EA024452B1 - Слитый белок против рака - Google Patents

Abstract

Слитый белок, содержащий домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент белковой последовательности hTRAIL, который начинается с аминокислоты в положении не ниже hTRAIL95, или гомолог указанного функционального фрагмента, имеющий по меньшей мере 70% идентичность последовательности; и домен (b), который представляет собой последовательность иммуностимулирующего эффекторного пептида, где последовательность домена (b) связана с С-концом или N-концом домена (а). Слитый белок можно использовать для лечения раковых заболеваний.

Description

Изобретение относится к области терапевтических слитых белков, в частности рекомбинантных слитых белков. Более конкретно изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагмент последовательности растворимого белка ТКАТЬ человека в комбинации с последовательностью иммуностимулирующего пептида, к фармацевтическим композициям, содержащим их, к их применению в терапии, в частности, в качестве средств против рака, и к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим слитые белки, экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотидные последовательности, и клеткам-хозяевам, содержащим эти экспрессирующие векторы.

Белок ТКАТЬ, принадлежащий семейству цитокинов (родственный фактору некроза опухоли индуцирующий апоптоз лиганд), также известный как Аро2Ь (Аро2-лиганд), является мощным активатором апоптоза в опухолевых клетках и в клетках, инфицированных вирусами. ТКАТЬ представляет собой лиганд, естественным образом, встречающийся в организме. Белок ТКА!Ь, его аминокислотная последовательность, кодирующие последовательности ДНК и системы экспрессии белков впервые были описаны в ЕР0835305А1.

Белок ТКА1Ь проявляет его активность против рака путем связывания с проапоптотическими поверхностными рецепторами ТКАТЬ 1 и 2 (ТКАТЬ-К1/К2) и последующей активации этих рецепторов. Эти рецепторы, также известные как ИК4 и ИК5 (рецептор смерти 4 и рецептор смерти 5), принадлежат семейству рецепторов ТИР и сверхэкспрессируются различными типами раковых клеток. Активация этих рецепторов может индуцировать внешний каскад передачи сигнала апоптоза, независимого от генасупрессора р53, который путем активации каспазы 8 приводит к активации исполнительных каспаз и, тем самым, деградации нуклеиновых кислот. Каспаза 8, высвобождаемая при активации ТКА!Ь, также может вызывать высвобождение белка Βίά и, тем самым, непрямую активацию митоходриального каскада, причем белок Βίά, транслоцированный в митохондрии, где он стимулирует высвобождение цитохрома с, таким образом, непрямо усиливает апоптотический сигнал рецепторов смерти.

ТКАТЬ действует селективно на опухолевые клетки, по существу не индуцируя апоптоз в здоровых клетках, которые устойчивы к этому белку. Таким образом, был признан огромный потенциал ТКАТЬ в качестве средства против рака, которое действует на широкий диапазон различных типов опухолевых клеток, включая гематологические злокачественные опухоли и солидные опухоли, одновременно сохраняя нормальные клетки и вызывая потенциально относительно небольшие побочные эффекты.

Белок ТКА1Ь представляет собой мембранный белок типа II, имеющий длину 281 аминокислот, и его внеклеточная область, содержащая аминокислотные остатки 114-281, при расщеплении протеазами образует растворимую молекулу кТКАТЬ размером 20 кДа, которая также является биологически активной. Как форма ТКАТЬ, так и форма кТКАТЬ, способны запускать апоптоз через взаимодействие с рецепторами ТКА1Ь, присутствующими на клетках-мишенях. Высокая противоопухолевая активность и очень низкая системная токсичность растворимой части молекулы ТКА1Ь были продемонстрированы с использованием исследований на клеточных линиях.

Клинические испытания у человека с рекомбинантным растворимым ТКА1Ь человека (гЬТКАТЬ), имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 114-281 ЬТКА1Ь, известным под ΙΝΝ дуланермин, также показали его хорошую переносимость и отсутствие лимитирующей дозу токсичности.

Также было выявлено, что фрагмент ТКАТЬ, более короткий, чем 114-281, способен связываться с мембранными рецепторами смерти и индуцировать апоптоз через эти рецепторы, как недавно описано для рекомбинантного, полученного путем круговой пермутации мутанта 122-281 ЬТКАТЬ, например, в ЕР 1 688 498.

Токсические эффекты рекомбинантного белка ТКА1Ь на клетки печени, описанные до настоящего времени, по-видимому, ассоциированы с присутствием модификации, т.е. полигистидиновых меток, в то время как немеченый ТКАТЬ не продемонстрировал системной токсичности.

Однако в ходе дальнейшего исследования и разработки, оказалось, что многие раковые клетки также продемонстрировали первичную или приобретенную устойчивость к ТКАТЬ (см. например, \νθ2007/022214). Хотя механизм устойчивости к ТКАТЬ не полностью понятен, полагают, что он может проявлять себя на различных уровнях индуцируемого ТКАТЬ каскада апоптоза, находящихся в диапазоне от уровня рецепторов клеточной поверхности до исполнительных каспаз в каскаде передачи сигнала. Эта устойчивость ограничивает применимость ТКАТЬ в качестве средства против рака.

Более того, в клинических испытаниях на пациентах показано, что истинная эффективность ТКАТЬ в качестве монотерапии является низкой. Для преодоления этой низкой эффективности и устойчивости опухолей к ТКАТЬ были разработаны различные способы комбинированной терапии с радио- и химиотерапевтическими средствами, которые обеспечивали синергический апоптотический эффект (νθ2009/002947; А. А1ша8аи αηά А. А^Нкспа/г Су!окше Сго\\1к Рас!ог КсОс\У5 14 (2003) 337-348; КК 8г1уа51ауа, №ор1а§18, Уо1 3, Νο 6, 2001, 535-546, §опа 1С е! а1., I. С1ш. Оисо1оду, Уо1 28, Νο 9 (2010), р. 1527-1533). Использование гЬТКАТЬ для лечения рака в комбинации с выбранными общепринятыми химиотерапевтическими средствами (паклитаксел, карбоплатин) и моноклональными антителами против УЬОР описано в νθ 2009/140469. Однако такая комбинация обязательно подразумевает хорошо известные недостатки общепринятой химиотерапии или лучевой терапии.

- 1 024452

Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности ингибитора ангиогенеза вазостатина и ТКЛ1Ы14-281, связанные с помощью линкера с участком расщепления металлопротеазой, был описан в качестве проявляющего эффект индукции апоптоза в опухолевых клетках, Α.Ι. Сио е! а1, СЫпеке 1оигпа1 оГ ВюсНетМгу апб Мо1еси1аг Вю1оду 2008, νοί. 24(10), 925-930. Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности тумстатина 183-230 из ингибитора ангиогенеза тумстатина и ТКА1Ш14-281 был описан как проявляющий индукцию апоптоза клеток рака поджелудочной железы, Ы.Кеп е! а1. ίη Асабетю 1оита1 оГ 8есопб МПбагу Мебюа1 ЬпЬегкЦу 2008, νο1. 28(5), 676-478.

В И8 2005/244370 и соответствующей \УО 2004/035794 описана конструкция ТКА1Ь95-281 в качестве эффекторного домена, связанного через пептидный линкер с внеклеточной частью другого представителя семейства лигандов ΨΝΡ СЭ40 в качестве домена, связывающегося с клеточной поверхностью. Утверждается, что активация конструкции происходит через связывание ее СЭ40-части.

Более того, было показано, что проблемой, связанной с терапией ТКАТЬ, является его низкая стабильность и быстрое выведение из организма после введения.

Преимущественный эффект цитокинов в терапии рака также известен. Представителем семейства цитокинов является интерферон - белок, который стимулирует иммунную систему. Интерфероны являются важными средствами против рака или вспомогательными средствами против рака (Вогбеп апб ^йПатк, ШегГегопк, Сапсег Мебюше, 511 ебйюп, 815-824, 2000). Было показано, что одним из эффектов интерферонов является сильная стимуляция множества проапоптотических факторов, включая лиганд ТКАТЬ.

Типичным представителем группы интерферонов типа II является интерферон-гамма (ΙΡΝ-γ), который представляет собой димерный растворимый цитокин. ΙΡΝ-γ секретируется ΝΚ, ΝΚ/Г, Т11, Тс и дендритными клетками. Лиганд ΙΡΝ-Υ связывается с двумя типами рецептора ΙΡΝ-γ Ка И ΙΡΝ-γ Κβ 1 и активирует каскад 1АК-8ТАТ. Одним из его эффектов является интенсивная стимуляция продуцирования моноцитами человека белка ТКАРЬ, который значительно влияет на их способность устранять раковые клетки (Сгйй!Ь е! а1, 1. Ехр. Меб., 189:1343-1353, 1999).

Интерферон-гамма активирует рецептор ΙΡΝ-гамма, стимулирующий антитело-зависимую токсичность, и усиливает процесс взаимодействия клеток с опухолевыми клетками. Кроме того, ΙΡΝ-гамма активирует каспазы, тем самым, индуцируя апоптоз в раковых клетках. Кроме того, было продемонстрировано, что во многих опухолевых линиях, демонстрирующих устойчивость к стимулируемому ТКАТЬ апоптозу, интерферон-гамма действовал синергично, внося вклад в их чувствительность к ТКАГЬ (\Уапд е! а1, Опсодепе, 23: 928-935, 2004). Однако существующие способы терапии с использованием ΙΡΝ-гамма не являются достаточно эффективными, чтобы применяться в лечении раковых заболеваний.

Также были продемонстрированы благоприятные эффекты интерферона-альфа на индукцию сверхпродукции ТКАШ в клетках миеломы, лимфом и рака печени (С1еп и е! а1, В1ооб, 98: 2183-21192; Нег/ег е! а1, Сапсег Ке8. 69(3): 855-862, 2009). Интерферон-альфа считается модулятором биологического ответа, который усиливает природные ответы организма на заболевания. Он влияет как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет. Он стимулирует продукцию антител против рака, активирует цитотоксическое действие макрофагов, ΝΚ-клеток и лимфоцитов. ΙΝΡ-альфа также увеличивает экспрессию антигенов гистосовместимости НЬА на раковых клетках, которые способствуют их распознаванию иммунными клетками. Он опосредует замедление роста и деления раковых клеток, и впоследствии их смерть.

Интерферон-альфа используют для лечения различных типов рака, включая волосатоклеточный лейкоз, меланому, рак почки, миелобластический и миелоцитарный лейкоз, лимфому, саркому Капоши и другие неопластические заболевания крови ^о1ктап ί., Ν. Епд1. ί. Меб.1995, 333: 1757-1763; 81бку ΥΑ, Вогбеп ЕС. Сапсег Кек. 1987. 47: 5155-5161; Ьеадак Н, Ηί/Ша А, ΥοκЬ^ηο Т, е! а1., Апйсапсег Кек. 1993, 13: 13-15; КиЪшдег М, Р1епбег1ейк ΙΗ, ЬеП/тап М, е! а1, Скек!. 1995, 108:281-282). Однако в дозе, требуемой для достижения терапевтического эффекта у пациентов, наблюдали токсические эффекты, такие как нейтропения, гриппоподобные симптомы, чувство дискомфорта, анорексия и дисфункция печени. Вследствие этих побочных эффектов терапию интерфероном-альфа часто прекращают, что делает эту терапию неэффективной. Более того, биологическое время полужизни большинства цитокинов, включая интерферон-альфа, является коротким и не более нескольких часов, вследствие чего требуются частые инъекции. По различным причинам, частое введение лекарственного средства является неудобным для пациента (особенно при длительном лечении). Это привело к необходимости разработки составов интерферонаальфа с пролонгированным высвобождением.

Было предпринято несколько попыток улучшить свойства интерферона-альфа. Попытка продлить биологическое время полужизни интерферона путем предоставления гетеродимерных слитых конструкций с белками-переносчиками, содержащих линкеры, обеспечивающие надлежащее сворачивание экспрессированных слитых белков, описана, например, в И87943733. Другие попытки основаны на решенной структуре биологически активной формы интерферона, т.е. ее образующихся в природе нековалентных гомодимерах, которые образуются с помощью антипаралельного взаимного сцепления двух мономеров в рецепторном участке с помощью иона цинка (2п²⁺) (К. КабНакпкНпап, 8!гис!иге 1996, Уо1. 4 № 12, 1453-1463). Конструкции гомодимеров интерферона-альфа, связанные через глицин-сериновый лин- 2 024452 кер, упомянуты в патентной заявке БТ2010012, однако данные об их активности не предоставлены.

Известно, что ΙΡΝγ действует в качестве нековалентно асоциированного гомодимера, в котором две идентичных полипептидных цепи ориентированы антипараллельно, образуя симметричную молекулу (Еайск, δ. Е., 8с1еиее (1991) 262, 698-702). Таким образом, существует возможность, что димерные формы ΙΡΝγ могут оккупировать участок связывания рецептора более эффективно, однако эта гипотеза не была клинически подтверждена.

Попытки разработать производные альфа-интерферона, которые были бы свободны от упомянутых выше побочных эффектов, привели к внедрению лечения пегилированными альфа-интерферонами длительного действия. Пегилирование является одним из распространенных способов введения белков в организм млекопитающих, нацеленным на снижение или преодоление побочных эффектов активного вещества. Принципом пегилирования является создание защитного барьера вокруг модифицированных молекул, что приводит к продлению времени желаемой концентрации вещества (вследствие изменения фармакокинетических и фармакодинамических свойств). Время всасывания увеличивается, и выведение из организма является более длительным.

Величины этих параметров зависят от структуры молекул полиэтиленгликоля (РЕС): длины цепи, линейности, степени ветвления, типа и количества участков связывания и количества присоединенных молекул гликоля. [Ие1дайо С, Егапсй СЕ, Еййег Ό., Тйе икек и ргорегйек оГ РЕС-йикей ргсйешк. Сйй Кеу. Тйег. Эгид Сатег 8укй. 1992; 9 (3-4): 249-304].

Пегилирование не влияет на связывание интерферона с его рецептором. Доклинические испытания продемонстрировали, что пегилированный интерферон-альфа связывается с рецептором ШЫа-2а и оказывает такую же, или более высокую биологическую активность ίη νίίτο, что подтверждено в исследованиях на культуре опухолевых клеток и на мышах с имплантированными клетками карциномы почки человека ^1еГоПН К, №йеаи К, Ра1е1 ΙΗ, Мои1й Ό. Ике оГ ап тййес! рйагтасойупатю кйти1айоп тойе1 оГ МХ ргсйет тйисйоп 1о сотраге ίη νί\Ό асй\йу оГ йИегГегоп а-2а апй а ро1уе1йу1епе д1усо1-тоййтей йетай\'е ίη йеаййу киЬ|ес1к. Сйп. Рйагтасо1. Тйег. 1996; 59: 636-46; Раи1 С, е1 а1. Реду1а1ей йиегГегоп - а-2Ь: Рйагтасокшейск, рйагтасойупатюк, каГе!у, апй ргейттагу еГЛсасу йа1а. Сйп. Рйагтасо1. Тйег. 2000; 68: 556-67].

Несмотря на перспективные данные из экспериментах с моделями на животных, коммерчески доступные, содержащие пегилированный интерферон препараты РЕСйИгоп® и РЕСА8У8® (С. Раки!, Р.М. Уегопеке, Ргод. Ро1ут. 8сг 32 (2007) 933-961), с разветвленными цепями РЕС массой 40 кДа и линейными цепями РЕС массой 12 кДа, присоединенными к ΙΡΝα, соответственно, продемонстрировали профиль безопасности, количественно сходный или даже худший, чем соответствующие немодифицированные молекулы интерферонов (Вико\ук1й К. М. е1 а1., Сапсег, 95(2):389-96 (2002); Вико\ук1й К. М. е1 а1., 1оигпа1 оГ Сйшса1 Опсо1оду, 20 (18): 3841-3949 (2002); \1о1/ег К. 1. е1 а1., 1. Сйп. Опсо1., 19(5): 1312-9 (2001); Топд М.Т, 1оигпа1 оГ йИегГегоп апй СуЮкте Кекеагсй, 18:81-86 (1998); Уао С. В. е1 а1., 1оигпа1 оГ Сак1гоеп1его1оду апй Нера!о1од., 15: 1165-1170 (2000); НеаШсо!е Е. 1. е1 а1, Ν. Епд1. 1. Мей., 343(23):1673-80 (2000); Топд М. 1. е1 а1., Нера1о1оду; 26(3):747-54 (1997)).

Наиболее часто наблюдаемые побочные эффекты терапии пегилированным ΙΡΝα включают: дозозависимую тошноту, анорексию, ригидность мышц. Кроме того, более длительная терапия выявила огранчивающие дозу эффекты, такие как тяжелая усталость, нейротоксичность, нарушение функции печени и ингибирование функции костного мозга (РЕС-йИгоп® в дозах 7,5 мкг/кг и выше) (Вико^кй К. М. е1 а1., Сапсег; 95(2):389-96 (2002)).

Таким образом, несмотря на существование клинически используемых способов терапии на основе белка ТКАТЬ и белков семейства интерферонов (также модифицированных, в частности, пегилированием), они являются недостаточно эффективными и имеют множество хорошо известных недостатков, среди которых одними из наиболее тяжелых и ограничивающих являются ограниченная эффективность лечения, отсутствие селективности в отношении раковых клеток, побочные эффекты и первичная или приобретенная устойчивость. Все еще существует потребность в усовершенствованной терапии рака на основе активности как интерферона, так и белка ТКАГЬ, которая была бы как эффективной, так и селективной ш νί\Ό против раковых клеток. Остается неотложная и неудовлетворенная потребность в новых средствах против рака, которые позволили бы как расширение диапазона доступных средств, так и выявление средств, которые являются более эффективными (цитотоксичными) и селективными. Также существует потребность в новых селективных средствах с увеличенной стабильностью и улучшенной фармакокинетикой.

Настоящее изобретение относится к решению этой проблемы с помощью новых слитых белков, которые включают домен, происходящий из ТКАГЬ, и короткий домен эффекторного пептида, имеющий активность стимуляции иммунной системы, причем этот эффекторный пептид не включает фрагменты ТКА1Ь, где эффекторный пептид усиливает или дополняет действие ТКАГЬ. Более того, оказалось, что во многих случаях слитые белки по изобретению являются более мощными, чем растворимый ТКАГЬ и его варианты, состоящие из фрагментов его последовательности, а также более мощными, чем соответствующие эффекторные пептиды. Во многих случаях новые слитые белки также преодолевают устойчи- 3 024452 вость к ТКАТЬ. Более того, включение эффекторного пептида приводит к продлению времени полужизни и увеличению удержания белка в опухоли и повышению его эффективности. Кроме того, в определенных вариантах новые слитые белки могут быть связаны РЕС, что имеет защитный эффект против неспецифических протеаз и, кроме того, изменяет фармакокинетические и фармакодинамические свойства, в частности, в отношении продления биологического времени полужизни.

Описание чертежей

Изобретение далее подробно описано с помощью фигур.

На фиг. 1 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 1, примером 2, примером 3 и примером 4.

На фиг. 2 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 5, примером 6, примером 7, примером 8, примером 9, примером 10 и примером 11.

На фиг. 3 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 12, примером 13, примером 14 и примером 15.

На фиг. 4 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 16 и примером 17.

На фиг. 5 представлены спектры кругового дихроизма для г11ТРЛ1Б114-281. гНТРЛ1Б95-281 и слитых белков в соответствии с примером 12, примером 5, примером 3 и примером 14, выраженные в удельной эллиптичности.

На фиг. 6 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышей Сг1:СО1-Рохп1, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 по сравнению с ιΉΡΛΙΕ114-281.

На фиг. 7 представлены величины ингибирования роста опухоли (%ТС1) у мышей Сг1:СО1-Рохп1, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 по сравнению с ιΉΡΛΙΕ114-281.

На фиг. 8 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышей СгТЗНО-РгкаИНг¹', нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ116, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с тЬТКАТЬ114-281.

На фиг. 9 представлены величины ингибирования роста опухоли (%ТС1) у мышей Ст1:§НОРткас^8С10Нт^Ьг, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ116, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с ткТКАТЬ114-281.

На фиг. 10 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышей Ст1:§НО-Рткас^8С10Нг^Ьг, нагруженных клетками рака печени РЬС/РКЕ/5, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с тЬТКАТЬ114-281.

На фиг. 11 представлены величины ингибирования роста опухоли (%ТС1) у мышей Ст1:§НОРткас^8С10Нт^Ьг, нагруженных клетками рака печени РЬС/РКЕ/5, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с тЬТКАТЬ114-281.

На фиг. 12 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышей Ст1:§НО-Рткас^8с1аНг^Вг, нагруженных клетками рака печени НерС2, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с тЬТКАТЬ114-281.

На фиг. 13 представлены величины ингибирования роста опухоли (%ТС1) у мышей Ст1:§НОРткас^8с1аНт^Ьг, нагруженных клетками рака печени НерС2, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с ткТКАТЬ114-281.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к слитому белку, содержащему:

домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка ЬТКАТЬ, который начинается с аминокислоты в положении не ниже ИКАТЬ95, или гомолог указанного функционального фрагмента, имеющий по меньшей мере 70% идентичность последовательности, и домен (Ь), который представляет собой последовательность иммуностимулирующего эффекторного пептида, где последовательность домена (Ь) присоединена к С-концу и/или Ν-концу домена (а).

Термин функциональный растворимый фрагмент последовательности растворимого ИКАТЬ следует понимать как обозначающий любой такой фрагмент растворимого ИКАТЬ, который способен индуцировать апоптотический сигнал в клетках млекопитающих при связывании с его рецепторами на поверхности клеток.

Также квалифицированному специалисту будет понятно, что существование по меньшей мере 70% гомологии с последовательностью ТКАТЬ известно в данной области.

Следует понимать, что домен (Ь) эффекторного пептида в слитом белке по изобретению не является ни белком НКА1Ь, ни частью или фрагментом белка ИКАТЬ.

Термин пептид в соответствии с изобретением следует понимать как молекулу, составленную из множества аминокислот, связанных друг с другом пептидной связью. Таким образом, термин пептид в соответствии с изобретением включает олигопептиды, полипептиды и белки.

В рамках настоящего изобретения аминокислотные последовательности пептидов представлены

- 4 024452 общепринятым путем, признанным в данной области, т.е. в направлении от Ν-конца (Ν-концевой части) пептида к С-концу (С-концевой части). Таким образом, в любой последовательности Ν-конец находится слева и С-конец находится справа в ее линейном представлении.

Слитый белок по изобретению может включать один домен (Ь) эффекторного пептида, присоединенный к С-концу или Ν-концу домена (а).

В конкретном варианте осуществления домен (а) представляет собой фрагмент последовательности ЬТКА1Ь, начинающийся с аминокислоты из диапазона от ЬТКА1Ь95 до НТРЛ1Ы22. включительно, и оканчивающийся аминокислотой ЬТКА1Ь281.

В частности, домен (а) может быть выбран из группы, состоящей из последовательности, соответствующей ЬТКА1Ь95-281, ЬТКА1Ь114-281, ЬТКА1Ь116-281, ЬТКА1Ь120-281, ЬТКА1Ь121-281 и ЬТКА1Ь122-281. Специалистам в данной области будет понятно, что ЬТКА1Ь95-281, ЬТКА1Ь114-281, ЬТКА1Ь116-281, ЬТКА1Ь120-281, ЬТКА1Ь121-281 и ЬТКА1Ь122-281 представляют собой фрагменты белка ТКАТЬ человека, начинающиеся с аминокислоты, обозначаемой номером 95, 114, 116, 120, 121 и 122, соответственно, в известной последовательности ЬТКА1Ь, опубликованной в ОепВапк под номером доступа № Р50591.

В другом конкретном варианте осуществления домен (а) представляет собой гомолог функционального фрагмента белковой последовательности растворимого ЬТКА1Ь, начинающегося не ниже НТКА1Ь95 и оканчивающегося аминокислотой ЬТКА1Ь281, последовательность которого по меньшей мере на 70%, предпочтительно на 85%, идентична исходной последовательности.

В конкретных вариантах этого варианта осуществления домен (а) представляет собой гомолог фрагмента, выбранного из группы, состоящей из последовательности, соответствующей ЬТКА1Ь95-281, ЬТКА1Ь114-281, ЬТКА1Ь116-281, ЬТКА1Ь120-281, ЬТКА1Ь121-281 и ЬТКА1Ь122-281.

Следует понимать что гомолог фрагмента ЬТКА1Ь представляет собой вариант/модификацию аминокислотной последовательности этого фрагмента, где изменена по меньшей мере одна аминокислота, включая 1 аминокислоту, 2 аминокислоты, 3 аминокислоты, 4 аминокислоты, 5 аминокислот, 6 аминокислот и не более 15% аминокислот, и где у фрагмента модифицированной последовательности сохранена функциональность последовательности ЬТКАЪЬ, т.е. способность связываться с рецепторами смерти на клеточной поверхности и индукцию апоптоза в клетках млекопитающих. Модификация аминокислотной последовательности может включать, например, замену, делецию, укорочение и/или вставку аминокислот.

Предпочтительно гомолог фрагмента ЬТКА1Ь, имеющий модифицированную последовательность, проявляет модифицированную аффинность к рецепторам смерти ΌΚ4 (ТКА1Ь-К1) или ΌΚ5 (ТКА1Ь-К2) по сравнению с нативным фрагментом ЬТКА1Ь.

Термин модифицированная аффинность относится к увеличенной аффинности и/или аффинности с измененной селективностью к рецептору.

Предпочтительно гомолог фрагмента ЬТКАЪЬ, имеющий модифицированную последовательность, проявляет увеличенную аффинность к рецепторам смерти ΌΚ4 и ΌΚ5 по сравнению с нативным фрагментом НТКА1Ь.

Особенно предпочтительно гомолог фрагмента ЬТКАЗЬ, имеющий модифицированную последовательность, проявляет увеличенную аффинность к рецептору смерти ΌΚ5 по сравнению с рецептором смерти ΌΚ4, т.е. увеличенную селективность ΌΚ5/ΌΚ4.

Также предпочтительно гомолог фрагмента ЬТКА1Ь, имеющий модифицированную последовательность, проявляет увеличенную селективность в отношении рецепторов смерти ΌΚ4 и/или ΌΚ5 по сравнению с аффинностью в отношении рецепторов ΌΚ1 (ТКА1Ь-К3) и/или ΌΚ2 (ТКА1Ь-К4).

Модификации ЬТКАЪЬ, приводящие к увеличенной аффинности и/или селективности в отношении рецепторов смерти ΌΚ4 и ΌΚ5, известны специалистам в данной области, например из публикации Тиг V, уап бег З1оо( АМ, КеЬ СК, З/еде/άί Е, Соо1 КН, ЗатаЪ А, Зеггапо Ь, Оиах VI ЬК4-5е1ес(1уе (итог песго515 Гас(ог-ге1а(еб арорЮ^Ь-тбистд Ьдапб (ТКА1Ь) уапап(5 оЫашеб Ьу 5(гис(иге-Ьа5еб бе81дп. 1. ΒιοΙ. СЬет. 2008 1и1 18; 283(29):20560-8, в которой описана мутация Ό218Η, имеющая увеличенную селективность в отношении ΌΚ4, или Оакрапап МЕ, СЬегпуак Βν, Оо1д1кЬ ЬА, Уадо1оуюЬ АХ Ророуа ΕΝ, ЗусЬеуа АМ, МокЬкоуккЪ ЗА, КирюЬшкоу МР. ОепегаЬоп оГ пе\у ТКА1Ь иш(ап(5 ЬК5-А апб ΌΚ5-Β \νί(1ι шргоуеб 5е1ес(Ьа(у (о беа(Ь гесер(ог 5, АрорЮкЬ. 2009 1ип; 14(6):778-87, в которой описана мутация Ό269Η, имеющая сниженную аффинность к ΌΚ4. Мутанты ЬТКА1Ь, приводящие к увеличенной аффинности в отношении одного рецептора, выбранного из ΌΚ4 и ΌΚ5, по сравнению с рецепторами ΌΚ1 и ΌΚ2, и увеличенной аффинности в отношении рецептора ΌΚ5 по сравнению с ΌΚ4, описаны в №02009077857 и №02009066174.

