EA028151B1

EA028151B1 - Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Info

Publication number: EA028151B1
Application number: EA201300313A
Authority: EA
Inventors: Владимир Константинович БОЖЕНКО; Владимир Константинович Боженко
Original assignee: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "МетаМакс" (ООО "МетаМакс")
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2017-10-31
Also published as: JP2016520547A; EA201300313A1; EP2982682A1; WO2014163535A1

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к новым вариантам последовательностей химерного пептида, включающего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17, а также гомологичных им на 60% и более последовательностей; а также к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, представленному аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17, а также гомологичных им на 60% и более последовательностей. Изобретение также относится к применению вышеуказанного химерного пептида для лечения онкологических заболеваний, а также к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, и способу лечения онкологических заболеваний, включающему введение указанного химерного пептида нуждающемуся в таком лечении млекопитающему. Изобретение позволяет создать лекарственный препарат, эффективно проникающий в клетки-мишени и обладающий высоким цитостатическим и цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток.

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к новым последовательностям химерного пептида, включающего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы ЗЕЦ ГО N0: 1 - ЗЕЦ ГО N0: 17, а также гомологичных им на 60% и более последовательностей; а также к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, представленному аминокислотной последовательностью, выбранной из группы ЗЕЦ ГО N0: 1 - ЗЕЦ ГО N0: 17, а также гомологичных им на 60% и более последовательностей.

Изобретение также относится к применению вышеуказанного химерного пептида для лечения онкологических заболеваний, а также к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью и способу лечения онкологических заболеваний, включающему введение указанного химерного пептида нуждающемуся в таком лечении млекопитающему. Задачей изобретения является разработка препарата, эффективно проникающего в клетки-мишени и обладающего высоким цитостатическим и цитотоксическим действием.

Уровень техники

С начала 90-х годов в России ежегодно диагностируют более 400 тысяч случаев злокачественных новообразований (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2008). При этом в Европе ежегодная смертность от онкологических заболеваний за период с 1985 г. по 2002 г. продолжает расти. В структуре причин смертности онкологические заболевания занимают 2-е место после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Поэтому поиск новых лекарственных противоопухолевых препаратов является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.

В настоящее время большое количество работ посвящено созданию новых лекарственных противоопухолевых препаратов на основании достижений молекулярной биологии (КзсЬагб ЕР. е! а1., 2003; Таке8Ыша К. е! а1., 2003; 1уойка А. е! а1., 2005, Копнин Б.П., 2000). Общепринято, что основополагающим признаком неопластической клетки является нарушение регуляции клеточного цикла и апоптоза (С1арршк Р.0., Карик!а Ь., 2005). Известно, что регуляция процессов пролиферации клетки контролируется путем последовательной активации циклинов и соответствующих циклинзависимых киназ (СИК). Активность циклиновых киназ определяется уровнем экспрессии соответствующих циклинов и активностью специфических ингибиторов циклиновых киназ (Как!ап М.В., Вайек 1., 2004). Имеется несколько семейств ингибиторов циклиновых киназ. Наиболее изученными и практически важными из них являются - р161ИК4а, р21С1Р/К1Р, р27 К1Р1 (Боте ЗЛУ. е! а1., 2004). Мутации или гиперметилирование промоторов генов ингибиторов циклиновых киназах наблюдаются в 40-60% случаев злокачественных лимфом, раке поджелудочной железы и ряде других злокачественных новообразований (За\\уег5 С., 2004; 0йеда 3. е! а1., 2002).

Основываясь на этих результатах был синтезирован ряд низкомолекулярных ингибиторов циклиновых киназ. Другим, возможным направлением, для создания ингибиторов циклиновых киназ может быть использование функциональных последовательностей из соответствующих внутриклеточных ингибиторов (21ед1ег А. е! а1., 2005). Белок р16ГОК4а является одним из наиболее интересных кандидатов группы ингибиторов Сбк (Хи Ό. е! а1., 2004; Ζΐιηηβ Υ. е! а1., 2005). Известно, что белок р16ГОК4а ингибирует циклинзависимые киназы Ό и тем самым прохождение 01 фазы клеточного цикла (Ей О.Н. е! а1., 2005; Веп-Заабоп К. е! а1., 2004). Показано, что его функция нарушена при широком спектре онкологических заболеваний (Ы ЕЦ. е! а1., 2004). В последнее время стали появляться экспериментальные работы, описывающие применение гена р161М<4а для генной терапии опухолей различного генеза (Ьее А.У.С., Ы 1-Н е!. а1., 2003; Ьщ З.Х., Тапд З.Ц., Ыаид ΟΥ., 2003; Ζ1κιη§ Υ., Ьщ 1. е! а1., 2005). Дополнительным мотивом к поиску технологий применения естественных белковых ингибиторов пролиферации стало открытие коротких последовательностей аминокислот (п=15-30), способных выполнять векторные (транспортные) функции в отношении пептидных последовательностей и соединений другой химической природы (РНК, ДНК) (Еате11 3., Зеегу 1. е! а1., 1994; УАек Е., Вгобт Р., ЬеЫеи В. 1997; Кар1ап 1.М. е! а1., 2005; 0ир!а В. е! а1., 2005; Регпапбе/-Сагпеабо 1. е! а1., 2005).

До настоящего времени проблему восстановления нарушенной функции внутриклеточных белков пытались решать на основе методов доставки гена (генная терапия) (Георгиев Г.П. 2000; Уепбег Р.А. е! а1., 2000; Барышников А.Ю. 2004). Однако эта технология до настоящего времени не получила широкого выхода в клиническую практику из-за ряда принципиальных проблем.

Альтернативный способ решения этой задачи, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы.

Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул имеющих патогенетическую направленность (Зс1ш1/е-Ребе1те1ег М.Р. е! а1., 2004; ТгеЫп К., Мегк1е Н.Р., 2004; Сопд-Ме1 Уи е! а1., 2004). Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной возможности создания индивидуальных химиопрепаратов на их

- 1 028151 основе, т.е. влияющих на патологические изменения свойственных данной конкретной опухоли (Регеа δ.Ε. е! а1., 2004).

Открытие пептидов, способных проникать в клетку без участия мембранных белков и способных осуществлять внутриклеточный транспорт связанных с ними белковых фрагментов и олигонуклеотидов, открывает новый этап в развитии биологии и медицины. Одним из эффективных переносчиков крупных молекул внутрь клеток является пептид рАп!р. Его свойства известны, в частности, из публикаций Эего551 Ό. е! а1., ТНе !Ηίτά НеП.х οί Ше Ап!еппареФа Ношеобаташ 1тапз1оса!е8 !НгоидН тетЬгапез.// ί. Βίο1. СНет. 269 (1994), 10444-10450 и Μοττίδ М.С. е! а1., А рерНбез сатег ίοτ !Не беНуегу οί Ью1одюа11у асйуе рто1еш8 ш таттаПап се118.//Ыа!. Вю!есНпо1оду. 19 (2001), 1173-1176.

По мнению автора, наиболее близким аналогом настоящего изобретения является патент И8 6569833 В1 (Сус1асе1 ЫтЛеб, ОВ). В этом документе раскрываются пептиды, которые связываются с циклиновыми киназами и включают аминокислотные остатки 84-103 полноцепочечного белка р16 и могут быть объединены с последовательностью транспортного белка пенетратина посредством дисульфидной связи, образующейся между остатками цистеина, специально присоединенными к С-концу пептида р16 и Ν-концу пептида Ап!р. Недостатком данного подхода является необходимость избирательного и многоступенчатого синтеза химерной молекулы, что усложняет схему получения целевого продукта и увеличивает общие временные затраты на синтез.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины.

Задачей изобретения является создание нового химерного пептида, обладающего повышенным терапевтическим действием и не требующего сложной и трудоемкой схемы его получения.

Техническим результатом настоящего изобретения является улучшенный медико-биологический эффект, объективно проявляющийся в выраженном цитотоксическом действии указанного химерного пептида в сравнении с другими аналогичными пептидами на опухолевые клетки таких заболеваний, как колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка рак яичника, миеломы, злокачественной лимфомы, а также фиброаденомы молочной железы, кроме того упрощение схемы получения химерного пептида за счет уменьшения общего количества стадий. Вторым техническим результатом является расширение арсенала лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний. Кроме того, автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил выраженный синергетический эффект при совместном использовании вышеуказанного химерного пептида с уже существующими химиотерапевтическими противоопухолевыми препаратами (этопозид, таксол и 5-фторурацил).

Технический результат достигается благодаря получению химерного пептида с антипролиферативной активностью, содержащего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1 или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 2, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 3, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 4, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 5, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 6, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 7, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 8, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 9, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 10, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 11, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 12, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 13, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 14, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 15, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 16, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 17, а также гомологичные им на 60% и более последовательности.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, включающему аминокислотную последовательность δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 2, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 3, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 4 δΕφ ΙΌ ΝΟ: 5, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 6, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 7, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 8, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 9, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 10, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 11, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 12, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 13, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 14, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 15, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 16, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 17, а также гомологичные им на 60% и более последовательности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению указанного химерного пептида для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения онкологических заболеваний.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному пептиду, включающему функциональный пептид, представленный аминокислотной последовательностью δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 2, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 3, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 4.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду, представленному аминокислотной последовательностью δΕφ ΙΌ ΝΟ: 1, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 2, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 3, или δΕφ ΙΌ ΝΟ: 4.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному пептиду, который может быть использован для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления химерный пептид может быть использован для лечения колоректального рака.

- 2 028151

В предпочтительном варианте осуществления указанное лекарственное средство может применяться для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, которая включает в качестве терапевтически активного вещества вышеуказанный химерный пептид или функциональный пептид в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, которая содержит два активных вещества, где первым активным веществом является вышеуказанный химерный пептид или функциональный пептид, а в качестве второго активного вещества может выступать химиотерапевтическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей алкилирующие препараты, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, противоопухолевые антибиотики, производные платины, производные камптотецина, альтретамин, амсакрин, Ь-аспарагиназу, дакарбазин, эстрамустин, гидроксикарбамид, прокарбазин, темозоломид, моноклональные антитела, гормоны, цитокины.

