Тетееп-20.

На фиг. 24 сравниваются реакция с использованием ΡΝΑ-зондов и реакция с использованием ЬЫАзондов в жидком формате с различными концентрациями Тетееп-20.

На фиг. 25 показано процентное изменение эмиссии с использованием ΡΝΑδ в зависимости от эмиссии с использованием ΕΝΛδ.

На фиг. 26 показано обнаружение вируса гепатита С при использовании различных количеств вирусной РНК.

Фиг. 27 показывает эмиссию различных копий плазмы через 1 мин после экспозиции световому стимулу.

На фиг. 28 показано процентное изменение эмиссии при использовании бактерий и аналогов нуклеиновой кислоты, которые являются специфичными либо к бактериям, либо к НСУ.

На фиг. 29 показано процентное изменение эмиссии при использовании коротких аналогов нуклеиновой кислоты или соединённых вместе коротких аналогов нуклеиновой кислоты.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и системы анализа для обнаружения полинуклеотида, имеющего мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты, с помощью аналогов нуклеиновой кислоты.

I. Общие методы.

При реализации настоящего изобретения используются, если не указано иначе, традиционные методы молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, иммунологии, кинетики протеинов и масс-спектроскопии, которые хорошо знакомы специалистам. Такие методы во всей полноте описаны в литературных источниках, таких как Мо1еси1аг ΟΊοηίπβ: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 11нгб ебйюп (8атЬгоок е1. а1., 2000) Со1б 8ргнщ НагЬог Ргезз; Мо1еси1аг ΟΊοηίπβ: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, зесопб ебйюп (8атЬгоок е1. а1., 1989) Со1б 8ргйщ НагЬог Ргезз; О11допис1еоЬбе 8уп1Ье818 (М.1. Сай, еб., 1984); МеШобз т Мо1еси1аг Вю1оду, Нитапа Ргезз; Се11 Вю1оду: А ЬаЬогакгу №1еЬоок (1.Е. Се11и8, еб., 1998) Асабетк Ргезз; Ашта1 Се11 СиЙиге (В.1. ЕгезЬпеу, еб., 1987); 1п1гобисбоп 1о Се11 апб Пззие СиЙиге (ЕР. МаШег апб Р.Е. ВоЬейз, 1998) Р1епит Ргезз; Се11 апб Т188ие СиЙиге: ЬаЬога1огу Ргосебигез (А. Эоук. ЕВ. Спйййз, апб ΌΌ. №\\с11. ебз., 1993-8) 1. \Убеу апб 8опз; Ме1йобз ш Епхуто1оду (Асабетк Ргезз, 1пс.); НапбЬоок о£ Ехрептеп1а1 1ттипо1оду (Л.М. \Уей апб С.С. В1аск\\'е11. ебз.); Сепе ТгапзГег УесЮгз Гог Матта1ап Се11з (ЕМ. МШег апб М.Р. Са1оз, ебз., 1987); СиггепГ РгоГосок ш Мо1еси1аг Вю1оду (Е.М. Аи8иЬе1 е1 а1., ебз., 1987 тс1ибтд 8ирр1етеп18 1йгоидй Мау 1, 2004); РСВ: Т1е Ро1утегазе Сйаш Веасйоп, (МиШз е1 а1., ебз., 1994); СиггепГ РгоГосок т 1ттипо1оду (ЕЕ. Сойдап е1 а1., ебз., 1991); и 81юг1 РгоГосок т Мо1еси1аг Вю1оду (\Убеу апб 8опз, 1999), которые все включены здесь полностью посредством ссылки. Кроме того, процедуры, в которых используются коммерчески доступные наборы для анализа и реагенты, как правило, осуществляются в соответствии с протоколами, предписанными производителями, если не оговорено иначе.

II. Определения.

Термин «мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты», как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой с использованием способов, композиций и систем анализа согласно изобретению. Вся или часть этой мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты может связываться с молекулой аналога нуклеиновой кислоты посредством аналогов специфичной гибридизации последовательности. Мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты может иметь любую длину, но, как правило, она имеет длину менее 1 тыс. оснований, менее 500 оснований, менее 24 оснований или менее 12 оснований. В следующем варианте осуществления мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты может быть длиной 10, 12, 14 или 18 оснований. В другом варианте осуществления мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты может быть длиной по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 оснований. Мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может включать в себя последовательность, кодирующую протеин, и (или) некодирующую последовательность (например, регуляторные последовательности, интроны и т.д.).

Термин «полинуклеотид» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидам, либо к рибонуклеотидам, либо к их аналогам. Следующие примеры являются неограничивающими примерами полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мессенджерная РНК (тВNΑ), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвлённые полинуклеотиды, плазмиды, векторы, нуклеиновые кислоты-зонды, праймеры и амплифицированная ДНК. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как мети

- 4 009302 лированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид также может быть модифицирован до или после полимеризации, например путём конъюгации с меченым компонентом. Полинуклеотид может представлять собой амплифицированную область в более длинном полинуклеотиде.

Термин «мишеневый полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, который включает в себя мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты.

Термин «аналог нуклеиновой кислоты» включает в себя любой аналог нуклеиновой кислоты, имеющий одно или более оснований, которые отличны от гуанина, тимидина, аденозина, цитозина или урацила, и (или) имеющий одно или более отличий в фосфорибозе скелета РНК или фосфодезоксирибозе скелета ДНК. «Аналоги нуклеиновой кислоты» включают в себя - но не ограничиваются ими - пептидные нуклеиновые кислоты (ΡΝΑδ), замкнутые нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ), такие как раскрытые в Тгепбк ίη Вю1есйпо1о§у 21:74-81, 2003, сцепленные с металлом нуклеиновые кислоты, модифицированные полинуклеотиды, такие как антрахинон-модифицированные (как раскрывается у Уатапа е! а1., 2003), треозовые нуклеиновые кислоты (ΤΝΑδ), такие как раскрытые у Сйари! е! а1., 1оита1 о£ Не Атепсап С11ет1са1 8ос1е1у, 125, 856-857, (2003), и химерные нуклеиновые кислоты.

Термин «пептидная нуклеиновая кислота», или «ΡΝΑ», включает в себя любой аналог нуклеиновой кислоты, у которого дезоксирибозо-фосфатный скелет нуклеиновой кислоты замещён синтетическим пептидоподобным скелетом, включающим в себя, например, блоки п-(2-аминоэтил)глицина, такие, без ограничений, как показанный на фиг. 2 (№екеп е! а1., 1991), и такие, как раскрытые в патентах США № 5786461; 6357163; 6107470; 5773571; 6441130; 6451968; 6228982; 5641625; 5766855; 5736336; 5719262; 5714331; 5719262 и 6414112. Пуриновые и пиримидиновые основания могут быть присоединены любой ковалентной связью, включая, например, метилен-карбонильные связи. В используемом здесь значении молекулы ΡΝΑ могут иметь дополнительные атомы между ΡΝΑ-скелетом и нуклеотидным основанием. Эти аналоги включают в себя, например, цепочки Ό-лизина, циклические структуры, такие как циклопентановые или пирролидиновые кольца, и (или) хиральные заместители, включая ΡΝΑ-молекулы, описанные в патенте США № 6403763, в патентной заявке США 2003/0162699 и в патентной заявке США 2003/0157500. Скелет ΡΝΑδ может включать в себя замещения или вставки в пептидном скелете. ΡΝΑδ могут включать в себя основанные на пептиде мимики (ΡΕΝΑΜ8), такие как раскрытые, например, в патенте США № 5705333, атомы, имеющие необычные хиральные центры, такие как Ό-хиральные центры и квазихиральные центры, и замещения атомов в скелете ΡΝΑ.

Термины «гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид» и «гибрид полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты» являются синонимами и относятся к аналогу нуклеиновой кислоты и полинуклеотида, специфическим образом гибридизованных в последовательность.

Термины «гибрид ΡΝΑ/полинуклеотид» и «гибрид полинуклеотид/ΡΝΑ» являются синонимами и относятся к ΡΝΑ и полинуклеотиду, специфическим образом гибридизованных в последовательность.

«Комплементарная» означает, что однонитевая молекула аналога нуклеиновой кислоты имеет способность связываться с полинуклеотидами специфическим образом основаниями. Молекула аналога нуклеиновой кислоты может быть синтезированной, чтобы связываться с мишеневым полинуклеотидом, таким как полинуклеотидная нить полной длины или её часть. Молекула аналога нуклеиновой кислоты, которая является «комплементарной», может иметь одну или несколько единичных ошибочных для спаривания пар оснований, вставок и (или) делеций, но всё ещё оставаться способной связываться с мишеневым полинуклеотидом при выбранных условиях гибридизации. В одном варианте осуществления комплементарные последовательности могут гибридизоваться посредством Уотсон-Криковского (№акопСпск) взаимодействия (А-Т или Α-ϋ и С-С). В следующем варианте осуществления комплементарные последовательности могут гибридизоваться посредством Ноод81еш-спаривания оснований аналога нуклеиновой кислоты и нуклеотидными основаниями полинуклеотида.

Под «строгой комплементарностью» подразумевается, что однонитевая молекула аналога нуклеиновой кислоты имеет способность связываться с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты и не содержит ошибочных для спаривания оснований. Молекула аналога нуклеиновой кислоты не является полностью комплементарной мишеневому полинуклеотиду, если будет иметься единственное несовпадение в спариваемых парах оснований между аналогом нуклеиновой кислоты и мишеневым полинуклеотидом.

Термин «скорость» относится к изменению (например, свойства композиции или соединения). Скорость может быть описана в терминах определённой размерности скорости. Скорость может быть определена проведением изменений в течение периода времени. Скорость может быть описана проведением измерений, определяемых в двух временных точках процесса (например, до и после определённого стимула, добавления компонента и т.д.), или проведением измерений по меньшей мере в трёх, по меньшей мере в четырёх или по меньшей мере в пяти временных точках. Скорость может быть выражена количественными или качественными оценками (например, изменение является «быстрым» или «медленным»). Скорость может быть определена путём сравнения характеристики или состава с эталонной скоростью или посредством других методов.

В используемом здесь значении термин «относительная скорость» относится к скорости одного

- 5 009302 процесса по сравнению со скоростью другого процесса. «Относительная скорость» может быть приблизительной (например, скорость одного процесса может быть «быстрее» или «медленнее», чем скорость другого процесса) или качественной (например, сравнивая измеренные скорости двух процессов).

В используемом здесь значении термин «краситель» относится к соединению, которое имеет измеряемую оптическую характеристику или которое может быть превращено в соединение с измеряемой оптической характеристикой. Измеряемые оптические характеристики включают в себя - но не ограничиваются ими - цвет, спектр поглощения, флюоресценцию, отражательную способность и хемилюминесценцию. Краситель может обнаруживать оптическое свойство в определённых условиях, таких как связывание с гибридом полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты или отсутствие связывания с гибридом полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты.

«Защищённая РНК» («Агтогеб ΚΝΑ™») относится к РНК, которая является устойчивой к рибонуклеазе благодаря капсидированию РНК в протеины бактериофагов. «Защищенная РНК» также описана, например, в патентах США № 6399307; 6214982; 5939262; 5919625 и 5677124.

«Неспецифический полинуклеотид-переносчик» в используемом здесь значении относится к немишеневым полинуклеотидным молекулам, которые увеличивают сродство к связыванию аналогов нуклеиновой кислоты с определёнными мишеневыми полинуклеотидами и (или) усиливают чувствительность системы анализа.

В используемом здесь значении термин «сайт связывания аналога нуклеиновой кислоты» относится к точке присоединения одной или более молекул аналога нуклеиновой кислоты к твёрдому субстрату.

В используемом здесь значении термин «сайт связывания ΡΝΑ» относится к точке присоединения одной или более ΡΝΑ молекул к твёрдому субстрату.

«Образец» относится к образцу жидкости любого типа (например, к крови, сыворотке, воде или урине) и (или) к твёрдому образцу любого типа (например, к клеткам, пищевому продукту, льду, воздуху, грунту или зерну) и (или) образцу воздушной взвеси любого типа.

Термин «субъект» относится к животному, такому как позвоночное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек. Термин «субъект» также относится к растению.

Термин «патоген» относится к любому агенту, вызывающему болезнь, нарушение и (или) к любому патологическому условию и (или) симптомам. К примеру, патоген может представлять собой организм (или ассоциированный с ним токсин), находимый в природе или создаваемый в лаборатории, который вызывает болезнь в каком-либо другом организме или развитие патологического условия или симптома в нём или понижает его жизнеспособность, ослабляет и (или) умерщвляет его. Патогены включают в себя без ограничения ими - вирусы, бактерии, грибки, эукариоты и (или) прокариоты, а также средства биологической борьбы, инфекционные болезни, находящиеся в воде патогены и пищевые патогены.

Термин «средство биологической борьбы» относится к любому организму (или ассоциированному с ним токсину), находимому в природе или создаваемому в лаборатории, главная цель использования которого состоит в том, чтобы вызвать болезнь в каком-либо другом живом организме, понизить его жизнеспособность или умертвить его. Примеры средств биологической борьбы включают в себя - но не ограничиваются ими - патогенные бактерии, грибки, протозоа, риккетсии и вирусы.

В используемом здесь значении термин «заражение» относится к присутствию патогена в хозяине. Заражение может быть в скрытой или острой форме. В одном варианте осуществления на присутствие патогена указывает изменение в экспрессии полинуклеотида и (или) полипептида в хозяине. Заражение может возникать такими путями - но не ограничиваясь ими - как воздушно-капельный, прямой контакт, перенос животными или насекомыми и заражённый пищевой продукт или напиток.

В используемом здесь значении термин «полинуклеотид, являющийся ответом хозяина» относится к полинуклеотиду, который изменён, или к полинуклеотиду, экспрессия которого в хозяине изменяется в ответ на стимул, такой как инфекция и (или) контакт с патогеном.

Термин «хозяин» в используемом здесь значении относится к животным и растениям. Животное может быть млекопитающим. Примеры млекопитающих включают людей, приматов, не являющихся людьми, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, мышей и крыс.

Примеры растений включают в себя - но не ограничиваются ими - сельскохозяйственные культуры.

III. Способы обнаружения полинуклеотидов.

Настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и системы анализа для обнаружения полинуклеотида, содержащего мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты, с помомщью аналогов нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления (1) образец, предположительно содержащий или предположительно не содержащий мишеневый полинуклеотид, (ίί) аналог нуклеиновой кислоты, который связывается с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты этого полинуклеотида в последовательность специфичным образом, и (ш) краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, объединяются для получения смеси. Смесь может далее включать в себя неспецифический полинуклеотид-переносчик, такой как - но без ограничения - неспецифическая растительная ДНК, дрожжевая ДНК, ДНК спермы лосося или тРНК. Скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси сравнивается с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в

- 6 009302 подобной смеси, содержащей известное количество (включая нулевое количество) гибрида полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством мишеневого полинуклеотида в образце, чтобы определить присутствие или количество мишеневого полинуклеотида в образце.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и системы анализа для обнаружения полинуклеотида, содержащего мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты, с помощью молекулы пептидной нуклеиновой кислоты (ΡΝΑ). В одном варианте осуществления (ί) образец, предположительно содержащий или предположительно не содержащий мишеневый полинуклеотид, (ίί) пептидная нуклеиновая кислота (ΡΝΑ), которая связывается с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты этого полинуклеотида в последовательность специфичным образом, и (ш) краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида полинуклеотид/ΡΝΑ, объединяются для получения смеси. Смесь может далее включать в себя неспецифичный полинуклеотид-переносчик, такой как - но не ограничиваясь им - неспецифичная растительная ДНК, дрожжевая ДНК, ДНК спермы лосося или тРНК. Скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси сравнивается с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество (включая нулевое количество) гибрида полинуклеотид/ΡΝΑ, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определённого полинуклеотида в образце, чтобы определить присутствие или количество мишеневого полинуклеотида в образце.

Эталонное значение может представлять собой значение характеристики композиции или соединения, которое известно. Например, в различных выполнениях эталонное значение может быть определено, используя смесь, которая не содержит гибрида полинуклеотид/нуклеиновая кислота; содержит определённое количество (например, известное количество) гибрида полинуклеотид/нуклеиновая кислота; содержит нулевое количество гибрида полинуклеотид/нуклеиновая кислота; или реакционную смесь, в которой отсутствуют один или более компонентов (например, аналог нуклеиновой кислоты, мишеневый полинуклеотид или краситель). Следующие неограничивающие примеры эталонного значения включают в себя значение оптической характеристики смеси, которая не подвергалась световому стимулу или, в альтернативном выполнении, оптической характеристики смеси, которая подвергалась световому стимулу. Вышеупомянутые примеры приведены для иллюстрации и не направлены на ограничение изобретения, и другие примеры будут очевидными для специалиста-практика, руководствующегося приведённым здесь раскрытием. Должно быть понятным, что эталонное значение может быть, но необязательно должно быть, определено эмпирически (например, если известно, что оптические характеристики композиции, содержащей краситель, не изменяются или изменяются минимально в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, эталонное значение может быть вычислено или логически выведено, а не измерено). Эталонное значение может быть константой. Хотя в некоторых случаях может оказаться удобным подвергать анализу «контрольный» образец параллельно с тестируемыми образцами, делать так необязательно. Эталонное значение может быть определено в одной временной точке, это значение записывается для сравнения со значениями в более поздних временных точках. Будет понятно, что вышеупомянутые примеры даны для иллюстрации, но не для ограничения изобретения. Множество эталонных значений приводится по всему дальнейшему описанию изобретения.

В одном аспекте эталонное значение представляет собой скорость изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, не содержащей гибрида полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления эталонное значение может быть охарактеризовано оптической характеристикой красителя до объединения всех компонентов в смесь. В другом варианте осуществления эталонное значение может быть стандартным значением. Для вариантов осуществления, в которых смесь подвергается световому стимулу, эталонное значение может являться оптической характеристикой красителя до применения светового стимула. Будет совершенно понятным, что эталонное значение необязательно определять одновременно с оптической характеристикой красителя в образце, аналоге нуклеиновой кислоты и окрашенной смеси. Кроме того, понятно, что эталонное значение может являться константой.

Ссылка на характерный пример поможет в понимании изобретения. Основанная на жидкости версия этого способа с использованием ΡΝΑ иллюстрируется в примере 1 и на фиг. 4. 10 мкМ молекул ΡΝΑ, комплементарной 358 промотору вируса мозаики цветной капусты (358 ΡΝΑ), и 1 мкМ 358 ДНК промотора (358 ДНК) смешивались в трубчатой микроцентрифуге и добавлялось 150 мкМ красителя. Трубка подвергалась световому стимулу, и по истечении 1 мин наблюдалось изменение цвета (фиг. 4) - изменение оптической характеристики красителя. В контрольных трубках мишеневый полинуклеотид отсутствовал, и цвет оставался розовым даже спустя 24 ч (без светового стимула), указывая на очень медленную скорость изменения оптической характеристики. В трубках, где либо отсутствует 358 ΡΝΑ (трубка 3), либо отсутствует специфическая мишень (трубка 1), наблюдается небольшое изменение характеристики (в данном случае изменение цвета).

- 7 009302

Следующий пример, с использованием ΡΝΑ-зонда, иллюстрируется на фиг. 1. А) Мембранную полоску с дискретно нанесёнными ΡΝΑ-последовательностями, комплементарными одной или более последовательностям мишеневого полинуклеотида, помещают в лизис/гибридизационную трубку 1. В) К лизис/гибридизационному буферу добавляют образец, и смесь нагревают до 95°С в течение 3 мин, и С) охлаждают до комнатной температуры. Ό) Полоску помещают в свежую трубку (трубка 2), в которой содержится промывочный буфер для инкубации. Несвязавшиеся ДНК, РНК и другой клеточный дебрис удаляются. Е) Полоска помещается в свежую трубку (трубка 3), содержащую обнаруживаемый краситель, где она инкубируется примерно в течение 1 мин. Р) Содержимое трубки быстро промывается в буфере для промывки (трубка 4) для удаления остатка несвязавшегося красителя. С) В этой мембранной системе только краситель связывается с комплексами ΡΝΑ/мишеневый полинуклеотид. На основании рисунка гибридизации можно определить присутствие конкретных мишеневых полинуклеотидов. Сравнивая изображения известных рисунков можно определить присутствие и идентифицировать вещество.

Следующий пример иллюстрируется фиг. 22. 10 мкМ молекул ΡΝΑ, комплементарной мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты, и 1 мкМ мишеневого полинуклеотида смешивались в трубчатой микроцентрифуге. Затем добавлялось 2 мкМ красителя и различные количества Тетееп-20. Трубки подвергались воздействию светового стимула, и через 10 мин наблюдалось изменение оптических характеристик (фиг. 22). Когда добавлялось более 1,0% Тетееп-20, наблюдалось небольшое изменение оптической характеристики для образцов, содержащих краситель и не содержащих гибрида мишеневый полинуклеотид/нуклеиновая кислота. Когда воздействию светового стимула подвергался образец, содержащий гибрид мишеневый полинуклеотид/нуклеиновая кислота, изменялась флюоресценция (или другая оптическая характеристика) красителя. Присутствие или количество мишеневого полинуклеотида обнаруживается наблюдением за изменением флюоресценции (или другой оптической характеристики). Будет понятно, что присутствие или количество полинуклеотида может быть определено посредством единичного измерения.

В следующем варианте осуществления множество последовательностей аналога нуклеиновой кислоты может быть объединено в смесь для обнаружения множества мишеневых полинуклеотидов посредством одновременного множественного измерения. Описание мультиплексных реакций, включающих известные системы анализа нуклеиновых кислот, можно найти, например, в патенте США № 5582989.

Безотносительно к какому-либо конкретному механизму или теории, в одном аспекте изобретения гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид может катализировать химическую реакцию, в которую вовлечен краситель. Краситель связывается с малым желобком гибридов аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, который действует как каталитический сайт. Применение светового стимула добавляет энергию в смесь и вызывает изменение оптической характеристики красителя у гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид с большей скоростью, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Например, 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодид становится светлым при применении светового стимула. Более высокая скорость изменения оптической характеристики красителя соответствует повышенному содержанию мишеневого полинуклеотида в образце.

В последующих разделах аспекты изобретения раскрываются более подробно.

А. Конструирование последовательностей аналога нуклеиновой кислоты.

Для использования согласно настоящему изобретению аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, чтобы быть комплементарными или строго комплементарными к последовательности нуклеиновой кислоты в мишеневом полинуклеотиде. В одном варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты имеет более примерно 4 нуклеотидов в длину, но менее примерно 24 оснований нуклеиновой кислоты в длину, исключая линкеры, аминокислоты и метки. В других вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты может иметь длину 5-100, 8-60 или 10-25 оснований нуклеиновой кислоты. В следующем варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты может быть длиной примерно 8, 10, 12, 14 или 18 оснований нуклеиновой кислоты, исключая линкеры, аминокислоты и метки. В другом варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты может быть длиной по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 оснований. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь часть, которая не является комплементарной мишеневому полинуклеотиду, такую как последовательность, которая «свешивается» от конца полинуклеотида.

Последовательность молекул аналога нуклеиновой кислоты может быть сконструирована множеством способов. К примеру - но не ограничиваясь им - молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что они будут иметь последовательности, основанные на известных праймерах, используемых для ΡΟΚ.-амплификации и обнаружения специфических мишеневых последовательностей. Молекула аналога нуклеиновой кислоты также может быть сконструирована таким образом, что она будет комплементарной или строго комплементарной любой мишеневой последовательно

- 8 009302 сти нуклеиновой кислоты полинуклеотида. К примеру, последовательность молекулы аналога нуклеиновой кислоты может быть основана на последовательности РСК.-праймеров, используемых для обнаружения полинуклеотидов, ассоциированных с патогенами, присутствия патогена в хозяине, гена болезни или генетического условия. Молекула аналога нуклеиновой кислоты также может быть комплементарной или строго комплементарной всей или части последовательности, кодирующей активные или функциональные домены протеина или интактного протеина, и (или) некодирующей последовательности (например, регуляторным последовательностям, интронам и т.д.).

В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть использованы для различения полинуклеотидов, имеющих строго комплементарную последовательность, и полинуклеотидов с единичным некомплементарным основанием. К примеру - но не ограничиваясь им - аналоги нуклеиновой кислоты для использования в данном изобретении могут быть сконструированы для обнаружения сингулярного нуклеотидного полиморфизма (8ΝΡδ). На гибридизацию аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид оказывает влияние некомплементарность оснований. В соответствии со способами по настоящему изобретению, при добавленном красителе некомплементарность одного основания между мишеневой последовательностью (например, 8ΝΡ) и аналогом нуклеиновой кислоты приводит к различной скорости изменения оптической характеристики красителя по сравнению с аналогом нуклеиновой кислоты, в котором не имеется некомплементарностей. Идентификация 8ΝΡδ для диагностики и других применений хорошо известна из уровня техники.

В другом варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты может быть сконструирован для обнаружения присутствия или количества классов организмов. Под классом организмов подразумевается, что все организмы имеют одну или более последовательностей, которые комплементарны или строго комплементарны к последовательности аналога нуклеиновой кислоты. Такие классы организмов могут быть отличены от других организмов на основании комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления молекула аналога нуклеиновой кислоты имеет содержание пуринов, меньшее чем примерно 60%, и имеет максимум 4 пуриновых основания или три гуаниновых основания подряд. Обогащённые пуриновыми основаниями молекулы аналога нуклеиновой кислоты имеют тенденцию образовывать агрегаты и имеют низкую растворимость в водных растворах. Молекулы аналога нуклеиновой кислоты отбираются таким образом, чтобы минимизировать или избежать самокомплементарных последовательностей с инвертированными повторами, шпильками и палиндромами, так как эти типы зондов предрасположены к образованию агрегатов.

Молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться с полинуклеотидами в любой ориентации, но антипараллельная ориентация является предпочтительной. Антипараллельная ориентация является предпочтительной конфигурацией в антисмысловых применениях и применениях типа ДНКзондов. Когда ориентация аналога нуклеиновой кислоты является антипараллельной, зонд Νтерминального конца аналога нуклеиновой кислоты эквивалентен 5'-концу ДНК. В настоящем изобретении используются как Ν', так и 5' варианты.

Любой специалист в данной области техники, руководствуясь приведённым здесь раскрытием, признает, что кроме конкретно перечисленных здесь аналогов нуклеиновой кислоты в способах согласно изобретению могут использоваться другие аналоги нуклеиновой кислоты (в том числе аналоги нуклеиновой кислоты, открытые или разработанные в будущем). Аналоги нуклеиновой кислоты, которые образуют гибрид полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты при определённых, описанных здесь условиях анализа, пригодны для применения в настоящих способах и влияют на скорость изменения оптической характеристики.

Аналоги нуклеиновой кислоты, пригодные для применения в данных способах, могут быть идентифицированы при использовании любого из многих методов скрининга. В одном методе, к примеру - но не ограничиваясь им - образец, содержащий тестируемый аналог нуклеиновой кислоты, выборочно при различных концентрациях объединяется с полинуклеотидом, имеющим комплементарную последовательность, при условиях, в которых образуется гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном варианте осуществления затем добавляют краситель. После этого определяют скорость изменения оптической характеристики красителя. Эту величину сравнивают с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В другом варианте осуществления эталонное значение является признаком отсутствия полинуклеотида. В ещё одном варианте осуществления эталонное значение является признаком присутствия мишеневого полинуклеотида (однонитевого или двунитевого). Следует признать, что порядок введения добавок не является категорическим, и компоненты могут добавляться в другом порядке.

В другом варианте осуществления эталонное значение является показателем ненулевой концентрации полинуклеотида. В этом выполнении для использования в заявленных способах отбираются гибриды аналоги нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, проявляющие различную скорость изменения оптической характеристики во времени по сравнению с эталонным значением (например, присутствие двунитевого полинуклеотида, но отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид). Относительную скорость изменения оптической характеристики коррелируют с присутствием или количеством опреде

- 9 009302 лённого полинуклеотида.

B. Пептидные нуклеиновые кислоты (ΡΝΑδ).

В одном аспекте аналогами нуклеиновой кислоты являются ΡΝΑδ. ΡΝΑ гибридизуется со всей или с частью мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты в мишеневом полинуклеотиде путём специфичной последовательной гибридизации. Альтернативно, условия можно изменить таким образом, что можно выявить изменение в одной паре оснований.

ΡΝΑ-молекулы могут быстро гибридизоваться с мишеневыми полинуклеотидами. Гибридизация ΡΝΑ с полинуклеотидами является независимой от концентрации солей (Эепибоу е! а1., 1994). ΡΝΑδ устойчивы к нуклеазной и протеазной атаке и связываются с полинуклеотидами более специфично, чем обычные ДНК-зонды. Короткие зонды можно использовать с большими последовательностями специфически (Вау апб Νογ6οπ. 2000). Кроме того, гибриды ΡΝΑ/полинуклеотид имеют более высокую термальную стабильность, чем соответствующие гибриды ДНК/полинуклеотид, и точка плавления гибридов ΡΝΑ/полинуклеотид относительно нечувствительна к ионной силе, показывая равную термальную стабильность при низких (<10 мМ №1С1) и умеренных (500 мМ №1С1) солевых концентрациях. Эта способность гибридов ΡΝΑ/полинуклеотид образовываться при низких солевых концентрациях является существенной, поскольку внутренняя структура άδΡΗΚ и τΡΗΚ в значительной мере нестабильна при солевых концентрациях ниже 200 мМ. Следовательно, можно выбирать условия, благоприятные для разрыва мишеневой нуклеиновой кислоты и, в то же время, способствующие сильной гибридизации ΡΝΑ-молекул (8!е£апо апб Ну1бщ-№е18еп. 1997). На ΡΝΑ/полинулеотид-гибридизацию очень сильно влияет некомплементарность оснований, и ΡΝΑ-молекулы могут поддерживать различимость вплоть до уровня единичной некомплементарности.

ΡΝΑ-молекулы можно приобрести, например, у ЕигодеШее (ИК), В1ие Негоп Вю1ес11по1оду (Во1йе11, \¥Л) и Лррбеб Вю8у81ет8 1пс. (ΑΒΙ) или синтезировать методами, известными в данной области техники.

C. Условия гибридизации.

Обычно, метод и (или) выбор условий гибридизации регулируется параметрами, такими - без ограничения - как степень комплементарности молекулы аналога нуклеиновой кислоты мишеневому полинуклеотиду, длина используемой молекулы аналога нуклеиновой кислоты и самого мишеневого полинуклеотида. Предпочтительные условия гибридизации дают одну или более из следующих возможностей: эффективное связывание аналогов нуклеиновой кислоты с мишеневыми полинуклеотидами, минимизация вторичной структуры РНК или ДНК, минимизация деградации РНК и либо ограничение одного или более изменения пар оснований, либо включение одного или более изменения пар оснований.

Реакции гибридизации могут быть осуществлены при условиях различной «строгости». Условия, которые влияют на строгость реакции гибридизации, широко известны и опубликованы в уровне техники. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЬога!огу Мапиа1, 1Ыгб ебйюп (8атЬгоок е!. а1., 2000) Со1б 8ргшд НагЬог ΡΐΌ88. Примеры соответственных условий включают в себя - но не ограничены ими - солевые концентрации, рН (буферы) и температура. Гибридизационные условия с использованием более низких солевых концентраций обычно увеличивают нестабильность ДНК и стабильность гибрида ΡΝΑ/полинуклеотид. Примеры буферов, которые могут быть использованы, включают в себя - но не ограничены ими - NазΡΟ₄, NаΗ8Ο₄, Κ₂ΗΡΟ₄, К₂8О₄ или Са8О₄. К примеру, молярность буферов может изменяться между примерно 10 мМ и примерно 0,5 М, и они могут иметь рН между примерно 4 и примерно 10 или между примерно 7 и примерно 10, такой как примерно 7,0 или примерно 7,5. Например, Ν₃ΡΟ₄ может использоваться между примерно 0,5 мМ и примерно 0,5 М, например 2,5 мкМ, и при рН между примерно 4 до примерно 10 или между примерно 7 и примерно 10, таком как, например, примерно 7,0 или примерно 7,5.

Примеры образцов условий включают в себя - но не ограничиваются ими - (в порядке увеличения строгости): температуры инкубации 25, 37, 50 и 68°С; концентрации буфера 10 X 88С, 6 X 88С, 4 X 88С, 1 X 88С, 0,1 X 88С (где 88С составляет 0,15 М №1С1 и мкМ любого буфера, которые здесь описываются) и их эквиваленты, использующие другие буферные системы; концентрации формамида 0, 25, 50 и 75%; время инкубации от 5 мин до 24 ч; 1, 2 или более стадий промывки; время промывочной инкубации 1, 2 или 15 мин; и растворы для промывки 6 X 88С, 1 X 88С, 0,1 X 88С или деионизированная вода. В предпочтительном варианте осуществления гибридизация и условия промывки осуществляются при высокой строгости. Например, гибридизация может быть проведена при 50%-ном формамиде и концентрации буфера 4 X 88С с последующими промывками в растворе 2 X 8СС/формамид при 50°С и 1 х 88С.

Буферы могут содержать ионы или другие соединения, или другие буферные компоненты. Альтернативно, компонент в буфере может иметь стабилизационную способность; например, неомицин или другие аминогликозиды, которые стабилизируют триплексную ДНК (Αιγη е! а1., 2003) или нафтален диимиды, которые увеличивают стабильность триплекса (О1апо1ю апб МсЬаидЫш, 2001), или нафтилхинолиновые димеры (Керр1ег е! а1., 1999).

Ό. Красители.

Присутствие или количество полинуклеотида можно определить, используя один или более красителей, у которых скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии гибрида ана

- 10 009302 лог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид по сравнению с известной концентрацией гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном аспекте изменение оптической характеристики может представлять собой изменение цвета, спектра поглощения, флюоресценции, отражательной способности или хемилюминесценции. Оптическая характеристика во время анализа может измеряться за один или за множество приёмов.

Скорость изменения оптической характеристики красителя можно сравнить с эталонным значением показателя скорости изменения оптической характеристики красителя в смеси, содержащей известное количество гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид или гибрида полинуклеотид/ΡΝΑ, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Эталонное значение может быть качественной или приблизительной величиной (например, наличие или отсутствие цвета). Альтернативно, эталонное значение может быть численной величиной. В другом примере эталонное значение может быть измерено или определено до, во время или после определения скорости изменения оптической характеристики красителя в образце. В следующем примере эталонное значение может быть постоянной, такой как константная скорость. Эталонное значение может также представлять собой скорость изменения оптической характеристики красителя в отсутствие мишеневого полинуклеотида или гибридов полинуклеотид/нуклеиновая кислота (т.е. известное количество гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид равно нулю).

В некоторых случаях краситель имеет более высокую скорость изменения оптической характеристики красителя в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, чем эталонное значение показателя характеристики в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Присутствие или количество полинуклеотида может, таким образом, быть обнаружено по увеличению относительной скорости изменения оптической характеристики сравнительно с эталонным значением. Примеры красителей, у которых оптическая характеристика изменяется более быстро в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/ДНК, включают в себя карбоцианиновые красители, которые являются полициклическими ароматическими соединениями. Эти красители интенсивно поглощают видимый спектр и связываются предпочтительно с гибридами аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид в растворе, изменяя цвет при связывании. Примеры цианиновых красителей включают в себя - но не ограничиваются ими - 3',3'-диэтилтиацианин йодид, 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодид, 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид и 3',3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодид.

В одном варианте осуществления при описываемых здесь условиях анализа 3',3'диэтилтиакарбоцианин йодид изменяет свою окраску от ярко-розовой до бесцветной при световом стимуле в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот и комплементарной ΡΝΑ. В отсутствие мишеневых нуклеиновых кислот скорость изменения цвета красителя более медленная. Световой стимул также уменьшает флуоресцентное свечение красителя в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот и комплементарной ΡΝΑ. В отсутствие светового стимула краситель сразу же изменяет окраску с ярко-розовой на темно-розовую в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот, а флуоресцентное свечение сразу же уменьшается в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот.

При описываемых здесь условиях анализа 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид изменяет свою окраску с голубой на пурпурную в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот.

При описываемых здесь условиях анализа 3',3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодид сохраняет цвет морской воды в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот и становится бесцветным в отсутствие мишеневых нуклеиновых кислот.

В других случаях краситель имеет более низкую скорость изменения оптической характеристики в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Присутствие или количество полинуклеотида может, таким образом, быть обнаружено по уменьшению относительной скорости изменения оптической характеристики сравнительно с эталонным значением показателя величины в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид.

Краситель может быть выбран из, например, молекул, которые соединяются с нуклеиновыми кислотами любым из множества способов. Полезные красители включают в себя такие, которые связываются с малыми желобками, с большими желобками, интеркаляторы и другие полинуклеотидсвязывающие молекулы, их производные и конъюгаты с ними. Некоторые красители, полезные в способах согласно настоящему изобретению, связываются с малым желобком гибридов аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Эти красители включают в себя карбоцианиновые красители, такие как 3',3'диэтилтиакарбоцианин йодид, 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид и 3',3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодид. Примеры включают в себя - но не ограничиваются ими - этидий бромид (Е!еЬ1д е! а1., 1999), флуоресцин, фенотиазиновые красители, такие как метиленовый синий (^адпег, 2002), ΌΑΡΙ (Кариксшккц 1995), тиазоловый оранжевый (Водег алб Тке, 2001, Саггеоп е! а1., 2004), НоесЫк! 33258 (АбЫкагу е! а1., 2003, Май1 е! а1., 2003, Могохкт е! а1., 2003, Тапюик е! а1., 2004, Та\гаг е! а1., 2003), 8УВК. Сгееп II (Могохкт е! а1., 2003), ВЕВО, ВЕТО, ВОХТО, ВО, ΒΘ-ΡΚΌ, ТО-ΡΚΌ, ΥΟ-ΡΚΌ (Каг1ккоп е! а1., 2003, Епкккоп е! а1., 2003), ГкоСте!! (То1и апб Муегк, 2003), ТО^КО-б (8оуепуйа/у е! а1., 2003), бисцианиновый краситель (8сЫаЬег1е е! а1., 2003), метил-гринпиронин Υ (ГгеШо апб Ьуоп, 2003), этидий бро

- 11 009302 мид и акридиновый оранжевый (бойпкоп с! а1., 2003, ЬаигеШ с! а1., 2003, Бисб1кс с! а1., 2003), нейтральный красный (Лайд с! а1., 2003), ВО (Каг1ккоп с! а1., 2003), моно- и бис-лекситропсины и пентамидин (Риско^кка с! а1., 2004), 2-(метилтио)фенилсалицилальдимин 8с1иГГ-щелочной медистый (II) (Веббу с! а1., 2004), бифункциональный платиновый (II) комплекс (Ма апб С1е, 2003), бис(9-аминоакридин-4карбоксиамиды) (Лакейп е! а1., 2003), бис-имидазоакридоны (Тагакоу е! а1., 2003), карбоксиамидсвязывающиеся параллельно или антипараллельно с малыми желобками (Вои!огше е! а1., 2003), конъюгаты олиго(2'-О-метилрибонуклеотидов) со связывающимися с малыми желобками (ЫоуоракЫпа е! а1., 2003), пирролимидазол полиамины (Впейи е! а1., 2003, Иегуап апб Ебе1коп, 2003, Веббу е! а1., 2003, Веппейегд апб Иегуап, 2003), пиррол (Ниапд е! а1., 2000), бис-пиррол (Саггаксо е! а1., 2003), рутениевый комплекс (КитаЬага е! а1., 2003), таллий (Оиатеиг е! а1., 2003), ароматический диамидин (Ыдиуеп е! а1.,

2002) , шартрезин (Вагсе1о е! а1., 2002), платиновый комплекс (8бусгтап е! а1., 2002), 8-3-нитро-2пиридинсульфенил-Ы-ацетил-цистеин (8Ыт е! а1., 2004), эфиры метилсульфоната (Уагабагфап е! а1.,

2003) , пептидный бис-интеркалятор (6ие1еу е! а1., 2001), металлоинтеркаляторы (РгоибГоо! е! а1., 2001), 2,2'-бинафтален (Копбо е! а1., 2004), интеркалирующие нуклеиновые кислоты (Сйпк!епкеп апб Ребегкеп, 2002, Ы|е1кеп е! а1., 2004), рутениевый (II) комплекс (Ьш е! а1., 2004), комплекс неотриен/медистый (II) циклического полиамина (В1уег е! а1., 2004), антрахинон 2,6-дисульфоновой кислоты (Лопд апб Оообтд, 2003), ферроценил антрацен, ферроценил и другие производные нафталендиимида (О1апо1ю апб МсЬаидЫт, 2001, Такепака е! а1., 2002, Ток апб Репкег, 2001), доксорубицин (Ра!о1кку е! а1., 2002, Х1ао е! а1., 2003), акридин-9-илтиомочевая кислота (Ваигай апб В1егЬасй, 2003), нафтален димид (Ыорта е! а1., 2001, Ыипех е! а1., 2000), митоксантрон (Лапд е! а1., 2003), криптолепин и неокриптолепин (Ошйа! е! а1., 2003), связанные с иминодиуксусной кислотой полиамиды (Лообк е! а1., 2002), дендритовые полиаминовые конъюгаты (Вгапа е! а1., 2002), дельта-дельта бис-интеркалятор |ти-С49србрр/(2)-(рйсп)(4)Ви(2)| (ОпГе1! е! а1., 2001, ОпГе1! е! а1., 2002), дитеркалиний (Вегде е! а1., 2002), 8-метоксипсорален (АгаЬ/абей е! а1., 2002), дауномицин и эллиптицин (Ве1а е! а1., 2002), 1,4,5,8-нафтален тетракарбоксильный диимид (6ие1еу е! а1., 2002), криптолепин (Ыкдайеп е! а1., 2002), АмАС (Репу е! а1., 2001), (-)-6[[(аминоалкил)окси]метил]-4-деметокси-6,7-дидезоксидауномциноны(1) (О|спск апб Уоде1. 1996), ЫБСО1 (Рараборои1ои е! а1., 2000), УОУО-1 (Лопд е! а1., 2001), ИАСА (Нюкк е! а1., 2001), циклометалатный Вй(Ш) (К1кко апб Вайоп, 2000), СП958 (Леек е! а1., 2000), пиразолоакридин (Ре11еу е! а1., 2000), цисдихлороплатиновые (II) комплексы (Ретп е! а1., 2000), имидазоакридиноны (Махегкк! апб Мисйете^, 2000), карбазол (8а)е\\'№ апб Икдои, 2000), 5,11-диметил-5Н-индол[2,3-Ь]хинолин (Ок^абасζ е! а1., 2000), УОУО-3, нетропсин, 8Ν6999, А3 апб 8Ν6113 (К1гксйк!ет е! а1., 2000), оксазоловый оранжевый Дпоие е! а1., 1999), 5,6-кризенхинон дииминовые комплексы родия (III) (1асккоп апб Вайоп, 2000), синий Ыйе (С1еп е! а1., 1999), узамбарензин (ОаккоппсуШе е! а1., 1999), 3-метозибензантрон (Уапд е! а1., 1999), 1,8-дигидроксиантрахиноны (Мие11ег апб 8!оррег, 1999), циклопропапирролоиндол (Иетрсу е! а1., 1999), антрацен (Ок1а^с\укк| е! а1., 1998), пирролизины и имидазолы (А1хуе11 е! а1., 1998), антрациклиновые комплексы (Мбапо е! а1., 1998), гетеродимеры, такие как атизоловый оранжевый - тиазоловый синий, тиазоловый оранжевый - этидий и флуоресцин - этидий (Вепкоп е! а1., 1993а, Вепкоп е! а1., 1993Ь). Кроме того, компании (например, Мо1еси1аг РгоЬек) многие виды препаратов нуклеиновых кислот, которые могут быть совместимы с данной системой анализа. Другие классы цианиновых красителей и стандартных красителей для реакций можно найти в 1оигпа1 оГ !1е Атепсап С’11еписа1 8ос1е!у 125:4132-4145 (2003) и в Вюсоп)ида!е Сйеткйу 13:387-391 (2002). Примеры других красителей включают в себя - но не ограниваются ими - триадные комплексы меди (II) (Лйаг е! а1., 2003), дистамицин А (Нпаки е! а1., 2002, Лообк е! а1., 2002), индоло[2,3-Ь]хинолизин бромид (Ую1а, 2002), эктейнасцидины (АпИопеу апб Тте1уек, 2001), металл амины (Вагу е! а1., 2002) или 2-ферилхинолинкарбокиднатные гибриды (ТокЫта е! а1., 1999). В некоторых вариантах осуществления краситель не является соединением, вызывающим расщепление.