Подходящие мутации представляют собой одну или несколько мутаций в положениях нативного ЬТКА1Ь, выбранных из группы, состоящей из 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 и 251, в частности, мутации, вовлеченные в замену аминокислоты основной аминокислотой, такой как лизин, гистидин или аргинин, или аминокислотой, такой как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота. В частности, могут быть указаны одна или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из О131К, О131К, К1491, К149М, Κ149Ν, К149К, З159К, О193Н, О193К, Ν199Η, Ν199Κ, К201Н, К201К,

- 5 024452

К204Е, Κ204Ό, К204Ь, Κ204Υ, К212К, 8215Е, 8215Н, 8215К, 8215Ό, Ό218Υ, Ό218Η, Κ251Ό, К251Е и К251Р, как описано в АО 2009066174.

Подходящие мутации также представляют собой одну или несколько мутаций в положениях нативного НТКАШ. выбранных из группы, состоящей из 195, 269 и 214, в частности мутации, вовлекающие замену аминокислоты основной аминокислотой, такой как лизин, гистидин или аргинин. В частности, могут быть указаны одна или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из Ό269Η, Е195К и Т214К, как описано в АО 2009077857.

В конкретном варианте осуществления домен (а), который является гомологом фрагмента ЙТКЛГЬ, выбран из мутанта Ό218Η нативной последовательности ТКА1Ь, как описано в АО2009066174, или мутанта Υ189Ν-Κ191Ι<-0193Κ-Η264Κ-Ι266Κ-Ο269Η нативной последовательности ТКА1Ь, как описано в Оакрапап МЕ, Сйетиуак ВУ, ЭсйщкН ИА, Υα§ο1ονίε1ι АУ, Ророуа ΕΝ, 8усйеуа АМ, Мокйкоуккп 8А, Кйрюйшкоу МР. Арор1о818. 2009 .Тип; 14(6):778-87.

Иммуностимулирующий эффекторный пептид домена (Ь) может представлять собой пептид цитокина, который, помимо прочего, интенсивно стимулирует продуцирование моноцитами человека белка ТКАГЬ, таким образом, значительно влияя на способность устранять раковые клетки.

В одном варианте осуществления слитого белка по изобретению эффекторный пептид представляет собой пептид, обладающий иммуностимулирующей активностью, выбранный из группы, состоящей из 5>Ер. №. 17 (происходящий из ΙΝΡ-альфа 2Ь) , 8Ер. №. 18 (происходящий из ΙΝΡ-гамма) , 8Ер. №. 19 (псевдодимер ΙΝΡ-гамма), 8Ер. №. 46 (псевдодимер интерферона альфа 2Ь) и 8Ер. №. 47 (консенсусная последовательность интерферона альфа).

Эффекторный пептид описанной выше группы представляет собой пептид, который стимулирует сверхэкспрессию ТКА1Ь, и, в частности фрагмент из 165-аминокислот субъединицы бета интерферона альфа, представленный в 8Ер. №. 17.

Полагают, что пептид, содержащий последовательность бета-субъединицы интерферона-альфа, включенный в слитый белок по изобретению, может эффективно устранять раковые клетки.

Другим эффекторным пептидом является фрагмент интерферона-гамма из 124 аминокислот, представленный в 5>Ер. №. 18.

Полагают, что пептид, содержащий последовательность интерферона-гамма, включенный в слитый белок по изобретению, может эффективно устранять раковые клетки.

Эффекторный пептид описанной выше группы представляет собой пептид из 263 аминокислот, представляющий собой слитую конструкцию двух субъединиц интерферона-гамма человека, образующих одноцепочечный псевдодимер ΙΝΡ-гамма, описанный Ьапйат'а е1 а1. (ЬМо1.Вю1. 299: 169-179, 2000). Полученный одноцепочечный вариант белка сохраняет способность связываться с подходящим рецептором и биологическую активность, предполагаемую для интерферона-гамма. Этот эффекторный пептид представлен в 8Ер. №. 19.

Другим эффекторным пептидом указанной выше группы является пептид из 351 аминокислот, представляющий собой слитую конструкцию двух субъединиц интерферона-альфа 2Ь человека, образующих одноцепочечный псевдодимер ΙΝΡ-альфа 2Ь, где вторая цепь последовательности субъединицы ΙΡΝ-альфа 2Ь является обратной по сравнению с нативной последовательностью (т.е. от С-конца к Νконцу). Полученный эффекторный пептид характеризуется двумя нативными С-концами интерферонаальфа 2Ь, связанными друг с другом. Мономеры в природных условиях образующихся димерах ΙΡΝальфа связаны их С-концами. Ν-концы, в свою очередь, ответственны за взаимодействие с рецептором и обеспечивают надлежащую среду для координации процесса димеризации ионов цинка (остатки глутаминовой кислоты 41 и 42). Полученный одноцепочечный вариант белка сохраняет способность связываться с подходящим рецептором и биологическую активность, предполагаемую для интерферона-альфа. Этот эффекторный пептид представлен в 8Ер. №. 46.

Другим эффекторным пептидом является консенсусная последовательность интерферона-альфа из 166 аминокислот, представленная в 8Ер. №. 47. Эта консенсусная последовательность описана в И8 4695623.

Полагают, что пептид, содержащий консенсусную последовательность интерферона-альфа, включенную в слитый белок по изобретению, может эффективно устранять раковые клетки.

При связывании с рецепторами ТРАГЬ, присутствующими на поверхности раковых клеток, слитый белок проявляет двойной эффект. Домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент ТКАТЬ или его гомолог с сохраненной функциональностью, проявляет его известную агонистичскую активность - т.е. связывание с рецепторами смерти на клеточной поверхности и активацию внешнего каскада апоптоза. После интернализации слитого белка, содержащего иммумностимулирующий пептид, домен (Ь) потенциально способен оказывать его действие внутриклеточно параллельно активности домена ТКАТЬ Таким образом, активность ТРАК- против рака может усиливаться активацией других элементов и механизмов, таких как стимуляция продуцированием В-клетками антител, стимуляция экспрессии каспазы 7 и 8, или стимуляция сверхэкспрессии ТРАК·.

В одном из вариантов осуществления изобретения домен (а) и домен (Ь) связаны по меньшей мере одним доменом (с), содержащим последовательность участка расщепления протеазами, распознаваемую

- 6 024452 протеазами, присутствующими в клеточном окружении, особенно в окружении опухолевых клеток. Связывание домена (а) с доменом (Ь) через по меньшей мере один домен (с) означает, что между доменами (а) и (Ь) может присутствовать более одного домена (с), в частности один или два домена (с).

Участок расщепления протеазами может быть выбран из:

последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, в частности Рго Ьеи С1у Ьеи А1а С1у (РБСБАС в однобуквенном представлении), обозначаемой как δΕρ. Νο. 20, последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, в частности, Агд Уа1 Уа1 Агд (КУУК в однобуквенном представлении), обозначаемой как δΕρ. Νο. 21, и их комбинаций.

В одном из вариантов осуществления изобретения участок расщепления протеазой представляет собой комбинацию последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, расположенных рядом друг с другом в любом порядке.

В одном варианте осуществления домен (с) представляет собой комбинацию ММР/иРА (δΕρ. Νο 20/δΕρ. Νο. 21), которая представляет собой последовательность Рго Ьеи С1у Ьеи А1а С1у Агд Уа1 Уа1 Агд (РЬСЬАСКУУК в однобуквенном представлении), или комбинацию иРА/ММР (δΕρ. Νο 21/δΕρ. Νο. 20), которая представляет собой последовательность Агд Уа1 Уа1 Агд Рго Ьеи С1у Ьеи А1а С1у (КУУКРБСБАС в однобуквенном обозначении). Такие комбинации могут повторяться, предпочтительно два раза.

Протеазы металлопротеазы ММР и урокиназа иРА сверхэкспрессируются в опухолевом окружении. Присутствие последовательности, распознаваемой протеазами, обеспечивает отщепление домена (а) от домена (Ь) при интернализации конструкции, т.е. высвобождение функционального домена (Ь) и, таким образом, его активацию.

Присутствие участка расщепления протеазой, позволяя быстрое высвобождение эффекторного пептида, увеличивает вероятность переноса пептида в область его действия до того, как произойдет случайная деградация слитого белка протеазами, присутствующими в клетке.

В другом варианте осуществления между доменами (а) и (Ь) дополнительно включен домен (ά) из последовательности, подходящий для присоединения молекулы РБС (линкер РБС) к слитому белку по изобретению.

Такой линкер РБС, представляет собой, например, известную последовательность А1а δе^ С1у Сук С1у Рго С1и (АδСССРБ в однобуквенном представлении), обозначаемую как δΕρ. Νο. 22. Линкер РБС также может быть выбран из А1а А1а Сук А1а А1а (ААСАА в однобуквенном представлении), δе^ С1у С1у Сук С1у С1у δе^ (δСССССδ в однобуквенном представлении) и δе^ С1у Сук С1у δе^ (δСССδ в однобуквенном представлении), обозначаемые как, соответственно, δΕρ. Νο. 23, δΕρ. Νο. 24 и δΕρ. Νο. 25.

В одном из вариантов осуществления белок по изобретению содержит как домен (с), так и домен (ά).

В предпочтительном варианте осуществления домен (ά) расположен между двумя доменами (с), в частности, между двумя доменами (с), которые выбраны из участка расщепления протеазой и комбинации участков расщепления протеазами, в частности, последовательности, распознаваемой металлопротеазами ММР (δΕρ. Νο. 20), последовательности, распознаваемой урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21) и комбинации ММР/иРА (δΕρ. Νο. 20/δΕρ. Νο. 21) или иРА/ММР (δΕρ. Νο. 21/δΕρ. Νο. 20).

Таким образом, в одном варианте осуществления слитого белка по изобретению участок расщепления протеазой представляет собой комбинацию последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, в любом порядке, разделенных последовательностью линкера РБС, описанной выше.

Следует понимать, что в случае, когда слитый белок имеет как домен (ά) из линкера РБС, так и домены (с) из участка расщепления, между доменами (а) и (Ь), тогда домены (с) расположены так, чтобы после расщепления конструкции домен (ά) отсоединялся от доменов (а) и (Ь). Эти два домена (с) могут содержать как один участок расщепления протеазой, так и их комбинацию, как определено выше. Иными словами, если слитый белок содержит как домен (ά), содержащий линкер РБС, так и домены участков расщепления (с), тогда домен (ά) расположен между доменами (с). Изобретение не включает такой вариант, в котором домен (ά) расположен между доменом (с) и доменом (а) или между доменом (с) и доменом (Ь), т.е. вариант, где после расщепления конструкции последовательность, подходящая для присоединения к слитому белку по изобретению молекулы РБС (ά), будет оставаться связанной с доменом (а) или доменом (Ь).

Молекулы РБС, пригодные для присоединения к слитому белку, могут быть выбраны из линейных и разветвленных молекул РБС. Особенно пригодными являются линейным молекулы РБС, имеющие молекулярную массу от 4000 до 20000.

Помимо основных функциональных элементов слитого белка -домена(ов) участка расщепления и последовательности линкера РБС, слитые белки по изобретению могут содержать нейтральную последовательность/последовательности гибкого пространственного глицин-серинового линкера (спейсер). Такие линкеры/спейсеры хорошо известны и описаны в литературе. Подразумевают, что их включение в последовательность слитого белка обеспечивает правильное сворачивание белков, продуцированных в

- 7 024452 процессе их сверхэкспрессии в клетках-хозяевах.

Гибкий пространственный линкер может быть выбран из любой комбинации остатков глицина и серина. В частности, гибкий линкер может быть выбран из группы, состоящей из С1у 8ег С1у С1у С1у (О8ООО в однобуквенном представлении), 01у 01у 01у 8ег (0008 в однобуквенном представлении), Хаа 01у 01у 8ег (Х008 в однобуквенном представлении), где Хаа обозначает любую аминокислоту или отсутствует, и 01у 01у 8ег 01у (0080 в однобуквенном представлении), обозначаемые как, соответственно 81 Τ). Νο. 26, 81 Τ). Νο. 27 и 81 Τ). Νο. 28) и 81 Τ). Νο. 50.

Конкретные варианты осуществления слитого белка по изобретению представляют собой слитые белки, содержащие иммуностимулирующий пептид, выбранный из группы, состоящей из белков, соответствующих 8Е0. Νο. 1, 8Е0. Νο. 2, 8Е0. Νο. 3, 8Е0. Νο. 4 и 8Е0. Νο. 45.

Другим конкретным вариантом осуществления слитого белка по изобретению является слитый белок, содержащий иммуностимулирующий пептид, соответствующий 8Е0. Νο. 44.

Другими конкретными вариантами осуществления слитого белка по изобретению являются слитые белки, содержащие иммуностимулирующий пептид, выбранный из группы, состоящей из белков, соответствующих 8ЕО. Νο. 5, 8ЕО. Νο. 6, 8ЕО. Νο. 7, 8ЕО. Νο. 8, 8ЕО. Νο. 9, 8ЕО. Νο. 10 и 8ЕО. Νο. 11.

Другими конкретными вариантами осуществления слитого белка по изобретению являются слитые белки, содержащие иммуностимулирующий пептид, выбранный из группы, состоящей из белков, соответствующих 8Е0. Νο. 12, 8Е0. Νο. 13, 8Е0. Νο. 14 и 8Е0. Νο. 15.

Подробное описание структуры типичных слитых белков, упомянутых выше, представлено на фиг. 1-3 и на фиг. 4, и в примерах, представленных в настоящем описании ниже.

В соответствии с настоящим изобретением слитый белок означает одну белковую молекулу, содержащую два или более белков или их фрагментов, ковалентно связанных через пептидную связь в их соответствующих пептидных цепях без дополнительных химических линкеров.

Слитый белок также может быть альтернативно описан как белковая конструкция или химерный белок. В соответствии с настоящим изобретением, термины конструкция или химерный белок, при их использовании, следует понимать как относящиеся к слитому белку, как определено выше.

Для специалиста в данной области будет очевидно, что слитый белок, определенный таким образом, можно синтезировать известными способами химического синтеза пептидов и белков.

Слитый белок можно синтезировать способами химического синтеза пептидов, особенно с использованием технологий пептидного синтеза на твердой фазе с использованием подходящих смол в качестве носителей. Такие технологии являются общепринятыми и известны в данной области, и описаны, среди прочих, в монографиях, таких как, например, Βοάаη8ζку апб Βοάаη8ζку, Тйе РгасОсе οί Рерйбе 8уп1йе515. 1984, 8ргшдег-Уег1ад, №ν ΥοιΈ, 81е\\аг1 е1 а1., 8ο1ίά Рйазе РерОбе 8уп1йе518, 2пб ЕбНюи 1984, Р1егее Сйет1са1 Сοтраηу.

Слитый белок можно синтезировать способами химического синтеза пептидов в качестве непрерывного белка. Альтернативно индивидуальные фрагменты (домены) белка можно синтезировать по отдельности, а затем объединять вместе в один непрерывный пептид через пептидную связь, путем конденсации (амино-) Ν-конца одного пептидного фрагмента с (карбоксил-) С-концом второго пептида. Такие способы являются общепринятыми и хорошо известны.

Для подтверждения структуры полученного пептида можно использовать известные способы анализа аминокислотного состава пептидов, такие как способ масс-спектрометрии высокого разрешения для определения молекулярной массы пептида. Для подтверждения пептидной последовательности также можно использовать секвенаторы белков, которые последовательно разрушают пептид и идентифицируют последовательность аминокислот.

Однако предпочтительно слитый белок по изобретению представляет собой рекомбинантный белок, полученный способами генной экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, в клетках-хозяевах.

Следующим аспектом изобретения является полинуклеотидная последовательность, в частности, последовательность ДНК, кодирующая слитый белок, как определено выше.

Предпочтительно, полинуклеотидная последовательность, в частности, ДНК, в соответствии с изобретением, кодирующая слитый белок, как определено выше, представляет собой последовательность, оптимизированную для экспрессии в Е. οο1ί.

Другим аспектом изобретения также является экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, в частности, последовательность ДНК по изобретению, как определено выше.

Другой аспект изобретения также представляет собой клетку-хозяина, содержащую экспрессирующий вектор, как определено выше.

Предпочтительной клеткой-хозяином для экспрессии слитых белков по изобретению является клетка Е. οο1ί.

Способы получения рекомбинантных белков, включая слитые белки, хорошо известны. В кратком изложении, этот способ состоит в получении полинуклеотидной молекулы, например молекулы ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность заданного белка и обеспечивающей экспрессию за- 8 024452 данного белка в хозяине. Затем полинуклеотидную молекулу, кодирующую заданный белок, включают в соответствующий экспрессирующий вектор, который обеспечивает эффективную экспрессию полипептида. Затем рекомбинантный экспрессирующий вектор вводят в клетки-хозяева для трансфекции/трансформации, и в результате получают трансформированную клетку-хозяина. После этого проводят культивирование трансформированных клеток для сверхэкспрессии заданного белка, очистку полученных белков и необязательно разрезание путем отщепления последовательностей меток, использованных для экспрессии и очистки белка.

Подходящие способы для экспрессии и очистки описаны, например, в монографии Сосббск Сеие Ехргеввюи Тесйио1о§у, Ме1йоЙ8 ίη Еигуто1о§у 185, Асайет1с Ргевв, 8аи О1едо, СА (1990), и А. §1агои е! а1., Абуаисев М!кгоЪю1., 2008, 47, 2, 1983-1995.

В качестве экспрессирующих векторов для введения и репликации последовательностей ДНК в клетках-хозяевах можно использовать космиды, плазмиды или модифицированные вирусы. Как правило, в качестве экспрессирующих векторов используют плазмиды. Подходящие плазмиды являются хорошо известными и коммерчески доступными.

Экспрессирующий вектор по изобретению содержит полинуклеотидную молекулу, кодирующую слитый белок по изобретению и необходимые регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции кодирующей последовательности, включенной в подходящую клетку-хозяина. Выбор регуляторных последовательностей зависит от типа клеток-хозяев, и он может быть без труда осуществлен специалистом в данной области. Примерами таких регуляторных последовательностей являются промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, последовательность связывания рибосом, содержащая сигнал инициации транскрипции, встроенная перед кодирующей последовательностью, и последовательность терминации транскрипции, встроенная после кодирующей последовательности. Более того, в зависимости от используемой клетки-хозяина и вектора, в экспрессирующий вектор можно вводить другие последовательности, такие как ориджин репликации, дополнительные участки рестрикции ДНК, энхансеры и последовательности, обеспечивающие индукцию транскрипции.

Экспрессирующий вектор также может содержать последовательность маркерного гена, которая придает определенный фенотип трансформированной клетке и обеспечивает специфическую селекцию трансформированных клеток. Более того, вектор также может содержать вторую маркерную последовательность, которая позволяет отличить клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, содержащей встроенные кодирующие последовательности заданного белка, от клеток, которые захватили плазмиду без вставки. Наиболее часто используют типичные маркеры устойчивости к антибиотикам, однако можно использовать любые другие репортерные гены, известные в данной области, присутствие которых в клетке (ίη νίνο) можно легко определить с использованием технологии радиоавтографии, спектрофотометрии или био- и хемилюминесценции. Например, в зависимости от клетки-хозяина, можно использовать репортерные гены, такие как 6-галактозидаза, β-глюкуронидаза, люцифераза, хлорамфениколацетилтрансфераза или зеленый флуоресцентный белок.

Более того, экспрессирующий вектор может содержать сигнальную последовательность, транспортирующую белки в соответствующий клеточный компартмент, например периплазму, где обеспечивается сворачивание. Кроме того, может присутствовать последовательность, кодирующая метку/маркер, такой как НгкТад, связанный с Ν-концом, или СЗТ, связанный с С-концом, которая облегчает последующую очистку продуцированного белка с использованием принципа аффинности, через аффинную хроматографию на никелевой колонке. Также могут присутствовать дополнительные последовательности, которые защищают белок от протеолитической деградации в клетках-хозяевах, а также последовательности, которые повышают ее растворимость.

Предпочтительно, вследствие простоты культивирования и генетического манипулирования, и большого количества полученного продукта используют экспрессирующую систему Е. сой. Таким образом, полинуклеотидную последовательность, содержащую заданную последовательность, кодирующую слитый белок по изобретению, оптимизируют для экспрессии Е. сой, т.е. она содержит кодоны кодирующей последовательности, оптимальные для экспрессии в Е. сой, выбранные из возможных вариантов последовательностей, известных на уровне техники. Более того, экспрессирующий вектор содержит описанные выше элементы, подходящие для Е. сой, связанные с кодирующей последовательностью.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок по изобретению, оптимизированную для экспрессию в Е. сой, выбрана из группы полинуклеотидных последовательностей, состоящей из: 8ЕС. Νθ. 29; 81Т). Νθ. 30; 81Т). Νθ. 31; 8ЕС. Νθ. 32; 8ЕС. Νθ. 33, 81Т). Νθ. 34; 8ЕС. Νθ. 35; 8ЕС. Νο. 36; 8ЕС. Νο. 37; 81Т). Νο. 38; 81Т). Νο. 39; 8ЕС. Νο. 40; 8ЕС. Νο. 41, 81Т). Νο. 42; 81Т). Νο. 43; 8Ер. Νο. 48 и 8Ер. Νο. 49; которые кодируют слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, соответственно: 8Ер. Νο. 1; 8Ер. Νο. 2; 8Ер. Νο. 3; 8Ер. Νο. 4; 8ЕС. Νο. 5; 81Т). Νο. 6; 81Т). Νο. 7; 81Т). Νο. 8; 81Т). Νο. 9; 8ЕС. Νο. 10; 81Т). Νο. 11, 8ЕС. Νο. 12, 8Ер. Νο. 13; 8Ер. Νο. 14 и 8Ер. Νο. 15; 8Ер. Νο. 44 и 8Ер. Νο. 45. В предпочтительном варианте осу- 9 024452 ществления изобретение также относится к экспрессирующему вектору, подходящему для трансформации Е. οοΐί. содержащему полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы полинуклеотидных последовательностей с 5>Ер. Νο. 29 по 5>Ер. Νο. 43, 5>Ер. Νο. 48 и 5>Ер. Νο. 49, указанных выше, а также к клетке Е. οοΐί, трансформированной таким экспрессирующим вектором.

Трансформацию, т.е. введение последовательности ДНК в бактериальные клетки-хозяева, в частности, Е. οοΐί, обычно проводят на компетентных клетках, подготовленных к захвату ДНК, например, путем обработки ионами кальция при низкой температуре (4°С), а затем воздействия теплового шока (при 3742°С) или электропорации. Такие способы хорошо известны и обычно определяются изготовителем экспрессирующей системы или описаны в литературе или лабораторных практикумах, таких как Машайк с1 а1., ΜοΙοοιιΕίΓ Εΐοηίπβ. Ε’οΐύ δρτίη§ Η-ιΛοη Ν.Υ., 1982).

Методика сверхэкспрессии слитых белков по изобретению в экспрессирующей системе Е. οοΐί дополнительно описана ниже.

Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, как определено выше, в качестве активного ингредиента и подходящий фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и общепринятые вспомогательные компоненты. Фармацевтическая композиция содержит эффективное количество слитого белка по изобретению и фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты, растворенные или диспергированные в носителе или разбавителе, и предпочтительно она находится в форме фармацевтической композиции, составленной в единичной дозированной форме, или состава, содержащего множество доз. Фармацевтические формы и способы их составления, а также другие компоненты, носители и разбавители, известны специалисту в данной области и описаны в литературе. Например, они описаны в монографии РепипдЮп'к РЬаттасеийса1 δοίепсек, ей. 20, 2000, Маск РиЬБкЫпд ^трапу, ЕакЮн И8А.

Термины фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и вспомогательный ингредиент включают любые растворители, дисперсионные среды, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, стабилизаторы, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), обеспечивающие изотоничность средства, известные в данной области. Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать различные типы носителей, разбавителей и эксципиентов, в зависимости от выбранного пути введения и выбранной дозированной формы, такой как жидкие, твердые и аэрозольные формы для перорального, парентерального, ингаляционного, местного введения, и от того, должна ли выбранная форма быть стерильной для данного пути введения, такого как инъекция. Предпочтительным путем введения фармацевтической композиции в соответствии с изобретением является парентеральный, в том числе инъекционный, путь, такой как внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутриопухолевый, или с помощью однократных или непрерывных внутривенных инфузий.

В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить путем инъекции непосредственно в опухоль. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить внутривенно. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить подкожно или внутрибрюшинно. Фармацевтическая композиция для парентерального введения может представлять собой раствор или дисперсию в фармацевтически приемлемой водной или неводной среде, забуференной до соответствующего значения рН и изоосмотической с жидкостями организма, если необходимо, и она может содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворимые вещества, которые делают композицию совместимой с тканями или кровью реципиента. Другими компонентами, которые могут быть включены в композицию, являются, например, вода, спирты, такие как этанол, полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль, липиды, такие как триглицериды, растительные масла, липосомы. Надлежащая текучесть и размер частиц вещества могут быть обеспечены с помощью покровных веществ, таких как лецитин, и поверхностно-активные вещества, такие как гидроксипропилцеллюлоза, полисорбаты и т.п.

Подходящие обеспечивающие изотоничность средства для жидких парентеральных композиций представляют собой, например, сахара, такие как глюкоза и хлорид натрия, и их комбинации.

Альтернативно фармацевтическая композиция для введения путем инъекции или инфузий может быть в форме порошка, такого как лиофилизированный порошок для восстановления непосредственно перед применением в подходящем носителе, например, таком как стерильная свободная от пирогенов вода.

Фармацевтическая композиция по изобретению для парентерального введения также может иметь форму для назального введения, включая растворы, спреи или аэрозоли.

Предпочтительно, форма для интраназального введения представляет собой водный раствор и является изотонической или забуференной для поддержания рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, так чтобы поддерживать свойства, сходные с носовыми секретами. Более того, она содержит консерванты или стабилизаторы, такие как в хорошо известных интраназальных препаратах.

Композиция может содержать различные антиоксиданты, которые замедляют окисление одного или

- 10 024452 нескольких компонентов. Более того, для предупреждения действия микроорганизмов, композиция может содержать различные антибактериальные и противогрибковые средства, включая, например и не ограничиваясь ими, парабены, хлорбутанол, тимеросал, сорбиновую кислоту, и сходные известные вещества этого типа. Как правило, фармацевтическая композиция по изобретению может включать, например, по меньшей мере приблизительно 0,01 мас.% активного ингредиента. Более конкретно, композиция может содержать активный ингредиент в количестве от 1 до 75% по массе единицы композиции, или например, от 25 до 60% по массе, но она не ограничивается этими указанными величинами. Истинную величину дозы композиции в соответствии с настоящим изобретением, вводимой пациентам, в том числе человеку, могут определять физические и физиологические факторы, такие как масса тела, тяжесть состояния, тип подвергаемого лечению заболевания, предшествующее или сопутствующее терапевтическое вмешательство, пациент и путь введения. Подходящую единичную дозу, общую дозу и концентрацию активного ингредиента в композиции должен определять лечащий врач.

Композицию, например, можно вводить в дозе от приблизительно 1 мкг/кг массы тела до приблизительно 1000 мг/кг массы тела пациента, например в диапазоне от 5 мг/кг массы тела до 100 мг/кг массы тела или в диапазоне от 5 мг/кг массы тела до 500 мг/кг массы тела. Слитый белок и композиции, содержащие его, являются противораковыми или противоопухолевыми, и их можно использовать для лечения раковых заболеваний. Также изобретение относится к применению слитого белка по изобретению, как определено выше, для лечения онкологических заболеваний у млекопитающих, в том числе у человека. Также изобретение относится к способу лечения раковых заболеваний у млекопитающих, в том числе человека, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективное против рака количество слитого белка по изобретению, как определено выше, необязательно в форме соответствующей фармацевтической композиции.

Слитый белок по изобретению можно использовать для лечения гематологических рака, таких как лейкоз, гранулематоз, миелома, и других гематологических рака. Слитый белок также можно использовать для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак легкого, в том числе немелкоклеточный рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак почки, рак головного мозга и т.п. Подходящим путем введения слитого белка при лечении рака, в частности, является парентеральный путь, который состоит во введении слитого белка по изобретению в форме инъекций или инфузий, в композиции и форме, подходящих для этого пути введения. Изобретение описано более подробно с помощью следующих общих методик и примеров конкретных слитых белков.