В предпочтительном варианте осуществления в указанной фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, в качестве второго активного вещества может выступать химиотерапевтическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей этопозид, таксол и 5-фторурацил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения онкологического заболевания, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного химерного пептида, или фармацевтической композиции, или лекарственного препарата.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.

Используемый в настоящем документе термин химерный пептид включает в себя пептид имеющий определенную последовательность связывания функционального и транспортного фрагментов в химерной пептидной молекуле любой последовательностью любой длины, в том числе посредством дополнительных аминокислотных остатков (от 1 до 50), связывающих между собой два вышеуказанных фрагмента, при этом транспортная аминокислотная последовательность, как вариант, может быть присоединена к С-концу указанной функциональной последовательности посредством группы X, где X представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 50 аминокислотных остатков. Методы получения химерного пептида включают в себя как твердофазный метод, представленный в документах Κϋ 2297241, 22.11.2004 и Κϋ 2435783, 29.09.2010, так и генно-инженерный метод, представленный в документах Κϋ 2297241, 22.11.2004 и Κϋ 2435783, 29.09.2010. Исследование свойств данных химерных пептидов приведены в документе Κϋ 2435783.

Структура исследуемых интернализируемых пептидов.

ρ16_ρΑηίρ(3)

КО5-ОААКЕОР1ГОТЬУУЬНКАОАК.

ΝΗ2ΚςίΚΙΨΡρΝΚΚΜΚλνΚΚ - соон

ЗЕКККОКЦТУТКУЦТЬ ЕЬЕКЕРНРИКУЬТККК К1Е1АНАЬСЬТЕПептиды 1-3 состоят из функциональной части р16!\К4а и интернализуемой последовательности ρΆηίρ и отличаются по местоположению функциональной группы относительно Ν-, С-концов молекулы и по наличию вставки для пептида 3 (получен генно-инженерным методом).

- 3 028151

Пептиды р16 ρΑη!ρ(1-2) отличаются местоположением функциональной группы ρ16ΙΝΚ4α: пептид 1 - ρ16INΚ4а расположен на С-конце молекулы, пептид 2 - ρ16INΚ4а расположен на Оконце, пептиды получены методом твердофазного синтеза. В случае химерного пептида р16 ρΆηίρ(3), полученного генно-инженерным методом, функциональная группа ρ16ΙΝΚ4α располагается на Ν-конце, но имеется вставка из 44 АКО.

Используемый в настоящем документе термин функциональный фрагмент представляет любую полипептидную последовательность любого размера или любую структуру или молекулу для выполнения функций заявленных в данном документе, включающую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1, или 8ЕЦ ГО N0: 2, или 8ЕЦ ГО N0: 3, или 8ЕЦ ГО N0: 4, или 8ЕЦ ГО N0: 5, или 8ЕЦ ГО N0: 6, или 8ЕЦ ГО N0: 7, или 8ЕЦ ГО N0: 8, или 8ЕЦ ГО N0: 9, или 8ЕЦ ГО N0: 10, или 8ЕЦ ГО N0: 11, или 8ЕЦ ГО N0: 12, или 8ЕЦ ГО N0: 13, или 8ЕЦ ГО N0: 14, или 8ЕЦ ГО N0: 15, или 8ЕЦ ГО N0: 16, или 8ЕЦ ГО N0: 17, а также гомологичные им на 60% и более последовательности.

Используемый в настоящем документе термин антипролиферативная активность включает в себя способность ингибиторов циклиновых киназ или композиций, включающих ингибиторы циклиновых киназ, оказывать цитостатический и цитотоксический эффект на клетки злокачественной и доброкачественной опухоли.

Используемый в настоящем документе термин транспортная последовательность включает в себя любую транспортную последовательность. Любая транспортная последовательность может быть использована при условии, что заявленная функциональная последовательность, включенная в любую другую полипептидную последовательность любого размера или любую другую структуру или молекулу, выполняет функции, указанные в настоящем документе. Могут быть использованы в том числе и последовательности пептида ΥΡ22 (ρΑηΐρ) вируса простого герпеса в качестве транспортного агента для переноса ингибитора циклиновых киназ внутрь целевых клеток, например К.р1К1^ррМККМК^КК (8ЕЦ ГО N0: 6), а также последовательности пептида Та!. Та! - белок, выполняющий трансактиваторную функцию у вируса СПИДа.

Используемый в настоящем документе термин фармацевтическая композиция включает в себя композицию, содержащую химерный пептид или функциональный пептид, а также может включать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения фармацевтически приемлемый носитель может включать связующие вещества, смачивающие агенты, дезинтеграторы, наполнители, солюбилизаторы, диспергирующие агенты, стабилизаторы, суспендирующие агенты, красители и ароматизаторы. Для инъецируемых препаратов фармацевтически приемлемый носитель может включать буферные агенты, консерванты, аналгетики, солюбилизаторы, изотонические агенты и стабилизаторы. Для препаратов местного применения фармацевтически приемлемый носитель может включать основания, наполнители, замасливатели и консерванты. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть получены в виде различных лекарственных форм с использованием вышеуказанных фармацевтически приемлемых носителей. Так, например, для перорального введения, фармацевтическая композиция может быть получена в виде таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Для препаратов, вводимых инъекцией, фармацевтическая композиция может быть получена в виде разовой лекарственной формы, такой как флакон, содержащий лекарственные средства для многократного приема, или ампула для введения одной дозы. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде растворов, суспензий, таблеток, капсул и препаратов пролонгированного действия.

С другой стороны, примерами носителей, наполнителей и разбавителей, подходящих для приготовления фармацевтических препаратов, являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтит, крахмал, аравийская камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтические препараты могут включать наполнители, антикоагулянты, замасливатели, увлажнители, отдушки, эмульгаторы и антисептики.

В основном доза лекарственного средства настоящего изобретения, используемого в качестве носителя, может быть определена в зависимости от нескольких факторов, включая, тип заболевания, подвергаемого лечению, способ введения, возраст, пол и вес пациента, тяжесть заболевания пациента, а также тип лекарственного средства, используемого в качестве активного компонента.

Используемый в настоящем документе термин алкилирующие препараты включает в себя:

1) алкилсульфонаты (бусульфан, треосульфан);

2) этиленимины (тиотепа);

3) производные нитрозомочевины (кармустин, ломустин, мюстофоран, нимустин, стрептозотоцин);

4) хлорэтиламины (бендамустин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, трофосфамид).

Используемый в настоящем документе термин антиметаболиты включает в себя:

1) антагонисты фолиевой кислоты (метотрексат, ралитрексед);

2) антагонисты пурина (кладрибин, флударабин, 6-меркаптопурин, пентостатин, тиогуанин);

3) антагонисты пиримидина (цитарабин, 5-фторурацил, капецитабин, гемцитабин).

- 4 028151

Используемый в настоящем документе термин алкалоиды растительного происхождения включает в себя:

1) подофиллотоксины (этопозид, тенипозид);

2) таксаны (доцетаксел, паклитаксел);

3) винка-алкалоиды (винкристин, винбластин, виндезин, винорельбин).

Используемый в настоящем документе термин противоопухолевые антибиотики включает в себя:

1) антрациклины (даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон);

2) другие противоопухолевые антибиотики (блеомицин, дактиномицин, митомицин, пликамицин).

Используемый в настоящем документе термин производные платины включает в себя карбоплатину, цисплатину, оксалиплатину.

Используемый в настоящем документе термин производные камптотецина включает в себя иринотекан, топотекан.

Используемый в настоящем документе термин моноклональные антитела включает в себя эдерколомаб, ритуксимаб, трастузумаб.

Используемый в настоящем документе термин гормоны включает в себя:

1) антиандрогены (бикалутамид, ципротерона ацетат, флутамид);

2) антиэстрогены (тамоксифен, торемифен, дролоксифен);

3) ингибиторы ароматазы (форместан, анастрозол, экземестан);

4) прогестины (медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат);

5) агонисты ЬН-КИ (бусерелин, госерелин, лейпролеина ацетат, трипторелин);

6) эстрогены (фосфэстрол, полиэстрадиол).

Используемый в настоящем документе термин цитокины включает в себя:

1) факторы роста (филграстим, ленограстим, молграмостим, эритропоэтин, тромбопоэтин);

2) интерфероны (α-интерфероны, β-интерфероны, γ-интерфероны);

3) интерлейкины (интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-П).

Используемый в настоящем документе термин онкологическое заболевание включает в себя как злокачественные, так и доброкачественные опухоли.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Изменение уровня апоптоза (аннексин-положительных частиц) мононуклеаров крови при внесении в клеточную среду пептидов Ό37Κ, Р26К-1 и ХУ26К-1 в различных концентрациях, средние значения. Время инкубации 24 ч.

Фиг. 2. Изменение количества живых/интактных клеток при инкубации клеток мононуклеарной фракции крови здоровых доноров с исследуемыми пептидными последовательностями Ό37Κ, Р26К-1 и ХУ26К-1 в разных концентрациях. Время инкубации 24 ч.

Фиг. 3. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. Время инкубации 24 ч.

Фиг. 4. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток МСР-7 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. Время инкубации 24 ч.

Фиг. 5. Изменение количества погибших клеток, включающих йодистый пропидий, культура НСТ-116, инкубация с исследуемыми пептидными последовательностями 24 ч. Концентрации пептидов 5, 10, 20, 40 мкМ.

Фиг. 6. Изменение количества погибших клеток, включающих йодистый пропидий, культура МСР7, инкубация с исследуемыми пептидными последовательностями 24 ч. Концентрации пептидов 5, 10, 20, 40 мкМ.

Фиг. 7. Изменение относительного количества живых клеток в культуре НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями 24 ч. За 100% принято количество живых клеток в контрольном образце (20мкл ДМСО), концентрации исследуемых пептидов составляли 5, 10, 20, 40 мкМ.

Фиг. 8. Изменение количества живых клеток в культуре МСР-7 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями 24 ч. Концентрации исследуемых пептидов составляли 5, 10, 20, 40 мкМ.

