EA031877B1 - Применение альфа-1-микроглобулина для профилактики или лечения преэклампсии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению альфа-1-микроглобулина для профилактики или лечения преэклампсии. Кроме того, изобретение включает способ профилактики или лечения преэклампсии, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей альфа-1-микроглобулин. Изобретение обеспечивает обратное развитие патологических состояний, связанных с данным заболеванием.

Description

Изобретение относится к биомаркерам преэклампсии, а также лечению данного заболевания. Конкретно, изобретение относится к способам диагностики либо способствования диагностике преэклампсии беременной особи млекопитающего женского пола, чтобы выявить повышенные уровни отдельных веществ. Это облегчает и делает возможной раннюю диагностику и клиническое вмешательство при обнаружении состояния преэклампсии. В дополнение, изобретение относится к способу лечения особей млекопитающих женского пола с преэклампсией с целью вызвать обратное развитие патологических состояний, связанных с данным заболеванием.

Уровень техники изобретения

Преэклампсия (РЕ), гестационная протеинурическая гипертензия, осложняет 3-7% всех беременностей и представляет собой мультисистемное нарушение со стороны матери. Ежегодно сообщается о 8500000 случаев во всем мире, из которых 5000 происходят в Швеции. Сегодня это наиболее частая причина смертности как детей, так и матерей во время беременности.

РЕ была названа заболеванием теорий [Roberts, 2001] и была описана еще 3000 лет назад древними египтянами [Stevens, 1975]. РЕ все еще представляет собой одно из доминирующих акушерских осложнений, вызывающее перинатальную и материнскую заболеваемость и смертность. Клинические проявления, т.е. гипертензия и протеинурия, появляются, начиная с 20 недели развития беременности, но лежащие в ее основе механизмы могут начаться еще в период имплантации. По мере прогрессирования заболевания спазм сосудов головного мозга и отек мозга могут вызывать серьезные эпилептические припадки - эклампсию [Lipstein et al., 2003].

Этиология РЕ все еще неизвестна; однако последние данные предполагают, что заболевание развивается во 2 стадии.

Стадия 1. Во время плацентации был показан дефект врастания плацентарных клеток, трофобластов, в мышечные слои спирально извитых артерий [Brosens et al. , 2002, Page, 1939]. Растущая масса свидетельств предполагает, что окислительный стресс (см. ниже) в дальнейшем ухудшает сосудистую функцию плаценты [Roberts, 1999], что в свою очередь [Shennan et al., 2001] вызывает ослабленную перфузию крови [Hung et al. , 2002]. Следствием этого являются сужение кровеносных сосудов и повышенное сопротивление к току крови. Совокупность данных, полученных авторами изобретения, показывает вовлечение генов как в окислительно-восстановительную регуляцию, так и в воспаление [Hansson et al., 2005].

Стадия 2. Сниженная плацентарная перфузия в сочетании с окислительным стрессом вызывает генерализованное повреждение эндотелиальных клеток плаценты. В поздней части 2 стадии воспаление эндотелия также повреждает сосудистую систему матери, в особенности почек, и представляет собой типичный гистологический показатель при РЕ [Roberts et al., 1989; de Groot and Taylor, 1993; Granger et al., 2001; Strevens et al., 2003]. Связь между первой и второй стадиями на сегодняшний день неизвестна.

Как правило, преэклампсия возникает у женщин во время их первой беременности, и наиболее часто затрагивает подростков и женщин в возрасте старше 35 лет. Женщины с основными заболеваниями, которые предрасполагают их к гипертензии, также находятся среди тех, которые подвержены повышенному риску развития данного состояния. Преэклампсия является ведущей причиной материнской смертности и заболеваемости. Она является причиной 12-18% всей материнской смертности, связанной с беременностью (приблизительно 70 материнских смертей в год в Соединенных Штатах и оценивается в 50000 материнских смертей в год во всем мире). Она также связана с высокой перинатальной смертностью и заболеваемостью, в первую очередь вследствие ятрогенной недоношенности. Неврологические проявления являются общими для преэклампсии и включают от головной боли, зрительных нарушений до более тяжелых проявлений, таких как эпилептические припадки, нарушение мозгового кровообращения и корковая слепота. Единственным радикальным лечением преэклампсии является рождение плода и удаление плаценты - факт, который привел к общепринятой теории, что плацентарная патология является центральной в развитии преэклампсии. Несмотря на интенсивные усилия исследователей этиология преэклампсии остается большей частью неизвестной.

Как упоминалось выше, существует мнение, что нарушенная плацентация, ведущая к уменьшению плацентарной перфузии, является ранней стадией развития РЕ. Сниженная перфузия, связанная с увеличением сосудистого сопротивления, может быть выявлена с помощью допплеросонографии, и женщины с признаками повышенного сопротивления в маточных артериях в ранние сроки беременности (notching, узурация) имеют больший риск развития РЕ, чем женщины без данного показателя. По мере прогрессирования РЕ задействуется сосудистое русло матери, и наблюдается генерализованное воспаление эндотелия. Низкая плацентарная перфузия возникает в результате каскада патологических изменений: сниженная доставка кислорода, окислительный стресс, образование активных форм кислорода, повреждение эндотелия, повышенная проницаемость сосудов и воспаление (см. фиг. 1).

Как правило, симптомы преэклампсии появляются в третьем триместре беременности и обычно выявляются при плановом мониторинге артериального давления и мочи женщины. Однако эти способы мониторинга неэффективны для диагностики синдрома на ранней стадии. Ранняя диагностика может уменьшить риск для пациента или развития плода, и пациенты с высоким риском должны проходить

- 1 031877 специфический мониторинг. В дальнейшем эффективное лечение, которое на сегодня все еще отсутствует, было бы идеальным в сочетании с ранним выявлением.