Общая методика для сверхэкспрессии слитого белка Получение плазмиды

Аминокислотную последовательность заданного слитого белка использовали в качестве матрицы для получения кодирующей его последовательности ДНК, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в ЕксйейсЫа сой. Такая методика позволяет увеличить эффективность следующей стадии синтеза заданного белка в ЕксйейсЫа сой. Затем полученную нуклеотидную последовательность синтезировали автоматически.

Кроме того, к полученному гену, кодирующему заданный белок, добавляли участки расщепления ферментов рестрикции Ыбе1 (на 5'-конце ведущей цепи) и Хйо1 (на З'-конце ведущей цепи). Их использовали для клонирования гена в вектор рЕТ28а (Ыоуадеи).

Также их можно использовать для клонирования белка в другие векторы. Заданный белок, экспрессированный с этой конструкции, необязательно может иметь на Ν-конце полигистидиновую метку (шесть остатков гистидина), которой предшествует участок, распознаваемый тромбином, который впоследствии служит для очистки аффинной хроматографией. Правильность полученной конструкции подтверждали сначала рестрикционным анализом выделенных плазмид с использованием ферментов №еЬ1 и Хйо1, а затем автоматическим секвенированием всей рамки считывания белка-мишени. Праймеры, использованные для секвенирования, были комплементарны последовательностям промотора Т7 (5'ТААТАССАСТСАСТАТАСС-3') и терминатора Т7 (5'-ССТАСТТАТТССТСАСССС-3'), присутствующим в векторе. Полученную плазмиду использовали для сверхэкспрессии заданного слитого белка в коммерческом штамме Е. сой, который трансформировали в соответствии с рекомендациями изготовителя. Колонии, полученные на селективной среде (агар ЬВ, канамицин 50 мкг/мл, 1% глюкоза), использовали для получения ночной культуры в жидкой среде ЬВ, дополненной канамицином (50 мкг/мл) и 1% глюкозой. После выращивания в течение приблизительно 15 ч во вращающемся инкубаторе, культуры использовали для инокуляции соответствующей культуры.

Сверхэкспрессия и очистка слитых белков - общая методика А Среду ЬВ с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ. сульфатом цинка инокулировали ночной культурой. Культуру инкубировали при 37°С до тех пор, пока оптическая плотность (ΘΌ) при 600 нм не достигала 0,60-0,80. Затем добавляли 1РТС до конечной концентрации в диапазоне 0,25-1 мМ. После инкубации (3,5-20 ч) с вращением при 25°С культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 д Бактериальные осадки ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М №С1, 10 мМ имидазол, рН 7,4. Суспензию обрабатывали ультразвуковым облучением на льду в течение 8 мин (амплитуда 40%, 15-секундный импульс, интервал

- 11 024452

с). Полученный экстракт очищали центрифугированием в течение 40 мин при 20000 д, 4°С. Смолу ΝίЗерЬагозе (СЕ Неаййсаге) предварительно обрабатывали буфером для уравновешивания, который использовали для получения экстракта бактериальных клеток. Затем смолу инкубировали в течение ночи при 4°С с супернатантом, полученным после центрифугирования экстракта. Затем ее помещали в хроматографическую колонку и промывали от 15 до 50 объемами буфера из 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М №С1, 20 мМ имидазола, рН 7,4. Полученный белок элюировали с колонки с использованием градиента имидазола в 50 мМ буфере КН₂РО₄ с 0,5 М №С1, рН 7,4. Полученные фракции анализировали с помощью δΌδ-РЛСЕ. Соответствующие фракции объединяли и подвергали диализу в течение ночи при 4°С против 20 мМ ТЙ8буфера, рН 7,2, 150 мМ №С1, 500 мМ Ь-аргинина, 0,1 мМ ΖηδΟ₄, 0,01% Т\\ееп 20, и в то же время 10 Н|8(ад отщепляли тромбином (1:50). После отщепления тромбин отделяли от заданного слитого белка с использованием смолы Веп/апибше ЗерЬагозе™. Чистоту продукта анализировали с помощью 3Ό3РАСЕ электрофореза (Машайз е! а1, Мо1еси1аг С1ошпд. Со1б Зрйпд НагЬог, ΝΥ, 1982).

Сверхэкспрессия и очистка слитых белков - общая методика В Среду ЬВ с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ сульфатом цинка инокулировали ночной культурой. Культуру инкубировали при 37°С до тех пор, пока оптическая плотность (ΟΌ) при 600 нм не достигала 0,60-0,80. Затем добавляли 1РТС до конечной концентрации в диапазоне 0,5-1 мМ. После инкубации в течение 20 ч с вращением при 25°С культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 д. Бактериальные клетки после сверхэкспрессии разрушали в Ргепсй Ргезз в буфере, содержавшем 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М №С1, 10 мМ имидазол, 5 мМ бета-меркаптоэтанол, 0,5 мМ РМЗР (фенилметилсульфонилфторид), рН 7,8. Полученный экстракт очищали центрифугированием в течение 50 минут при 8000 д. Полученный супернатант инкубировали в течение ночи со смолой №-ЗерЬаго8е. Затем смолу со связанным белком помещали в хроматографическую колонку. Для смыва фракций, содержавших не связывающиеся белки, колонку промывали от 15 до 50 объемами буфера из 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М №С1, 10 мМ имидазола, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 0,5 мМ РМЗР (фенилметилсульфонилфторид), рН 7,8. Затем, для смыва большинства белков, специфично связывающихся с подложкой, колонку промывали буфером, содержащим 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М №С1, 500 мМ имидазол, 10% глицерин, 0,5 мМ РМЗР, рН 7,5. Полученные фракции анализировали с помощью ЗЭЗ-РАСЕ (Машайз е! а1, Мо1еси1аг С1ошпд. Со1б Зрйпд НагЬог, ΝΥ, 1982). Фракции, содержавшие заданный белок, объединяли и расщепляли тромбином (1 Е на 4 мг белка, 8 ч при 16°С) для удаления полигистидиновой метки. Затем фракции подвергали диализу против буфера для составления (500 мМ Ьаргинин, 50 мМ ТЙ8, 2,5 мМ ΖηЗΟ₄, рН 7,40).

Пример 1. Слитый белок ЗЕр. №. 1.

Белок ЗЕр. №. 1 представляет собой слитый белок, имеющий длину 345 аминокислот и массу 39,8 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКА1Ы22-281 присоединена субъединица 2Ь интерферона-альфа человека из 165-аминокислот (ЗЕр. №. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАТЬ последовательно включены рядом друг с другом участки расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (ЗЕр. №. 20) и урокиназой иРА (ЗЕр. №. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представляют собой, соответственно, ЗЕр. №. 1 и ЗЕр. №. 29, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность ЗЕр. №. 1 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК ЗЕр. №. 29. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. сой ВЬ21 (ЭЕ3) и Типег(РЕ3)рЬу8З от №уадеп. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 2. Слитый белок ЗЕр. №. 2.

Белок ЗЕр. №. 2 представляет собой слитый белок, имеющий длину 347 аминокислот и массу 40 кДа, в котором к С-концу последовательности ТКАТЬ120-281 присоединена субъединица 2Ь интерферона-альфа человека из 165 аминокислот (ЗЕр. №. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАТЬ последовательно включены рядом друг с другом последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (ЗЕр. №. 20) и урокиназой иРА (ЗЕр. №. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представляют собой, соответственно, ЗЕр. №. 2 и ЗЕр. №. 30, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность ЗЕр. №. 2 со структурой, описанной выше, использовали в

- 12 024452 качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК БЕЦ. Νο. 30. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3) от Νοναβοη. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 3. Слитый белок 8ЕЦ. Νο. 3.

Белок 8ЕЦ. Νο. 3 представляет собой слитый белок, имеющий длину 352 аминокислоты и массу

40.4 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКА1Ы22-281 присоединена субъединица 2Ь интерферона-альфа человека из 165 аминокислот (8ЕЦ. Νο. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКЛ1Ь включены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемыми металлопротеазой ММР (8ЕЦ. Νο. 20) и урокиназой иРА (8ЕЦ. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между этим двумя комбинациями 8ЕЦ. Νο. 20 и 8ЕЦ. Νο. 21 слитый белок, кроме того, включает линкер для пегилирования (8ЕЦ. Νο. 22).

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. той, представляют собой, соответственно, 8ЕЦ. Νο. 3 и 8ЕЦ. Νο. 31, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8ЕЦ. Νο. 3, представленную выше использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8ЕЦ. Νο 31, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. той ВЬ21 (ΌΕ3) от Νοναβοη. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 4. Слитый белок 8ЕЦ. Νο. 4.

Белок 8ЕЦ. Νο. 4 представляет собой слитый белок, имеющий длину 353 аминокислоты и массу

40.5 кДа, в котором к С-концу последовательности ТКА1Б121-281 присоединена субъединица 2Ь интерферона-альфа человека из 165 аминокислот (8ЕЦ. Νο. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКА1Ь включены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (8ЕЦ. Νο. 20) и урокиназой иРА (8ЕЦ. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между этими двумя комбинациями 8ЕЦ. Νο. 20 и 8ЕЦ. Νο. 21 слитый белок дополнительно включает линкер для пегилирования (8ЕЦ. Νο. 22).

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. той, представляют собой, соответственно, 8ЕЦ. Νο. 4 и 8ЕЦ. Νο. 32, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8ЕЦ. Νο. 4, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8ЕЦ. Νο 32, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. той ВЬ2ГОЕ3рЬу53К1Ь от Зййадепе и Е. той Типег (ΌΕ3) от Шуадеп. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 5. Слитый белок 8ЕЦ. Νο. 5.

Белок 8ЕЦ. Νο. 5 представляет собой слитый белок, имеющий длину 300 аминокислот и массу 34,7 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКА1Ш16-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (8ЕЦ. Νο. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКА1Ь белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (8ЕЦ. Νο. 20) и урокиназой иРА (8ЕЦ. Νο. 21).

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. той, представляют собой, соответственно, 8ЕЦ. Νο. 5 и 8ЕЦ. Νο. 33, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8ЕЦ. Νο. 5 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8ЕЦ. Νο. 33.

Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. той Типег (ΌΕ3) от Νοуадеп. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

- 13 024452

Пример 6. Слитый белок δΕρ. Νο. 6.

Белок δΕρ. Νο. 6 представляет собой слитый белок, имеющий длину 307 аминокислот и массу 35,1 кДа, в котором к С-концу последовательности ТКЛ1Ы16-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (δΕρ. Νο. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАТЬ белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (δΕρ. Νο. 20) и урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21).

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер (δΕρ. Νο. 27) между последовательностью ТКАТЬ и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицинсериновый (δΕρ. Νο. 28) между участком расщепления урокиназой иРа и эффекторной последовательностью.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сο1^, представляют собой, соответственно, δΕρ. Νο. 6 и δΕρ. Νο. 34, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность δΕρ. Νο. 6 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК δΕρ. Νο. 34. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. тоП Τυ^Γ(ΌΕ3) от №уадеи. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 7. Слитый белок δΕρ. Νο. 7.

Белок δΕρ. Νο. 7 представляет собой слитый белок, имеющий длину 310 аминокислот и массу 35,5 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКАТБ116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (δΕρ. Νο. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАТЬ белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (δΕρ. Νο. 20) и урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21).

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер δΕρ. Νο. 26 между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер δΕρ. Νο. 26 между участком расщепления урокиназой иРа и последовательностью ТКА1Ь.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. отН. представляют собой, соответственно, δΕρ. Νο. 7 и δΕρ. Νο. 35, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность δΕρ. Νο. 7 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК δΕρ. Νο. 35. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. тоП Тиηе^(^Ε3) от №уадеи. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 8. Слитый белок δΕρ. Νο. 8.

Белок δΕρ. Νο. 8 представляет собой слитый белок, имеющий длину 310 аминокислот и массу 35,3 кДа, в котором к С-концу последовательности ТКЛI^116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (δΕρ. Νο. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАТЬ белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (δΕρ. Νο, 20) и урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21).

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер СδССС (δΕρ. Νο. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР/ и гибкий глицин-сериновый линкер СδССС (δΕρ. Νο. 26) между участком расщепления урокиназой иРа и последовательностью ТКАТЬ.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. отН. представляют собой, соответственно, δΕρ. Νο. 8 и δΕρ. Νο. 36, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность δΕρ. Νο. 8 со структурой, описанной выше использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК δΕρ. Νο. 36. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. тоП Тиηе^(^Ε3) от №уадеи. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 9. Слитый белок δΕρ. Νο. 9.

Белок δΕρ. Νο. 9 представляет собой слитый белок, имеющий длину 317 аминокислот и массу 35,9

- 14 024452 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКА1Ь116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (8ЕО. №. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАТЬ включена комбинация участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (8Е0. №. 20) и урокиназой иРА (8ЕО. №. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между 8ЕО. №. 20 и 8ЕО. №. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (8ЕО. №. 22).

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер О8ООО (8Е0. №. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Е0. №. 26) между участком расщепления урокиназой иРа и последовательностью ТКАТЬ.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представляют собой, соответственно, 8Е0. №. 9 и 8Е0. №. 37, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8Е0. №. 9 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8Е0. №. 37. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. сой Кокейа (ЮЕ3) от №уадеи. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 10. Слитый белок 8Е0. №. 10.

Белок 8Е0. №. 10 представляет собой слитый белок, имеющий длину 338 аминокислот и массу

38,3 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКАТЬ95-281 присоединен фрагмент интерферонагамма человека (8Е0. №. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАГЬ слитый белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (8Е0. №. 20) и урокиназой иРА (8Е0. №. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Рядом с 8Е0. №. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (8Ер. №. 22).

Белок также содержит гибкие линкеры: между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Е0. №. 26); и между линкером для пегилирования и последовательностью ТКАТЬ гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Ер. №. 26).

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представляют собой, соответственно, 8Е0. №. 10 и 8Е0. №. 38, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8Е0. №. 10 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8Е0. №. 38. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. сой ВЬ21 (ПЕ3) и Тииег(ПЕ3)рЬу88 от №уадеи. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 11. Слитый белок 8Е0. №. 11.

Белок 8Е0. №. 11 представляет собой слитый белок, имеющий длину 317 аминокислот и массу 35,9 кДа, в котором к С-концу последовательности ТКАТЫ16-281 присоединен фрагмент интерферонагамма человека (8Е0. №. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАГЬ белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (8Е0. №. 20) и урокиназой иРА (8Е0. №. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между 8Е0. №. 20 и 8Е0. №. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (8Ер. №. 22).

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Е0. №. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Е0. №. 26) между участком расщепления урокиназой иРа и последовательностью ТКАТЬ.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представляют собой, соответственно, 8Е0. №. 11 и 8Е0. №. 39, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

- 15 024452

Аминокислотную последовательность δΕρ. Νο. 11 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК δΕρ. N0. 39. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3) и Е. сой ΤιιηοΓ(ΌΕ3)ρΕ.γ5δ от Νοναβοη. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 12. Слитый белок δΕρ. Νο. 12.

Белок δΕρ. Νο. 12 представляет собой слитый белок, имеющий длину 449 аминокислот и массу 51,8 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТРАЛБ116-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (δΕρ. Νο. 19) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТРАЛЬ белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (δΕρ. Νο. 20) и урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка.

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер ΟδΟΟΟ (δΕρ. Νο. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер ΟδΟΟΟ (δΕρ. Νο. 26) между участком расщепления урокиназой иРа и последовательностью ТРАЛЬ.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. той, представляют собой, соответственно, δΕρ. Νο. 12 и δΕρ. Νο. 40, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность δΕρ. Νο. 12 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК δΕρ. Νο. 40. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. той ВЬ21 (ΌΕ3) и Е. той ΤιιηοΓ(ΌΕ3)ρΕ.γ5δ от Νοναβοη. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 13. Слитый белок δΕρ. Νο. 13.

Белок δΕρ. Νο. 13 представляет собой слитый белок, имеющий длину 44 9 аминокислот и массу 51,8 кДа, в котором к С-концу последовательности ТРАЛЙ116-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (δΕρ. Νο. 19) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКА1Ь последовательно встроены последовательности участков распознавания протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (δΕρ. Νο. 20) и урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка.

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер ΟδΟΟΟ (δΕρ. Νο. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления урокиназой иРа; и гибкий глицин-сериновый линкер ΟδΟΟΟ (δΕρ. Νο. 26) между участком расщепления металлопротеазой ММР и последовательностью ТРАЛЬ.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. той, представляют собой, соответственно, δΕρ. Νο. 13 и δΕρ. Νο. 41, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность δΕρ. Νο. 13, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК δΕρ. Νο 41, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. той В.21 (ΌΕ3) от Νονα^οη и Е. той Ε21ΟΕ3ρΕγ5δΡΙΕ от δΙηιΕίβοηο. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 14. Слитый белок δΕρ. Νο. 14

Белок δΕρ. Νο. 14 представляет собой слитый белок, имеющий длину 456 аминокислот и массу

52,4 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТРА1Ы16-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (δΕρ. Νο. 19) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТРАЛЬ встроены последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (δΕρ. Νο. 20) и урокиназой иРА (δΕρ. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между последовательностями δΕρ. Νο. 20 и δΕρ. Νο. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (δΕρ. Νο. 22).

- 16 024452

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Ер. Νο. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления урокиназой иРа; и гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Ер. Νο. 26) между участком расщепления металлопротеазой ММР и последовательностью ТКА1Ь.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. οο1ί, представляют собой, соответственно, 8Ер. Νο. 14 и 8Ер. Νο. 42, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8Ер. Νο. 14, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8Ер. Νο 42, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. οο1ί В.21 (ЭЕ3) от №уадеп и штамма Е. οο1ί ВЬ2ШЕ3рЬу88К1Ь от 81га1адепе. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 15. Слитый белок 8Ер. Νο. 15.

Белок 8Ер. Νο. 15 представляет собой слитый белок, имеющий длину 456 аминокислот и массу

52.4 кДа, в котором к С-концу последовательности ТКА1Ы16-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (8Ер. Νο. 19) в качестве эффекторного пептида. Между последовательностью ТКА1Ь и эффекторным пептидом слитый белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (8Ер. Νο. 20) и урокиназой иРА (8Ер. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между последовательностями 8Ер. Νο. 20 и 8Ер. Νο. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (8Ер. Νο. 22).

Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Ер. Νο. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления урокиназой иРа; и гибкий глицин-сериновый линкер 08000 (8Ер. Νο. 26) между участком расщепления металлопротеазой ММР и последовательностью ТКА1Ь.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. οο1ί, представляют собой, соответственно, 8Ер. Νο. 15 и 8Ер. Νο. 43, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8Ер. Νο. 15, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8Ер. Νο. 43, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. οο1ί В.21 (ЮЕ3) от №уадеп и штамма Е. οο1ί Е2ШЕ3рЕу58К1Е от 81га1адепе. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 16. Слитый белок 8Ер. Νο. 44.

Белок 8Ер. Νο. 44 представляет собой слитый белок, имеющий длину 538 аминокислот и массу

62.4 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКА1Ы22-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-альфа 2Ь человека (8Ер. Νο. 46) в качестве эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКА1Ь встроены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (8Ер. Νο. 20) и урокиназой иРА (8Ер. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между двумя комбинациями последовательностей 8Ер. Νο. 20 и 8Ер. Νο. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (8Ер. Νο. 22).

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 4 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. οο1ί, представляют собой, соответственно, 8Ер. Νο. 44 и 8Ер. Νο. 48, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8Ер. Νο. 44, представленную выше, используют в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8Ер. Νο. 48, представленной выше. Можно получать плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и сверхэкспрессию слитого белка можно осуществлять в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию можно осуществлять в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. οο1ί В.21 (ЭЕ3) от Шуадеп и штамма Е. οο1ί Е21ЭЕ3рЕу58Р1Е от 81та1адепе. Разделение белка можно проводить с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 17. Слитый белок 8Ер. Νο. 45.

Белок 8Ер. Νο. 45 представляет собой слитый белок, имеющий длину 384 аминокислоты и массу 44

- 17 024452 кДа, в котором к Ν-концу последовательности ТКА1Ь95-281 присоединена консенсусная последовательность интерферона-альфа человека (5>Ер. Νο. 47) в качестве эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКА!Ь встроены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (5>Ер. Νο. 20) и урокиназой иРА (5>Ер. Νο. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между комбинациями последовательностей 5>Ер. Νο. 20 и 8ЕО. Νο. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (5Ер. Νο. 22).

Белок также содержит гибкий глицин-сериновый линкер ОО8О (8Е0. Νο. 50) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР.

Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 4 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. той, представляют собой, соответственно, 8Е0. Νο. 45 и 8Е0. Νο. 49, как показано в прилагаемом списке последовательностей.

Аминокислотную последовательность 8Е0. Νο. 45, представленную выше, используют в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК 8Е0. Νο 49, представленной выше. Можно получать плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и сверхэкспрессию слитого белка можно осуществлять в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию можно осуществлять в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. той В.21 (ΌΕ3) от Шуаден и штамма Е. той Ь21 ПЕ3рЬук8К1Ь от §1та!адепе. Разделение белка можно проводить с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.

Пример 18. Исследование противоопухолевой активности слитых белков.

Исследование противоопухолевой активности слитых белков проводили ίη νίίτο в анализе цитотоксичности на опухолевых клеточных линиях и ίη νίνο у мышей. Для целей сравнения использовали белок тйТКА1Ь114-281 и плацебо.

1. Измерение кругового дихроизма.

Качество препаратов слитых белков с точки зрения их структуры определяли с помощью кругового дихроизма (СИ) для соединений примера 3, примера 5, примера 12 и примера 14.

Круговой дихроизм используют для определения вторичных структур и конформации белка. В способе СИ используется оптическая активность белковых структур, проявляющаяся во вращении плоскости поляризации света и появлении эллиптической поляризации. Спектр СИ белков в дальней ультрафиолетовой области (УФ) обеспечивает точные данные о конформации главной полипептидной цепи.

Образцы белка, подлежащие анализу после составления в буфере, состоящем из 50 мМ Тг1к-НС1, рН 8,0, 100 мМ ИаС1, 10% глицерина, 0,1 мМ ΖηΟ₂, 80 мМ сахарозы, 5 мМ ЭТТ подвергали диализу в мешках для диализа (Ыдта-АИпсН) с пределом 12 кДа. Диализ проводили против 100-кратного избытка (об./об.) буфера по сравнению с белковыми препаратами при перемешивании в течение нескольких часов при 4°С. После завершения диализа каждый препарат центрифугировали (25000 об./мин, 10 мин, 4°С) и соответствующие супернатанты собирали. Концентрацию белка в образцах, полученных таким образом, определяли способом Брэдфорд.

Измерение кругового дихроизма для белков в диапазоне концентраций 0,1-2,7 мг/мл проводили на спектрополяриметре Окто ί-710 в кварцевой кювете с оптическим путем 0,2 мм или 1 мм. Измерение проводили в потоке азота со скоростью 7 л/мин, который позволял проводить измерение в диапазоне длин волн от 195 до 250 нм. Параметры измерения: спектральное разрешение - 1 нм; половина ширины пучка света 1 нм; чувствительность 20 мград, среднее время для одной длины волны - 8 с, скорость сканирования 10 нм/мин.

Результаты представлены в качестве среднего значения для трех измерений. Спектры кругового дихроизма для гйТКА1Ь114-281, тйТКА1Ь95-281 и белков примера 12, примера 5, примера 3 и примера 14 представлены на фиг. 5.

Полученные спектры анализировали в численном виде в диапазоне 193-250 нм с использованием программного обеспечения СИРго. Точки, для которых напряжение на фотоумножителе превышало 700 В, пропускали, вследствие слишком низкого соотношения сигнала к шуму при этом диапазоне длин волн.

Полученные данные служили для вычисления содержания конкретных вторичных структур с использованием программного обеспечения СИРго (табл. 1).

- 18 024452

Таблица 1 Содержание вторичных структур в анализируемых белках

Белок	МКМ50 (Ехр-Са1)	а- спираль	β- слой	Сдвиг	Неупорядо- ченность
Ех. 3	0.018	98.0%	1.5%	0.0%	0.5%
Ех. 5	0.048	45.6%	8.2%	18.8%	27.4%
Ех.12	0.104	39.3%	17.3%	15.0%	28.4%
Ех. 14	0.01	100.0%	0.0%	0.0%	0.0%
КгТКАЦ*		1.94%	50.97%	7.74%	39.35%
ЬгТКАИ.114-281	0.389	4.9%	33.7%	23.1%	38.3%
ЬгТКАИ 95	0.074	0.0%	21.6%	16.0%	62.4%

* величина, полученная, исходя из кристаллической структуры 1Ό4Υ

Контроли (гЬТКАТЬ114-281 и тЬТКАТЬ95-281) демонстрируют спектр СО, характерный для белков с преобладанием структур типа β-слоя (резко очерченный минимум эллиптичности при длине волны 220 нм). Это подтверждает вычисление компонентов вторичной структуры, которое указывает на минимальное количество элементов α-спирали.

Полученный результат также согласуется с данными о кристаллической структуре белка ТКАТЬ, где бета-элементы составляют более половины его состава.

В случае слитых белков согласно примеру 3, примеру 5, примеру 12 и примеру 14, спектры кругового дихроизма характеризуются двумя минимумами при длинах волн 208 и 220 нм, что характерно для белков со смешанной вторичной структурой типа альфа/бета. Молекулы интерферона, присоединенные к ТКАТЬ в слитых белках, образуют, главным образом, альфа-спиральные структуры, таким образом, смешанный характер вторичных структур в анализируемых химерных белках может подтвердить присутствие надлежащим образом свернутых элементов как ТКАТЬ, так и интерферона.

В случае препаратов согласно примеру 3 и примеру 14, было выявлено практически 100% структур альфа-типа. Такое содержание структур альфа-типа является следствием узкого диапазона длин волн, используемых в анализе, что является следствием выбора составов, оптимальных для способов и материалов (высокое количество шума в дальней УФ-области). Отсутствие остро очерченного диапазона 180200 нм в анализируемой области спектра может привести к тому, что содержание структур α-спирали будет переоцененным.

2. Исследования на клеточных линиях ίη νίίτο.