Красители также могут включать в себя малахитовый зелёный, красный двумышьяковистый и флуоресцин. В некоторых вариантах осуществления красители не являются малахитовым зелёным, красным двумышьяковистым и флуоресцином.

Специалист в данной области техники поймёт, что красители можно скринировать, чтобы идентифицировать те из них, которые могут быть использованы в рассматриваемых способах. Красители, которые связываются с гибридами аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид и обнаруживают изменение оптической характеристики во времени, опционально, после обработки стимулом, можно легко идентифицировать и отобрать.

Специалист в данной области техники, руководствуясь данным раскрытием, признает, что дополнительно к перечисленным здесь красителям в этих способах могут быть использованы другие красители (в том числе красители, открытые или разработанные в будущем). Красители, у которых скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, при описанных здесь условиях анализа пригодны для рассматриваемых способов.

Подходящие красители могут быть идентифицированы с помощью любого из множества способов скрининга. Например - но не ограничиваясь этим - образец, содержащий аналог нуклеиновой кислоты, объединяют с полинуклеотидом, имеющим комплементарную последовательность, при условиях, в ко

- 12 009302 торых образуется гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном варианте осуществления затем добавляют заданный краситель, в различных выбранных концентрациях. Порядок добавления компонентов не является категорическим, и они могут добавляться в другом порядке. Затем определяется скорость изменения оптической характеристики во времени. Эту величину сравнивают с эталонной величиной показателя изменения оптической характеристики в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном варианте осуществления эталонное значение является показателем отсутствия полинуклеотида. В одном варианте осуществления эталонное значение является показателем присутствия полинуклеотида (однонитевого или двунитевого). В другом варианте осуществления эталонное значение является показателем ненулевой концентрации полинуклеотида. Красители, которые обнаруживают разную скорость изменения оптической характеристики во времени по сравнению с эталонным значением, отбираются для использования в заявленных способах. Относительную скорость изменения оптической характеристики коррелируют с присутствием или количеством определённого полинуклеотида.

Е. Световой стимул.

Световой стимул может быть применён к образцу, аналогу нуклеиновой кислоты и окрашенной смеси либо одновременно с изготовлением смеси, либо в определённое время после изготовления смеси. Световой стимул вызывает изменение скорости изменения оптической характеристики красителя.

Световой стимул может относиться к видимой части спектра или к невидимой части спектра. Световой стимул может быть белым светом со множеством волн разной длины. Альтернативно, световой стимул может представлять собой свет определённой длины волны или диапазона длин волн. Световой стимул может также иметь определённую интенсивность.

Источники света известны в уровне техники. Различные источники света приводят к разным скоростям реакций из-за различия в интенсивности или длине волны источника света. Примеры источников света в порядке возрастания скорости реакции включают в себя 8у1уаша Соо1 \У1Шс Т-8С\У. Оеиега1 Е1ес1пс Т8-С50 и Ετίΐζ Аигога 50/50. Другие источники света включают в себя 8у1уаша би1их 89^ СЕ9Э8/Ыие и Окгат Е9ТТ/50К, которые оба ведут к более быстрой стимуляции скоростей реакции, чем Оеиега1 Е1есШс Т8-С50.

Специалист в данной области техники поймёт, что оптимальный световой стимул может быть определён без чрезмерного экспериментирования для определённого красителя или для определённого аналога нуклеиновой кислоты, полинуклеотида и окрашенной смеси.

IV. Создание гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты.

Анализы для обнаружения мишеневых полинуклеотидов могут выполняться с использованием множества гибридизационных схем. В одном формате полинуклеотидная последовательность может быть идентифицирована по гибридизации мишеневого полинуклеотида непосредственно с аналогом нуклеиновой кислоты для создания гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты.

В одном формате аналогом нуклеиновой кислоты может быть ΡΝΑ. ΡΝΑ/ΡΝΑ имеет расстояние, которое отличается от расстояний в ДНК/ДНК и от расстояний в ΡΝΑ/ДНК. Детальная структура дуплексных гибридов ΡΝΑ/ΡΝΑ и ΡΝΑ/ДНК различается с помощью ЯМР и рентгеновской кристаллографии. Дуплексные гибриды ΡΝΑ/ΡΝΑ имеют очень широкий и глубокий главный желобок и очень узкий и мелкий малый желобок, и дуплексы имеют очень большой шаг в 18 пар оснований на виток спирали и большую высоту шага (56,6). Каноническая спираль В-формы, видимая для дуплексного гибрида ДНК/ДНК, имеет шаг в 10 пар оснований на виток и высотой 34, в то время как гибридный дуплекс ΡΝΑ/ДНК имеет шаг в 13 пар оснований на виток и высотой 42. Поскольку пары оснований в дуплексном гибриде ΡΝΑ/ДНК обладают иной геометрией по сравнению с двойной спиралью ДНК, ожидается, что сила стэкинг-взаимодействия в дуплексных гибридах ΡΝΑ/ДНК отличается от таковой в дуплексных гибридах ДНК/ДНК. Предполагается, что СЭ-спектры 10, 12 и 16 тег дуплексных гибридов ΡΝΑ/ДНК отличаются и конфигурацией своих оснований.

В зависимости от красителя и сайта его связывания на гибриде аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид можно влиять на прохождение реакции. Например, красители, которые связываются с главным или малым желобком гибрида, могут требовать, чтобы гибрид содержал определённое количество пар оснований для эффективного связывания. Минимальное количество пар оснований может быть легко определено специалистом в области техники.

В одном аспекте молекула аналога мишеневой нуклеиновой кислоты комплементарна к частично комплементарному аналогу нуклеиновой кислоты. Аналог нуклеиновой кислоты гибридизуется как с молекулой аналога нуклеиновой кислоты, так и с мишеневым полинуклеотидом, как изображено на фиг. 18А. Это может быть осуществлено в одну стадию или в многостадийном процессе. В одностадийном процессе мишеневый полинуклеотид и аналоги нуклеиновой кислоты объединяются в одном шаге. В многостадийном процессе мишеневый полинуклеотид и аналоги нуклеиновой кислоты объединяются последовательно.

В следующем аспекте присутствие мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено созданием разветвлённой крестообразно реакционной структуры, пример которой изображен на фиг. 18В. В этом формате мишеневый полинуклеотид гибридизуется с двумя промежуточными полинуклеотидами, кото

- 13 009302 рые частично комплементарны мишеневому полинуклеотиду. Промежуточные полинуклеотиды образуют разветвлённые структуры, которые гибридизуются с мишеневым полинуклеотидом и первичной молекулой аналога нуклеиновой кислоты. Гибридизующиеся с мишенью области промежуточных полинуклеотидов могут быть сконструированы таким образом, чтобы они были слишком короткими для того, чтобы краситель связывался с молекулой аналога нуклеиновой кислоты отдельно, но достаточно большими для того, чтобы связываться с молекулами аналога нуклеиновой кислоты при гибридизации. Затем может быть определена величина оптического изменения красителя. В одном варианте осуществления единичная молекула аналога нуклеиновой кислоты может являться универсальным аналогом нуклеиновой кислоты, который используется для всех анализов и оптимизирован для эффективных изменений оптической характеристики красителя. Универсальный аналог нуклеиновой кислоты можно было бы использовать для любой мишеневой нуклеиновой кислоты, а промежуточные последовательности могли бы меняться. Эта схема может быть адаптирована к формату с помощью иммобилизованного аналога нуклеиновой кислоты.

В другом формате множество молекул аналога нуклеиновой кислоты образуют гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид со смежными областями мишеневого полинуклеотида. В этом формате каждая молекула аналога нуклеиновой кислоты является слишком короткой для того, чтобы краситель связывался и приводил к изменению величины оптической характеристики красителя, но множество молекул аналога нуклеиновой кислоты может обеспечить достаточно большую область, чтобы привести к изменению величины оптической характеристики. Как изображено на фиг. 18С, мишеневый полинуклеотид, как единичная молекула, может связываться с образованием дуплекса аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид с помощью трёх отдельных молекул аналога нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются смежными последовательностями. Однако если центральная молекула аналога нуклеиновой кислоты не может гибридизоваться как показано на фиг. 18Ό, тогда изменение оптической характеристики наблюдать нельзя. В этом формате одна из молекул аналога нуклеиновой кислоты может быть иммобилизованной.

V. Определение количества мишеневого полинуклеотида.

Рассматриваемые способы, композиции и системы могут быть использованы для определения количества мишеневого полинуклеотида в образце. В одном варианте осуществления количество мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено путём осуществления серийных разведений молекулы аналога нуклеиновой кислоты добавлением разных количеств образцов мишеневого полинуклеотида и сравнения образцов с контрольными образцами известной концентрации. В другом варианте осуществления количество мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено осуществлением серийных разведений мишеневого полинуклеотида добавлением разных количеств молекул аналога нуклеиновой кислоты и сравнением образцов с контрольными образцами известной концентрации.

Альтернативно, количество мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено измерением кинетики анализа, основанной на времени. Измерения красителя в объединённой смеси проводятся через периодические интервалы времени после приготовления смеси или после применения светового стимула. Краситель может быть обнаружен в разное время после приготовления смеси или после применения светового стимула. Время может быть временным периодом, например, общим временем для изменения оптической характеристики, или временем, необходимым для того, чтобы оптическая характеристика изменилась на определённый процент, такой как - но не ограничиваясь им - примерно 20%. Реакции могут быть заморожены (дальнейшее изменение прекращается), например, добавлением растворителей, таких как 20%-ный метанол, 15%-ный изопропанол, 15%-ный ΌΜ8Ο или 10%-ный бутанол.

Реакция может также включать в себя ряд буферов и растворителей. Эти буферы и растворители включают в себя фосфатные буферы, воду, 0,1%-ный 8Ό8, 0,1%-ный Тгйоп X, 0,1%-ный Т\уееп-20. 3%-ный бутанол, 10%-ный метанол, 10%-ный изопропанол, 10%-ный ΌΜ8Ο, 1Х кровяной лизисный буфер (0,15 М ΝΗ₄Ο1, 10 мМ ИаНСО₃, 0,1 мМ ΕΌΤΑ рН 7,4) и сахарозный лизисный буфер (0,32 М сахарозы, 10 мкМ Тпк, 1%-ный Тгйои Х-100, 5 мМ МдС1₂).

Количество полинуклеотида в образце может быть определено после его экспозиции световому стимулу. Изменение оптической характеристики красителя может быть измерено до начала экспозиции световому стимулу - для стартовой световой характеристики. Измерения могут быть проведены в другое время (например, через 30-секундные интервалы) после экспозиции световому стимулу. Реакции могут быть заморожены (дальнейшее изменение прекращается), как описано выше.

Изменения в образце благодаря экспозиции световому стимулу может наблюдаться несколькими способами. Изменение оптической характеристики может наблюдаться как изменение цвета, спектра поглощения, флуоресценции, отражательной способности, хемилюминесценции или их комбинации. Альтернативно, изменение оптической характеристики может быть считано с помощью считывающего устройства. Это изменение измеряется с использованием спектрофотометра, такого как Тесап Оепюз или Тесап ЗаПге. Можно наблюдать определённую длину волны, например, с помощью фильтра. Положительный контроль показывает изменение спектра поглощения быстрее, чем негативный тест. Он может быть измерен как разность скоростей изменения или различия в изменении за определённое время. Если используется световой стимул и наблюдаются показатели флуоресценции, световой стимул, обеспечи

- 14 009302 ваемый образцу, будет более высоко энергетическим (низкая длина волны), чем наблюдаемая эмиссия. Возбуждение может быть, например, при 535 нм, а эмиссия может читаться при 590 нм. Флуоресценция может быть измерена как разница в скорости изменения или разница в изменении в установленное время.

Кроме того, смесь может иметь изменения, которые происходят до экспозиции световому стимулу. Эти различия могут наблюдаться либо в спектрофотометрической системе, либо в системе флуоресцентной эмиссии, либо в хемилюминесцентной системе.

VI. Форматы анализа.

A. Жидкостные системы анализа.

Как продемонстрировано в примерах 1-4, способы и системы анализа для обнаружения мишеневого полинуклеотида могут быть основаны на жидкости. Образец, аналог нуклеиновой кислоты, который связывается с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты полинуклеотида в последовательность специфичным образом, и краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, объединяются, чтобы приготовить смесь в жидком растворе. Скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси сравнивается с эталонным значением показателя изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определённого полинуклеотида в образце для определения присутствия или количества полинуклеотида в образце.

Способ и система анализа могут также быть осуществлены в любом сосуде, таком как микроцентрифужные трубки, тестовые пробирки и чипы, в которых жидкость удерживается поверхностным натяжением. Способы и система анализа могут также быть осуществлены в многолуночных микропланшетах. Планшеты могут содержать любое количество лунок. В одном формате используется 96-луночный планшет. В другом формате используется 384-луночный планшет. Когда формат анализа представляет собой микролуночный формат, жидкость содержится в каждой лунке титрационного микропланшета.

B. Системы анализа на твёрдом носителе.

Способы и система анализа могут быть осуществлены на твёрдой среде (например, один или более компонентов иммобилизованы на твёрдом носителе). Чаще всего аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид иммобилизуют. Существует много типов твёрдых носителей, к которым могут быть присоединены молекулы аналога нуклеиновой кислоты или мишеневого полинуклеотида, в том числе - но не ограничиваясь ими - проницаемые для жидкости мембраны (нитроцеллюлозные, нейлоновые), керамические носители, протравленные мембраны (ТЕМ), поливинилидендифлорид, латекс, парамагнитные шарики, пластиковые носители всех типов, стекло, порошковый кремний или алюминий на подложечной матрице. Если используется сетчатый рисунок, молекула аналога нуклеиновой кислоты/твёрдый носитель образует микроанализ. В другом варианте осуществления молекулы аналога нуклеиновой кислоты или мишеневого полинуклеотида могут быть ковалентно модифицированы, чтобы включать в себя связывающее средство, такое как биотиновое или амидное звено, которые связываются с мембранами. В следующем варианте осуществления молекулы аналога нуклеиновой кислоты или мишеневого полинуклеотида могут быть иммобилизованы через последовательную специфическую гибридизацию с одной или более последовательностями.

На фиг. 17 схематически представлено обнаружение, с активированием световым стимулом и иммобилизацией на поверхности, аналогов нуклеиновой кислоты. А) Стрепавидиновая лунка. В) В лунку добавлены биотинилированные аналоги нуклеиновой кислоты и обеспечена возможность присоединения к носителю. С) Лунка промыта и избыток аналогов нуклеиновой кислоты удалён. Ό) Внесён полинуклеотидный образец, и специфическая мишеневая последовательность присоединяется к комплементарному аналогу нуклеиновой кислоты. Е) Неспецифичный и избыточный полинуклеотид удален. Е) Краситель добавлен и экспонирован световому стимулу.

Настоящее изобретение предполагает любые средства присоединения молекулы аналога нуклеиновой кислоты к носителю. В одном аспекте молекула аналога нуклеиновой кислоты может быть присоединена непосредственно к мембране. Аналогом нуклеиновой кислоты может являться ΡΝΑ (например, Л.Сщсг. Ьс51сг А., К1е1Ьег 1. Аиб Огит Н., 1998, ΡΝΑ аггау 1се1то1оду ίη то1еси1аг бхадиокбск. Шсйоббек аиб №с1ео81бе, 17(1717-1724)). Раствор молекул аналога нуклеиновой кислоты (в воде) просто прикладывается к заряженному или химически модифицированному фильтру и оставляется сушиться на воздухе. Фильтр затем используется для гибридизации.

В другом аспекте меченная биотином молекула аналога нуклеиновой кислоты может быть присоединена к покрытой стрепавидином поверхности, такой как шарик или лунка (см., например, С1аиб1ег, Ό.Ρ., 8!иЙ8, 1.К., Аибегкои, К.К., СеЬи1а, 8., 8сйиск, В.Ь., аиб Вгосктаи, ЕЛ., 2000. АГПиПу СарШге аиб Кесоуегу оГ ΌΝΑ а! Еет1ото1аг Соисеибабоик χνίίΐι Рер11бе Шсйю Ас1б РгоЬек. Аиаббса1 Вюсйет. 283:241-249). Меченные биотином молекулы аналога нуклеиновой кислоты смешиваются со стрепавидином, меченным латексом или шариками поликарбоната. Биотин прочно связывается со стрепавидином,

- 15 009302 позволяя молекуле аналога нуклеиновой кислоты односторонне связываться с шариком. Затем шарики опускают на незаряженную мембрану с размером отверстий на 25-30% больше диаметра шарика. Шарики остаются в отверстиях, образуя локализованный участок «присоединённых молекул аналога нуклеиновой кислоты». Прямой синтез молекул аналога нуклеиновой кислоты на твёрдом носителе, таком как полипропиленовая мембрана, может быть выполнен с использованием стандартной химии синтеза 9флуоренилметоксикарбоил (Ртос) протеина (см., например, Ма1убак 8., КеиШпег Ρ. Αηά Но11сбс1 ΙΌ. ЛШотаОпд рага11е1 рерббе купШебк £ог ргобисбоп о£ пис1ею ааб апа1од бЬгагу аггаук, ВюТсс11пк.|ис5 31:896-904).

В другом аспекте молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут быть присоединены к стеклу или другому твёрдому носителю приложением водного раствора молекул аналога нуклеиновой кислоты непосредственно к стеклу или другому носителю, позволяя ему высохнуть на воздухе.

В одном варианте молекула аналога нуклеиновой кислоты конструируется таким образом, чтобы она имела суммарный положительный заряд и могла связываться отрицательно заряженной мембраной. Например, положительно заряженный лизин или глицин на 5' и 3' концах молекулы аналога нуклеиновой кислоты может быть использован для присоединения этой молекулы аналога нуклеиновой кислоты к отрицательно заряженной нейлоновой мембране. Отрицательно заряженная мембрана отталкивает любую нуклеиновую кислоту, которая не является комплементарной и (или) частично комплементарной к аналогу нуклеиновой кислоты, таким образом минимизируя неспецифическое связывание.

Посредством системы, основанной на твёрдом носителе, можно обнаружить любой мишеневый полинуклеотид или группу мишеневых полинуклеотидов. В этом случае твёрдый носитель содержит множество молекул аналога нуклеиновой кислоты, иммобилизованных на твёрдом носителе. Контрольный аналог нуклеиновой кислоты, который не образует гибридных молекул аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, не гибридизуется. Он также может быть включён в твёрдый носитель.

Система, основанная на твёрдом носителе, может быть использована для обнаружения по меньшей мере одного мишеневого полинуклеотида. В других вариантах система, основанная на твёрдом носителе, обнаруживает или измеряет экспрессию по меньшей мере примерно 8, по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 30, по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 50 или по меньшей мере примерно 60 разных мишеневых полинуклеотидов. В другом варианте система, основанная на твёрдом носителе, обнаруживает или и распознает экспрессию по меньшей мере примерно 60 или более мишеневых полинуклеотидов.

В качестве примера - но не ограничиваясь им - на фиг. 3 изображена основанная на твёрдом носителе версия этого анализа, в которой в качестве твёрдого носителя используется мембрана. Анализ показывает присутствие мишеневого полинуклеотида. Эта система позволяет идентифицировать и (или) определять количественно малые количества определённого мишеневого полинуклеотида в пределах нескольких минут без необходимости использования большого количества оборудования и даёт визуальный сигнал (например, розовая окраска изменяется на бесцветную). После довольно быстрого лизиса образца, гибридизации и введения красителя применяется световой стимул, и наблюдается скорость изменения цветового рисунка на мембране. Скорость изменения в рисунке окрашенных полос на мембране даёт возможность пользователю легко обнаруживать и идентифицировать мишеневые полинуклеотиды. Опционально, этот способ или его вариант могут быть осуществлены на портативном устройстве, получающем питание от небольшой батареи. В автоматическом роботизированном варианте все стадии могут быть осуществлены машиной без вмешательства человека.

Система анализа, основанная на твёрдом носителе, может быть реализована в титрационном микропланшете. Может быть использован любой титрационный микропланшет. В такой системе анализа его компоненты могут оставаться жидкими. В одном формате используются 96-луночные микропланшеты. В другом формате используются 384-луночные планшеты. Когда анализ производят в микротитровальном формате, все компоненты, за исключением тех, которые связываются с твёрдым носителем, остаются в растворе в каждой лунке титрационного микропланшета.

VI. Мишеневые полинуклеотиды и источники мишеневых полинуклеотидов.

Мишеневый полинуклеотид может быть любым полинуклеотидом, в том числе встречающимся в природе, синтетическим и амплифицированным. Другие типы полинуклеотидов могут быть однонитевыми или двунитевыми. Не ограничивающие примеры мишеневых полинуклеотидов включают в себя ДНК, РНК, регуляторную РНК, мРНК, регуляторную микроРНК, б РНК, искусственную РНК и химерную РНК. Другие неограничивающие примеры мишеневых полинуклеотидов включают в себя эпигеномную ДНК, эпигенетическую ДНК, ίη νίίΐΌ амплифицированную ДНК и химерную ДНК. Мишеневый полинуклеотид может содержать 8ΝΡκ, который идентифицируют и определяют количественно раскрытыми здесь способами.

Описанные здесь способы, системы и анализы имеют множество применений. Неограничивающие примеры этих применений включают в себя обнаружение и количественное определение организмов, патогенов, таких как патогены в пище, патогены окружающей среды, патогены в воде или патогены, применяемые в агротерроризме. Другие неограничивающие примеры применений включают в себя диагностику заболеваний, такую как диагностика заболеваний, передаваемых половым путём, обнаружение

- 16 009302 генов, придающих устойчивость к антибиотикам, обнаружение генов, придающих предрасположенность к ответу на лекарство, обнаружение генов, вовлечённых в эффективный ответ на лекарство, обнаружение генетически модифицированных организмов и обнаружение неместной флоры или фауны. Дополнительные неограничивающие применения включают в себя сельскохозяйственные применения и применения в ветеринарии.

Ниже описываются примеры для иллюстрации, а не ограничения.

А. Патогены.

В одном аспекте изобретение относится к способам, композициям и системам анализа для обнаружения присутствия патогена и (или) заражения хозяина патогеном. Как правило, присутствие патогена и (или) присутствие патогена в хозяине обнаруживается анализом мишеневых полинуклеотидов в образце. Более конкретно, изобретение относится к способам, композициям веществ и системам анализа для анализа мишеневых полинуклеотидов с помощью последовательной специфической гибридизации с молекулой аналога нуклеиновой кислоты и добавления красителя для образования смеси. Затем наблюдается скорость изменения оптической характеристики красителя, чтобы обнаружить присутствие или количество мишеневого полинуклеотида.

Примеры патогенов или присутствия патогена в хозяине, которые могут быть обнаружены настоящими способами и системами анализа, включают в себя - но не ограничиваются ими - 81арйу1ососсик ер1бегт1б1к, ЕксйейсЫа сой, устойчивые к метициллину 81арйу1ососсик аигеик (Μ8ΚΑ), 81арйу1ососсик аигеик, 81арйу1ососсик йот1шк, Еп!егососсик Гаесайк, Бкеикотопак аегидтока, 81арйу1ососсик сарШк, 8!арйу1ососсик театеп, К1еЬк1е11а рпеитошае, НаеторШик тЕип/ае, 81арйу1ососсик к1ти1апк, 81гер1ососсик рпеитошае и Сапб1ба а1Ь1сапк.

Дополнительные примеры включают в себя - но не ограничиваются ими - ВасШик апШгаак (сибирская язва), С1ок1пбшт ЬойШпит (ботулизм), Вгисе11ае (бруцеллез), УШйо ско1ега (холера), С1ок1пбшт регГгтдепк (газовая гангрена, клостридийный мионекроз, некротический энтерит), вирус Эбола (геморрагическая лихорадка Эбола), Уегыша рекйк (чума), Сох1е11а ЬигпеШ (Ο-лихорадка) и вирус оспы (оспа). В предпочтительном варианте обнаруживают ВасШик апШгаак.

Примеры полинуклеотидов ответа хозяина для ВасШик апШгаак включают в себя - но не ограничиваются ими - те, которые раскрыты Моск Μ., Мщпо1 Т. Лп111гах 1охшк апб Ше 1юк1: а к!огу оГ пШтасу. Се11 МюгоЬюБ 2003 1ап; 5(1): 15-23 и Вееб Ό.8., 8то11 I., С1ЬЬк Ρ., БШ1е 8.Р. Ве1а1еб ΑγΙκ^κ, Бткк Марртд оГ апйЬобу гекропкек Ю Не ргоЮсБге апйдеп оГ ВасШик апШгаак Ьу йоте су1оте1пс апа1ук1к. СуЮте1пу. 2002 8ер. 1; 49(1): 1-7, или легко получаемые методами, известными в данной области.

Патогены можно отличить от других патогенов на основании их мишеневых полинуклеотидов. Определённые патогены имеют специфические мишеневые полинуклеотиды, которые не обнаруживаются в других патогенах. Конструируются молекулы аналога нуклеиновой кислоты, комплементарные или строго комплементарные одному или более мишеневым полинуклеотидам, которые характерны для определённого патогена. Контактируя с мишеневыми полинуклеотидами патогена, молекула аналога нуклеиновой кислоты гибридизуется с полинуклеотидами, содержащими мишеневый полинуклеотид, но не с полинуклеотидами, которые не содержат мишеневого полинуклеотида. Таким образом, определённые патогены, которые содержат мишеневый полинуклеотид, могут быть отличены от патогенов, не содержащих мишеневого полинуклеотида.

Кроме того, можно различить разные штаммы одного и того же патогена. Разные штаммы одного и того же патогена имеют разные полинуклеотидные последовательности. Часто различия настолько малы, что сводятся к единичному нуклеотиду. Конструируются молекулы аналога нуклеиновой кислоты, комплементарные или строго комплементарные одному или более мишеневым полинуклеотидам, которые идентифицируют определённый штамм патогена. Контактируя с мишеневыми полинуклеотидами патогена, молекула аналога нуклеиновой кислоты гибридизуется с полинуклеотидами, содержащими мишеневый полинуклеотид, но не с полинуклеотидами, которые не содержат мишеневого полинуклеотида. Когда мишеневый полинуклеотид является специфичным для определённого патогенного штамма, молекулы аналога нуклеиновой кислоты гибридизуются с мишеневыми полинуклеотидами, содержащимися в патогенном штамме, но не гибридизуются с мишеневыми полинуклеотидами другого штамма.

Примеры клинически важных патогенов и данные по их обнаружению с использованием ΡΟΉ перечислены ниже. Молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательность БСВ-праймера к последовательностям определённых патогенов, и могут быть использованы в комбинации во многих описанных здесь вариантах осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления патоген может быть 81ар11у1ососсик ер1бегш1б1к. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации 81ар11у1ососсик ер1бегш1б1к. Примеры этих ЕСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Ргапсо1к, Ρ., Ό. ΡίΐίΌΐ, М. ВепЮ, В. Ρереу, Ρ. Уаибаих, Ό. Бете апб I. 8с1пеп/е1. 2003. Вар1б Эе1ес1юп оГ МейсШт-ВеыкШп! 81арйу1ососсик аигеик Э1гесйу Ггот 81еп1е ог №пк1еп1е С11шса1 8атр1ек Ьу а №те Мо1еси1аг Ακκην. I С1т МюгоЬю1 41(1):254-60, Р. Р11хра(г1ск, Н. Нитрйгеук, Е. 8тйй, ΟΑ. Кеппебу

- 17 009302 апб ΙΡ. О'Сзгз. 2002. Епу1гоптеп1а1 гедикйюп οΓ όίοΓίΙιη ΓοηηαΙίοη ίη кИепзп'е саге ι.ιηίΐ ίδοίαίοδ οΓ 81арку1отосснз ер1бегт1б1з. ί Ηοκρ 1пкес! 52(3):212-8, ί. Уцдцегоз, Α. Тетриню, В. Вегоак М. Заискех. С. Нетам/. БМ. Εικη§ο апб №1кагго. 2000. О1ус!^а1зекубе-3-ρкοзρка!е бекуб^οдеπазе-сοб^πд депе аз а изеМ ίаxοηοт^с ΐοοί Γογ ЗйркуЮтоссиз зрр. ί С1т МюгоЬЫ 38(12):4351-5).

Патогеном может быть ЕзскепсЫа той. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации ЕзскепсЫа то1к Примеры этих кСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Ь. С. Не11ег, С. В. БаУз, К. К. Ρеак, Ό. \УтдПе1б, А. С. Сзπποπз. Р. Т. Λιπι^ο, апб ί. Сайат. 2003. Сοтρа^^зοπ οΓ МеЙюбз Γογ ΌΝΑ ΕοΕ-Κίοη Ргот Ροοά Затр1ез Γογ ^е!есί^οπ οΓ ЗЫда Тοxт-Ρ^οбистд ЕзскепсЫа ток Ьу Веа1-Т1те ΡСВ. Арр1 Εηνίτοη М1сгоЬЫ 69(3): 1844-6, Вактап, Н. 2002. Ми1йр1ех ΡСВ Γογ бе!ес!^οπ οΓ зйх депез οΓ ЕзскегюЫа той. 1пб1ап ί Меб Вез 115:251-4, и Е. Ргакт, апб и. ОЬз!. 2003. Αρρ1^саί^οη οΓ !ке ['кюгодешс ргаЬе 1есйпк|ие (ТадМап ΡСВ) ίο !ке бе!ес!^οπ οΓ ЕгИеготоссиз зрр. апб ЕзсйегюЫа ток ίη теа!ег затр1ез. ί МюгоЬЫ Меίкοбз 52(1):123-31).

Патогеном может являться устойчивый к метициллину Зίзρку1οсοссиз аигеиз (МЗВА). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации З!аρку1οсοссиз аигеиз (МЗВА). Примеры этих ΡСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, V. В. νаη Бееитееп, С. νаη Ρек, Α. Биуепбцк, Н. А. УегЬгидк, апб V. Н. Оοеззеπз.

1999. Вар1б бе!ес!^οπ οΓ те!Ыск1т гез1з!апсе ίη З!аρку1οсοссиз аигеиз ίδο^δ Ьу !ке МВЗΑ-зс^ееπ 1а!ех ад§1ιιΙίη;·ιΙίοη !ез!. ί С1т МюгоЬЫ 37(9):3029-30, Ρ. Ρ^аπсο^з, Ό. ΡίΙ^Ρ М. Веηΐο, В. Ρеρеу, Ρ. Уаибаих, Ό. Бете, апб Б Зскгег^ек 2003. Вар1б ^е!есί^οπ οΓ Ме1к1с111т-Вез1з!ап! З!аρку1οсοссиз аигеиз 01гес(1у Ргот З1еп1е ογ №пз1еп1е С11П1си1 Затр1ез Ьу а №те ΜοΚαιΕίΓ Αззау. ί С1ш МюгоЬЫ 41(1):254-60, и М. Тзипюка апб I. КагиЬе. 2003. Вар1б φ^·0ΓίάίζηΙίοπ а! Ыдк за1! сοπсеπ!^а!^οπ апб бе!есί^οπ οΓ Ьас1епа1 ΌΝΑ изтд ккюгезсепсе ρο1аπζайοπ. СотЬ Скет Н1дк Ткгоидкри! Зсгееп 6(3):225-34).

Патогенами могут являться Сапб1ба. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-πраймерам, используемым для идентификации Сапб1ба. Примеры этих ΡСВпраймеров раскрыты в уровне техники (см., например, З. Αктаб, Ζ. Ккап, Α. З. Ми8!аРа, апб Ζ. и. Ккап. 2002. Зет1пез!еб ΡСВ Γογ б1адгюз1з οΓ сапб1бет1а: сοтρа^^зοπ текк сикиге, апкдеп бе!ес!юп, апб Βίοскетюа1 те!кοбз Γογ зреаез 1беп!Шса!юп. ί С1т МюгоЬЫ 40(7):2483-9, апб и. Н. Тиюбкег, Б Ρ. №11аго, З. Зткк, Б. БазСазаз, апб К. Ό. РакскЛб. 2003. Ое!ес!юп οΓ йтдепка Ьу ρο1уте^азе скат геас!юп ίη сп!юа11у 111 пестайз апб сккбгеп. I Ρе^^ηа!ο1 23(2): 117-22).

Патогеном может являться Сапб1ба а1Ь1сапз. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации Сапб1ба а1Ь1сапз. Примеры этих ΡСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Ρ. Б. ХУййе, Α. Зкейу, апб В. Α. Вагпез. 2003. ^е!есί^οη οΓ зеνеη Сапб1ба зреаез изтд !ке Б1дк!-Сус1ег зуз!ет. ί Меб МюгоЬЫ 52(Ρ! 3):229-38, М. Сг(|з1уз, В. Ηο^νа!к, М. Оепб1з, Б Егпу, апб Б Вепеб1к. 2003. ΜοΕαιΕίΓ б1адтоз1з οΓ сикиге педзкхе ίηеπбοса^б^ί^з: скшса1 уа11ба1юп ίη а дгопр οΓ зигдюаПу йеа!еб ракеп!з. Неай 89(3):263-8, и В. νί11ίηдег, А. ОЬ^абον^с, В. Зек!зск, Б Веск-Маппадейа, V. Витона, Н. Вгаип, Ρ. ΑρΓа1!е^, Α. М. Нкзск1, Α. Макпз!а!Ыз, апб М. Вοйе^. 2003. Ое1ес1юп апб ^беηί^Р1саί^οη οΓ Γι,ιηβί Ποιη кипдиз Ьа11з οΓ !ке тахк1агу зтиз Ьу πο^η13γ 1ескпк|иез. ί Скп МюгоЬЫ 41(2):581-5).

Патогеном может являться Зίзρку1οсοссиз аигеиз. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации ЗйркуЮтоссиз аигеиз. Примеры этих ΡСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Ρ. Ргапто1з, Ό. ΡίΙΚΙ, М. ВеНю, В. Ρеρеу, Ρ. Уаибаих, Ό. Бете, апб Б Зскгетек 2003. Вар1б Ое1ес1юп οΓ Ме!Ыск1т-Вез1з!ап! Зίзρку1οсοссиз аигеиз 01гес11у Ргот З!еп1е ογ №пз1еп1е Скшса1 Затр1ез Ьу а №те ΜοΕαιΡίΓ Αззау. ί Скп МюгоЬЫ 41(1):254-60, каЮт-нез, С., М. I. ΐοη^, Α. Ίοη^, I. Αζπ3γ, апб I. С. кзЫт-цез. 2003. Вар1б бе!ес!юп апб ^беηί^Γ^саί^οη οΓ З^ркуЦтоссиз аигеиз Ргот Μοο6 си1!иге зресйпепз изтд геа1-кте П1.югезсепсе ΡСВ. Б|здп МюгоЬЫ 1п£ес! О1з 45(3): 183-9, и I. Хи, В. С. М111аг, I. Е. Мοο^е, К. Мигрку, Н. \УеЬЬ, Α. I. Ροχ, М. СзЙегкеу, апб М. Б Сгатее. 2003. ЕтрЦутеп! οΓ Ьгоаб-гапде 16З γΡΝΑ ΡСВ !ο бе!ес! аеί^ο1οд^са1 адеп!з οΓ ίπΒΛίοη Егот скшса1 зреатепз ίη ра!1еп!з тейк аси!е тешпдй1з-гар1б зеρа^аί^οη οΓ 16З γΡΝΑ ΡСВ атрктопз тей^и! !ке пееб Γογ сЫкпд. ί Αρρ1 МюгоЬЫ 94(2): 197-206).

Патогеном может являться ЗйркуЮтоссиз 1ютЫз. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации Зίзρку1οсοссиз кοт^η^з. Примеры этих ΡСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, В. Μα^ου, М. Вез, Υ. Вгип, М. Вοибοита, Б. 1бпзз1, Н. Меидшег, Б Ргепеу, апб Б Ейеппе. 2001. ΜοΕαιΕίΓ 1ескпк|иез ορеη ир пете У1з1аз Γογ 1ур1пд οΓ тоади1азе- педаНте з^ркуЮтосск Ρ31Ηο1 Είο1 (Еапз) 49(3):205-15, Б Унднегоз, Α. ТетΙίππιο, В. Вегоа1, М. Заπскеζ, С. Негпагто Б М. Εικη§ο, апб О. №1кагго. 2000. 61усе^а1бекубе-3-ρкοзρка!е

- 18 009302 беЬубгодепаке-епсоб1пд депе ак а икеГи1 (ахопопис 1оо1 Гог 81арЬу1ососсик крр. 1 С1ш МюгоЬю1 38(12):43515, и Μ. №|е5ег. апб Н. 1. Викке. 2000. Кар1б 1бепШюа1юп оГ 81арЬу1ососсик ер1бегт1б1к. 1п( 1 8уз1 Еуо1 ΜίсгоЬю1 50 Ρ( 3: 1087-93).

Патогеном может являться ЕпЮгососсик ГаесаКк. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСΚ-праймерам, используемым для идентификации Еп1егососспк Гаеса11к. Примеры этих ΡСΚ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, С. К. Нибкоп, Ρ. 1. Ребогка-Сгау, Μ. С. 1асккоп-На11, апб Ь. Μ. Нюй. 2003. Αηота1^ек ш креаек 1бепййсабоп оГ еШегососс! Ггот хе1еппагу коигсек иктд а соттегта1 ЬюсЬетка1 1бепйДсайоп кук1ет. Ьей Αрр1 МюгоЬю1 36(4):245-50, 8. Μ. ПопаЬеб1ап, Ь. Α. ТЬа1, Е. НегкЬЬегдег, Μ. В. Ρе^^^, 1. №. СЬоте, Ρ. Вагйей, К. 1опек, К. 1оусе, 8. Коккйег, К. Сау, 1. 1оЬпкоп, С. Маскткоп, Е. ОеЬекк, 1. Маббеп, Р. Αηди1о, апб Μ. 1. 2егуок. 2003. Мо1еси1аг сЬагас1еп/айоп оГ деп1аппст-гек1к1ап1 Етегососс! ш Не Ипйеб 81а1ек: еу1бепсе оГ кргеаб Ггот атта1к (о Ьитапк 111гоид11 Гооб. 1 С1ш М1сгоЫо1 41(3):1109-13, апб V. СаибисЬоп, Ь. СЬа1аЬгеукке, 1. Ебеппе, М. Се1агб, Υ. Вепйо, Н. Ьер1б1, Р. ТЫхоШ-Вещк апб Р. VаηбеηексЬ. 2003. Мо1еси1аг б1адпокк оГ тГесйхе епбосагбйк Ьу ΡίΚ атрййсайоп апб б1гес1 кес.|иепстд оГ ΌΝΑ Ггот уа1уе йккие. 1 С1ш М1сцЬю1 41(2):763-6).

Патогеном может являться Ρкеиботоηак аегидίпока. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСΚ-праймерам, используемым для идентификации Ρкеиботоηак аегидтока. Примеры этих ΡСΚ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, М. Е. СогЬе11а, апб Α. Ρиуеΐ. 2003. Кеа1-Т1те Кехегке Τ^аηксπрύоη-ΡСΚ Α^Ν^ оГ Ехргеккюп оГ На1оЬепхоа1е апб 8аНсу1а1е СаΐаЬо1^кт-Αккос^аΐеб Орегопк ш Т\хо 81га1пк оГ Ρкеиботоηак аепдшока. Αрр1 Епуйоп МюгоЬю1 69(4):2269-75, С. Αда^теа1, Α. Карй, 8. К. КаЬга, К. СЬапбга, В. Оак, апб 8. Ν. Опхебг 2002. ΡЬеηоΐур^с & депоКрю хапагИк оГ Ρкеиботоηак аегидтока кок-Иеб Ггот сЬйбгеп тейЬ сукйс ПЬгок1к ш 1пб1а. 1пб1ап 1 Меб Кек 116:73-81, апб №. ЭаЬгслхккк и. С7ека.)1о-Ко1об71е.), Ό. Мебга1а, апб 8. С1ебгук-Ка1етЬа. 2003. Орбтк кайоп оГ ΑΡ-ΡΕΡ Гтдегрппбпд бкспттаНгу ро\хег Гог с11шса1 1ко1а1ек оГ Ρкеиботоηак аегидтока. РЕМ8 МюгоЬю1 Ьей 218(1):51-7).

Патогеном может являться 8(арЬу1ососсик сар111к. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСΚ-праймерам, используемым для идентификации 81арЬу1ососспк сар1йк. Примеры этих ΡСΚ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, М. №1екег, апб Н. 1. Викке.

2000. Кар1б 1бепйДсайоп оГ 8(арЬу1ососсик ер1бегт1б1к. 1п( 1 8ук1 Еуо1 МюгоЬю1 50 Ρ( 3:1087-93, и Р. Магйпеаи, Р. 1. Ρ^са^б, Ρ. Н. Коу, М. Оие11ейе, апб М. С. Вегдегоп. 1996. 8рес1ек-кресШс апб иЫдийоик ΌΝΑЬакеб аккаук Гог гар1б 1бепййсайоп оГ 81арЬу1ососсик ер1бегт1б1к. 1 С1т МюгоЬю1 34(12):2888-93).

Патогеном может являться 8(арЬу1ососсик \хагпегг Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСΚ-праймерам, используемым для идентификации 8(арЬу1ососсик \хагпеп. Примеры этих кСК-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, М. №1екег, апб Н. 1. Викке. 2000. Кар1б 1бепййсайоп оГ 81арЬу1ососсик ер1бегт1б1к. 1п( 1 8ук1 Еуо1 МюгоЬю1 50 Ρ( 3:1087-93, и Т. 8акЬ1Ьага, Н. К1тига, Т. ШдисЫ, Α. ΑбасЬ^, Н. Майикакг К. 8опото!о, апб Α. Ши/акк 2000. Α поуе1 апйЫойс, пикаст 18К-1, оГ 8(арЬу1ососсик \хагпеп 18К-1: с1ошпд оГ Не кйисШга1 депе апб 1бепййсайоп оГ Не кйисНге. Вюкт Вю1есЬпо1 ВюсЬет 64(11):2420-8).

Патогеном может являться К1еЬк1е11а рпеитошае. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСΚ-праймерам, используемым для идентификации К1еЬк1е11а рпеитотае. Примеры этих ΡΟΉ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Ρе^еζ-Ρе^еζ, Р. 1., апб Ν. Ό. Напкоп. 2002. ОеЮсйоп оГ р1акпиб-теб1а1еб ΑтрС Ье1а-1ас1атаке депек ш с11шса1 1ко1а1ек Ьу иктд ти1йр1ех 1’СК. 1 С1т МюгоЬю1 40(6):2153-62, 81етеагб, СГО., !К. КакЬееб, 8. К. НиЬей, 1. №. В1бб1е, Ρ. М. Капеу, С. 1. Αηбе^коη, Ρ. Ρ. №1Шатк, К. Ь. Впйат, Α. ОЬуег, 1. Е. МсСотеап, 1г., апб Р. С. Тепоуег. 2001. СЬагас1епха1юп оГ с1шюа1 1ко1а1ек оГ К1еЬк1е11а рпеитошае Ггот 19 1аЬога1опек иктд (Ье №1йопа1 СоттШее Гог С1шюа1 ЬаЬога1огу 8(апбагбк ех1епбеб-кресйит Ье1а1ас1атаке бе1есйоп те(Ьобк. 1 С1т МюгоЬю1 39(8):2864-72, апб Сайег, 1. 8., апб Ό. 1. Кетр. 2000. Α со1опте1пс бе1есйоп кук!ет Гог Са1утта1оЬас1егшт дгапи1отайк. 8ех Тгапкт 1пГес1 76(2): 134-6).