Некоторые способы диагностики были описаны в предшествующем уровне техники, но пока ни один из них не применяется успешно во врачебной практике в больших масштабах. Например, могут быть упомянуты патенты США 5079171 и США 5108898, которые раскрывают, что преэклампсия, гипертензия, индуцированная беременностью, и эклампсия могут быть диагностированы посредством идентификации присутствия маркера эндотелиальной клетки, клеточного фибронектина, в образце крови, плазмы или сыворотки беременной женщины, например, посредством применения сэндвич- или конкурентного иммуноанализа. Клеточный фибронектин происходит из эндотелиальных клеток, которые перфорирутся или повреждаются во время течения болезни. Патент США 5238819 раскрывает диагностику преэклампсии с использованием анализа измерения митогенного фактора в крови. Митогенный фактор представляет собой белковое соединение, составляющее приблизительно 160 кДа и способное стимулировать митоз фибробластов. Его присутствие определяют посредством определения усвоения меченного радиоактивным изотопом тимидина клетками, активированными сывороткой или плазмой больного преэклампсией. Данный маркер появляется после уже случившегося повреждения сосудистого русла матери, следовательно, на поздней стадии прогрессирования заболевания.

Публикация WO 05/093413 (Yale University and Brigham and Women's Hospital) раскрывает способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных женщин, включающий измерение уровня свободного гемоглобина в образце спинномозговой жидкости.

На сегодняшний день лечение преэклампсии неизвестно. Преэклампсия может варьировать по тяжести от легкой до угрожающей жизни. Легкая форма преэклампсии может оставаться легкой на фоне постельного режима и частого мониторинга. Для средних и тяжелых случаев необходима госпитализация, а также показано медикаментозное лечение артериального давления и противосудорожные препараты для предотвращения эпилептических приступов. Если состояние становится угрожающим для жизни матери или ребенка, то единственное лечение заключается в прерывании беременности, что часто приводит к преждевременному рождению ребенка.

Несомненно, что отсутствие лечения преэклампсии, связанное с давней недостаточной возможностью диагностики, пока болезнь не прогрессировала в более тяжелую форму, вызывает необходимость в новых подходах для диагностики и лечения преэклампсии, представляющей собой значительную проблему общественного здоровья.

Описание изобретения

Соответственно, существует необходимость выявления биомаркеров, которые могут достоверно выявить: i) беременных пациенток с риском развития преэклампсии, ii) беременных пациенток, страдающих ранней стадией преэклампсии, и/или iii) беременных пациенток, страдающих преэклампсией (независимо от того, была ли она диагностирована или нет). Более того, необходимо развитие схем лечения беременных женщин любой из групп i)-iii), упомянутых выше.

Настоящее изобретение предоставляет такой биомаркер, а именно, фетальный гемоглобин, который, как было показано, поступает в материнскую систему кровообращения беременной женщины, страдающей преэклампсией.

Настоящее изобретение основано на знаниях авторов изобретения и понимании того, что повышенные уровни свободного фетального гемоглобина у беременной женщины тесно связаны с повышенным риском развития преэклампсии. Следовательно, свободный фетальный гемоглобин может быть использован в качестве биомаркера для диагностики преэклампсии, а также является мишенью-кандидатом для лечения преэклампсии.

Данный биомаркер дает возможность выявления повышенного риска развития преэклампсии на ранней стадии, таким образом, оставляя больше надежд на эффективное лечение. Также в соответствии с настоящим изобретением способы диагностики преэклампсии позволяют избежать ненужной госпитализации беременной женщины, не находящейся в группе риска. Кроме того, способ мониторинга прогрессирования или регрессии преэклампсии может помочь планировать рождение плода и уменьшить риск преждевременных родов.

Преэклампсия была кратко описана раньше в данном документе. У женщин уже после 12 недель беременности формируется маточно-плацентарный кровоток. Плацентарный барьер охраняет кровообращение плода, надежно отделенное от материнского (см. фиг. 2). Наименьшие функциональные единицы плаценты, а именно ворсинки, обеспечивают плод питательными веществами и кислородом, переносимыми через барьер. Однако при РЕ уменьшенная плацентарная перфузия приводит к менее оксигенированной крови, текущей к плаценте. Недостаток кислорода и неравномерная перфузия крови вызывают окислительный стресс в плаценте. Окислительный стресс индуцирует апоптоз плацентарных клеток, что, в свою очередь, является причиной воспаления и генерализованного повреждения эндотелиальных клеток плаценты (см. фиг. 3). При повреждении плацентарного барьера клетки плода могут переноситься в кровоток матери. Знание того, что клетки плода переносятся в кровоток матери, стало доступным, ориентировочно, в течение последних десяти лет, однако до настоящего времени никто не рассмотрел свободный гемоглобин (т.е. гемоглобин, обнаруженный вне клеток (например, в плазме) и, соответственно,

- 2 031877 не связанный в клетках). В основном проводили исследование свободной фетальной ДНК.

Подкрепленные показателями, представленными в экспериментальной части настоящего документа, авторы настоящего изобретения обнаружили повышенные уровни свободного фетального гемоглобина (или его субъединиц, альфа- и/или гамма-цепи) у пациенток, страдающих РЕ. У женщин, не страдающих РЕ, уровень свободного фетального гемоглобина должен составлять приблизительно 0,038 мкг/мл [Turpeinen et al., 1992], тогда как показатели, полученные авторами изобретения, указывают на 20кратное повышение до уровней приблизительно 1 мкг/мл или более в зависимости от тяжести заболевания.