Клеточные линии Таблица 2. Прикрепляющиеся клетки

Клеточная линия	Тип рака	Среда	количество клеток на лунку (тысячи)
Со1о 205 АТСС #ССЬ*222	рак ободочной и прямой кишки человека	ΚΡΜΙ ♦ 10% РВ5 ♦ пенициллин + стрептомицин	5
ИГ-29 АКС К СС1.-2	рак ободочной и прямой кишки человека	МсСоу + 10% ГВ5 ♦ пенициллин * стрептомицин	5
Ьи-145 АТСС# НТВ-81	рак предстательной железы человека	ΚΡΜΙ * 10% Р85 +пенициллин + стрептомицин	3
РС-3 АТСС #СКЫ 435	рак предстательной железы человека	ЯРЛАГ * 10% ГВ5 *пенициллин + стрептомицин	4
МСР-7 АТСС #НТВ-22	рак молочной железы человека	МЕМ ♦ 10% ГВ5 +пенициллин + стрептомицин	4,5
МОА-М&-231 АТСС # НТВ-26	рак молочной железы человека	0МЕМ + 10% РВ5 +пенициллин + стрептомицин	4,5
им-ис-з АТСС# СЬК-1749	рак мочевого пузыря человека	МЕМ * 10% РВ5 + пенициллин + стрептомицин	3*5
5ΊΫ780 АТСС #СК1-2169	рак мочевого пузыря человека	0МЕМ + 10% ^пенициллин + стрептомицин	3
51*625 АТСС «СС1-227	рак ободочной и прямой кишки человека	ОМЕМ + 10% РВ5 + пенициллин + стрептомицин	5
ВхРС-3 АТСС «СКИ 687	рак поджелудочной железы человека	КРАМ + 10% РВ5 *пеницмллин + стрептомицин	4,5
5Κ-θν·3 АТСС «НТВ-77	рак яичников человека	МсСоу + 10% РВ5 + пенициллин·· стрептомицин	4
№Н:ОУСАК-3 АТСС #НТВ-161	рак яичников человеке	ΚΡΜΙ + 20% РВ5+0,1 мг/мл инсулина + пенициллин «-стрептомицин	7
НерС2 АТСС#НВ-В065	гелэтома человека	МЕМ + 10% ГВ5 «-пенициллин + стрептомицин	7
293 АТСС Г си-1573	клетки почки эмбриона человека	ААЕМ * 10% РВ$ + пенициллин + стрептомицин	4
АСНЫ АТСС #ССЕ.-222	рак почки человека	МЕМ* 10% РВ5 +пенициллин* стрептомицин	4
САК12 АТСС «НТВ-47	рак почки человека	МсСоу +10% ГВ$ * пенициллин » стрептомицин	3,5
ΝΟ- Н69АК АТСС 0СГО.-11351	мелкоклеточный рак легких человека	ΚΡΜΙ * 10% Р65 * пенициллин * стрептомицин	10
НТ144 АТСС# НТВ-63	клетки меланомы человека	МсСоу * 10% П55 + пенициллин 4 стрептомицин	7
МС1-Н460 АТСС «НТВ-177	рак легкого человека	МЕМ * 10% РВ$ +ленициллин * стрептомицин	2,5
1НѫРАТСС #СК1-1740	рак предстательной железы человека	ΚΡΜΙ ♦ 10% РВ5 + пенициллин * стрептомицин	4,5

- 19 024452

Таблица 3. Не прикрепляющиеся клетки

Клеточная линия	Тип рака	Среда	Количество клеток на (т«и)
Ν0Ι-Η69 ' АТСС# НТВ-119	мелкоклеточный рак легких человека	ΚΡΜΙ + 10% РВ5 + пенициллин + стрептомицин	22
-1игка1 АЗ АТССЮ1.-2570	лейкоз человека	ΚΡΜΙ ♦ 10% РВ5 ♦пенициллин * стрептомицин	10
Н1_60 АТСС# СС1.-240	лейкоз человека	ΚΡΜΙ + 20% ГВ5 ♦пенициллин * стрептомицин	10
ССКГ-СЕМ АТСС# ССЬ-119	лейкоз человека	ΛΡΜΙ ♦ 20% РВ5 ♦пенициллин + стрептомицин	10

МТТ-тест цитотоксичности

Анализ с МТТ представляет собой колориметрический анализ, используемый для измерения пролиферации, жизнеспособности и цитотоксичности клеток. Он состоит в разложении желтой соли тетразолия МТТ (4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до нерастворимого в воде фиолетового красителя формазана под действием митохондриального фермента сукцинат-тетразолий редуктазы 1. Восстановление МТТ происходит только в живых клетках. Анализ данных состоит в определении концентрации Ιί'.'₅₀ белка (в нг/мл), при которой происходит 50% снижение количества клеток в обработанной популяции по сравнению с контрольными клетками. Результаты анализировали с использованием программного обеспечения ОгарйРай Рп8т 5.0. Тест проводили в соответствии с описанием в литературе (Се11'8, ΙΕ, (1998). Се11 Вю1оду, а ЬаЬотаТоту НапйЬоок, 8есопй еййюп, Асайепис Рге88, 8ап Э|едо; Υηπ^, Υ., Кой, ЬА, Т8а1, Ж, (2004); КуокетеШ оГ уйа1 апй сйетка1 ГасЮг8 \\йй ога1 сапсег т Такай. 1рп I С1т Опсо1, 34(4), 176-183).

Клеточную культуральную среду разбавляли до определенной плотности (10⁴-10⁵ клеток на 100 мкл). Затем 100 мкл соответствующим образом разбавленной суспензии клеток наносили в 96-луночный планшет в трех экземплярах. Полученные таким образом клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С в 5 или 10% СО₂, в зависимости от использованной среды, а затем к клеткам (в 100 мкл среды) добавляли дополнительные 100 мкл среды, содержащей различные концентрации исследуемых белков.

После инкубации клеток с исследуемыми белками в течение следующих 72 ч, что эквивалентно делению клеток 3-4 раза, в среду с исследуемым белком добавляли 20 мл рабочего раствора МТТ [5 мг/мл], и инкубацию продолжали в течение 3 ч при 37°С в 5% СО₂. Затем среду с раствором МТТ удаляли, и кристаллы формазана растворяли добавлением 100 мкл ЭМ8О. После перемешивания измеряли поглощение при 570 нм (эталонный фильтр 690 нм).

Тест цитотоксичности с ΕΖ4ϋ

Тест ΕΖ4υ (Вютейюа) использовали для исследования цитотоксической активности белков в не прикрепляющихся клеточных линиях. Этот тест является модификацией МТТ, где формазан, образующийся при восстановлении соли тетразолия, является растворимым в воде. Исследование жизнеспособности клеток проводили после непрерывной инкубации клеток в течение 72 часов с белком (семь концентраций белка, каждый в трех экземплярах). Исходя из этого, определяли величины Ιί\₀ (в качестве среднего значения для двух независимых экспериментов) с использованием программного обеспечения ОгарйРай РЙ8т 5.

Результаты тестов цитотоксичности ш уйто обобщенно представлены в табл. 4 и в табл. 5 в качестве величин ГС50 (нг/мл), которые соответствуют концентрации белка, при которой наблюдают цитотоксический эффект слитых белков на уровне 50% относительно контрольных клеток, обработанных только растворителем.

Каждый эксперимент соответствует средней величине по меньшей мере двух независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах. В качестве критерия отсутствия активности препаратов белков, был принят предел Ιί\₀ 2000 нг/мл. Слитые белки с величиной Ιί\₀ выше 2000 считали неактивными.

Клетки для этого теста отбирали так, чтобы они включали опухолевые клеточные линии, естественным образом устойчивые к белку ТРАК (критерий естественной устойчивости к ТРАК: Κ₅₀ для белка ТКАК > 2000), опухолевые клеточные линии, чувствительные к белку ТРАК, и устойчивую к доксорубицину линию МЕ8-8А/ЛХ5 в качестве линии раковых клеток, устойчивой к общепринятым средствам для лечения рака.

Недифференцированную клеточную линию НиУЕС использовали в качестве клеточной линии здорового контроля для оценки эффекта/токсичности слитых белков в нераковых клетках. Полученные результаты подтверждают возможность преодоления устойчивости клеточных линий к ТРАК путем введения определенных слитых белков по изобретению в клетки, естественным образом устойчивые к ТРАК. Когда слитые белки по изобретению вводили в клетки, чувствительные к ТРАК, в некоторых случаях наблюдали явное и существенное усиление мощности действия, проявляющееся в сниженных величинах Κ₅₀ слитого белка по сравнению с Κ₅₀ для ТРАК отдельно. Более того, была достигнута цитотоксическая активность слитого белка по изобретению в клетках, устойчивых к классическому средству против рака доксорубицину, и в некоторых случаях она была сильнее активности ТРАК отдельно.

- 20 024452

Величины 1С₅₀ выше 2000, полученные для нераковых клеточных линий, демонстрируют отсутствие токсических эффектов, ассоциированных с использованием белков по изобретению, для здоровых клеток, что указывает на потенциальную низкую системную токсичность белка.

Определение цитотоксической активности выбранных препаратов белков против расширенной панели опухолевых клеточных линий

В табл. 5 представлены результаты исследований цитотоксической активности ίη νίίΐΌ для выбранных слитых белков по изобретению против широкой панели опухолевых клеток из различных органов, соответствующих широкому диапазону большинства распространенных типов рака.

Полученные величины 1С₅₀ подтверждают высокую цитотоксическую активность слитых белков и, таким образом, их потенциальную применимость при лечении рака.

Таблица 4. Цитотоксическая активность слитых белков по изобретению

Белок	Непрерывная инкубация препаратов с клетками в течение 72 часов, (МТТ тест, нг/мл)
МЕ5-5А	МЕ5-5А/ОХ5	НСГ116	5К-МЕ5-1	А549	МСР10А
1СМ	±50	1С»	±50	•с»	±50	1С«	±50	1С»	±50	1С»	±50
гКТКАН.95-281	>2000		32.2	2.40	173	31,3	12.2	2.33	>2000		>2000
Пример 1	196.5	11.74	46.9	0.16	210.7	102.67	108.2	28.43	>2000		>2000
ПримерЗ	68.31	3.5	26.54	5.2	37.97	1.9	17.91	34.1	872.2	85.3	2000
Пример 5	57.18	40.8	14.11	6.7	72.1	36.1	53.84	30.9	1326	888.2	>2000
Пример 12	1.33	0.54	2.73	2.23	1.90	0,22	1.82	1,00	526	107.4	>2000
Пример 14	0.09	0.01	0.059	0,08	2-10	о.зз	0.06	0,01	672,80	8.20	>2000

опухолевых клеточных линий

Таблица 5. Анализ цитотоксической активности выбранных препаратов белков против широкой панели

Клеточная линия	СОЮ 205	НТ 29	59/620	МСР 7	МОА-МВ-231	Ои 145	ШСаР	РС 3
ЙК	50		50		5ϋ		50		50		50		50		50
ГНТКАИ95-281	24.9	17.68	10000		10000		10000		10000		10000		2052	466.0	10000
Пример 14	2.916	0,70	131,5	33.23	562.5	371.7	3901	2745.7	6.38	3-21	34.75	12.37	1378	377.60	1325
	59/780	им-ис-з	293	САК12	5Κ-ΟΥ-3	ОУ-САК-3	К69АК	ΝΟ-Η69
линия	жата	50	Жййй	50		50		50	ΖΖΟΖί	50		50		50		50
гЬТНА11_95-281	120	42.43	2242	1367	10000		10000		10000		93.1	8.34	10000		10000
Пример 14	0.766	1.04	3.154	0,21	10000	0.0	6594	3661.4	8172	2585.9	0.007	0,01	3889	864.79	10000
Клеточная	НС1-Н460	ВхРСЗ	НерС2	НТ 144	АСНЫ	ДЖКАТ АЗ	нио	ССКР-СЕМ
линия		50		50		5Э		50		50	£Е®аа	50		50		50
гЬТКА1195-281	5889	111,0	64.71	31.81	10000		1734	218.5	10000		10000		10000		10000
Пример 14	0.547	0.25	0.137	0.11	10000	0.00	0.13	0.02	2.95	1.29	0.112	0.1	10000		ιοοοο
Клеточная	СОЮ	ΪΟ5	НТ 29	59/620	МСР 7	МОА-МВ-231	ои 145	ЬЫСаР	РС 3
линия	ж	50	ж&я	50	&№Я	50	яяяяи	50		50	ЖЖЙ	50	ίβίβΚδ	50		50
гЪТКА11_95‘281	24.9	17.68	10000		10000		10000		10000		10000		2052	466.0	10000
Пример 5	5.717	1.69	159.6	7.64	683.5	477.3	867.5	108,2	108.8	18.67	296.9	65.20	459.9	45.04	1649	861.3
Клеточная	59/780	им-ис-з	293	САК12	5К-ОУ-3	ОУ-САК-З	Н69АК	ΝΟ-Η69
линия	йж	50	среднее значение	50		$0		5£>		50	ж	50	жжк	50		50
гЬТКА11_95-281	120	42.43	2242	1367	10000		10000		10000		93.1	8.34	10000		10000
Пример 5	18.68	2.37	21.29	2.10	1126	291,0	2799	371.2	5221	170.4	15.03	0.69	1251	94.05	5270	763.7
Клеточная	ΝΟ-Η460	БхРСЗ	НерО2	НТ 144	АСНМ	ЛЖКАТ АЗ	Н160	ССКР-СЕМ
линия		50		50		50	/Ж	50		50	Ж	50	Жй	50		50
ГЫПА1195-281	5889	111.0	64.71	31.81	10000		1734	218.5	10000		10000		10000		10000
Пример 5	22.95	2.57	17.6	0.85	1174	58.69	26.85	2.94	187.3	45.61	372.2	225.1	7000		7000

2. Противоопухолевая эффективность слитых белков ίη νί\Ό на ксенотрансплантатах.

Противоопухолевую активность препаратов белков исследовали в модели на мышах с клетками рака толстого кишечника человека НСТ116.

Клетки

Клетки НСТ116 поддерживали в среде КРМ1 1640 (Нус1опе, Ьодап, ИТ, США), смешанными в соотношении 1:1 с Ορίί-МЕМ (ΙηνίϋΌ^η, каталожный номер № 22600-134), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамина. В день трансплантации мышам клетки открепляли от подложки путем промывания клеток трипсином (ΙηνίϋΌ^η), затем клетки центрифугировали при 1300 об./мин., 4°С, 8 мин., суспендировали в буфере НВ§§ (среда Хенкса), подсчитывали и разбавляли до концентрации 25 х 10⁶ клеток/мл.

Клетки РЬС/РКТ/5 (СЬ8) поддерживали в ΌΜΕΜ (НуС1оге, Ьодащ ИТ, США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамина. В день трансплантации мышам клетки открепляли от подложки путем промывания трипсином (ΙηνίΡΌ^η), затем клетки центрифугировали при 1300 об./мин., 4°С, 8 мин., суспендировали у буфере НВ§§ (среда Хенкса), подсчитывали и разбавляли до концентрации 25х 10⁶ клеток/мл.

Клетки НерС2 поддерживали в МЕМ (Ну-Ооие. Бодан ИТ, США), дополненной 10% эмбриональ- 21 024452 ной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамина. В день трансплантации мышам клетки открепляли от подложки путем промывания трипсином ОпхЬгодеп), затем клетки центрифугировали при 1300 об./мин., 4°С, 8 мин., суспендировали у буфере НВ88 (среда Хенкса), подсчитывали и разбавляли до концентрации 25х10⁶ клеток/мл.

Мыши

Исследование противоопухолевой активности белков по изобретению проводили у мышей СЭ-гшбе в возрасте 7-9 недель (С^1:С^1-Ροxη1^ηи 1) или у мышей Сг1:8НО-Ргкбс^кс1бНг^Ьг в возрасте 4-5 недель, полученных от СЬаг1ек КТег Сегтапу. Мышей содержали в специализированных свободных от патогенов условиях со свободным доступом к пище и деминерализованной воде (без ограничений). Все эксперименты на животных проводили в соответствии с руководством: йИегбЬарПпагу Ргтар1ек апб СшбеЬпек Гог !Ье Ике оГ Атта1к ш КекеагсЬ, МагкеЬпд апб ЕбисаЬоп, выпущенным №ν Υο^к Асабету оГ 8с1епсек' Аб Нос СотпиНее оп Атта1 КекеагсЬ и они были добраны арр^ονеб Ιν Ьоса1 Е!Ыск СоттЪ!ее оп Атта1 Ехрептеп!а!юп ш \Уагка\у (№. 71/2009).

Ход экспериментов и оценка

Модель рака толстого кишечника человека мыши С^1:С^1-Ροxη1^ηи 1.

На 0 сутки мышам С^1:С^1-Ροxη1^ηи 1 подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 5х10⁶ клеток НСТ116, суспендированных в 0,2 мл буфера НВ88 с помощью шприца с иглой 0,5х25 мм (Водтагк). Когда опухоли достигали размера ~50-140 мм³ (14 сутки), мышей случайным образом, распределяли с получением среднего размера опухолей в группе ~70 мм³ и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 (10 мг/кг), и гЬТКА1Ь114-281 (10 мг/кг) в качестве сравнения и буфер для составления (5 мМ NаН₂РО₄, 95 мМ №₂НРО₄, 200 мМ №С1, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ 2пС1₂, 10% глицерин, 80 мМ сахароза, рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) каждые сутки в течение десяти суток на 8-12 сутки и 15-19 сутки. Когда группа введения достигала среднего размера опухоли ~1000 мм³, мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга. В контрольной группе вводили гЬТКА1Ь114-281.

Мыши Сг1:8НО-Ргкбс^кс1бНг^Ьг

На 0 сутки мышам Сг1:8НО-Ргкбс^кс1бНг^Ьг подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 5х10⁶ клеток НСТ116, суспендированных в 0,1 мл буфера НВ88 с помощью шприца с иглой 0,5х25 мм (Водтагк). Когда опухоли достигали размера ~200-700 мм³ (18 сутки), мышей случайным образом, распределяли с получением среднего размера опухолей в группе ~400 мм³ и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 14 (50 мг/кг), и гЬТКА1Ь114-281 (20 мг/кг) в качестве сравнения и буфер для составления (5 мМ NаН₂РО₄, 95 мМ №₂НРО₄, 200 мМ №С1, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ 2пС1₂, 10% глицерин, 80 мМ сахароза, рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) 6 введений один раз в двое суток. На 32 сутки эксперимента мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга.

Модель рака печени человека Клетки Р1 ,С/РК1'75

На 0 сутки мышам Сг1:8НО-Ргкбс^кс1бНг^Ьг подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 7х10⁶ клеток РЬС/Р^^, суспендированных в смеси буфер НВ88:матригель (3:1) объемом 0,1 мл с помощью шприца с иглой 0,5х25 мм (Водтагк). Когда опухоли достигали размера ~140-300 мм³ (31 сутки), мышей случайным образом распределяли с получением среднего размера опухолей в группе ~200 мм³ и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 14 (20 мг/кг) и гЬТКА1Ь114-281 (30 мг/кг) в качестве сравнения и буфера для составления (5 мМ NаН₂РО₄, 95 мМ №₂НРО₄, 200 мМ №С1, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ 2пС1₂, 10% глицерин, 80 мМ сахароза, рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) по следующей схеме: 4 введения раз в трое суток, а затем 2 введения раз в двое суток (с|3бх4 и С|2бх2). На 32 сутки эксперимента мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга.

Клетки НерС2

На 0 сутки мышам Сг1:8НО-Ргкбс^кс1бНг^Ьг подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 7х10⁶ клеток НерС2, суспендированных в смеси буфер НВ88:матригель (3: 1) объемом 0,1 мл с помощью шприца с иглой 0,5х25 мм (Водтагк). Когда опухоли достигали размера ~250-390 мм³ (19 сутки), мышей случайным образом, распределяли с получением среднего размера опухолей в группе ~330 мм³ и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 14 (50 мг/кг) и гЬТКА1Ь114-281 (30 мг/кг) в качестве сравнения и буфера для составления (5 мМ NаН₂РО₄, 95 мМ №₂НРО₄, 200 мМ №С1, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ 2пС1₂, 10% глицерин, 80 мМ сахароза, рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) 6 введений один раз в двое суток. На 31 сутки эксперимента мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга.

Размер опухоли измеряли с использованием электронного толщиномера, объем опухоли вычисляли с использованием формулы: (а²хЪ)/2, где а = более короткая диагональ из 25 опухоли (мм) и Ъ = более длинная диагональ опухоли (мм). Ингибирование роста опухоли вычисляли с использованием формулы:

ТС! [%] (ингибирование роста опу.\оли)=(\УТЛУС)х 100-100%,

- 22 024452 где \УТ относится к среднему объему опухоли в группе введения, \УС относится к среднему объему опухоли в контрольной группе.

Экспериментальные результаты представлены в качестве среднего значения ± стандартное отклонение (8Ό). Все вычисления и графики подготавливали с использованием программного обеспечения СгарЬРаб РгХт 5.0.

Экспериментальные результаты, полученные у мышей Сг1:СИ1-Рохи1^ии, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14, и в сравнении с гйТКА1Ь114-281 представлены на фиг. 6 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 7, на которой показано ингибирование роста опухоли (%ТС1) в качестве процента от контроля.

Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 6 и 7, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 вызывало ингибирование роста опухоли НСТ116, с ТС1, соответственно, 71%; 67% и 75% относительно контроля на 28 сутки эксперимента. Для ГЙТКА1Ы14-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с ТС1 на уровне 44%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с ТКА1Ь отдельно.

Экспериментальные результаты, полученные у мышей Сг1:§НО-Ргкбс^8с1бНг^Ьг, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 14 (20 мг/кг), и в сравнении с гйТКА1Ь114-281 представлены на фиг. 8 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 9, на которой показано ингибирование роста опухоли (%ТС1) в качестве процента от контроля.

Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 8 и 9, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 14 вызывало ингибирование роста опухоли НСТ116 с ТС1 22,5% относительно контроля на 32 сутки эксперимента. Для гйТКА1Ь114-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с ТС1 на уровне 5,6%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с ТКА1Ь.

Экспериментальные результаты, полученные у мышей Сг1:§НО-Ргкбс^8с1бНг^Ьг, нагруженных клетками рака печени РЬС/РКР/5, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 14 и в сравнении с гйТКАГЫ 14-281, представлены на фиг. 10 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 11, на которой показано ингибирование роста опухоли (%ТС1) в качестве процента от контроля.

Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 10 и 11, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 14, вызывало ингибирование роста опухоли РЬС/РКР/5 с ТС1 34% относительно контроля на 49 сутки эксперимента. Для гйТКА1Ь114-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с ТС1 на уровне 18%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с ТКА1Ь.

Экспериментальные результаты, полученные у мышей Сг1:§НО-Ргкбс^8с1бНг^Ьг, нагруженных клетками рака печени НерС2, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 14 и в сравнении с ГЙТКА1Ы14-281, представлены на фиг. 12 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 13, на которой показано ингибирование роста опухоли (%ТС1) в качестве процента от контроля.

Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 12 и 13, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 14, вызывало ингибирование роста опухоли НерС2 с ТС1 33,6% относительно контроля на 31 сутки эксперимента. Для ГЙТКА1Ы14-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с ТС1 на уровне 7%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с ТКА1Ь.

Исследованные слитые белки не вызывали существенных побочных эффектов, проявляющихся в снижении массы тела мышей (т.е. менее 10% от исходной массы тела). Это показывает низкую системную токсичность белка.

- 23 024452

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ас1а1пес1 Зр. ζ о. о.

<12 0> Слитый белок против рака <130> Р072 02 РЬ <160> 50 <170> РаРепРШ уегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 345 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 1

Суб Азр Ьеи Рго С1п ТЬг Н1з Зег 1 5

Ьеи С1у Зег Агд Агд ТЬг Ьеи МеР 10 15

Ьеи Ьеи А1а О1п Мер Агд Агд Не 20

Зег Ьеи РЬе Зег Суз Ьеи Ьуз Азр 25 30

Агд Нгз Азр РЬе С1у РЬе Рго θΐη 35 40

61и 61и РЬе Е1у Азп С1п РЬе 61п 45

Ьуз А1а С1и ТЬг 11е Рго Уа1 Ьеи 50 55

ΗΪ5 С1и МеР 11е 61п 61п 11е РЬе 60

Азп Ьеи РЬе Зег ТЬг Ьуз Азр Зег 65 70

Зег А1а А1а Тгр Азр 61и ТЬг Ьеи 75 80

Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЬг С1и Ьеи 85

Туг 61п С1п Ьеи Азп Азр Ьеи С1и 90 95

А1а Суз Уа1 11е 61 п 61у Уа1 61 у 100

Уа1 ТЬг 61ц ТЬг Рго Ьеи Мер Ьуз 105 110

61и Азр Зег 11е Ьеи А1а Уа1 Агд 115 120

Ьуз Туг РЬе 61п Агд 11е ТЬг Ьеи 125

Туг Ьеи Ьуз 61и Ьуз Ьуз Туг Зег 130 135

Рго Суз А1а Тгр 61и Уа1 Уа1 Агд 140

А1а 61и 11е Мер Агд Зег РЬе Зег 145 150

Ьеи 5ег ТЬг Азп Ьеи Е1п 61 и Зег 155 160

Ьеи Агд Зег Ьуз 61ц Рго Ьеи б!у 165

Ьеи А1а 61у Агд Уа1 Уа1 Агд Рго 170 175

- 24 024452

Ьеи

61у

Ьеи

А1а 180

61у

Агд

Уа1 Уа1

Агд Уа1 А1а А1а 185

Н1з

Не 190

ТЬг

61у

ТЬг

Агд

61у

Агд

Зег

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Азп

Зег

Ьуз

Азп

61и

195

200

205

Ьуз

А1а

Ьеи

61у

Агд

Ьуз

Не

Азп

Зег

Тгр

61и

Зег

Зег

Агд

Зег

61 у

210

215

220

ΗΪ3

Зег

РЬе

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи

Н1з

Ьеи

Агд

Азп

61 у

61 и

Ьеи

Уа1

Не

225

230

235

240

Н1з

61 и

Ьуз

61 у

РЬе

Туг

Туг

Не

Туг

Зег

61п

ТЬг

Туг

РЬе

Агд

РЬе

245

250

255

61 п

61 и

61и

Не

Ьуз

61и

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

61 п

МеГ

Уа1

61 п

260

265

270

Туг

Не

Туг

Ьуз

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Рго

Азр

Рго

Не

Ьеи

Ьеи

МеГ

Ьуз

275

280

285

Зег

А1а

Агд

Азп

Зег

Суз

Тгр

Зег

Ьуз

Азр

А1а

61и

Туг

61у

Ьеи

Туг

290

295

300

Зег

Не

Туг

61п

61 у

61у

11е

РЬе

61и

Ьеи

Ьуз

61 и

Азп

Азр

Агд

Не

305

310

315

320

РЬе

Уа1

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

61и

ΗΪ8

Ьеи

Не

Азр

МеГ

Азр

Нгз

61и

А1а

325

330

335

Зег

РЬе

РЬе

61 у

А1а

РЬе

Ьеи

Уа1

61у

340

345

<210> 2 <211> 347 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 2

61п Агд Уа1 А1а А1а Нгз Не ТЬг 61у ТЬг Агд 61у Агд Зег Азп ТЬг 15 10 15

Ьеи Зег Зег Рго Азп Зег Ьуз Азп 61и Ьуз А1а Ьеи 61у Агд Ьуз 11е 20 25 30

- 25 024452

Азп Зег Тгр СЬи Бег Бег Агд Бег СЬу НЬз Бег РЬе Ьеи Бег Азп Ьеи 35 40 45

Н1з Ьеи Агд Азп СЬу СЬи Ьеи УаЬ Не Шз С1и Ьуз СЬу РЬе Туг Туг 50 55 60

11е Туг Бег 61п ТЬг Туг РЬе Агд РЬе СЬп СЬи СЬи 11е Ьуз СЬи Азп 65 70 75 80

ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз СЬп МеЪ УаЬ СЬп Туг 11е Туг Ьуз Туг ТЬг Бег 85 90 95

Туг Рго Азр Рго Не Ьеи Ьеи МеЬ Ьуз Бег АЬа Агд Азп Бег Суз Тгр 100 105 НО

Бег Ьуз Азр АЬа СЬи Туг СЬу Ьеи Туг Бег Не Туг СЬп СЬу СЬу Не 115 120 125

РЬе СЬи Ьеи Ьуз СЬи Азп Азр Агд 11е РЬе УаЬ Бег Уа1 ТЬг Азп СЬи 130 135 140

НЬз Ьеи Не Азр МеЬ Азр НЬз СЬи АЬа Бег РЬе РЬе СЬу АЬа РЬе Ьеи 145 150 Х55 160

УаЬ СЬу Рго Ьеи СЬу Ьеи АЬа СЬу Агд УаЬ УаЬ Агд Рго Ьеи СЬу Ьеи 165 170 175

АЬа СЬу Агд УаЬ УаЬ Агд Суз Азр Ьеи Рго СЬп ТЬг НЬз Бег Ьеи СЬу

180 185 190

Бег Агд Агд ТЬг Ьеи МеЬ Ьеи Ьеи АЬа СЬп МеГ Агд Агд Не Бег Ьеи 195 200 205

РЬе Бег Суз Ьеи Ьуз Азр Агд НЬз Азр РЬе СЬу РЬе Рго СЬп СЬи СЬи 210 215 220

РЬе СЬу Азп СЬп РЬе СЬп Ьуз АЬа СЬи ТЬг 11е Рго УаЬ Ьеи НЬз СЬи 225 230 235 240

МеЬ Не СЬп СЬп Не РЬе Азп Ьеи РЬе Бег ТЬг Ьуз Азр Бег Бег АЬа 245 250 255

АЬа Тгр Азр СЬи ТЬг Ьеи Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЬг СЬи Ьеи Туг СЬп 260 265 270