Патогеном может являться НаеторЬйик тПипхае. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСΚ-праймерам. используемым для идентификации НаеторЬйик 1пДипζае. Примеры этих ΡСΚ-πраймеров раскрыты в уровне техники (см., например, 8. 8Ьота, М. КаЬтап, апб М. Уакгшп. 2001. Кар1б бе1есйоп оГ НаеторЬйик тПиепхае (уре Ь т Вапд1абекЫ сЬйбгеп тейЬ рпеитоша апб тешпдйк Ьу ΡΕΡ апб апа1укк оГ апйтюгоЫа1 гек1к1апсе. 1 НеаЪЬ Ρори1 Νυίτ 19(4):268-74, С. Е. Сог1екк, М. Сшуег, К. Вопоте, V. ЕбтеагбкПопек, Α. 1. Рох, апб Е. В. Касхтагккг 2001. 81тийапеоик бе1есйоп оГ №1ккепа тешпдШбк, НаеторЬйик тПием/ае, апб 81гер1ососспк рпеитошае ш кпкрес1еб сакек оГ тешпдй1к апб керйсет1а иктд геа1-йте ΡΕΡ. 1 С1т МюгоЬю1 39(4): 1553-8, и Сайег, 1. 8., апб Ό. 1. Кетр. 2000. Α со1опте1пс бе1есйоп кхк1ет Гог Са1хтта1оЬас1епит дгапи1отайк. 8ех Тгапкт 1пГес1 76(2): 134-6).

- 19 009302

Патогеном может являться ЗЕарбуксоссиз збтбаиз. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные РСВ-праймерам, используемым для идентификации З1арбу1ососсиз 81ти1аи8. Примеры этих РСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, 1. Уидиегоз, Α. Тетргапо, В. Вег/а1, М. Раиске/, С. Негиаих, 1. М. Ьиеидо, апб О. Шбгго. 2000. С1усега1-бекубе-3ркозрка!е бекубгодеиазе-еисобтд деие аз а изеГи1 !ахоиот1с Юо1 Гог З1арку1ососсиз зрр. 1 Ски М1сгоЫо1 38(12):4351-5, и Р. 8х\уеба. В. Р1абхук. В. Ко!1отезк1, аиб 1. Киг. 2001. С1ошид, ехргеззюи, аиб ршайсакои оГ Ле З1арку1ососсиз 31ти1аиз 1узоз1арЫи изшд Ле т!ет-сЫки-Ьтбтд ботат (ΟΒΌ) зуз!ет. Рго!ет Ехрг РипГ 22(3):467-71).

Патогеном может являться Зкер!ососсиз риентошае. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные РСВ-праймерам, используемым для идентификации З1арбу1ососсиз риеитошае. Примеры этих РСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, 1. Хи, В. С. МШаг, 1. Е. Мооге, К. Мигрку, Н. ХУеЬЬ, Α. 1. Еох, М. СаГГегкеу, аиб М. 1. С.’го\уе. 2003. Етр1оутегИ оГ Ьгоаб-гаиде 16З γΒΝΑ РСВ [о бе(ес( аеко1адка1 адеи!з оГ 1иГескои Ггот скшса1 зреатеиз т ракеи!з \укб аси1е тешпдЦ1з- гар1б зерагакои оГ 16З γΒΝΑ РСВ атрксоиз теккои! Ле иееб Гог с1ошид. 1 Αрр1 М1сгоЫо1 94(2): 197-206, О. Сгетег, Р. 1. Оау, Р. Р. Воззкагб, Е. 1теп, М. Α1ίтеедд, аиб Ό. №1ба1. 2001. ^иапΛаΐ^νе бе!ескои оГ З1герЮсоссиз риеитошае ш иазоркагуидеа1 зесгекоиз Ьу геа1-кте РСВ. 1 С1ш М1сгоЫо1 39(9):3129-34, и С. Е. Сог1езз, М. Сшуег, В. Вогготе, V. Ебтеагбз-1оиез, Α. 1. Еох, аиб Е. В. Кас/тагзкк

2001. 81ти11аиеоиз бе!ескои оГ №ззепа тешидШб1з, Наеторкбиз тПие^ае, аиб З1герЮсоссиз риеитошае т зизрес!еб сазез оГ тешидЛз аиб зерксет1а изшд геа1-кте РСВ. 1 С1Л М1сгоЫо1 39(4): 1553-8).

Патогеном может быть Согоиау1гиз, РНК-вирус, для обнаружения 8ΑΒ8. Последовательность коронавируса можно найти, например, на вебсайте Центра по контролю за заболеваниями. Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, Т. С. Юа/ек, Ό. Егбтаи, С. З. Со1бзт1Л, З. В. ΖΪΛ, Т. Регер 3. Етегу, З. Тоид, С. ИгЬат, 1. Α. Сотег, У. Ыт, Р. Е. ВоШи, З. Е. ОотееН, Α. Е. Ьтд, С. Ό. Нитркгеу, У. 1. ЗЫек 1. Сиатег, С. Ό. Раббоск, Р. Во!а, В. Е1е1бз, 1. Ое-В|зг 1. Υ. Уаид, Ν. Сох, 1. М. Нидкез, 1. У. ЬеПис, У. 1. ВеШш, аиб Ь. 1. Либегзои. 2003. Α Шуе1 Согоиауииз Лззос1а1еб текк Зеуеге Αси!е Везр1га!огу Зуибготе. N Еид1 1 Меб 16:16; С. Огоз!еи, З. СииЛег, У. Рге1зег, З. Vаη Эег УегГ, Н. В. Вгобк З. Вескег, Н. ВаЬеиаи, М. Раитид, Ь. Ко1езшкоуа, В. Α. ЕоисЫег, Α. Вегдег, Α. М. Вигдшеге, 1. СшаИ, М. Ехсктаии, Ν. Езспои, К. Сгутеиа, З. Кгатте, 1. С. Маиидиегга, З. Ми11ег, V. Вккекз, М. ЗЛгтег, З. '1еЛ, Н. Ό. К1еик, Α. Ό. Оз!егкаиз, Н. ЗсИтЦх, аиб Н. У. Ооегг. 2003. Иеикйсакои оГ а №хе1 Согоиау1гиз т Ракеи!з текк Зеуеге Дсйе Везр1га!огу Зуибготе. Ν Еид1 1 Меб 10:10).

Патогеном может быть Вогбе!е11а регЛзз1з, или судорожный кашель. Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, Е. Поисе!-Рори1а1ге, Ν. Воигдео1з, О. Скагага, М. Ве11а1ске, Е. Вккагбш, 1. Ь. За1отои, Ь. Вегагб1-Сгазз1аз, 1. С. Скиазз1а, аиб Р. Еоисаиб. 2002. [Воикие изе оГ деие атркДсакои Гог регЛзз1з б1адиоз1з т скббгеи]. ΑπΑ Реб1а1г 9(11): 1145-52; Ьтдарра, Е В., У. Ьатегеисе, З. Уез!-КееГе, В. СаиЮт, аиб В. Т. Соокзои. 2002. П1адиоз1з оГ соттиш1у-асдшгеб рег1изз1з шГескои: сотрапзои оГ ЬоЛ сикиге аиб Г1ио^езсеи!-аηкЬобу аззауз тейк РСВ бе!ескои изшд е1ескоркогез1з ог бо! Ь1оГ куЬг1б17акои. I С1ш М1сгоЬ1о1 40(8):2908-12).

Патогеном может быть Рку!орк!ога гатогит (причина внезапного омертвения дуба). Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, Ь. Ьеуу, аиб V. Маугоб1еуа. 2003. Еуа1иабои оГ Ле РСВ Ое!ескои аиб ΌΝΑ 1зо1акои шеЛобз Гог изе ш Ле Рку!орк!кога гатогит. Νιкоиа1 Рбо1 Зшуеу, уо1. 2003, ауабаЫе а! Ле Ригбие ишуегзку тееЬзке; В. Α. МсРкегзои, Ό. М. Βίζ/о, М. СагЬе1о!!о, Р. ЗуЛга, Ό. Ь. Уооб, Α. Е ЗЮгег, Ν. М. Ке11у, Ν. Ра1коузку, З. Α. Т)озуо1б, В. В. 3!аηб^Го^б, аиб З. Т. Ко1ке. 2002. Зиббеи Оак ОеаЛ т Са11Гот1а, уо1. 2003. Ноте & Ьаибзсаре, ауабаЫе а! Ле Ишуегзку оГ СакГогша а! Эау1з тееЬзйе).

Патогеном может быть №гтеа1к-вирус. Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, Α. З. Ккаи, С. Ь. Мое, В. I. С1азз, З. З. Моигое, М. К. Ез!ез, Ь. Е. Скартаи, X. Лаид, С. Нитрктеу, Е. Рои, Г К. ккаибег, аиб е! а1. 1994. №г\уа1к уйиз-аззос1а!еб дазкоеи!еккз 1гасеб !о 1се соизитркои аЬоагб а сгшзе зкр ш Натеаи: сотралзои аиб аррксакои оГ то1еси1аг теЛоб-Ьазеб аззауз. I С1Л М1сгоЬ1о1 32(2):318-22; В. Ь. Негтеа1б!, Е Е. Ьете, С. Ь. Мое, Ό. С. Ьете1з, С. Ό. Нитрктеу, З. З. Моигое, Е. У. Рои, аиб В. I. С1азз. 1994. Ска^ас!е^^ζакои оГ а уапаи! зкат оГ Шг\уа1к У1гиз Ггош а Гооб-Ьоте ои!Ьгеак оГ дазкоеи!епкз ои а сгшзе зкр т Натеаи. 1 С1Л М1сгоЬю1 32(4):861-6).

Патогеном может быть ВИЧ. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные РСВ-праймерам, используемым для идентификации НУ. Примеры этих РСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, К. М. Зткй, К. Α. Сгаиба11, М. Ь. Кие1зз1, аиб В. Α. Νηνίη. 2000. РСВ бе!ескои оГ коз! аиб НЕ'-! зедиеисез Ггош агскгуа1 Ьгаш кззие. 1 №игоупо1 6(2): 16471;Сискасоу1ск, В., З. Отиек аиб Α. М. Заи!оз. 2003. Αрр1^сакоиз оГ ро1утегазе скат геаскои ш гкеита!о1оду. Вкеит Э|з С1ш ШгЛ Αш 29(1): 1-20, ν; Р. Сиии^идкаш, Ό. Маток, С. НапТз, З. Наисоск, Α. Сагг, аиб Ό. Соорег. 2003. Еа1зе иедакуе Ш'-1 р^оν^^а1 ΌΝΑ ро1утегазе скат геаскои Л а ракеи! текк ртищу шГескои асдикеб т Ткакаиб. 1 Ски '1го1 26(2): 163-9).

- 20 009302

Патогеном может быть МусоЬасРегшт РиЬегси1ок1к. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные ΡСВ-праймерам, используемым для идентификации туберкулеза. Примеры этих ΡСВ-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Μ. 1. Тоггек, Α. Спайо, Μ. Ειιίζ. А.

С. Ь1апок, 1. С. Ρа1ота^ек, апй 1. ΛζηαΓ. 2003. Ттргоуей геа1-йте Ρί’Β Гог гар1й йеРесР1оп оГ пГатрт апй

ЬогшШй гекЛапсе ίη МусоЬасРегшт РиЬегси1ок1к сйшса1 1ко1аРек. Э|адп МюгоЬю1 1пГес1 Όίκ 45(3):207-12; В. ВЬайасЬагуа, К. Кагак, Α. С. СкокаР Α. Воу, 8. Иак, Ρ. Иапйарар, Ό. КЬеРауаР, Ό. К. Моийа1, 8. Вкайасйагуа, апй 8. СЬакгаЬагй. 2003. Эеуе1ортеп1 оГ а пе\у кепкйВе апй еГПаегИ ти1йр1ех ро1утегаке скат геасПоп (ГСВ) Гог 1йеп11Г1са11оп апй й1ГГегеп(1а!1оп оГ й1ГГегеп! тусоЬасРепа1 креаек. Тгор Мей !п! Неа11к 8(2): 150-7; М. КаГуаЬи1и1а, К. ΑΡιικΤ Т. №да!аке, ί. Сорок, 8. Мйагац К. ΘίζιιιηΡ апй Α. 2ит1а. 2002. Еуа1иаПоп оГ ΡСВ-Ьаκей теРЬойк Гог 1ке й1адпок1к оГ РиЬегси1ок1К Ьу 1йеп(1Пса11оп оГ тусоЬасРепа1 ΌΝΑ т иппе катр1ек. 1пр I ТиЬегс Ьипд Όίκ 6(8):732-7).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты сконструированы таким образом, что будут связываться с мишеневыми полинуклеотидами, общими для целой группы патогенов. Например, аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы так, чтобы обнаруживать бактерии (ВР6), грамположительные бактерии (ВР19), грамотрицательные бактерии (ВР3) и грибки (ΕΡ8). Примеры последовательностей аналогов нуклеиновых кислот для ВР6, ВР19, ВР3 и ΕΡ8 показаны ниже.

'цаа88М Υс Υаасас УГадсай (8Εζ)ΤΟΝο: 3) '(асааМцац У У §с ХУацас 8ц Υ ца8 (8ΕΥ)ΙΟΝΟ:4)

ВР6 о12018 о12019

ВР19 ΟΙ2021

ΟΙ2022

ВРЗ ΟΙ2003 о!2004

5'цсацУ\Уаасцса11аацсас1 (8ЕО

ΙϋΝΟ: 5)

5'ас£асас£а£с1§ас£асаа(!5Е(2

ΙΌ ΝΟ: 6)

5'[с1ацс12.д1с12.ацацца1цас (8ΕρΐϋΝΟ:7) 5'§а£Па§ссд§1£сНсис1 (δΕςίϋΝΟ: 8)

З'сйцсдцйХааШцайса

ГР8 012055 (8Ε<2ΙϋΝΟ:9) зЧацсеасцццсццГцГЩа

012057 (5ΕΌΙΟΝΟ:10)

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть использованы в клинических применениях для диагностики микробной причины сепсиса или в других применениях, где содержание микробов в продуктах важно при оценке их срока хранения и устойчивости или в других продуктах, для которых оценивается стерильность.

Мишеневые полинуклеотиды могут быть специфичными к последовательностям рибосомной РНК, такой как 168 РНК из Е. со11. Рибосомная РНК содержит специфические последовательности, которые характерны для организма-хозяина. Используя последовательности аналога нуклеиновой кислоты, которые комплементарны или строго комплементарны к мишеневому полинуклеотиду, присущему последовательности рибосомной РНК, можно диагностировать патогены на основании последовательностей их рибосомной РНК. Последовательности рибосомной РНК, присущие различным патогенам или штаммам патогенов, можно найти, например, у Откка\у I. ΡаΡе1, Ακίί К. 8ип, Еепд Вапд, Ысопд Вапд, Иеί ЕапВ. Д|ау Китаг апй 8у1\зе Nоη^η. 8йисРиге, Весодпйюп апй Αйарр^νе Втйтд т ΒΝΑ. Αрίате^ Сотр1ехек. ί. Мо1. Вю1. (1997) 272, 645-664).

В. Полинуклеотиды ответа хозяина.

Мишеневый полинуклеотид может также являться полинуклеотидом ответа хозяина. После того как хозяин инфицирован патогеном, его гены в ответ на патоген могут экспрессироваться по-разному, давая определённый рисунок мРНК (профиль генной экспрессии). Гены хозяина, чей рисунок экспрессии коррелирует с инфицированием определённым патогеном, называют «диагностическими маркерными генами» для данного агента. мРНК, как правило, происходит из белых кровяных телец образца. Способы идентификации ответа хозяина и изменённые профили экспрессии можно найти, например, у: 1) Иак, В.,

- 21 009302

Мепб1к, С., Уаи, Ζ., №ей1, В., Воу1е, Т., апб бей, М. (1998) А1!егайопк ίη депе ехргеккюп кко\\' ипк|ие ра!1егпк 1п гекропке !о адеп!к. 1п Ргосеетдк оГ 1Не 2151 Агту 8с1епсе СопГегепсе. Е-Р9, и 2) Мепбк, С., Эак, В., Уапд, Ό., апб беП, М. (1998) 1бепиПса1юп оГ а11ега11опк т депе ехргеккюп ш гекропке !о 8!арку1ососса1 еп1его1ох1п В (8ЕВ) иктд б1ГГегеп(1а1 бкр1ау (ΌΌ). 1п 1Не А8СВ 38(Н Аппиа1 Меейпд, 8ап Егапсксо, СА.

Методы профилирования генной экспрессии разработаны для различных медицинских состояний, как описано, например, в патентных документах США № 5723290 (ЕЬегоше е! а1.), США № 6218122 (Елепб е! а1.), №О 99/10536 (Уаггатбк е! а1.) и №О 99/57130 (Ргаккаг е! а1.). Вкратце, такой способ включает в себя получение уровня экспрессии мРНК в клетках, отобранных в связи с выбранным условием, и сравнение полученных относительных уровней с установленными контрольными. Затем на основании сравнения уровней экспрессии мРНК ставится диагноз. мРНК выделяется из клеток с помощью какоголибо из множества методов, хорошо известных из уровня техники, но в общем, лизируя клетки и обогащая их мРНК или выделяя из них мРНК. Затем любыми известными в данной области средствами получают профили генной экспрессии, включая - но не ограничиваясь ими - способы, раскрытые: Ргаккаг е! а1. в №О 97/05286; Ыаид е! а1. в 8с1епсе 257:967-971 (1992); капоха е! а1. в №ис1ею Ас1бк Век. 23:2954-2959 (1995); и Ргаккаг е! а1. в Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. И8А 93:659-663 (1996). С помощью этих методов обычно получают профили генной экспрессии, используя №ойкегп-анализ, ЕВЕТ-детекцию, гибридизацию с анализом олигонуклеотидов, гибридизацию с анализом кДНК, с кДНК-последовательностями, кДНКфингерпринтингом и т.п. Часто профилями генной экспрессии называют представление экспрессии образцов мРНК в том виде, как их можно обнаружить на ауторадиограмме меченых фрагментов кДНК, полученных из тотальной клеточной мРНК, выделенной на основании размера путём слоевого гельэлектрофореза, капиллярного гель-электрофореза, НРЬС и другими методами выделения. Системы анализа и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают альтернативный путь оценки экспрессии мРНК. Как описано ниже, уровни экспрессии мРНК (т.е. профили генной экспрессии) сравнивают, или, напротив, изменения в экспрессии мРНК от диагностических маркерных генов обнаруживают, анализируя гибридизацию ответа мРНК хозяина по их комплементарности или строгой комплементарности аналогам нуклеиновой кислоты.

С. Пищевые патогены и патогены окружающей среды.

Согласно настоящему изобретению могут быть обнаружены любые пищевые патогены или патогены окружающей среды. Пищевые патогены включают в себя - не ограничиваются ими - Ьк!епа, Сатру1оЬас!ег, Е. сок и 8а1топе11а. Раскрываемые здесь способы с использованием аналогов нуклеиновой кислоты легко позволяют обнаруживать конкретные пищевые патогены. Например, Бк1епа можно легко отличить от 8а1топе11а. Кроме того, можно обнаруживать конкретные штаммы пищевых патогенов, таких как конкретные штаммы Ь. топосу!одепек.

Любой мишеневый полинуклеотид, ассоциированный с пищевыми патогенами, может быть идентифицирован способами согласно настоящему изобретению. Мишеневые полинуклеотиды, которые характеризуют конкретные патогены и штаммы патогенов, могут быть идентифицированы, как обсуждается выше. Данный способ может быть использован для обнаружения мишеневых полинуклеотидов, ассоциированных с Ьк!епа, Сатру1оЬас!ег, Е. со11 и 8а1топе11а. Например, специфичные для Ьк!епа гены, которые могут быть идентифицированы раскрытыми здесь способами, включают гены к1у (листериолизина О) и 1ар (протеина, ассоциированного с инвазией) и мРНК (НЬУР№А и 1АРР№А, соответственно).

Мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие 8а1топе11а крр., могут быть обнаружены согласно настоящему изобретению. Последовательности, специфичные для 8а1топе11а крр., известны в уровне техники (см., например, Регех-Реге/, Р. б., апб Ν. Ό. Напкоп. 2002. Ое1ес1юп оГ р1акт1б-теб1а!еб АтрС Ье!а1ас!атаке депек т скшса1 1ко1а!ек Ьу иктд ти1йр1ех РСВ. б С1ш МюгоЬю1 40(6):2153-62, 8. Ό. Окуейа, С. В. ВобепЬикск, М. С. Се, 8. Ь. Воска, апб С. №. Сапа1. 2003. Еуа1иайоп оГ кексНхе апб поп-ке1есйуе еппсктеп! РСВ ргосебигек Гог 8а1топе11а бе!есйоп. Ьей Арр1 МюгоЬю1 36(4):217-21, и С. М. 8!гарр, А. Е. 8кеагег, апб В. Ό. боегдег. 2003. 8игуеу оГ ге(а1 1 а1Га1Га кргоик апб тиккгоотк Гог !ке ргекепсе оГ ЕкскепсЫа сой О157:Н7, 8а1топе11а, апб Бк1епа νί(Π ВАХ, апб еуа1иайоп оГ Инк ро1утегаке скат геас!юп-Ьакеб кук!ет \\йк ехрептеп!а11у соп!атта!еб катр1ек. б Еооб Рго! 66(2): 182-7).

В другом варианте осуществления могут быть определены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие ЕкскепсЫа сок. Последовательности, специфичные для ЕкскепсЫа сок, известны в уровне техники (см., например, Ь. С. Не11ег, С. В. Паук, К. К. Реак, Ό. №шдДе1б, А. С. Саппопк, Р. Т. Атико, апб б. Сайаш. 2003. Сотрапкоп оГ Ме!кобк Гог Э№А 1ко1а!1оп Ггот Еооб 8атр1ек Гог Пе!есйоп оГ 8Ыда Тохш-Ргобистд ЕкскепсЫа сок Ьу Веа1-Т1те РСВ. Арр1 ЕпУ1гоп МюгоЬю1 69(3): 1844-6, Вактап, Н. 2002. Ми1йр1ех РСВ Гог бе!ес!юп оГ к!х депек оГ ЕкскепсЫа сок. 1пб1ап б Меб Век 115:251-4, и Е. Егакт, апб и. ОЬк!. 2003. Арркса!юп оГ !ке Пиогодешс ргоЬе 1ескпк|ие (Тас.|Мап РСВ) !о !ке бе!ес!юп оГ Еп!егососсик крр. апб ЕкскепсЫа сок т \ха1ег катр1ек. б МюгоЬю1 Ме!кобк 52(1): 123-31.

В другом варианте осуществления могут быть определены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Сатру1оЬас!ег крр. Последовательности, специфичные для Сатру1оЬас!ег крр., известны в уровне техники (см., например, б. 8. Сайег апб Ό. б. Кетр.

- 22 009302

2000. А со1опте!пс бс1сс11оп кукует ког Са1утта1оЬас1сг1ит дгапШотайк. 8ех Тгапкт 1пГсс1 76(2): 134-6, Υ. Могепо, 8. Во1е11а. 1. Ь. А1опко, М. А. Реггик, М. Негпапбех, апб 1. Нетапбех. 2003. 8ресШс бе!ес!юп оГ АгсоЬас!ег апб Сатру1оЬас!ег к!гатк ш теа!ег апб кетеаде Ьу РСК апб йиогексеп! ш кйи куЬпб1хайоп. Арр1 Епу1гоп М1сгоЫо1 69(2): 1181-6, и Ό. Ό. Вапд, А. Уеббегкорр, К. Ребегкеп, апб М. Мабкеп. 2002. Кар1б РСК икшд пек!еб рптегк оГ !ке 168 γΡΝΛ апб !ке Шрршгсаке (Ыр О) депек !о бе!ес1 Сатру1оЬас!ег _)е.)иш апб Сатру1оЬас!ег сой ш епу1гоптеп!а1 катр1ек. Мо1 Се11 в другом варианте осуществления могут быть определены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие ВасШик крр. Последовательности, специфичные для ВасШик крр., известны в уровне техники (см., например, V. Маи1упеп, апб К. Ыпбк!гот. 1998. А гар1б РСК-Ьакеб ΌΝΑ 1ек1 Гог еп1егоЮх1с ВасШик сегеик. Арр1 Епуйоп М1сгоЫо1 64(5): 1634-9, Н. 8скгай апб М. У. СпГГйкк. 1995. 8рес1йс ойдопис1еойбе рптегк Гог бе!есйоп оГ 1есйк1паке-рок1йуе ВасШик крр. Ьу РСК. Арр1 Епуйоп М1сгоЫо1 61(1):98-102, и В. Е. Ьеу, С 1. Ып!оп, Ό. М. Веппе!!, Н. 1а1а1, А. В. Роо!, апб М. К. МШаг. 1998. Пе!ес!юп оГ Ьас!егает1а т райеп!к тейк Геуег апб пеШгореша икшд 168 γΡΝΛ депе атрййсайоп Ьу ро1утегаке скат геасйоп. Еиг 1 Сйп М1сгоЫо1 1пГес! 1)1к 17(4):247-53).

Мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Ркеиботопак крр., также могут быть обнаружены. Последовательности, специфичные для Ркеиботопак крр., известны в уровне техники (см., например, 1. Хи, В. С. МШаг, 1. Е. Мооге, К. Мигрку, Н. УеЬЬ, А. 1. Рох, М. СаГГегкеу, апб М. 1. Сго\уе. 2003. Етр1оутеп1 оГ Ьгоаб-гапде 168 γΡΝΛ РСК 1о бе(ес( аебо1од1са1 адеп!к оГ ίпГесНоп Ггот с11шса1 крес1тепк т райеп!к тейк аси!е тешпдШк- гар1б керагайоп оГ 168 γΡΝΛ РСК атрйсопк тейкои! !ке пееб Гог с1ошпд. 1 Арр1 М1сгоЫо1 94(2): 197-206, В. Е. Ьеу, С. 1. Ып!оп, Ό. М. Веппе!!, Н. 1а1а1, А. В. Роо!, апб М. К. МШаг. 1998. Пе!ес!1оп оГ Ьааегаеппа ш райеп!к тейк Геуег апб пеи!гореша иктд 168 γΡΝΛ депе атрййсайоп Ьу ро1утегаке скип геасйоп. Еиг 1 Скп М1сгоЫо1 Ыес! Э1к 17(4):247-53, апб К. 1окпкеп, О. Епдег, С. 8. 1асоЬкеп, Ь. ТЫгир, апб V. Тогку1к. 1999. РиапШаНуе ке1есйуе РСК оГ 168 пЬокота1 ΌΝΑ согге1а!ек тее11 тейк ке1есйуе адаг р1айпд т бекспЬшд рори1айоп бупаппск оГ тб1депоик Ркеиботопак крр. т кой йо1 кро!к. Арр1 Епуйоп М1сгоЫо1 65(4): 1786-8).

Мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Еп!егосссик крр., также могут быть обнаружены. Последовательности, специфичные для Еп!егосссик крр., известны в уровне техники (см., например, С. К. Нибкоп, Р. 1. Ребогка-Сгау, М. С. 1асккоп-На11, апб Ь. М. Нюй. 2003. Апотайек т креаек 1бепййсайоп оГ еп!егососс1 Ггот уе!ейпагу коигсек икшд а соттегс1а1 Ыоскеппса1 1бепййсайоп кук!ет. Ьей Арр1 М1сгоЫо1 36(4):245-50, 8. М. ПопаЬеб1ап, Ь. А. Тка1, Е. НегккЬегдег, М. В. Рет, 1. У. Скоте, Р. Ваг!1е!!, К. 1опек, К. 1оусе, 8. Коккйег, К. Сау, 1. 1окпкоп, С. Маскткоп, Е. ОеЬекк, 1. Маббеп, Р. Апди1о, апб М. 1. 2егуок. 2003. Мо1еси1аг скагааепхакоп оГ деп!ат1ст-гек1к!ап! Еп(егососс! т 1ке Ипйеб 81а1ек: еу1бепсе оГ кргеаб Ггот ашта1к !о китапк Шгоидк Гооб. 1 С1т М1сгоЫо1 41(3): 1109-13, и 8. В. Vаки1епко, 8. М. ПопаЬеб1ап, А. М. Жккгекепкк1у, М. 1. 2егуок, 8. А. Ьетег, апб 1. У. Скоте. 2003. Ми1йр1ех РСК Гог беГесйоп оГ аттод1усок1бе гек1к1апсе депек т еп!егососа. АпйткгоЬ Адеп1к СкетоШег 47(4): 1423-6).

Мишеневые полинуклеотиды могут также иметь полинуклеотидные последовательности, соответствующие Е. сок О157. Последовательности, специфичные для Е. сой О157, известны в уровне техники (см., например, Рап Т. М., Скеп Ь. М., 8и Υ. С. 1бепййсайоп оГ ЕкскепсЫа сой О157:Н7 Ьу ти1йр1ех РСК тейк рптегк кресйгс (о 1ке к1уА, еаеА, к!х 1, к!х2, ГИС апб гГЬ депек, 1 Рогток Меб Аккос. 2002 8ер; 101(9):661-4; Ворр Ό.Ι, 8аибегк ВГО., ХУагтд А.Ь. Аске1кЬегд 1., Эптак Ν., Вгаип-Ноте1апб Е., Ох1етеп1кк| Ό., Уа11асе В.1., Ке11у М., На1ке Т., Миккег К.А., 8тйк Р.Р., Могке Ό.Ε., ЫтЬегдег К.1. ОеГесйоп, 1ко1айоп, апб Мо1еси1аг 8иЬ1урШд оГ Екскепска сой О157:Н7 апб Сатру1оЬас!ег _)е.)иш Аккос1а!еб тейк а Ьагде Уа1егЬоте ОШЬгеак, 1 Сйп М1сгоЫо1. 2003 1ап;41 (1): 174-80; 1Ьектее А.М., Спехе С.М. ОеГесйоп апб с.|иапййсайоп оГ Екскепска сой О157:Н7 т епу1гоптеп!а1 катр1ек Ьу геа1-йте РСК, 1 Арр1 М1сгоЫо1. 2003; 94(3):421-31).

Мишеневые полинуклеотиды могут также иметь полинуклеотидные последовательности, соответствующие Ык!епа крр. и Ь. топосу!одепек. Последовательности, специфичные для Ык!епа крр. и Ь. топосу!одепек, известны в уровне техники (см., например, Ж1оккоу Ό., Какоо1у А. Скитакоу К., ί’ΐιίχΐιίкоу V. 1бепййсайоп оГ ЫкГепа креаек Ьу ткгоаггау-Ьакеб аккау. 1 Сйп М1сгоЫо1. 2002 Эес; 40(12):4720-8; Сосойп Ь., Капйюи К., 1аситШ Ь., Сап!ош С., Сот1 С. Όπ-ес! 1бепййсайоп т Гооб катр1ек оГ Ык!епа крр. апб Б|к1епа топосу (оде пек Ьу то1еси1аг теШобк. Арр1 Епуйоп М1сгоЫо1. 2002 Эес; 68(12):6273-82; 8кеагег А.Е., 8(гарр С.М., 1оегдег К.Э. Еуа1иайоп оГ а ро1утегаке скат геасйоп-Ьакеб кук!ет Гог бе!есйоп оГ 8а1топе11а еп!егШб1к, Екскепска сой О157:Н7, Ык!епа крр., апб ЫкГепа топосу!одепек оп Ггекк йийк апб уеде!аЬ1ек. 1 Рооб Рго!. 2001 1ип; 64(6):788-95; ВиЬей А., Нет I., Каиск М., Ьсйпсг А., Υооп В., СоеЬе1 У., Уадпег М. Ое(ес(юп апб бГЕГегепкайоп оГ Ык!епа крр. Ьу а ктд1е геасйоп Ьакеб оп ти1йр1ех РСК. Арр1 Епуйоп М1сгоЬ1о1. 1999 Ос!; 65(10):4688-92; 1ипд Υ.8., Ргапк 1.Р., Вгаске!! К.Е., Скеп 1. Ро1утегаке скат геасйоп бе!есйоп оГ Ыйепа топосу!одепек оп ГгапкГиг(егк икшд ойдопис1еойбе рптегк (агдейпд (ке депек епсобтд т!етайп АВ. 1 Рооб Рго!. 2003 РеЬ; 66(2):237-41; и Рапда11о Ό., Касйкоуа Е., Киск!а Т., ЭгакохкЕа Н. Ое(ес(юп оГ БАена топосу!одепек Ьу ро1утегаке скат геасйоп опеп(еб !о Ш1В депе. №те М1сгоЫо1. 2001 Ос(; 24(4):333-9).

Мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие

- 23 009302 формам Е5с11епс1иа. также могут быть обнаружены. Последовательности, специфичные для форм Εδсбепсбаа. известны в уровне техники (см., например, Сазаз Ν., Зипеп Ε. Пекесбоп оГ еп1егоу1ги8е8, бераббз Α У1гиз апб гобаагизез ш зеуаде Ьу теапз оГ ап бттипотадпебс саркиге геуегзе бапзсбрбоп-РСВ аззау. МюгоЬю1 Вез. 2002; 157(3): 169-7; Зсбкоегег Ε., Vепки^а М., ЬиЬоз О., Са/аах 6., Зегсеаи В., Соигшег Ν., ЭиЬо1з Υ., Саттабе Р., Р1ешу Н.Ь, ЬаГоп Μ.Ε. ЦиаШабуе апб диапШабуе то1еси1аг бекесбоп оГ еп1егоу|гизез т уакег Ггот ЬакЫпд агеаз апб Ггот а зеуаде 1геа1теп1 р1ап1; Вез М1сгоЫо1. 2001 Маг; 152(2): 179-86. Ветбагб Α.Ε., Ие1б К.6. 1бепббсабоп оГ попротк зоигсез оГ Геса1 робибоп т соаз1а1 уакегз Ьу изтд 1юз(зресбгс 16З бЬозота1 ΌΝΑ депебс тагкегз Ггот Геса1 апаегоЬез. Арр1 Наукой МюгоЬю1. 2000 Арг; 66(4): 1587-94).

В ещё одном варианте осуществления могут быть обнаружены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие ЧЬбо сбо1егае и V. рагабето1убсиз. Последовательности, специфичные для ЧЬбо сбо1егае и V. рагабаето1убсиз, известны в уровне техники (см., например, Муегз М.Ь., Рашскег 6., Ве.) Α.Κ. РСВ Оекесбоп оГ а №у1у Бтегдеб Раибетк ЧЬбо рагабаетоббсаз 03: К6 РаШодеп 61 Риге Сибигез апб Зеебеб \Уа1егз Ггот Ле 6и1Г оГ Мех1со. Αрр1 Εпν^^оп М1сгоЪю1. 2003 Αр^; 69(4):2194-200; В1аскзкопе 6.М., №гб-З1гот 1.Ь., Чскегу М.С., Воуеп МГО., Меуег В.Р., ЬеРао1а Α. Оекесбоп оГ ракбодешс ЧЬбо рагабаето1убсиз т оуз1ег еа^^сбтеаιз Ьу геа1 бте РСВ. ί МюгоЬю1 МеШобз. 2003 Мау; 53(2): 149-155; и Ьуоп \ν.Ρ ТацМап РСВ Гог бекескбоп оГ ν^Ο сбо1егае О1, 0139, поп-ОС апб поп-0139 т риге сибигез, гау оузкегз, апб зупШебс зеауаке^.Αрр1 Εпν^^оп МкгоЬюк 2001 Оск; 67(10):4685-93).

В следующем варианте осуществления могут быть обнаружены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие плесневым грибкам. Последовательности, специфичные для плесневых грибков, известны в уровне техники (см., например, Ζπγ 6., Зб1тош Ε., НаНегтап Ε., Казб1 Υ. Оекесбоп оГ Αбетаба Гипда1 соп1аттабоп т сегеа1 дгатз Ьу а ро1утегазе сбат геасбоп-Ьазеб аззау. 1 Рооб Рго!. 2002 зер; 65(9): 1433-40; йтепе/ Ь., Зта11з В., 1дпаг В. Изе оГ РСВ апа1уз1з Гог бекесбпд 1оу 1еуе1з оГ Ьас1ег1а апб то1б соп1аттабоп ш рбагтасеибса1 затр1ез. ί МюгоЬю1 МеШобз. 2000 Αυ§; 41(3):259-65; и Vап^бапакот Ν., Vапбΐапакот Р., Нау В.к Варбб 1бепбйсабоп оГ РешсШшт тагпеГГе1 Ьу РСВ-Ьазеб бекесбоп оГ зресблс зедиепсез оп 1бе γΡΝΑ депе, ί Сбп МкгоЬюк 2002 Мау; 40(5): 1739-42).

Мишеневые полинуклеотиды могут иметь полинуклеотидные последовательности, соответствующие Ьедюпеба. Последовательности, специфичные для Ьедюпеба, известны в уровне техники (см., например, Αок^ З., Нбака1а Υ., Мбуа/акб Υ., 1/апикауа К., Υапад^ба^а К., Тотопо К., Υатаба Υ., Тазббо Т., Кобпо З., Катбага З. Оекесбоп оГ Ьедюпеба ΌΝΑ Ьу РСВ оГ убо1е-Ь1ооб затр1ез т а тоизе тобе1. ί Меб МюгоЬю1. 2003 Αр^; 52(Рк 4):325-9; Ваддат В.В., Ьебпег Ε., Миб1Ьаиег 6., Вегд 1., Зкосбег М., 6бзо1б Α.Ρ, Мабб Ε., Кезз1ег Н.Н. Оааб1а1уе бекесбоп оГ Ьедюпеба зресбез т Ьгопсбоакео1аг 1ауадез апб тбисеб зрика Ьу аикотакеб ΌΝΑ ехбасбоп апб геа1-бте ро1утегазе сбат геасбоп. Меб МюгоЬю1 1ттипо1 (Вег1). 2002 Оск; 191(2): 119-25; и Α1еx^ои-^ап^е1 З., З1у11апак1з Α., Рароикзб Α., Ζо^Ьаз I., Рара Α., ЬатЬгорои1оз Α.Ρ., Αпкоп^аб^з Α. Αрр1^сак^оп оГ ро1утегазе сбат геасбоп Гог бекесбоп оГ Ьедюпеба рпеиторбба ш зегит затр1ез. Сбп МюгоЬю1 1п£еск. 1998 Маг; 4(3):144-148).

мРНК ответа хозяина может быть также обнаружена при ответе на инфицирование пищевыми патогенами.

Ό. Патогены водного происхождения.

Раскрытые здесь способы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие и определение патогенов водного происхождения. Патогены водного происхождения включают в себя бактерии, вирусы и простейших. Примеры патогенов водного происхождения включают в себя БЩегососсб. Ε. сой, ВасШиз зрр., Рзеиботопаз зрр., Сгуркозроббшт и Обагбба. Патогены водного происхождения могут быть получены из образцов воды, в том числе - но не ограничиваясь ими - из плавательных бассейнов, аквапарков, колодцев, бытовой питьевой воды, резервуаров, с берегов водоёмов, из озер, океанов, ферм по разведению рыбы и моллюсков, сельскохозяйственной воды, воды для растворов, обработанной восстановлением воды, воды очистных сооружений, на круизных судах, на действующих космических кораблях и кипячёной воды.

Раскрытые здесь способы позволяют легко обнаруживают патогены, происходящие из воды. Могут быть, в частности, обнаружены конкретные штаммы. Например, среди прочих могут быть обнаружены конкретные штаммы Εпке^ососс^, включая Εпке^ососс^ ηνίυιιι. Ε. саззебйаиз, Ε.сесо^ит, Е. со1итЬае, Ε. ббзраг, Ε. бигапз, Ε. Гаесшт, Ε. Гаесабз, Ε. даШпагит, Ε. ббае, Е. та1обогакиз, Ε. типбки, Ε. рзеабо^'бат. Ε. гаГйпозиз, Ε. зассбаго1убсиз, апб Ε. зибигоиз.

Любые полинуклеотиды, связанные с патогенами водного происхождения, могут быть обнаружены способами согласно настоящему изобретению. Данные способ может быть использован для обнаружения генов, связанных с Εηке^ососсиз зрр., Ε. соб, ВасШиз зрр. и Рзеиботопаз зрр., которые уже описаны (см., например, Бзсбегбсбба соб: Ь. С. Не11ег, С. В. Оа\'бз. К. К. Реак, О. ’№тдйе1б, А. С. Саппопз, Р. Т. Αтизо, апб ί. Сабапг 2003, Сотрабзоп об МеШобз бог ΌΝΑ 1зо1абоп Ггот Рооб Затр1ез бог Оекесбоп об Зб1да Тохт-Ргобистд Εзсбе^^сб^а соб Ьу Веа1-Т1те РСВ. Αрр1 Εпν^^оп МюгоЬю1 69(3): 1844-6; Вабтап, Н. 2002. Ми1бр1ех РСВ Гог бекесбоп оГ зкх депез оГ Εзсбе^^сб^а сой. 1пб1ап ί Меб Вез 115:251-4, и Ε. Ргабт апб и.