Даже если имелись данные, что женщины, страдающие РЕ, имеют повышенный уровень общего гемоглобина, до настоящего времени нет сообщений о том, что свободный фетальный гемоглобин является достоверным показателем. Более того, измерение постепенно нарастающего повышения уровня свободного фетального гемоглобина, а не повышение общего гемоглобина, предоставляет намного более надежные и достоверные результаты. Причиной является то, что нормальный уровень общего гемоглобина намного выше, чем уровень фетального гемоглобина. Если уровень фетального гемоглобина в плазме у здоровой беременной женщины составляет 0,05 мкг/мл, а у пациентки с РЕ 1 мкг/мл, то его повышение составляет (1-0,05)/0,05х 100=2000% (или 21-кратное). Для сравнения, уровни общего гемоглобина у здоровых или страдающих РЕ пациенток составляют 3 и 4,5 мкг/мл соответственно (см. пример 5.1), которые соответствуют повышению (4,5-3)/3 х 100=50% (или в 1,5 раза).

Как показано на фиг. 1, результаты, полученные авторами изобретения, представленные в примерах в настоящем документе, показывают, что фетальный гемоглобин (Hb-F) представляет собой связь между стадией 1 и 2. В течение многих лет предполагали, что индикатором РЕ является плацентарный токсин. Известно, что стадия 1 имеет место в плаценте как последствие гипоксии в результате нарушенной перфузии. Плацентарная реакция тогда воздействует на материнскую систему, но не было выявлено никакого специфического фактора. Основываясь на результатах, представленных в экспериментальном разделе, авторы настоящего изобретения полагают, что таким фактором является фетальный Hb, в соответствии с вышеуказанными механизмами. Ранняя диагностика может помочь отследить женщин, подверженных риску развития РЕ -начальное здоровье. Женщины с клиническими признаками РЕ могут наблюдаться как амбулаторные пациенты, исходя из того, что прогрессирование можно контролировать конкретно, следовательно, посредством последующих уровней фетального Hb и/или соотношения фетальный Hb/общий Hb. Необходимость нового лечения является очевидной, а польза от него может быть громадной.

Уровень фетального гемоглобина может быть использован отдельно для оценки, находится ли пациентка в группе риска или уже имеет развившуюся преэклампсию, но он также может быть использован в сочетании с общим уровнем гемоглобина либо уровнем зрелого гемоглобина, присутствующего в конкретном организме в качестве индикатора прогрессирования заболевания.

В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что повышенные уровни свободного гемоглобина, в особенности фетального гемоглобина, у беременной женщины связаны с повышенным риском развития преэклампсии. Следовательно, фетальный гемоглобин может быть использован в качестве биомаркера для диагностики преэклампсии, а также он представляет собой подходящий объект для лечения преэклампсии.

Основываясь на данном наблюдении, настоящее изобретение относится к применению альфа-1микроглобулина для профилактики или лечения преэклампсии.

Настоящее изобретение также предусматривает применение альфа-1-микроглобулина для производства фармацевтической композиции для профилактики или лечения преэклампсии. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция для профилактики или лечения преэклампсии дополнительно содержит антитело, стволовую клетку или рекомбинантную клетку, которые нацеливают указанный альфа-1-микроглобулин на плаценту.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ профилактики или лечения преэклампсии, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей альфа-1-микроглобулин.

В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция предназначена для парентерального применения. В конкретных вариантах осуществления изобретения парентеральное применение выбрано из перечня, состоящего из внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной и подкожной инъекции.

В ещё одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция предназначена для перорального применения. В конкретных вариантах осуществления изобретения композиция находится в форме жидкой композиции или твердой композиции, разработанной для восстановления ее водой перед введением. В конкретных вариантах осуществления изобретения композиция находится в лекарственной форме, выбранной из порошков, гранул, пеллетов, шариков, сиропов, микстур, суспензий и эмульсий.

Определения.

В данном описании, пока не определено иначе, формы единственного числа означают один или

- 3 031877 более.

Как используется в данном описании, термин преэклампсия определяется в соответствии с критериями, установленными комитетом по Терминологии Американского Колледжа Акушерства и Гинекологии, т.е. гипертензия плюс протеинурия, выраженный отек или и то и другое. Например, преэклампсия может быть определена при артериальном давлении >140/90 мм рт.ст. и протеинурии >0,3 г/л.

Существуют различные формы гемоглобина. Зрелый гемоглобин (гемоглобин А) состоит из двух альфа и двух бета полипептидных цепей (Hba, Hb(l). причем каждая содержит непептидную группу гема, которая обратимо связана с одной молекулой кислорода. Гемоглобин А2, другой компонент зрелого гемоглобина, состоит из двух альфа-цепей и двух дельта-цепей (Hba, Hb5). Фетальный гемоглобин (гемоглобин F), с другой стороны, является главным компонентом гемоглобина у плода. Данный гемоглобин имеет две альфа и две гамма полипептидные цепи (Hba, Hby).

Термин свободный гемоглобин в данном описании относится к свободному гемоглобину в целом и включает общий свободный гемоглобин, свободный гемоглобин А, свободный гемоглобин А2, свободный гемоглобин F и любую субъединицу свободного гемоглобина (например, цепь Hba, Hb(3, Hb5 или Eby) или любую их комбинацию. Дополнительно, он включает данные категории гемоглобина либо в полипептидной (белок) или нуклеотидной (РНК) форме, за исключением, когда он выступает в качестве мишени для лечения. Термин свободный фетальный гемоглобин относится к свободному гемоглобину F или любой субъединице гемоглобина F и включает категории гемоглобина F в полипептидной (белок) или нуклеотидной (РНК) форме, за исключением, когда он выступает в качестве мишени для лечения.

В данном описании термин свободный при использовании, в числе прочего, в выражениях свободный гемоглобин, свободный фетальный гемоглобин, либо субъединицы свободного гемоглобина (например, цепи Hba, Hb(T Hb5 или Hby) относится к гемоглобину, фетальному гемоглобину или субъединицам гемоглобина, свободно циркулирующим в биологической текучей среде, в противоположность к клеточному гемоглобину, который относится к молекулам, остающимся внутри клеток. Термин свободный в этом смысле является, таким образом, наиболее используемым для того, чтобы отличить свободный гемоглобин от гемоглобина, который представлен в интактных эритроцитах.