СЬп Ьеи Азп Азр Ьеи СЬи АЬа Суз УаЬ Не 61п СЬу УаЬ СЬу УаЬ ТЬг 275 280 285

61 и

ТЬг

Рго

Ьеи

Меб

Ьуз

61и

Азр

Зег

Не

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

Ьуз

Туг

290

295

300

РЬе

61п

Агд

Не

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

Ьуз

61и

Ьуз

Ьуз

Туг

Зег

Рго

Суз

305

310

315

320

А1а

Тгр

61и

Уа1

Уа1

Агд

А1а

61и

Не

МеЬ

Агд

Зег

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

325

330

335

ТЬг

Азп

Ьеи

61 п

С1и

Бег

Ьеи

Агд

Зег

Ьуз

61и

340 345 <210> 3 <211> 352 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный
<400> 3
Суз Азр Ьеи Рго 61п ТЬг	Нгз	Зег	Ьеи	61у	Зег	Агд	Агд	ТЬг	Ьеи	Мее
1 5				10					15
Ьеи Ьеи А1а 61п Мее Агд	Агд	Не	Зег	Ьеи	РЬе	Зег	Суз	Ьеи	Ьуз	Азр
20			25					30
Агд ΗΪ3 Азр РЬе б1у РЬе	Рго	61п	61 и	С1и	РЬе	б1у	Азп	61п	РЬе	61 п
35		40					45
Ьуз А1а 61и ТЬг Не Рго	Уа1	Ьеи	Нгз	61и	Мее	Не	61 п	61п	Не	РЬе
50	55					60
Азп Ьеи РЬе Бег ТЬг Ьуз	Азр	Зег	Зег	А1а	А1а	Тгр	Азр	61и	ТЬг	Ьеи
65 70					75					80
Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЬг	61 и	Ьеи	Туг	61п	61п	Ьеи	Азп	Азр	Ьеи	61 и
85				90					95
А1а Суз Уа1 Не 61п 61у	Уа1	61у	Уа1	ТЬг	61и	ТЬг	Рго	Ьеи	Мее	Ьуз
100			105					НО
61и Азр Бег Не Ьеи А1а	Уа1	Агд	Ьуз	Туг	РЬе	61п	Агд	Не	ТЬг	Ьеи
115		120					125
Туг Ьеи Ьуз 61и Ьуз Ьуз	Туг	Зег	Рго	Суз	А1а	Тгр	61 и	Уа1	Уа1	Агд
130	135					140
А1а 61и 11е Мее Агд Бег	РЬе	Зег	Ьеи	Зег	ТЬг	Азп	Ьеи	61п	61и	Зег
145 150					155					160

- 27 024452

Ьеи Агд Зег	Ьуз	61и 165	Рго	Ьеи	С1у Ьеи А1а С1у Агд Уа1 Уа1 Агд А1а
170	175
Зег С1у Суз	61 у 180	Рго	61 и	Рго	Ьеи 61у Ьеи А1а 185	61у Агд Уа1 Уа1 Агд 190
Уа1 А1а А1а 195	Нгз	Не	ТЬг	61 у	ТЬг Агд 61у Агд 200	Зег Азп ТЬг Ьеи Зег 205
Зег Рго Азп 210	Зег	Ьуз	Азп	61 и 215	Ьуз А1а Ьеи С1у	Агд Ьуз Не Азп Зег 220
Тгр 61и Зег 225	Зег	Агд	Зег 230	61у	Нгз Зег РЬе Ьеи 235	Бег Азп Ьеи Нгз Ьеи 240
Агд Азп 61 у	61 и	Ьеи 245	Уа1	Не	Нгз 61и Ьуз 61у ' 250	РЬе Туг Туг Не Туг 255
Зег 61п ТЬг	Туг 260	РЬе	Агд	РЬе	61п 61и 61и 11е 265	Ьуз 61и Азп ТЬг Ьуз 270
Азп Азр Ьуз 275	61п	МеО	Уа1	61 п	Туг Не Туг Ьуз 280	Туг ТЬг Зег Туг Рго 285
Азр Рго 11е 290	Ьеи	Ьеи	МеО	Ьуз 295	Зег А1а Агд Азп	Зег Суз Тгр Зег Ьуз 300
Азр А1а 61и 305	Туг	61 у	Ьеи 310	Туг	Зег 11е Туг 61п 315	61у 61у Не РЬе 61и 320
Ьеи Ьуз 61и	Азп	Азр 325	Агд	Не	РЬе Уа1 Зег Уа1 330	ТЬг Азп 61и Нгз Ьеи 335
Не Азр МеО Азр Нгз 61и А1а Зег РЬе РЬе 61у 340 345 <210> 4 <211> 353 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность	А1а РЬе Ьеи Уа1 61у 350

<220>

<223> искусственный <400> 4

Агд Уа1 А1а А1а Нгз Не ТЬг 61у ТЬг Агд 61у Агд Зег Азп ТЬг Ьеи 15 10 15

- 28 024452

- 29 024452

Туг ТЬг СЬи Ьеи Туг СЬп СЬп Ьеи Азп Азр Ьеи СЬи АЬа Суз УаЬ ТЬе 275 280 265

СЬп СЬу УаЬ СЬу УаЬ ТЬг СЬи ТЬг Рго Ьеи МеЪ Ьуз СЬи Азр Зег 1Ье 290 295 300

Ьеи АЬа УаЬ Агд Ьуз Туг РЬе СЬп Агд 1Ье ТЬг Ьеи Туг Ьеи Ьуз СЬи 305 310 315 320

Ьуз Ьуз Туг Зег Рго Суз АЬа Тгр СЬи УаЬ УаЬ Агд АЬа СЬи Ые МеЬ 325 330 335

Агд Зег РНе Зег Ьеи Зег ТЬг Азп Ьеи СЬп СЬи Зег Ьеи Агд Зег Ьуз 340 345 350

СЬи <210> 5 <211> 300 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> искусственный <400> 5

СЬп Азр Рго Туг УаЬ Ьуз СЬи АЬа 1 5

СЬи Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЬе Азп 10 15

АЬа СЬу НЬз Зег Азр УаЬ АЬа Азр 20

Азп СЬу ТЬг Ьеи РЬе Ьеи СЬу Ые 25 30

Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз СЬи СЬи Зег 35 40

Азр Агд Ьуз Ые МеЬ СЬп Зег СЬп 45

11е УаЬ Зег РНе Туг РЬе Ьуз Ьеи 50 55

РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр СЬп 60

Зег Ые СЬп Ьуз Бег УаЬ СЬи ТЬг 65 70

11е Ьуз СЬи Азр Меб Азп УаЬ Ьуз 75 80

РЬе РЬе Азп Зег Азп Ьуз Ьуз Ьуз 85

Агд Азр Азр РЬе СЬи Ьуз Ьеи ТЬг 90 95

Азп Туг Зег УаЬ ТЬг Азр Ьеи Азп 100

УаЬ СЬп Агд Ьуз АЬа Ые НЬз СЬи 105 110

Ьеи Ые СЬп УаЬ МеЬ АЬа СЬи Ьеи 115 120

Зег Рго АЬа АЬа Рго Ьеи СЬу Ьеи 125

- 30 024452

А1а б1у Агд 130

Уа1 Уа1

Агд

61и Агд 61у Рго 61п Агд УаЬ А1а А1а НЬз

135

140

Пе

ТЬг

С1у

ТЬг

Агд

61у

Агд

Зег

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Азп

Зег

145

150

155

160

Ьуз

Азп

61и

Ьуз

А1а

Ьеи

61у

Агд

Ьуз

Не

Азп

Зег

Тгр

С1и

Зег

Зег

165

170

175

Агд

Зег

61у

Н1з

Зег

РЬе

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи

Шз

Ьеи

Агд

Азп

61 у

61и

180

185

190

Ьеи

Уа1

Не

ΗΪ5

61и

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Туг

Не

Туг

Зег

61п

ТЬг

Туг

195

200

205

РЬе

Агд

РЬе

61 п

СЬи

СЬи

11е

Ьуз

61 и

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

61 п

210

215

220

МеЬ

Уа1

61п

Туг

Не

Туг

Ьуз

Тух

ТЬх

Зех

Туг

Рхо

Азр

Рго

Не

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

МеЬ

Ьуз

Зег

АЬа

Агд

Азп

Зег

Суз

Тгр

Зег

Ьуз

Азр

А1а

СЬи

Туг

245

250

255

61у

Ьеи

Туг

Зег

Не

Туг

61п

СЬу

61 у

11е

РЬе

СЬи

Ьеи

Ьуз

61и

Азп

260

265

270

Азр

Агд

Не

РЬе

νβΐ

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

СЬи

НЬз

Ьеи

Не

Азр

МеЬ

Азр

275

280

285

Шз

61и

А1а

Зег

РЬе

РЬе

СЬу

А1а

РЬе

Ьеи

Уа1

61 у

290

295

300

<210> 6 <211> 307 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 6

61и 1

Агд 01у

Рго

61п Агд УаЬ А1а 5

АЬа

НЬз 10

Не ТЬг

СЬу

ТЬх

Агд 15

61 у

Агд

Зег Азп

ТЬг

Ьеи Зег

Зег

Рго

Азп

Бег

Ьуз

Азп

61и

Ьуз

АЬа

Ьеи

20

25

30

- 31 024452

СЬп	Агд Ьуз А1а 290	11е НЬз	СЬи 295	Ьеи 11е СЬп УаЬ	МеЬ 300	АЬа	СЬи	Ьеи	Бег
Рго АЬа АЬа 305 <210> 7 <211> 310 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220> <223> искусственный <400> 7
СЬп 1	Азр Рго Туг	УаЬ Ьуз 5	СЬи	АЬа СЬи Азп Ьеи 10	Ьуз	Ьуз	Туг	РЬе 15	Азп
АЬа	СЬу НЬз Зег 20	Азр УаЬ	АЬа	Азр Азп СЬу ТЬг 25	Ьеи	РЬе	Ьеи 30	СЬу	11е
Ьеи	Ьуз Азп Тгр 35	Ьуз СЬи	СЬи	Зег Азр Агд Ьуз 40	11е	Меб 45	СЬп	Зег	СЬп
11е	УаЬ Зег РЬе 50	Туг РЬе	Ьуз 55	Ьеи РЬе Ьуз Азп	РЬе 60	Ьуз	Азр	Азр	СЬп
Зег 65	11е СЬп Ьуз	Зег УаЬ 70	СЬи	ТЬг 11е Ьуз СЬи 75	Азр	Меб	Азп	УаЬ	Ьуз 80
РЬе	РЬе Азп Зег	Азп Ьуз 85	Ьуз	Ьуз Агд Азр Азр 90	РЬе	СЬи	Ьуз	Ьеи 95	ТЬг
Азп	Туг Зег УаЬ 100	ТЬг Азр	Ьеи	Азп УаЬ СЬп Агд 105	Ьу»	АЬа	11е 110	НЬз	СЬи
Ьеи	11е СЬп УаЬ 115	МеЬ АЬа	СЬи	Ьеи Зег Рго АЬа 120	АЬа	СЬу 125	Бег	СЬу	СЬу
СЬу	Рго Ьеи СЬу 130	Ьеи АЬа	СЬу 135	Агд УаЬ УаЬ Агд	СЬу 140	Бег	СЬу	СЬу	СЬу
СЬи 145	Агд СЬу Рго	СЬп Агд 150	УаЬ	АЬа АЬа НЬз 11е 155	ТЬг	СЬу	ТЬг	Агд	СЬу 160
Агд	Зег Азп ТЬг	Ьеи Зег 165	Зег	Рго Азп Зег Ьуз 170	Азп	СЬи	Ьуз	АЬа 175	Ьеи
СЬу	Агд Ьуз 11е 180	Азп Зег	Тгр	СЬи Зег Бег Агд 185	Бег	СЬу	НЬз 190	Зег	РЬе

- 33 024452

Ьеи

Зег

Азп 195

Ьеи

НЬз

Ьеи Агд

Азп 200

51 у

51 и

Ьеи

Уа1

Не 205

НЬз

61и

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Туг

11е

Туг

Зег

51 п

ТЬг

Туг

РЬе

Агд

РЬе

61п

61 и

61и

210

215

220

Не

Ьуз

61и

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

61п

МеГ

Уа1

51п

Туг

Не

Туг

225

230

235

240

Ьуз

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Рго

Азр

Рго

Не

Ьеи

Ьеи

МеЬ

Ьуз

Зег

А1а

Агд

245

250

255

Азп

Зег

Суз

Тгр

Бег

Ьуз

Азр

А1а

51и

Туг

61у

Ьеи

Туг

Зег

Не

Туг

260

265

270

51 п

61 у

61у

Не

РЬе

61и

Ьеи

Ьуз

61и

Азп

Азр

Агд

Не

РЬе

УаЬ

Зег

275

280

285

Уа1

ТЬг

Азп

С1и

НЬз

Ьеи

Не

Азр

МеГ

Азр

НЬз

61 и

А1а

Зег

РЬе

РЬе

290

295

300

С1у

А1а

РЬе

Ьеи

Уа1

СЬу

305 310 <210> 8 <211> 310 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ι <400>

искусственный 8

СЬи 1

Агд

61у

Рго

61п 5

Агд

ν&ι

АЬа

АЬа

НЬз 10

Не

ТЬг

61 у

ТЬг

Агд 15

61у

Агд

Зег

Азп

ТЬг 20

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Азп 25

Зег

Ьуз

Азп

61 и

Ьуз 30

А1а

Ьеи

61 у

Агд

Ьуз 35

Не

Азп

Зег

Тгр

61и 40

Зег

Зег

Агд

Зег

61у 45

НЬз

Зег

РЬе

Ьеи

Зег 50

Азп

Ьеи

НЬз

Ьеи

Агд 55

Азп

СЬу

51 и

Ьеи

Уа1 60

Не

НЬз

С1и

Ьуз

61у 65

РЬе

Туг

Туг

Не

Туг 70

Зег

61п

ТЬг

Туг

РЬе 75

Агд

РЬе

61п

61и

61и 80

- 34 024452

11е Ьуз С1и Азп ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз С1п Мер Уа1 С1п Туг 11е Туг 65 90 95

Ьуз Туг ТЬг Зег Туг Рго Азр Рго 11е Ьеи Ьеи Мер Ьуз Зег А1а Агд 100 105 110

Азп Зег Суз Тгр Зег Ьуз Азр А1а С1и Туг 61у Ьеи Туг Зег 11е Туг 115 120 125

С1п 61у б1у 11е РЬе 61и Ьеи Ьуз 61и Азп Азр Агд Не РЬе Уа1 Зег 130 135 140

Уа1 ТЬг Азп С1и Ηίβ Ьеи 11е Азр Мер Азр Нгз С1и А1а Зег РЬе РЬе 145 150 155 160

С1у А1а РЬе Ьеи Уа1 61у С1у Зег С1у 61у С1у Рго Ьеи С1у Ьеи А1а 165 170 175

С1у Агд Уа1 Уа1 Агд С1у Зег 61у С1у С1у С1п Азр Рго Туг Уа1 Ьуз 180 185 190

61и А1а 61и Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЬе Азп А1а С1у Нгз Зег Азр Уа1 195 200 205

А1а Азр Азп 61у ТЬг Ьеи РЬе Ьеи С1у Не Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз 51и 210 215 220

61и Зег Азр Агд Ьуз Не Мер 61п Зег С1п 11е Уа1 Зег РЬе Туг РЬе 225 230 235 240

Ьуз Ьеи РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр С1п Зег Не 61п Ьуз Зег Уа1 245 250 255

С1и ТЬг Не Ьуз 61и Азр Мер Азп Уа1 Ьуз РЬе РЬе Азп Зег Азп Ьуз 260 265 270

Ьуз Ьуз Агд Азр Азр РЬе С1и Ьуз Ьеи ТЬг Азп Туг Зег Уа1 ТЬг Азр 275 280 285

Ьеи Азп Уа1 С1п Агд Ьуз А1а Не Нгз С1и Ьеи Не С1п Уа1 Мер А1а 290 295 300

61и Ьеи Зег Рго А1а А1а 305 310 <210> 9 <211> 317 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность

- 35 024452 <220>

<223> искусственный <400> 9

СЬп Азр Рго Туг УаЬ Ьуз С1и АЬа СЬи Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЬе Азп Ь 5 10 15

АЬа СЬу НЬз Зег Азр УаЬ АЬа Азр Азп СЬу ТЬг Ьеи РЬе Ьеи СЬу 1Ье 20 25 30

Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз СЬи СЬи Бег Азр Агд Ьуз 1Ье Мер СЬп Бег СЬп 35 40 45

1Ье УаЬ Зег РЬе Туг РЬе Ьуз Ьеи РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр СЬп 50 55 60

Зег 1Ье СЬп Ьуз Бег УаЬ СЬи ТЬг 1Ье Ьуз СЬи Азр Мер Азп УаЬ Ьуз 65 70 75 80

РЬе РЬе Азп Зег Азп Ьуз Ьуз Ьуз Агд Азр Азр РЬе СЬи Ьуз Ьеи ТЬг 85 90 95

Азп Туг Бег УаЬ ТЬг Азр Ьеи Азп УаЬ СЬп Агд Ьуз АЬа ЬЬе НЬз СЬи 100 105 110

Ьеи ЬЬе СЬп УаЬ Мер АЬа СЬи Ьеи Бег Рго АЬа АЬа СЬу Бег СЬу СЬу 115 120 125

СЬу Рго Ьеи СЬу Ьеи АЬа СЬу АЬа Бег СЬу Суз СЬу Рго СЬи Агд УаЬ 130 135 140

УаЬ Агд СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬи Агд СЬу Рго СЬп Ахд УаЬ АЬа АЬа 145 150 155 160

НЬз Не ТЬе СЬу ТЬг Агд СЬу Агд Зег Азп ТЬг Ьеи Бег Бег Рго Азп 165 170 175

Зег Ьуз Азп СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬу Агд Ьуз 11е Азп Бег Тгр СЬи Бег 180 185 190

Бег Агд Бег СЬу НЬз Зег РЬе Ьеи Бег Азп Ьеи НЬз Ьеи Агд Азп СЬу 195 200 205

СЬи Ьеи УаЬ 11е НЬз СЬи Ьуз СЬу РЬе Туг Туг 11е Туг Бег СЬп ТЬг 210 215 220

Туг РЬе Агд РЬе СЬп СЬи СЬи 11е Ьуз СЬи Азп ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз 225 230 235 240

- 36 024452

СЬп

МеС

УаЬ

СЬп

Туг

Ые

Туг

Ьуз

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Рго

Азр

Рго

11е

245

250

255

Ьеи

Ьеи

МеС

Ьуз

Зег

АЬа

Агд

Азп

Зег

Суз

Тгр

Зег

Ьуз

Азр

АЬа

СЬи

260

265

270

Туг

СЬу

Ьеи

Туг

Зег

Ые

Туг

СЬп

СЬу

61 у

Ые

РЬе

СЬи

Ьеи

Ьуз

СЬи

275

260

285

Азп

Азр

Агд

Не

РЬе

УаЬ

Зег

УаЬ

ТЬг

Азп

СЬи

НЬз

Ьеи

11е

Азр

МеС

290

295

300

Азр

Шз

СЬи

АЬа

Зег

РЬе

РЬе

СЬу

АЬа

РЬе

Ьеи

УаЬ

СЬу

305 310 315 <210> 10 <2Ы> 338 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный
<400> 10
СЬп Азр Рго Туг УаЬ Ьуз	СЬи	АЬа	СЬи	Азп	Ьеи	Ьуз	Ьуз	Туг	РЬе	Азп
1 5				10					15
АЬа СЬу НЬз Зег Азр УаЬ	АЬа	Азр	Азп	СЬу	ТЬг	Ьеи	РЬе	Ьеи	СЬу	Ые
20			25					30
Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз СЬи	СЬи	Зег	Азр	Агд	Ьуз	Ые	МеС	СЬп	Зег	СЬп
35		40					45
11е УаЬ Зег РЬе Туг РЬе	Ьуз	Ьеи	РЬе	Ьуз	Азп	РЬе	Ьуз	Азр	Азр	СЬп
50	55					60
Зег Ые СЬп Ьуз Зег УаЬ	СЬи	ТЬг	Ые	Ьуз	СЬи	Азр	МеС	Азп	УаЬ	Ьуз
65 70					75					80
РЬе РЬе Азп Зег Азп Ьуз	Ьуз	Ьуз	Агд	Азр	Азр	РЬе	СЬи	Ьуз	Ьеи	ТЬг
85				90					95
Азп Туг Зег УаЬ ТЬг Азр	Ьеи	Азп	УаЬ	СЬп	Агд	Ьуз	АЬа	Ые	НЬз	СЬи
100			105					110
Ьеи Ые СЬп УаЬ Мес АЬа	СЬи	Ьеи	Зег	Рго	АЬа	АЬа	СЬу	Зег	СЬу	СЬу
115		120					125

- 37 024452

61у

Рго Ьеи 61у Ьеи А1а 61у Агд Уа1 Уа1 Агд АЬа

Зег

61у

Суз

61 у

130

135

140

Рго

61и

С1у

Зег

61 у

61 у

С1у

ТЬг

Зег

б1и

61и

ТЬг

Не

Зег

ТЬг

Уа1

145

150

155

160

61п

61и

Ьуз

61п

61 п

Азп

Не

Зег

Рго

Ьеи

Уа1

Агд

61и

Агд

61у

Рго

165

170

175

С1п

Агд

УаЬ

А1а

А1а

НЬз

Не

ТЬг

С1у

ТЬг

Агд

61 у

Агд

Зег

Азп

ТЬг

180

185

190

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Азп

Зег

Ьуз

Азп

б1и

Ьуз

А1а

Ьеи

61у

Агд

Ьуз

Не

195

200

205

Азп

Зег

Тгр

61и

Зег

Зег

Агд

Зег

О1у

ΗΪ5

Зег

РЬе

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи

210

215

220

Н1з

Ьеи

Агд

Азп

б1у

□1и

Ьеи

Уа1

Не

НЬз

61и

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Туг

225

230

235

240

Не

Туг

Зег

61 п

ТЬг

Туг

РЬе

Агд

РЬе

61п

61и

61и

Не

Ьуз

61и

Азп

245

250

255

ТЬг

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

51 п

МеГ

Уа1

61п

Туг

11е

Туг

Ьуз

Туг

ТЬг

Зег

260

265

270

Туг

Рго

Азр

Рго

Г1е

Ьеи

Ьеи

МеГ

Ьуз

Зег

А1а

Агд

Азп

Зег

Суз

Тгр

275

280

285

Зег

Ьуз

Азр

А1а

61и

Туг

61у

Ьеи

Туг

5ег

Не

Туг

61п

61у

61у

Не

290

295

300

РЬе

61и

Ьеи

Ьуз

51 и

Азп

Азр

Агд

Не

РЬе

Уа1

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

61и

305

310

315

320

Н1в

Ьеи

11е

Азр

МеГ

Азр

Нгз

СЬи

АЬа

Зег

РЬе

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьеи

325

330

335

Уа1 61 у <210> 11 <211> 317 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> искусственный

- 38 024452 <400> 11

61и Агд 61у Рго 61п Агд Уа1 А1а А1а Нгз 11е ТЬг 61у ТЬг Агд 61у 15 10 15

Агд Зег Азп ТЬг Ьеи Зег Зег Рго Азп Зег Ьуз Азп 61и Ьуз А1а Ьеи 20 25 30

61у Агд Ьуз 11е Азп Зег Тгр 61и Зег Зег Агд Зег б1у НЬз Зег РЬе 35 40 45

Ьеи Зег Азп Ьеи НЬз Ьеи Агд Азп 61у 61и Ьеи Уа1 Не НЬз 61и Ьуз 50 55 60

С1у РЬе Туг Туг 11е Туг Зег 61п ТЬг Туг РЬе Агд РЬе С1п С1и С1и 65 70 75 60

11е Ьуз 61и Азп ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз 61п МеЬ Уа1 61п Туг 11е Туг 85 90 95

Ьуз Туг ТЬг Зег Туг Рго Азр Рго 11е Ьеи Ьеи МеЬ Ьуз Зег А1а Агд 100 105 НО

Азп Зег Суз Тгр Зег Ьуз Азр А1а 61ц Туг 61у Ьеи Туг Зег Не Туг 115 120 125

61п 61у 61у Не РЬе 61и Ьеи Ьуз 61и Азп Азр Агд 11е РЬе Уа1 Зег 130 135 140

Уа1 ТЬг Азп 61и НЬз Ьеи Не Азр Меб Азр НЬз 61и А1а Зег РЬе РЬе 145 150 155 160

61у А1а РЬе Ьеи Уа1 61у 6Ьу Зег 61у 61у 61у А1а Зег б1у Суз 61у 165 170 175

Рго 61и Рго Ьеи 61у Ьеи А1а 61у Агд Уа1 А/а1 Агд 61у Зег 61у 61у 180 185 190

61у 61п Азр Рго Туг Уа1 Ьуз 61и А1а 61и Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЬе 195 200 205

Азп А1а 61у НЬз Зег Азр УаЬ А1а Азр Азп 61у ТЬг Ьеи РЬе Ьеи 61у 210 215 220

Не Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз 61и 61и Зег Азр Агд Ьуз 11е Меб 61п Зег 225 230 235 240

61п Не νβΐ Зег РЬе Туг РЬе Ьуз Ьеи РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр 245 250 255

- 39 024452

61 п

Зег

Не

61п

Ьуз

Зег

Уа1

61и

ТЬг

Не

Ьуз

61и

Азр

МеО

Азп

Уа1

260

265

270

Ьуз

РЬе

РЬе

Азп

Зег

Азп

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Агд

Азр

Азр

РЬе

61и

Ьуз

Ьеи

275

280

285

ТЬг

Азп

Туг

Зег

Уа1

ТЬг

Азр

Ьеи

Азп

Уа1

61п

Агд

Ьуз

А1а

Не

Нгз

290

295

300

61и

Ьеи

Не

61п

Уа1

МеО

А1а

61 и

Ьеи

Зег

Рго

А1а

А1а

305 310 315 <210> 12 <211> 449 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный

<400> 12

61 п 1

Азр

Рго

Туг

Уа1 5

Ьуз

61и

А1а

б1и

Азп 10

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг

РЬе 15

Азп

А1а

61 у

Нгз

Зег 20

Азр

Уа1

А1а

Азр

Азп 25

61у

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьеи 30

С1у

Не

Ьеи

Ьуз

Азп 35

Тгр

Ьуз

61и

61и

Зег 40

Азр

Агд

Ьуз

Не

МеО 45

61п

Зег

61 п

Не

Уа1 50

Зег

РЬе

Туг

РЬе

Ьуз 55

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

РЬе 60

Ьуз

Азр

Азр

61η

Зег 65

Не

61п

Ьуз

Зег

Уа1 70

61и

ТЬг

Не

Ьуз

61и 75

Азр

МеО

Азп

Уа1

Ьуз 80

РЬе

РЬе

Азп

Зег

Азп 85

Ьу5

Ьуз

Ьуз

Агд

Азр 90

Азр

РЬе

61и

Ьуз

Ьеи 95

ТЬг

Азп

Туг

Зег

Уа1 100

ТЬг

Азр

Ьеи

Азп

Уа1 105

61п

Агд

Ьуз

А1а

Не 110

Азр

61 и

Ьеи

Не

61п 115

Уа1

МеО

А1а

61и

РЬе 120

Зег

ТЬг

61 и

61и

61п 125

С1п

61 и

61у

Рго

Туг 130

Уа1

Ьуз

61и

А1а

61и 135

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг 140

РЬе

Азп

А1а

61 у

- 40 024452

НЬз Зег Азр УаЬ АЬа Азр Азп СЬу ТЬг Ьеи РЬе Ьеи СЬу Не Ьеи Ьуз 145 150 155 160

Азп Тгр Ьуз СЬи СЬи Зег Азр Агд Ьуз 11е Меб СЬп Зег СЬп 11е УаЬ 165 170 175

Зег РЬе Туг РЬе Ьуз Ьеи РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр СЬп Зег 11е 180 185 190