- 24 009302

ОЫкк 2003. Αрр1^сайοη оГ Ле ГЛогодешс ргоЫе 1есйпк|ие (ТацМап ГС’Ю ю Ле бе!есйоп оГ ЕЛегососсик крр. апб ЕксйейсЛа сой ίη \га1ег катр1ек. ί М1сгоЫю1 МеЛобк 52(1): 123-31. ВасШик крр: V. МаЛупеп апб К. Ыпбкйот. 1998. Α гарЛ ЕСВ-Ыакеб ΌΝΑ 1ек1 Гог еп1его1охю ВасШик сегеик. Αрр1 Епуйоп М1сгоЫт1 64(5): 1634-9, Н. 8сйгай апб М. ^. СпЕйЛк. 1995. 8ресШс ойдопис1еойбе рйтегк Гог бе1есйоп оГ 1есййтакерокШуе ВасШик крр. Ыу Ρ№ Αрр1 Епуйоп М1сгоЫю1 61(1):98-102, и В. Е. Ьеу, С. Е ЫпЛп, Ό. М. Веппей, Н. ба1а1, Α. В. Еоок апб М. В. МШаг. 1998. Ое1есОоп оГ Ыабегаепиа т райеЛк ЮЛ Геуег апб пеийореша иктд 168 γΚΝΑ депе атрййсайоп Ыу ро1утегаке сйат геасйоп. Еиг ί С1ш М1сгоЫт1 1пГес1 Э|к 17(4):247-53. Ρкеибοтοηак крр: Е Хи, В. С. МШаг, Е Е. Мооге, К. Мигрйу, Н. ^еЫЫ, Α. Е Еох, М. СаГГегкеу, апб М. к СТо\\'е. 2003. Етр1оутеп1 оГ Ыгоаб-гапде 168 γΚΝΑ ΡΟΉ ю бе!ес( аейо1од1са1 адепй оГ шЕесйоп Ггот с11шса1 креатепк т райеЛк ЮЛ асЛе тешпдШк - гар1б керагайоп оГ 168 γΚΝΑ ΡΟΉ атрйсопк \\ййои1 Ле пееб Гог с1ошпд. I Αрр1 М1сгоЫю1 94(2): 197-206, В. Е. Ьеу, С. I. ЫпЛп, Ό. М. Веппей, Н. ба1а1, Α. В. Еоок апб М. В. МШаг. 1998. Ое!есйоп оГ Ыабегаеппа ш райеЛк ЮЛ Геуег апб пеийореша иктд 168 γΚΝΑ депе атрййсайоп Ыу ро1утегаке сйаш геасйоп. Еиг ί Сйп М1сгоЫю1 1пГес1 Эв 17(4):247-53, апб К. Лйпкеп, О. Епдег, С. 8. 1асоЫкеп, Ь. ТЛгир, апб V. ТогкуЛ. 1999. РиапЛайуе ке1есйуе ΡСВ оГ 168 йЫокота1 ΌΝΑ соггек-Нек \ге11 шЛ ке1есйуе адаг р1айпд ш бексйЫшд рорЛайоп бупаписк оГ тб1депоик Ρкеибοтοηак крр. т кой йо1 кро1к. Αрр1 Епуйоп М1сгоЫю1 65(4): 1786-8. ЕЛегососсик крр: С. В. Нибкоп, Ρ. ί. Еебогка-Сгау, М. С. ЛсккопНа11, апб Ь. М. Нтй. 2003. Αηοта1^ек ш креаек 1бепййсайоп оГ еШегососс! Ггот уе1еппагу коигсек иктд а соттегс1а1 Ыюсйет1са1 1бепййсайоп кук1ет. Ьей Αрр1 М1сгоЫю1 36(4):245-50, 8. М. ОопаЫеб1ап, Ь. Α. Тйа1, Е. НегкйЫегдег, М. В. Еет, I. ^. Сйою, Ρ. Вагйей, В. Лпек, К. Лусе, 8. Воккйег, К. Сау, I. Лйпкоп, С. Маскткоп, Е. ЭеЫекк, ί. Маббеп, Ρ. Αηди1ο, апб М. ί. 2егуок. 2003. Мо1еси1аг сйа^асΐеπζайοη оГ депЛтктгек1к(ап1 Ейегососш ш Ле Ипйеб 81а1ек: еу1бепсе оГ кргеаб Ггот ашта1к 1о йитапк Лгоидй Гооб. ί Сйп М1сгоЫю1 41(3):1109-13, и 8. В. Vаки1еπкο, 8. М. ОопаЫеб1ап, Α. М. №ккгекепкк1у, М. I. 2егуок, 8. Α. Ьетег, апб ί. ^. Сйо\у. 2003. Ми1йр1ех ΡСВ Гог бе!есйоп оГ аттод1усок1бе гек1к1апсе депек т егИегососсг Α^ι1сгоЫ Αдеηΐк СйетоЛег 47(4): 1423-6. Например, конкретные гены ЕШегососсг которые могут быть идентифицированы раскрытыми здесь способами, включают в себя последовательности 168 рибосомной РНК, которые являются консервативными в Еп1егососсг мРНК ответа хозяина может быть также обнаружена при ответе на инфицирование патогенами, имеющими водное происхождение.

Е. Агротерроризм.

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на ΡСВ обнаружения конкретных патогенов, вовлечённых в агротерроризм. Примеры патогенов, имеющих клиническое значение, и ссылочные документы по основанному на ΡСВ обнаружению перечислены ниже. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности специфичных ΡСВпраймерных последовательностей и могут быть использованы в комбинации во многих выполнениях настоящего изобретения, описанных ниже.

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы, например, таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на ΡСВ обнаружения Тохор1акта допбп. Тохор1акта допбп имеет очень низкую хозяйскую специфичность и, вероятно, инфицирует любое млекопитающее. Она также передаётся от птиц и обнаруживается фактически в каждой стране мира. Подобно большинству представителей Αр^сοтр1еxа, Тохор1акта является облигатным интрацеллюлярным паразитом. У большинства людей, инфицированных Тохор1акта, заболевание бессимптомно. Однако при некоторых условиях, токсоплазмоз может вызвать серьезную патологию, включая гепатит, пневмонию, слепоту и серьезные нейрологические нарушения. Праймеры, используемые в основанном на ΡСВ обнаружении Тохор1акта допби, в уровне техники известны (см., например, Т. V. Αкр^ηа11, О. Маг1ее, ί. Е. Нубе, апб Ρ. Ρ. 81тк. 2002. Егеуа1епсе оГ Тохор1акта допби т соттегс1а1 теа1 ргобисй ак топйогеб Ыу ро1утегаке сйат геасйоп-Гооб Гог Лоидй!? 1п1 ί Еагак!^ 32(9): 1193-9, Т. V. Αφίпа11, Е. С. Сиу, К. Е. ВоЫейк, Ό. Н. Лупкоп, ί. Е. Нубе, апб Ρ. Е. 81тк. 2003. Мо1еси1аг еу1бепсе Гог ти1йр1е Тохор1акта дапби шЕесйопк т Лб1У1биа1 райепй т Епд1апб апб Жа1ек: риЫйс йеайй трйсайопк. 1п1 ί Ρηηкйо1 33(1):97-103, I. ЕиеЛек, ί. М. ВиЫт, С. Вати^, апб ί. Α1υπγ. 2001. СепоВрю сйа^асΐеπζайοη оГ Тохар1акта допби к!га1пк акко6а1еб ЮЛ йитап Лхор1акток1к Л 8рат: б1гес! апа1ук1к Ггот сйшса1 катр1ек. I Сйп М1сгоЫю1 39(4): 1566-70, и М. В. ^агпекЛакийуа, ί. Ό. Лйпкоп, апб В. Е. НоШтап. 1998. Ое!есйоп оГ Тохор1акта допбп Л сигеб теа1к. 1п1 ί Еооб М1сгоЫю1 45(3):211-5).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на ΡСВ обнаружения 8йтде11а крр., грамотрицательной бактерии. Праймеры, используемые в основанном на ΡСВ обнаружении 8Лпде11а крр., в уровне техники известны (А. В. Найтап, Екк1е1, II, Ό. ^. ИепЫагдег, апб Ь. Е. Ыпб1ег. 2003. Ер1бетю1оду оГ Тейасусйпе ВекШапсе Ое1егттап1к Л 8Лде11а крр. апб ЕЛеготуаыуе ЕксйейсЛа сой: СйагабеЛайоп апб О1ккеттайоп оГ ΐеΐ(Α)-1. ί Сйп М1сгоЫю1 41(3): 1023-32, К. Α. Ьатре1, апб Ρ. Α. Ог1апб1. 2002. Ео1утегаке сйат геасйоп бе!есйоп оГ Луаыуе 8Лде11а апб 8а1топе11а егИепса т Гооб. МеЛобк Мо1 Вт1 179:235-44, В. Е. ^апд, ^. ^. Сао, апб С. Е. Сегшдйа. 1997. Α ишуегка1 ргоЮсо1 Гог ΡСВ бе!есйоп оГ 13 креаек оГ ГообЫоте раЛодепк т Гообк. ί Αрр1 М1сгоЫю1

- 25 009302

83(6):727-36, и К. А. Ьатре1, I. А. 1адоте, М. Тгисккекк, аиб Л. Е. Н111. 1990. Ро1утегаке сбат геасйои Гог бе!есбои оГ шуабауе 8б1де11а Лехиен ш Гооб. Арр1 Еиупои М1сгоЫо1 56(6): 1536-40).

В следующем варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения Сус1окрога сауе!аиеикк. Сус1окрога сауеΐаηеиκ^κ является одноклеточным паразитом, слишком маленьким, чтобы его можно было видеть в микроскоп. О первых известных случаях заболевания человека, вызванного инфекцией Сус1окрога (т.е. циклоспориаз), сообщалось в 1979 г. Более часто о подобных случаях стали сообщать в середине 1980-х. В последние несколько лет о вспышках циклоспориаза сообщалось в Соединённых Штатах и Канаде. Сус1окрога распространяется через употребление воды или пищи, заражённой испражнениями. Вспышки циклоспориаза связывают с различными типами сырых продуктов. Сус1окрога требуется время (дни или недели) после прохождения в пищеварительный тракт, чтобы стать инфекционной. Поэтому маловероятно, чтобы Сус1окрога передавалась прямо от одного человека другому.

Праймеры, используемые в основанном на РСК обнаружении Сус1окрога сауе!аиеикк, известны в уровне техники (см., например, М. Ь. ЕЬегбагб, N. I. Р1еша7ек, аиб М. I. Агго\\'ооб. 1997. ЬаЬога!огу б1адиок1к оГ Сус1окрога хиГесбоик. Агсб Ра!бо1 ЬаЬ Меб 121(8):792-7, N. I. Р1еша7ек, 8. В. 81етеиба, А. I. ба 8буа, Е. М. АГаио, аиб М. I. Агго^ооб. 1996. РСК оГ шГесйои \νίΐ1ι Сус1окрога сауеΐаηеиκ^κ.

Етегд [иГес! Όίκ 2(4):357-9, Л. Рит!его-Ве!аисоий, Е. К. Рее1е, аиб I. В. Коке. 2002. Сгур!окройбшт рагуит аиб Сус1окрога сауе!аиеикк: а ге\зе\\· оГ 1аЬога!огу те!бобк Гог бе!есбои оГ Леке \\'а1егЬогпе рагакбек. I М1сгоЫо1 МеЛобк 49(3):209-24, и М. Vа^та, I. Ό. Нек!ег, Е. Л. 8сбаеГег, 3гб, М. Л. Лаге, аиб Н. Ό. бй'1бс.|шк1. 2003. Пе!есбои оГ Сус1окрога сауеΐаηеик^к иктд а диаШбайуе геа1-бте РСК аккау. I М1сгоЫо1 МеЛобк 53(1):27-36)

Е. Диагностика болезней.

Раскрытые здесь способы обеспечивают также быстрый и чувствительный тест на присутствие генов (например, аллелей, связанных с болезнями) или изменённой экспрессии генов. Обнаруживаемые генные последовательности могут быть вовлечены в генетические болезни, нарушения и предрасположенности. Один пример мишеневых полинуклеотидов включает в себя специфические геномные последовательности, в том числе мутации, полиморфизмы, вставки и делеции. Другим примером мишеневых полинуклеотидов являются полинуклеотидные последовательности, которые изменяют генную экспрессию (например, экспрессию, регулируемую против или по ходу транскрипции) при конкретном заболевании или нарушении. Примеры генов, связанных с заболеваниями и нарушениями включают в себя - но не ограничиваются ими - гены, вовлечённые в рак, фиброз мочевого пузыря и синдром Дауна и в заболевания, связанные с полиморфизмами и мутациями. Могут быть также идентифицированы унаследованный гемахроматоз, фактор 11, фактор V и НЬА-генотипы тканевых трансплантантов.

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемых для основанного на РСК обнаружения мишеневых полинуклеотидов, вовлечённых в рак или изменённую клеточную пролиферацию. Мишеневые полинуклеотиды, соответствующие генам, вовлечённым в рак или изменённую клеточную пролиферацию, могут быть обнаружены. Многочисленные гены, вовлечённые в рак, известны в уровне техники.

В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения рака поджелудочной железы. Праймеры, используемые в основанном на РСК обнаружении рака поджелудочной железы, такие как ПРС4, известны в уровне техники (см., например, V. М. ВагЬега, М. Магби, Ь. Майиоко, А. Мийие, А. Сагга!о, Е. X. Кеа1, аиб М. ЕаЬге. 2000. Тбе 18с.|21 гедюи 1и со1огес!а1 аиб раисгеабс саисег: тбереибеи! 1окк оГ ОСС аиб ЭРС4 ехргеккюи. ВюсЫт Вюрбук Ас!а 1502(2):283-96, Ό. Вайке11, Р. Вайб, Ό. Вакбаи, А. Катак^ату, В. Сегбек, В. Сба1оирка, Υ. Пекк, В. 81тои, аиб А. 8сбибу. 1999. Шдбег Ггедиеису оГ ОРС4/8таб4 абегабоик т раиегеабс саисег се11 1тек Лаи 1и рйтагу раисгеабс абеиосагсшотак. Саисег Ьеб 139(1):43-9, и Ό. Вайксб, 8. А. Наби, К. Ό. Патсбеуккц А. Катак^ату, Ό. Вакбаи, Н. 6а1еббай, Р. Вайб, Л. 8сбт1еде1, В. 81тои, аиб М. КоЛтииб. 1999. Ми!айоик оГ !бе ОРС4/8таб4 деие т иеигоеибосйие раисгеабс !итогк. Оисодеие 18(14):2367-71).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения рака шейки матки. Мишеневые полинуклеотиды, соответствующие всем или части генов, связанных с раком шейки матки, также могут быть идентифицированы (см., например, Н. X. 81, 8. Л. Ткао, С. 8. Роои, Ь. Ό. Лаид, Υ. С. Лоид, аиб А. Ь. Сбеиид. 2003. νίπι1 1оаб оГ №ν т екорбадеа1 кдиатоик се11 сагстота. 1и! I Саисег 103(4):496-500, и Р. Е. Сакбе, М. 8сбй£таи, Р. Е. Сгауб!, Н. Кеиба11, 8. Екбтаи, Н. Эоид, А. Н11бекбе1т, К. Неггего, М. С. Вгаб1, М. Е. 8бегтаи, А. Ьойис/, I. Е. 8сбикк1ег, аиб К. Ό. Вигк. 2002. Сотрайкоик оГ №ν ΌΝΑ бе!есбои Ьу МΥ09/11 РСК те!бобк. I Меб νίΐΌ1 68(3):417-23).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемых для основанного на РСК обнаружения рака молочной железы. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательно

- 26 009302 сти, соответствующие всем или части генов, связанных с раком молочной железы (см., например, С. I. Μίη, Ь. ТаГга, апб К. М. ^гЬапас. 1998. Шепбйсабоп оГ киребог тагкегк Гог ро1утегаке скат геасбоп бе1есбоп оГ Ьгеак( сапсег те1ак1акек ίη кеп11пе1 1утрб побек. Сапсег Кек 58(20):4581-4, М. К. ΑЬЬакζабсдаη, I Р. 8биегтд, К. М. Вгогп, I. V. 8шбег, Ρ. Оообка1б, К. Ооге-Ьапд(оп, апб М. К. Нидбек. 1997. Αиΐοтаΐсб бйесбоп оГ ргеуа1еп( ти(абопк ίη Β^Α1 апб ΒΗίΆ депек, иктд а ГШогодешс РСК а11ебс бйсбттабоп аккау. Сепе1 Тек( 1(3): 171-80, апб О. Татига, С Маекага, Υ. 8ихикг М. КакбШаЬа, М. 1кб1ба, К. 8айо, апб К. 8а1оба1е. 1994. бтргоуеб бе(есбоп оГ 1окк оГ бе1егохудокЦу а! гебпоЬ1ак(ота депе 1осик ίη битап Ьгеак( сагсшота. Ра1бо1 Ιηί 44(1):34-8).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения меланомы. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с меланомой (см., например, М. Ь. Сопха1до, С. М. Вепбег, Е. Н. Нои, I. М. О1епбешпд, I. Ρ. Р1огек, О. I. ^а1кег, Ν. К. Наугагб, Р. Α. Шпек, апб I. V. Еоип(ат. 1997. бо\у Ггес.|иепсу оГ р16/С^КN2Α те(бу1абоп ίη крогабк те1апота: сотрагабуе арргоасбек Гог те(бу1абоп апа1убк оГ рбтагу (итогк. Сапсег Кек 57(23):5336-47, I. Сбеп, Е. 8. КоЬткоп, I. Αίсηс^ο, Ζ. \Уапд, 8. Ка/1ап1к, Ь. Ό. Со1еба, К. 8. №игп, апб Г К. МсСаггеу. 2001. С.’багас1еп/аиоп оГ (бе С^КN2Α апб ΑΕΡ депек ίη υν-тбисеб те1апосубс бурегр1ак1ак апб те1апотак оГ ап ороккит (Мопобе1рбгк ботекбса). Мо1 Сагстод 31(1): 16-26, и Р. М. Ро11оск, к ^е1сб, апб Ν. К. Наугагб. 2001. Еу1бепсе Гог (бгее (итог кирргекког 1ос1 оп сбготокоте 9р туойеб ίη те1апота бете1ортеп1. Сапсег Кек 61(3): 1154-61).

Кроме того, аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения рака прямой кишки. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с раком прямой кишки (см., например, 8. Αοк^, Υ. Такад1, М. Науакага, К. Уатадисг М. Еи(атига, К. Кишеба, апб 8. 8ар. 2002. Бйесбоп оГ рег1(опеа1 т1сготе1ак1акек Ьу гсусгкс 1гапкспр1аке-ро1утегаке сбат геасбоп 1агде(1пд сагсшоетЬгуошс апбдеп апб су(окегабп 20 ίη со1оп сапсег рабеп(к. ί Ехр С1ш Сапсег Кек 21(4):555-62, К. 8б1оуегтап-Сбеп, Е. Ебебтап, Α. Е1дег, М. Сагте1, Υ. Ра(ае1, Р. Ка(б, Н. Н. Е1ббег, 8. Ваг-Мей, апб Ь. Тбеобог. 2001. Тбе 11307К ЛРС ро1утогрбгкт: ргеуа1епсе ίη ηοη-Лкбксηаζ^ 1е\ук апб еу1бепсе Гог а Гоипбег еГГес(. Сепе1 Тек( 5(2): 141-6, и V. М. 8тйб, Ν. I. Vаη Огкоиг, Е. Α. Еох, К. Ό. Ко1обпег, I. νί)§, апб С Епд. 1998. Αсси^аίс, бгдб1бгоидбри1 кпаркбо( бе(есбоп оГ бМЬН1 ти(абопк Ьу 1\уо-бппепкюпа1 ΌΝΑ е1ес1горбогек1к. Сепе1 Тек( 2(1):43-53).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения ретинобластомы. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с ретинобластомой (см., например, I. Αс^кЬак, I. Кекег, 8. К1бс, Н. Вадс1, О. Каг^эиход1и, апб О. ЬШесг 2002. Бйесбоп оГ ЬОН оГ (бе КВ1 депе ίη Ь1аббег сапсегк Ьу РСК-КЕЬР. иго1 Ιηί 68(3): 189-92, О. Татига, С. Маекага, Υ. 8ихикг М. КакбШаЬа, М. 1кбгба, К. 8айо, апб К. 8а1оба1е. 1994. бтргоуеб бе(есбоп оГ 1окк оГ бе1егохудокЦу абебпоЬ1ак(ота депе 1осик ίη битап Ьгеак( сагсшота. Ра(бо1 Ιηί 44(1):34-8, и Ό. Ьобтапп, В. Ногк(бетке, О. ОШеккеп-КаекЬасб, Е. Н. 8(еГап1, апб Н. Но(1ег. 1992. Бйесбоп оГ кта11 КВ1 депе бе1е(1опк ίη гебпоЬ1ак(ота Ьу ти1бр1ех РСК апб Ыдб-геко1ибоп де1 ексборбогекй. Нит Оепе( 89(1):49-53.

В следующем варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на РСК обнаружения гемофилии. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с гемофилией (см., например, Мапиисс1, Р. М. 2002. Натгаккегтап 1ес1иге: беторбШа апб ге1а(еб Ыеебтд бйогбегк: а к(огу оГ бйтау апб киссекк. Нета(о1оду (Αι 8ос Нета(о1 Ебис Ргодгат): 1-9, и Сйгоп, М., Ь. Собтбог, Т. Оапди1у, апб Α. Оапди1у. 2002. Н1дб (бгоидбри( тШабоп ксгеешпд оГ (бе Гас(ог VIII депе (Е8С) ίη беторбШа Α: 37 поуе1 тШабопк апб депо(уре-рбепо(уре согге1абоп. Нит Ми1а1 20(4):267-74).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с фенилкетилурией (РКИ) (см., например, Ν. Ргошпа, 8. С|аппа11ак1о, Р. ба11ап/1о, К. бидоукка, Р. Vсνс^с. апб Α. Когпе)еуа. 2003. Тбе то1еси1аг Ьакй оГ рбепу1ке(опиба ίη ба1У!а. Нит Ми1а1 21(4):398-9, Н. 8иеока, М. №1дао, апб 8. СбгЬа. 2000. Кар1б ти(абоп ксгеешпд оГ рбепу1ке(опиба Ьу ро1утегаке сбат геасбоп-бпкеб гек(г1с(1оп сηζутс аккау апб б1гес( кедиепсе оГ (бе рбепу1а1атпе бубгоху1аке депе: сбшса1 аррбсабоп ίη поПбегп Шрап апб поПбегп Сбгпа. Оепе( Тек( 4(3):249-56, и К. С. Ейепктйб, Α. Α. Ообкоу, апб 8. Ь. XVоо. 1994. Α к1тр1е, гар1б, апб бгдб1у 1пГогтабуе РСК-Ьакеб ргосебиге Гог ргепа(а1 б1адпокй апб сагбег ксгеешпд оГ рбепу1ке(опипа. Ргепа( Б1адп 14(12): 1113-8). Α^ιύ, К. Ь., Т. Αкб^ζага, Г 1апкоу1с, С. Т. Саккеу, апб С 8. Ккбагбк. 1996. Мо1еси1аг бе(есбоп оГ пег ти(абопк, гекобШоп оГ атЫдиоик гекибк апб сотр1ех депебс соипкебпд йкиек ίη НипбпдТоп бйеаке. Αι ί Меб Оепе( 66(3):281-6, νηαιсак-Шпек, С. Ь. 2003. Е1иогексепсе РСК апб Оепе8сап апа1укй Гог (бе бе(есбоп оГ СΑО гереа( ехрапкюпк аккос1а(еб гйб НипбпдТоп'к бйеаке. Ме(бобк Мо1 Вю1 217:101-8, апб I. Рападорои1ок, С. Ьаккеп, и. Кг1к(оГГегккоп, апб Р. Αтаη. 1999. Α поуе1 РСК-Ьакеб арргоасб Гог (бе бе(есбоп оГ (бе НипбпдТоп бгкеаке аккосга(еб

- 27 009302

Йтис1еойбе гереа! ехрапкюп. Нит Ми!а! 13(3):232-6).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Хантингтона, например, вследствие увеличенного числа САСповторов (см., например, В. Ь. Α1Γογ6, Т. Α^ζιγι, 1. 1апкоу1с, С. Т. Саккеу, апб С. 8. ВюНагбк. 1996. Мо1еси1аг бе!есйоп оГ пег тЫайопк, гекоЫйоп оГ атЫдиоик геки1!к апб сотрех депейс соипзейпд ккиек ίη Нипйпд!оп бкеаке. Лт ί Меб Сепе! 66(3):281-6, С. Ь. Упепсак-Ыпек, 2003. Р1иогексепсе ЙСВ апб Сепе8сап апа1ук1к Гог (Не бе!есйоп оГ С'АС гереа! ехрапкюпк аккоаа!еб \\ЙН Нипйпд!оп'к б1кеаке. Ме!Нобк Мо1 Вю1 217:101-8, апб I. Ρаηадорои1ок, С. Ьаккеп, и. Кйк!оГГегккоп, апб Ρ. Лтаη. 1999. Α поуе1 ЙСВ-Ьакеб арргоасН Гог (Не бе!есйоп оГ !Не Нипйпд!оп б1кеаке аккоаа!еб 1г1пыс1ео11бе гереа! ехрапкюп. Нит Ми!а! 13(3):232-6).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с гемофилией (см., например, Ρ. М. Мапписа, 2002. Натгаккегтап 1ес!ше: НеторЫйа апб ге1а!еб Ь1еебшд бкогбегк: а к!огу оГ б1ктау апб киссекк. Нета!о1оду (Ат 8ос Нета!о1 Ебис Йгодгат): 1-9, и М. Сйгоп, Ь. Собтйог, Т. Сапди1у, апб Α. Сапди1у. 2002. Н1дй (НгоидНрШ ти!айоп ксгеептд оГ (Не Гас!ог VIII депе (Р8С) т НеторЫйа Α: 37 поуе1 ти(а(1опк апб депо(уре-рНепо(уре согге1айоп. Нит Ми!а! 20(4):267-74).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Тея-Сакса (см., например, 1. Е. Вюе, Ρ Α. 8аηсйеζ, К. Е. Й1егсе. апб Ь. Р \¥апдН. 2002. Веа1-йте ЙСВ \\ЙН то1еси1аг Ьеасопк ргоу1бек а ЫдЫу ассига!е аккау Гог бе!есйоп оГ Тау-8асНк а11е1ек т ктд1е се11к. Ρκμ! Э|адп 22(12): 1130-4, 8. Татаки, Н. №кЫо, Н. Луак^, М. 1. Ьее, М. М|/и(оп. Υ. ТакекЫта, Н. №катига. М. Ма!кио, Т. Магио, апб К. 8итто. 1999. Ρι^κ-ιι;·! б1адпок1к оГ а Ырапеке Гатйу а! пкк Гог Тау-8асНк б1кеаке. Лрр1^са!^оη оГ а Г1иогексеп( сотреййуе аПе1е-кресШс ро1утегаке скат геасйоп (ΡΟΗ) те!Ноб. КоЬе 1 Меб 8с1 45(6):259-70, и 8егтоп, К. ^. Ыккепк, Ζ. Ρ.Nаду, Α. Уап 8!е1йедйет, апб I. ЫеЬаегк. 1995. 81ти1!апеоик атрййсайоп оГ !Не 1\\ό ток! Ггециеп! тЫайопк оГ тГапЙ1е Тау-8асНк б1кеаке т ктд1е Ь1ак!отегек. Нит Вергоб 10(8):2214-7).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с множественным склерозом (МС) (см., например, 8. Ьаигегк, Н. Уапбег Неубеп, апб В. ВотЬаи!. 2002. 8сгеешпд апб орйт1кайап оГ ат ΕΜ8Α те!Ноб Гаг 1Не циапШаНуе бе!есйоп оГ еп!егоу1гик кресШс ВТ-ЙСВ ргобис!к Ьу теапк оГ а !го-1еуе1 ехрептеп!а1 беидп. ί йНагт Вютеб Α^1 29(4):659-68, Н. йеггоп. 1. Α. Сагкоп, Р. Вебт, Р. Векете, С. Ρа^аηйок-Вассаίа, Р. Κоти^^аη-Ρ^абе1, Р. Ма11е!, Ρ. ^. Тике, С. Уо1кке!, Р Ь. В1опб, В. Ьа1апбе, Р М. 8е1дпеипп, апб В. Мапбгапб. 1997. Мо1еси1аг 1бепйГ1са(1оп оГ а поуе1 ге!гоу1гик гереа!еб1у 1ко1а!еб Ггот райеп!к \\ЙН ти1йр1е кс1егок1к. Тре СойаЬогайуе ВекеагсН Сгоир оп Ми1йр1е 8с1егок1к. йгос №111 Лсаб 8α υ8Α 94(14):7583-8, и В. 8. КиНпе апб Ρ. ОксНтапп. 2002. ОиапШаНуе геа1-йте ВТ-ЙСВ иктд йуЬ^^б^ζаί^оη ргоЬек апб ппроПеб к!апбагб сшуек Гог су!окте депе ехргеккюп апа1ук1к. Вю!есНЫдиек 33(5): 1078, 1080-2, 1084 ракит).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с лимфомой Буркитта (см., например, Υ. \¥и. Υ. СНеп. Р Xи, апб Ь. Ьи. 2002. Лη(^саηсе^ асЙуЫек оГ сигситт оп Нитап ВигкЫ'к 1утрНота. Ζ^^Π^ Ζΐιοπβ Ыи Ζι Ζΐιί 24(4):348-52, К. Вакко, Е. Ргаксе11а, Ь. Ζ8№800, апб Α. Воко1еп. 1999. Нтргоуеб 1опд-б1к!апсе ро1утегаке скат геасйоп Гог !Не бе!есйоп оГ !(8;14)(ц24;ц32) т ВигкЫ'к 1утрНотак. Лт ί Ρа!йо1 155(5):1479-85, и М. Α^ι, Т. М1уакЫ!а, Р. ВеккНо, Ν. КоЬауакЫ, апб 8. М^ζи!аη^. 1991. Майдпап! се11 бе!ес!юп т ВшкЫ'к 1утрНота иктд !Ыгб- сотр1етеп!ап!у-бе!егтттд гедюп (СОВШ), с1опе-кресШс ргоЬе беуе1ореб Ьу кециепстд ΌΝΑ Ггот к!огеб кНбек. 1рп 1 Сапсег Век 82(7):848-53).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с фиброзом мочевого пузыря (см., например, Тоташо1о, В., М. 8рта, апб С. Сак!а1бо. 2003. Мо1еси1аг б1адпойк оГ сукйс йЬгойк: сотрайкоп оГ Гоиг апа1уйса1 ргосебигек. С1т СНет ЬаЬ Меб 41(1):26-32, М. С. Соηζа1еζ-Соηζаίеζ, М. Сагаа-Ноуок, М. Р Тгир11о, М. Вобпдиех бе Α^η. I. Ьогба8аηсйеζ, Р О|ах-Весакепк. Е. Са11агбо, С. Луико, апб С. Ваток. 2002. Ρ^еηаίа1 бе!есйоп оГ а сукйс йЬгойк тЫайоп т Ге!а1 ΌΝΑ Ггот та!егпа1 р1акта. ΡπακΚ Э|адп 22(10):946-8, и С. СогЬе!!а, М. 8е1а, Α. Вакко!й, Α. ЛтЬ^ок^оη^, Α. Сшп!а, апб В. Ρабоаη. 2002. 8сгеептд Гог сукйс йЬгойк т пегЬогп шРап!к: геки1!к оГ а рИо! ргодгатте Ьакеб оп а Рго Пег рго!осо1 (IВТ/^NЛ/IВТ) ш!Не йайап рори1айоп. ί Меб 8сгееп 9(2):60-3).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с начинающимся в детстве диабетом (см., например, Т. Кпегг, В. Верр, Р Оо!кск, Ν. СгаЫй. Р Напхе. Т. Каре11еп, апб ^. ВаксНег. 1999. ОпапШаНоп оГ депе ехргеккюп Ьу геа1-йте ΡСВ бкргоуек а ге!гоуйа1 НуроЫейк Гог сНйбНооб-опке! б1аЬе!ек те111!ик. Геб!!!!· Век 46(1):57-60, 8. Ьаигегк, Υ. Уапбег Неубеп, апб В. ВотЬаи!. 2002. 8сгеешпд апб орйткайоп оГ ап Ε^I8Л те!Ноб Гог !Не циапЫайуе бе!есйоп оГ еп!егоунак кресШс ВТ-ЙСВ ргобис!к Ьу теапк оГ а !го-1еуе1 ехрейтеп!а1 бейдп. ί Ρίκιπη Вютеб Лηа129(4):659-68, и К. 8а1ттеп, К. 8абеНади, М. Ьогтго!, Ρ. УаНака1о, Α. Кирйа, 8. КогНопеп, Р Попеп, О. 81те11, М. Кшр, апб Н. Нуо!у. 2003. Еп!егоупик 1пРесйопк аге аккоаа!еб !Не тбисйоп оГ Ье!асе11 аи!о1ттипйу ш а ргокресйуе ЫпН соНог! к!ибу. ί Меб Уйо1 69(1):91-8).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Паркинсона (см., например, 1. Ноешска, Ь. У1ба1, В. Мога1ек, I. Лтрие^о, Р. Р йтепе/-Ртепе/. Р Вегаапо, Т. бе1 8ег, Α. Ртепе/. Ρ. С. Ριιίζ. апб Р С. бе ΥеЬеηек. 2002.

- 28 009302

Мо1еси1аг Гтбтдк ш ГатД1а1 ДагкРпкоп б1кеаке ш 8раД1. Агск №иго1 59(6):966-70; С. В. Ьисктд апб А. Впсе. 2003. 8еш1диап!1!а!1уе ΡΟΚ Гог 1Не бе!есДоп ок ехоп геаггапдетеп!к т !ке Дагкт депе. Ме1кобк Мо1 В1о1 217:13-26; V. Ό. Ье, Ρ. Хи, к .Гапкоук, Н. Лапд, 8. Н. Арре1, К. С. 8тйД, апб Ό. К. Уаккйайк. 2003. МШакопк т ΝΚ4Α2 аккос1а!еб \νί11ι Гат1Да1 ?агкткоп б1кеаке. №11 Сепе! 33(1):85-9; и Рогоиб, Т., 8. К. Ишаске, Ь. Ьш, Ν. Ρаик^а!ζ, А. Кибо1рД, С. На1!ег, С. 8Ди1!к, К.Магбег, Ρ. М. Соппеа11у, апб V. С. №ско1к. 2003. Не1егохудокйу Гог а ти1аДоп т 1Де рагкш депе 1еабк !о 1а!ег опке! Дагкткоп б1кеаке. №иго1оду 60(5):796-801).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Альцгеймера (см., например, МагекД, С. А., Ό. ЕгехуДтах, С. Е. Миггу, Ό. №сДДп, апб А. Ό. 8пои. 1996. Пе!есДоп апб с.|иапД1а1юп оГ рег1есап пМА 1еуе1к ш А1хкейпег'к б1кеаке апб погта1 адеб Ырросатрик Ьу сотреДДуе геуегке 1гапкспрДоп-ро1утегаке скат геасДоп. б №игоскет 67(3): 1132-44; и М. к 8тйД, К. к Сагбпег, М. А. Кшдй!, 8. М. Роггек!, К. ВеугеиШег, Е. 8!огеу, С. А. МсЬеап, К. С. Со!!оп, К. Сарра1, апб С. Ь. Мак!егк. 1999. Еаг1у-опке! А1хкекпег'к б1кеаке саикеб Ьу а поуе1 ти!аДоп а! собоп 219 оГ 1Де ргекеш1т-1 депе. №игогероД 10(3):503-7).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с тромбозом (см., например, 8апбегк 8еуа11, к 2000. Рас!ог V Ье1беп депо!уршд иктд геа1 Дте Диогексеп! ро1утегаке скат геасДоп. Мо1 Се11 ДгоЬек 14(4):249-53; Реггека-Сопха1ех, А., Ь. М. Р1ккег, С. М. Ьектап, М. Н. Ьапд1еу, Ό. Н. Ьок1апб, О. Х1а, N. X. Nдиуеπ, Ό. Мобек!о, к В. XV111оидкЬу, Ό. 8. ^Дкткоп, апб С. Т. Сагге!!. 1997. Ре!ес!юп оГ а соттоп ти!а!юп ш Гас!ог V депе гекропк1Ь1е Гог гек1к1апсе !о асДуа!е рго!еш С саиктд ргебДрокШоп !о !кготЬок1к. б С’1т ЬаЬ Апа1 11(6):328-35; XVагккаикку, I., С. Нгеп, Ь. 8егаа, В. 8кабгаск, 8. К. РейсДег, Е. №и!оп, апб К. КоДке-Магскап!. 2002. Эе1есДоп оГ а поуе1 рот! ти!а!юп оГ ГДе ргоМотЬт депе а! рокДюп 20209. Э|адп Мо1 ?а1До1 11(3):152-6).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с подверженностью туберкулезу (см., например, Ве11ату К. 8иксер11Ь1111у !о тусоЬас!епа1 тГесДопк: ГДе ппройапсе оГ кок! депеДск. Сепек 1ттип., 2003 бал; 4(1):4-11; Аиотоу! А.А., Магскап! А., Ноикоп 1.М., МсАбат КЛ., В1аские11 1.М., №\\рой М.1. 1п!ег1еикт-10, ро1утогрЫкт ш 8БС11А1 (Гогтег1у NКΑМΡ1), апб киксерДЬДйу !о !иЬегси1ок1к. 1 Мес! Р1к. 2002 Эес 15;186(12):1808-14. Ве11ату К. NКΑМΡ1 апб киксерДЬПйу !о !иЬегси1ок1к. 1п! 1 ТиЬегс Ьипд Р1к. 2002 8ер;6(9):747).

Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (4ΐν) (см., например, 1Гегдап I., Вегпагб Ν.Ρ., Вгипеаи 1., А1агу М., Ткоикак С.М., Кодег М. А11е1е Ггедиепсу оГ !кгее ГипсДопа11у асДуе ро1утогрЫктк оГ !Де МОК-1 Сепе ш ЫдД-пкк НШ-педаДуе апб НШ-рокДкуе Саисамапк. АГО8. 2002 Μν 22; 16(17):2340-2; и Рагхап М., МДхаЬекоу Т., Ко1скткку Ρ., ^уаД К., СауаЬуаЬ М., Сегагб Ν.Ρ., Сегагб С., 8обгокк1 1., Ское Н. Тугокте ки1Га11оп оГ !Де атто !еегттик оГ ССК5 ГасШ!а!ек НШ-1 епДу. Се11 1999 Маг 5; 96(5):667-76).

Раскрытые здесь способы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие генов или изменённой экспрессии генов в генетических анализах другого рода. Например, они могут быть использованы для определения идентичности образцов человека, например, в тестах по установлению отцовства, судебной медицине или при сравнении подходящих или неподходящих донорских органов. Диагностика может также проводиться не на образцах от человека, а, например, для установления родословной скота.

С. Болезни, передаваемые половым путём.

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности или фрагменты последовательностей праймеров, используемые для основанного на ΡΟΡ обнаружения патогенов, которые вызывают болезни, передаваемые половым путём (8ТОк). Примеры 8ТРк, имеющих клиническое значение, и ссылочные документы по обнаружению болезней на основе ΡΟΡ перечислены ниже. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности специфических последовательностей ΡСК-праймеров и могут быть использованы в комбинации во многих вариантах осуществления раскрытого здесь изобретения.

В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемые для основанного на ΡΟΡ обнаружения хламидий. Многие такие праймеры известны в уровне техники (см., например, Е. Н. Коитапк, С. М. В1аск, Ь. Е. Магкои11х, Е. Ипдег, А. Йетсе, М. К. 8аиуег, апб 1. К. Ρарр. 2003. Сотрапкоп оГ те!кобк Гог бе!есДоп оГ Ск1атуб1а ДасДотаДк апб №1ккепа допоггЬоеае иктд соттегс1а11у ауаДаЫе писШс ас1б атрНДсаДоп !ек!к апб а 1к.|шб рар ктеаг тебшт. 1 Скп МюгоЬю1 41(4): 1507-11; М. Ρио1акка^пеп, Е. НД!ипеп-Васк, Т. Кеипа1а, 8. 8иДопеп, Ρ. каД!еептак1, М. кеДДпеп, апб 1. Ρаауоηеη. 1998. Сотрапкоп оГ регГогтапсек оГ !ио соттегс1а11у ауаДаЫе !ек!к, а ΡΟΡ аккау апб а Ддаке сДат геасДоп !ек!, т бе!ес!юп оГ игодеш1а1 Ск1атуб1а ДасДотаДк ГиГесДоп. 1 Скп МюгоЬю1 36(6): 1489-93; Ве!кои Р., Веаитоп! К., 8иеиг 1.М., ОгД1а 1. Сопк1гпсДоп апб еуа1иа!юп оГ Мета1 сопДо1 ^NΑ Гог ΡΟΡ атрДйсаДоп оГ Ск1атуб1а ДасДотаДк ^NΑ Ггот иппе катр1ек. 1 С1т МюгоЬюк 2003 Маг; 41(3):1274-6; Кпох 1., ТаЬпх1 8.Ν., МШег Ρ., Ρе!оитеηок К., Баи М., СДеп 8., Саг1апб 8.М. Еуа1иаДоп оГ ке1к-со11ес!еб катр1ек т сопДак! !о ргасД!юпег-со11ес!еб катр1ек Гог бе!ес!юп оГ Ск1атуб1а ДасДотаДк, №1ккепа допоггЬоеае, апб Тпскотопак уадтаДк Ьу ро1утегаке сДат геас

- 29 009302 йоп атопд \готеп 1Мпд ш гетоГе агеаз. 8ех Тгапзт Όίδ. 2002 Коу; 29(11):647-54; Мудтб Т., В1гке1ипб 8., ВйкеЬаек Ν., ОезГегдаагб Ь., кпзеп 1., Сйпзйапзеп С. ИеГегттайоп оГ РСВ еГПаепсу ш с1е1ех-100 рипйеб сйшса1 затр1ез апб сотрапзоп оГ геа1-йте диапШайуе РСВ апб сопуепйопа1 РСВ Гог беГесйоп оГ С11атуб1а рпеитошае. ВМС М1сгоЪю1. 2002 й.11 9; 2(1): 17).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемые для основанного на РСВ обнаружения Тгеропета ра111бит. Примеры праймеров, используемых для идентификации Тгеропета раШбит с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, А. СепГилоп-Ьага, С. СазГго, 1. М. 8НаГГег. XV. С. Уап УоогЫз, С. М. Магга, апб 8. А. Ьикейап. 1997. ИеГесйоп оГ Тгеропета ра1Йбит Ьу а зепз1Йуе геуегзе йапзспрГазе РСВ. 1 С1т М1сгоЫо1 35(6): 1348-52; А. А. МагГт, Н. Ьш, М. Υ. 8ийоп, В. 8Гетег, А. Р111ау, апб Ь. Е. Магко\\йх. 2001. Атрййсайоп оГ Г1е ОКА ро1утегазе I депе оГ Тгеропета ра1йбит Ггот \г1ю1е Ь1ооб оГ регзопз \νίΐ1ι зурЫйз. Э|адп М1сгоЫо1 ЫесГ Όίδ 40(4): 163-6; 8. Ь. ОгГоп, Н. Ьш, В. Υ. Эобб, апб А. Е. Лйкатз. 2002. Ргеуа1епсе оГ спси1айпд Тгеропета раШбит ОКА апб ВИА шЬ1ооб бопогз νίΐΗ сопДгтеб-розШуе зурЫйз ГезГз. ТгапзГизтп 42(1):94-9).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на РСВ обнаружения ВИЧ. Примеры праймеров, используемых для идентификации ВИЧ с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, Ь. С1Ьпеу, М. Маса1изо, К. Кпк, М. 8. Наззап, 1. 8с11\\'еЬке, 8. Н. Уегтипб, апб Р. Сйоибйигу. 2001. Ргеуа1епсе оГ 1пГесйоиз б1зеазез т Вапд1абез1п \\'отеп 1Мпд аб)асепГ Го а Ггиск зГапб: Н[У/8ТО/11ераГЙ1з/депйа1 ГгасГ 1пГесйопз. 8ех Тгапзт ГпГссГ 77(5):344-50; 8р1ш11о,

A. , М. ПеЬ1адд1, Р. 2ага, В. Мазегай, Р. Ро1аГй, апб А. Эе 8апГо1о. 2001. РасГогз аззотаГеб \νίΐ1ι пис1е1с ас1бз ге1аГеб Го 1штап 1ттипобейс1епсу упиз Гуре 1 т сегуко-уадта1 зесгейопз. В_)од 108(6):634-41).