Фиг. 9. Изменение количества клеток в фазах δ и О2/М при 24-часовой инкубации активно пролиферирующих клеток линий МСР-7 и НСТ-116 с пептидными последовательностями Ό37Κ, Р26К-1, Р26К-2, \У26К-1. \У26К-2 в концентрациях 10 и 40 мкМ.

Фиг. 10. Изменение уровня клеток в 00/01-фазе клеточного цикла в культуре НСТ-116 при инкубации синхронизованной культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.

Фиг. 11. Изменение уровня клеток в 00/01-фазе клеточного цикла в культуре МСР-7 при инкубации синхронизованной обедненной средой культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.

Фиг. 12. Изменение уровня клеток в 00/01-фазе клеточного цикла в культуре А549 при инкубации синхронизованной обедненной средой культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.

- 5 028151

Фиг. 13. Изменение уровня клеток в δ-фазе клеточного цикла в культуре А549 при инкубации синхронизованной обедненной средой культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.

Фиг. 14. Различия в уровне δ-фазы в культуре клеток А549 при времени инкубации 0, 4, 6 и 8 ч с пептидными последовательностями Р26К-1, ХУ26К-1 и Ό37Κ в концентрациях 40 мкМ.

Фиг. 15. Изменение количества клеток в С0/С1-фазе клеточного цикла при инкубации клеток линии δΚΟν с исследуемыми пептидами в течение 24 ч.

Фиг. 16. Изменение количества клеток в δ+02/М-фазах клеточного цикла при инкубации клеток линии δΚΟν с исследуемыми пептидами в течение 24 ч.

Фиг. 17. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток δΚΟν при инкубации с исследуемыми пептидами 24 ч, оцененный как гиподиплоидный пик на ДНК-гистограммах. Концентрации пептидов составляли 5, 10, 20, 30, 40 мкМ. Культура была предварительно синхронизована в С0/С1-фазе методом обедненной культуральной среды.

Фиг. 18. Изменение уровня белка Вс1-2 в клетках линии НСТ-116 при инкубации с последовательностями Ό37Κ, Р26К-1, Р26К-2, ХУ26К-1 и ^26К-2. Время инкубации 24 ч. При исследовании изменения уровня Вс1-2 было получено, что пептиды Ό37Κ и ХУ26К-1 оказывают минимальный эффект, снижая уровень Вс1-2-положительных клеток в культуре на 5% при инкубации 24 ч и концентрации пептидов 40 мкМ. Пептиды ХУ26К-2 и Р26К-1 снижали уровень Вс1-2 более 15%.

Фиг. 19. Изменение уровня фосфорилированного рКЬ в культуре МСР-7 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями Ό37Κ, Р26К-1, Р26К-2, ХУ26К-1 и ХУ26К-2. Время инкубации 24 ч. А - концентрация пептидов 10 мкМ, В - концентрация пептидов 40 мкМ.

Фиг. 20. Изменение уровня недофосфорилированного рКЬ в культуре клеток НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. А - концентрация пептидов 10 мкМ, В - концентрация пептидов 40 мкМ.

Фиг. 21. Изменение уровня недофосфорилированного рКЬ в культуре клеток δΚΟν при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. А - концентрация пептидов 10 мкМ, В - концентрация пептидов 40 мкМ.

Фиг. 22. Зависимость количества мертвых клеток линии НСТ-116 от концентрации лекарственных препаратов (этопозид, таксол). Цитотоксический эффект регистрировался с помощью МТТ-теста. Время инкубации составило 24 ч, лекарственные препараты в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ.

Фиг. 23. Зависимость количества мертвых клеток линии НСТ-116 от концентрации интернализуемых последовательностей (Р26К-1, Ό37Κ). Цитотоксический эффект регистрировался с помощью МТТтеста. Время инкубации составило 24 ч, последовательности в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ. Цитотоксический эффект оказался выше для пептида Р26К-1, имеется концентрационная зависимость.

Фиг. 24. Сочетанное воздействие на клетки НСТ-116 последовательности Ό37Κ и ЛП (таксол, этопозид), концентрации 1, 10 и 30 мкМ, время инкубации 24 ч.

Фиг. 25. Сочетанное воздействие на культуру НСТ-116 последовательности Р26К-1 в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ и Этопозида в тех же концентрациях. Время инкубации 24 ч, анализ - МТТ-тест.

Фиг. 26. Сочетанное воздействие на культуру НСТ-116 последовательности Р26К-1 в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ и Таксола в тех же концентрациях. Время инкубации 24 ч, анализ - МТТ-тест.

Фиг. 27. Исследование сочетанного воздействия Таксола и последовательностей Ό37Κ (А) и Р26К-2 (В) на культуре МСР-7. Концентрации препаратов 10, 20, 30 мкМ, время инкубации 24 ч.

Фиг. 28. Исследование сочетанного воздействия 5-фторурацила и последовательностей Ό37Κ (А) и Р26К-2 (В) на культуре МСР-7. Концентрации препаратов 10, 20, 30 мкМ, время инкубации 24 ч.

Фиг. 29. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями (А) и сочетанный эффект этопозида и последовательностей (В). Время инкубации 24 ч, окраска ΡΙ, фиксированные образцы.

Фиг. 30. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями (А) и сочетанный эффект этопозида и последовательностей (В). Время инкубации 24 ч, окраска Αηηβχίην-ΡΙ.

Фиг. 31. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями при предварительной инкубации с этопозидом в концентрации 10 мкМ. Время инкубации с пептидами 24 ч, окраска Аппсх1пУ-Р1.

Фиг. 32. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями при предварительной инкубации с этопозидом в концентрации 10 мкМ. Время инкубации с пептидами 24 ч, окраска ΡΙ с предварительной фиксацией образцов.

Фиг. 33. Распределение белка ρΑηΐρ р16 в клетках А549 во времени. Через 1, 15 и 30 мин после добавления белка. Лазерный сканирующий микроскоп Ье1ка.

Фиг. 34. Изменение объема опухоли перевитых клеток у бестимусных мышей при введении в опухоль химерного интернализуемого пептида Айр р16. Мышам перививали культуру клеток А549 и вводили пептид Аи1р р16 в дозах 0,1 и 0,2 мг.

- 6 028151

Фиг. 35. Изменение объема опухоли перевитых клеток у бестимусных мышей при введении в опухоль химерного интернализуемого пептида Άπίρ р16. Мышам были перивиты клетки НСТ-116, пептид вводился в дозе 0,1 мг.

Фиг. 36. Фотографии экспериментальных животных на момент 7 инъекции исследуемого интернализуемого пептида Р16 Λπίρ. А и В - фотографии мышей с перевитыми клетками А549, А - мышь из контрольной группы на 16 день эксперимента, опухоль имеет размер 6,0х7,0 мм. В - мышь из опытной группы на 16 день эксперимента при введении Р16 Απίρ в дозе 0,1 мг, опухоль размером 3,0х3,0 мм. С и Ό мыши с перевитыми клетками НСТ-116, С - мышь из контрольной группы на 18 день после перевивки опухолевых клеток (опухоль размером 11,5x13,5 мм). Ό - мышь из опытной группы после 7 инъекций Р16 Αηίρ в дозе 0,1 мг, опухоль размером 4,5х4,5 мм.

Фиг. 37. Двухпараметрическая цитограмма клеток молочной железы. По оси X - окраска Р1, по оси Υ - окраска цитокератином. Регион - цитокератин-положительный апоптоз указан стрелкой.

Осуществление изобретения

Таблица 1

Исследованные пептидные последовательности

Р26К-1	ЗЕф ГО ΝΟ: 1	РЪОАЬУУЕ (Н-РЬе-Ееи-Азр-АИ-Ееи-УаРУаРЬеи-ЛЬх)
Р26К-2	8Е(2 ГО ΝΟ: 2	РЬОАГОЫ (Н-РЬе-Ееи-Азр-АЬ-Пе-Ьеи-Ееи-Пе-АЬх)
АУ26К-1	8Εζ) ГО ΝΟ: 3	АУПАЬУУБ (Н-Тгр-Пе-ТЕг-АЬ-Ееи-УаРУаРЬеи-АНх)
	3Εζ) ГО ΝΟ: 4	АУГГАГОЫ (Н-Тгр-Пе-ТЬт-АИ-Ие-Ееи-Ьеи-Ие-АНх)
	8Е(Д ГО ΝΟ: 5	АЬОАЕУУЕ
	8Е0 ГО ΝΟ: 6	РУОАЬУУЬ
	3Εζ) ГО ΝΟ: 7	ХУГОАЬУУЬ
	3Εζ) ГО ΝΟ: 8	РЕТАЬУУЬ
	ЗЕ<2 ГО ΝΟ: 9	ХУАОАЬУУЬ
	ЗЕС) ΙϋΝΟ: 10	ΨΙΤΑννΑν
	8Εζ) ГО ΝΟ: 11	ЖТАЬААЕ
	ЗЕф ГО ΝΟ: 12	ЖТА1АА1
	δΕζ)Π)ΝΟ: 13	\У1ТАЬЫ1
	ЗЕф ГО ΝΟ: 14	РЬОАЕЬУЕ
	ЗЕ(2 ГОРЮ: 15	РЬОАЕУЬЕ
	ЗЕф ГОРЮ: 16	^УУОАЬУУЬ
	ЗЕф ГО ΝΟ: 17	УТТАЫГО
Д37К	ЗЕ(2 ΙϋΝΟ: 18	ΟΑΑΚΕΟΡΕϋΤΕννΕΗΚΑΟΑΚ.8^ΙΚΙΨΡρΝΚΚΜΚΨΚΚ

Пример 1. Исследование влияния пептидных последовательностей Ό37Κ, Т26К-1, ^26К-1 на неделящиеся мононуклеары периферической крови.