СЬп Ьуз Бег УаЬ СЬи ТЬг 11е Ьуз СЬи Азр Меб Азп УаЬ Ьуз РЬе РЬе 195 200 205

Азп Зег Азп Ьуз Ьуз Ьуз Агд Азр Азр РЬе СЬи Ьуз Ьеи ТЬг Азп Туг 210 215 220

Зег УаЬ ТЬг Азр Ьеи Азп УаЬ СЬп Агд Ьуз АЬа 11е НЬз СЬи Ьеи Не 225 230 235 240

СЬп УаЬ Меб АЬа СЬи Ьеи Зег Рго АЬа АЬа Ьуз ТЬг СЬу Ьуз Агд Ьуз 245 250 255

Агд Зег СЬп Меб Ьеи РЬе Агд СЬу Зег СЬу СЬу СЬу Рго Ьеи СЬу Ьеи 260 265 270

АЬа СЬу Агд УаЬ УаЬ Агд СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬи Агд СЬу Рго СЬп 275 280 285

Агд УаЬ АЬа АЬа НЬз 11е ТЬг СЬу ТЬг Агд СЬу Агд Зег Азп ТЬг Ьеи 290 295 300

Зег Зег Рго Азп Зег Ьуз Азп СЬи Ьуз АЬа Ьеи СЬу Агд Ьуз 11е Азп 305 310 315 320

Зег Тгр СЬи Зег Зег Агд Зег СЬу НЬз Зег РЬе Ьеи Зег Азп Ьеи НЬз 325 330 335

Ьеи Агд Азп СЬу СЬи Ьеи УаЬ Не НЬз СЬи Ьуа СЬу РЬе Туг Туг Не 340 345 350

Туг Зег СЬп ТЬг Туг РЬе Агд РЬе СЬп СЬи СЬи 11е Ьуз СЬи Азп ТЬг 355 360 365

Ьуз Азп Азр Ьуз СЬп Меб УаЬ СЬп Туг Не Туг Ьуз Туг ТЬг Зег Туг 370 375 380

Рго Азр Рго Не Ьеи Ьеи Меб Ьуз Зег АЬа Агд Азп Зег Суз Тгр Зег 385 390 395 400

- 41 024452

<210> 13 <2Ы> 449 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 13

01и Агд 1

СЬу Рго

СЬп Агд УаЬ АЬа АЬа НЬз

Не

ТЬг СЬу

ТЬг

Агд 15

СЬу

5

10

Агд

Зег

Азп

ТЬг

Ьеи

Бег

Зег

Рго

Азп

Зег

Ьуз

Азп

СЬи

Ьуз

АЬа

Ьеи

20

25

30

СЬу

Агд

Ьуз

Не

Азп

Бег

Тгр

СЬи

Зег

Зег

Агд

Зег

СЬу

НЬз

Зег

РЬе

35

40

45

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи

НЬз

Ьеи

Агд

Азп

СЬу

СЬи

Ьеи

УаЬ

Не

НЬз

СЬи

Ьуз

50

55

60

СЬу

РЬе

Туг

Туг

11е

Туг

Зег

СЬп

ТЬг

Туг

РЬе

Агд

РЬе

СЬп

СЬи

СЬи

65

70

75

80

Не

Ьуз

СЬи

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

СЬп

Мер

УаЬ

СЬп

Туг

Не

Туг

85

90

95

Ьуз

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Рго

Азр

Рго

Не

Ьеи

Ьеи

Мер

Ьуз

Зег

АЬа

Агд

100

105

НО

Азп

Зег

Суз

Тгр

Зег

Ьуз

Азр

АЬа

СЬи

Туг

СЬу

Ьеи

Туг

Зег

11е

Туг

115

120

125

СЬп

СЬу

СЬу

Не

РЬе

СЬи

Ьеи

Ьуз

СЬи

Азп

Азр

Агд

Не

РЬе

УаЬ

Зег

130

135

140

УаЬ

ТЬг

Азп

СЬи

НЬз

Ьеи

Не

Азр

Мер

Азр

НЬз

СЬи

АЬа

Зег

РЬе

РЬе

145

150

155

160

- 42 024452

С1у А1а РЪе Ьеи Уа1 61у 61у Зег С1у 61у С1у Рго Ьеи 61у Ьеи А1а 165 170 175

С1у Агд Уа1 Уа1 Агд 61у Зег 61у 61у 61у С1п Азр Рго Туг Уа1 Ьуз 180 185 190

С1и А1а С1и Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЪе Азп А1а 61у ΗΪ3 Зег Азр Уа1 195 200 205

А1а Азр Азп С1у ТЪг Ьеи РЪе Ьеи 61 у Не Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз 61и 210 215 220

61и Зег Азр Агд Ьуз 11е Меи 61п Зег 61п 11е Уа1 Зег РЪе Туг РЪе 225 230 235 240

Ьуз Ьеи РЪе Ьуз Азп РЪе Ьуз Азр Азр 61п Зег 11е 61п Ьуз Зег Уа1 245 250 255

С1и ТЪг 11е Ьуз 61и Азр Меи Азп Уа1 Ьуз РЪе РЪе Азп Зег Азп Ьуз 260 265 270

Ьуз Ьуз Агд Азр Азр РЪе 61и Ьуз Ьеи ТЪг Азп Туг Зег Уа1 ТЪг Азр 275 280 285

Ьеи Азп Уа1 61п Агд Ьуз А1а 11е Азр 61и Ьеи 11е 61п Уа1 Меи А1а 290 295 300

61и РЪе Зег ТЪг 61и С1и С1п С1п С1и 61у Рго Туг Уа1 Ьуз С1и А1а 305 310 315 320

С1и Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЪе Азп А1а 61у ΗΪ3 Зег Азр Уа1 А1а Азр 325 330 335

Азп 61у ТЪг Ьеи РЪе Ьеи 61у 11е Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз 61и С1и Зег 340 345 350

Азр Агд Ьуз 11е Меи 61п Зег 61п 11е Уа1 Зег РЪе Туг РЪе Ьуз Ьеи 355 360 365

РЪе Ьуз Азп РЪе Ьуз Азр Азр 61п Зег 11е 61п Ьуз Зег Уа1 61и ТЪг 370 375 380

11е Ьуз 61и Азр Меи Азп Уа1 Ьуз РЪе РЪе Азп Зег Азп Ьуз Ьуз Ьуз 385 390 395 400

Агд Азр Азр РЪе 61 и Ьуз Ьеи ТЪг Азп Туг Зег Уа1 ТЪг Азр Ьеи Азп 405 410 415

УаЬ Зег Агд

СЬп Агд

Ьуз АЬа 420

Пе ТЬг

НЬз СЬу

61и Ьеи 425 Ьуз Агд 440

Не СЬп УаЬ

Мер АЬа

СЬи Ьеи

Ьеи РЬе

Рго

АЬа 435

СЬп 445

430 Мер

АЬа

Ьуз

Ьуз

Агд

Зег

<210> 14 <211> 456 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220> <223> искусственный <400> 14

[ последовательность 1

СЬп 1

Азр

Рго

Туг

УаЬ 5

Ьуз

С1и

АЬа СЬи

Азп 10

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг

РЬе 15

Азп

АЬа

СЬу

НЬз

Зег 20

Азр

УаЬ

АЬа

Азр Азп 25

СЬу

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьеи 30

СЬу

Не

Ьеи

Ьуз

Азп 35

тгр

Ьуз

СЬи

бЬи

Зег Азр 40

Агд

Ьуз

Пе

Мер 45

СЬп

Зег

СЬп

Не

УаЬ 50

Зег

РЬе

Туг

РЬе

Ьуз 55

Ьеи РЬе

Ьуз

Азп

РЬе 60

Ьуз

Азр

Азр

СЬп

Зег 65

11е

СЬп

Ьуз

Зег

УаЬ 70

СЬи

ТЬг 11е

Ьуз

СЬи 75

Азр

Меб

Азп

УаЬ

Ьуз 80

РЬе

РЬе

Азп

Зег

Азп 85

Ьуз

Ьуз

Ьуз Агд

Азр 90

Азр

РЬе

СЬи

Ьуз

Ьеи 95

ТЬг

Азп

Туг

Зег

УаЬ 100

ТЬг

Азр

Ьеи

Азп УаЬ 105

СЬп

Агд

Ьуз

АЬа

Пе 110

Азр

СЬи

Ьеи

Не

СЬп 115

УаЬ

Мер

АЬа

61 и

РЬе Зег 120

ТЬг

СЬи

СЬи

61п 125

СЬп

СЬи

СЬу

Рго

Туг 130

УаЬ

Ьуз

СЬи

АЬа

СЬи 135

Азп Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг 14 0

РЬе

Азп

АЬа

СЬу

ΗΪΞ 145

Зег

Азр

УаЬ

АЬа

Азр 150

Азп

61у ТЬг

Ьеи

РЬе 155

Ьеи

СЬу

Пе

Ьеи

Ьуз 160

- 44 024452

Азп Тгр Ьуз Е1и 61и Зег Азр Агд Ьуз 11е МеР 61п Зег 61п 11е Уа1 165 170 175

Зег РЬе Туг РЬе Ьуз Ьеи РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр С1п Зег Не 180 185 190

С1п Ьуз Зег Уа1 О1и ТЬг 11е Ьуз С1и Азр Мер Азп Уа1 Ьуз РЬе РЬе 195 200 205

Азп Зег Азп Ьуз Ьуз Ьуз Агд Азр Азр РЬе С1и Ьуз Ьеи ТЬг Азп Туг 210 215 220

Зег Уа1 ТЬг Азр Ьеи Азп Уа1 С1п Агд Ьуз А1а 11е Шз С1и Ьеи 11е 225 230 235 240

61п Уа1 МеР А1а 61и Ьеи Зег Рго А1а А1а Ьуз ТЬг 61 у Ьуз Агд Ьуз 245 250 255

Агд Зег С1п МеР Ьеи РЬе Агд 61у Зег С1у 61у 61у Рго Ьеи С1у Ьеи 260 265 270

А1а 61у А1а Зег 61у Суз 61у Рго 61и Агд Уа1 Уа1 Агд 61у Зег О1у 275 280 285

61у 61у О1и Агд 61у Рго 61п Агд Уа1 А1а А1а Н1з 11е ТЬг С1у ТЬг 290 295 300

Агд б1у Агд Бег Азп ТЬг Ьеи Зег Зег Рго Азп Зег Ьуз Азп С1и Ьуз 305 310 315 320

А1а Ьеи 61у Агд Ьуз 11е Азп Зег Тгр 61и Зег Зег Агд Зег 61у Н1з 325 330 335

Зег РЬе Ьеи Зег Азп Ьеи Ηίε Ьеи Агд Азп С1у С1и Ьеи Уа1 11е Н±з 340 345 350

61и Ьуз 61у РЬе Туг Туг 11е Туг Зег С1п ТЬг Туг РЬе Агд РЬе 61п 355 360 365

61и 61и 11е Ьуз б1и Азп ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз С1п Мер Уа1 61п Туг 370 375 380

11е Туг Ьуз Туг ТЬг Зег Туг Рго Азр Рго 11е Ьеи Ьеи МеР Ьуз Зег 385 390 395 400

А1а Агд Азп Зег Суз Тгр Зег Ьуз Азр А1а 61и Туг 61у Ьеи Туг Зег 405 410 415

- 45 024452

Не Туг 61п С1у С1у Не РЬе 61и ьеи Ьуз 61и Азп Азр Агд Не Рке 420 425 430

Уа1 Зег Уа1 ТЬг Азп С1и НЬз Ьеи Не Азр МеЬ Азр НЬз СЬи АЬа Зег 435 440 445

РЬе РЬе СЬу АЬа РЬе Ьеи УаЬ СЬу 450 455 <210> 15 <211> 456 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 15

61 и 1

Агд 61у Рго

61п 5

Агд Уа1 А1а АЬа

НЬз 10

Не ТЬг

61 у

ТЬг

Агд 15

61 у

Агд

Зег

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Азп

Зег

Ьуз

Азп

61 и

Ьуз

А1а

Ьеи

20

25

30

С1у

Агд

Ьуз

Не

Азп

Зег

Тгр

С1и

Зег

Зег

Агд

Зег

С1у

НЬз

Зег

РЬе

35

40

45

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи

НЬз

Ьеи

Агд

Азп

61 у

СЬи

Ьеи

Уа1

Не

НЬз

61 и

Ьуз

50

55

60

С1у

РЬе

Туг

Туг

11е

Туг

Зег

С1п

ТЬг

Туг

РЬе

Агд

РЬе

61п

61и

61и

65

70

75

80

Не

Ьуз

С1и

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

61п

МеЬ

Уа1

С1п

Туг

Не

Туг

85

90

95

Ьуз

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Рго

Азр

Рго

11е

Ьеи

Ьеи

МеЬ

Ьуз

Зег

А1а

Агд

100

105

110

Азп

Зег

Суз

Тгр

Зег

Ьуз

Азр

А1а

51и

Туг

61у

Ьеи

Туг

Зег

Не

Туг

115

120

125

СЬп

61у

СЬу

Не

РЬе

С1и

Ьеи

Ьуз

СЬи

Азп

Азр

Агд

Не

РЬе

Уа1

Зег

130

135

140

УаЬ

ТЬг

Азп

61 и

НЬз

Ьеи

Не

Азр

МеЬ

Азр

НЬз

61 и

А1а

Зег

РЬе

РЬе

145

150

155

160

61 у

А1а

РЬе

Ьеи

УаЬ

61у

61 у

Зег

61 у

С1у

61у

Рго

Ьеи

61у

Ьеи

А1а

165

170

175

- 46 024452

- 47 024452

Не 61η Уа1 Меб А1а С1и Ьеи Зег Рго А1а А1а Ьуз ТЬг 01у Ьуз Агд 435 440 445

Ьуз Агд Зег Б1п Меб Ьеи РЬе Агд 450 455 <210> 16 <211> 281 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <300>

<308> 5епВапк/Р50591

<309>

1996-10-01

<313>

¢1) . ·

. (281)

<400>

16

МеГ

А1а

Меб

Меб

51 и

Уа1

51 п

51 у

51 у

Рго

Зег

Ьеи

51 у

61п

ТЬг

Суз

1

5

10

15

Уа1

Ьеи

11е

Уа1

11е

РЬе

ТЬг

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1п

Зег

Ьеи

Суз

Уа1

А1а

20

25

30

Уа1

ТЬг

Туг

Уа1

Туг

РЬе

ТЬг

Азп

61и

Ьеи

Ьуз

01 п

Меб

С1п

Азр

Ьуз

35

40

45

Туг

Зег

Ьуз

Зег

51 у

11е

А1а

Суз

РЬе

Ьеи

Ьуз

61 и

Азр

Азр

Зег

Туг

50

55

60

Тгр

Азр

Рго

Азп

Азр

51 и

51и

Зег

Меб

Азп

Зег

Рго

Суз

Тгр

С1п

Уа1

65

70

75

80

Ьуз

Тгр

С1п

Ьеи

Агд

01п

Ьеи

Уа1

Агд

Ьуз

Меб

11е

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

85

90

95

61и

С1и

ТЬг

Т1е

Зег

ТЬг

Уа1

С1п

О1и

Ьуз

61п

61 п

Азп

Не

Зег

Рго

100

105

110

Ьеи

Уа1

Агд

О1и

Агд

С1у

Рго

С1п

Агд

Уа1

А1а

А1а

Нхз

Не

ТЬг

С1у

115

120

125

ТЬг

Агд

01у

Агд

Зег

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Азп

Зег

Ьуз

Азп

С1и

130

135

140

Ьуз

А1а

Ьеи

С1у

Агд

Ьуз

11е

Азп

Зег

Тгр

51 и

Зег

Зег

Агд

Зег

О1у

145

150

155

160

Нхз

Зег

РЬе

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи

Нхз

Ьеи

Агд

Азп

51у

61ц

Ьеи

Уа1

11е

165

170

175

- 48 024452

НЬз СЬи Ьуз СЬу РЬе Туг Туг Не Туг Зег СЬп ТЬг Туг РЬе Агд РЬе 180 185 190

СЬп СЬи СЬи 11е Ьуз СЬи Азп ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз СЬп Мек УаЬ 61п 195 200 205

Туг Не Туг Ьуз Туг ТЬг Зег Туг Рго Азр Рго Не Ьеи Ьеи Мек Ьуз 210 215 220

Зег АЬа Агд Азп Зег Суз Тгр Зег Ьуз Азр АЬа 61и Туг СЬу Ьеи Туг 225 230 235 240

Зег Не Туг 61п СЬу СЬу ТЬе РЬе СЬи Ьеи Ьуз СЬи Азп Азр Агд Не 245 250 255

РЬе УаЬ Зег УаЬ ТЬг Азп СЬи НЬз Ьеи Не Азр Мек Азр НЬз СЬи АЬа 260 265 270

Зег РЬе РЬе СЬу АЬа РЬе Ьеи УаЬ СЬу 275 280

<210>	17
<211>	150
<212>	БЕЛОК
<213>	Нолю зарЬепз
<300>
<308>	СепВапк: ААВ59402.1
<309>	2001-01-08
<313>	(24)..(173)
<300>
<308>	СепВапк/ ААВ59402.1
<309>	2001-01-08
<313>	(24).,(173)
<4 0 0>	17
Суз Азр Ьеи Рго СЬп ТЬг НЬз Зег Ьеи СЬу Зег Агд Агд ТЬг Ьеи Мек

Ь 5 10 15

Ьеи

Ьеи

АЬа

СЬп 20

Мек

Агд

Агд

Не

Зег 25

Ьеи

РЬе

Зег

Суз

Ьеи 30

Ьуз

Азр

Агд

НЬз

Азр 35

РЬе

СЬу

РЬе

Рго

СЬп 40

СЬи

СЬи

РЬе

СЬу

Азп 45

СЬп

РЬе

СЬп

Ьуз

АЬа 50

СЬи

ТЬг

Не

Рго

УаЬ 55

Ьеи

НЬз

СЬи

Мек

Не 60

СЬп

СЬп

Не

РЬе

Азп

Ьеи

РЬе

Зег

ТЬг

Ьуз

Азр

Зег

Зег

АЬа

АЬа

Тгр

Азр

СЬи

ТЬг

Ьеи

- 49 024452

70

80

Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЬг СЬи Ьеи 85

Туг СЬп СЬп Ьеи Азп Азр Ьеи СЬи 90 95

АЬа Суз УаЬ 1Ье СЬп СЬу УаЬ СЬу 100

УаЬ ТЬг СЬи ТЬг Рго Ьеи Меб Ьуз 105 110

СЬи Азр Зег Не Ьеи АЬа УаЬ Агд 115 120

Ьуз Туг РЬе СЬп Агд Не ТЬг Ьеи 125

Туг Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Ьуз Туг Зег 130 135

Рго Суз АЬа Тгр СЬи УаЬ УаЬ Агд 140

АЬа СЬи 11е Меб Агд Зег

145	150
<210>	18
<211>	124
<212>	БЕЛОК
<213>	Нолю зарЬепз
<300>
<308>	СепВапк: ААМ2888
<309>	2002-05-16
<313>	(2)..(125)
<300>
<308>	СепВапк/ААМ28885
<309>	2002-05-16
<313>	(2)..(125)
<400>	18
СЬп Азр	Рго Туг УаЬ Ьуз
1	5
АЬа СЬу	НЬз Зег Азр УаЬ 20
Ьеи Ьуз	Азп Тгр Ьуз СЬи 35
Не УаЬ 50	Зег РЬе Туг РЬе
Зег Не	СЬп Ьуз Зег УаЬ
65	70
РЬе РЬе	Азп Зег Азп Ьуз 85

СЬи Азп Ьец Ьуз Ьуз Туг РЬе Азп 10 15

Азп СЬу ТЬг Ьеи РЬе Ьеи СЬу 11е 25 30

Азр Агд Ьуз Не Меб СЬп Зег СЬп 45

РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр СЬп 60

Не Ьуз СЬи Азр Меб Азп УаЬ Ьуз 75 80

Агд Азр Азр РЬе СЬи Ьуз Ьеи ТЬг 90 95

- 50 024452

Азп Туг

Зег

УаЬ

ТЬг

Азр

Ьеи

Азп

УаЬ

СЬп

Агд

Ьуз

АЬа

Ые

НЬз

СЬи

100

105

110

Ьеи Ые

СЬп

УаЬ

МеС

АЬа

СЬи

Ьеи

Зег

Рго

АЬа

АЬа

115

120

<210>

19

<211>

263

<212> :

БЕЛОК

<213> :

Ното

зархепз

<300>

<308>

РРВ/ЬЕЮТА

<309>

2008-

-09-;

24

<313>

(2) .

. (264)

<400>

19

СЬп Азр

Рго

Туг

УаЬ

Ьуз

СЬи

АЬа

СЬи

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг

РЬе

Азп

1

5

10

15

АЬа СЬу

НЬз

Зег

Азр

УаЬ

АЬа

Азр

Азп

СЬу

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьеи

СЬу

Ые

20

25

30

Ьеи Ьуз

Азп

Тгр

Ьуз

СЬи

СЬи

Зег

Азр

Агд

Ьуз

Ые

МеС

СЬп

Зег

СЬп

35

40

45

Ые УаЬ

Зег

РЬе

Туг

РЬе

Ьуз

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

РЬе

Ьуз

Азр

Азр

СЬп

50

55

60

Зег ХЬе

СЬп

Ьуз

Зег

УаЬ

СЬи

ТЬг

11е

Ьуз

СЬи

Азр

МеС

Азп

УаЬ

Ьуз

65

70

75

80

РЬе РЬе

Азп

Зег

Азп

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Агд

Азр

Азр

РЬе

СЬи

Ьуз

Ьеи

ТЬг

85

90

95

Азп Туг

Зег

УаЬ

ТЬг

Азр

Ьеи

Азп

УаЬ

СЬп

Агд

Ьуз

АЬа

Ые

Азр

СЬи

100

105

ыо

Ьеи Ые

СЬп

УаЬ

МеС

АЬа

СЬи

РЬе

Зег

ТЬг

СЬи

СЬи

СЬп

СЬп

СЬи

СЬу

115

120

125

Рго Туг

УаЬ

Ьуз

СЬи

АЬа

СЬи

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг

РЬе

Азп

АЬа

СЬу

ЬЗО

135

140

НЬз Зег

Азр

УаЬ

АЬа

Азр

Азп

СЬу

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьеи

СЬу

Ые

Ьеи

Ьуз

145

150

155

160

Азп Тгр

Ьуз

СЬи

СЬи

Зег

Азр

Агд

Ьуз

Ые

МеС

СЬп

Зег

СЬп

Ые

УаЬ

165

170

175

- 51 024452

Азр Азр 61п Зег Не

190

Азп Л<а1 Ьуз РЬе РЬе 205

Ьуз Ьеи ТЬс Азп Туг 220

11е Шз С1и Ьеи 11е 240

ТЬг 61у Ьуз Агд Ьуз 255

Рго Ьеи С1у Ьеи А1а СЬу 1 5 <210> 21 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> искусственный <400> 21

Агд Уа1 Уа1 Агд <210> 22 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <300>

<301> ТеиДзипи. Υ, Опда М, ЫадаДа 3, Ьее Б, КгеЬДтап КЛ, РазДап I. <302> ЗЬДе-зресдГдс сЬетЬсаЬ тоб1£1саД1оп мЬДЬ ро1уеДЬу1епе д1усо1 о£ гесотМпапД ЬттипоДохЬп апМ-Тас(Гу)-РЕ38 (ЬМВ-2) ллпргоуез

- 52 024452

	апбгбитог асбЬугбу апй гейисез ап±та1 ΐοχίσίΐγ апй ЬпипиподепгсЬбу.
<303> <304> <305> <30б> <307> <308> <309>	Ргос Ыаб1 Асай ЗсЬ и 3 А. 97 15 8548-53 2000-07-18 РМЮ/10890891 2000-07-18
<400>	22

А1а Зег 61у Суз 61у Рго 61и

1	5
<210> <211> <212> <213>	23 5 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	искусственный
<400>	23

А1а А1а Суз А1а А1а

1	5
<210> <211> <212> <213>	24 7 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	искусственный
<400>	24

Зег С1у С1у Суз С1у С1у Зег 1 5

<210> <211> <212> <213>

25 5 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	искусственный
<400>	25

Зег С1у Суз С1у Зег 1 5

<210> <211> <212> <213>	26 5 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220>

- 53 024452 <223> искусственный <400> 26

СЬу Зег СЬу СЬу СЬу 1 5 <210> 27 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 27

СЬу СЬу СЬу Зег ь

<210> 28 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <220>

<221> отличающийся элемент <222> (1) . . (1) <22 3> Хаа может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту <400> 28

Хаа СЬу СЬу Зег <210> 29 <211> 1034 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 29

РдРдаРсРдс	сдсадассса	РадссРдддР	адссдРсдРа	сссРдаРдсР	дсрддсасад	60
аРдсдРсдРа	РРадссРдРР	РадсРдссРд	ааадаРсдРс	аРдаРРРРдд	РРРРссдсад	120
даадааРРРд	дРааРсадРР	Рсадааадсс	дааассаРРс	сддРРсРдса	РдаааРдаРР	180
садсадаРРР	РРаассРдРР	Радсассааа	даРадсадсд	садсарддда	РдааасссРд	240
сРддаРаааР	РРРаРассда	асРдРаРсад	садсРдааРд	аРсРддаадс	аРдРдРРаРР	300
садддРдРРд	дрдррассда	аасассдсРд	аРдааадаад	аРадсаРРсР	ддссдрдсдр	360
аааРаРРРРс	адсдсаРРас	ссРдРаРсРд	ааадаааааа	ааРаРадссс	дрдрдсардд	420

- 54 024452

даадГГдГГс	дГдсадаааГ	ГаГдсдГадс	ГГГадссГда	дсассааГсГ	дсаддааадс	480
сГдсдГадса	аадаассдсГ	дддГсГддса	ддГсдГдСГд	ГГсдГссдсГ	ддссГддсГд	540
дссдГдГддГ	дсдГдГГдса	дсасаГаГГа	ссддсасссд	ГддГсдГадс	ааГасссГда	600
дсадсссдаа	ГадсаааааЬ	дааааадссс	ГдддГсдсаа	ааГГааГадс	Гдддааадса	660
дссдгадсдд	ГсаГадсГСГ	сГдадсааГс	ГдсаГсГдсд	СааГддСдаа	сГддГдаГГс	720
аГдааааадд	сГГГГаГГаЬ	аГГГаЪадсс	адассГаГГГ	ГсдсГГГсад	даадаааГГа	780
аадааааГас	саааааГдаГ	ааасаааГдд	Сдсадгагаг	сСаГаааГаГ	ассадсгагс	840
сддаГссдаГ	ГсГдсГдаГд	аааадсдсас	дГааЪадсГд	ГГддадсааа	даГдсадааГ	900
аГддссГдГа	ГадсаГСГаГ	садддЬддса	гтГдаасГ	дааадааааГ	даГсдсаГЫ:	960
ГГдГдадсдГ	дассааГдаа	саГсЬдаГЬд	аГаЪддаГса	Гдаадссадс	ГГГГГЬддГд	1020
саГГГсГддГ	дддг					1034

<210> 30 <211> 1040 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 30

ссдсадсдГд ГГдсадсаса ГаГГассддс асссдГддГс дГадсааГас ссГдадсадс	60
ссдааГадса ааааГдаааа адсссГдддГ сдсааааГГа аЪадсГддда аадсадссдГ	120
адсддГсаГа дсГГСсГдад саагсгдсаг сГдсдГааГд дГдаасГддГ даГГсаГдаа	180
аааддсГГГЬ λΓΓβΓθΓΓΓβ Гадссадасс ГаГГЪГсдсГ ГГсаддаада ааГГааадаа	240
ааГассаааа абдаГаааса ааГддГдсад ГаГаЬсГаГа ааГаГассад сГаЬссддаГ	300
ссдаГГсГдс ГдаГдаааад сдсасдСааГ адсГдГГдда дсааадаГдс адааГаГддс	360
сГдбаГадса ГГГаГсаддд ГддсаГГГЬГ даасГдааад ааааГдаГсд саГтГдГд	420
адсдГдасса аГдаасаГсГ даГГдаЬаГд дабсаГдаад ссадсГГт ГддЬдсаГГЬ	480
сГддбдддГс сдсГдддГсГ ддсаддГсдГ дГГдГГсдГс сдсГдддссГ дсГддссдГд	540
ГддГдГдГда ГсГдссдсад асссаГадсс ГдддГадссд ГсдГасссГд аГдсГдсбдд	600
сасадаГдсд ГсдГаГГадс сГдГСГадсГ дссГдааада ГсдГсаГдаГ ГГГддГГГГс	660
сдсаддаада аГГГддГааГ садГГГсада аадссдааас саГГссддГГ сГдсаГдааа	720
ГдаГГсадса даГГГГГаас сГдГГЬадса ссааадаГад садсдсадса ГдддаГдааа	780
сссбдсГдда ГаааГЬГГаГ ассдаасГдГ аГсадсадсб даабдаГсГд даадсаГдГд	840
ЬГаЫсаддд ГдГЬддГдГГ ассдааасас сдсГдаГдаа адаадаГадс аГГсГддссд	900
ГдсдГаааГа ГГГГсадсдс аГГасссГдГ аГсГдааада аааааааГаГ адсссдГдГд	960