В ещё одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на РСВ обнаружения папиллом авируса человека (НРУ). Примеры праймеров, используемых для идентификации НРУ с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, В. Ь. Л1пег, 8. К. Ьее, Г Р. Нидйез, Ό. Е. Абат, Ν. В. КМаГ, апб Ь. А. КоиГзку. 2003. Сепйа1 1штап рарШотауйиз 1пГесйоп: 1пс1бепсе апб пзк ГасГогз ш а сойогГ оГ Гета1е ишуегзйу зГибепГз. Ат 1 Ер1бетю1 157(3):218-26; 1. Е. Ьеу1,

B. К1еГег, V. С. ОтпЕ М. С. Р1пк, С. Ь. СапГо, В. МаГзиЬага, I. ^^ηйа^ез. А. 8едигабо, В. УапбеФогдИк Е Е. ИеГо, апб Ь. Е Уап Эогп. 2002. Н1д1 ргеуа1епсе оГ 1итап рарШотауйиз (НРУ) шГесйопз апб 1пд11 Ггецпепсу оГ ти1йр1е НРУ депоГурез т 1штап 1ттипобейс1епсу упиз- шГесГеб \\'отеп ш Вгахй. 1 Сйп М1сгоЬю1 40(9):3341-5; М. 8кег1еу, М. Сгсе, М. 8йоГкоу1ае-8кег1еу, К. Низщак, апб Е ЕГро/епс1с. 2002. Нитап рарй1отау1гиз та1е депйа1 1пГесйопз: сйшса1 уапайопз апб Г1е з1дшйсапсе оГ ΩΝΛ Гуртд. Сйп ИегтаГо1 20(2): 173-8).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на РСВ обнаружения Ие1ззепа допоггкоеае. Примеры праймеров, используемых для идентификации Ие1ззепа допоггкоеае с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, С. 8. Мдопе, Т. Ьир^а, апб V. Υека. 2002. Н1д1 ргеуа1епсе оГ Ие1ззепа допоггкоеае апб ти1йр1е зехиа11у ГгапзтйГеб б1зеазез атопд гига1 теотеп ш Г1е ЕазГегп ШдЫапбз Ргоутсе оГ Рариа Ие\\' Сшпеа, беГесГеб Ьу ро1утегазе сНат геасйоп. 8ех Тгапзт Э|з 29(12):775-9; 1. Р. Сотез, Ь. Тауна, Р. ЕхрозГо, Е. РпеГо, апб М. А. СаГгу. 2001. Жззепа допопйоеае апб СЫатуб1а йас1отайз 1пГесйопз т райепГз айепбтд 8ТЭ апб Гатйу р1апптд сйп1сз 1п В1ззаи, Сшпеа-В1ззаи. АсГа Тгор 80(3):261-4; Ό. 1. ИГетегГ, М. Ό. ЫЬтап, апб Р. ЬеЬе1. 2002. СопГтпайоп Ьу 168 гВИА РСВ оГГ1е СОВА8 АМРЫСОВ СТ/ИС ГезГ Гог б1адпоз1з оГ Ие1ззепа допопйоеае шГесйоп 1п а 1о\\-ргема1епсе рори1айоп. 1 Сйп М1сгоЫо1 40(11):4056-9).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на РСВ обнаружения генитального герпеса. Примеры праймеров, используемых для идентификации генитального герпеса с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, М. Н. Vο1ГГ, 1. 8сйт^ГГ, М. Вайаиз, Н. Иибба, апб V. НаГхтапп. 2002. Сйшса1 апб зиЬсйшса1 геасйуайоп оГ депйа1 Иегрез У1тз. !пГег^^/1го1оду 45(1):20-3; Vа1б, А. 2002. Тезйпд Гог депйа1 Ьегрез: 1оте, те1о, апб \у11у. Сигг Сйп Тор ЫесГ И1з 22:166-80; 8сои1аг, А. 2002. Изтд Г1е еу1бепсе Ьазе оп депйа1 Ьегрез: орйт1зтд Г1е изе оГ б1адпозйс ГезГз апб шГогтайоп ргоу1зюп. 8ех Тгапзт ЫесГ 78(3): 160-5).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на РСВ обнаружения Тпс1ютопаз уапдтайз. Примеры праймеров, используемых для идентификации Тпс1ютопаз уапд1пайз с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, Vепбе1, К. А., Е. 1. ЕгЬе1б1пд, С. А. Саубоз, апб А. М. Вотра1о. 2002. Тпс1тотопаз уадтайз ро1утегазе с1ат геасйоп сотрагеб \\Й11 зГапбагб б1адпозйс апб Легареийс ргоГосо1з Гог беГесйоп апб ГгеаГтепГ оГ уадта1 Гпс1ютошаз1з. Сйп ЫесГ И1з 35(5):576-80; К. А. Vепбе1, Е. 1. ЕгЬе1бтд, С. А. Саубоз, апб А М. Вотра1о. 2003. Изе оГ иппе ро1утегазе с1ийп геасйоп Го бейпе Г1е ргеуа1епсе апб сйшса1 ргезепГайоп оГ Тпс1ютопаз уадтайз ш теп айепбтд ап 8ТЭ сйшс. 8ех Тгапзт ГпГссГ 79(2): 151-153).

- 30 009302

Наконец, аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения общих 8ТОк. Примеры праймеров, используемых для идентификации 8ТЭк с использованием основанных на РСВ анализов, в уровне техники известны (см., например, 8. Мйгаш-ВокепЬаит, В. Тку1ей, О. Ьау1е, В. Во1бек, Е. Ап!еЬу, 8. 8Ытопоуйсй, Т. ^аζа^оν^!сй, апб А. Рпебтапп. 1994. 81тийапеоик бе!ес!юп оГ 1йгее соттоп кехиа11у !гапктй!еб адеп!к Ьу ро1утегаке скат геасйоп. Ат I ОЬк!е!: Супесо1 171(3):784-90).

Н. Устойчивость к антибиотикам.

Способы, композиции и системы анализа могут быть использованы для обнаружения присутствия или изменения экспрессии генов, придающих устойчивость к антибиотикам. Мишеневый полинуклеотид может соответствовать генам, которые придают антибиотическую устойчивость к патогену. Альтернативно, мишеневый полинуклеотид может соответствовать гену хозяина, имеющему изменённый метаболизм, который может влиять на действенность антибиотика.

Примеры генов, экспрессирующих устойчивость к антибиотикам, можно найти в следующих ссылочных документах. Приводимые примеры не ограничиваются перечисленными примерами. Гены, такие как кодирующие бета-лактамазы, передают устойчивость к антибиотикам, в том числе - но не ограничиваясь ими - пенициллин, эритромицин, цефотаксим, ампициллин, пиперациллин, цефоперазон, цефазидим, цефепим, моксолактам, имипенем (см., например, Ыуегтоге, Ό.Μ. 1995. в-Ьас1атакек т ЬаЬога!огу апб Сйшса1 ВеккЮпсс. Сйп. МюгоЪю1. Веу1еук. 8:557-584, Нкией, Р., Тепд, Ь., Ьее, Ь., Уапд, Р., Но, 8., апб Ьий, К., 1999. Оккеттайоп оГ Н1дй-Ьеуе1 РешсШт-, Ех!епбеб-8рес1гит Серйа1окропп-, апб Егу!йготустВек1к!ап! 81гер!ососсик рпеитошае С1опек т Татап. I. Сйп. МсгоЬюй 37:221-224, 8е!сйапоуа, Ь., апб Тота^, А. 1999. Мо1еси1аг С’йагасЮШайоп оГ РешсШт-Век1к!ап! 81гер!ососсик рпеитошае Но1а!ек Ггот Ви1дапа. I. Сйп. МюгоЬюй 37:638-648, Люйе1йаик, Т.А., Кет, 8., 8сйаГег, V., Вгабе, V. 1999. Вар1б Эс1ссйоп оГ Ер1бетю 8!гатк оГ Ме1йюШт-Век1к!ап! 81арйу1ососсик аигеик. Е Сйп. МюгоЬюГ 37:690-693, и 1асоЬу С.А. 1994. Сепейск оГ Ех!епбеб-8рес!гит Ве!а-Ьас1атакек. Еиг. Е Сйп. МюгоЬю1. ЫесГ. П1к.13:кирр1.1:2-11).

Другие неограничивающие примеры генов, придающих устойчивость к антибиотикам, включают в себя хинолоновые гены устойчивости, которые придают устойчивость к таким антибиотикам, как цепрофлоксацин, офлоксацин, норфлоксацин, эноксацин, спарфлоксацин (см., например, Магдеткоп, Е. Е. С, Нореуе11, В., апб Ркйег, Ь.М. 1992. Ыис1еойбе 8едиспсс оГ !йе 81арйу1ососсик аггеик дугВ-дугА Ьосик Епсобшд !йе ОЫА Сугаке А апб В Рго!ешк. Е Вас!епо1. 174:1596-1603, МсЛЫппеу, Р.Н.М., Ра!е1, 8., Лййеу, В.А., Нагб1е, ЕМ., СШекр1е, 8.Н., апб К1ЬЬ1ег, С.С. 1993. АсйуШек оГ Ро!епйа1 Тйегареийс апб Ргорйу1асйс АпйЫойск адашк! В1ооб Сийиге Но1а!ек оГ νί^-ιι^ Сгоир 8!гер!ососа Ггот №и1горешс Райеп!к Весе1утд С1ргоГ1охаст. АпйтюгоЬ. Адеп!к. СйетоИег. 37:2493-2495, и УокЫба, Н., Водак1, М., Ыакатига, 8., ЦЬика1а, К., апб Коппо, М. 1990. Ыис1еойбе 8едиспсс апб Сйагас!еШа!юп оГ !йе 81арйу1ососсик аигеик погА Сепе, ЛЫсй СопГегк Век1к1апсе !о Отпо1опск. Е Вас!епо1. 172:6942-6949).

Дополнительные примеры генов устойчивости к антибиотикам включают гликопептидные гены устойчивости, которые передают устойчивость к таким антибиотикам, как вакомицин и тейкопланин (см., например, Тгет1е!!, С.Н., Вгоуп, Ό.Ρ.Ι, апб ЛообГогб, N. 1999. Vа^^а!^оп т 8!гис!иге апб Ьосайоп оГ VапА С1усорерйбе Век1к!апсе Е1етеп!к атопд Еп!егососс1 Ггот а 8тд1е Райеп!. I. Сйп. МюгоЬю1. 37:818-820, апб Аййиг, М., Перагб1еи, Р., Мойпак, С., Веупо1бк, Р., апб Сошуайп, Р. 1995. Тйе уап2 депе оГ Тп1546 Ггот Еп!егососсик Гаесшт ВМ4147 сопГегк гекк1апсе !о !еюор1ашп. Сепе, 154 (1995) 87-92), аминогликозидные гены устойчивости, которые передают устойчивость к таким антибиотикам, как тобрамицин, гентамицин, стрепомицин, канамицин, амикацин (Сайтапб М., йатЬеп, Т., СегЬаиб, С., апб Сошуайп, Р. 1993. Сйа^ас!е^^ζа!^оп оГ !йе аас(6')-1Ь депе Епсобтд ап Аттод1усок1бе 6'-Ы-Лсс1у11гапкГсгакс т Ркеиботопак аегидтока ВМ2656. АпйтюгоЬ. Адеп!к. Сйето!йег. 37:1456-1462, йатЬеп, Т., СегЬинб, С., апб Соигуайп, Р. 1994. С’11агас1еШа1юп оГ Тгапкрокоп Тп1528, Лйюй СопГегк Ат1каст Век1к!апсе Ьу 8уп1йек1к оГ Аттод1усок1бе 3'-О-Рйокрйо1гапкГегаке Туре VI. АпйтюгоЬ. Адеп!к. Сйето!йег. 38:702-706, и 8йау, К.Е, Мипаууег, Н., Ва!йег, Р.Ы., Наге, В.8., апб М111ег, С.Н. 1993. Ыис1еойбе 8едиспсс Апа1ук1к апб ЭЫА НуЬ^^б^ζа!^оп 8!иб1ек оГ !йе ап!(4')-Па Сепе Г!от Ркеиботопак аегидтока. АпйтюгоЬ. Адеп!к. Сйето!йег. 37:708-714).

В некоторых случаях имеются особые типы устойчивости, представляющие большой интерес. Они включают в себя метициллин-устойчивые 8!арйу1ососсик аигеик (см., например, Йо, Т., К. Окита, X. X. Ма, Н. Υυζη^η, апб К. Н1гата!ки. 2003. !пк1дИ(к оп апйЬюйс гек1к1апсе оГ 8!арйу1ососсик аигеик Ггот йк уйо1е депоте: депотю 1к1апб 8СС. Эгид Векк! Ирба!е 6(1):41-52, Кигоба, М., Т. Ой!а, I. ИсЫуата, Т. ВаЬа, Н. Υυζη^η, I. КоЬауакЫ, Ь. Сш, А. ОдисЫ, К. Аок1, Υ. Ыада1, I. Ыап, Т. Йо, М. Калатой, Н. Макитаги, А. Матуата, Н. Мигакатц А. Нокоуата, Υ. М1т!аш-и1, Ν. К. ТакайакЫ, Т. 8ауапо, В. Шоие, С Кайо, К. 8ек^т^ζи, Н. Ниакауа, 8. Кийага, 8. Со!о, I. ΥаЬиζак^, М. КапеЫка, А. Υатакй^!а, К. ОкЫта, К. Ригиуа, С. Υокй^по, Т. 8й1Ьа, М. На!!оп, Ν. Одакауага, Н. НауакЫ, апб К. Н1гата!ки. 2001. Лйо1е депоте кес.|иепстд оГ тейсШт-гекк1ап! 8!арйу1ососсик аигеик. Ьапсе! 357(9264): 1225-40, и В. А. 8киггау, апб Ν. РиГй. 1997. Мо1еси1аг еуо1ийоп оГ ти111р1у-ап1|Ыо11с-гск!к1ап1 к!арйу1ососс1. С1Ьа Роипб 8утр 207:167-83).

Другие гены, придающие устойчивость к антибиотикам, которые могут быть обнаружены, включают в себя туберкулезные гены устойчивости к антибиотикам (см., например, I. Мокгоикоу, Т. Ойеп, М. РШрепко, А. Vуаζоνауа, Е. Сйгароу, Е. Ытексйепко, Ь. 8!ек1оуа, В. Vуκйлеνκк^у, апб О. №гуккауа. 2002.

- 31 009302

Ое1есйоп оГ 1коп1ахлб-гек1к1ап( МусоЬас!епит 1иЬегси1ок1к к(га1пк Ьу а ти1йр1ех а11е1е-кресШс БСВ аккау !агдейпд каЮ собоп 315 уапайоп. I С1т М1сгоЫо1 40(7):2509-12; С. Сопд, Н. Бее, С. Н. Капд, Υ. Н. 8к1т, I. Ник, апб 8. К. Ккапд. 2002. №к!еб БСВ Гог б1адпок1к оГ 1иЬегси1оик 1утркабешйк апб ΡСВ-88СΡ Гог 1бепййсайоп оГ пГатркт гекШапсе ш Ппе-пееб1е акриа1ек. О1адп Су1ора11ю1 26(4):228-31; Ό. Сагаа бе У1ебта, М. бе1 8о1 Шах 1пГап1ек, Р. Бака1а, Р. Скауек, Б. Α1са1а, апб Е. Воиха. 2002. №те геа1-йте БСВ аЬ1е Ю бе1ес( ш а к1пд1е 1иЬе ти1йр1е пГатрт гекШапсе ти1айопк апб Ыдк-1еуе1 1кошах1б гек1к!апсе ти1айопк т МусоЬас1ейит 1иЬегси1ок1к. I Скп М1сгоЬю1 40(3):988-95).

I. Генетический скрининг на предрасположенность к реакциям на лекарства.

Способы, композиции и системы анализа могут быть использованы для обнаружения генов, придающих предрасположенность к реакциям на лекарства. Мишеневый полинуклеотид может соответствовать любой полинуклеотидной последовательности, которая придаёт предрасположенность к реакциям на лекарства. Мишеневый полинуклеотид может соответствовать последовательностям, включённым в предрасположенность к лекарствам, которые влияют на кардиоваскулярную систему (см., например, С. Оиб1еу, В. Кеаупеу, В. Сакабе1, I. Соптеау, В. Впб, апб Ρ. Ва1скГГе. 1996. Ρ^еб^сΐ^оп оГ райеп! гекропкек Ю апйкурейепкгуе бгидк икшд депейс ро1утогрЫктк: туекйдайоп оГ гешп-апд1о1епкш кук1ет депек. I Нурег!епк 14(2):259-62; Ρ. В. Ыта, I. Α. СоЩуо, I. В. Борек бе Рапа, Р. Р. Сок!а, апб 8. Т. 8ааб. 1997. Вапб 3 Сатртак: а поуе1 крйстд ти1айоп т 1ке Ьапб 3 депе (ΑΕ1) аккоаа1еб текк кегебкагу кркегосуШкЦ, курегаскуку оГ №1+/Б|+ соиШейгапкрой апб ап аЬпогта1 гепа1 ЫсагЬопа1е капбкпд. В1ооб 90(7):2810-8; Т. 8акаеба, Т. Накатит, М. НогтоисЫ, М. Какито!о, Ν. Окто!о, Т. 8ака1, Υ. Могка, Т. Татига, Ν. Αоуата, М. Н1га1, М. Какида, апб К. Окитига. 2001. МОВ1 депо1уре-ге1а1еб ркагтасоктекск оГ б1дохт айег ктд1е ога1 абтшкйайоп ш кеаййу 1арапеке киЬ)ес1к. Бкагт Век 18(10): 1400-4).

Мишеневый полинуклеотид может также соответствовать генам и другим полинуклеотидным последовательностям, вовлечённым в предрасположенность к психиатрическим лекарствам (см., например, Ό. Мко^В I. С. 8к1т, М. Райскйб, Ν. Ρайеп, В. Α. Руа1, А. Н. Коск, Α. ΜасΡке^κоп, Ό. Р1осккай, Υ. В. Υооп, I. 8. Υооп, Υ. Н. К1п, апб I. С. 8Ып. 2002. Ακκос^аΐ^оп Ье1теееп СУБ2О6 депоВре апб 1агб|уе букктек1а 1п Когеап ксЫхорйгешск. Ρка^тасодеπот^сκ I 2(6):400-7; Б. ВегШккоп, М. Б. Оай1, апб С. ТуЬппд. 1997. Ρка^тасодепеΐ^сκ оГ аийбергеккаи1к: с1шса1 акрес!к. Α^π Бкуск1а1г 8сапб 8ирр1 391: 14-21; 8. Скеп, А. Н. Скои, В. Α. В1ошп, Ζ. Мао, Б. Б. Нитркпек, 0. С. Меек, I. В. №ί11, А. Б. Магйи, Б. В. Наук, апб Ρ. I. Аеб1ипб. 1996. Тке су1оскготе Ρ450 2Ό6 (ΓΎΡ2Ο6) епхуте ро1утогрк1кт: ксгеешпд сок1к апб тПиепсе оп сйшса1 оШсотек ш ркусЫайу. Скп Бкагтасо1 Ткег 60(5): 522-34).

Мишеневый полинуклеотид может также соответствовать последовательностям генов или другим полинуклеотидным последовательностям, соответствующим предрасположенности к обезболивающим препаратам (см., например, М. I. То^^еκ-Са1νаи, Ν. Ойеда, Р. 8апскех-Сагаа, С. В1апсо, Т. СагтШо, апб I. Ошгаке. 2001. БТС4-купШаке Α-444С ро1утогрЫкт: 1аск оГ аккоаайоп текк N8ΑI^-^пбисеб во1а1еб репогЬка1 апдюебета ш а 8раткк рори1айоп. Αηи Α1^^ Α^^α 1ттипо1 87(6):506-10).

I. Гены, вовлечённые в эффективную реакцию на лекарства.

Способы, композиции и системы анализа согласно настоящему изобретению могут быть использованы для генетического тестирования как потенциального указания реакции на лекарственное средство. Способы, композиции и анализы могут быть использованы для определения того, работает ли применяемое лечение, или развивается устойчивость (толерантность). Тестирование генной экспрессии могло бы быть использовано для определения того, становится ли или станет опухоль устойчивой к лечению. Основанное на генах диагностическое тестирование может также включать в себя предварительный скрининг вероятности развития болезни или нарушения в будущем, предварительный скрининг на генетическую предрасположенность к определённым типам рака и идентификацию генетического полиморфизма.

Могут быть сконструированы аналоги нуклеиновой кислоты для обнаружения присутствия и экспрессии конкретных генов. В одном аспекте, настоящие способы могут быть использованы для определения уровня экспрессии ферментов, которые могут метаболизировать связанное лекарство. Полиморфные ферменты изменяют действие лекарств и, таким образом, изменяют их способность использоваться в лечении. Можно обнаружить генетический полиморфизм в генах, который влияет на реакцию связанного лекарства и, таким образом, влияет на способность лекарства использоваться как лекарственное средство.

В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих цитохром ί'.ΎΡ2Ο6. Цитохром ί'.ΎΡ2Ο6 может метаболизировать дебризокин, который используется для лечения антигипертензии. Увеличенная экспрессия цитохрома ί'.ΎΡ2Ο6 указывает на устойчивость к дебризокину (см., например, Α. МакдоиЬ, I. В. 1б1е, Б. С. Оппд, В. Бапсайег, апб В. Б. 8ткк. 1977. Бо1утогрк1с кубгоху1айоп оГ ЭеЬпкос.|шпе т тап. Бапсе! 2 (8038): 584-6; апб Α. Аеηие^ко1т, I. Зокапккоп, Α. Υ. Макке1е, М. Бапбе, С. Α^, Υ. Αбеп-ΑЬб^, М. Б. Оай1, Μ.Iпде1таи-8ипбЬе^д, Б. ВегШккоп, апб Б. Б. СийаГккоп. 1999. Эесгеакеб сарасйу Гог беЬпкос.|шпе те!аЬоккт атопд Ь1аск Тапхашапк: апа1укек оГ Ше ί.ΎΡ2Ο6 депо!уре апб ркепоВре. Ρка^тасодепеΐ^сκ 9 (6): 707-14).

Наличие экспрессии цитохрома ί'.ΎΡ2Ο6 может быть использовано для определения устойчивости к спартеину, который используется для лечения послеоперационных болей (см., например, М. Е1ске1Ьаит, Ν. 8раииЬ^иске^, В. 81етске, апб Н. I. Оепд1ег. 1979. ЭеГес11уе N-оx^баΐ^оп оГ крайете т тап: а пете ркаг

- 32 009302 тасодепейс беГес!. Еиг б С1т Ркагтасо1 16 (3): 183-7; Е. Вго1у, Ό. Маге/, Ν. 8аЬЬадк, М. Ьедгапб, 8. М111есатрк, б. М. Ьо Ошбюе, Р. Воопе, апб и. А. Меуег. 1995. Ап еГДтеп! к!га!еду Гог бе!есйоп оГ кпо\\'п апб пе\х ти!а!юпк оГ !ке СУР2Э6 депе иктд кшд1е кйапб сопГогтайоп ро1утогрккт апа1укк. Ркагтасодепейск 5 (6): 373-84).

Наличие экспрессии цитохрома С.УР2О6 может быть использовано для определения устойчивости к нортриптилину, который используется для лечения депрессии и кардиоваскулярной болезни (см., например, Р. Оа1еп, М. Ь. Оак1, М. Ь. Яш/, б. №огбш, апб Ь. ВегШккоп. 1998.10-Нубтоху1а!юп оГ пойпр1у1те ш \\'1Ше регкопк \νί11ι 0,1, 2,3, апб 13 Гипс!юпа1 СУР2Э6 депек. С1т Ркагтасо1 Ткег 63 (4): 444-52; Ц. У. Уие, Ζ. Н. ΖΗ^, О. ТуЬппд, Р. Оа1еп, М. Ь. ЭпИк Ь. ВегШккоп, апб Е. 8)осрзкк 1998. Ркагтасоктейск оГпог1г1р(уИпе апб йк 10-кубгоху те!аЬо1йе ш СЫпеке киЬ_)ес!к оГ бйГегеп! СУР2Э6 депо!урек. С1ш Ркагтасо1 Ткег 64 (4): 384-90).

Наличие экспрессии цитохрома С.УР2О6 может быть использовано для определения изменённого метаболизма кодеина (см., например, 8. Н. 8шбгир апб К. Вгокеп. 1995. Тке ркагтасодепейск оГ собеше куроа1дек1а. Ркагтасодепейск 5 (6): 335-46; О. Могйтег, К. Регккоп, М. О. Ьабопа, Ό. 8ра1бшд, и.М. Ζапде^, и. А. Меуег, апб А.Вапе. 1990. Ро1утогрЫс Гогтайоп оГ тогрЫпе Ггот собете т роог апб ех!епкйе те1аЬоКхегк оГ бехйотеШогркап: ге1а!юпкЫр !о !ке ргекепсе оГ 1ттипо1бепШ1еб су!оскготеР-4501ГО1. С1ш Ркагтасо1 Ткег 47(1): 27-35).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих цитохром СУР2С9. Цитохром СУР2С9 может метаболизировать варфарин, который используется в качестве антикоагулянта (см., например, О. Р. Айка1, С. Р. Оау, Р. б. Кек!еуеп, апб А. К. Эа1у. 1999. Аккос1а!юп оГ ро1утогрЫктк т !ке су!оскготе Р450 СУР2С9 \\йк \хагГапп боке гес.|ийетеп1 апб пкк оГ Ыеебтд сотрйсайопк. Ьапсе! 353 (9154): 717-9; В. ЬоеЬк!еш, Н. УопаШ, Ό. Ре1ед, 8. А1тод, М. Во!епЬегд, А. ЬиЬе!кку, б. Войе1тап, Ό. Нага!к, Н.На1кш, апб Ό. Ехга. 2001. 1п!егшб1У1биа1 уапаЬййу т кепккйку !о \\'агГапп-№11иге ог пийиге? С1ш Ркагтасо1 Ткег 70 (2): 159-64).

Цитохром СУР2С9 может также метаболизировать фенитуан, который используется для лечения мозговых нарушений (см., например, б. уап бег №е1бе, Ь. 8. 8!еупк, М. б. уап №ее1беп, апб К. бе Наап. 2001. Тке еГГес! оГ депейс ро1утогрккт оГ су!оскготе Р450 СУР2С9 оп ркепу!ош боке гес.|ийетеп1. Ркагтасодепейск 11 (4): 287-91; В. Вгапбо1еке, М. О. 8согбо, Е. 8рта, М. Оике11а, апб В. Рабйш. 2001. 8еуеге ркепу!ош ш!ох1сайоп ш а киЬ_)ес! котохудоик Гог СУР2С9*3. С1т Ркагтасо1 Ткег 70 (4): 391-4).

Кроме того, цитохром СУР2С9 может метаболизировать омепразол, который используется для лечения кислотно-рефлюксной болезни (см., например, б. Ό. Вайап, Ν. 8иккоуа, б. №. Наттк, б. Нетей, Ь. Р1ск1е, б. А. Оо1бк!е1п, В. Ь. №оок1еу, апб Ό. А. Е1осккай. 1995. Тке кубгоху1а!юп оГ отергахо1е согге1а!ек \\йк 8-теркепу!ош те!аЬоккт: а рори1а!юп к!ибу. С1тРкагтасо1 Ткег 57 (6): 662-9; О. ТуЬппд, У. Вой1дег, б. №1беп, апб Ь. ВегШккоп. 1997. Епапйоке1есйуе кубгоху1айоп оГ отергахо1е са1а1ухеб Ьу-СУР2С19 т 8тебкк текйе киЬ_)ес!к. С1т Ркагтасо1 Ткег 62 (2): 129-37).

В следующем варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих дигидропиримидин дегидрогеназу. Дигидропиримидин дегидрогеназа может метаболизировать флуороурацил, который используется для лечения неопластических заболеваний (лечение различных видов рака) (см. М. Тисктап, б. 8. 8!оеске1ег, Ό. Т. К1апд, В. Е. ОПеа, М. Ь. Ватпагаше, апб В. Ь. Мйкш. 1985. Еат1ка1 руйт1бтет1а апб руйт1бтшга аккоаа!еб \\Лк кеуеге Диогоигасй !охюйу. Ν Епд1 б Меб 313(4): 245-9; В. В. П1акю, Т. Ь. Веауегк, апб б. Т. Сагреп!ег. 1988. ЕатШа1 беДтепсу оГ б1кубгоруйт1бте бекубгодепаке. В1оскетка1 Ьакк Гог ГатШа1 руйт1бтет1а апб кеуеге 5-Диогоигасй-тбисеб !охюйу. б Скп 1пуек! 81(1):47-51).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих бутирилхолинэстеразу.

Бутирилхолинэстераза может метаболизировать сукцинилхолин, который используется в качестве мышечного релаксанта (см., например, Ьоскйбде, О. 1990. ОепеДс уапап!к оГ китап кегитско1шек!егаке 1пДиепсе те!аЬойкт оГ 1ке тикс1е ге1ахап!киссту1ско1ше. Ркагтасо1 Ткег 47(1): 35-60; апб Е. Серра, 8.О1беппе, А. Венок, Е. Еоп!ап, апб Р. Вита!. 2002. Вар1б 1бепйДсаДоп оГ а1ур1са1 уапап! оГ р1актаЬи!угу1скокпек!егаке Ьу РСВ. Скп Скет ЬаЬ Меб 40 (8): 799-801).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих Ν-ацетилтрансферазу 2. Ν-Ацетилтрансфераза 2 может метаболизировать изониазид, который используется для лечения туберкулеза (см., например, У. Еиге!, У. Веск!е1, С. Ье Оие11ес, Р. В. Веск!е1, Е. АийекЬеса, апб О. РакИаиб. 2002. С11тса1 ге1еуапсе оГ N-асеΐу1!^апκГе^аκе 1уре 2 ^АТ2) депейс ро1утогрккт, Ткегар1е 57 (5):427-31; Т. Кйа, У. Ташда^ага, 8. СЫка/а^а, Н. На!апака, Т. 8акаеба, Е. Котаба, 8. Закате, апб К. Окитига. 2001. ΝАсе!укгапкГегаке2 депо!уре согге1а!еб \\Лк коша/|б асе!у1айоп ш барапеке !иЬегси1оик райеп!к. Вю1 Ркагт Ви11 24 (5): 544-9; апб Нйа!кика, М. 2002. Пеуе1ортеп! оГ к1тркДеб апб гар1б бе!есйоп аккау Гог депейс ро1утогркктк 1пДиепс1пд бгид гекропке апб йк сйшса1 аррйсайопк. Уакидаки Ζη^Ηι 122 (7): 451-63).

Ν-Ацетилтрансфераза 2 может также метаболизировать гидралазин, который используется для лечения антигипертензии (см., например, б. А. Т1тЬге11, 8. б. Наг1апб, апб V. ЕассЫш. 1980. Ро1утогрк1с

- 33 009302 асе1у1аОопоГ куйгакШпе. Скп кНаппа^ Ткег 28 (3):350-5; и Ρ. 2ксЫекскапд, Р. Шере, Е.СготЫса-Ше, I. ВооРк, апй I. СаксогЬР 2002. Ьаск оГ аккоаайоп ЬеРиееп агу1атте N-асеΐу1Р^аηкРе^аке 2 (NΑТ2) ро1утогрЫкт апй кукРетк 1ирик егуРкетаРокик. Ρка^тасодеπеΐ^ск 12 (7): 559-63).

Ν-Ацетилтрансфераза 2 может метаболизировать прокаинамид, который используется для лечения аритмии (см., например, М. М. Ве1йепЬегд, Ό. Е. Огауег, М. Ьеуу, апй Н. ХУагпег. 1975. Го/утогрЫс асеРу1айоп рго-сашат1йе ш тап. С1ш Ρкз^тзсо1 Ткег 17 (6): 722-30; апй Ό. Шсктап, 1. В. Ρа1атаηйа, 1. Ό. *Ипай1саР, апй Е. 81т. 1995. Епгуте ктейс ргорегйек оГ китап гесотЬтапР агу1атте Ν-асерукгапкГегаке 2 а11оРур1с уапапРк ехргеккей ίπ ЕкскепсЫа сок. Вюскет ΡΙμ^ι^ 50(5):697-703).

В другом аспекте аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих уридин дифосфатглюкуронозилтрансферазу 1А1. Уридин дифосфат-глюкуронозилтрансфераза 1А1 может также метаболизировать иринотекан, который используется для лечения рака прямой кишки (см., например, Ь. 1уег, Ό. На11, 8. Ьзк, М. Α. МогРе11, 1. Ват11^, 8. К1т, Α. Όί В1ешо, апй М. 1. ВаРат. 1999. Ρкеπоΐуре-деπоΐуре согге1аРюп оГ т у1Рго 8Ν-38 (асР1уе теРаЬокРе оГ шпоРесап) апй ЬШгиЬт дЫсигоЫйаРюп ш китап куег Рккие мкШСТШ рготоРег ро1утогрЫкт. С1т ΡΙμ^ι^ Ткег 65 (5): 576-82; Υ. Απйо, Н. 8ака, С. Α^ί, 8. 8идшга, К. 8к1токаРа, апй Т. КатаРакР 1998. υСТ1Α1 депоРурек апй дЫсигоЫйаРюп оГ 8Ν-38, Рке асйуе теРаЬокРе оГ шпоРесап. Απη Опсо1 9 (8):845-7).

Уридин дифосфат-глюкуронозилтрансфераза 1А1 может также метаболизировать билирубин, который используется для лечения синдрома Гилберта, мягкого нарушения печени (см., например, Ρ. 1. Вокта, 1. В. Скоийкигу, С. Ваккег, 8. СапР1а, Α. йе Воег, В. Α. ОокРга, Ό. ЬтйкоиР, С. Ν. ТуРдаР, Ρ. Ь. 1апкеп, В. Ρ. ОийеЕРГеппк, апй еР а1. 1995. Тке депейс ЬакЫ оГ Рке гейисей ехргеккюп оГ Ь^кшЬ^πυ^Ρ- д1исигопокукгапкРегаке 1 ш СйЬей'к купйготе. Ν Епд1 I Мей 333 (18): 1171-5; Υ. Н. К1т, I. Е. Υеоπ, С. М. ктд, Н. I. К1т, I. 8. К1т, К. 8. Вуип, Υ. Т. Вак, апй С. Н. Ьее. 2002. Α кРийу оГ ро1утогрЫкт ш υΌΡд1исигопоку1РгапкГегаке 1 (υСТ-1Α1) рготоРег депе ш Когеап раР1епРк У11к СйЬей'к купйготе. Таекап Кап Наккое СЫ 8 (2): 132-8).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих тиопурин 8-метилтрансферазу. Тиопурин 8-метилтрансфераза может метаболизировать меркаптопурин, который используется для лечения болезни Крона (см., например, УетккйЬоит, В. М. 1992. МеРку1аРюп ркаттасодепейск: РЫорилпе теРкуЙгапкГегаке ак а тойе1 кукРет. ХепоЫоРса 22 (9-10): 1055-71; апй Α. Уеппегко1т, I. .Токапккоп, Α. Υ. Макке1е, М. Ьапйе, С. Α™, Υ. Αйеп-ΑЬй^, М. Ь. ЬакР М. 1пде1тап-8ипйЬегд, Ь. ВегШккоп, апй Ь. Ь. СикРаРккоп. 1999. Эесгеакей сарасйу Рог йеЬпкос.|ите теРаЬоккт атопд Ь1аск ТашаЫапк: апа1укек оГ Рке ί.ΎΡ2Ό6 депоРуре апй ркепоРуре. Ρка^тасодепеР^сκ 9 (6): 707-14).

Тиопурин 8-метилтрансфераза может также метаболизировать азатиоприн, который также используется для лечения болезни Крона (см., например, В. А. Каккак, Е. Ьошк, и. НтйогГ, Е. 8скаеРРе1е^, 1. ОеПапйге, Р. Сгаер1ег, К. 8скт1еде1ои, М. Сгедог, и. М. 2апдег, М. Е1ске1Ьаит, апй М. 8скизЬ. 2003. 8аГе РгеаРтепР оГ РЫоригте 8-11^111)-111311^13^ йейтепР Сгокп'к йкеаке раР1епРк У11к гшйЫорппе. СиР 52 (1): 1402; апй С. А. Магга, 1. М. Екйайе, апй Α. Н. ΑιτΝ. 2002. Ρ^асР^са1 Ρка^тасодепеΐ^ск: Тке СокР ЕГГескуепекк оГ 8сгеешпд Гог ТЫоригте к-МеРкуШ^^еике Ρо1уто^рк^ктк т Ρаΐ^епРк уПк ВкеитаРо1од1са1 Сопййюпк ТгеаРей У11к ΑζаРк^ор^^пе. 1 ВкеитаРо1 29 (12): 2507-12).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения последовательностей или фрагментов последовательностей, кодирующих катехол О-метилтрансферазу. Катехол Ометилтрансфераза может метаболизировать леводопу, которая используется для лечения болезни Паркинсона (см., например, Ό. К. ВеШу, Ь. В1уега-Сакткт, апй Ό. Уап Ьуке. 1980. СаРеско1-ОтеРку1РгапкГегаке асР1УЙу: а йеРегттапР оГ 1еуойора гекропке. Скп Ρкз^тзсо1 Ткег 28 (2): 278-86; апй А. Уеппегко1т, I. Рокапккоп, Α. Υ. Макке1е, М. Ьапйе, С. Α1ι, Υ. Αйеп-ΑЬй^, М. Ь. ЬакР М. 1пде1тап8ипйЬегд, Ь. ВегШккоп, апй Ь. Ь. СикРаГккоп. 1999. Ьесгеакей сарасйу Гог йекикосцппе теРаЬоккт атопд Ь1аск Ташатапк: апа1укек оГ Рке ΡΥΡ2Ό6 депоРуре апй ркепоРуре. Ρка^тасодепеР^сκ 9 (6): 707-14).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения генетического полиморфизма, связанного с устойчивостью к лекарствам. В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения АСЕ-полиморфизма, который может влиять на ответ АСЕ-ингибиторного антигипертензива, используемого для лечения сердечной недостаточности (см., например, Ρ. РасоЬкеп, К. Воккшд, Ρ. Воккшд, Ь.Татпои, С. Ма11еР, О. Ρо^^^е^, Р. СатЬ1еп, апй Н. Н. Ρατνί^. 1998. Αпд^оРепк^п сопуегйпд еηζуте депе ро1утогрЫкт апй ΑСЕ 1пЫЬШоп т й1аЬеР1с перкгораРку. К1йпеу ЫР 53 (4): 1002-6; М. Кокпо, К. Уококзиз, М. Мшат, Н. Капо, К. УакипагР Т. НапеЫга, апй 1. УокЫкаиа. 1999. Ακκос^аΐ^оπ ЬеРиееп апдюРепкш-сопуегйпд еηζуте депе ро1утогрЫктк апй гедгеккюп оГ 1еГР уепРпси1аг курейгорку ш раР1епРк РгеаРей укк апдюРепкт-сопуейшд еηζуте 1пк1Ьйогк. Αι ί Мей 106 (5): 544-9).

АСЕ-полиморфизм может также влиять на ответ флувастатину, используемому для лечения коронарного атеросклероза (см., например, Α. Ь Мапап, Р. 81^111 Ь. Регкс, 1. К. Эипп, Α. М. Сойо, апй С. М. Ва11апРупе. 2000. киегасиопк ЬеРиееп апдюРепктй сопуегйпд еηζуте ткейюп/йе1ейоп ро1утогрЫкт апй гекропке оГ р1акта Пртйк апй согопагу аРкегокс1егок1к Ро РгеаРтепР \уШ1 РРиуакРаРш: Рке кроргоРеш апй согопагу

- 34 009302 а!бегокс1егок1к к!ибу. I Ат Со11 Сагбю1 35(1): 89-95; Υ. Вокке, М. С. VоЫ, М. Оитои!, М. Вгосби, I. Вегдегои, I. Р. Пекргек, аиб Э.Ргиб'Нотте. 2002. ШЗиеисе оГ Ле аидюйикт-соиуейтд еи/уте деие ткегбои/беккои ро1утогрбкт ои брорго!еЛЛр1б гекроике 1одетПЬгохП. С1ш Сеие! 62(1): 45-52).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения полиморфизма арахидонат 5-липоксигеназы, который может влиять на ответ лейкотриеновых ингибиторов, используемых в качестве противовоспатилельного средства (см., например, 8. I. ЕоМег, I. Р. На11, А. М. ЛПкои, А. Р. Лбеабеу, аиб В. I. Ыр^огЛ. 2002.5-Ырохудеиаке ро1утогрбкт аиб 1и у1уо гекроике !о 1еико!-йеие гесер!ог аи!адошк!к. Еиг I Сби Рбагтасо1 58 (3): 187-90; аиб Т. Кокбто, 8. Такаио, 8. Кбаш, Ν. ОбкЫта, Υ. 8аио, Т. ТакакЫ, К. Н1га1, К. Υатато!о, аиб Υ. Могба. 1999. №уе1 ро1утогрбкт оГ Ле 5-11рохудеиаке асбуабид рго!ет (ЕЬАР) ргото!ег деие аккос1а!еб \νίΛ акЛта. Мо1 Се11 Вю1 Кек Соттии 2(1): 32-5).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения полиморфизма β2адренергического рецептора, который может влиять на ответ в2-агонистов, используемых для лечения астмы и лёгочных заболеваний (см., например, Ыддеб, 8. В. 2000. Ье!а(2)-абгеиегд1с гесер!огрбагтасодеиебск. Ат I Кекр1г Сгб Саге Меб 161 (3 Р! 2): 8197-201; V. Окбу, С. С. 8оГо^ога, Н. С. Х1е, К. В. К1т, Ό. Л.Вугие, С. М. 8!ет, аиб А. I. Лооб.2001. Тбе еГГес! оГ соттои ро1утогрбктк оГ !бе Ье!а2-абгеиегд1с гесер!ог ои адошк!-теб1а!еб уакси1аг бекеийб/абои. Ν Еид1 I Меб 345 (14): 1030-5).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма В2 рецептора брадикинина, который может влиять на ответ АСЕ-рецептора, используемого для лечения сердечной недостаточности (см., например, 8. Микае, 8. Аок1, 8. 1!об, Т. 1^а!а, Н. Иеба, аиб Т. Ка!адш. 2000. ВгабукшЛ В (2) гесер!ог деие ро1утогрбкт к аккоаа!еб тЛ аид1о!еикт-соиуегбид еихуте шЛЬбогге1а!еб соидб. Нурепеикюи 36 (1): 127-31; 8. Микае, 8. 1!об, 8. Аок1, Т. 1^а!а, К. №кбю, К. 8а!о, аиб Т. Ка!адт. 2002. Аккотабои оГ ро1утогрбктк оГ !бе геши-аидюйикт кук!ет аиб ЬгабуЛши В2 гесер!ог \νίΛ АСЕ- тЫЫог-гекаеб соидб. I Нит Нурейеик 16 (12): 857-63).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения полиморфизма дофаминовых рецепторов (Ό2, Ό3, Ό4), которые могут влиять на ответ нейролептикам (см., например, М. I. Аттат, I. Мишо, I. В1гкеб, А. Во1оииа, Ό. Маисата, М. 8обб1, К. Р. Ьексб, I. Е. Меуег, Р. 8бат, Ό. А. Со1бег, К. М. Миггау, аиб К. Л. Кег\\Л. 2000. Рбагтасодеиебс ргебкбои оГ с1о/арб1е гекроике. Ьаисе! 355 (9215): 1615-6;1 V. 8. Вакбе, М. МакеШк, Е. Вабй, А. Ό. Ра!егкои, Н. Υ. МеИ/ет, I. А. ЫеЬегтаи, 8. С. Рокт, Е. Масс1агб1, аиб I. Ь. Кеииебу. 1999. Аккоаабои оГ !бе Мкс1 ро1утогрбкт оГ Ле боратте Ό3 гесер!ог деие \\Й1 !агб1уе букктейа т ксЫ/орбгешаЛеигоркусборбагтасоЛду 21(1): 17-27).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма эстрогенового рецептора-α, который может влиять на ответ конъюгированным эстрогенам и используется в гормонзамещающей терапии во время менопаузы, остеопороза (см., например, Ό. М. Негйид!ои, Т. Ό. Но^агб, С. А. На^ктк, Ό. М. КеЬоиккЛ I. Хи, 8. Ь. 2беид, К. В. Вгокшбаи, Ό. А. Меуегк, аиб Е. К. В1еескег. 2002. Екбодеи- гесер!ог ро1утогрбктк аиб еГГес!к оГ екбодеи гер1асетеи! ои Ыдб-беикбу брорго!ет сбо1ек!его1 т теотеи \νίΛ согоиагу бкеаке. Ν Еид1 I Меб 346 (13): 967-74; В. ОидрИрбаббаиакЛ, 8. СбаиргакейуоЛт, Р. Рауабки1, 8. 8. Тиид, Ν. Р1акеи, Ь. Сбабигкб, 8. Сбаикшкат, С. Риауба1, аиб К. Ка]а!аиаут. 2000. Оек!годеи-гесер!ог-а1рба деие ро1утогрбкт айеск гекроике ш Ьоие ттега1 беикбу !о оек!годеи ш рок!-теиораика1 теотеи. С1т Еибосйио1 (ОхГ) 52 (5): 581-5).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма гликопротеиновой субъединицы 111а гликопротеина 11Ь/111а, который может влиять на ответ аспирину или ингибиторам гликопротеина 11Ь/111а, используемым для лечения инфаркта миокарда (см., например,

А. Ό. М1сбе1кои, М. I. Еигтаи, Р. Со1бксбт1б!-С1егтои!, М. А. МаксеШ, С. Неибйх, Ь. Со1етаи, I. Натбид!ои, М. К. Вагиагб, Т. К1ск1ег, Ό. I. Сбйкбе, 8. Кииби, аиб Р. Е. Вгау. 2000. Р1а!е1е! СР11-1аР1 (А) ро1утогрбктк бкр1ау бШегеи! кеикб1уб1ек !о адошк!к. С1гси1айои 101 (9): 1013-8; С. Аибйоб, Р. Мти/, Р. 8о1его, 8. РтсеШ, К. Ойо1ат, 8. Ьикйдиоб, аиб Р. Ве11аубе. 2000. ОеГесбуе р1а!е1е! гекроике !о агасЫбошс ааб аиб ЛготЬохаие А (2) ш киЬ_)ес!к \\Й1Р1 (А2) ро1утогрбкт оГ Ье!а (3) киЬиш! (д1усорго!ет 111а). Вг I Наета!о1 110 (4): 911-8).