На мононуклеарной фракции лейкоцитов здоровых доноров был поставлен ряд экспериментов для оценки цитотоксического влияния на неделящиеся клетки крови последовательностей Ό37Κ, Т26К-1 и \Υ'26Κ-1. Для этого из цельной венозной крови с антикоагулянтом (ЭДТА) на градиенте плотности р=1,007, была выделена мононуклеарная фракция, клетки отмыты в ФСБ и помещены в 24-луночный планшет в количестве 150000 в мл. К суспензии клеток добавлялись исследуемые пептиды в концентрациях 10, 20, 30 40, 50 и 60 мкМ, пептиды были растворены в ФСБ. Инкубация составляла 24 ч при 37°С и 5% СО₂ в культуральной среде КРМ1 (10% ФБС).

После инкубации клетки отбирались в микропробирки, отмывалась среда и проводилось окрашивание образцов с помощью антител аннексин V (КесотЪтап! Ьишап Аппехт V Т1ТС соп|ида1е, САБТАО БаЪогаФпез, И.8.А.) и Р1 по методике производителя. Результаты были оценены на проточном цитометре Весшап Сои11ег.

Показано, что исследуемые пептидные последовательности способны индуцировать апоптоз (фиг. 1), имеется четко выраженная концентрационная зависимость уровня апоптоза мононуклеаров крови от количества внесенного пептида, значения апоптоза близки для 3 исследованных последовательностей. Количество живых клеток, оцененное как количество интактных/неокрашенных клеток при окраске аннексин ν/ΓΙ, резко падает при инкубации с исследуемыми пептидами, что свидетельствует о выраженной цитотоксической активности (фиг. 2). Причем эффект более выражен для последовательности Ό37Κ.

Пример 2. Исследование цитотоксической активности на пролиферирующих клеточных линиях.

Было исследовано влияние пептидных последовательностей Ό37Κ, Т26К-1, Т26К-2, ^26К-1, \Υ'26Κ-2 на клетки перививных клеточных культур МСТ-7 (рак молочной железы), А549 (аденокарцинома легкого), 8Κ0ν (рак яичника) и НСТ116 (аденокарцинома толстой кишки).

При подготовке к экспериментам культуры клеток рассаживали в 24-луночные планшеты в количестве 1х10⁴ клеток в лунке, инкубировали 48 ч при 37°С и 5% СО₂, среда ΌΜΕΜ (ПанЭко, Россия), содержащая глутамин, гентамицин, 10% ФБС. После такой инкубации культуры клеток образовывали рыхлый монослой. Постановка эксперимента: культуральная среда заменялась на среду, содержащую исследуемые пептиды в концентрациях 5, 10, 20, 40 мкМ; в контрольных образцах среда содержала 20 мкл ДМСО для определения влияния растворителя (пептиды растворяли в ДМСО). Время инкубации 24 ч.

- 7 028151

Затем клетки аккуратно снимали с подложки, используя трипсин (клетки в лунках с пептидами прикреплены сильнее, чем контрольные образцы), отмывали от среды центрифугированием 3000 об/мин в течение 7 мин, удаляли супернатант и проводили окрашивание по двойной метке аннексин ν/ΡΙ. Анализ проводился на проточном цитометре, оценивали количество клеток, включающих аннексин V - апоптоз, количество клеток, включающих йодистый пропидий - погибшие клетки, количество интактных клеток живые клетки.

При исследовании уровня апоптоза показано, что внесение пептидных последовательностей в культуральную среду пролиферирующих клеток приводит к увеличению апоптоза в культуре (фиг. 3, 4), апоптоз увеличивается пропорционально увеличению концентрации пептида.

Было получено, что пептидная последовательность Р26К-2 (Н-РЬе-Ьеи-А8р-А1а-11е-Ьеи-Ьеи-11е-АЬх) обладает более выраженным проапоптотическим действием на исследуемые клеточные линии. В отношении других исследованных последовательностей достоверных отличий в уровне индуцированного апоптоза не получено.

Количество погибших клеток, включающих йодистый пропидий, также увеличивается при внесении в культуральную среду пептидов и имеет концентрационную зависимость (фиг. 5, 6).

При исследовании количества погибших клеток не было получено достоверных отличий в степени влияния пептидов, однако уровень мертвых клеток в культуре НСТ-116 выше, чем в культуре МСР-7, что, возможно, объясняется более высоким уровнем спонтанной гибели клеток в культуре НСТ-116.

Количество живых клеток имеет обратную зависимость с концентрацией внесенных в среду пептидных последовательностей (фиг. 7, 8).

При исследовании цитотоксического эффекта пептидных последовательностей на культуры А549 и δΚΘν было получено, что последовательности Р26К-1 и \У26К-1 оказывают наиболее сильные эффекты, так, для культуры А549 при концентрации последовательностей 40 мкМ уровень клеток, положительных по аннексину, имел значения 43,5 и 52,1% для последовательностей Р26К-1 и ^26К-1; количество частиц, имеющих субдиплоидную/фрагментированную ДНК - 46,4 и 48,2%. При инкубации с исследуемыми последовательностями в течение 24 ч. При инкубации клеток линии А549 с последовательностью Э37К в концентрации 40 мкМ в течение 24 ч количество аннексин-положительных клеток составляло 33,8%; количество частиц с фрагментированной ДНК -36,3%. В контрольных образцах уровень аннексинположительных частиц не превышал 8%, уровень частиц с фрагментированной ДНК не превышал 10%.

Для культуры 81<ϋν значения в уровне раннего апоптоза (аннексин-положительные частицы) составляли 41,8% для последовательности Р26К-1 и 45,2% для последовательности \У26К-1. Для пептидной последовательности Э37К уровень раннего апоптоза составлял 37,6%. Количество частиц с фрагментированной ДНК в данной культуре при инкубации 24 ч с последовательностями Р26К-1 и \У26К-1 составило 42,6 и 44,1% соответственно. Уровень фрагментированной ДНК при инкубации с последовательностью Э37К составил 31,5%; уровень фрагментированной ДНК в контрольных образцах для обеих культур не превышал 8%.

Различий в изменении количества живых для разных последовательностей получено не было.

Пример 3. Исследование цитостатического эффекта.

На клеточных линиях МСР-7, НСТ-116, А549 (аденокарцинома легкого) и 81<ϋν (рак яичника) было проведено исследование влияния пептидных последовательностей на пролиферативную активность клеток. Постановка экспериментов включала синхронизацию клеток в С0/С1-фазе клеточного цикла с помощью обедненной культуральной среды. Клетки в 24-луночном планшете выдерживали 48 ч в среде, содержащей 0,5% ФБС, после этого проводили снятие блока синхронизации путем замены среды, содержащей 5% ФБС и исследуемые пептиды в различных концентрациях. Инкубировали 24 ч, а затем снимали клетки с подложки с помощью трипсина, отмывали в ФСБ, фиксировали в этаноле. Окраска образцов: отмывка от этанола в ФСБ путем центрифугирования, инкубация с РНКазой, окраска йодистым пропидием. Анализ проводился методом проточной цитометрии, оценивалось распределение клеток по фазам клеточного цикла на ДНК-гистограммах с помощью программы ΜοάΡίΐ 3.0. Для культур клеток МСР-7 и НСТ-116 было исследовано влияние 5 пептидных последовательностей в концентрациях 10 и 40 мкМ. Показано, что исследуемые последовательности способны снижать пролиферативную активность делящихся клеток (фиг. 9).

При исследовании изменений в распределении клеток по фазам клеточного цикла в зависимости от времени инкубации с последовательностями было показано, что наиболее четко антипролиферативный эффект и его концентрационная зависимость прослеживаются для последовательностей Р26К-2, \У26К-1. \У26К-2. Для последовательности Э37К антипролиферативный эффект выражен для клеточной линии МСР-7, однако не прослеживается в отношении клеток линии НСТ-116. Так, для культуры НСТ-116 задержка выхода клеток из фазы покоя составляет 8-12 ч при воздействии последовательностей Р26К-1, Р26К-2, \У26К-1, \У26К-2, наибольшая задержка наблюдалась при инкубации клеток с последовательностью ХУ26К-2 (12 ч, количество клеток в 00/01-фазе 72%) (фиг. 10).

Для культуры МСР-7 задержка пролиферации (выхода клеток после блока синхронизации) наблюдалась для всех исследуемых пептидных последовательностей, и достоверных отличий между влиянием последовательностей Р26К-1, Р26К-2, \У26К-1, \У26К-2 и Э37К обнаружено не было.

- 8 028151

При оценке изменений уровней фаз клеточного цикла в культуре клеток линии А549 задержки в выходе клеток из фазы 00/01 получено не было (фиг. 12).

Для линии А549 наблюдался более плавный выход из синхронизации, чем для культур МСР-7 и НСТ-116, клетки в контрольных образцах до 8 ч после инкубации оставались в фазе 00/01 в количестве, превышающем 60%. Влияние исследуемых последовательностей на уровень фазы 00/01 было минимальным. Однако при анализе изменений уровня δ-фазы было получено, что внесение в культуральную среду таких последовательностей, как Р26К-1, \У26К-1 и Ό37Κ, приводит к задержке входа клеток в δ-фазу. Если в контрольных образцах уровень δ-фазы начинал возрастать сразу после снятия блока синхронизации, то в образцах с последовательностями Р26К-1, \У26К-1 и Ό37Κ уровень δ-фазы начинал возрастать только через 8 ч после исключения синхронизирующего фактора (фиг. 13, 14).

Таким образом, для культуры клеток линии А549 была поучена задержка на уровне второй рестрикционной точки, переход δ-02, для последовательностей Р26К-1, \У26К-1 и Ό37Κ, что, возможно, объясняется особенностями данной клеточной линии.

При исследовании влияния пептидных последовательностей на культуру клеток δΚΟν инкубация проводилась с последовательностями Р26К-1, Р26К-2, ХУ26К-1, \У26К-2. Клетки предварительно синхронизовали обедненной средой, содержащей 0,5% ФБС (фетальная бычья сыворотка), пептиды вносили в культуральную среду вместе со снятием блока синхронизации, заменой питательной среды на среду, содержащую 10% ФБС.