- 55 024452 сабдддаадЪ ГдООсдОдса даааЫабдс дОадсООЪад ссОдадсасс ааОсОдсадд 1020 ааадссОдсд Садсааадаа 1040 <210> 31 <211> 1054 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 31

ГдОдаЬсСдс	сдсадассса	СадссСдддЬ	адссдЪсдСа	сссбдаОдсЪ	дсЬддсасад	60
аГдсдЬсдГа	бЪадссГдГЬ	•ЬадсГдссЬд	ааадаЬсдЬс	аПдаСЪЪСдд	ОСЪЪссдсад	120
даадааГГГд	дЪааЬсадГГ	Гсадааадсс	дааассаДДс	сддЕЬсЪдса	ОдаааЪдаЬС	180
садсадаЕЪЬ	ЬЪаассбдЬС	Ъадсассааа	дабадсадсд	садсабддда	ГдааасссЬд	240
сЬддабаааЪ	ОЪГаЪассда	асЪдбабсад	садсЪдааГд	аЬсЬддаадс	абд^дЫгаСС	300
садддЪдЁСд	дГдССассда	аасассдсЪд	асдааадаад	абадсаГЬсб	ддссдГдсдб	360
аааиППс	адсдсаЪГас	ссЬдбабсЪд	ааадаааааа	ааЪаЬадссс	дЬдбдсаСдд	420
даадГЪдГГс	дЪдсадаааб	ГаЬдсдбадс	ГЬЪадссЬда	дсассааЬсЪ	дсаддааадс	480
сбдсдОадса	аадаассдсС	дддСсЪддса	ддГсдСдСЪд	ГГсдЬдсд'Ьс	ддсЪдсддбс	540
сддаассдсГ	дддссЪддсС	ддссдЬдСдд	ЪдсдГдЬЪдс	адсасаЪаЪа	ссддсасссд	600
СддбсдГадс	аабасссгда	дсадсссдаа	ГадсаааааГ	дааааадссс	бдддГсдсаа	660
ааГЬааДадс	Одддааадса	дссдГадсдд	ЬсаЪадсСЬГ	сЪдадсааГс	ЕдсаЪсЪдсд	720
ГааЪддбдаа	сГддОдаЪЪс	абдааааадд	οΓΊζΓΓβΟϋβί	аЪСЬаЪадсс	адассбаГЬЪ	780
ЬсдсГГСсад	даадаааСЪа	аадаааа£ас	саааааСдаб	ааасаааЪдд	ГдсадбаОа!	840
сСаЬаааГаЬ	ассадсЪаЪс	сддаЪссдаЪ	ГсОдсЬдабд	аааадсдсас	дЪааЪадсЬд	900
ЬЪддадсааа	дабдсадааС	аЪддссГдба	ГадсаГСГаГ	садддбддса	ГбЪбГдаасб	960
дааадааааб	даЬсдсаЬГГ	ГГдГдадсдГ	дассааЪдаа	саГсГдаЪЬд	абаГддаГса	1020
Сдаадссадс	ССССДГддбд	саЬГСсГддГ	дддЪ			1054

<210> 32 <211> 1057 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 32 садсдбдПд садсасаЬаС Ъассддсасс сдЬдд-ЬсдСа дсааСасссО дадсадсссд 60 ааГадсаааа аЬдааааадс ссЬдддЪсдс ааааЪОааЪа дсЪдддааад садссдбадс 120

- 56 024452

ддрсаРадсР РРсРдадсаа РсРдсаРсРд сдРааРддРд аасРддРдаР РсаРдааааа	180
ддсРРРРаРР аРаРРРаРад ссадассРаР РРРсдсРРРс аддаадаааР РааадааааР	240
ассаааааРд аРааасаааР ддрдсадРаР агсРаРаааР аРассадсРа РссддаРссд	300
аРРсРдсРда Рдаааадсдс асдРааРадс РдРРддадса аадардсада аРаРддссРд	360
РаРадсаРРР аРсадддРдд саРРРРРдаа срдааадааа аРдаРсдсаР РРРРдРдадс	420
дрдассаард аасаРсРдаР РдаРаРддаР саРдаадсса дсрРРРРРдд РдсаРРРсРд	480
дрдддрссдс РдддРсРддс аддРсдРдРР дРРсдРдсдР сРддсРдсдд ссддаассдс	540
РдддссРддс РддссдРдРд дрдрдрдарс Рдссдсадас ссаРадссРд драдссдрсд	600
РасссРдаРд сРдсРддсас адаРдсдРсд РаРРадссРд РРРадсРдсс РдааадаРсд	660
РсаРдаРРРР ддРРРРссдс аддаадааРР РддРааРсад РРРсадааад ссдааассаР	720
рссддРРсРд саРдаааРда РРсадсадаР рррраассрд РРРадсасса аадарадсад	780
сдсадсаРдд даРдааассс РдсРддараа арррраРасс даасРдРаРс адсадсРдаа	840
РдаРсРддаа дсаРдРдРРа РРсадддРдР рддрдррасс дааасассдс Рдардааада	900
адаРадсаРР срддссдрдс драааРаРРР РсадсдсаРР асссРдРаРс Рдааадаааа	960
ааааРаРадс ссдРдРдсаР дддаадРРдР Рсдрдсадаа аРРаРдсдРа дсрррадсср	1020
дадсассааР срдсаддааа дссРдсдРад сааадаа	1057

<210> 33 <211> 899 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 33

саддаРссдР	аРдРРааада	адссдааааР	срдааааааР	аРРРРааРдс	сддРсаРРсР	60
даРдРРдсад	аРааРддсас	ссРдРРРсРд	ддРаРРсРда	ааааРРддаа	адаадааадс	120
даРсдсаааа	РсаРдсадад	ссадаРсдРд	адсРРРРаРР	РсааасРдРР	саааааРРРР	180
ааадаРдаРс	ададсаРРса	даааадсдрд	дааассаРРа	аадаадасаР	даасдРаааа	240
РРсРРсааРР	ссааРааааа	аааасдсдаР	дарррсдааа	аасРдассаа	РРаРадсдРд	300
ассдаРсРда	аРдРРсадсд	РааадссаРР	саРдаасРда	РРсаддРРаР	ддсадаасРд	360
РсРссддсад	сассдсрддд	РсРддсаддс	сдРдРРдРРс	дрдаасдрдд	ссдсадсдрд	420
РРдсадсаса	РаРРассддс	асссдРддРс	дРадсааРас	ссРдадсадс	ссдааРадса	4В0
ааааРдаааа	адсссрдддр	сдсааааРРа	аРадсРддда	аадсадссдр	адсддРсаРа	540
дсРРРсРдад	сааРсРдсаР	сРдсдРааРд	дрдаасрддр	даРРсаРдаа	аааддсРРРР	600
аррараррра	Радссадасс	РаРРРРсдсР	РРеаддаада	ааррааадаа	аасассаааа	660

- 57 024452

абдабаааса	аабддбдсад бабабсбаба аабабассад сбабссддаб ссдаббсбдс	720
бдабдаааад	сдсаедбааб адсбдббдда дсааадабдс адаабабддс сбдбабадса	780
бббабсаддд	бддсаббббб даасбдааад аааабдабсд сабббббдбд адсдбдасса	840
абдаасабсб	даббдабабд дабсабдаад ссадсббббб бддбдсаббб сбддбдддб	899

<210> 34 <211> 857 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

<220>
<223> искусственный
<400> 34 сдбдаасдбд	дбссдсадсд	бдббдсадса	сабаббассд	дсасссдбдд	бсдбадсааб	60
асссбдадса	дсссдаабад	сааааабдаа	ааадсссбдд	дбсдсааааб	баабадсбдд	120
дааадсадсс	дбадсддбса	бадсбббсбд	адсаабсбдс	абсбдсдбаа	бддбдаасбд	180
дбдаббсабд	аааааддсбб	ббаббабабб	бабадссада	ссбаббббсд	сбббсаддаа	240
даааббааад	аааасассаа	ааабдабааа	сааабддбдс	адбабабсба	бааабабасс	300
адсбабссдд	абссдаббсб	дсбдабдааа	адсдсасдба	абадсбдббд	дадсааадаб	360
дсадаабабд	дссбдбабад	сабббабсад	ддбддсаббб	ббдаасбдаа	адаааабдаб	420
сдсабббббд	бдадсдбдас	сддбддбадс	ссдсбдддбс	бддсаддссд	дббдббддбд	480
дбадссадда	бссдбабдбб	ааадаадссд	аааабсбдаа	аааабабббб	аабдссддбс	540
аббсбдабдб	бдсадабааб	ддсасссбдб	ббсбдддбаб	бсбдаааааб	бддааадаад	600
ааадсдабсд	саааабсабд	сададссада	бсдбдадсбб	ббабббсааа	сбдббсаааа	660
аббббааада	бдабсададс	аббсадаааа	дсдбддааас	саббааадаа	дасабдаасд	720
бааааббсбб	сааббссааб	ааааааааас	дсдабдаббб	сдааааасбд	ассааббаба	780
дсдбдассда	бсбдаабдбб	садсдбааад	ссаббсабда	асбдаббсад	дббабддсад	840

аасбдбсбсс ддсадса 857 <210> 35 <211> 928 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

<220> <223> искусственный
<400> 35 саддабссдб	абдббааада	адсадааааб	сбдааааааб	аббббаабдс	аддбсабадс	60
дабдббдсад	абаабддбас	асбдбббсбд	ддбаббсбда	ааааббддаа	адаадааадс	120
дабсдбаааа	бсабдсадад	ссадаббдбд	адсббсбабб	ббааасбдбб	сааааабббб	180

- 58 024452

ааадакдакс	ададсаккса	даааадсдкд	дааассакса	аадаадакак	даасдккааа	240
ккккксаака	дсаасааааа	аааасдкдак	даккккдааа	ааскдассаа	скакадсдкд	300
ассдакскда	акдкксадсд	кааадсаакк	сакдааскда	кксаддккак	ддсадааскд	360
адкссддсад	саддкадсдд	кддкддкссд	скдддкскдд	саддксдкдк	дкксдкддка	420
дсддаддкдд	кдаасдкддк	ссдсадсдкд	ккдсадсаса	каккассдда	сссдкддксд	480
кадсаакасс	скдадсадсс	сдаакадсаа	ааакдааааа	дсаскдддкс	дкааааккаа	540
кадскдддаа	адсадссдка	дсддксакад	скккскдадс	аакскдсакс	кдсдкаакдд	600
кдааскддкк	акксакдааа	ааддккккка	ккакакккак	адссадасск	акккксдккк	660
ксаддаадаа	аккааадааа	акассааааа	кдакаадсад	акддкксадк	асакккакаа	720
акакассадс	какссддакс	сдаккскдск	дакдаааадс	дсасдкаака	дскдккддад	780
сааадакдса	даакакддкс	кдкакадсак	ккаксадддк	ддкакккккд	ааскдааада	840
ааакдаксдк	акккккдкка	дсдккассаа	кдаасакскд	аккдакакдд	аксакдаадс	900
дадскккккк	ддкдсакккс	кддккддк				928

<210> 36 <211> 929 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 36

сдкддкссдс адсдкдккдс адсасакакк ассддсассс дкддксдкад саакассскд	60
адсадсссда акадсааааа кдааааадса скдддксдка аааккаакад скдддааадс	120
адссдкадсд дксакадскк кскдадсаак скдсакскдс дкаакддкда аскддккакк	180
сакдааааад дкккккакка какккакадс садасскакк кксдккккса ддаадааакк	240
ааадаааака ссааааакда каадсадакд дкксадкаса кккакааака кассадскак	300
соддакссда ккскдскдак даааадсдса сдкаакадск дккддадсаа адакдсадаа	360
какддкскдк акадсаккка ксадддкддк акккккдаас кдааадаааа кдаксдкакк	420
кккдккадсд ккассаакда асакскдакк дакакддакс акдаадсдад сккккккддк	480
дсакккскдд ккддкддкад сддкддкддк ссдскдддкс кддсаддксд дккдкксдкд	540
дкадсддадд кддкдаасад дакссдкакд ккааадаадс адаааакскд аааааакакк	600
ккаакдсадд ксакадсдак дккдсадака акддкасаск дкккскдддк аккскдаааа	660
аккддааада адааадсдак сдкаааакса кдсададсса даккдкдадс ккскакккка	720
ааскдкксаа аааккккааа дакдаксада дсакксадаа аадсдкддаа ассаксааад	780
аадакакдаа сдккаааккк кксаакадса асаааааааа асдкдакдак кккдааааас	840

- 59 024452

Вдассаасба аддВВаВддс	ВадсдВдасс адаасВдадВ	даЬсЕдааЁд ссддсадса	ВВсадсдВаа	адсааВВсаВ	даасВдаВВс	900 929
<210> 37 <211> 948 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> искусственный <400> 37 саддаВссдВ аЕдВВааада адсадааааВ сВдааааааб	аббВВааЕдс	аддВсаВадс	60
даВдВВдсад	аВааВддВас	асВдВВВсВд	ддВаВВсВда	ааааВВддаа	адаадааадс	120
даВсдВаааа	ВсаВдсадад	ссадаВВдВд	адсввсвавв	ВВааасбдбб	саааааВВВВ	180
ааадаВдаВс	ададсаВВса	даааадсдВд	дааассаВса	аадаадаВаВ	даасдВВааа	240
ввиввсаава	дсаасааааа	аааасдВдаВ	даВВЕВдааа	аасВдассаа	сВаВадсдВд	300
ассдавсвда	авдввсадсд	ВааадсааВВ	саВдаасВда	ВВсаддВВаВ	ддсадаасВд	360
адВссддсад	саддВадсдд	ВддсддВссд	сВдддВсВдд	саддВдсдВс	дсВдсддВсс	420
ддаасдВдВВ	дВВсдВддба	дсддаддсдд	ВдаасдВддВ	ссдсадсддв	ВдсадсасаВ	480
аВВассддса	сссдВддВсд	ВадсааВасс	сВдадсадсс	сдааВадсаа	аааВдааааа	540
дсасВдддВс	дВааааВВаа	ВадсВдддаа	адсадссдВа	дсддВсаВад	сВВВсВдадс	600
ааВсВдсаВс	ВдсдВааВдд	ВдаасВддЕВ	аВВсаВдааа	ааддВВВВВа	ввабавввав	660
адссадассВ	аввввсдввв	Всаддаадаа	аввааадааа	аВассааааа	ВдаВаадсад	720
абддВВсадВ	асаВВВаВаа	аВаВассадс	ВаВссддаВс	сдаВВсВдсВ	даВдаааадс	780
дсасдВааВа	дсВдВВддад	сааадаВдса	дааВаВддВс	вдвавадсаб	ВВаВсадддВ	840
ддВаВВВВВд	аасВдааада	аааВдаВсдВ	авевввдбба	дсдВВассаа	ВдаасаВсВд	900
аВВдабаВдд	аВсаВдаадс	дадсвввввв	ддвдсавввс	вддВВддв		948

<210> 38 <211> 1014

<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> искусственный <400> 38 саддаВссдВ аВдВВааада адссдадаас сВдааааааб	аВВВВааВдс	сддВсаВВсс	60
да£д£Ъдсад	аВааВддсас	ссВдВВВсВд	ддВаВВсВда	ааааВВддаа	ададдааадс	120
дассдсаааа	ВсаВдсадад	ссадаВВдВд	адсВВсбаВВ	ВсааасбдВВ	сааааасВВс	180
ааадасдасс	ададсаВВса	даааадсдВд	дааассаВса	аадаадаВаВ	даасдВсааа	240

- 60 024452

ррсррсааса	дсаасааааа	аааасдсдас	дасРРРдада	аасРдассаа	РРаРадсдрд	300
ассдаРсрда	аРдРРсадсд	РааадсааРР	саРдаасРда	РРсаддРРаР	ддсадаасРд	360
адРссддсад	саддРадсдд	РддРддРссд	срдддрсрдд	саддрсдрдр	РдРРсдРдса	420
адсддРРдРд	дрссддаадд	РадРддРддР	ддсассадсд	аадааассаР	РадсассдРР	480
саадааааас	адсадааРаР	РадРссдсРд	дррсдрдаас	дрддрссдса	дсдРдРРдса	540
дсасаРаРРа	ссддсасссд	РддРсдРадс	ааРасссРда	дсадсссдаа	РадсаааааР	600
дааааадсас	РдддРсдсаа	ааРсааРадс	Рдддааадса	дссдРадсдд	РсаРадсРРР	660
сРдадсааГс	РдсаРсРдсд	РааРддРдаа	сРддРдаРРс	аРдааааадд	сРРсРасРаР	720
аРсРасадсс	адассРаРРР	РсдсРРссаа	даадаааРса	аададаасас	сааааасдас	780
ааасааардд	РдсадРасаР	сРасаааРаР	ассадсРаРс	сддаРссдаР	РсРдсРдаРд	840
аааадсдсас	дРааРадсРд	РРддадсааа	даРдсадааР	аРддрсРдРа	РадсаРРРаР	900
садддРддса	РсРРРдадсР	дааадааааР	даРсдсаРсР	РРдРРадсдР	дассаасдаа	960
саРсРдаРсд	аРаРддаЬса	Ьдаадссадс	РРРРРРддРд	саРРРсРддР	дддр	1014

<210> 39 <211> 951 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 39

даасдрддрс сдсадсдрдр РдсадсасаР аРРассддса сссдрддрсд РадсааРасс	60
сГдадсадсс сдааРадсаа аааРдааааа дсасРдддРс драаааРРаа РадсРдддаа	120
адсадссдРа дсддРсаРад сРРРсРдадс аарсрдсарс РдсдРааРдд РдаасРддРР	180
аРРсардааа ааддРРРРРа РРаРаррРаС адссадассР аРРРРсдРРР Рсаддаадаа	240
аРРааадааа арассааааа РдаРаадсад аРддРРсадР асаРРРаРаа аРаРассадс	300
РаРссддарс сдаРРсРдсР даРдаааадс дсасдРааРа дсРдРРддад сааадаРдса	360
дааРаРддРс рдРаРадсаР РРаРсадддР ддРаРРРРРд аасРдааада аааРдаРсдР	420
аРРРРРдРРа дсдРРассаа РдаасаРсРд аЬРдаРаРдд аРсаРдаадс дадсРРРРРР	480
ддРдсаРРРс РддРРддРдд Радсддрддс ддРссдсРдд дРсРддсадд РдсдРсРддс	540
РдсддРссдд аасдрдррдр РсдРддРадс ддаддсддрс аддаРссдРа рдррааадаа	600
дсадааааРс РдааааааРа РРРРааРдса ддРсаРадсд аРдРРдсада РааРддРаса	660
сРдРРРсРдд дРаРРсРдаа аааРРддааа даадааадсд аРсдРааааР саРдсададс	720
садаРРдРда дсРРсРаРРР РааасРдРРс аааааРРРРа аадаРдаРса дадсаРРсад	780
аааадсдрдд ааассаРсаа адаадаРаРд аасдРРаааР РРРРсааРад саасаааааа	840

- 61 024452 ааасдрдард аРРРРдаааа асРдассаас РаРадсдРда ссдаРсРдаа РдРРсадсдР 900 ааадсааРРс аРдаасРдаР РсаддРРаРд дсадаасРда дРссддсадс а 951 <210> 40 <211> 1347 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 40

саддаРссдР	ардррааада	адссдадаас	сРдааааааР	аРРРРааРдс	сддРсаРРсс	60
даРдРРдсад	аРааРддсас	ссрдрррсрд	ддРаРРсРда	ааааРРддаа	ададдааадс	120
даРсдсаааа	РсаРдсадад	ссадаРРдРд	адсРРсРаРР	РРааасРдРР	саааааРРРР	180
ааадаРдаРс	ададсаРРса	даааадсдрд	дааассаРса	аадаадаРаР	даасдррааа	240
РРРРРсааРа	дсаасааааа	аааасдРдаР	даРРРРдааа	аасРдассаа	сРаРадсдРд	300
ассдаРсрда	аРдРРсадсд	РааадсааРР	даРдаасРда	РРсаддРдаР	ддсадааРРР	360
адсассдаад	аасадсаада	дддРссРРаР	дрдааадаад	садааааРсР	дааааааРас	420
РРсаасдсад	дрсарадсда	сдРРдссдаР	аасддрасас	РдРРссРддд	саРссРдааа	480
аасРддааад	аадааРсада	РсдРааааРс	аРдсааРссс	адаРсдРдРс	сРРсРасРРс	540
ааасРдРРса	аааасРРсаа	адасдассад	Рсаарсеада	ааРсадРдда	аасдаРРааа	600
даадаРарда	асдРсаааРР	сРРсааРРса	аасааааааа	аасдсдасда	сРРсдадааа	660
сРдасдааРР	аРРсадРРас	сдаРсРдаас	дрдсаасдса	аадссаРсса	РдадсРдаРс	720
саддРРаРдд	ссдаасРдад	Рссддсадса	аааассддра	аасдРааасд	РадссадаРд	780
сРдРРРсдрд	драдсддрдд	РддРссдсРд	ддРсРддсад	дРсдРдРРдР	РсдРддРРса	840
ддрддрддрд	аасдрддрсс	дсадсдРдРР	дсадсасаРа	РРассддсас	ссдрддрсдр	900
адсааРассс	Рдадсадссс	дааРадсааа	ааРдааааад	сасРдддРсд	сааааРсааР	960
адсРдддааа	дсадссдРад	сддРсаРадс	рррсрдадса	аРсРдсаРсР	дсдРааРддР	1020
даасрддрда	РРсаРдаааа	аддсРРРРаР	РаРаРРРаРа	дссадассра	РРРРсдсРРР	1080
саадаадада	РРааадаааа	РассаааааР	даРааасааа	РддРдсадРа	саРРРаРааа	1140
РаРассадсР	аРссддассс	даРРсРдсРд	аРдаааадсд	сасдРааРад	срдррддадс	1200
ааадардсад	ааРаРддРсР	дРаРадсаРР	РаРсадддРд	дсаРсРРРда	дсРдааадаа	1260
ааРдаРсдса	РсРРРдРРад	сдрдассаас	даасаЬсРда	РсдаРаРдда	РсаРдаадсс	1320
адсРРРРРРд	дРдсаРРРсР	ддрдддр				1347

<210> 41 <211> 1350

- 62 024452 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 41

даасдбддбс	сдсадсдСдС	СдсадсасаС	аССассддса	сссдСддСсд	СадсааСасс	60
сСдадсадсс	сдааСадсаа	аааСдааааа	дсасСдддСс	дсааааСсаа	СадсСдддаа	120
адсадссдЪа	дсддСсаСад	сСССсСдадс	ааСсСдсаСс	СдсдСааСдд	СдаасСддСд	180
аЬЬсаЬдааа	ааддсССССа	ССаСаСССаС	адссадассС	аССССсдсСС	Ссаадаадад	240
аООааадааа	аСассааааа	СдаСааасаа	аСддСдсадС	асаСССаСаа	аСаСассадс	300
ОаЬссддасс	сдаССсСдсЬ	даСдаааадс	дсасдСааСа	дсСдССддад	сааадаСдса	360
даабабддбс	СдСаСадсаС	ССаСсадддС	ддсаСсСССд	адседааада	аааСдаСсдс	420
асесьидида	дсдСдассаа	сдаасаСсСд	аСсдаеаСдд	аСсаедаадс	садссссссе	480
ддбдсаЪДЪс	СддСдддСдд	СадсддСддС	ддСссдсСдд	дСсСддсадд	ЪсдЪдЪЪдЪЪ	540
сдЬддЬЪсад	дСддСддСда	асаддаСссд	СаСдССааад	аадссдадаа	ссЪдаааааа	600
•сассссааьд	ссддСсаССс	сдаСдССдса	даСааСддса	сссСдСССсС	дддСаССсСд	660
аааааседда	аададдааад	сдаСсдсааа	аСсаСдсада	дссадаССдС	дадсССсСаС	720
ССЬааасСдС	СсаааааССС	СааадаСдаС	сададсаССс	адаааадедс	ддааассаСс	7В0
ааадаадаЪа	СдаасдССаа	аСССССсааС	адсаасаааа	ааааасдСда	СдаССССдаа	840
ааасСдасса	асСаСадсдС	дассдаСсСд	ааСдССсадс	дСааадсааС	СдаСдаасСд	900
аССсаддСда	СддсадааСС	Садсассдаа	даасадсаад	адддСссССа	СдСдааадаа	960
дсадааааСс	СдааааааСа	сССсаасдса	ддСсаСадсд	асдССдссда	СаасддСаса	1020
сСдССссСдд	дсаСссСдаа	ааасСддааа	даадааСсад	аСсдСааааС	саСдсааСсс	1080
садаСсдСдС	ссССсСасее	сааасСдССс	ааааасССса	аадасдасса	дСсааСссад	1140
аааесадСдд	ааасдаССаа	адаадаСаСд	аасдСсаааС	СсССсааССс	ааасаааааа	1200
ааасдсдасд	асССсдадаа	асСдасдааС	СаССсадССа	ссдаСсСдаа	сдСдсаасдс	1260
ааадссаСсс	аСдадсСдаС	ссаддССаед	дссдаасСда	дСссддсадс	ааааассдде	1320
ааасдСааас	дСадссадаС	дсСдСССсдС				1350

<210> 42 <211> 1368 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400 42 саддаьссдд аГдДДааада адссдадаас сбдааааааЪ аббббааГдс сддДсаДЪсс 60

- 63 024452

дабдССдсад	абаабддсас	ссСдСССсСд	ддСаССсСда	ааааббддаа	ададдааадс	120
даСсдсаааа	ЪсаСдсадад	ссадаССдСд	адсССсбабС	ббааасСдсс	саааааСССб	180
ааадабдаСс	ададсаЪбса	даааадсдЪд	дааассаЪса	аадаадаЪаС	даасдбЬааа	240
бСббСсааба	дсаасааааа	аааасдСдаС	даССГСдааа	аасбдассаа	сбабадсдСд	300
ассдаСсСда	аСдСЬсадсд	СааадсааСС	даСдаасСда	ССсаддСдаС	ддсадааССЬ	360
адсассдаад	аасадсаада	дддСссССаС	дбдааадаад	садаааабсС	дааааааСас	420
ббсаасдсад	дСсаЬадсда	сдСЬдссдаб	аасддСасас	Ъдббссбддд	саСссСдааа	480
аасСддааад	аадааСсада	СсдЬааааСс	аСдсааСссс	адаЬсдСдЬс	сССсСасССс	540
ааасСдССса	аааасССсаа	адасдассад	СсааДссада	ааСсадбдда	аасдаССааа	600
даадаСаЬда	асдбсаааСС	сССсааССса	ааоааааааа	аасдсдасда	сССсдадааа	660
сСдасдааСС	аССсадСгас	сдаСсСдаас	дЬдсаасдса	аадссабсса	СдадсСдаСс	720
саддбСабдд	ссдаасЪдад	Ъссддсадса	аааассддСа	аасдСааасд	СадссадаСд	780
сСдСССсдСд	дбадсддСдд	СддСссдсСд	ддСссддсад	дСдсдбсСдд	сСдсддСссд	840
даасдбдбСд	66сд6ддС8с	аддСддЬддС	даасдбддбс	сдсадсдбдС	СдсадсасаС	900
аЪЬассддса	сссдСддСсд	СадсааЪасс	сСдадсадсс	сдааЬадсаа	аааЬдааааа	960
дсасбдддбс	дсааааСсаа	СадсСдддаа	адсадссдСа	дсддбсабад	сСССсСдадс	1020
ааСсСдсаСс	Сдсдбаабдд	СдаасСддСд	абСсаСдааа	ааддсССССа	ССаСаСССаС	1080
адссадассб	аббССсдсСб	Ссаадаадад	аССааадааа	аСассааааа	СдаСааасаа	1140
абддбдсадС	асаСССаСаа	абаСассадс	баСссддасс	сдаССсбдсб	даСдаааадс	1200
дсасдЬааба	дсСдббддад	сааадаГдса	дааЬаЪддЬс	СдСаЪадсаС	ССаСсадддС	1260
ддсаЬсЬЬЬд	адсСдааада	ааабдаСсдс	аЬсЪССдССа	дсдСдассаа	сдаасаСсСд	1320
аСсдаСаСдд	аСсаСдаадс	садсССС-ССС	ддСдсабббс	СддСдддС		1368