Термины маркер и биомаркер в данном описании относятся к биомолекуле, предпочтительно, полипептиду или белку, которая дифференциально присутствует в образце, взятом у женщины, страдающей преэклампсией, либо женщины с повышенным риском развития преэклампсии, по сравнению с образцом сравнения, взятым у женщины, называемой здоровой женщиной/пациенткой, которая не страдает преэклампсией или не подвержена повышенному риску развития преэклампсии.

Термин биологический образец от беременной особи млекопитающего женского пола или его эквиваленты предназначены обозначать образец от самого млекопитающего; соответственно, образец не получают от, например, плода или амниотической жидкости.

По всему описанию любая и все ссылки конкретно включены в данную патентную заявку посредством ссылки.

Касательно i) способа диагностики РЕ.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предоставлен способ диагностики или способствования диагностике преэклампсии, включающий следующие стадии: (а) получение биологического образца от беременной особи млекопитающего женского пола; (b) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в указанном биологическом образце; и (с) сравнение уровня свободного фетального гемоглобина в образце с контрольным значением или сравнение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с контрольным значением, для определения, страдает или не страдает преэклампсией указанная беременная особь, или подвержена она или нет повышенному риску развития преэклампсии.

Стадия получения биологического образца от указанной беременной особи млекопитающего женского пола включает процесс получения биологического образца, полученного стандартными способами, хорошо известными в данной области.

Биологический образец может представлять собой, например, кровь, плазму крови, мочу, вагинальный секрет, слезную жидкость, ткани, сыворотку, кал, гной, амниотическую жидкость и спинномозговую жидкость. В конкретных вариантах осуществления биологическим образцом является кровь, моча, амниотическая жидкость или плацентарная ткань.

В определенных вариантах осуществления биологическим образцом является кровь, плазма, моча, или плацентарная ткань.

Количество собранного биологического образца варьирует в зависимости от индивидуальных потребностей и чувствительностей. Собранное количество может широко варьировать в зависимости от используемого типа тестирования, места сбора и возможности каких-либо неблагоприятных воздействий для матери или плода. В конкретном варианте осуществления количество образца крови находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 75 мл, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 40 мл.

- 4 031877

Предполагается, что способы по данному изобретению являются применимыми к любым животным, которые являются плацентарными животными, т.е. животным, у которых внутриутробное питание плода происходит через плаценту. Такие животные включают, среди прочих, людей, других приматов, млекопитающих мясо-молочных животных. Предпочтительным животным для диагностики является человек или хозяйственно ценное животное или крупный рогатый скот.

В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим является человек.

В определенном варианте осуществления образцы собирают у беременных женщин. Беременная женщина может представлять собой индивидуума, у которого определили высокий риск преэклампсии, основываясь на ее личном или семейном анамнезе. А еще пациенты, в числе прочих, включают беременных женщин, о которых известно, что они страдают преэклампсией, и для которых тест применяют для того, чтобы определить эффективность терапии или лечения, которое они получают. Также пациенты могут включать здоровых беременных женщин, которым проводят тест, как часть регулярного исследования.

Если желательно, образец может быть получен для того, чтобы повысить возможность выявления свободного фетального гемоглобина. Обычно получение образца включает разделение на фракции образца и собирание фракций, у которых определено, что они содержат свободный гемоглобин. Способы предварительного фракционирования включают, например, центрифугирование, извлечение РНК/ДНК, гель-хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез и жидкостную хроматографию.

Стадия измерения уровня свободного фетального гемоглобина может быть выполнена, например, посредством иммунологического анализа (например, ELISA, или другого твердофазного иммуноанализа, такого как SPRIA или расширенного ELISA, так называемого IMRAMP), анализа чипов белка, количественной ПЦР-амплификации в режиме реального времени, поверхностно-усиливаемой лазерной десорбции/ионизации (SELDI), высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, гибридизации in situ, иммуногистохимии, хемилюминисценции, нефелометрии/турбометрии, проточной или чистой или поляризованной флуоресценции или электрофореза. Однако для специалиста в данной области должно быть понятно, что данный список методов не является полным, и данные методы не являются единственно подходящими способами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении для измерения уровня свободного фетального гемоглобина.

Вещества, подлежащие выявлению и/или измерению в способах изобретения, включают общий гемоглобин, гемоглобин А, гемоглобин А2, гемоглобин F, любые из цепей гемоглобина (Hba, Π6β, Hb5 и Hby) или любые их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления изобретения цепь гаммагемоглобина (Hby) выявляют и измеряют способом по изобретению. Понятно, что гемоглобин F и его субъединицы являются наиболее важными, поскольку эти обнаружения основаны на повышенных уровнях свободного фетального гемоглобина и его влиянии на развитие РЕ. Как обсуждается в данном документе, гамма-цепь служит признаком фетального гемоглобина, тогда как, например, бета- и дельта-цепи служат признаком зрелого гемоглобина. Основываясь на описании настоящего изобретения, специалист в данной области будет знать, какие цепи гемоглобина должны быть измерены.

В соответствии с настоящим изобретением иммунологический анализ (иммуноанализ) может быть использован для измерения уровня свободного гемоглобина. Иммуноанализ представляет собой анализ, в котором используют антитело для того, чтобы специфично связать антиген (например, гемоглобина). Иммуноанализ отличается использованием свойств специфического связывания конкретных антител, для того чтобы выделить, пометить и/или определить количество антигена. Таким образом, в условиях обозначенного иммуноанализа указанные антитела связывают конкретный белок по меньшей мере в два раза чаще, чем фоновый белок, и не связывают, по существу, значительное количество других белков, присутствующих в образце. Используя очищенные маркеры или последовательности их нуклеиновых кислот, могут быть получены антитела, которые специфично связаны с маркером (например, гемоглобином), с использованием любых подходящих способов, известных в данной области [см., например, Coligan, 1991].