На фиг. 15, 16 представлено изменение количества клеток в фазах 00/01 и δ+02/М, для всех исследуемых пептидов наблюдаются увеличение количества клеток в 00/01-фазе и снижение пролиферирующих клеток (δ+02/М-фазы) при увеличении концентраций пептидов. Несколько меньший антипролиферативный эффект наблюдался в данном случае для последовательности ХУ26К-2. Последовательности Р26К-1, Р26К-2, \У26К-1 вызывали задержку пролиферации клеток линии δΚΟV без достоверных отличий.

Уровень апоптоза, оцененный как гиподиплоидный пик на ДНК-гистограммах, коррелирует с концентрацией внесенного пептида и повышается с 17,8% в контрольном образце до 31,2% при инкубации 24 ч с пептидом Р26К-1 в концентрации 40 мкМ и до 35,3% при инкубации с пептидом \У26К-2 (40 мкМ) (фиг. 17).

При попытках поставить эксперименты по изучению цитостатического эффекта пептидных последовательностей с применением других методов синхронизации: использование гидроксимочевины - остановка в 00/01-фазе, таксола - остановка в 02-фазе и этопозида -остановка в δ-фазе, получить достоверные результаты не удалось. В данных экспериментах при добавлении к клеточным культурам исследуемых последовательностей наблюдалась гибель клеток более 70%, что исключало возможность адекватного анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла.

Пример 4. Исследование влияния пептидных последовательностей на изменение уровня Вс1-2.

С помощью моноклональных антител Апй Нитап Вс1-2 (СаКад БаЬогаЮпсь υδΑ) было оценено изменение уровня Вс1-2 в клетках линии НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. Клетки переносились на 24-луночный планшет в количестве 1х10⁴ в лунке, 48 ч, росли при обычных условиях (среда ΌΜΕΜ, 10 %), затем проводилась синхронизация обедненной средой, содержащей 0,5% ФБС, в течение 48 ч.

При снятии блока синхронизации к клеткам добавлялась среда, содержащая 10% ФБС и исследуемые пептидные последовательности в концентрациях 10 и 40 мкМ. Инкубация с пептидами составила 24 ч, затем культуру снимали с помощью трипсина, фиксировали в течение 1 ч раствором ФСБ, содержащим 1% формальдегида, далее фиксировали этанолом. Окраску и анализ проводили согласно инструкции производителя антител. Было получено, что исследуемые последовательности способны ингибировать экспрессию белка Вс1-2, наиболее сильно ингибирование происходит под воздействием последовательностей Р26К-1, Р26К-2, А26К-2, для данных последовательностей также получена зависимость уровня Вс1-2 от концентрации пептида (фиг. 18). Тем самым показано, что индуцируемый внесением в культуральную среду пептидных последовательностей апоптоз объясняется специфическим воздействием пептидов на молекулярные процессы клетки.

При исследовании изменения уровня Вс1-2 было получено, что пептиды Э37К и \У26К-1 оказывают минимальный эффект, снижая уровень Вс1-2-положительных клеток в культуре на 5% при инкубации 24 ч и концентрации пептидов 40 мкМ. Пептиды \У26К-2 и Р26К-1 снижали уровень Вс1-2 более 15%.

Пример 5. Исследование изменения количества фосфорилированного рКЬ при инкубации клеточных культур с пептидными последовательностями.

Одной из задач проведенной работы было доказать, что антипролиферативные эффекты исследуемых пептидов связаны со специфическим действием фрагментов ингибиторов циклиновых киназ, входящих в их структуру. Хотя в литературе и описано сохранение ингибирующих свойств таких пептидов на фосфорилирующую функцию циклинзависимых киназ, эти подтверждения получены на клеточных экстрактах. Авторы провели исследование изменения уровня фосфорилирования рКВ - молекулярной мишени циклиновых киназ Ό типа на фоне действия исследуемых пептидов - включающих последовательности, имеющие гомологию с ρ16ΙΝΙ<4;·ι на клеточном уровне с использованием метода проточной

- 9 028151 цитометрии.

Активация в клетке собственного ρ16ΙΝΚ4α приводит к ингибированию фосфорилирования рКЬ. Накопление недофосфорилированого рКЬ приводит к ингибированию Е2Р1 и снижению экспрессии циклинов А и В, что является одним из ключевых механизмов в остановке клеточного цикла. По количеству фосфорилированного рКЬ можно судить об активности р16.

Метод проточной цитометрии позволяет визуализировать клетки, в которых продукт рКЬ находится в недофосфорилированном (ипйерЬо8ркогу1а1ей) состоянии. Меченные флуоресцентной меткой антитела взаимодействуют с недофосфорилированным рКЬ.

Для определения количества недофосфорилированного рКЬ был проведен ряд экспериментов, к синхронизированным методом обедненной среды культурам клеток (МСР-7, НСТ-116) после снятия блока синхронизации добавлялись исследуемые пептидные последовательности, затем клетки снимались через каждые 2 ч. С каждой чашки часть клеток фиксировалась для дальнейшего определения фаз клеточного цикла, а часть - для определения количества недофосфорилированного рКЬ. Также был поставлен отрицательный контроль в виде образцов синхронизированных клеток, но без добавления пептидов. Было показано, что внесение в культуру клеток пептидных последовательностей вызывает задержку фосфорилирования рКЬ и снижает его максимальный уровень в культуре (фиг. 19).

Как видно из фиг. 19, после снятия блока синхронизации в контрольных образцах без добавления пептидов, уровень недофосфорилированного рКЬ начинает расти и к определенному моменту (4 или 6 ч инкубации), в зависимости от клеточной линии, достигает максимального значения, а затем начинает снижаться. В образцах с пептидами уровень недофосфорилированного рКЬ начинает увеличиваться позднее и достигает своего максимального значения через 12-18 ч инкубации, причем задержка в достижении максимального уровня рКЬ зависит от концентрации пептидных последовательностей. Для культуры клеток МСР-7 (фиг. 19) наибольшую задержку в образовании недофосфорилированного рКЬ оказывали последовательности Р26К-2 и \У26К-2. При исследовании изменения уровня недофосфорилированного рКЬ в культуре НСТ-116 при инкубации клеток с пептидными последовательностями наибольший эффект задержки был получен для последовательностей Р26К-1 и Р26К-2. Для культуры НСТ-116 были поставлены 3 эксперимента по определению уровня недофосфорилированного рКЬ. Клетки синхронизировали методом обедненной среды (48 ч в среде, содержащей 0,5% ФСБ), при смене среды на среду, содержащую 10% ФСБ, к культуре добавляли исследуемые последовательности в концентрациях 10 и 40 мкМ. Анализировали уровень недофосфорилированного рКЬ каждые 2 ч, максимальное время инкубации составило 24 ч.

Как показано на фиг. 20, для культуры НСТ-116 наибольший эффект задержки образования недофосфорилированного рКЬ оказывали последовательности Р26К-1 и Р26К-2, для этих последовательностей максимальный уровень недофосфорилированного рКЬ, при концентрации пептидов 10 мкМ наблюдался после 16 ч инкубации, а при концентрации 40 мкМ - после 20 ч. Для последовательности Ό37Κ эффект задержки наблюдался такой же по времени, но уровень недофосфорилированного рКЬ был ниже.

При исследовании уровня недофосфорилированного рКЬ на клетках линии §КОУ эффект задержки образования недофосфорилированного рКЬ был ниже, чем для культур МСР-7 и НСТ-116, хотя на данной клеточной линии ранее был показан эффект задержки пролиферации при инкубации клеток с исследуемыми пептидными последовательностями. На фиг. 21 показано изменение уровня недофосфорилированного рКЬ в культуре клеток §КОУ при воздействии на клетки последовательностей Ό37Κ, Р26К-1, Р26К-2, ХУ26К-1, \У26К-2 в концентрациях 10 мкМ (А) и 40 мкМ (В). Очевиден эффект задержки образования недофосфорилированного рКЬ по сравнению с контрольным образцом, однако в случае клеточной линии §КОУ эффект несколько ниже, чем для культур МСР-7 и НСТ-116. Последовательность Э37К в данном случае оказывает наиболее сильный эффект, но и Р26К-2 вызывает задержку в образовании недофосфорилированного рКЬ на 4-10 ч по сравнению с контролем.

Таким образом, было получено, что исследованные пептидные последовательности О37К, Р26К-1, Р26К-2, \У26К-1 и \У26К-2 способны индуцировать апоптоз в активно пролиферирующих клетках, тормозить процессы пролиферации. Из исследованных последовательностей наиболее ярко выраженными цитотоксическими и цитостатическими эффектами обладают последовательности Р26К-1 и Р26К-2, при инкубации с которыми апоптоз имеет несколько более высокие значения для пролиферирующих клеток, наблюдается задержка пролиферации (увеличение количества клеток в 00/01-фазе клеточного цикла), снижение уровня Вс1-2, имеющее концентрационную зависимость. Для других исследованных последовательностей также наблюдаются цитотоксические и цитостатические эффекты, но менее выраженные.

Пример 6. Исследование сочетанного эффекта интернализуемых последовательностей и лекарственных препаратов.

На культуре клеток НСТ-116 был поставлен ряд экспериментов по изучению сочетанного воздействия интернализуемых последовательностей Р26К-1 и Э37К и лекарственных препаратов, обладающих противоопухолевой активностью (таксол, этопозид). Приведенные ниже данные, средние значения по 3 экспериментам. Лекарственные препараты и интернализуемые последовательности вносили в культуральную среду в конечных концентрациях 1, 10 и 30 мкМ, проводили инкубацию 24 ч. Цитотоксический

- 10 028151 эффект оценивали с помощью МТТ-теста. Данный метод основан на способности митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (ММТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (ДМСО).

Для проведения МТТ-теста клетки в концентрации 2х10⁶/мл помещали в лунки 96-луночного планшета в объеме среды 100 мкл, инкубировали 24 ч, затем проводили замену среды на среду, содержащую ЛП и интернализуемые последовательности, инкубировали 24 ч, отбирали среду и добавляли 30 мкл чистой полной среды, затем добавляли по 170 мкл РВ§ и по 20 мкл МТТ. Инкубировали при 37°С в течение 30 мин, отбирали супернатант. Добавляли по 200 мкл ДМСО (диметилсульфоксиде) и 15 мин инкубировали в темноте при комнатной температуре. Показания оптической плотности считывали на ИФА-ридере (иммуноферментный анализатор) при 492 нм.