<210> 43 <211> 1368 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> искусственный <400> 43

даасдСддСс	сдсадсдСдС СдсадсасаС аССассддса сссдбддСсд СадсааСасс	60
сСдадсадсс	сдааСадсаа аааСдааааа дсасСдддСс дсааааСсаа СадсСдддаа	120
адсадссдСа	дсддСсаСад сСССсСдадс аабсСдсаСс СдсдСааСдд СдаасСддСд	180
аССсаСдааа	ааддсССССа СЬаСаСССаС адссадассС аССССсдсСС Ссаадаадад	240
аССааадааа	аСассааааа СдаСааасаа аСддСдсадС асаСССаСаа аСаСассадс	300

- 64 024452

бабссддасс	сдаббсбдсб	дабдаааадс	дсасдбааба	дсбдббддад	сааадабдса	360
даабабддбс	бдбабадсаб	ббабсадддб	ддсабсбббд	адсбдааада	ааабдабсдс	420
абсбббдбба	дсдбдассаа	сдаасабсбд	абсдабабдд	абсабдаадс	садсбббббб	480
ддбдсабббс	бддбдддбдд	бадсддбддб	ддбссдсбдд	дбсбддсадд	бдсдбсбддс	540
бдсддбссдд	аасдбдббдб	бсдбддббса	ддбддбддбс	аддабссдба	бдббааадаа	600
дссдадаасс	бдааааааба	ббббаабдсс	ддбсаббссд	абдббдсада	баабддсасс	660
сбдбббсбдд	дбаббсбдаа	аааббддааа	даддааадсд	абсдсааааб	сабдсададс	720
садаббдбда	дсббсбаббб	бааасбдббс	ааааабббба	аадабдабса	дадсаббсад	780
аааадсдбдд	ааассабсаа	адаадабабд	аасдббаааб	ббббсаабад	саасаааааа	840
ааасдбдабд	аббббдаааа	асбдассаас	бабадсдбда	ссдабсбдаа	бдббсадсдб	900
ааадсааббд	абдаасбдаб	бсаддбдабд	дсадааббба	дсассдаада	асадсаадад	960
ддбссббабд	бдааадаадс	адаааабсбд	аааааабасб	бсаасдсадд	бсабадсдас	1020
дббдссдаба	асддбасасб	дббссбдддс	абссбдаааа	асбддааада	адаабсадаб	1080
сдбаааабса	бдсаабссса	дабсдбдбсс	ббсбасббса	аасбдббсаа	ааасббсааа	1140
дасдассадб	саабссадаа	абсадбддаа	асдаббааад	аадабабдаа	сдбсаааббс	1200
ббсааббсаа	асаааааааа	асдсдасдас	ббсдадааас	бдасдаабба	ббсадббасс	1260
дабсбдаасд	бдсаасдсаа	адссабссаб	дадсбдабсс	аддббабддс	сдаасбдадб	1320
ссддсадсаа	ааассддбаа	асдбааасдб	адссадабдс	бдбббсдб		1368

<210> 44 <211> 538 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> нет

<400>

44

Суз 1

Азр

Ьеи

Рго

С1п 5

ТЬг

Нгз

Зег

Ьеи

С1у 10

Зег

Агд

Агд

ТЬг

Ьеи 15

Меб

Ьеи

Ьеи

А1а

О1п 20

Меб

Агд

Агд

Не

Зег 25

Ьеи

РЬе

Зег

Суз

Ьеи 30

Ьуз

Азр

Агд

Нгз

Азр 35

РЬе

01 у

РЬе

Рго

О1п 40

С1и

С1 и

РЬе

С1 у

Азп 45

С1 п

РЬе

О1п

Ьуз

А1а 50

С1и

ТЬг

Не

Рго

Уа1 55

Ьеи

Нгз

С1и

Меб

Не 60

О1п

С1п

Не

РЬе

- 65 024452

Азп Ьеи РЬе Зег ТЬг Ьуз Азр Зег Зег АЬа АЬа Тгр Азр СЬи ТЬг Ьеи 65 70 75 80

Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЬг СЬи Ьеи Туг СЬп 61п Ьеи Азп Азр Ьеи СЬи 85 90 95

АЬа Суз УаЬ 11е СЬп СЬу УаЬ СЬу УаЬ ТЬг СЬи ТЬг Рго Ьеи МеД Ьуз 100 105 110

СЬи Азр Зег Ые Ьеи АЬа УаЬ Агд Ьуз Туг РЬе СЬп Агд 11е ТЬг Ьеи 115 120 125

Туг Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Ьуз Туг Зег Рго Суз АЬа Тгр СЬи УаЬ УаЬ Агд 130 135 140

АЬа СЬи 11е МеД Агд Зех РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Азп Ьеи С1п СЬи Зег 145 150 155 160

Ьеи Агд Зег Ьуз СЬи С1у СЬу СЬу СЬу Зег Рго Ьеи СЬу Ьеи АЬа СЬу 165 170 175

Агд УаЬ УаЬ Агд Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬи Ьуз Зег Агд Ьеи Зег 180 185 190

СЬи СЬп Ьеи Азп ТЬг Зег Ьеи Зег РЬе Зег Агд МеД Ые СЬи АЬа Агд 195 200 205

УаЬ УаЬ СЬи Тгр АЬа Суз Рго Зег Туг Ьуз Ьуз СЬи Ьуз Ьеи Туг Ьеи 210 215 220

ТЬг Ые Агд СЬп РЬе Туг РЬе Агд УаЬ АЬа Ьеи Ые Зег Азр СЬи Ьуз 225 230 235 240

МеД Ьеи Рго ТЬг СЬи ТЬг УаЬ СЬу УаЬ СЬу СЬп Ые УаЬ Суз АЬа СЬи 245 250 255

Ьеи Азр Азп Ьеи СЬп СЬп Туг Ьеи СЬи ТЬг Туг РЬе Ьуз Азр Ьеи Ьеи 260 265 270

ТЬг СЬи Азр Тгр АЬа АЬа Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Зег РЬе Ьеи Азп РЬе 275 280 285

Ые СЬп СЬп Ые МеД СЬи НЬз Ьеи УаЬ Рго Ые ТЬг СЬи АЬа Ьуз СЬп 290 295 300

РЬе СЬп Азп СЬу РЬе СЬи СЬи СЬп Рго РЬе СЬу РЬе Азр НЬз Агд Азр 305 310 315 320

- 66 024452

Ьуз Ьеи Суз Зег РЬе Ьеи Зег 11е Агд Агд Меб 01п А1а Ьеи Ьеи Меб 325 330 335

Ьеи ТЬг Агд Агд Зег 51у Ьеи Зег Нхз ТЬг С1п Рго Ьеи Азр Суз Рго 340 345 350

Ьеи С1у Ьеи А1а С1у Агд Уа1 Уа1 Агд А1а Зег 61у Суз С1у Рго С1и 355 360 365

Рго Ьеи С1у Ьеи А1а С1у Агд Уа1 Уа1 Агд Уа1 А1а А1а Нхз 11е ТЬг 370 375 380

51у ТЬг Агд 61у Агд Зег Азп ТЬг Ьеи Зег Зег Рго Азп Зег Ьуз Азп 385 390 395 400

С1и Ьуз А1а Ьеи С1у Агд Ьуз 11е Азп Зег Тгр Е1и Зег Зег Агд Зег 405 410 415

61у Нхз Зег РЬе Ьеи Зег Азп Ьеи Нхз Ьеи Агд Азп С1у С1и Ьеи Уа1 420 425 430

Не ΗΪ5 61и Ьуз 51у РЬе Туг Туг 11е Туг Зег 61п ТЬг Туг РЬе Ахд 435 440 445

РЬе С1п С1и С1и Не Ьуз С1и Азп ТЬг Ьуз Азп Азр Ьуз С1п Меб Уа1 450 455 460

С1п Туг Не Туг Ьуз Туг ТЬг Зег Туг Рго Азр Рго Не Ьеи Ьеи Меб 465 470 475 480

Ьуз Зег А1а Агд Азп Зег Суз Тгр Зег Ьуз Азр А1а С1и Туг С1у Ьеи 485 490 495

Туг Зег Не Туг Ξΐη 51у <31у 11е РЬе С1и Ьеи Ьуз С1и Азп Азр Агд

500 505 510

Не РЬе Уа1 Зег Уа1 ТЬг Азп С1и ΗΪ3 Ьеи Не Азр Меб Азр Нхз С1и 515 520 525

А1а Зег РЬе РЬе 51у А1а РЬе Ьеи Уа1 С1у 530 535 <210> 45 <211> 384 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> нет

- 67 024452

<400> 45

Зег 1

Азр

Ьеи

Рго

61 п 5

ТЬг

НЬз

Зег

Ьеи

С1у 10

Азп

Агд

Агд

А1а

Ьеи 15

Не

Ьеи

Ьеи

А1а

О1п 20

Меб

Агд

Агд

Не

Зег 25

Рго

РЬе

Зег

Суз

Ьеи 30

Ьуз

Азр

Агд

Шз

Азр 35

РЬе

51 у

РЬе

Рго

01 п 40

51 и

б1и

РЬе

Азр

61 у 45

Азп

01п

РЬе

61п

Ьуз 50

А1а

С1п

А1а

Не

Зег 55

Уа1

Ьеи

НЬз

б1и

Меб 60

11е

61п

С1п

ТЬГ

РЬе 65

Азп

Ьеи

РЬе

Зег

ТЬг 70

Ьуз

Азр

Бег

Зег

А1а 75

А1а

Тгр

Азр

С1и

Зег 80

Ьеи

Ьеи

01 и

Ьуз

РЬе 85

Туг

ТЬг

61 и

Ьеи

Туг 90

61п

61п

Ьеи

Азп

Азр 95

Ьеи

61и

А1а

Суз

Уа1 100

Не

С1п

01 и

Уа1

01 у 105

Уа1

61 и

61и

ТЬг

РГО НО

Ьеи

Меб

Азп

Уа1

Азр 115

Зег

Не

Ьеи

А1а

Уа1 120

Ьуз

Ьуз

Туг

РЬе

С1п 125

Агд

Не

ТЬг

Ьеи

Туг 130

Ьеи

ТЬг

С1и

Ьуз

Ьуз 135

Туг

Зег

Рго

Суз

А1а 140

Тгр

61 и

Уа1

Уа1

Агд 145

А1а

61 и

Не

Меб

Агд 150

Зег

РЬе

Зег

Не

Зег 155

ТЬг

Азп

Ьеи

61 п

61 и 160

Агд

Ьеи

Агд

Агд

Ьуз 165

01и

01у

01 у

Зег

С1у 170

Рго

Ьеи

61у

Ьеи

А1а 175

61 у

Агд

Уа1

Уа1

Агд 180

А1а

Зег

σι у

Суз

61у 185

Рго

61 и

Рго

Ьеи

61 у 190

Ьеи

А1а

61у

Агд

Уа1 195

Уа1

Агд

ТЬг

Зег

С1и 200

01 и

ТЬГ

Не

Зег

ТЬг 205

Уа1

61п

61 и

Ьуз

С1п 210

С1п

Азп

Не

Зег

Рго 215

Ьеи

Уа1

Агд

01 и

Агд 220

51 у

Рго

01 п

Агд

Уа1 225

А1а

А1а

Ηί5

Не

ТЬг 230

σι у

ТЬг

Агд

б1у

Агд 235

Зег

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег 240

Зег

Рго

Азп

5ег

Ьуз 245

Азп

61и

Ьуз

А1а

Ьеи 250

σι у

Агд

Ьуз

Не

Азп 255

Зег

- 68 024452

Тгр

61 и

Зег

зег 260

Агд

Зег

61у

НЬз

Зег 265

РЬе

Ьеи

Зег

Азп

Ьеи 270

НЬз

Ьеи

Агд

Азп

61 у 275

61 и

Ьеи

Уа1

Не

НЬз 280

61и

Ьуз

61у

РЬе

Туг 285

Туг

Не

Туг

Зег

61 п 290

ТЬг

Туг

РЬе

Агд

РЬе 295

61п

61и

61 и

11е

Ьуз 300

61и

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп 305

Азр

Ьуз

61 п

Мер

УаЬ 310

61п

Туг

Не

Туг

Ьуз 315

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Рго 320

Азр

Рго

Не

Ьеи

Ьеи 325

Мер

Ьуз

Зег

АЬа

Агд 330

Азп

Зег

Суз

Тгр

Зег 335

Ьуз

Азр

А1а

61и

Туг 340

61у

Ьеи

Туг

Зег

Не 345

Туг

61п

61у

61 у

Не 350

РЬе

61 и

Ьеи

Ьуз

61 и 355

Азп

Азр

Агд

Не

РЬе 360

УаЬ

Зег

Уа1

ТЬг

Азп 365

61 и

НЬз

Ьеи

Не

Азр 370

Мер

Азр

НЬз

61 и

А1а 375

Зег

РЬе

РЬе

61 у

АЬа 380

РЬе

Ьеи

Уа1

С1у

<210> 46 <211> 351 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> нет <400> 46

Суз 1

Азр

Ьеи

Рго

61п 5

ТЬг

НЬз

Зег

Ьеи

СЬу 10

Зег

Агд

Агд

ТЬг

Ьеи 15

МеР

Ьеи

Ьеи

АЬа

61п 20

Мер

Агд

Агд

Не

Зег 25

Ьеи

РЬе

Зег

Суз

Ьеи 30

Ьуз

Азр

Агд

НЬз

Азр 35

РЬе

61у

РЬе

Рго

61 п 40

61и

61и

РЬе

61 у

Азп 45

61 п

РЬе

61п

Ьуз

АЬа 50

61и

ТЬг

Не

Рго

Уа1 55

Ьеи

НЬз

61и

Мер

Не 60

61п

61п

Не

РЬе

Азп 65

Ьеи

РЬе

Зег

ТЬг

Ьуз 70

Азр

Зег

Зег

А1а

А1а 75

Тгр

АЗр

61и

ТЬг

Ьеи 80

Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЬг СЬи Ьеи Туг СЬп СЬп Ьеи Азп Азр Ьеи СЬи 85 90 95

АЬа Суз УаЬ 11е 61п СЬу УаЬ СЬу УаЬ ТЬг СЬи ТЬг Рго Ьеи МеД Ьуз 100 105 110

СЬи Азр Зег 11е Ьеи АЬа УаЬ Агд Ьуз Туг РЬе СЬп Ахд 11е ТЬг Ьеи 115 120 125

Туг Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Ьуз Туг Зег Рго Суз АЬа Тгр СЬи УаЬ УаЬ Агд 130 135 140

АЬа СЬи Ые МеД Агд Зег РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Азп Ьеи СЬп СЬи Зег 145 150 155 160

Ьеи Агд Зег Ьуз СЬи СЬу СЬу СЬу СЬу Зег Рго Ьеи СЬу Ьеи АЬа СЬу 165 170 175

Агд УаЬ УаЬ Агд Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬи Ьуз Зег Агд Ьеи Зег 180 185 190

СЬи СЬп Ьеи Азп ТЬг Зег Ьеи Зег РЬе Зег Агд МеД Ые СЬи АЬа Агд 195 200 205

УаЬ УаЬ СЬи Тгр АЬа Суз Рго Зег Туг Ьуз Ьуз СЬи Ьуз Ьеи Туг Ьеи 210 215 220

ТЬг Ые Агд СЬп РЬе Туг РЬе Агд УаЬ АЬа Ьеи Ые Зег Азр СЬи Ьуз 225 230 235 240

МеД Ьеи Рго ТЬг СЬи ТЬг УаЬ СЬу УаЬ СЬу СЬп Ые УаЬ Суз АЬа СЬи 245 250 255

Ьеи Азр Азп Ьеи СЬп СЬп Туг Ьеи СЬи ТЬг Туг РЬе Ьуз Азр Ьеи Ьеи 260 265 270

ТЬг СЬи Азр Тгр АЬа АЬа Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Зег РЬе Ьеи Азп РЬе 275 280 285

Ые СЬп СЬп Ые МеД СЬи НЬз Ьеи УаЬ Рго Ые ТЬг СЬи АЬа Ьуз 61п 290 295 300

РЬе СЬп Азп СЬу РЬе СЬи СЬи СЬп Рго РЬе СЬу РЬе Азр НЬз Агд Азр 305 310 315 320

Ьуз Ьеи Суз Зег РЬе Ьеи Зег Ые Агд Ахд МеД СЬп АЬа Ьеи Ьеи МеД 325 330 335

- 70 024452

Ьеи ТЬг Агд Агд

Зег

СЬу

Ьеи

Зег

НЬз 345

ТЬг

С1п

Рго

Ьеи

Азр 350

Суз

340

<210>

47

<211>

166

<212> :

БЕЛОК

<213> 1

Искусственная последовательность

<220>

<223> ;

нет

<400>

47

Зег Азр

Ьеи Рго

С1п

ТЬг

НЬз

Зег

Ьеи

СЬу

Азп

Агд

Агд

АЬа

Ьеи 11е

1

5

10

15

Ьеи Ьеи

АЬа 61п

Мек

Агд

Агд

Не

Зег

Рго

РЬе

Зег

Суз

Ьеи

Ьуз Азр

20

25

30

Агд НЬз

Азр РЬе

СЬу

РЬе

Рго

СЬп

С1и

СЬи

РЬе

Азр

СЬу

Азп

61п РЬе

35

40

45

СЬп Ьуз

АЬа СЬп

А1а

Не

Зег

УаЬ

Ьеи

НЬз

61 и

Мек

Не

СЬп

61п ТЬг

50

55

60

РЬе Азп

Ьеи РЬе

Зег

ТЬг

Ьуз

Азр

Зег

Зег

А1а

А1а

Тгр

Азр

СЬи Зег

65

70

75

80

ьеи ьеи

СЬи ьуз

РЬе

туг

ТЬГ

СЬи

ьеи

Туг

СЬп

СЬп

Ьеи

Азп

Азр Ьеи

85

90

95

С1и АЬа

Суз УаЬ

Не

СЬп

СЬи

УаЬ

01 у

Уа1

СЬи

СЬи

ТЬг

Рго

Ьеи Мек

100

105

110

Азп Уа1

Азр Зег

Не

Ьеи

АЬа

УаЬ

Ьуз

Ьуз

Туг

РЬе

С1п

Агд

Не ТЬг

115

120

125

Ьеи Туг

Ьеи ТЬг

СЬи

Ьуз

Ьуз

Туг

Зег

Рго

Суз

АЬа

Тгр

СЬи

УаЬ УаЬ

130

135

140

Агд А1а

СЬи Не

Мек

Агд

Зег

РЬе

Зег

Не

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи

СЬп СЬи

145

150

155

160

Агд Ьеи

Агд Агд

Ьуз

СЬи

165 <210> 48 <211> 1614 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 71 024452 <223> нет <400> 48

рдрдарррас	сасааасаса	РРсаРРадда	Рсаадаадаа	саРРааРдРР	аРРадсасаа	60
аРдадаадаа	РаРсаРРаРР	РРсаРдРРРа	ааддарадас	аРдаРРРРдд	аРРРссасаа	120
даадааРРРд	дааарсаарр	Рсааааддса	дааасааРас	садРдРРаса	РдаааРдаРа	1В0
саасаааРаР	рраарррарр	РРсаасааад	даРРсаРсад	садсаРддда	РдааасарРа	240
РРадаРаадР	РРРаРасада	аРРаРаРсаа	сааРРаааРд	аРРРадаадс	аРдРдРдаРа	300
сааддадрдд	дадрдасада	аасассаРРа	аРдааддаад	аРРсааРаРР	адсадрдада	360
аадРаРРРРс	ааадааРаас	аРРаРаРРРа	ааддаааада	адРарРсасс	аРдРдсаРдд	420
даадрддрда	дадсадаааР	аардадаРса	РРРРсаРРаР	саасаааРРР	асаадааРса	480
рраадарсаа	аддааддадд	аддаддаРса	ссаРРаддаР	Радсаддаад	адрддрдада	540
Рсаддаддад	даддаРсада	ааадРсаада	РРаРсадаас	ааРРаааРас	аРсаРРаРса	600
РРРРсаадаа	рдарадаадс	аададрддрд	дааРдддсаР	дРссаРсаРа	Раадааддаа	660
аадРРаСаРС	РаасааРаад	асааРРРРаР	РРРададРдд	саСРааРаРс	адаРдаааад	720
аРдРРассаа	садааасадр	дддадрддда	сааарадрдр	дрдсадаарр	адаРаарРРа	780
саасааРаРС	РадааасаРа	РРРРааддаР	РРаРРаасад	аадаРРдддс	адсаРсаРса	840
даРаадасаР	сарррррааа	РРРРаРасаа	саааРааРдд	аасаРРРадР	дссааРааса	900
даадсааадс	ааРРРсаааа	РддаРРРдаа	даасаассар	ррддарррда	РсаРададаР	960
аадРРаРдРР	саРРРРРаРс	ааРаадаада	аРдсаадсаР	РаРРааРдРР	аасаадаада	1020
РсаддаРРаР	сасаРасаса	ассаРРадаР	РдРссаРРад	даРРадсадд	аададрддрд	1080
ададсаРсад	даРдРддасс	адаассаРРа	ддаРРадсад	даададрддр	дададрддса	1140
дсасаРаРаа	саддаасаад	аддаадаРса	ааРасаРРаР	сагсассааа	РРсааадааР	1200
дааааддсаР	Раддаадааа	даРаааРРса	РдддааРсаР	саадаРсадд	асаРРсаРРР	1260
РРаРсаааРР	РасаРРРаад	аааРддадаа	РРадРдаРас	аРдааааддд	аРРРРаРРаР	1320
аРаРаРРсас	ааасаРаРРР	РадаРРРсаа	даадаааРаа	аддааааРас	ааадааРдаР	1380
аадсаааРдд	РдсааРаРаР	аРаРаадРаР	асаРсаРаРс	садаРссааР	аРРаРРааРд	1440
аадРсадсаа	даааРРсаРд	РРддРсааад	даРдсадааР	аРддаРРаРа	РРсааРаРаР	1500
сааддаддаа	РаРРРдааРР	аааддааааР	даРадааРаР	РРдРдРсадР	дасаааРдаа	1560
саРГГааРад	аРаРддаРса	РдаадсаРса	РРРРРРддад	саРРРРРадР	ддда	1614

<210> 49 <211> 1152 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 72 024452 <223> нет <400> 49

ссада£££ас	сасааасаса	С£са££адда	аабадаадад	саббаабабб	аббадсасаа	60
абдадаадаа	ЬаЕсассаЪЪ	£6036916,1:=1	ааддабадас	абдаббббдд	абббссасаа	120
даадаа£££д	а£ддааа£са	абббсаааад	дсасаадсаа	бабсадбдбб	асабдааабд	180
аНасаасааа	са£££аа£££	аббббсааса	ааддаббсаС	садсадсабд	ддабдаабса	240
££а££адааа	ад£С££а£ас	адааббабаб	саасааббаа	абдабббада	адсабдбдбд	300
асасаадаад	бдддадЪдда	адааасасса	ббаабдаабд	бддаббсааб	аббадсадбд	360
аадаадЪаЪЪ	££сааадаа£	аасаббабаб	ббаасадааа	адаадбаббс	ассабдбдса	420
ЪдддаадЪдд	Ьдададсада	аабаабдада	бсаббббсаа	Ьабсаасааа	бббасаадаа	4В0
адассаадаа	даааддаадд	аддабсадда	ссаббаддаб	бадсаддаад	адбддбдада	540
дсабсаддаб	дЪддассада	ассаббадда	Ъбадсаддаа	дадбддбдад	аасабсадаа	600
дааасааЬаЬ	саасадбдса	адаааадсаа	саааабабаб	сассаббадб	дададааада	660
ддассасааа	дадСддсадс	асабабааса	ддаасаадад	даадабсааа	басаббабса	720
ЪсассаааЬС	сааадааЪда	аааддсабба	ддаадааада	баааббсабд	ддаабсабса	780
адабсаддас	аЬЬса£££££	абсаааббба	сабббаадаа	абддадаабб	адбдабасаб	840
даааадддаС	£££а££а£а£	абаббсасаа	аса£а££66а	дабббсаада	адааабааад	900
дааааЪасаа	адаабдабаа	дсааабддбд	саабабабаб	абаадбабас	абсабабсса	960
да£ссаа£а£	Ъа££аа£даа	дбсадсаада	ааббсабдбб	ддСсааадда	бдсадаабаб	1020
дда££аса££	сааСаСаЪса	аддаддааба	бббдааббаа	аддаааабда	бадаабаббб	1080
дЬдбсадЪда	сааабдааса	бббаабадаб	абддабсабд	аадсабсабб	ббббддадса	1140
ЬЪЬбЬадбдд	да					1152

<210> 50 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> нет <400> 50

С1у С1у 5ег С1у

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Слитый белок, содержащий домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент белковой последовательности йТРАХЬ, начинающийся аминокислотой в положении не ниже чем НТРАК95, или гомолог указанного функционального фрагмента, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью последовательности; и домен (Ь), который представляет собой последовательность иммуностимулирующего эффекторного пептида, выбранного из группы, состоящей из псевдодимера интерферона-гамма с 8Ер. №. 19 и псевдодимера интерферона альфа 2Ь с 8Ер. №. 46, где последовательность домена (Ь) присоединена к С-концу или Ν-концу домена (а).
2. 2. Слитый белок по п.1, где домен (а) содержит фрагмент белковой последовательности НТРАК которая начинается аминокислотой из диапазона от НТРАК95 до йТКΑI^122 включительно и оканчивается аминокислотой НТРАК281.
3. 3. Слитый белок по п.1 или 2, где домен (а) выбран из группы, состоящей из фрагментов начинающихся аминокислотой в положении 95, 116, 120, 121 или 122.
4. 4. Слитый белок по любому из пп.1-3, который между доменом (а) и доменом (Ь) содержит по меньшей мере один домен (с), содержащий участок расщепления протеазами, выбранный из группы, состоящей из последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, и их комбинаций.
5. 5. Слитый белок по п.4, где последовательность, распознаваемая металлопротеазой ММР, представляет собой 5>Ер. №. 20, и последовательность, распознаваемая урокиназой иРА, представляет собой ЛУ). №. 21.
6. 6. Слитый белок по п.4 или 5, где домен (с) представляет собой комбинацию последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, расположенных рядом друг с другом.
7. 7. Слитый белок по любому из пп.4-6, который между двумя доменами (с) содержит домен (й) линкера для присоединения молекулы РЕО, выбранного из группы, состоящей из 8Ер. №. 22, 8Ер. №. 23, КС). №. 24 и КС). №. 25.
8. 8. Слитый белок по любому из пп.4-7, который дополнительно содержит глицин-сериновый гибкий пространственный линкер между доменами (а), (Ь), (с) и/или (й).
9. 9. Слитый белок по п.8, где глицин-сериновый линкер выбран из группы, состоящей из КО. №. 26, КС). №. 27, КС). №. 28 и КС). №. 50.
10. 10. Слитый белок по п.1, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из КС). №. 12, КС). №. 13, КС). №. 14, КС). №. 15 и КС). №. 44.
11. 11. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, который представляет собой рекомбинантный белок.
12. 12. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок по любому из пп.1-11 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
13. 13. Фармацевтическая композиция по п.12 в форме для парентерального введения.
14. 14. Способ лечения раковых заболеваний у млекопитающего, в том числе человека, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного против рака количества слитого белка по пп.1-11 или фармацевтической композиции по п.12 или 13.