В следующем варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма транспортера серотонина (5-гидрокситриптамина), который может влиять на ответ антидепрессантам, используемым при лечении болезни Альцгеймера и депрессии (см., например, Ό. К. К1т, 8. Л. Ыт, 8. Ьее, 8. Е. 8оби, 8. К1т,С. С. Наби, аиб В. I. Сагго11. 2000. 8его!оши йаикройег деие ро1утогрбкт аиб аиббергеккаи! гекроике. №игогерой 11(1): 215-9; аиб Е. 8тега1б1, К. Ζаηа^б^, Е. ВеиебеЛ, Ό. Όί Ве11а, I. Регех, аиб М. Са!а1аио. 1998. Ро1утогрбкт \νίΛίπ !бе ргото!ег оГ Ле кего!оши йаикройег деие аиб аиббергеккаи! еГйсасу оГ Виуохатте. Мо1 РкусЫайу 3 (6): 508-11).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма аддуцина, который может влиять на ответ диуретикам, используемым для лечения инфаркта миокарда и гипертонии (см., например, М. Т. 8с1аггоие, Р. 8!е11а, С. Вайаккта, Р. МаииЛа, С. Ьаи/аш, С. В1аисб1, аиб Ό. Сикк 2003. АСЕ аиб а1рба-аббист ро1утогрбкт ак тагкегк оГ тб1У1биа1 гекроике !о бшгебс Легару. Нурепеикюи 41 (3): 398-403; В. М. Рка!у, Ν. Ь. 8тбб, 8. К. НескЬей, Н. Ь. Уок, К. Ν. Ьетабге, А. Р. Кетег,

- 35 009302

й. З. Збзсохбск. ί. Вбз, Т. Йит1еу, V. Т. Ьопдзкгекб, 1г., апб Р. В. Возепбаа1. 2002. йбигебс кбегару, ббе а1рбааббисбп депе хагбапк апб ббе гбзк оГ туосагбба1 бпГагсПоп ог зкгоке т регзопз убкб кгеакеб бурейепзюп. бата 287 (13): 1680-9).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма аполипопротеина Е (АРОЕ), который может влиять на ответ статинам, используемым для лечения коронарной артериальной болезни, холестерола, атеросклероза (см., например, 1. М. Огбохаз, ί. борехМпапба, Р. Регех-йтепе/. С. Вобпдиех, ί. З. Рагк, Т. Со1е, апб Ε. ί. ЗсбаеГег. 1995. БСГеск оГ ароНроргокет Ε апб Α-ΐν рбепобурез оп кбе 1оу бепзббу Нроргобебп гезропзе ко НМ6 ΡοΑ гебисбазе шббЬбког Легару. ΑΛе^озс1е^оз^з 113 (2): 157-66; Ь. и. 6егбез, С. 6егбез, К. Кегхбпеп. М. Захо1а^иеи, I. С. К1аизеп, Р. З. Напзеп, Υ. Α. Кезапбетб, апб О. Раегдетап. 2000. Тбе аройроргокебп ерзПоп 4 а11е1е бекегттез ргодпозбз апб Ле еГГеск оп ргодпозбз оГ збтхазкакбп ш зшугхогз оГ туосагЛа1 бпГагсПоп: а зиЬзкибу оГ Ле Зсапббпахбап збтхазбаббп зигхгха1 зкибу. Сбгси1а1боп101 (12): 1366-71).

АРОЕ-полиморфизм может влиять также на ответ такрину, используемому для лечения болезни Альцгеймера (см., например, 1. Робгбег, М. С. ОеНз1е, В. Оибгбоп. I. Αι,^γΙ. М. Раг1оу, Ό. йаббгб. З. Нш, Р. ВеПгапб. ί. №1Ьапкод1и, В. М. 6б1йх, апб ек а1. 1995. Αро1^рор^оке^и Ε4 а11е1е аз а ргеббсЮг оГ сбобпегдбс бейсбкз апб йеактепк оиксоте т Α1ζ1κ6ιικγ ббзеазе. Ргос№б1 Αсаб Зсб и З Α 92 (26): 12260-4). Робгбег. ί. 1999. Αро1^рор^оке^п Ε: а рбагтасодепекбс кагдек Гог кбе кгеабтепк оГ Α1ζбе^те^'з ббзеазе. Мо1 йбадп 4 (4): 335-41; Н. Зобшпеп, О. Козипеп, З. Не1бза1тб, Α. Маппегтаа, Й. РаЦагхб. З. Табазпбетб, М. Вуупапеп, апб Р. Вбеккбпеп. Зг. 1995. Α зехеге 1озз оГ сбобпеасе1уНгапзГегазе ш Ле Ггоп1а1 согбех оГ Α1ζбе^те^ райепкз саггутд ароНроргобебп ерзйоп 4 а11е1е. №игозсб Ьей 187 (2): 79-82).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма Нб-Α. который может влиять на ответ абакавиру, используемому в качестве противовирусного средства и при лечении ВИЧ (см., например, З. Ма11а1, Ό. №1ап. С. νίΙΙ, 6. Мазе1, Α. М. Магббп, С. Мооге, Ό. Зауег, Α. Сазйеу, С. Матокке, Ό. Махуе11, I. батез, апб Р. Т.Сбпзбапзеп. 2002. Αззос^айои Ьебуееп ргезепсе оГ Нб-Α- В*5701, ΒΡΑ-ΌΡ?. апб ΒΕ·Α-ϋΟ3 апб бурегзепз111х1(у ко НТ^ 1 гехегзе-йапзспрйзе шббЬбког аЬасахбг. йапсек 359 (9308): 727-32; апб З. НеЛегбпдЮп. Α. В. Нидбез, М. Мозке11ег, Ό. Збойбпо, К. Ь. Вакег, V. Зргееп. Ε. йаб. К. йахбез. Α. Напб1еу, Ό. ί. йохх. М. Ε. Ебпд. М. Зкосит, С Воутап. й. М. Тбигтопб. апб Α. Ό. Возез. 2002. 6еиек^с хагбаБопз бп ΒΕ-Α-В гедбоп апб бурегзепзбббхббу геаскбопз ко аЬасахбг. йапсек 359 (9312): 1121-2).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма холестерол-эфир транспортирующего протеина (СЕТР), который может влиять на ответ статинам, используемым для лечения коронарной артериальной болезни, холестерола, атеросклероза (см., например, б. Α. Кибхепбохеп. ί. V. Шкета, Α. Н. Ζу^ибе^таи, Р. беКпб)ГГ. В. МсРбегзоп, Α. V. Вгизсбке, К. I. йбе. апб ί. б.Каз1е1ебп. 1998. Тбе го1е оГ а соттоп хагбап! оГ Ле сбо1езкегу1 езкег йапзГег ргокет депе т Ле ргодгеззбоп оГ согопагу аЛегозс1егозбз. Тбе Ведгеззбоп 6гоуЛ З1а1бп Зкибу 6гоир. Ν Επ§1 ί Меб338 (2):

86-93; Р. Витр, В. Р. Мепзбпк. апб 6. Ногпзйа. 2002. бпбегасббоп Ьебуееп а соттоп хагбап! оГ Ле сбо1езкегу1 езкег йапзГег ргокет депе апб Ле аройроргокебп Ε ро1утогрб1зт: еГГескз оп р1азта 1брббз апб йроргокебпз т а собой оГ 7-уеаг-о1б сбб1бгеп. ΝΛγ МекаЬ Сагббохазс йбз 12 (6): 317-24; апб Р. V. хап Vеп^оо^^, В. Р. Зко1к, ί. ϋ. Вапда, Т. Р. Зцтопзта. Α. хап То1, Ό. V.Ε^ке1еиз, апб 6. М. Йа11бпда-Тббе. 2003. Соттоп сбо1езкегу1 езкег йапзГег ргокет депе ро1утогрб1зтз апб кбе еГГеск оГ аЮгхазбЛп кбегару т 1уре 2 ббаЬекез. ВбаЬекез Саге 26(4): 1216-23).

В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма, связанного с ионным каналом, который может влиять на ответ эритромицину, антибиотику, используемому для лечения бактериальных инфекций (см., например, Р. Зезй, 6. V. ΑЬЬой, б. Vе^, К. Т. Миггау, З. Закзепа, Р. б. ЗсбуагЛ, З. 6. Ргбогб, Ό. М. Вобеп, Α. й. 6еогде, бг., апб З. Α. 6о1бзкебп. 2000. Α соттоп ро1утогрб1зт аззосбакеб убЛ аийЬ^ок^с-^ибисеб сагббас аггбукбтба. Ргос №111 Αсаб Зсб и З Α 97 (19): 10613-8; 6. V. ΑЬЬокк, Р. Зезй, йЗр1ауз1сб, М. Ε. Виск, М. Н. йебтапп, К. V. Тбтокбу, М. Т. Кеактд, апб З. Α. 6о1бз1ебп. 1999. М1ВР1 ГогтзбКг роказзшт сбаппе1з убкб №В6 апб бз аззосбакеб убкб сагббас аггбуЛтба. Се11 97 (2): 175-87).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма метилгуанин метилтрансферазы, который может влиять на ответ кармустину, используемому для лечения глиомы (см., например, М. Εзке11е^, б. 6агсба-Ропсб11аз, Ε. Αиб^ои, З. Ν. 6ообтап, О. Р. Нбба1до, V. Vаиас1осба, З. В. Вау1бп, апб й 6. Негтап. 2000. бпасБхабоп оГ кбе ΌΝΑ-герабг депе М6МТ апб кбе с1бпбса1 гезропзе оГ дйотаз ко а1ку1айпд адепкз. Ν йп§1 б Меб 343 (19): 1350-4; 6егзоп, З. й. 2002. С1бпбса1 ге1ехапсе оГ М6МТ т Ле кгеабтепк оГ сапсег. б Сбп Опсо1 20 (9): 2388-99).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения полиморфизма Паркина, который может влиять на ответ леводопе, используемой для лечения паркинсоновской болезни (см., например, С. В. йисктд, Α. йпгг. V. ВопбГакб, й Vаидбаи, 6. Йе Мбсбе1е, Т. 6аззег, В. З. Нагбапдб, 6. Месо, Р. йепеПе. Ν. V. Vооб, Υ. Α§ι6. апб Α. Вгбсе. 2000. Αззос^айои Ьебуееп еаг1у-опзек Рагкбпзоп'з ббзеазе апб тибакбопз бп Ле рагкбп депе. Ргепсб Рагкбпзоп'з йбзеазе 6епейсз Зкибу 6гоир. Ν йп§1 б Меб 342 (21): 1560-7; V. ВопбГакб, 6. Йе Мбсбе1е, С. В. йпскбпд. Α. йигг, Ε. РаЬ^^ζ^о, 6. ΑтЬ^оз^о, Ν. Vапасо^е, М. Йе Магб, В. Магсопб, й. Сариз, М. М. Вгеке1ег, Т. 6аззег, В. Оозкга, Ν. Vооб, Υ. Α§ι6. Α. Рб11а, 6. Месо, апб

- 36 009302

Α. Впсе. 2001. ТЬе рагкш депе апб йк рЬепо(уре. Иайап ΡΌ Сепейск 8(ибу Сгоир, РгепсЬ ΡΌ Сепейск 8(ибу Сгоир апб Не Еигореап Сопкойшт оп Сепейс 8иксерйЬййу т Ρа^к^ηкоη'к Океаке. №иго1 8а 22(1): 51-2).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для обнаружения полиморфизма протромбина и фактора V, который может влиять на ответ оральным контрацептивам и указывать на потенциальный риск развития тромбоза (см., например, 1. Таккш, Α. Эигг, Α. М. ВоппеЕ К. Сй, М. V^байЬеΐ, С.

В. Ьискшд, 1. У. Соак, Р. ОшН, М. ΑЬаба, В. ЕсЬеппе, 1. Мойе, Α. Ьадиепу, Ь. ЬасотЫех, Ρ. 1ебупак, В. Ваййо1оте, У. Αд^б, апб Α. Впсе. 2000. Ьеуобора-гекропкке букЮша. СΤΡ сус1оЬубго1аке I ог рагкт ти(айопк? Вгат 123 (Ρ( 6):1112-21; I. МагйпеШ, Е. 8ассЫ, С. Ьапб1, Е. Таюй, Р. Писа, апб Ρ. М. Мапписа. 1998. Н1дЬ гкк оГ сегеЬга1-ует ИотЬокк т сатегк оГ а ргоИотЬт-депе ти^айоп апб ш икегк оГ ога1 сопДасерйуек. Ν Епд1 1 Меб 338 (25): 1793-7; апб I. МагйпеШ, Е. Таюй, Ρ. ВисаагеШ, 8. ΑкЬаνаη, апб Ρ. М. Мапписа. 1999. Шегасйоп Ье(теееп ΗеС20210Α ти^айоп оГ Не ргоНготЫп депе апб ога1 сопйасерйуе ике т беер ует (ЬготЬокк. ΑΓ^παδο^Γ ТЬготЬ Vаке Вю1 19 (3): 700-3).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть также сконструированы для обнаружения полиморфизма стромелизина-1, который может влиять на ответ статину, используемому для лечения атеросклероза (см., например, С. Ьедпат, С. Ρа1а^еΐ^, С. Сиа/ха^са, В. Сокт1, В. ЬипдЫ, Р. Вегпагб, апб 8. СоссЬеп. 2002. Vеηоик ИготЬоетЬоЬкт ш уоипд теотеп; го1е оГ ИготЬорЬНс тШайопк апб ога1 соШгасерДуе ике. Еиг Неай 1 23 (12): 984-90; Ыддей, 8. В. 2000. Ье(а (2)-абгепегд1с гесер(ог рЬагтасодепейск. Αη 1 Кекр1г Сгй Саге Меб 161 (3 Ρ( 2):8197-201; 8. Е. НитрЬпек, Ь. Α. Ьиопд, Ρ. 1. Та1тиб, М. Н. Рпск, У. Α. Кекатет1, Α.Ρакΐетаск, М. К. Такктеп, апб М. 8ууаппе. 1998. ТЬе 5Α/6Α ро1утогрЫкт т (Ье ргото(ег оГ (Ьек(готе1укт-1 (ΜΜΡ-3) депе ргеб1с(к ргодгекктп оГ апдюдгарЫсайу бе(егттеб согопагу аг(егу бкеаке ш теп ш (Ье ЬОС'АТ детПЬго/П к(ибу. Ьор1б Согопагу Α^^ι^Ν Тпа1. Α(Не^окс1е^ок^к 139(1): 49-56). 8. НитрЬпек, С. Ваи1егк, Α. МейЬаедЬе, Ь. Ьиопд, М. Вегйапб, апб Ρ. Αтоиуе1. 2002. ТЬе 5Α6Α ро1утогрЫкт т (Ье ргото(ег оГ (Ье кйоте1укт-1 (ΜΜΡ3) депе ак а гкк Гас(ог Гог гейепокк. Еиг Неаг( 1 23 (9): 7215; апб М. Ρ. бе МааЕ 1. №. 1икета, 8. Υе, Α. Н. 2тетбегтап, Ρ. Н. МодЬаббат, М.Веектап, 1. 1. Как(е1еЙЕ Α. 1. уап Воуеп, Α. V. ВгиксЬке, 8. Е. НитрЬпек, С К1ий, апб Α. М. Неппеу. 1999. ЕГГес( оГ 1Ьек1готе1укт-1 ргото(ег оп еГДсасу оГ ргахак(а(т т согопагу аШегокс1егокк апб гек(епокк. Αη 1 Сагбю1 83 (6): 852-6).

К. Генетически модифицированные организмы.

Раскрытые здесь методы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие генетически модифицированных организмов (СМОк). Примеры генетически модифицированных организмов включают в себя - но не ограничиваются ими - организмы, в которых модифицированы, добавлены или делетированы один или более генов. СМОк могут характеризоваться присутствием одного или более определённых генов, отсутствием одного или более определённых генов, определённым изменением или изменённой экспрессией одного или более конкретных генов. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для комплементирования мишеневых полинуклеотидов СМОк. Присутствие и количество СМОк может быть измерено, используя методы реакции.

Ь. Неместная флора и фауна.

Раскрытые здесь методы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие и оценку неместной флоры и фауны. Организмы, которые не присущи определённому региону, присутствуют в окружающей среде и являются биологически случайными по отношению к местной флоре и фауне. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для комплементирования мишеневых полинуклеотидов неместной флоры и фауны. Присутствие и количество неместной флоры и фауны может быть измерено, используя методы реакции.

М. Применения в сельском хозяйстве.

Раскрытые здесь методы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие и оценку конкретных растений и сортов растений. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для комплементирования мишеневых полинуклеотидов конкретных растений и сортов растений. Присутствие и количество растений и сортов растений может быть измерено, используя методы реакции.

Ν. Применения в ветеринарии.

Раскрытые здесь способы, композиции и анализы могут также обеспечить быстрые и чувствительные диагностические тесты для применений в ветеринарии. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы для комплементирования мишеневых полинуклеотидов, которые соответствуют животным и характерны для инфекций или генетических болезней или нарушений.

В одном варианте осуществления способы, композиции и анализы могут быть использованы для обнаружения присутствия или инфицирования вирусом бешенства. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на ΡΕΡ обнаружения бешенства. Примеры праймеров, используемых для идентификации вируса бешенства с применением основанных на ΡΟΗ анализов, в уровне техники известны (см., например, Йо М., 1(ои Т., 8йо)| У., 8ака1 Т., Йо Р.Н., Απιί У.Т., ТакакаИ Т., Кигапе I. Оксптшайоп Ье(теееп бодге1а!еб апб уатрие Ьа(-ге1а(еб гаЫек У1гикек т Вга/П Ьу кйтп-кресШс геуегке (гапксг1р(аке-ро1утегаке сЬат геасйоп апб гекйгсйоп Ггадтеп! 1епд1Ь ро1утогрЬкт апа1укк. 1 С1т Уйо1. 2003 Αр^; 26 (3): 317-30; В1аск Е.М., Ьотетдк Ι.Ρ., 8тйй 1., Неа(оп Ρ.Ε., МсЕ1Ь1ппеу Ь.М. Α гар1б те(Ьоб (о б|ГГегепШ1(е к1х

- 37 009302 ек!аЬДкДеб депо!урек оГ гаЫек апб гаЬкк-ге1а!еб уМкек иктд ТадМап !ескио1оду. б Уно1 Ме!Добк. 2002 Аид; 105(1): 25-35; Раузб Ό., ΥакоЬкоп В., Ко!епЬегд Ό., Руегек Ν., Раузбкоп I., 8!гат Υ. КаЫек уник бе!есДоп Ьу КТ-ДСК 1п бесотрокеб па!ига11у Д1Гес1еб Ьгатк. Vе! МкгоЫо1. 2002 бип 20; 87 (2): 111-8; Ио М., Дои Т., 8ака1 Т., 8ап!ок М.Р., Ага1 Υ.Ί’., Такакак Т., Кигапе I., Ио Р.Н. Ре!есДоп оГ гаЫек у1тк ЖА 1ко1а!еб Ггот кеуега1 крескк оГ ашта1к т ВгахП Ьу КТ-БСК, б Vе! Меб 8с! 2001 Рес; 63 (12): 1309-13).

В другом варианте осуществления способы, композиции и анализы могут быть использованы для обнаружения синдрома стресса свиней. Синдром стресса свиней вызывается гомозиготной или гетерозиготной мутацией (К^К-1)-гена рианодинового рецептора. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на ₽СК обнаружения синдрома стресса свиней. Примеры праймеров, используемых для идентификации синдрома стресса свиней с применением основанных на ₽СК анализов, в уровне техники известны (см., например, Ьее 8.Н., СЬо К.К., Капд 8.К., К1т С.^., ₽агк Н.С., Скоу Υ.4., СДо1 Υ.6. Ре1есДоп оГ р1дк геккйп! !о рок!-иеашпд б1аггДеаеа, оебета б1кеаке апб рогсте кНекк купбготе Ьу а11е1е-кресгДс ро1утегаке сДат геасДоп. Атт Сепе!. 2002 бип; 33 (3): 237-9, Ви Н., Ьт б., Ь1 8.Р. ТДе КΥК1 депо!уре оГ СЫпеке тЬгеб р1дк. 2Допддио Хт Ри СДопд Дап \νηί Ке 2а ΖΗί. 2000 8ер; 14(5):311-4).

Способы, композиции и анализы могут быть использованы для обнаружения заболевания гиперкалиемическим периодическим параличом (НуРР). НуРР является генетической болезнью лошадей на американских ранчо или их гибридов. По имеющимся сведениям, НуРР наследуется как кодоминантное генетическое нарушение, поскольку гомозиготы показали более тяжёлые клинические проявления болезни, чем гетерозиготы. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для обнаружения НуРР, основанного на ₽СК.

В другом варианте осуществления способы, композиции и анализы могут быть использованы для обнаружения РеСV (коронавируса кошек).

Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на ₽СК обнаружения коронавируса кошек. Примеры праймеров, используемых для идентификации коронавируса кошек с применением основанных на ₽СК анализов, в уровне техники известны (см., например, Кеппебу М., С1Дпо 8., Мс№ЬЬ А.Н., МоГГа!! А.8., Сег1х К., Каша 8. Ре1есДоп оГ ГеНпе согопауник ш сарДуе РеДбае ш !Де И8А. б Vе! Р|адп Ыуек!. 2002 Ш; 14 (6): 520-2; Абб1е Ό.Ό., багге!! О. Ике оГ а геуегке-Дапкспрйке ро1утегаке сДат геасДоп Гог топДог1пд !Де кДеббтд оГ ГеНпе согопауник Ьу ДеаИДу са!к. Vе! Кес. 2001 Мау 26; 148 (21): 649- 53; НеггеиедД А.А., МаД1ег М., НебпсД Н.6., Наадтапк В.Ь., ЕдЬе^^ик Н.Р., Ногапек М.С., Ко!Дег Ρ.6., бе Сгоо! К.б. Ρο к1к!епсе апб еуоЫНоп оГ ГеДпе согопау1гик т а с1океб са!-Ьгеебтд со1опу. Уно1оду. 1997 Аид 4; 234 (2): 34963).

В другом варианте осуществления способы, композиции и анализы могут быть использованы для обнаружения присутствия или инфицирования РГО-вирусом, мутантом повсеместно распространенного кишечного коронавируса кошек (РЕСУ). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на Ρ0Ρ. обнаружения РШ-вируса. Примеры праймеров, используемых для идентификации РШ-вируса с применением основанных на ΡΟΗ анализов, в уровне техники известны (см., например, Сипп-Мооге Р.А., СгиРГубб-бопек Т.6., НагЬоиг Р.А. Ре1есДоп оГ ГеДпе согопауникек Ьу си1!иге апб геуегке Дапкспр1аке-ро1утегаке сДат геасДоп оГ Ь1ооб катр1ек Ггот ДеаИДу са!к апб са!к иДД сДшса1 ГеНпе МесДоик реп!ошДк. Уе! МкгоЫо1. 1998 би1; 62 (3): 193-205; Кеппебу М., Воебекег Ν., С1ЬЬк Ρ., Каша 8. Ре1еНопк т !Де 7а ОКР оГ ГеНпе согопауМк аккос1а!еб иДД ап ер1бетк оГ ГеНпе шРесНоик реп!ошДк. Уе! МкгоЫо1. 2001 Аид 8; 81 (3): 22734).

Способы, композиции и анализы могут быть также использованы для обнаружения присутствия или инфицирования вирусом инфекционной анемии лошадей (ЕбАУ). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на ΡΘΡ. обнаружения Е№У. Примеры праймеров, используемых для идентификации Е№У с применением основанных на Ρ0Ρ. анализов, в уровне техники известны (см., например, Соок К.Р., Соок 8.6., Ы Р.Ь., Моп!е1аго К.С., Ике1 С.б. Реуе1ортеп1 оГ а ти1Др1ех геа1-Дте геуегке !^аикс^^р!аке-ро1утегаке сДат геасДоп Гог едшпе шРесДоик апет1а уник (Е^У). б Уно1 Ме!Добк. 2002 Аид; 105 (1): 171-9; Ьапдетекг б.Ь., Соок 8.6., Соок К.Р., КикД1ои К.Е., Моп!е1аго К.С., Ике1 С.б. Рс!ссДоп оГ едите МесДоик апет1а уна1 ^А т р1акта катр1ек Ггот гесеп!1у Д1Гес1еб апб 1опд-!егт таррагеп! сатег ашта1к Ьу Ρ№. б СДп МкгоЫо1. 1996 бип; 34 (6): 1481-7; №дага)ап М.М., 81тагб С. Ре1есНоп оГ Догкек шРес!еб па!ига11у иДД едите МесДоик апет1а у1гик Ьу пек!еб ро1утегаке сДат геасДоп. б Уно1 Ме!Добк. 2001 Мау; 94 (1-2): 97-109).

Способы, композиции и анализы могут быть также использованы для обнаружения присутствия или инфицирования Вгисе11а оук. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на Ρ0Ρ. обнаружения Вгисе11а оук. Примеры праймеров, используемых для идентификации Вгисе11а оук с применением основанных на Ρ0Ρ. анализов, в уровне техники известны (см., например, Мап1его1а Ь., Те_)егоСагсек А., Ркара1 А., 8Дорауеуа С., В1аксо 6.М., Мапп С.М., Борех-Сош I. Еуа1иаДоп оГ а ΡΘΡ. !ек! Гог !Де

- 38 009302 б1адиоз1з оГ Вгисе11а оуиз шГескои ш зетеи затр1ез Ггош гатз., 'е! МюгоЬю1. 2003 Маг 20; 92 (1-2): 65-72; Натбу М.Е., Αт^и ΑΧ Пе!ескои оГ Вгисе11а зреаез т !ке тбк оГ 1пГес!еб сай1е, зкеер, доа!з аиб сате1з Ьу РСВ. 'е! 1. 2002 Мау; 163 (3): 299-305; Впскег В.к, НаШид З.М. ПЩегеикакои оГ Вгисе11а аЬокиз Ьу. 1,2, аиб 4, Вгисе11а теШеизхз, Вгисе11а оу1з, аиб Вгисе11а зшз Ьу.1 Ьу РСВ. 1 Сйи МюгоЬю1. 1994 Гоу; 32(11): 2660-6).

Предшествующие примеры являются лишь образцами. Мишеневые полинуклеотиды могут включать в себя полинуклеотиды, соответствующие другим придающим устойчивость к антибиотикам генам, известным в уровне техники.

VIII. Наборы.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор для обнаружения мишеневых полинуклеотидов. Набор может включать в себя один или несколько реагентов, полезных для настоящего изобретения, например, красителей, аналогов нуклеиновых кислот, источников светового стимула, буферов, стандартов, используемых для контроля, реагентов-ключей, показывающих положительную и отрицательную реакцию контрольных образцов для интерпретации результатов реакции. Опционально, используется один или более буферов. Наборы могут также включать в себя подходящую упаковку соответствующих композиций, инструкции и (или) другие выборочные компоненты, как раскрыто ниже.

Α. Красители.

Обеспечиваемые здесь наборы включают в себя один или несколько красителей.

Красители могут быть обеспечены в расфасованном виде или в одном тюбике, из которого могут отбираться аликвоты.

Красители также могут быть упакованы в любую подходящую упаковку, позволяющую отделить их от других компонентов набора и облегчить расходование композиции.

B. Аналоги нуклеиновых кислот.

Наборы могут также включать в себя один или более аналогов нуклеиновых кислот.

Аналог нуклеиновой кислоты может быть любым аналогом, как описано ниже. В одном варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты представляет собой ΕΝΑ. В другом варианте осуществления аналогом нуклеиновой кислоты является ΡNΑ.

Аналог нуклеиновой кислоты может иметь любую последовательность, которая комплементарна или полностью комплементарна мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты. Последовательность может быть любой последовательностью, известной в уровне техники. В одном варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты имеет раскрываемую здесь последовательность.

Аналог нуклеиновой кислоты может быть обеспечен в любом подходящем контейнере и может быть расфасован на аликвоты в подходящих количествах или в одном тюбике, из которого потом берутся порции. Контейнер также может быть упакован в любую подходящую упаковку для отделения от других компонентов набора и облегчения расходования композиции для отмывки. В другом варианте осуществления в одной упаковке могут содержаться последовательности двух или более аналогов нуклеиновых кислот.

Наборы могут также включать в себя средство для облегчения эффективной гибридизации аналога нуклеиновой кислоты с мишеневым полинуклеотидом, таким как ДНК спермы лосося.

C. Источник светового стимула.

Набор может также, опционально, включать в себя источник светового стимула. Неограничивающие примеры источников света включают в себя Зукаша Соо1 Уббе Т8-СУ, Сеиега1 Е1есктс Т8-С50 и ΒπΙζ Αи^о^а 50/50, Зукаша би1их З9У СВ9ЭЗ/Ь1ие и ОзгатЕ9ТТ/50К.

Ό. Компоненты для манипуляций с полинуклеотидами.

Наборы могут также включать в себя компоненты, используемые для манипуляций с полинуклеотидами, такие как буферы, ферменты, колонки и другие материалы.

Буферы, ферменты, колонки и другие материалы могут включать в себя такие, которые используются для лизиса клеток или экстрагирования из клеток ДНК и РНК. Буферы, ферменты, колонки и другие материалы могут также включать в себя компоненты, используемые для манипуляций с полинуклеотидами, включая ДНК и РНК. Такие компоненты включают в себя, например, такие, которые раскрыты в Мо1еси1аг С1ошид: Α ЬаЬога!огу Маииа1, ббгб ебйои (ЗатЬгоок е! а1., 2000) Со1б Зрпид НагЬог Ргезз, или в других раскрытых здесь ссылочных документах.

Е. Инструкции.

Наборы могут также включать в себя инструкции для осуществления описываемых здесь способов. Инструкции могут быть включены в виде отдельного вложения и (или) как часть упаковки или контейнера, например, в виде этикетки, прикреплённой к контейнеру или как надпись или иное сообщение, включённое как часть контейнера. Инструкции могут информировать того, кто использует рассматриваемые способы, о применении и (или) удалении содержимого набора, предосторожностях и методах обращения с материалами, ожидаемыми результатами, предупреждениями, касающимися неправильного использования, и т. п.

Е. Дополнительные выборочные компоненты наборов.

Наборы могут также включать в себя компоненты, полезные при осуществлении раскрытых здесь

- 39 009302 способов. Примеры дополнительных компонентов включают в себя химически устойчивые мешки для отходов, трубки, растворители, перчатки, ножницы, маркеры и защитные очки.

Примеры

Следующие неограничивающие примеры служат для более полного описания способа использования описанного выше изобретения. Понятно, что эти примеры ни в коей мере не ограничивают объём этого изобретения, а представлены скорее для его иллюстрации.

Все растворы аналогов нуклеиновых кислот и готовых ДНК в нижеследующих примерах были приготовлены в 5 мМ фосфатном буфере, рН 7,5, если иначе не оговорено. Готовый краситель был приготовлен в метаноле или ЭМ8О.

Пример 1.

Системы анализа на основе жидкости для обнаружения связывания ΡΝΑ/полинуклеотида.

Образование комплекса ΡΝΑ/полинуклеотид приводило к изменению окраски индикаторного красителя. В качестве конкретного мишеневого полинуклеотида использовалась ДНК 358-просмотра вируса мозаики цветной капусты. Красителем являлся 3,3'-диэтилтиакарбоцианин.

В тестовую пробирку помещалось 15 мкМ молекул ΡΝΑ, комплементарных промотору 358 вируса мозаики цветной капусты (358ΡΝΑ) добавлялось к 5 мкМ ДНК 358-просмотра (358ΌΝΑ). ΡΝΑ имела последовательность СССΑСССΑССΑСС-^Υ8 (8Е0 ГО NО: 11), добавлялось 150 мкМ красителя в 5 мМ фосфатном буфере, рН 7,5. 358ΡΝΑ и краситель присутствовали в системе в избытке.

Изменение окраски указало на присутствие полинуклеотида.

Системы анализа на основе жидкости тестировались с использованием 1 мкл 2,5 мМ красителя, разведённого в 50 мкл общего объёма 5 мМ ΡО₄ реакционного буфера. Системы и способы были успешно протестированы при рН в интервале 4-10, однако система лучше тестировалась при рН 5. По времени нулевые реакции в интервале 4-10 рН выглядели почти идентичными одна другой, но колебания были меньше, чем для контролей, в которых отсутствовал гибрид ΡΝΑ/мишеневый полинуклеотид. После экспозиции световому стимулу реакции начинали осветляться. При дальнейшей экспозиции световому стимулу реакции с гибридом ΡΝΑ/мишеневый полинуклеотид стали совершенно прозрачными при том же самом показателе рН 6-10. В реакциях с гибридом ΡΝΑ/мишеневый полинуклеотид при рН 4-5 краситель оставался окрашенным в различные оттенки розового цвета.

Использовался ряд буферов при концентрации 10 мМ. Некоторые буферы тестированилсь при различных рН. Буферы NаΡО₄ тестировались при концентрациях до 0,5 мМ. Буферы и соли, которые приготавливались выборочно, включали в себя NаΡО₄, NаН8О₄, К₂№О₄ и Са8О₄. Буферы и соли, которые оказались неуспешными для осуществления способов, включали в себя цитрат №, №С1, СаНгГОд, Ее8О₄ и Мд8О₄. В способах может также использоваться чистая вода, 0,1% 8Ό8, 0,1% Тгйоп X, 0,1% Тюееп-20, 3% бутанол, 10% метанол, 10% изопропанол или 10% ЭМ8О, 1Х буфер лизиса клеток крови (0,15 М №Н₄С1, 10 мМ NаНСОз, 1 мМ Е^ТΑ) рН 7,4 или буфер лизиса сахарозы (0,32М кисгоке, 10 мМ Тпк, 1% Тийоп Х-100, 5 мМ МдС1₂).

Натрий-фосфатный буфер тестировался при рН 4, 5, 5,5, 6, 7, 8, 9, 10. Все другие буферы тестировались при рН 7,5. При рН 7 натрий-фосфатный буфер давал самую быструю реакцию.

Обнаруживалось 300 мишеневых полинуклеотидов на микролитр реакции. Концентрации составляли 1,5х10¹⁴ мишеневых полинуклеотидов на реакцию (3х10¹² мишеневого полинуклеотида на 1 и1 реакции); обнаруживалось также 10⁸ амплифицированных мишеневых полинуклеотидов на реакцию (2х10⁶ ампликонов мишеневого полинуклеотида на 1 и1 реакции).

Пример 2.

Определение влияния молекул ΡΝΑ на реакции ΡСВ.

Примеры показывают влияние различных молекул ΡΝΑ на реакции ΡСВ. Компонентами ΡСВ являлись следующие:

- 40 009302

Компонент

Вода

Праймер против хода транскрипции, 50 мкМ

Праймер по ходу транскрипции, 50 мкМ

М§С1₂, 25 Мм

10Х реакционный буфер (Ргошеда)

РСК-смесь нуклеотидов (Рготсда), 1 ОмМ каждого 6ΝΤΡ

Тац-ДНК-полимераза в буфере для хранения

В(Рготеда), 5 и/мкл

В8А

Объём	Конечная концентрация
38 мкл	Ν/Α
0,5 мкл	25 мкМ
0,5 мкл	25 мкМ
3 мкл	1,5 мМ
5 мкл	1 X
1 мкл	800 мкМ
0,5 мкл	5 ед/ мкл
0,5 мкл	10 мг/мл

Состав 10Х реакционного буфера:

ТГ18-НС1

КС1

100 мМ

500 мМ %

ΤπΙοη Х-100

Праймерные последовательности были следующими:

Праймер	Праймерная последовательность
01 17	5' ССТССТАСАААТСССАТСА (8Еф Ιϋ ΝΟ: 12)
01 18	5' САТАСТСС6АТ0ТСССТСА (8Εζ)ΙϋΝΟ: 13)
ΡΝΑ	5' СССАСССАСОАООААСАТС (δΕφΙϋΝΟ: 14)

Программа термальных циклов (М1 Кекеагсб РТС-200) 95° в течение 1 мин цикла из:

94° в течение 10 с

53° в течение 10 с

72° в течение 20 с

Хранение при 4°

Следующие образцы анализировались с помощью РСК для определения, ингибируют ли молекулы РNΑ реакции РСК:

1. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы (В1/КК-кукуруза была генетически модифицированной)

2. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы, 1 мкл РNΑ (100 мМ)

3. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы, 5 мкл РNΑ (100 мМ)

4. 1 мкл воды

Результаты РСК были визуализированы с использованием электрофореза на 2% ТВЕЕ агарозном геле.

Следующие образцы анализировались для определения, ингибирует ли присутствие РNΑ РСК.

1. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы

2. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы, 1 мкл РNΑ (100 мМ)

3. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы, 5 мкл РNΑ (100 мМ)

4. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы, 1 мкл метанола

5. 1 мкл В1/КК ДНК кукурузы, 5 мкл метанола

6. 1 мкл воды

Результаты РСК были визуализированы с использованием электрофореза на 2% ТВЕЕ агарозном геле.

Результаты указывают, что РNΑ не ингибировала РСК, когда к реакции добавлялся 1 мкл РNΑ (пробирка 2). РNΑ не ингибировала РСК, когда к реакции добавлялось 5 мкл РNΑ (пробирка 3). Метанол

- 41 009302 не ингибировал РСК, когда к реакции добавлялся 1 мкл ΡNΑ (пробирка 4). Метанол не ингибировал РСК, когда к реакции добавлялось 5 мкл ΡNΑ (пробирка 5).

Пример 3.

Стимулированное в течение воздействия света изменение оптической характеристики 3'3диэтилтиакарбоцианина при различных концентрациях молекул ДНК определялось для конкретной последовательности мишеневого полинуклеотида и для последовательности ΡNΑ.

Мишеневый полинуклеотид имел последовательность 5' СТАССССАСССАССАСТС 3' (8Е0 ΙΌ NО: 2), а комплементарная молекула ΡNΑ - последовательность Ν' САСТССТСССТСССССТАС-Ьук (8Е0 ΙΌ NО: 1). Концентрации мишеневого полинуклеотида были такими, которые перечислены в подписи к фиг. 5. Концентрация ΡNΑ составляла 14,4 пмоль на реакцию. Концентрация красителя - 6 пмоль на реакцию.

Фиг. 5 показывает эмиссию 3'3-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя во времени после экспозиции световому стимулу при различных концентрациях ДНК; чувствительность анализа с помощью различной контрольной концентрации ДНК, используя источник света со смешанными длинами волн для стимуляции изменения. Различные концентрации полинуклеотида (в данном случае - ДНК) показаны на подписи к этому чертежу. Концентрация в подписи представляет конечную концентрацию ДНК в каждой реакции, представляет образцы, содержащие только зонд и краситель; (Δ) представляет образцы, содержащие только краситель; (х) представляет образцы, содержащие только буфер.

На фиг. 6 изображено изменение эмиссии в процентах при различных концентрациях ДНК. Краситель имел более высокую скорость изменения эмиссии при более высоких концентрациях ДНК. Путём сравнения скорости изменения оптической характеристики красителя при более высоких концентрациях ΡNΑ со скоростью изменения оптической характеристики при более низких концентрациях ΡNΑ (или в отсутствие ΡNΑ) было обнаружено присутствие мишеневого полинуклеотида и могло быть измерено количественно, как показано на фиг. 10. Концентрации полинуклеотидов те же самые, что показаны в подписи к фиг. 5.

Пример 4.

Данный пример иллюстрирует, что скорости изменения оптических характеристик красителя могут различаться для разных длин волн светового стимула.

Мишеневый полинуклеотид, имеющий последовательность 5' СТАССССАСССАССАСТС 3' (8Е0 ΙΌ NО: 2), в количестве 20 пмоль на реакцию и молекула ΡNΑ, имеющая последовательность Ν' САСТССТСССТСССССТАС-Ьук (8ЕО ΙΌ NО: 1), в количестве 14,4 пмоль на реакцию объединялись с 3'3-диэтилтиакарбоцианин-йодидным красителем с образованием смеси. Эта смесь затем подвергалась воздействию светового стимула, создаваемого различным световым спектром в течение 10 мин, и в течение этого времени измерялось процентное изменение эмиссии красителя.

На фиг. 7 показаны результаты этого эксперимента. Белый световой стимул генерировался при помощи ЕгНх Аигога 50/50 видимого спектра, и генерировались длины волн от 400 до 700 нм. Голубой световой стимул генерировался с использованием голубого фильтра. Производимый голубой свет имел длину волны от 450 до 480 нм. Зелёный световой стимул генерировался с использованием зелёного фильтра. Производимый зелёный свет имел длину волны от 450 до 480 нм. Красный световой стимул генерировался с использованием красного фильтра. Производимый красный свет имел длину волны от 630 до 720 нм.

Белый световой стимул приводил к наибольшему процентному изменению эмиссии. Стимул с красными длинами волн показывал очень медленное изменение в эмиссии.

Пример 5.

Данный пример показывает, что способы могут быть также использованы для обнаружения различий в последовательности нуклеиновых кислот.

Подготавливались два образца. Первый образец содержал смесь ΡNΑ, комплементарной СМОпоследовательности, обнаруженной в полинуклеотиде СМО сои, полинуклеотида СМО сои и 3'3диэтилтиакарбоцианин йодида. Второй образец содержал смесь ΡNΑ, комплементарной СМОпоследовательности, обнаруженной в полинуклеотиде СМО сои, полинуклеотида не-СМО сои и 3'3диэтилтиакарбоцианин йодида. Для обоих образцов наблюдалась скорость изменения эмиссии во времени после экспозиции световому стимулу. Для обеих смесей соевые полинуклеотиды были получены из листьев сои. В обеих смесях использовался 1 мкл выделенной ДНК на 100 мкл реакционного объёма при концентрации ДНК 25 нг/мкл.

Полученная скорость изменения эмиссии во времени показана на фиг. 8. Процентное изменение эмиссии 3'3-диэтилтиакарбоцианин йодида измерялось во времени для образца, содержащего 3'3диэтилтиакарбоцианин йодид, молекулу ΡNΑ, комплементарную к области соевого 358-полинуклеотида генетически модифицированного организма (СМО), и либо соевого полинуклеотида генетически модифицированного организма (СМО), либо соевого полинуклеотида не-СМО. Изменение эмиссии красителя происходило при гибридизации ΡNΑ с СМО соей и не происходило при гибридизации с не-СМО соей. Способ выявил СМО сою и не выявил не-СМО сои. Данные способы обеспечивают средства для обна

- 42 009302 ружения различий в полинуклеотидных последовательностях, присутствующих в ДНК.