На фиг. 22 представлено изменение количества мертвых клеток при воздействии лекарственных препаратов на клеточную культуру. Цитотоксический эффект этопозид в данном диапазоне концентраций и для данной клеточной линии был минимален, таксол оказывал выраженный цитотоксический эффект при концентрации 30 мкМ. Для исследуемых последовательностей было показано, что последовательность Р26К-1 индуцирует клеточную гибель, и наблюдается зависимость количества мертвых клеток от концентрации последовательности в культуральной среде (фиг. 23).

При исследовании сочетанного эффекта последовательности И37К и препаратов таксол, этопозид, для культуры НСТ-116 не было получено эффектов усиления цитотоксического воздействия препаратов (фиг. 24). Количество мертвых клеток такое же, как при воздействии чистых ЛП.

При исследовании сочетанного воздействия последовательности Р26К-1 и ЛП была получена суммация цитотоксических эффектов. Наиболее четкий эффект суммации наблюдается при совместной инкубации клеток с последовательностью Р26К-1 и этопозидом (фиг. 25). При инкубации клеток с последовательностью Р26К-1 и таксолом эффект суммации наблюдается при концентрациях 1 и 10 мкМ Р26К-1, но теряется при увеличении концентрации последовательности Р26К-1 до 30 мкМ (фиг. 26). Данный эффект повторялся во всех проведенных экспериментах, и объяснить его на данном этапе не удалось, возможно, имеет место механизм перенасыщения, в ответ на гиперактивацию проапоптотических механизмов, включаются пути обратной регуляции и, как следствие, торможение клеточной гибели.

На культуре клеток МСР-7 (рак молочной железы) было исследовано сочетанное воздействие ЛП 5-фторурацил и таксол и последовательностей И37К и Р26К-2 (в исследованиях по цитотоксичности данная последовательность оказывала наиболее выраженный эффект на культуру МСР-7). Клетки выращивались на 24-луночных планшетах до 70% монослоя, затем проводилась замена среды на среду, содержащую исследуемые последовательности и ЛП в концентрациях 10, 20 и 30 мкМ. Время инкубации составляло 24 ч. Анализировали клетки, вступившие в апоптоз, с помощью окраски аннексин-йодистый пропидий, методом проточной цитофлуориметрии.

Было показано, что при сочетанном использовании таксола и последовательности Р26К-2 наблюдается суммация цитотоксических эффектов, выражающаяся в увеличении уровня апоптоза пропорционально концентрациям препаратов. Данный эффект несколько снижается при увеличении концентрации последовательности Р26К-2 до 30 мкМ (фиг. 27 В). В случае последовательности И37К на концентрации 10 мкМ цитотоксический эффект был минимален, а эффекты концентраций 20 и 30 мкМ были практически одинаковы (фиг. 27 А). В случае сочетанного использования 5-фторурацила и интернализуемых последовательностей И37К и Р26К-2 для обеих исследованных последовательностей были получены линейные зависимости усиления цитотоксического эффекта от концентраций, причем сопоставимыми значениями количества апоптотических частиц, и снижение эффекта при увеличении концентрации пептидной последовательности до 30 мкМ (фиг. 28).

На культуре клеток Н460 (рак легкого) было исследовано сочетанное влияние последовательностей Р26К-1, Р26К-2, А26К-1, А26К-2 и этопозида. Для этого клетки инкубировали в 24-луночном планшете до образования 70% монослоя, затем проводили замену среды на среду, содержащую интернализуемые последовательности в концентрациях 5, 10, 20 и 30 мкМ и Этопозид в концентрации 10 мкМ. Время инкубации составило 24 ч. Был исследован уровень апоптоза с помощью окраски на аннексин-йодистый пропидий (ранний апоптоз) и уровень апоптоза по количеству частиц с фрагментированной ДНК, субдиплоидный пик при окраске фиксированных клеток йодистым пропидием.

Было показано, что все исследованные последовательности обладают выраженным апоптотическим эффектом относительно данной культуры клеток, причем уровень апоптоза значимо возрастает при сочетанном использовании пептидных интернализуемых последовательностей и этопозида.

На фиг. 29А показано изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями без этопозида, время инкубации 24 ч, апоптоз анализировался как субдиплоидный пик. На фиг. 29В, увеличение уровня апоптоза при инкубации клеток и с последовательностями, и с этопозидом.

На фиг. 30 представлены те же образцы, но окрашенные по двойной метке АипехшУ-Р1, отмечается увеличение уровня раннего апоптоза, клетки, положительные по аннексину, при воздействии на культуру пептидных последовательностей (А) и суммация эффектов пептидных последовательностей и этопо- 11 028151 зида (В).

Для культуры Н460 были также поставлены модифицированные эксперименты по изучению сочетанного воздействия Этопозида и пептидных последовательностей. Клетки инкубировали в 24-луночном планшете до образования 70% монослоя, затем проводили замену среды на среду, содержащую этопозид в концентрации 10 мкМ, инубировали в течение 24 ч. Заменяли среду на содержащую интернализуемые последовательности в концентрациях 5, 10, 20 и 30 мкМ, без этопозида. Инкубировали 24 ч. Был исследован уровень апоптоза с помощью окраски на аннексин-йодистый пропидий (ранний апоптоз) и уровень апоптоза по количеству частиц с фрагментированной ДНК, субдиплоидный пик при окраске фиксированных клеток йодистым пропидием.

Было получено резкое увеличение уровня апоптоза, при концентрациях последовательностей Р26К2 и А26К-1 5 мкМ, уровень апоптоза составил более 80% (фиг. 31).

Уровень клеток с фрагментированной ДНК, что соответствует более поздним апоптотическим процессам, имел другую форму зависимости, но вид зависимости был идентичен для всех исследованных пептидных последовательностей (фиг. 32). При данной постановке эксперимента наблюдалась картина общего возрастания апоптоза по сравнению с экспериментами, в которых ЛП вносили в культуральную среду одновременно с интернализуемыми последовательностями. Данный эффект, возможно, объясняется задержкой пролиферации, которую индуцирует этопозид (блок выхода из δ-фазы), интернализуемые последовательности, обладая способностями циклинзависимых киназ, стимулируют запуск процессов апоптоза в клетках, остановленных этопозидом.

Таким образом, в ходе проведенных исследований было показано, что все исследованные пептидные последовательности (Ό37Κ, Р26К-1, Р26К-2, А26К-1, А26К-2) обладают способностью индуцировать апоптоз, влияют на процессы пролиферации клетки. Уровень эффектов зависит как от последовательности, так и от клеточной культуры. При сравнении пептидных последовательностей было показано, что А26К-1 является наиболее слабой, остальные же последовательности по цитотоксическим эффектам превосходят исследованную ранее Э37К.

Представлена возможность сочетанного использования интернализуемых последовательностей и лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике. Показано усиление цитотоксических свойств противоопухолевых препаратов.

Пример 7. Изучение проникающей способности интернализуемых пептидов.

Для регистрации проникновения пептидов внутрь клетки и исследования динамики накопления использовали идентичные химерные последовательности, конъюгированные с флуоресцентной меткой флоуресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). Так как включение молекул ФИТЦ в готовый полипептидный продукт часто приводит к существенному изменению его физико-химических свойств и потере физиологической активности, поэтому к исходной последовательности на Ν-конце присоединялась молекула лизина, которая и несла одну молекулу ФИТЦ.

Методом световой флуоресцентной микроскопии было показано, что изучаемые пептиды связываются с клетками и проникают в клеточные линии Кар, ДикаР, А549, 293 и периферические лимфоциты крови человека. Методом проточной цитофлуорометрии было показано связывание пептида с клетками и отсутствие эффекта тушения флуоресценции трипановым синим, что свидетельствует о накоплении пептида внутри клетки.

Наиболее объективные данные о накоплении пептида внутри клетки были получены с использованием метода сканирующей лазерной микроскопии. Белок, меченный флуоресцеин-изотиоцианатом, был растворен в 0,9% №С1. Клеточные линии А549, 293 выращивались на предметных стерильных стеклах и помещались в специальной камере непосредственно под окуляры микроскопа. Среда замещалась на среду с исследуемым белком. Насыщение белком наблюдали во времени. Кроме того, производилось послойное сканирование клеток с целью определения локализации пептида.

Анализ полученных изображений при данном увеличении не выявил преимущественного расположения белка р16 ρΑηίρ в клетке. Очевидно, что белок распределяется в компартментах клетки равномерно. Проникновение белка внутрь клетки происходит достаточно быстро. И уже через 15 мин инкубации можно наблюдать относительно гомогенное распределение его во внутриклеточном пространстве (фиг. 33).

Скорость проникновения пептида в периферические лимфоциты крови человека, а также лимфоциты клеточных линий (Кар, ДикаР) была оценена с использованием метода проточной цитофлуорометрии. Данный метод позволяет исследовать большие концентрации клеток во времени и удобен для оценки скорости проникновения исследуемого пептида. Измерялась флуоресценция лимфоцитов под действием белка р16-рАПр-ФИТЦ при рН 7,5 и 6.0. Принцип метода основан на меньшем квантовом выходе флуоресценции ФИТЦ в растворах с более кислым рН. Так как скорость измерения происходит достаточно быстро, то значение рН внутри клетки не может измениться. Лимфоциты инкубировались с пептидом в течение 1-15 мин, после этого к ним сразу добавлялся 20-кратный объем фосфатного буфера с рН 6,0 и 7,5. При этом оценивалась разность интенсивности флуоресценции. В большинстве измерений интенсивности флуоресценции достоверно не отличались после 15 мин инкубации. Таким образом, можно предположить, что после 15 мин инкубации пептид полностью проникает внутрь клетки.