В определенном варианте осуществления первого аспекта уровень свободного фетального гемоглобина измеряют, например, используя иммунологический анализ. Конкретно, иммунологический анализ представляет собой ELISA. Однако, как продемонстрировано в примерах в данном документе, также может быть использован вестерн-блоттинг.

В определенном варианте осуществления первого аспекта уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения РНК свободного фетального гемоглобина. Конкретно, РНК свободного фетального гемоглобина измеряют с использованием ПЦР в режиме реального времени. В тех случаях, когда также определяют уровень общего гемоглобина, данный уровень может быть также определен посредством измерения РНК альфа-цепи гемоглобина, например посредством использования ПЦР в режиме реального времени.

В целом, образец, полученный у субъекта, может быть подвергнут взаимодействию с антителом, которое специфично связывает маркер. Необязательно, антитела могут быть зафиксированы на твердом носителе для того, чтобы облегчить отмывание и последующее выделение комплекса перед взаимодей- 5 031877 ствием антител с образцом. Примеры твердых носителей включают стекло или пластик в виде, например, планшета для микротитрования, палочки, гранулы или микрогранулы.

После инкубации образцы с антителами, смесь отмывают, и образованный комплекс антителамаркер может быть обнаружен. Это может быть выполнено посредством инкубации отмытой смеси с реагентом для выявления. Данный реагент для выявления может представлять собой, например, второе антитело, которое помечают определяемой меткой. Примеры определяемых меток включают магнитные микроносители, флуоресцентные красители, радиоизотопные метки, ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие обычно используемые в ELISA) и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или пластмассовые гранулы.

В качестве альтернативы, маркер в образце может быть выявлен с использованием непрямого анализа, при котором, например, второе меченое антитело используют, чтобы выявить маркер, связанный специфическим антителом, и/или в конкурентном или анализе подавления, где, например, моноклональное антитело, которое связывает конкретный эпитоп маркера инкубируют одновременно со смесью.

Способы измерения количества или наличия комплекса антитело-маркер включают, например, определение флуоресценсции, люминесценции, хемолюминесценции, абсорбции, отражения, проницаемости, показателя преломления (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрия, способ резонансного зеркала, синхронизированный способ со связанным волноводом или интеферометрия) или радиоактивность. Оптические способы включают микроскопию (как конфокальную, так и неконфокальную), способы с визуализацией и способы без визуализации. Электрохимические способы включают способы вольтаметрии и амперометрии. Радиочастотные способы включают мультиполярную резонансную спектроскопию.

Применяющиеся анализы являются хорошо известными в данной области, включая, например, ферментный иммуноанализ (EIA), такой как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ, такой как RIA и SPRIA; анализ вестерн-блоттинг; или анализ слот-блоттинг.

В конкретном варианте изобретения ELISA является предпочтительным способом измерения уровня свободного гемоглобина.

В соответствии с настоящим изобретением стадия измерения уровня свободного фетального гемоглобина также может быть выполнена посредством выявления и измерения свободной РНК, кодирующей полипептиды гемоглобина в образце, например выявление последовательностей РНК, кодирующих гамма-цепь гемоглобина (Hby) или ее фрагменты в плазме крови.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления РНК свободного гемоглобина подсчитывают, используя ПЦР в режиме реального времени.

На этапе сравнения уровня свободного гемоглобина в образце с нормальным значением или сравнения соотношения между уровнем субъединицы свободного гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с нормальным значением термин контрольное значение по отношению к настоящему изобретению в соответствии с вариантом осуществления относится к определенному исходному уровню или среднему уровню свободного гемоглобина, т.е. к уровню свободного гемоглобина, который измеряют на стадии (b), или соотношению между уровнем субъединицы свободного гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце из контрольной группы. Предпочтительно, чтобы контрольная группа включала беременных особей млекопитающих женского пола без диагноза преэклампсии.

При использовании контрольной группы определение контрольного значения свободного фетального гемоглобина выполняют с использованием стандартных способов исследования, хорошо известных в данной области. Значение будет, конечно, изменяться в зависимости от, например, применяемого типа исследования, типа свободного гемоглобина, подлежащего измерению, типа биологического образца и группы пациенток. Например, нормальные средние уровни общего свободного гемоглобина крови в группе беременных женщин без диагноза преэклампсии и измеренные ELISA находятся обычно в диапазоне от 2,5 до 3,5 мкг/мл, но, конечно, могут изменяться в зависимости от возраста, массы, количества предыдущих беременностей и т.д.

В случае, когда указанное контрольное значение представляет собой уровень свободного фетального гемоглобина или соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах из контрольной группы, повышенный уровень свободного фетального гемоглобина или повышенное значение указанного соотношения в образце относительно контрольного значения показывает, что указанная беременная особь страдает преэклампсией или подвержена повышенному риску развития преэклампсии.