Пример 6.

Этот пример показывает, что количество полинуклеотида в образце может быть определено измерением скорости изменения оптической характеристики красителя в образце, имеющем неизвестную концентрацию полинуклеотида, и корреляцией скорости изменения оптической характеристики с кривой известных скоростей изменения оптической характеристики. Время может быть фиксированным, и изменение может быть измерено в определённый момент реакции. Определение величины может также включать в себя одноразовое определение изменения оптической характеристики и корреляцию изменения оптической характеристики с концентрацией одного или более образцов, имеющих известную концентрацию.

Было подсчитано время, необходимое для 20%-ного изменения эмиссии в сериях концентраций полинуклеотида. Мишеневый полинуклеотид имел последовательность 5' СТАССССАСССАССАСТС 3', (8Εζ) Ш N0: 2), а молекула ΡΝΑ - последовательность Ν' САСТССТСССТСССССТАС-Бух. (8Εζ) Ш N0: 1). Время, требуемое для 20%-ного уменьшения, как функция концентрации мишеневого полинуклеотида, показано на фиг. 10. Эти данные соответствуют данным процентного изменения на фиг. 6. По одному варианту анализа точка, при которой имеется 20%-ное изменение эмиссии, измеряется для образца, имеющего неизвестную концентрацию. Количество полинуклеотида в данном образце может быть определено экстраполяцией со стандартной кривой.

Пример 7.

Этот пример показывает, что мишеневым полинуклеотидом может быть РНК.

Объединялись ΡΝΑ, РНК и 3'3-диэтилтиакарбоцианин-йодидный краситель. Мишеневой последовательностью РНК была 5' СиАСббОАббСАбСАбиО 3', (8Е0 Ш N0: 15), а ΡΝΑ-последовательность представляла собой универсальный бактериальный ΡΝΑ-зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности РНК. Смеси подвергались воздействию светового стимула, и измерялось процентное изменение эмиссии красителя во времени и сравнивалось с образцом, включающим в себя ДНК-последовательность полинуклеотида вместо РНК-последовательности полинуклеотида.

Результирующее процентное изменение оптической характеристики во времени изображено на фиг. 11. Сравнивается 20 пмоль мишеневой ДНК на реакцию и мишеневая РНК (·) при концентрациях РНК 20 пмоль на реакцию, 10 пмоль на реакцию и 2 пмоль на реакцию. По оси Υ представлено процентное изменение флуоресценции со временем по сравнению с только зондом и красителем. РНКполинуклеотиды производили изменение эмиссии красителя во времени. Присутствие РНК обнаруживалось на основании показателя изменения оптической характеристики красителя.

Пример 8.

Данный пример демонстрирует, что настоящий способ работает в загрязнённой среде.

Определялось процентное изменение эмиссии 3',3-диэтилтиакарбоцианин йодида во времени в образце мясного сока. Подготавливались 3'3-диэтилтиакарбоцианин-йодидый краситель и молекула ΡΝΑ. Мишеневый полинуклеотид имел последовательность 5' СТАС666А66СА6СА6Т0 3' (8Εζ) Ш N0: 2), а ΡΝΑ -последовательность Ν' САСТбСТбССТССССбТАб-Ьуз (8Еф Ш N0: 1).

Результаты изображены на фиг. 12. Показано процентное изменение в незагрязненной, чистой системе и в образцах с загрязненным субстратом с 1 01, 2 01 и 4 П1 концентрациями мясного сока (незатемнённые символы). Этот пример показывает, что присутствие полинуклеотида было обнаружено в загрязнённой среде.

Пример 9.

Фиг. 13 показывает добавление ΡΝΑ «клиньев» в системе. Биотинилированная ΡΝΑ (5Ъю-оода!ад1дддайд1дсд1) (8Εζ) Ш N0: 16) присоединена к стрептавидиновой лунке и затем реагировала с полинуклеотидом. После гибридизации добавлялся краситель, система подвергалась воздействию светового стимула, и определялось процентное изменение во времени. Полинуклеотид мог быть синтезированным или ампликоновым мишеневым полинуклеотидом. «Тест/а» показывает 358 ΡΝΑ 5Ъю-оода!ад1дддайд1дсд1 (8Εζ) Ш N0: 16) и 195Ьр ампликоновый мишеневый полинуклеотид. «Тест/а+1» включает в себя как 358 ΡΝΑ 5Ъю-оо-да1ад1дддайд1дсд1 (8Εζ) Ш N0: 16) с 195Ьр ампликоновым мишеневым полинуклеотидом, так и ΡΝΑ 5'1сйсйй1ссасд-Е¥8 (8Εζ) Ш N0: 17). «Тест/а+2» включает в себя 358 ΡΝΑ 5'Ью-оо-да1ад1дддайд1дсд1 (8Εζ) Ш N0: 16) с 195Ьр ампликоновым мишеневым полинуклеотидом и ΡΝΑ 5'1сйсйй1ссасд-Е¥8 (8Εζ) Ш N0: 17). «Тест/а+Ь» включает в себя 358 ΡΝΑ 5Ъ1о-оо-да1ад1дддайд1дсд1 (8Εζ) Ш N0: 16) с 195Ьр ампликоновым мишеневым полинуклеотидом, 5'1сйсй1йссасд-Е¥8 (8Εζ) Ш N0: 17) и 5'1саса1саа1ссас1-Е¥8 (8Εζ) Ш N0: 18). «Тест/а+Ь рте» включает в себя 358 ΡΝΑ 5Ъю-оода!ад1дддайд1дсд1 (8Εζ) Ш N0: 16) с 195Ьр ампликоновым мишеневым полинуклеотидом, 5'1сйсйй1ссасдЬУ8 (8Еф Ш N0: 17) и 51саса1саа1ссас1-Е¥8 (8Еф Ш N0: 18), где 51сйс1ййссасд-Е¥8 (8Еф Ш N0: 17) и 5'1саса1саа1ссас1-Е¥8 (8Εζ) Ш N0: 18) инкубировались с ампликоновым мишеневым полинуклеотидом до гибридизации с присоединённой ΡΝΑ. «Тест/о» показывает 358 ΡΝΑ 5Ъ1о-оо-да1ад1дддайд1дсд1 (8Εζ) Ш N0: 16) с комплементарным полинуклеотидом. Линкер -оо- представлял собой 8-амино-3,6диоксаоклановую кислоту. В этом и других выполнениях линкерами могут быть любые химические свя

-43 009302 зывающие группы, известные в данной области. Добавление аналогов нуклеиновой кислоты к различным сайтам в мишеневом полинуклеотиде может менять скорость изменения.

Пример 10.

Этот пример показывает скорость изменения оптической характеристики красителя при разных длинах волн.

На фиг. 14 показано сравнение экспозиции световому стимулу различной длины волны для серии образцов. Готовилась смесь мишеневого полинуклеотида, ΡΝΑ и 3'3-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя и наблюдалось изменение оптической характеристики красителя. Мишеневый полинуклеотид имел последовательность 5' СТΑСОООΑООСΑОСΑОТО 3', (ЗЕО ΙΌ NО: 2), а молекула ΡΝΑ - последовательность N'СΑСТОСТОССТССССОТΑО-^уз (ЗЕО ΙΌ 1).

На фиг. 14 а)-б) показано протекание эмиссии красителя во времени для следующих серий длин волн: а) смешанный свет; Ь) источник голубого света, 450 нм; с) источник зелёного света, 510 нм; б) источник красного света, 645 нм. Для каждого из а)-Л) показывает позитивный контроль или тестовый образец; показывает только ΡΝΑ-зонд; показывает только 3'3-диэтилтиакарбоцианин-йодидный краситель; (х) показывает буферный субстрат. Эмиссия соответствует процентному изменению, показанному на фиг. 7.

Пример 11.

Этот пример показывает, что данные способы могут быть использованы в формате твёрдой системы посредством приготовления гибрида ΡΝΑ-полинуклеотид либо до, либо после связывания с твёрдым носителем.

В этих экспериментах использовались универсальный бактериальный ΡΝΑ-зонд и комплементарный ему полинуклеотид. Мишеневый полинуклеотид имел последовательность 5' СТΑСОООΑООСΑОСΑОТО 3', (ЗЕО ΙΌ NО: 2), а молекула ΡΝΑ - последовательность 5' Οίο - СΑСТОСТОССТССССОТΑО 3' (ЗЕО ΙΌ NО: 1). В первом образце биотинилированный ΡΝΑ-зонд был иммобилизован на лунке посредством стрептавидин-биотинового связывания. Затем были добавлены полинуклеотид и 3'3диэтилтиакарбоцианин-йодидный краситель. Образец был подвергнут световому стимулу, и было измерено процентное изменение флуоресцентной эмиссии.

Во втором образце биотинилированный зонд и мишеневый полинуклеотид гибридизовались с образованием гибрида ΡΝΑ/полинуклеотид. Затем гибрид ΡΝΑ/полинуклеотид был внесён в лунку, покрытую стрептавидином, и гибриду была дана возможность связаться с поверхностью лунки.

Фиг. 15 показывает процентное изменение эмиссии во времени, наблюдавшееся в первом и втором образцах. В тесте 1 биозонд иммобилизовался на лунке посредством стрептавидин-биотинового связывания до реакции с мишеневой ДНК и красителем. В тесте 2 молекула ΡΝΑ и мишень гибридизовались в растворе до внесения в лунку. Ось Υ показывает процентное изменение флуоресценции во времени по сравнению с одним только зондом.

Пример 12.

Этот пример демонстрирует, что данные способы могут быть использованы для идентификации и (или) определения количества мишеневого полинуклеотида, полученного из образца крови.

Человеческая кровь отбиралась из вены в Е^ТΑ-пробирки. 10 мкл мужской крови и 10 мкл женской крови вносились в цетрифужную пробирку, содержащую 180 мкл буфера для лизиса, которым являлся 6М-гуанидин тиоцианат; 20 мМ Е^ТΑ; 10 мМ Тпз-НС1 (рН 6,5); 40 г/л ТоГОн X; 10 г/л дитиотреитола. Перед добавлением к крови буфер нагревался до 60°С до растворения. 10 мкл женской крови добавлялось в центрифужную пробирку, содержащую 190 мкл того же самого буфера. Реакции инкубировались при комнатной температуре в течение 10 мин.

Реакции центрифугировались в течение 5 мин при 4000 грт. Супернатант удалялся и осадок промывался 500 мкл буфера для лизиса. Осадок снова центрифугировался в течение 2 мин при максимальной скорости. Супернатант удалялся и промывался 500 мкл буфера для промывки (25% этанол; 25% изопропанол; 100 мМ №С1; 10 мМ Тпз-НС1 (рН 8,0)). Реакции центрифугировались в течение 2 мин при максимальной скорости, и супернатант удалялся. Реакции дважды промывались 5 мМ фосфатного буфера, используемого в реакции гибридизации ΡΝΑ. После заключительной промывки реакции суспендировались 200 мкл 5 мМ фосфатного буфера.

Следующая таблица показывает условия тестов для реакции в микролунках. Было использовано 2,5 мкл цельной крови в 50 мкл реакционного объёма. Это равно 300 мишеней на 1 мкл реакции и 1 нг ДНК. Последовательность ΡΝΑ - 5' В^ο-ОО-ТОΑОТОТОТООСТТТСО 3' (ЗЕО ΙΌ 19).

- 44 009302

	Тест	Отриц. контроль	Отсутствие ΡΝΑ контр.
Образец	48 мкл теста	48 мкл отрицательн.	48 мкл отрицательн.
ΡΝΑ	1 мкл	1 мкл	0
Краситель	1 мкл	1 мкл	1 мкл

Данные по эмиссии собирались с помощью спектрофотометра Сеток, при длине волны возбуждения 535 нм и длине волны эмиссии 590 нм. После первоначальной нулевой минуты чтения образцы были подвергнуты световому стимулу от ΑυΐΌΓα 50/50 в течение 30 с. Флуоресценция измерялась каждые 30 с в течение 10 мин.

Фиг. 16 показывает, что образец мишеневой мужской крови, обозначенный ()’ был обнаружен анализом, а женской крови, обозначенной как негативный контроль, обнаружен не был.

Пример 14.

Ряд последовательностей нуклеиновых кислот был или мог быть использован для обнаружения мишеневых полинуклеотидов. Эти последовательности приведены ниже.

Наименование ΡΝΑ Последовательность

РР12101Ыо	З'Ыо-оойдаа^ЦддсШсд (8Е() Ю ΝΟ: 19)	11118ΒΥ
РР12024	5’сас1дс1§сс1сссд1ад-Ь¥8 (8ЕЦ ГО N0:1)	168
РР12024Ыо	5’Ыо-ОО-ас1дс1дсс1сссд1ад (8Ер ГО ΝΟ: 20)
РР12025Ь1о4	5 ’Ъ1О-ОООО-1§сс4ссс§4а§ (8ЕЦ ГО N0:21)
РР12025Ыо6	5’Ыо-000000-12сс1ссс§1а (8ЕС) Ю ΝΟ: 22)
РР12025Ыо8	5 ’Ыо-ОООООООО-1дсс1сссд1а (8ЕЦ ΙΏΝΟ: 22)
РР12025Ью10	5’Ыо-0000000000-48Сс1ссс§1ад (8ΕΟΙϋΝΟ:21)
ΡΡΙ2025 иь	5’1дсс4сссд1ад (8Εζ> ГО ΝΟ: 21)

РРП8Ыо	5 'Ыо-оо-дага^ддай^дсдг (8Ε0ΙΟΝΟ: 16)	358
ΡΡΙ359	З’сссасссасдадд-ЬУЗ (8Ε0ΙΟΝΟ: И)
ΡΡΙ485	5 ЧсйсйШссасд-Ь ¥8 [8Εζ)ΙΟΝΟ: 17)
ΡΡΙ486	5 ЧсасассаасссасЬБУЗ (δΕΟΙϋΝΟ: 18)
ΡΡΙ2202	Ыо-(О) ί (8ЕЦ Ю ΝΟ: 23)	ΗΙΥ
ΡΡΙ911	Ыо-(О)|0-с§са§ассас1а (8ΕΟΙΟΝΟ: 24)	НСУ

Пример 15.

Фиг. 19 показывает эффект экспозиции световому стимулу различных длин волн.

Смесь, включающая в себя 168 ΡΝΑ (5'сасΐдсΐдссΐсссдίад-^Υ8) (8ЕО ГО ΝΟ: 1), полинуклеотид (5' с!асдддаддсадсад!д) (8ЕО ГО ΝΟ: 2) и 3'3 диэтилтиакарбоцианин-йодидый краситель, подвергалась сти

- 45 009302 мулу белого света, содержащего все длины волн видимого диапазона, источника голубого света (450 нм), источника зелёного света (510 нм), источника красного света (645 нм) и не подвергалась никакому световому стимулу. Источником смешанного света служил Αιηο^ι 50/50 от РIТΖ. Для создания голубого, зелёного и красного света на ΑϋΓΟΓΗ 50/50 помещались фильтры. Считывание осуществлялось по многолуночному планшетному считывателю 8айге (производимому Тесап).

Смеси, на которые воздействовали световым стимулом, показали скорость изменения оптической характеристики красителя, отличающуюся от эталонной величины. Смеси, на которые не воздействовали световым стимулом, не показали никакого значительного изменения в течение всего времени измерений. Различные длины волн приводили к разным скоростям изменения оптических характеристик. Этот пример показывает, что световое излучение может быть использовано для вызывания различных скоростей изменения оптической характеристики красителя.

Пример 16.

ΡΝΑ была иммобилизована на твёрдом субстрате, и количество ДНК обнаруживалось на основании изменения величины флуоресценции красителя.

В этом примере использовались следующие реактанты: а) 10 мкМ зонд-ВЮ (из примера 14); Ь) 2 мМ красителя диэтилтиакарбоцианин йодида (100 мМ хранившегося в ИМ8О; 2 мМ рабочей концентрации в 5мМ буфере); с) 5 мМ буфер (рН 5,5) (1 мл 100 мМ Nа₂ΗΡΟ₄·7Η₂Ο + 24 мл 100 мМ ^^^О^Н^ + 475мл Н₂О рН до 5,5); б) 1X01’8 + 0,05% Тгееп-20 ^В8Т) (1X1 ΡВ8 = 0,137М №С1 + 2,68 мМ КС1 + 4,3 мМ NаΗ₂ΡΟ₄ + 1,47 мМ КНгГОд); е) стрептавидиновые микротитровальные планшеты (ΝυΝ0) и Г) тестовые образцы, содержащие или не содержащие мишневый полинуклеотид.

Подсчитывалось количество лунок. Каждая лунка подготавливалась предварительной промывкой 3Х 200 мкл 1XΡВ8Т. 1 мкл ΡΝΑ-зонда использовалось в 50 мкл общей реакции. 3 мкл зонда добавлялось к 147 мкл ΡВ8Т.

ΡΝΑ-зонды присоединялись к твёрдой поверхности микротитровальных лунок. Смесь инкубировалась в течение 1 ч при комнатной температуре с легким встряхиванием.

+ контроль	Тестовый образец	Только зонд	Только буфер
50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл буфер

Лунки затем промывались с использованием 3Х 100 мкл ΡВ8Т. Затем лунки промывались с помощью 3Х 5 мМ фосфатного буфера. Для позитивного контроля 1 мкл реакции добавлялось к 49 мкл фосфатного буфера, после этого вносилось в лунку позитивного контроля. 1 мкл образца разводился в 49 мкл фосфатного буфера, затем вносился в лунку тестового образца. К лункам с зондом и только буфером добавлялось 50 мкл фосфатного буфера. Все лунки инкубировались в течение 30 мин при комнатной температуре с лёгким встряхиванием. Лунки промывались 5Х 100 мкл фосфатного буфера, как описано выше.

Раствор красителя приготавливался с использованием 1 мкл 2 мМ красителя к 49 мкл фосфатного буфера на лунку. Раствор красителя вносился во все лунки за исключением одной лунки для буфера негативного контроля. В единственную лунку для буфера вносилось 50 мкл фосфатного буфера.

Наблюдалась флуоресценция красителя. Первоначальное чтение флуоресценции было обнаружено до экспозиции световому стимулу от источника света ΑϋΓΟΓΗ 50/50. Возбуждение происходило при 535 нм, а эмиссия при 590 нм наблюдалась каждые 2 мин с использованием многолуночного планшетного считывателя Сешок.

Пример 17.

А. Использование жидких образцов ΡΝΑ осуществлялось в соответствии со следующим протоколом.

Было подготовлено достаточное количество лунок для числа тестируемых образцов плюс три контрольных. Были выделены ДНК или РНК.

Каждая тестовая реакция содержала: 1 мкл ΡΝΑ-зонда, 47 мкл буфера (5 мМ 2 мл 100 мМ №₂№О₄-7Н₂О + 48 мл NаΗ₂ΡΟ₄·Η₂Ο/^ (рН 5,5)), и 1 мкл тестового образца. Образцы были загружены в 96-луночные полосовые планшеты Стешет (#705070).

Зонд, краситель и буфер объединялись для образования смеси, и лунки подготавливались следующим образом:

+· контроль	Тестовый образец	Только ΡΝΑ	Только буфер
1 мкл + контроль	1 мкл образца	1 мкл буфера	50 мкл буфера

мкл смеси вносилось во все лунки кроме лунок, содержащих только буфер. Раствор слегка помешивался.

Поглощение спектра или флуоресценция без экспозиции световому стимулу наблюдались при следующих длинах волн: поглощение: 562 нм; флуоресцентная эмиссия: 535 нм; флуоресцентное возбуждение: 590 нм.

Образцы подвергались воздействию светового стимула с использованием Αι^οη 50/50, и поглоще

- 46 009302 ние или флуоресценция определялись спустя каждые 30 с экспозиции световому стимулу.

В. Следующий протокол осуществлялся при использовании молекул ΡNΑ, которые были иммобилизованы на твёрдой поверхности.

В протоколе использовались следующие реактанты: а) 10 мкМ ΡNΑ (АВ1); Ь) 2 мМ 3'3диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя (81дта-А1бпск, катал. #173738); с) 5 мМ 1ХРВ8 (0,137М №С1 + 2,68 мМ КС1 + 4,3 мМ NаН₂ΡО₄ + 1,47 мМ КН₂РО₄) + 0,05% Ттеееп-20; б) (0,137М ЫаС1 + 2,68 мМ КС1 + 4,3 мМ NаН₂ΡО₄ + 1,47 мМ КН₂РО₄) + 0,05% Ттеееп-20; е) тестовые образцы, содержащие мишневый полинуклеотид; и Г) покрытые стрептавидином планшеты ДцпсЬтапб 1ттоЫ1хег™ (Катал. № 436014)).

В одном варианте ΡNΑ была иммобилизована до введения полинуклеотидного образца. Для тестируемых образцов (п) было подготовлено достаточное количество лунок плюс три лунки для контроля промыванием 3Х 300 мкл 1Х РВ8Т. Были выделены ДНК или РНК, которые должны были тестироваться. Биотинилированная ΡNΑ была иммобилизована на покрытых стрептавидином лунках добавлением 1 мкл 10 мкМ исходной ΡNΑ в 49 мкл РВ8Т.

Была приготовлена основная масса ΡNΑ, которая включала (п+2)Х 1 мкл 10 мкМ исходной ΡNΑ и (п+2)Х 49 мкл РВ8Т. 50 мкл смеси ΡNΑ вносилось во все лунки кроме лунок, содержащих только буфер.

Смесь закрывалась и инкубировалась в течение 1 ч при комнатной температуре с лёгким встряхиванием.

Каждая лунка промывалась 3Х 200 мкл РВ8Т, а затем - 3Х 5 мМ фосфатного буфера, и образцы нуклеиновой кислоты добавлялись к иммобилизационному зонду. 1 мкл образца добавлялся к 49 мкл 5 мМ фосфатного буфера.

Контрольные лунки были подготовлены как показано ниже:

	Тест	+- контроль	Только ΡΝΑ	Только буфер
Тестовый образец	1 мкл	1 мкл	0	0
5тМ фосфатный буфер	49 мкл	49 мкл	50 мкл	50 мкл

Лунки накрывались при комнатной температуре на 30 мин и инкубировались при лёгком встряхивании. Затем каждая лунка промывалась 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера 6Х. Раствор красителя был приготовлен добавлением 1 мкл 2 мМ раствора красителя к 49 мкл 5 мМ фосфатного буфера на образец. 50 мкл 5 мМ фосфатного буфера было внесено в лунку, содержащую только буфер.

Первоначальные показания поглощения или флуоресценции были обнаружены до экспозиции световому стимулу при следующих длинах волн: поглощение - 562 нм; флуоресцентная эмиссия - 535 нм; флуоресцентное возбуждение - 590 нм.

Образцы подвергались воздействию светового стимула с использованием Аигога 50/50. Аигога 50/50 может также использоваться с различным цветофильтрами (голубым, зелёным, красным) для выбора желаемой длины волны каждые 20 мин экспозиции световому стимулу.

В другом варианте ΡNΑ иммобилизовалась и мишеневые полинуклеотиды гибридизовались в одно и то же время. Для тестируемых образцов (п) было подготовлено достаточное количество лунок, а также три лунки для контроля промыванием 3Х 300 мкл 1Х РВ8Т. Были выделены ДНК или РНК.

Смесь ΡNΑ-зонда и образца готовилась как показано ниже:

	Тест	г контроль	Только ΡΝΑ	Только буфер
ΡΝΑ	1 мкл	1 мкл	1 мкл	0
Тестовый образец	1 мкл	1 мкл	0	0
5тМ фосфатный буфер	48 мкл	48 мкл	49 мкл	50 мкл

Смесь инкубировалась закрытой в течение 10-120 мин при комнатной температуре с лёгким встряхиванием. Затем смесь промывалась 6Х 100 мкл 5 мМ фосфатного буфера. Краситель подготавливался как описано выше. 50 мкл раствора было внесено в лунку, содержащую только буфер.

Пример 18.

Следующий протокол осуществлялся при использовании растительной ДНК.

Использовалась линия КК 2701 сои. Использованная ДНК была из очищенного экстракта ДНК, содержавшего 62 нг/мкл. Образцы получались серийным разведением из 62 до 0,062 нг/мкл. 1 мкл этого раствора использовалась в 50 мкл реакции.

Стрептавидиновый планшет промывался 3Х 400 мкл подсоленого фосфатного буфера (РВ8) (+ 0,5% Ттеееп (РВ8Т)) при комнатной температуре (КТ). Вся промывка, загрузка и выгрузка осуществлялись с использованием пипетки. Для промывки в каждую лунку вносилось 400 мкл раствора. Затем раствор отсасывался с использованием той же самой пипетки и наконечника.

ΡNΑ Ь1о-18 (358) разводилась 1/10 в воде. (1 мкл исходной ΡNΑ к 9 мкл воды). (В1ОООСАТАСТСССАТТСТСССТ (8ЕО ΙΌ NО: 16), где ОО являются двумя линкерами). 1 мкл разведённой ΡNΑ вносилось на 49 мкл РВ8Т. Основная смесь приготовлялась так, чтобы все лунки были заполнены,

- 47 009302 плюс был запас ещё для одной. То есть если бы нужно было охватить 10 лунок, достаточная основная смесь приготовлялась для 11 лунок (11 мкл разведённой РИА + 539 мкл РВ8Т). 50 мкл этой смеси вносилось в каждую лунку. Планшет инкубировался 1 ч при ВТ с лёгким встряхиванием на орбитальном шейкере. В назначенное время была приготовлена ДНК посредством получения серийных разведений (1/10, 1/100, 1/1000) каждого образца ДНК в микро-РСВ пробирках. Пробирки помещались в термальный циклер (95°С в течение 5 мин). После этого трубки помещались на лёд на необходимое время. После инкубации планшеты промывались 3Х РВ8Т как описано выше. Затем планшеты промывались 3Х 5 мМ буфера РО4 (рН 5,7) как описано выше. 1 мкл ДНК или разведённой ДНК образца вносилось в каждую лунку (СМ или не-СМ ДНК, один образец на лунку). Добавлялось 49 мкл РО4-буфера. Планшеты слегка помешивались и инкубировались в течение 30 мин при ВТ с лёгким встряхиванием на орбитальном шейкере. После инкубирования планшеты промывались 5Х РО4-буфером как описано выше. 1 мкл 3'3диэтилтиакарбоцианиа (3 мМ) добавлялось к 49 мкл РО4-буфера (основная смесь была приготовлена, чтобы хватило на все лунки, плюс ещё на одну). 50 мкл смеси краситель/буфер вносилось в каждую лунку с помощью пипетки. Затем планшет помещался в сканер Тесап для наблюдения спектральной эмиссии реакции при 535 нм для возбуждения и 590 нм для эмиссии. Первоначальное считывание производилось при нулевом времени. Затем планшет подвергался световому стимулу, и считывание производилось в интервале 1 мин. Данные проанализированы в Ехсе1 и вычислялись на основании процентного изменения от времени с использованием выравнивания 100-(только образец/РИА окрашивание) X 100.

На фиг. 20 показано обнаружение различных концентраций соевой ДНК. Они обозначены +. Соевая ДНК, которая не содержала СМО-последовательность, была близка к фоновым уровням. Они обозначены -. Данный способ позволяет обнаружить 0,0625 нг ДНК СМО-сои, что соответствует приблизительно 21 геному. Фиг. 21 показывает процентное изменение оптической характеристики от числа геномов СМО-положительной сои и сои дикого типа, которая не содержит РИА-последовательности мишени.

Пример 19.

Следующая реакция показывает обнаружение мишеневого полинуклеотида в одном лишь фосфатном буфере с различными концентрациями Тетееп-20. Подобные же эксперименты были проделаны и с другими неионными детергентами, включая ИР-40 и ГпГоп Х-100.

В протоколе использовались следующие реактанты: а) 10 мкМ РИА (АВ^; Ь) 2 мМ 3,3'диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя (81дта-А1бпсЬ, катал. #173738); с) 5 мМ буфер (рН 5,5) (2 мл 100 мМ Иа₂НРО₄-7Н₂О + 48 мл ИаН₂РО₄-Н₂О/Б); б) тестовые образцы.

Было подготовлено достаточное количество лунок по числу образцов, плюс 3 для контроля. Были выделены ДНК или РНК. В каждой тестовой реакции содержалось 1 мкл зонда, 47 мкл буфера и 1 мкл образца для приготовления смеси.

+ контроль	Тестовый образец	Только ΡΝΑ	Только буфер
1 мкл + сопГго!	1 мкл образца	1 мкл буфера	50 мкл буфера

Во все лунки, исключая лунки только с буфером, добавлялось 49 мкл смеси, и раствор слегка размешивался.

Первоначальное измерение флуоресценции производилось без экспозиции световому стимулу при эмиссии, установленной на 535 нм, и возбуждении, установленном на 590 нм. Образцы подвергались световому стимулу с использованием Аигога 50/50, и измерялось поглощение и (или) флуоресценция спустя каждые 60 с экспозиции световому стимулу. Использовался стандартный 5 мМ буфер (рН 5,5) и производилось сравнение с реакциями в фосфатном буфере, содержащем 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, и 2% Т\уееп-20.

Фиг. 22 показывает эмиссию с использованием различных концентраций Тетееп. показывает реакцию с мишеневой ДНК, X) показывает только зонд, (Δ) показывает краситель с буфером и (*) показывает только буфер.

Фиг. 23 показывает процентное изменение в эмиссии для различных концентраций Тетееп.

Пример 20.

Этот пример демонстрирует, что в реакции могут быть использованы аналоги нуклеиновой кислоты иные, чем РИАз. В данной реакции используются замкнутые нуклеиновые кислоты (БИАз). Тоже тестировались различные концентрации Т\уееп-20 в фосфатном буфере.

Использовались следующие последовательности БИА:

ΕΝΑ-А Т8^гас^та^тс^п,с^тС6ТА0 (8ЕС) ГО ΝΟ: 25)

ΕΝΑ-Β Т0с™С1^тСс^тС6ТА0 (8Еф ГО ΝΟ: 26)

БКА-С ТОССТСс^гаССТАС (8ЕС) ГО ΝΟ: 27)

Строчная буква со значком «^т» представляет модифицированные последовательности.

Реакции проводились в жидкой форме в соответствии с методами, раскрытыми выше в примере 19. На фиг. 24 сравниваются необработанные данные с зондами РИА и с зондами БИА в жидкой реак

- 48 009302 ции. Стандартная реакция в фосфатном буфере сравнивалась для различных концентраций Тюееп-20, добавляемого к фосфатному буферу. Затемнённые значки представляют тестовую реакцию, а светлые соответствующие только зондам.

(и, □) _ΡΝΑ. (♦, 0) _ΕΝΑ._Α· (Α, Δ) _ΕΝΑ_Β; (·. °) ЬМА-С.

Фиг. 25 показывает процентное изменение в эмиссии при использовании ΡNΑк против ΕΝΑ^ представляет процентное изменение в реакции по сравнению с одним только зондом ΡΝΑ;

представляет процентное изменение в тестовой реакции ΕΝΑ-Α по сравнению с одним только ΕΝΑ-Αзондом и красителем; представляет процентное изменение в тестовой реакции ΕΝΑ-Β по сравнению с одним только ΕΝΑ-Β-зондом; представляет процентное изменение в тестовой реакции ΕΝΑ-С по сравнению с одним только ΕΝΑ-С-зондом.

Пример 21.

Данный способ может быть также использован для обнаружения вируса гепатита С. С помощью стандартных методов из плазмы была выделена РНК вируса гепатита С, в которой присутствовало известное количество вируса гепатита С. Использующие эту выделенную РНК реакции проводились в жидкой форме в соответствии с методами, раскрытыми выше в примере 19.

На фиг. 26 показано обнаружение зонда вируса гепатита С с использованием различных количеств плазмы. Скорость изменения оптической характеристики различна для вирусов, даже когда они присутствуют в очень малом числе копий.

Число копий вируса гепатита С также может быть подсчитано. Фиг. 27 показывает эмиссию красителя, полученную при введении в анализ разного количества РНК вируса гепатита С.

Пример 22.

Данный пример демонстрирует, что настоящие способы могут быть использованы для идентификации и (или) определения количества мишеневого полинуклеотида в бактериях.

500 мкл бактериальной (либо Е. сой, либо ВасШик сегеик) культуры, выращенной в течение ночи в Т8В (триптический соевый отвар), осаждалось центрифугированием в течение 5 мин при 6000 об/мин, затем ресуспендировалось в 500 мкл фосфатного буфера, затем отстаивалось в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого к системе добавлялись ΡΝΑ (либо 5Ъю-оо-да1ад1дддайд1дсд1 (8ЕЦ ГО 16) для 168-последовательности, либо 5'В^ο-ОО-ТСΑСТСТСТСССТТТСС 3' (8ЕО ГО 19) для не-специфической последовательности отрицательного контроля НСУ) и краситель, следовала экспози ция световому стимулу и считывались данные.

В следующей таблице показаны тестовые условия реакции в микролунках с реакционным объёмом 50 мкл.

	Р/О-тест	Только зонд	Только краситель	Бактерия гест	Бактерия краситель
ΡΝΑ	5 мкл	5 мкл		5 мкл
Олиго	5 мкл
Бактериальная культура				43 мкл	43 мкл
краситель	2 мкл	2 мкл	2 мкл	2 мкл	2 мкл
Фосфатный буфер	38 мкл	43 мкл	48 мкл		5 мкл

Данные по эмиссии собирались с помощью спектрометра Сешок при длине волны возбуждения 535 нм и длине волны излучения 590 нм. После начальной нулевой минуты считывания образцы подвергались световому стимулу от света Αιιιόπι 50/50 в течение 60 с. Флуоресценция измерялась каждые 60 с в течение 10 мин.

Фиг. 28 показывает скорость изменения флуоресценции по сравнению с отсутствием гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид для каждого образца. Образец мишеневой Е. сой или В. сегеик (обозначенных, соответственно, «х» и «+»), был обнаружен в анализе с помощью 168 ΡΝΑ-зонда, но мишеневая Е. сой или В. сегеик (обозначенные, соответственно, и «А») не была обнаружена в анализе с помощью вирусного НСV ΡΝΑ-зонда. Чёрный квадратик показывает положительный контроль с олигонуклеотидом к 168-последовательности, как мишеневому полинуклеотиду.

Пример 23.

Олигонуклеотиды (5 '1д1даасдса 3' и 5' 1дсдйсаса 3') смешивались в гибридизационном буфере (10 мМ Тпк, рН 7,5 - 8,0, 50 мМ №С1, 1 мМ Е^ТΑ) до 10 мМ и нагревались при 95°С в течение 10 мин в термальном циклере. На реакцию использовался 1 мкл этой смеси.

ΡNΑк №Вю-ОО-да1ад1дддайд1дсд1, С(1)' и Ν' 1саса1саа1ссас1-1ук, С',(2) использовались смешанными по отдельности по 10 мМ в рекционном буфере (5 мМ ΡО₄ + 0,05 % Тюееп). На реакцию использовался 1 мкл каждой смеси.

- 49 009302 мМ исходного 3-3'-диэтилтиакарбоцианинового красителя разводилось до 4 мМ в реакционном буфере. На реакцию использовался 1 мкл этой смеси.

Список литературы

1. Э.Р. Скаиб1ег, ЕВ. З!и1!з., К.К. Α^ο^^ З. СеЬи1а, В.Ь. Зскиск, аиб Е.Е Вгосктаи. 2000. ЛГГ^п^ιу сар!иге аиб гесоуегу оГ ΌΝΑ а! Гет!ото1аг соисеи!га!юиз текк реркбе иис1ею ас1б ргоЬез. Α^Ε Вюскет. 283:241-249.

2. Паз, В., Сшпииидз, С., Меиб1з, С., Νοι11, В., Ьибте1д, С., Нооуег, Ό., Рагаиаукаиа, С., Уаид, П.Н.С., Ьтб1ег, Ь., Ниаид, X., Неиска1, Е., аиб ДеН, М. (2001). С1оЬа1 Сеие Αиа1уз^з оГ 'апоиз Вю1одюа1 Ткгеа! аиб Мескоиз Αдеи!з Изшд РВМС: [трксакоиз Гог Ткегару аиб Вар1б П1адиозксз. Л: Όί-αιο МсРиезкои (еб) Ргосеебшдз, Скетка1 аиб Вю1одюа1 ПеГеизе Зутрозтт.

3. Пет1боу, V.'., Ρо!ашаи, '.Ν., Е^апк-Кашеие!зк^^, М.Э., Едко1т, М., Вискагб, О., ЗоииТскзеи, З.Н., аиб №е1зеи, Р.Е. (1994). ЗТаЬкку оГ реркбе иис1е1с аабз ш китаи зегит аиб се11и1аг ех!гас!з. Вюскет Ркагтасо1 48, 1310-3.

4. Наата, С., Ьокзе, Α., Вискагб!, О. аиб №е1зеи, Р.Е. (1996). Реркбе М.1с1ек Αс^бз ^ΝΑ) сои!а1шид Шутте тоиотегз бегкеб Ггош сЫга1 атто аабз. НуЬ^^б^ζа!^ои аиб зо1иЬ11ку ргорегйез оГб-1узше ΡNΑ. Αιΐβ Скет 35, 1939-1941.

5. 1е!!, М., Паз, В., Сшпти®, С., Меиб1з, С., Νοι11, В., Нооуег, Ό., Ьшб1ег, Ь., Рагаиаукаиа, С., Ниаид, X., Ьибте1д, С., Неиска1, Е., аиб Уаид, П.Н.С. (2001). ИеикДсакои ОГ Скаидез Л Сеие Ехргеззюи Лбисеб Ву Тохю Αдеи!з: [трксакоиз Гог Ткегару ΑιΑ Вар1б П1адиоз1з. Л: Ргосеебшдз оГ NΑТО СоиГегеисе: Орегакоиа1 кзиез ш Скетка1 аиб Вю1одюа1 ПеГеизе Нитаи Еас!огз ш Мебюше Раие1. Уабе (еб).

6. М1кке1к1и, ΑΧ., ΖΙιιιζο, ΑΧ., аиб Ζазеба!е1еν, ΑΧ (2000). Вшбтд оГ зутте1гка1 суаите буез ш!о !ке ΌΝΑ ттог дгооуе. 1 Вюшо1 З!гис! Пуи 18, 59-72.

7. №е1зеи, Р.Е., Едко1т, М., Вегд, В.Н., аиб Вискагб!, О. (1991). Зедиеисе-зе1ескуе гесодткои оГ ΌΝΑ Ьу зкаиб б^зр1асешеи! текк а ίкуш^ие-зиЬзк!и!еб рокапибе. Заеисе 254, 1497-500.

8. №е1зеи, Р.Е. (2001). Реркбе иис1е1с ааб: а уегза!11е !оо1 ш деиекс б1адиозксз аиб то1еси1аг Ью1оду. Сигг Орт Вю1ескио1 12, 16-20.

9. Вау, Α., аиб Шгбет В. (2000). Реркбе иис1е1с ааб ^ΝΑ): кз теб1са1 аиб Ью!есктса1 аррксакоиз аиб ргопЕзе Гог !ке Ги!иге, ЕазеЬ 1 14, 1041-60.

10. ЗгеГаио, К. аиб Ну1б1д-№е1зеи, 1.1. (1997). П1адиозкс Αрр1^сакоиз оГ ΡNΑ океотегз. Л: П1адиозкс Сеие Пе!ескои аиб РиаикДсакои Тескио1о§1ез Мтбег, (еб). рр. 19-39.

11. Уаид, 1., Ра1есек, Е., №е1зеи, Р.Е., Вгуаз, С., Са1, X., ЗкитзЫ, Н., ПоиЛа, Ν., Ьио, Ό., аиб Еаиаз, РА.М. (1996). Реркбе М.1с1е1с Α^ РгоЬез Гог Зедиеисе-ЗресГю ΌΝΑ Вюзеизогз. 1 Αш Скет Зос 118,7667-70.

12. УПке^ззои, Ь.М., Шгбет В., Миккеуее, К., Пи1ау, М.Т., аиб Ζ-γο, Β.Ν. (2002). Сеиекс зсгеешид изшд !ке со1ог скаиде оГ аΡNΑ-^NΑ куЬпб-Ьтбтд сузите буе. М.1с1е1с Αс^бз Вез30,Е3.

13. ЛзкШе оГ Еооб ТесЬηо1од^з!з (2002). Етегдшд М1сгоЬ1о1од1са1 Еооб ЗаГе!у кзиез: [трксакоиз Гог Сои!го1 1и !ке 21^з! Сеи!игу.

14. Уадиег, З.Е 2002. 'киз таскуакои т Ь1ооб сотроиегИз Ьу рко!оаскуе ркеиоΐк^аζше буез. Тгаизшз. Меб. Веу. 16:61-6.

15. Каризстзк1, 1., 1995. ^ЛΡI: а ^NЛ-зрес^Г^с Диогезсеи! ргоЬе. Вю!еск. Н1з1оскет. 70:220-33.

16. Саиеои, ЕВ., Макои, К.Р. _)г., Ке11еу, З.О. 2004. Пшиок огаиде-реркбе сои)ида!ез: зеизкгуку оГΌΝΑ Ьшбшд !о скетка1 з!гис!иге. Огд. Ьек. 6:517-9.

17. МотОт, Е.З., Ьа1аоиоу, Р.Р., Вукоуа, Е.У., '1аззоу, V.'., 2003. Е1иоготе1пс диаикксакои оίВNΑ аиб ΌΝΑ ш зоккоиз сои!а1шид Ьо!к иис1ею аабз. Αиа1. Вюскет. 322:48-50.

18. Епкззои, М., Каг1зои, Н.Е, Уез1тат С., Лке^тап. В. 2003. Сгооуе-Ьтбтд иизутте1пса1 суаите буез Гог з!аштд оГ ΌΝΑ: б1ззоаакои га!ез ш Ггее зо1икои аиб е1ес!горкогез1з де1з. МШек Αс^бз Вез. 3.1:6235-42.

19. Каг1ззои, Н.Е, Епкззои, М., Регеои, Е., Лке^тап. В., Ьшсо1и, Р., Уез1тат С. 2003. Сгооуе-Ьтбшд 1.тзутте1пса1 суаите буез Гог з!а1шид оГ ΌΝΑ: зуи!кезез аиб скагааетакои оГ !ке ΠΝΑ-Ьшбтд. М.1с1ек Αс^бз Вез. 31:6227-34.

20. ЗскаЬепе, Е.Д., КАтт, '.Α., Воиззеукск, Т.Е. 2003. Зрес!гозсор1с з!иб1ез оГ !ке ш!егаскои оГЫскготоркопс суаите буез текк ΌΝΑ. ЕГГес! оГ ютс з!геид!к. Вюскт. Вюркуз. ΑΠα. 1621:183-91.

21. Мат, З., Скаибкигу, Ν.Χ., Скотебкигу, З. 2003. Ноескз! 33258 Ьтбз !о С-диабгир1ех ш !ке ргото!ег гедюи оГ китаи с-тус. Вюскет. Вюркуз. Вез. Соттии. 310:505-12.

22. То1ии, С., Муегз, В.З. 2003. Α геа1-кте Пиазе аззау (ΒοΌΑ) Ьазеб ои РюоСгееи Диогезсеисе. Νυс1ею Αс^бз Вез. 31 :е111.

23. Зоνеиукаζу, К.М., Вогбе1ои, Ι.Α., Реку, 1.Т. 2003. Зрескозсорю з!иб1ез оГ !ке тиШр1е Ьшбшд тобез оГ а 1пте1кте-Ьпбдеб сузите буе текк ΌΝΑ. М.1с1е1с Αс^бз Вез. 31:2561-9.

24. Ргеи!о, Р., Ьуои, Н.О. 2003. Ме!ку1 дгееи-ругоши У з1аттд оГ иис1ею аабз: з!иб1ез ои !ке еГГес!з оГ з1аттд кте, буе сотрозЛои аиб бГГизюи га!ез. Вю!еск. Н1з1оскет. 78:27-33.