- 12 028151

Для исследования скорости накопления пептида внутри клетки использовали метод проточной цитофлуорометрии. Для этого меченный ФИТЦ пептид вводили непосредственно в измерительную пробирку проточного цитометра, что позволяло регистрировать динамику изменения флуоресценции клеток. Исследовалась мононуклеарная фракция лейкоцитов крови здоровых доноров, выделенная на градиенте фиколла. После небольшой лаг-фазы происходит быстрое накопление пептида в клетках нормальных лимфоцитов. Конечная концентрация достигается за время равное ~1 мин.

Похожая кинетика накопления пептида получена и для клеток злокачественных лимфом. В качестве моделей исследовались линии Лика! (происходящая из лимфобластного лейкоза и имеющая Т-клеточный фенотип) и Кар, происходящая из В-клеточной лимфомы Беркита.

В опухолевые клетки пептид проникает с большой скоростью. Время достижения максимальной концентрации - менее 1 мин. Кинетика накопления исследовалась при комнатной температуре (1=20°С). Следует подчеркнуть, что механизм проникновения исследуемого класса пептидов до настоящего времени не известен. Однако показано, что накопление происходит одинаково эффективно даже при температуре 5°С и не связано с затратами энергии в клетке, не опосредуется клеточными рецепторами и не использует фаго- и пиноцитозный путь. Авторы также подтвердили факт накопления синтезированного пептида, содержащего интернализуемый фрагмент, при разных температурах (до 5°С).

Так как исследуемые пептиды могут преодолевать клеточную мембрану в обоих направлениях, можно предположить, что накопленные в клетке пептиды могут выходить из нее при снижении внеклеточной концентрации. Исследование процессов экспорта пептидов из клетки могут быть темой отдельных исследований.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что кинетика накопления химерного пептида, содержащего интернализуемый фрагмент и фрагмент белка ρ16ΙΝΚ4α, имеет степенной характер с зависимостью типа С=сои8П+сои812х1² Показано также, что динамика накопления и внутриклеточного распределения пептида в нормальных и опухолевых клетках не отличается по характеру и по скорости накопления.

Пример 8. Исследование противоопухолевой активности пептида Ό37Κ ίη νίνο (местное введение).

На бестимусных мышах (Νπάο) исследовалась противоопухолевая активность химерного интернализуемого пептида Ό37Κ.

Мышам были перевиты опухолевые культуры клеток человека линий А549 и НСТ-116 в количестве около 1 млн клеток на мышь.

мышам были привиты клетки А549, из них 20 мышей составили контрольную группу, им в дальнейшем вводили плацебо. 10 мышей составили первую опытную группу. Им после образования пальпируемой опухоли (через 4 дня после перевивки клеток) стали вводить непосредственно в опухоль исследуемый пептид в дозе 0,1 мг. 9 мышей составили вторую опытную группу, им также после образования опухолевого узла на 4 день перевивки стали вводить в ложе опухоли по 0,2 мг пептида. Пептид в опытных группах вводили один раз в два дня. Эксперимент продолжался 24 дня.

В опытных группах наблюдали снижение темпов роста опухолей и на 6 день после начала введения пептида можно наблюдать заметное снижение объема опухолей в опытных группах по сравнению с контрольной (фиг. 34). Эксперимент продолжался 24 дня. За это время в опытных группах было проведено 10 инъекций химерного пептида. В контрольной группе на 24 день эксперимента средний объем опухолей у мышей составил 95,24 мм³, одна мышь погибла. В первой опытной группе (доза вводимого пептида - 0,1 мг) средний объем опухолей составил 39,29 мм³, одна мышь погибла. Во второй опытной группе (доза вводимого пептида -0,2 мг) средний объем опухолей составил 57,51 мм³, но погибших животных не было.

При введении мышам перевивной культуры человека НСТ-116 животных разделили на две группы: контрольная группа (10 мышей), которым в последующем не вводили исследуемый пептид, и опытная группа (10 мышей), которым вводили исследуемый химерный пептид Р16 Αηίρ в дозе 0,1 мг в область опухолевого узла. Эксперимент продолжался 28 дней, было сделано в опытной группе 11 инъекций пептида, первая инъекция была сделана на 6 день после перевивки опухолевых клеток. Опухолевый узел из клеток НСТ-116 отличался большими размерами и наличием изъязвлений. В контрольной группе на 28 день эксперимента средний объем опухолей составил 679 мм³, за время эксперимента погибло 3 мыши. В опытной группе отмечался более низкий темп роста опухоли (фиг. 35), на 28 день эксперимента средний объем опухолей составил 225,4 мм³, погибших животных в опытной группе было 2.

На фиг. 36 представлены пары мышей из разных групп после 7 проведенных инъекций исследуемого пептида. Видно заметное уменьшение опухолевого узла в опытных группах.

Местное введение химерного пептида ρ16-Αηΐρ приводит к достоверному (более 50%) торможению роста экспериментальных моделей опухолей человека (рак молочной железы, колоректальный рак).

Пример 9. Исследование цитотоксических свойств Ό37Κ на краткосрочных культурах опухолей человека.

Исследовалась противоопухолевая активность Ό37Κ. Были синтезированы 150 мг пептида Ό37Κ методом твердофазного синтеза. Для исследования эффектов на опухолях человека использовали метод краткосрочных культур.

- 13 028151

Методика получения краткосрочных культур опухолей из операционного материала.

Краткосрочные культуры получали из операционного материала. Забор участка для приготовления культуры проводился по возможности в кратчайшие сроки после операции и с участием патологоанатома. Вырезался участок ткани, в среднем 1,5 см³. Ткань механически размельчалась, суспензия клеток помещалась в среду ΚΡΜΙ, содержащую 5% ФБС. Через 24 ч инкубации при 37°С и 5% СО₂ среда заменялась на среду, содержащую химерный пептид (р16 Αηίρ в концентрации 40 мкмоль), либо для ряда экспериментов на таксол в концентрации 100 или 500 нмоль, содержащую и пептид и таксол. В контрольных образцах среда заменялась на свежую. Снималась первая точка - 0 ч.

Инкубация проходила при 37°С и 5% СО₂ 24 ч, для ряда экспериментов 24 и 48 ч. Оценивали результаты методом проточной цитофлуориметрии (описание метода см. методы ΐη νότο) с использованием двойной окраски образцов АппехшУ-ΡΙ и окраски фиксированного материала ΡΙ. Оценивали уровень частиц, положительных по АппехшУ (ранний апоптоз), уровень частиц, положительных по двойной метке АппеххпУ-ΡΙ (поздний апоптоз), количество частиц в нефиксированных образцах, способных включать ΡΙ (некроз); распределение клеток по фазам клеточного цикла, уровень субдиплоидного пика (количество частиц с фрагментированной ДНК, апоптоз). Для выявления апоптоза эпителиальных клеток использовали двойную окраску антитела к цитокератину-ФИТЦ - ΡΙ (фиг. 37).

Всего проанализировано 126 образца ткани: из них 63 образца патологических тканей (и 63 образца нормальных тканей в качестве контролей). Из 63 патологических образцов было исследовано опухолей злокачественного генеза 47 (10 - рак молочной железы, 15 - рак почки, 6 - рак матки, 4 - рак предстательной железы, 3 - рак яичника и рак легкого и по 2 случая - рак желудка, рак поджелудочной железы, мочевого пузыря.) Кроме того, исследовались образцы ткани фиброаденом (N=9), а также 7 образцов ткани молочной железы при простой протоковой гиперплазии.

Уровень апоптоза анализировали через 24 и 48 ч после добавления пептидов в концентрации 40 мкМ. Часть экспериментов провели для изучения сочетанного цитотоксического действия на клетки опухоли традиционных химиотерапевтических препаратов и пептида Ώ37Κ.

Пример 10. Исследование противоопухолевой активности пептида Ώ37Κ.

Суммарные результаты по цитотоксической активности пептид Ώ37Κ приведены в табл. 2.

Таблица 2

Средний уровень индуцированного апоптоза в краткосрочных культурах опухолей при воздействии пептида Ώ37Κ (24 ч, 40 мкМ)

Анализ полученных результатов показывает, что наиболее чувствительными формами рака для цитотоксического действия пептида Ώ37Κ являются: рак почки, молочной железы, желудка, мочевого пузыря. Следует отметить, что для краткосрочных культур рака мочевого пузыря характерен очень высокий уровень спонтанного апоптоза (до 60-70%). Несмотря на то что добавление пептида повышает этот уровень незначительно, на этом фоне полученные результаты могут иметь нерепрезентативный характер.

Пример 11. Исследование цитотоксического действия на клетки фиброаденомы молочной железы.

Интересные результаты были получены при исследовании образцов тканей фиброаденомы молочной железы. В краткосрочных культурах этих клеток при невысоком уровне спонтанного апоптоза (максимальный до 20%, средний 12,8%) пептид р16 оказывал существенное цитотоксическое действие и вызывал выраженный апоптоз через 24 ч со средним уровнем 38,2% при максимально до 80%. Менее выраженное цитотоксическое действие было обнаружено для клеток молочной железы имеющих признаки простой протоковой гиперплазии (средний уровень индуцированного апоптоза 14,5%). Эти результаты согласуются с полученными автором данными по изучению соотношения активности пролиферации и уровня спонтанного апотоза в патологических тканях молочной железы. Было показано, что соотноше- 14 028151 ние пролиферации и спонтанного апоптоза наиболее высоко для ткани фиброаденомы, а клетки рака молочной железы по этому показателю находятся на втором месте, далее следует простая протоковая гиперплазия в ткань нормальной молочной железы. Если одним из факторов, определяющих чувствительность клеток к цитотоксическому действию пептидов, содержащих ингибиторы пролиферации, является активность клеточного деления, то чувствительность клеток фиброаденомы к пептиду Ό37Κ является вполне логичной. Обнаруженный эффект чувствительности доброкачественных пролиферативных процессов в ткани молочной железы может оказаться перспективным для их лечения. Результаты по локальному введению пептидов для лечения перевивных солидных опухолей позволяют предположить эффективность их при локальном введении в область доброкачественных пролиферативных процессов в тканях молочной железы.