В определенном варианте осуществления первого аспекта контрольное значение представляет собой уровень свободного фетального гемоглобина или соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах из контрольной группы, где повышенный уровень свободного фетального гемоглобина или повышенное значение указанного соотношения в образце относительно контрольного значения показывает, что указанная беременная особь страдает преэклампсией или подвержена повышенному риску развития преэклампсии. Предварительные результаты - использование способа Вестерн Блоттинг для определения свободного фетального гемогло- 6 031877 бина - показывают, что женщины, имеющие уровень в плазме, равный приблизительно 5 мкг/мл или выше или, в качестве альтернативы, уровень в моче, равный 1 мкг/мл или выше, подвержены РЕ или развитию РЕ. Ожидается, однако, что данные значения будут лучше идентифицироваться с использованием более чувствительного способа, как, например, ELISA. В литературе сообщалось, что нормальный уровень в плазме фетального гемоглобина составляет приблизительно 0,3-76 мг/л, т.е. 0,0003-0,076 мкг/мл (см. Turpeinen et al, 1992) со средним значением, равным 0,038 мкг/мл. Соответственно, определенные уровни фетального гемоглобина были замечены у женщин при развитии РЕ или уже страдающих РЕ. Соответственно, предполагается, что женщины, имеющие уровень фетального гемоглобина в плазме в 510 раз или более выше нормального уровня (т.е. 0,3 мкг/мл или более), подвержены риску развития РЕ. Однако ожидается также, что данное значение будет лучше идентифицироваться с использованием более чувствительного способа, как, например, ELISA. В конкретных вариантах осуществления предполагается, что если уровень фетального гемоглобина в плазме составляет приблизительно в 20 раз или более, приблизительно в 50 раз или более, приблизительно в 75 раз или более или приблизительно в 100 раз или более, то женщина либо подвержена риску развития, или страдает РЕ, либо на стадии 1 или 2. Другими словами, применяют рассмотренный и предоставленный вышеупомянутый нормальный диапазон, причем женщина подвержена риску или страдает РЕ, если уровень свободного фетального гемоглобина в плазме составляет приблизительно 0,5 мкг/мл или более, такой как, например, приблизительно 0,75 мкг/мл или более, приблизительно 1 мкг/мл или более, приблизительно 1,25 мкг/мл или более, приблизительно 1,5 мкг/мл или более, приблизительно 1,75 мкг/мл или более, приблизительно 2 мкг/мл или более, приблизительно 2,5 мкг/мл или более, приблизительно 3 мкг/мл или более, приблизительно 3,5 мкг/мл или более, приблизительно 4 мкг/мл или более, приблизительно 4,5 мкг/мл или более или приблизительно 5 мкг/мл. Предполагается, что болезнь на настоящей стадии с пониженным уровнем фетального гемоглобина является менее тяжелой. Прогрессирование (или регрессия) болезни могут сопровождаться частым измерением уровня фетального гемоглобина у одной и той же женщины.

Результаты примеров данного документа подкрепляют вышеупомянутые соображения. Таким образом, при использовании способа Вестерн блоттинга приблизительно 20% женщин во II группе (т.е. группе уже страдающих РЕ) имели уровень в плазме, равный 5 мкг/мл или более. Что касается уровня в моче приблизительно 20% женщин, страдающих РЕ, имели уровень фетального Hb в моче, равный 1 мкг/мл или более (см. пример 5.2). Соответственно, что касается уровней в моче, оказывается, уровень немного ниже, чем уровень в плазме и, соответственно, применяют все уровни, упомянутые выше для плазмы, но пониженные уровни в моче уменьшают до приблизительно 0,06 мкг/мл или более, приблизительно 0,1 мкг/мл или более, приблизительно 0,2 мкг/мл или более, приблизительно 0,4 мкг/мл или более и т.д.

Иным способом, чем рассматривать точный уровень фетального гемоглобина в плазме или моче с целью решить, подвержена ли женщина риску или уже имеется признак РЕ, является рассмотреть среднеквадратическое отклонения для теста, проводимого при определении уровня в плазме или моче (или, фактически, уровень в любой другой подходящей жидкости организма). В данном документе предполагается, что подходящим параметром является превышение нормального уровня (например, в плазме или моче и т.д.) 5-кратное среднеквадратическое отклонение или более, такое как, например, 10-кратное среднеквадратическое отклонение или более, 25-кратное среднеквадратическое отклонение или более, 50-кратное среднеквадратическое отклонение или более или 100-кратное среднеквадратическое отклонение или более.

Что касается измерения соотношения (R) между свободным фетальным Hb (Hb F) и свободным общим гемоглобином (общий Hb), соотношение у нормальной женщины (т.е. не страдающей РЕ) является приблизительно 0,038 мкг/мл/3 мкг/мл=0,012, когда измеряют два параметра посредством флуорометрического иммуноанализа с разрешением во времени, как описано Turpeinen et al., и ELISA, как описано ниже (пример 5). Соответственно, предполагается, что соотношение R, равное 0,12 или более, указывает, что женщина подвержена риску или имеет уже развившуюся РЕ на определенной стадии. В определенных вариантах осуществления о риске РЕ или определенной стадии заболевания свидетельствует, если R составляет 0,15 или выше, как, например, 0,2 или выше, 0,3 или выше, 0,4 или выше, 0,5 или выше или 0,6 или выше. Теоретически, R=1, когда весь (100%) свободный общий Hb является фетальным Hb. Следовательно, это верхний предел.

Настоящее изобретение предполагает также использование способов, описанных в данном документе в сочетании с другими способами диагностики. Способы диагностики, которые могут быть использованы в сочетании со способами по изобретению, включают существующие способы диагностики или способствования диагностике преэклампсии, известные медицинским практикующим специалистам в данной области, в качестве примеров таких способов может быть упомянуто измерение уровня урата или уровня цистатина С в сыворотке. Биологический образец может сперва быть проанализирован посредством способов, описанных в данном документе. Затем биологический образец может быть протестирован посредством других способов для подтверждения наблюдения. Следовательно, точность диагностического способа настоящего изобретения может быть улучшена посредством его сочетания с другими способами диагностики.

Касательно ii) оценки прогрессирования/регрессии РЕ.