25. Лбк^ка^у. Α., ВизсНтат, V., Ми11ег, С., Заиег, М. 2003. ЕизетЫе аиб зтдк-токсик Диогезсеисе ЗресВозсорк з!ибу оГ !ке Ьшбшд тобез оГ !ке Ыз-Ьеюк1Фио1е бегкакуе Ноескз! 33258 текк ΌΝΑ. №

- 50 009302 с1е1с Αс^бз Вез. 31:2178-86.

26. .ΤοΙ^οη, Ι.Μ., Китаг, З.О., Ма1а!к1, В. 2003, Ое-ййегса1а1юп οΓ екйбтт Ьгот1бе апб аспбте οτ- зпде Ьу хзпкше бепхайхез апб !ке1г πο6η131ογ^· ейес! οη знРсзнсег аден!з: а з!ибу οΓ ΌΝΑ-6ιιό^6 Нхюйу епкдк!енеб Ьу !1пе зшд1е р^Нн ΜΠίΡη^. I. βίοηο1. ЗРис!. Эуп. 20:677-86.

27. ХУапд, Ζ., Ζ^-ιη^, Ζ., Бт, Ό., Όοπ^, З. 2003. Α !епрега!иге-беренбен! ш!егас!юн οΓ неи!га1 геб тейк са1йкутиз ΌΝΑ. Зрес1госЫт. Α^η. Α Μο1. Вюптой Зрес1гозс. 59:949-56.

28. Ка^1ззοн, Н.к, БитоН, Ρ., ХУезРпап, О. 2003. Зун!кез1з апб ΌΝΑ Ьшбтд з!иб1ез οΓ а нете азуппе!пс суапше буе Ьтбшд ίη !ке тйюг д^οονе οΓΙρο^^Α^^ρ. ΕίοοΓβ. Меб. Скет. 11:1035-40.

29. Ρискοтезка, Α., В1е1атезк1, К., В1е1атезка, Α., М^би^а-Nοтеасζек, К. 2004. Ατοπ3!κ апаЦдз οΓ ΌΝΑ ткюг §ιόο\ό Ьтбегз-зун!кез1з анб Ью^тс/Й еνа1иаί^οн. Еиг. I. Меб. Скет, 39:99-105.

30. Веабу, Ρ.Α., ЗанРа, В.К., №1йз|Й М., СкакгахаРу, Α.Ρ. 2004. Ме!а1-азз1з!еб кдк!-1нбисеб ΌΝΑ с1езхзде асРхйу οΓ2-(πе!ку1!й^ο)ρкену1за1^су1а1б^тπе ЗсЫйЬазе торрекИ) тотркхез кахшд р1апаг ке1егосускс Ьазез. I, Ιπογ§. Вюскеп. 98:377-86.

31. Танюиз, Ρ.Α., Нате1Ьегд, Ό., Вак1у, С., Сζату, Α., Вοук^н, Ό.ν., ΧνίΕοη, ν.Ό. 2004. ΌΝΑ зедиепсе беренбен! ιηοηοηκιΉίπκΓ Ьтбшд ποби1аί^οн οΓ азуттеЮс Ηηζίι^ηζοΚ бепхайхез. I. Απ. Скет. Зοс. 126:143-53.

32. Ма, Ό.Ό., Ске, С.М. 2003. Α ΜΓπΗΛίοΗ31 р1а!шит(н) топр1ех сараЬ1е οΓ йИегсак-Июп анб кубгоденЬοнб^нд т!егас!юнз тейк ΌΝΑ: Ьшбтд з!иб1ез анб суФНхюйу. Скет1з!гу. 9:6133-44.

33. ХУакейт Ό.Ρ., Ви, X., Е1ейкенοи, Α., Йзгтзг, Α., Науек, С., З!етеай, В.XV. 2003. В1зт!егеа1а!тд !кгеаб1нд б1аспбтез: ^е1аί^οнзй^ρз Ье1теееп ΌΝΑ Ьтбшд, суНФхюйу, анб се11 сус1е аггез!. I. Меб. Скет. 46:5790-802.

34. Та^азον, З.О., Сазаз-Рте!, кВ., ΟΗο1οάγ, ν.Ν., Кοззкονзка-Скο1οбу, Т., О^усζунзк^, Ζ.Ε., М1ске|бз, С.1. 2003. В^з^т^бзζοзс^^бοπез: 2. З!еабу-з!а!е анб ί^πе-^езο1νеб П1югезсепсе з!иб1ез οΓ !кей бгуегзе ίη!егас!юн8 тейк ΌΝΑ. Ρкο!οскет. Ρ!οΙοόίο1. 78:313-22.

35. Татеаг, и., кип, Α.Ε., Сканбга, В., Зтдк, У., Отезгзкзпз1й, В.З., Скаибкигу, КК., Οοο6, Ь., Танбοн, V. 2003. Μίποτ д^οονе Ьтбшд ΌΝΑ кданбз тейк ехранбеб Α/Т зедиепсе 1енд!к ^есοдш!^οн, зе1есйхе Ьтбшд !ο Ьен! ΌΝΑ гедюнз анб енкансеб Γ1иο^есен! ргорегиез, Вюскет1зРу. 18:13339-46.

36. Вοи!οнне, Α.8., ВуаЬшт, ν.Α., Nονορазй^πа, О.З., Vенуат^нονа, Α.Ο., Не1ене, С., З^а^у, Α^. 2003. З!аЬ^1^ζаΡοн οΓ ΌΝΑ бοиЬ1е анб !пр1е кейсез Ьу ^η)^3!ίοΗ οΓ тйюг д^οονе Ьтбегз !ο ο1^еοнис1еοЙбез. Nис1еοз^без ^с^Шез ШсЮс Αс^бз. 22:1267-72.

37. Nονορазй^πа, Ό., З^а^х, Α., ВуаЬшт, V., Vенуат^нονа, Α., Вοи!οηπе, Α. 2003. Εοι·^^!^ οΓοкдο(2'-0-πе!ку1^^Ьοнис1еοί^без) тейк тйюг д^οονе Ьтбегз аз нете зедиепсе-зреаПс аден!з ^есοдη^ζ^нд Ьο!к д^οονез οΓ бοиЬ1е-зί^анбеб ΌΝΑ. Nис1еοз^без ^с^^без Шс1е1с Αс^бз. 22:1179-82.

38. Окат, З., Зенарак, Ό., Оаз, Ρ.Ι<., СкаНюрабкуау, Ρ., №!ка_р, М., Скзкгахайу, Α.Ρ. 2003. Тегнагу торрег тотркхез Γογ ρкο!οс1еаνаде οΓ ΌΝΑ Ьу геб Идк!: бкес! ех1бенсе Γογ зи1Γи^-!ο-сορρе^ скагде РинзИт апб б-б Ьанб ^нνο1νеπен!. I. Απ. Скет. Зοс. 125:12118-24.

39. Н1гзки, У., О1катеа, З., КатеашзЫ, З. 2002. О1з!апусш Α, а тйюг д^οονе Ьтбег, скапдез енеб1унетбисеб ΌΝΑ с1еахаде зйез анб енкансез аρορ!οз^з. №.1с1ею Αс^бз Вез. Зирр1. 2002:95-6.

40. Оегхап, Ρ.Ρ., Ебе^н, В.З. 2003. Ветоди!^ οΓ Не ΌΝΑ тйюг д^οονе Ьу ρу^^ο1е-ин^баζο1е ρο1уат1без. Сигг. Орт. З!гис!. Вю1. 13:284-99.

41. Веббу, Ρ.Μ., Лнбга, В.Т., ЗаН, Α.Ό., Вгисе, Т.С. 2003. Зедиепсе зе1есйхе ^есοдшΡοн ίη !ке πίποτ д^οονе ο^ΌΝΑ Ьу ругго1е, ^т^баζο1е-зиЬз!^!и!еб Ь^з-Ьенζ^т^баζο1е ^^^3^. I. Απ. Скет. Зοс. 125:7843-

8.

42. Внекн, ΟΑ., ХУеуегтапп, Ρ., Оегхан, Ρ.Ε. 2003. Α1!е^ηа!^νе ке!егосу-с1ез Γογ ΌΝΑ ^есοдн^!^οн: !ке Ηηζίι^ηζοΕ/ίι^ηζοΒ рай. Скет1зРу. 9:2110-22.

43. ВеппеЬегд, Ό., Оегхан, Ρ.Ε., 2003. Iт^б^аζορу^^б^не/Ρу^^ο1е анб куб^οxуЬеηζ^т^баζο1е/ρу^^ο1е ракз Γογ ΌΝΑ πίποτ д^οονе ^есοдη^!^οн. I. Απ. Скеп. Зοс. 125:5707-16.

44. КитеаЬага, Т., №ба, Т., Ок!аке, Н., Ок!зке, Т., Шуата, З., 1капуапа, Υ. С1азз^Р^саί^οн οΓ ΌΝΑЬтбтд тюбе οΓ анк йтюг анб ап!Мга1 аден!з Ьу Не е1ес!госкетйиттезсенсе οΓ гиНешип топркх. Απ31. Вюскеп. 314:30-7.

45. Оиапеиг, Α.Α., №1Пзй Зк., Мοка^е^аη^, Ν., Та]т1г-В1аЫ, ΗΑ. 2003. Ткактп-ΌΝΑ тотркхез ίη а^иеοиз зο1и!^οн. Μ3|ογ ογ πίποτ д^οονе Ьтбшд. к ВюпюЙ ЗРис!. Оун, 20:561-5.

46. Сап-азто, С., Нек^зеу, Ρ., Нзгоип, М., Вз1беугои, В., кзпз1зих, Α., Οο18οη, Ρ., ^^(еа С., ΟίοΓ^ίВенаи1!, З., Ва111у, С. 2003. Оез1дн οΓ а сοπροз^!е еίк^б^иπ-неί^ορз^н-ан^1^нοаснб^не πο^Οϋ^ Γοτ ΌΝΑ ге^дηίίίοη. СкепЬюскеп. 3:50-61.

47. Nдиуен, В., Бее, Μ.Ρ., Напе1Ьегд, О., Ιοπ^τΙ, Α., Ва111у, С., Вгин, В., №1б1е, З., νίΗοη, Χν.Ό.Ι Απ. Скеп. Зοс. 124:13680-1.

йй) ВагсеИ Р., Саρο, Ό., Ροτ^31, Б 2002. Тке^ποбунат^с ска^ас!е^^ζа!^οн οΓ !ке пиккакн! Ьтбшд οΓска^ι^еиз^н !ο ΌΝΑ. ШсЮс Αс^бз Вез. 30:4567-73.

48. Зкхегпан, Α.Ρ., Ви, V., Сοкен, З.М., Б1рратб, З.к, 2002. 2.4-Α тоз^ з!гис!иге 01 пе азутпектс р1а!пип топр1ех [Ρ!(аππ^не)(сус1οкеxу1атπе)]2+ Ьοинб !ο а бοбесзте^ ΌΝΑ бир1ех. Б Вю1. Скеп. 277:49743-9.

- 51 009302

49. Що1а, О., ОаИ^сдпа, Е., ОаЬе11т1, Ν., Мого, 8., ^ба1б1, Ό., IЬтс1к, Н. 2002. Мок[2.3-Ь]с|шпо1|/тшт Ьгот1бе: ап еГйс1еп( т(егса1а(ог г1(б ^NΑ-рбο(οбатад^ηд ргорегйек. СбетЬюсбет. 3:550-8.

50. Αηίбοηсу, Ό.Α., Тге1уек, С.1. 2001. ΌΝΑ: к(111 а (агде( гопб а1ттд а(? Α геу1ег оГ пег ΌΝΑт(егасруе адеп(к. Αι. Г Рбагтасодепоткк. 1:67-81.

51. 8Ыт, ΥΉ., Α^^тοηбο, Р.В., Ьа1д1е, Α., ОагЬекц Α., Ьау1е11е, 8. 2004. Ке1айуе ΌΝΑ Ьтбтд аГПп1(у оГ бебх 3 ботеоботат апа1одк, та.)ог дгооуе Ьтбегк, сап Ье гар1б1у ксгеепеб Ьу б1кр1асетеп( оГргеЬоипб е(Ыбтт Ьгот1бе. Α сотрагайуе к(ибу. Огд. Вюто1. Сбет. 2:915-21.

52. Vа^аба^а^аη, 8., 8баб, Ό., Бапбе, Р., 8е((1ек, 8., Сбеп, Е.Х., Егопха, О., Оо1б, В. 2003. ΌΝΑ батаде апб су(о(ох1с1(у тбисеб Ьу ттог дгооуе Ьтбтд те(бу1 ки1Гопа(е ек(егк. Вюсбетййу. 42:14318-27.

53. Оие1еу, V., бее, I, I, 8огеу, 8., НоГГтап, Ό.ν., Гуегкоп, В.б. 2001. Рерббе Ь1к-т(егса1а(ог

Ьтбк ΌΝΑ у1а (бгеабтд тобе г1(б кес.|иепсе кресГйс соп(ас(к ίη 1йе та)ог дгооуе. Сбет. Вю1. 8:415-25.

54. Ниапд, X., 8и1етап, Α., 8к1Ьо, Е.В. 2000. Ка(юпа1 бебдп оГругго1о. Втогд. Сбет. 28:324-37.

55. РгоибГоо(, Е.М., Маскау, ГР., Кагико, Р. 2001. РгоЬтд к11е крес1Г1с1(у оГ ΌΝΑ Ьтбтд те(а11от(егса1а(огк Ьу ЯМК крес(гоксору апб то1еси1аг тобейпд. Вюсбетййу. 40:4867-78.

56. Копбо, 8., К1п)о, Т., Υаηο, Υ. 2004. 8уп(бекй оГ а поуе1 т(егса1а(ог Ьакеб оп 2,2'-Ьтарб(ба1епе Ьеаппд б1те(бу1аттошит дгоирк. Вюогд. Меб. Сбет. бе((. 14:1641-3.

57. №е1кеп, С.В., Ре(егкеп, М., Ребегкеп, Е.В., Нагкеп, Р.Е., Сйпк(епкеп, и.В. 2004. ЯМК к(гис(иге бе(егттайоп оГ а тобШеб ΌΝΑ о11допис1ео(1бе соп(аштд а пег т(егса1а(тд пис1е1с ΑΜ. Вюсощид. Сбет. 15:260-9.

58. бш, Е., ’№апд, К., Ва1, О., Ζбаηд, Υ., Оао, б. 2004. Тбе рНЧпбисеб Етпккюп 8гйсЫпд апб [п1егек(тд ΌΝΑ-Втбтд Ргорегйек оГ а №те1 Оиш-с1еаг Ки(бешит(П) Сотр1ех. Шогд. Сбет. 43:1799-806.

59. Вгуег, Т., 8ессо, Е., Тте, М.К., Vеη(и^^т, М. 2004. Ктейск апб ес.|ш1|Ьпа Гог (бе ГогтаРоп оГ а пег ΌΝΑ те(а1-те(егса1а(ог: (бе сусйс ро1уатте №о(пепу'соррег(П) сотр1ех. ί. Йюгд. Втсбет. 98:33-10.

60. баигеШ, Е., бисак бе Ме1о, Е., Вепаб, ЕЙ., бе Ме1(о \^;'о1о1ао, Гс., сап(ок, Ν., бшпагек, К.Е., №/ага, С. 2003. Ике оГаспбте огапде к(аштд Гог (бе бе(ес(юп оГго(ау!гпк 6ΝΑ ίη ро1у асгу1 ат1бе де1к. 1 ^гок Ме(бобк. 114:29-35.

61. ’№опд, Е.6., Оообтд, ί.ί. 2003. Е1ес(гошс бе(ес(юп оГ (агде( пис1е1с атбк Ьу а 2,6-б1ки1Гошс атб ап(Нгадптопе т(егса1а(ог. Αηа1. Сбет. 75:3845-52.

62. биеб(ке, Ν.ν., бт, О., Тог, Υ. 2003. КNΑ-1^даηб т(егасйопк: аГйпйу апб кресШсйу оГ аттод1усок1бе б1тегк апб аспбте соп)ида(ек (о (бе НЕУ-1 Кеу гекропке е1етеп(. Вюсбет1к(гу. 42:11391-403.

63. Υатаηа, К., Кагакатц Ν., Об(кика, Т., 8ид1е, Υ., Nакаηο, Н., 8апо, I. 2003. Е1есйосбетка1 бе(есйоп оГ ктд1е-Ьаке т1кта(сбек ίη ΌΝΑ Ьу а гебох-ас(гуе т(егса1а(ог соп)ида(еб обдопис1еойбе. Шсйю Αс^бк Кек. 8ирр1. 2003:89-90.

64. Такапака, 8., Об(ика, К., М1уабага, Н., Хорта, Т., Такадц М. 2002. Αη апШгасепе бейуайуе саггутд Геггосепу1 то1ейек а( йк 9 апб 10 рокШопк ак а пег е1есйосбетка11у асйуе (бгеабтд т(егса1а(ог. Νιι^κ Αс^бк Кек. 8ирр1. 2002:291-2.

65. Х1ао. Υ., Кбап(опоу, ΑΒ., Ра(о1кку, Е., Vе^ζтаηη, Υ., νί1Μτ, I. 2003. Е1есйоса(а1уйс т(егса1а(огтбисеб гтбтд оГ боиЬ1е-к(гапбеб ΌΝΑ гйб ро1уаш1те. Сбет. Соттип. (СатЬ). 7:1540-1.

66. Вагиаб, Н., В1егЬасб, и. 2003. ипикиа1 т(егса1айоп оГ аспбт-9-у1(бгоигеа т(о (бе 5 ΌΑ/ТС ΌΝΑ Ьаке к(ер Ггот (бе ттог дгооуе: 1трйсайопк Гог (бе соуа1еп( ΌΝΑ аббис( ргой1е оГ а поуе1 р1а(титт(егса1а(ог соп)ида(е. Νιι^χ Αс^бк Кек. 31:4138-46.

67. Nο^^та, Т., Копбоб, Υ., Такепака, 8., кЫШата, Т., Такад1, М., Такбйо, Н., Ма(кито(о, К. 2001. Ое(есйоп оГ ΌΝΑ буЬг1б1ха(1оп Ьу ике оГ а 1ап(бап1бе йиогексеп( т(егса1а(ог (ба( кресгйса11у Ьтбк (о боиЬ1е к(гапбеб ΌΝΑ. ΝικΕχ Αс^бк Кек. 8ирр1. 2001:105-6.

68. ’№апд, 8., Репд, Т., Υаηд, С.Е., 2003. Е1ес(госбет1са1 бе(егттайоп оГ т(егас(юп рагате(егк Гог ΌΝΑ апб тйохапйопе ίη ап 1ггеуегк1Ь1е гебох ргосекк. Втрбук. Сбет. 104:239-48.

69. Ошйа(, б., Л1Ье^(^, Р., Коки, Е., Vаη М1ег(, 8., Тбе(ю(, Е., Р1е(егк, б., ОаЬейса, V., Ое Раиг, Е., О((ау1апг, Α., Кюи, ГЕ., Мегдпу, Гб., 2003. Iη(е^ас(^οηк оГ сгур(о1ерте апб пеосгур(о1ерте гйб ипикиа1 ΌΝΑ к(гис(игек. Вю-сЫт1е. 85:535-47.

70. Валу, С.О., Титеу, Е.С., Оау, С.8., 8а1и(а, О., Кисега, О.6., В1егЬасб, и., 2002. Тбегта11у тег( те(а1 атттек ак Ндб(-тбис1Ь1е ΌΝΑ-ίη^Μ адеп(к. 8уп(бек1к, рбо(осбет1к(гу, апб рбо(оЬю1оду оГ а рго(о(ур1са1 гбобштДЩ-тйгсаЩог соп)ида(е. Йюгд Сбет. 41:7159-69.

71. Сйпк(еп8еп, и.В., Ребегкеп, Е.В. 2002. Iη(е^са1а(^ηд пис1е1с атбк соп(а1шпд ткегйопк оГ 1-0-(1ругепу1те(бу1)д1усего1: к(аЬ111ха(1оп οГбк^NЛ апб бйспттайоп оГ ΌΝΑ оуег ΡΝΑ. Νιι^χ Αс^бк Кек. 30:4918-25.

72. Ра(о1кку, Р., КаЩ Е., V^11ηе^, I. 2002. Лтр1^Г^еб ΌΝΑ бе(есйоп Ьу е1ес(годепега(еб Ыосбетйит1пексепсе апб Ьу (бе са(а1ухеб ргетрйайоп оГ ап тко1иЬ1е ргобис( оп е1ес(гобек ίη (бе ргекепсе оГ (бе бохогиЫст т(егса1а(ог. Αηд^ег. Сбет. М Еб. Епд1. 41:3398-402.

73. ’№ообк, С.К., Iкй^^, Т., Водег, Ό.6. 2002. 8уп(бекй апб ΌΝΑ Ьтбтд ргорегйек оГ 1ттоб1асейс атбйпкеб ро1уат1бек: сбагасХпхаРоп оГ соорегайуе ех(епбеб 2:1 к1бе-Ьу-к1бе рага11е1 Ьтбтд. I. Αι. Сбет. 8ос. 124:10676-82.

74. -№ообк, С.К., Еаисбег, Ν., ЕксбдГа11ег, В., Вай, ΕΛν., Водег, Ό.6. 2002. 8уп(бекгк апб ΌΝΑ Ьтбтд

- 52 009302 ргорегйек оГ ка!ига!еб бк!атусш апа1одк. Вюогд. Меб. Скет. Ье!!. 12:2647-50.

75. Вгапа, М.Е., ПотФдие/, О., 8ае/, В., Вотегбак1, С., ВоЬшкоп, 8., Ваг1о//агк Т. 2002. 8уп!кек1к апб апхйитог асйуйу оГ пе\у бепбгФс ро1у-аттек-(|т1бе-ОХА-т1егса1а1ог) соп)ида!ек: ро!еп! Ьск 1пЫЬйогк. Еиг. б. Меб. Скет. 37:541-51.

76. ОпГе1к В., Оок!ппд, Ь., Ьтсо1п, Р., Хогбеп, В., ОпГе11, А. 2002. Се11 к!иб1ек оГ !ке ЭХА Ьк1т!егса1а!ог Пе1!а-Ле1!а [ти-С4 (србрр/)(2)-(ркеп)Ви(2)](4+): !ох1с еГГес!к апб ргорегйек ак а Идк! етййпд ^NΑ ргоЬе т ν79 СЫпеке катк!ег се11к. Ми!адепек1к. 17:317-20.

77. Вегде, Т., беп1спк, Ν.8., Норкйк, В.В., №аппд, М.Ь., Ебуагбкоп, 6.М., Непбегкоп, В.М. 2002. 8!гис!ига1 регФгЬайопк ш ^NΑ саикеб Ьу Ьк-т!егса1айоп оГ бйегсакпшт хкиак/еб Ьу а!отк Гогсе ткгоксору, Νυ^ΐο Ас1бк Век. 30:2980-6.

78. АгаЬ хабе к, А., Ва!как, 8.Ζ., Еагкат, Н., Атап1ои, М., 8аЬоигу, А.А., 8коскгау1, А., Моокаук Моуакеб1, А.А. 2002. 8!иб1ек оп тескапкт оГ 8-теΐкοxурκο^а1еп-^NΑ т!егас!юп Ф Фе багк. 1п!. б, Ркагт. 237:47-55.

79. Века, Ό., КаЬекас, М., Ву_)асек, Е., 8ропег, б., 8ропег, 6.Е., ЕкФег, М., 8ика1, 8., НоЬ/а, Р. 2002. Гп!егса1а!огк. 1. ΝιΦιό оГ к!асктд т!егас!юпк Ьейуееп т!егса1а!огк (еФ1бшт, баипотуст, еШрйсте, апб 4',6б1атш1бе-2-ркепу1тбо1е) апб ^NΑ Ьаке ракк. АЬ шйю уиаШит скет1са1, бепкйу Гипс!юпа1 !кеогу, апб етртса1 ро!епс1а1 к!ибу. б. Ат. Скет. 8ос. 124:3366-76.

80. Оие1еу, V., 8огеу, 8., НоГГтап, Όν., Гуегкоп, В.Ь. 2002. Скапдтд ^NΑ дгооуек-а 1,4,5,8парЫка1епе !е!гасагЬохукс бйт1бе Ьк-т!егса1а!ог \\йк Фе кпкег (Ье!а-А1а)(3)-Ьук Ф Фе ттог дгооуе. б. Ат. Скет. 8ос. 124:2864-5.

81. Ькдайеп, Γ.Ν., Сок, М., Ройида1, б., №пдк!, С.№., Аутатр б. 2002. Тке ап!1та1апа1 апб су!о!ох1с бгид сгур!о1ерте т!егса1а!ек т!о ^NΑ а! су!окте-су!окте кйек. Να!. 8!гис!. Вю1. 9:57-60.

82. Ееггу, Э.М., Vап Ζίρ, Р.Ь., №11коп, №.В. 2001. 8епкй1уе 1к|шб скгота!одгарЫс аккау Гог Фе Ьакк ^NΑ т!егса1а!ог (N,N-б^те!ку1ат^пοе!ку1)-9-ат^пο-5-те!ку1ас^^б^пе-4-.

83. СагЬохат1бе апб йк пйгоагу1те!ку1 с.|иа1егпагу ргобгидк Ф Ью1одка1 катр1ек. б. Скгота!одг. В. Вктеб. 8с1. Арр1. 763:149-56.

84. Ток, 6.В., Еепкег, б., 2001. №уе1 купФекк апб ВNΑ-Ь^пбтд ргорегйек о! атФод1усок1бе б1тегк соп)ида!еб У1а а парк!ка1епе бкт1бе-Ьакеб т!егса1а!ог. Вкогд. Меб. Скет. Ье!!. 11:2987-91.

85. Пкпек, Ζ., \оде1, Р. 1996. Акутейк 8упФекк апб ^NΑ Гп!егса1айоп оГ (-)-6[[(АтФоа1ку1)оху]те!ку1]-4-бетеШоху-6,7-б1беохубаипотустопек(1). б, Огд. Скет. 61:6958-6970.

86. Рараборои1ои, М.\^;'., Л, М., Вао, М.К., В1оотег, №.Ό. 2000. 4-[3-(2-Nй^ο-1-^т^баζο1у1)р^οру1ат^пο7-ск1огос.|ипокпе кубгосЫопбе (Ν^Ρ-1), а поуе1 Ыогебисйуе адеп! ак габюкепкЫ/ег Ф уйго апб ш у1уо: сотрапкоп νίΐΗ Фара/атте, Опсо1. Век. 12:325-33.

87. Водег, П.Ь., Тке, №.С. 2001. ТЫа/о1е огапде ак !ке Диогексеп! т!егса1а!ог ш а Ыдк геко1и!кп Дб аккау Гог бе!егттФд ^NΑ Ьтбтд аГГтйЦу апб кеуиепсе ке1есДуйу оГ кта11 то1еси1ек. Вкогд. Меб. Скет. 9:2511-8.

88. О1апо1к, Э.А., МсЬаидккп, Ь.№. 2001. ТеФегеб паркФакпе бкт1бе т!егса1а!огк епкапсе ^NΑ !пр1ех к!аЫ1йу. Вюогд. Меб. Скет. 9:2329-34.

89. ОпГе1!, В., Ыпсо1п, Р., В. 2001. Епап!юке1есйуе ^NΑ !кгеабтд бупаткк Ьу ркепа/те-

1Фкеб. б. Ат. Скет. 8ос. 123:3630-7.

90. №опд, М., Копд, 8., Игадоукка, №.Н., Ва11у, М.В. 2001, Оха/ок уе11о\у котоб1тег УОУО-11аЬе1еб ^NΑ: а Диогексеп! сотр1ех !ка! сап Ье икеб !о аккек к!гис!ига1 скапдек т ^NΑ Го11оутд Гогтайоп апб се11и1аг бекуегу оГ са!юшс Крбб ^NΑ сотр1ехек. ВюсЫт. Вюркук. Ас!а. 1527:61-72.

91. Нккк, К.О., Ргиуп, Е.В., Вади1еу, В.С., №11коп, №.В. 2001. Ех!гауакси1аг йапкрой оГ Фе ^NΑ ш!егса1а!ог апб !орокотегаке рокоп N-[2-(^^теΐку1ат^пο)еΐку1]ас^^б^пе-4-са^Ьοxат^бе (ЮАСА): бйФкюп апб те!аЬо1кт ш ти1!ке11и1аг 1ауегк оГ Фтог се11к. б. Ркагтасо1. Ехр. Ткег. 297:1088-98.

92. Ккко, б.Ь., Вайоп, б.К. 2000. Весодшйоп оГ ^NΑ Ьаке рай ткта!скек Ьу а сус1оте!а1а!еб Вк(Гй) т!егса1а!ог. Гпогд. Скет. 39:4942-9.

93. Иеек, Е.С., №кйДе1б, Ь.В., Огоуе, №.В., Витте1, 8., Огоскоу, Ь.В., Попекотег, В.С. 2000. А ркаке 1 апб ркагтасо1одк еуаЫайоп оГ Фе ^NΑ т!егса1а!ог СГ-958 Ф райеп!к уйк абуапсеб кокб Фтогк. С1т. Сапсег Век. 6:3885-94.

94. Ре11еу, В., Оапара!к1, В., №ооб, Ь., ВуЬккр Ь., МсЬат, Ό., Вибб, О.Т., РеегеЬоот, Ό., О1епск1, Т., Викоукк1, В.М. 2000. А ркаке 11 ркагтасобупатк к!ибу оГруга/о1оаспбте ш ра!кп!к уйк те!ак!а!к со1огес!а1 сапсег. Сапсег СкетоФег. Ркагтасо1. 46:251-4.

95. Ретп, Ь.С., Ргеп/1ег, РГО. СиШпапе, С., РЫШрк, И.В., Пеплу, №.А., МсЕабуеп, №.И. 2000. ^NΑ !агде!еб р1айпит сотр1ехек: куп!кекк, су!о!охкйу апб ^NΑ т!кгас!юпк оГск-бкк1огор1а!тит(П) сотр1ехек !еФегеб !о ркепа/те-1-сагЬоха1Ыбек. б. Гпогд. Вюскет. 81:111-7.

96. Ма/егкк1, б., Мискеук/, К. 2000. Тке т!егса1а!юп оГ пФба-хоаспбтопек т!о ^NΑ тбисек соп£Ьгтайопа1 скапдек Ф Фей к1бе скат. Ас!а. ВюсЫт. Ро1. 47:65-78.

97. 8а]еук/, №., Итдок/, А. 2000. Су!о!охкйу оГ коте ро!епйа1 ^NΑ т!егса1а!огк (сагка/ок аспбте апб апФгасепе бепхаНхек) еуаФа!еб Фгоидк пеийорЫ1 скетйитФексепсе. б. Арр1.Тохко1.20:305-12.

98. Отабас/, б., Ма.)ка, б., С/атеккк К., Ресупкка-С/оск, №., Ζак^ζеνκка-Сζе^у^пκка, б., Кас/тагек,

- 53 009302

Ь., 8ока1кк1, У.А. 2000. 8ес.|иепсе-ке1есихПу оГ 5,11-б1те!ку1-5Н-тбо1о[2,3-Ь]дшпокпе Ьтбтд !о ΌΝΑ. Роо!-ргт!тд апб то1еси1аг тобейпд к!иб1ек. Вюогд. Меб. Скет. 8:937-43.

99. К1гкскк!ет, О., 81р, М., К1!!еп Ь. 2000. ОиапШайхе апб кедиепсе-кресШс апа1ук1к оГ ОИА-Идапб т!егаскоп Ьу теапк оГ Диогексеп! т!егса1а!ог ргоЬек. Е Мо1. Кесодт!. 13:157-63.

100. Мппех, М.Е., №уек, К.Т. С1апоко, Ό.Α., МсЬаидЫт, Ь.У., Вайоп, ЕК. 2000. Ьопд-гапде диатпе ох1ба!юп т ΌΝΑ гек!пс!юп Ггадтеп!к Ьу а Д1р1ех-б1гес!еб парка!ка1епе бит1бе т!егса1а!ог. ВюскетИДу. 39:6190-9.

101. Еюккоп, В.А., ВаДоп, ЕК. 2000. КесодшДоп оГ Ьаке т1кта!скек т ΌΝΑ Ьу 5,6-скгукепедшпопе битте сотр1ехек оГгкобшт(ПТ): а ргорокеб тескашкт Гог ргеГегепДа1 Ьтбтд т бек!аЬШ/еб гедюпк оГ !ке боиЬ1е кекх. ВюскетбДу. 39:6176-82.

102. Скеп, Ρ.Υ., Ы, О.Ь.Ь., 2као, Υ., Υапд, Н.Н., 2ки, ρ.Ζ., Хи, ЕС. 1999. Мегаскоп оГ а поуе1 гебгедюп Диогексеп! ргоЬе, №1е Ь1ие, текк ΌΝΑ апб 1!к аррксакоп !о пис1ею атбк аккау. Апа1ук!. 124:901-6.

103. ОаккоппеуШе, Ь., ХУаНех, Ν., МаЫеи, С., Со1коп, Р., НоикДег, С., Ргебепск, М., Т1!к, М., Апдепо!, Ь., ВаШу, С. 1999. Тке р1ап! а1ка1о1б икатЬагепкте т!егса1а!ек т!о ΌΝΑ апб тбисек арор!окб т китап НЬ60 1еикет1а се11к. АпДсапсег Кек. 19:5245-50.

104. ТокЫта, К., Такапо, К., Маеба, Υ., 8и/икЕ М., Ака1, А., Ма!китига, 8. 1999. 2-Ркепу1с.|шпо1теСагЬокубга!е НуЬпбк: Мо1еси1аг Оетдп, Скетка1 8уп!кек1к, апб Еуа1иа!юп оГ а Иете Ратку оГЪ1дк!Ас!1уа!аЬ1е ОИА-С1еаутд Адеп!к. Апдете. Скет. Ιπΐ. Еб. Епд1. 38:3733-3735.

105. Υаπд, Х., Ыи, МН., 1п, У.Е, 8кеп, С.Ь., Υυ, КД 1999. ΌΝΑ Ьтбтд к!иб1ек оГ а ко1уа!оскготк Пиогексепсе ргоЬе 3-те!кохуЬеп2ап!кгопе. 8рес!осЫт. Ас!а. А Мо1. Вюто1. 8рескокс. 55А:2719-27.

106. Мие11ег, 8.О., 8!оррег, Н. 1999. Скагааеп/акоп оГ !ке депо!ох1сбу оГ ап!кгадитопек ш татта11ап се11к. ВюсЫт. Вюркук. Ас!а. 1428:406-14.

107. Дюне, Т., 8идтга, Υ., 8айок, Е, НЫдиго, Т., О!кика, М., 1999. Р1игогексепск ргореДу оГохахо1е уе11оте-Дпкеб окдопис1еоДбе. ТДр1е кекх ГогтаДоп апб рко!ос1еауаде оГ боиЬ1е-к!гапбеб ΌΝΑ ш !ке ргекепсе оГкрегтте. Вюогд. Меб. Скет. 7:1207-11.

108. Оетрсу, К.О., Ки!уау1п, Ι.ν., М111к, А.С, Ьикк!апоу, Е.А., Меуег, К.В. 1999. Ьткегк беДдпеб !о т!егса1а!е !ке боиЬ1е кекх дгеаДу ГасШ!а!е ΌΝΑ а1ку1аДоп Ьу !Др1ех-Гогтшд о11допис1еоДбек сапутд а сус1оргораругго1отбо1е геасДуе то!е!у. Иис1ею Атбк Кек. 27:2931-7.

109. Керр1ег, М., Ζед^оска, О., 8кекотекк1, Ь., Рох, К.К. 1999. ΌΝΑ !йр1е кекх к!аЬШ/аДоп Ьу а парк!ку1дито1те б1ттег. РЕВ8 Ье!!. 447:223-6.

110. Ок!ак/етек1, К., Уксхупкка, Е., Уо1к/с/ак, М. 1998. Тке куп!кек1к оГ апете !уре оГ ап!кгасепе ΌΝΑ 1п!егса1а!ог. Вюогд. Меб. Скет. Ье!!. 8:2995-6.

111. А!тее11, С.Е, Рап, ΕΥ., Тап, К., Оеппу, У.А. 1998. ОИА-О1гес!еб а1ку1а!тд адеп!к.7. 8уп!кек1к, ΌΝΑ т!егас!юп, апб ап!1!итог асДубу оГ -Ык(кубгохуте!ку1)- апб Ык(сагЬата!е)-киЬк!1!и!ебруггок71пек апб тиба/о1ек. ЕМеб. Скет. 41:4744-54.

112. МДапо, М.Т., Ни, С.С., У1Шатк Ό.Ό., Веткагб, У.А. 1998. М1дга!юп оГ е1есДопк апб ко1ек т сгук!аШпе б(ССАТСС)-ап!кгасускпе сотр1ехек Х-1ггаб1а!еб а! 4К. Каб1а!. Ке. 150:101-14,

113. Вепкоп, 8.С., Ма!Ыек, К.А., С1ахег, Α.Ν. 1993. Не!егоб1теДс ΌΝΑ-Ьтбтд буек беДдпеб Гог епегду !гапкГег: к!аЬ11Ду апб аррИсаДопк оГ !ке ΌΝΑ сотр1ехек. М.1с1ею Ас1бк Кекеагск. 21:5720-5726.

114. Вепкоп, 8.С., 8тдЬ, Р., С1ахег, Α.Ν. 1993. Не!егоб1теДс ΌΝΑ-Ьтбтд буек беДдпеб Гог епегду ДапГег: куп!кек1к апб крескоксорю ргорегДек. Ыис1е1с Ас1бк Кекеагск. 21:5727-5735.

115. 8тбк, ГО., О1коп, Ό.Α., Агткаде, В.А. 1999. Мо1еси1аг гесодтДоп оГ РЫА-соп!а1п1пд кукпбк: 8роп!апеоик аккетЬ1у оГ кекса1 суашпе буе аддгеда!ек оп РЫЛ !етр1а!ек. Е Ат. Скет.8ос. 121:2686-2695.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные здесь, включены в описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в такой же степени, как если было бы конкретно указано, что каждая индивидуальная публикация, патент или патентная заявка включены здесь посредством ссылки. Хотя представленное изобретение было описано в некоторых деталях посредством иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, в свете раскрытия этого изобретения для специалистов в данной области техники совершенно очевидно, что определённые изменения и модификации могут быть сделаны без отхода от сущности и объёма раскрытия.

Claims (23)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ качественного или количественного обнаружения мишеневого полинуклеотида в образце, содержащий следующие шаги:

   а) изготавливают первую смесь, содержащую образец, аналог нуклеиновой кислоты, который комплементарен мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты, и краситель;

   б) воздействуют на первую смесь стимулирующим средством для изменения скорости изменения его оптической характеристики, при этом оптическая характеристика первой смеси до и после воздействия стимулирующего средства отличается по меньшей мере на 15% в течение примерно 30 мин после этого воздействия;

   в) коррелируют качественно или количественно обнаружение определённого мишеневого полинук

   - 54 009302 леотида в образце с разностью в оптической характеристике первой смеси до и после шага воздействия.
2. 2. Способ по п.1, содержащий далее шаги, в которых определяют относительную скорость изменения оптической характеристики первой смеси, сравнивают скорость изменения в оптической характеристике первой смеси с эталонным значением, которое представляет собой характеристику скорости изменения оптической характеристики второй смеси, которая содержит известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты и краситель, после того, как вторую смесь подвергают воздействию стимулирующего средства для изменения скорости изменения оптической характеристики второй смеси, при этом известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты равно нулю или более; и коррелируют качественно или количественно обнаружение мишеневого полинуклеотида в образце с относительной скоростью изменения оптической характеристики первой смеси.
3. 3. Способ по п.1, в котором подвергают краситель химической реакции в ответ на стимулирующее средство.
4. 4. Способ по п.3, в котором аналогом нуклеиновой кислоты является пептидная нуклеиновая кислота (ΡΝΑ).
5. 5. Способ по п.3, в котором аналогом нуклеиновой кислоты является замкнутая нуклеиновая кислота (ΕΝΑ).
6. 6. Способ по п.3, в котором мишеневым полинуклеотидом является ДНК.
7. 7. Способ по п.3, в котором краситель является цианиновым красителем.
8. 8. Способ по п.7, в котором цианиновый краситель выбирают из группы, состоящей из 3,3'диэтилтиацианин йодида, 3,3'-диэтилтиакарбоцианин йодида, 3,3'-диэтилтиадикарбоцианин йодида и 3,3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодида.
9. 9. Способ по п.1, в котором оптическая характеристика представляет собой цвет, поглощение или флуоресценцию.
10. 10. Способ по п.1, в котором мишеневым полинуклеотидом является ДНК.
11. 11. Способ по п.3, в котором мишеневым полинуклеотидом является РНК.
12. 12. Способ по п.1, в котором аналог нуклеиновой кислоты включает в себя комплементарную область, которая имеет длину, большую, чем примерно 4 нуклеотидных основания, и меньшую, чем примерно 24 нуклеотидных основания.
13. 13. Способ по п.1, в котором аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид иммобилизован на твёрдом субстрате.
14. 14. Способ по п.1, в котором стимулирующее средство вызывает более высокую скорость изменения оптической характеристики первой смеси по сравнению с изменением оптической характеристики второй смеси.
15. 15. Способ по п.1, в котором стимулирующее средство вызывает более низкую скорость изменения оптической характеристики первой смеси по сравнению с изменением оптической характеристики второй смеси.
16. 16. Способ по п.1, в котором краситель является цианиновым красителем.
17. 17. Способ по п.16, в котором цианиновый краситель выбирают из группы, состоящей из 3,3'диэтилтиацианин йодида, 3,3'-диэтилтиакарбоцианин йодида, 3,3'-диэтилтиадикарбоцианин йодида и 3,3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодида.
18. 18. Способ по п.1, в котором оптическая характеристика представляет собой цвет, поглощение или флуоресценцию.
19. 19. Способ обнаружения сингулярного нуклеотидного полиморфизма (8ΝΡ), содержащий качественное или количественное обнаружение мишеневого полинуклеотида в образце согласно способу по п.1, в котором мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты является последовательностью, специфичной для 8ΝΡ, и в котором качественное или количественное обнаружение мишеневого полинуклеотида указывает на упомянутый 8ΝΡ.
20. 20. Способ обнаружения организма в образце, содержащий качественное или количественное обнаружение мишеневого полинуклеотида в образце согласно способу по п.1, в котором мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты является последовательностью, специфичной для организма, и в котором качественное или количественное обнаружение мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество упомянутого организма.
21. 21. Набор для выполнения способа по п.1, содержащий:

    а) один или более аналогов нуклеиновой кислоты;

    б) по меньшей мере один краситель;

    в) источник стимулирующего средства.
22. 22. Способ качественного или количественного обнаружения мишеневого полинуклеотида в образце, содержащий следующие шаги:

    а) изготавливают первую смесь, содержащую образец, первое средство для воздействия на оптическую характеристику первой смеси, второе средство для катализа химической реакции, которая воздействует на первое средство, и третье средство для стимуляции этой химической реакции, при этом второе

    - 55 009302 средство включает в себя мишеневый полинуклеотид и аналог нуклеиновой кислоты, который комплементарен мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида;

    б) воздействуют на первую смесь стимулирующим средством для изменения скорости изменения его оптической характеристики, при этом оптическая характеристика первой смеси до и после воздействия стимулирующего средства отличается по меньшей мере на 15% в течение примерно 30 мин после этого воздействия;

    в) коррелируют качественно или количественно обнаружение определённого мишеневого полинуклеотида в образце с разностью в оптической характеристике первой смеси до и после шага воздействия.
23. 23. Способ по п.22, в котором первое средство представляет собой краситель, а третье средство является светом.