Полученные результаты позволили выявить спектр чувствительных к пептиду Ό37Κ опухолей человека. Обнаружено, что такие локализации, как рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак почки являются перспективными объектами для дальнейшего изучения цитотоксического (противоопухолевого) действия изучаемого пептида. Полученные результаты являются новыми, так как в доступной литературе нет данных по изучению влияния анализируемого пептида на опухоли человека.

Специалист в данной области согласится с взаимозаменяемостью некоторых элементов различных вариантов исполнения изобретения. Аналогичным образом, некоторые вышеуказанные элементы и действия, а также другие известные эквиваленты для каждого элемента, действия и метода могут быть совмещены или заменены одним из обычных компонентов в соответствии с вышеуказанными принципами с целью образования соединения. Несмотря на то что информация была представлена в контексте определенных вариантов исполнения изобретения и примеров, специалисты в данной области согласятся с тем, что данная информация охватывает более широкую сферу применения, чем применение в рамках вышеуказанных вариантов исполнения изобретения, и/или на ее основе могут быть использованы возможные модификации и эквиваленты. Таким образом, информация не ограничена применением исключительно в рамках представленных вариантов исполнения изобретения.

- 15 028151

Список последовательностей <110> оЬзКезеуо 5 ОдгаптсНеппоу ОСуеСзСуеппозСти метамах <120> сЬттегтс РерСтс! апс! РКагтасеиСтса! СотрозтСтоп Гог Тгеастпд Нурегрго!тГегаСтуе Ртзеазез <130> ЕА2О13ОО313 <160> 18 <210> 1 <211> 8 <212> РКТ <213> ното зартепз <220>

<223> -Гипс-Стопа! зедиепсе оГ ргосетп тпКт'Ьтсог о£ сус!тп-ктпазе <400> 1

РКе 1_еи Азр А1а 1_еи Уа1 Уа1 1_еи 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>

<223> -ГипсСтопа1 зедиепсе оГ ргосетп тпКт'Ьтсог о£ сус!тп-ктпазе <400> 2

РКе 1_еи Азр а! а 1!е Ьеи Ьеи II е

5 <210> 3 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз <22О>

<223> -ГипсСтопа! зедиепсе оГ ргосетп тпКтЬт'сог оГ сус! т п-кт пазе <400> 3 тгр 1!е тЬг а!а 1_еи Уа! Уа! 1_еи

5 <210> 4 <211> 8 <212> РКТ <213> ното зартепз <220>

<223> -ГипсСтопа! зедиепсе оГ ргосетп тпНт’ЬтСог о£ сус!тп-ктпазе <400> 4

Тгр1! етН га! а11 е 1_еи 1_еи I! е

5 <210> 5 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз

- 16 028151 <220>

<223> ΐυηεΐίοηβΐ зечиепсе οί ргогетп ιηΙτίΜΐΟΓ οί сусТт η-кт пазе <400> 5

Тгр ьеи Азр А1а Ьеи Уа1 Уа1 ьеи

5 <210> 6 <211> 8 <212> РРТ <213>,ното зартепз <220>

<223> ^псТтопа! зедиепсе οί ргоТетп тпКтЬтТог οί сусИп-ктпазе <400> 6 рКе Уа1 Азр А1а ьеи Уа1 Уа1 ьеи

5 <210> 7 <211> 8 <212> РРТ <213> ното зартепз <22О>

<223> ^псттопа1 зечиепсе οί рготетп ч'пМЬтТог οί сус1 тп-ктпазе <400> 7 тгр 11е Азр А1а ьеи \/а1 Уа1 ьеи

5 <210> 8 <211> 8 <212> РРТ <213> Ното зартепз <220>

<223> ίυηοΐτοΓ^Ι зечиепсе οί ргоТетп тпМЬтЬог οί сус1 тп-ктпазе <400> 8

РЬе Ьеи тЬг А1а ьеи Уа1 Уа1 ьеи

5 <210> 9 <211> 8 <212> РРТ <213> Ното зартепз <22О>

<223> ^псТтопа! зедиепсе οί ргоТетп тпЫЬтТог οί сус!ίп-ктпазе <400> 9

Тгр А1а Азр А1а ьеи Уа1 Уа1 Ьеи 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> РРТ <213> Ното 5ар1еп5 <220>

<223> ^псТтопа! зедиепсе οί ргогетп тпЬтЬтТог οί сусИп-ктпазе

- 17 028151 <400> 10 тгр IIе ТНг А1а Уа1 Уа1 А1а Уа1 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз <22О>

<223> Рипсгтопа1 зеяиепсе οί ргогетп тпММгог οί сусЪ'п-ктпазе <400> 11

Тгр 11е тЬг А1а ьеи А1а А1а 1_еи

5 <210> 12 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>

<223> Рипсп'опа! 5еяиепсе об ргохетп тпМЫгог об сусНп-ктпазе <400> 12 тгр 11е тЬг А1а 11е А1а А1а 11е

5 <210> 13 <211> 8 <212> РКТ <213> ното зартепз <220>

<223> Рипсттопа1 зеяиепсе об ргогетп тпМЬНог οί сусИп-ктпазе <400> 13 тгр 11е тЬг А1а 1_еи 1_еи 11е 11е

5 <210> 14 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>

<223> РипсТтопа! зедиепсе οί ргогетп тпМЬНог οί сусИп-ктпазе <400> 14 рКе 1_еи А5р А1а 1_еи 1_еи Уа1 1_еи

5 <210> 15 <211> 8 <212> РКТ <213> Ното зартепз <22О>

<223> РипсТтопа! Беяиепсе οί ρτοΐθίη тпКтЬтгог οί сусИп-ктпазе <400> 15

РКе 1_еи Азр А1а ьеи Уа1 ьеи 1_еи

5 <210> 16

- 18 028151 <211> 8 <212> РРТ <213> Ното зартепз <22О>

<223> Гипс-Стопа! зедиепсе оГ ргосетп тпКтЫсог оГ сусНп-ктпазе <400> 16 тгр Уа1 Азр А1а ьеи Уа! Уа! ьеи

5 <210> 17 <211> 8 <212> РРТ <213> ното зартепз <22О>

<223> ГипсСтопа1 зедиепсе о Г ргоСетп тпНтЬтСог о Г сус!тп-ктпазе <400> 17

Тгр 1!е тНг А1а Ьеи 11е 11е ьеи

5 <210> 18 <211> 37 <212> РРТ <213> Ното зартепз <220>

<223> Гипсстопа1 зедиепсе оГ ргосетп тпКт'Ьт'Сог оГ сусНп-ктпазе <400> 18

Азр А1а А!а Агд С1и с!у РЬе ьеи Азр тНг ьеи Уа1 Уа! ьеи нтз Агд 15 10 15

А1а С1у А1а Агд 5ег Агд б!п 11е Ьуз 11е тгр РКе С1п Азп Агд Агд

25 30 мес ьуз тгр ьуз ьуз

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Химерный пептид с антипролиферативной активностью, включающий функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 - δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 17.
2. Химерный пептид по п.1, отличающийся тем, что функциональный фрагмент представлен пептидом, включающим аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4.
3. Функциональный пептид с антипролиферативной активностью, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 - δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 17.
4. Химерный пептид по п.1, отличающийся тем, что транспортная последовательность состоит из белка Айр или ТаЕ
5. Применение химерного пептида по п.1 для лечения злокачественной опухоли.
6. Применение химерного пептида по п.1 для лечения доброкачественной опухоли.
7. Применение функционального пептида по п.3 для лечения злокачественной опухоли.
8. Применение функционального пептида по п.3 для лечения доброкачественной опухоли.
9. Применение химерного пептида по п.5, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
10. Применение функционального пептида по п.7, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
11. Применение химерного пептида по п.1 для приготовления лекарственного средства на его основе для лечения злокачественной опухоли.
12. Применение химерного пептида по п.1 для приготовления лекарственного средства на его основе для лечения доброкачественной опухоли.
13. Применение химерного пептида по п.11, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому, злокачественную лимфому.
14. Применение функционального пептида по п.3 для приготовления лекарственного средства на его основе для лечения злокачественной опухоли.
15. Применение функционального пептида по п.3 для приготовления лекарственного средства на его основе для лечения доброкачественной опухоли.
16. Лекарственное средство по п.14, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
17. Фармацевтическая композиция с антипролиферативной активностью, включающая в качестве терапевтически активного вещества химерный пептид по п.1 или функциональный пептид по п.3, а также фармацевтически приемлемые носители.
18. Фармацевтическая композиция по п.17, включающая дополнительное фармацевтически активное вещество, выбранное из группы, включающей алкилирующие препараты, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, противоопухолевые антибиотики, производные платины, производные камптотецина, альтретамин, амсакрин, Ь-аспарагиназу, дакарбазин, эстрамустин, гидроксикарбамид, прокарбазин, темозоломид, моноклональные антитела, гормоны, цитокины.
19. Применение фармацевтической композиции по п.17 для приготовления лекарственного средства на ее основе для лечения злокачественной опухоли.
20. Применение фармацевтической композиции по п.17 для приготовления лекарственного средства на ее основе для лечения доброкачественной опухоли.
21. Применение фармацевтической композиции по п.19, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
22. Применение фармацевтической композиции по п.18 для приготовления лекарственного средства на ее основе для лечения злокачественной опухоли.
23. Применение фармацевтической композиции по п.18 для приготовления лекарственного средства на ее основе для лечения доброкачественной опухоли.
24. Применение фармацевтической композиции по п.22, отличающееся тем, что злокачественная

- 20 028151 опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
25. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, химерного пептида по п.1 или функционального пептида по п.3 в терапевтически приемлемой дозе.
26. Способ лечения доброкачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, химерного пептида по п.1 или функционального пептида по п.3 в терапевтически приемлемой дозе.
27. Способ лечения по п.25, отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
28. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.17 в терапевтически приемлемой дозе.
29. Способ лечения доброкачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.17 в терапевтически приемлемой дозе.
30. Способ лечения по п.28, отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.
31. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.18 в терапевтически приемлемой дозе.
32. Способ лечения доброкачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.18 в терапевтически приемлемой дозе.
33. Способ лечения по п.31, отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелому и злокачественную лимфому.