- 7 031877

В дополнительных вариантах осуществления свободный фетальный гемоглобин, например субъединицы свободного фетального гемоглобина, могут быть использованы для определения состояния преэклампсии (например, тяжелая преэклампсия) и для прогнозирования, т.е. предварительной оценки исхода заболевания у пациентки, например концентрация свободного гемоглобина коррелирует с тяжестью преэклампсии (например, преэклампсия легкой тяжести и тяжелая преэклампсия). Известно, что неврологические проявления, такие как эпилептические припадки или кома (эклампсия), нарушения мозгового кровообращения, гипертензионная энцефалопатия, головные боли и нарушения зрения (скотома, диплопия, амавроз, гомонимная гемианопсия, являются общими при тяжелой преэклампсии) [Douglas and Redman, 1994].

Таким образом, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предоставлен способ контроля прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий: (а) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего женского пола; (b) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у указанной беременной особи млекопитающего женского пола в более поздний момент времени; и (с) сравнение значений, измеренных на стадиях (а) и (b), где повышение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или увеличение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии; а понижение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или понижение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.

Авторы изобретения проводили выездную часть своего исследования в Muhimbili Hospital в ДарЭс-Саламе, главном городе Танзании (см. пример 5). Данный Muhimbili Hospital является специализированным центром третьего уровня, принимающим пациенток преимущественно из муниципальных больниц. Muhimbili University of Health and Allied Sciences (MUHAS) является единственным публичным университетом в стране, предлагающим высшее образование для обучения медико-санитарным дисциплинам. Большие количества беременностей, осложненных РЕ и эклампсией в Танзании, делают его подходящим для исследования, проведенного авторами изобретения. В Muhimbili Hospital РЕ была обнаружена у 16% женщин, посещающих дородовые женские консультации. Частота встречаемости эклампсии на базе больницы составляла 200/10000 посещений, основываясь на исследованиях в период 1999-2000. Это можно сравнить с частотой встречаемости 5/10000 беременностей в Европе. Десять пациенток с тяжелой РЕ или эклампсией и десять связанных контрольных моделей были включены в исследование (см. следующую таблицу).

Таблица 1. Клинические характеристики родов пациенток, которые участвовали в данном исследовании

	РЕ	Контроль
Количество’	10	10
Возраст (годы)	28, 5 (19-40)	21,5 (18-30)
Количество рожденных детей	1,6±2,3	0, 6±1, 4
Внутриутробный возраст плода (дни)	256 (217-266)	280 (231-287)
Систолическое давление (мм рт.ст.)*	191134	115+9
Диастолическое давление (мм рт, ст.) ***	124118	7417
Протеинурия (т/л)*”-ь	2,6±0,8	0,3±1,0
Масса при рождении (г)	20051717	30401398
Масса плаценты (т)	3351120	506+68
Сечения (п)	6	4
IUFD (п)	5	0
Эклампсия (п)	4	0

РЕ - преэклампсия.

Был использован односторонний дисперсионный анализ со вторичным тестом Бонферрони для статистической оценки различий между группами. Считалось, что значение р<0,05 является статистически значимым.

- 8 031877 ***Тест показал существенное различие между РЕ и контролем (р<0,001).

^а Один случай материнской смерти в течение 24 ч после родов в группе РЕ.

^b Значения протеинурии являются неточными по причине ограничения способа. Наибольшее измеряемое значение было 3 г/л.

Пациентки были выбраны в течение шестинедельного периода, сентябрь-октябрь 2007 года в Отделении Гинекологии и Акушерства Muhimbili Hospital. Группа преэклампсии была выбрана из блока интенсивной терапии эклампсии, где госпитализировали в среднем по две пациентки с РЕ в день. Признаками включения являлись либо тяжелая РЕ (диастолическое артериальное давление >110 мм рт.ст. при двух измерениях) или эклампсия. Все пациентки с зафиксированной хронической гипертензией перед беременностью были исключены из изучения. Пациентки были опрошены с использованием опросного листа, переведенного на Суахили. Медицинские карты для каждой участвующей пациентки были изучены для получения дополнительной информации. Женщины, включенные в исследование, имели стойкое повышение артериального давления в течение первых 24 ч госпитализации и протеинурию >1 г/л. Были зафиксированы возраст, количество рожденных детей, количество посещений предродовой консультации, способ родов, поступление в период родов, результаты для матери и плода.

Образцы мочи, собранные перед родами, показали статистически достоверное различие уровней общего гемоглобина между РЕ и контрольными группами (фиг. 21). Статистическая обработка данных была проведена посредством непараметрического U-теста по методу Манна и Уитни, который показал значение р, равное 0,0093. Среднее значение для группы преэклампсии было 31,0 мкг/мл по сравнению с 2,5 мкг/мл у контрольной группы. Высокое значение у контрольной группы наиболее вероятно является таким по причине высокого влияния малярии. Также были проанализированы образцы мочи, собранные после родов.

В конкретных вариантах осуществления предполагается, что повышение уровня свободного фетального гемоглобина, соответствующего двойному среднеквадратическому отклонению или более, такому как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, указывает на повышенный риск развития РЕ и/или прогрессирование заболевания. В аналогичном предмете понижение уровня свободного фетального гемоглобина, соответствующего двойному среднеквадратическому отклонению или более, такому как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, указывает на пониженный риск развития РЕ и/или регрессию заболевания. Еще один критерий может представлять собой соотношение (R₁) между Hb F в момент времени t₂ и Hb F в момент времени t₁, где t₁ является временем взятия первого образца, а t₂ является временем взятия второго образца. Повышение R₁ является указанием на прогрессирование заболевания, а понижение R₁ является указанием на регрессию заболевания. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной, благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение R₁, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение R₁, равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.

В тех случаях, когда используют соотношение R (т.е. соотношение между Hb F и общим Hb), критерий обычно представляет собой соотношение между R (R2), полученным во второй момент времени, и R, полученным в первый момент времени (R₁). Повышение R₂/R₁ представляет собой показатель прогрессирования заболевания, а понижение R₂/R₁ представляет собой показатель регрессии заболевания. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной, благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение R₂/R₁, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение R₂/R₁, равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.

Подробности, упомянутые в первом аспекте, также применяют к данному и следующим аспектам.

Касательно iii) способа оценки эффективности конкретного лечения РЕ.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предоставлен способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий следующие стадии: (а) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего женского пола перед лечением; (b) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце от той же беременной особи млекопитающего женского пола после лечения; и (с) сравнение уровня или уровней, определенных в (а), с уровнем или уровнями, определенными в (b) , где понижение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или понижение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемо- 9 031877 глобина в первом образце указывает, что лечение является эффективным для излечения преэклампсии.

В конкретных вариантах осуществления предполагается, что эффективность лечения может быть оценена посредством определения какого-либо понижения уровня свободного фетального гемоглобина. Если понижение уровня соответствует двум среднеквадратическим отклонениям или более, таким как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, это является показателем того, что лечение было эффективным для понижения прогрессирования РЕ и/или лечения заболевания и/или облегчения симптомов, связанных с заболеванием. В аналогичном предмете повышение уровня свободного фетального гемоглобина, соответствующего двум среднеквадратическим отклонениям или более, таким как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, это является показателем того, что лечение было неэффективным. Еще один критерий может представлять собой соотношение (R₁) между Hb F в момент времени t₂ и Hb F в момент времени t₁, где t₁ является временем взятия первого образца, а t₂ является временем взятия второго образца. Повышение R₁ является указанием на прогрессирование заболевания, т.е. лечение является неудовлетворительным, тогда как повышение R1 является показателем регрессии заболевания и эффективного лечения. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной, благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение R₁, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение R₁, равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.

В тех случаях, когда используют соотношение R (т.е. соотношение между Hb F и общим Hb), критерий обычно представляет собой соотношение между R (R2), полученным во второй момент времени, и R, полученным в первый момент времени (R₁). Повышение R₂/R₁ представляет собой показатель прогрессирования заболевания, т.е. лечение, похоже, не удовлетворительно, а понижение R2/R1 представляет собой показатель регрессии заболевания, т.е., похоже, лечение имеет желательный эффект. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение R₂/R₁, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение R₂/R₁, равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.

Касательно iv) набора для диагностики.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения предоставлен набор для анализа для диагностики или способствования диагностике эклампсии в соответствии с настоящим изобретением, содержащий средства измерения уровня свободного фетального гемоглобина в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола и инструкции по применению указанного средства определения.

Настоящее изобретение предоставляет наборы для диагностики или способствования диагностике эклампсии. Наборы используют для определения или скрининга наличия свободного гемоглобина, который дифференцировано присутствует в образцах пациенток с преэклампсией.

В одном варианте осуществления набор содержит средства для определения в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола уровней свободного гемоглобина (например, альфа-цепи гемоглобина (Hba), бета-цепи гемоглобина (Hb3), дельта-цепи гемоглобина (Hb5), гаммацепи гемоглобина (Hby) и общего свободного гемоглобина) или отдельно, или в сочетании с другими средствами определения, и инструкции по применению указанных средств определения. В качестве альтернативы или дополнительно набор в соответствии с изобретением содержит средства определения мРНК фетального Hb.

В предпочтительном варианте осуществления набор содержит средства определения уровня свободного фетального гемоглобина, например средство измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (Hby) в образце. В еще одном варианте осуществления он дополнительно содержит средства определения уровня общего свободного гемоглобина.

В одном варианте осуществления средство определения содержит антитела, специфичные для гемоглобина, предпочтительно для фетального гемоглобина (например, антитела против Hby человека).

В дополнительном варианте осуществления указанные инструкции содержат подходящие рабочие параметры в виде наклейки или отдельного вкладыша. Например, инструкции могут информировать потребителя, как собирать образец и как отмывать пробу. Особенно осторожно должны отбираться образцы крови, чтобы минимизировать гемолиз, для того чтобы избежать ложных значений общего Hb.

Применяемый набор в способе изобретения может дополнительно содержать показатели нормы анализируемых веществ, реагенты и т.д.

В определенном варианте осуществления четвертого аспекта уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (Hby).

В определенном варианте осуществления четвертого аспекта набор для анализа дополнительно

- 10 031877 включает средство определения уровня общего свободного гемоглобина, например, для того чтобы определить соотношения общего Hb и фетального Hb и/или мРНК фетального Hb.

Более конкретно, набор для диагностики изобретения может, например, содержать все компоненты (кроме воды), которые необходимы, чтобы выполнить ELISA, разработанный для того, чтобы измерить концентрацию фетального гемоглобина в образце или два ELISA, разработанные для того, чтобы измерить как концентрацию фетального гемоглобина, так и общего гемоглобина в образце. Предпочтительным способом измерения концентраций фетального гемоглобина является сравнительный вариант ELISA, описанный ниже в данном документе.

Гемоглобин-F, разбавленный до 1-5 мкг/мл в водном растворе, наносят на 96-луночные планшеты для микротитрования посредством выдерживания в течение ночи. Предварительные планшеты будут предоставлены готовыми для применения в наборе. В больнице лунки планшета для микротитрования должны быть выдержаны со смесью, содержащей 50 мкл кроличьих анти-гемоглобин-F, разбавленных в 1000-10000 раз водным раствором А (например, 0,9% NaCl, содержащий 0,1% детергента, например Tween 20, и 0,1% альбумина плазмы быка) плюс либо 50 мкл серий стандартных образцов оксигемоглобина-F, разбавленных водным раствором А до концентраций 1-10000 нг/мл, или 50 мкл образцов от пациенток (разбавленных 100-10000-кратно водным раствором А). Данная смесь должна быть оставлена в лунках планшета для микротитрования в течение периода времени от 30 мин до 3 ч при комнатной температуре. Затем планшеты должны быть трижды отмыты водным раствором А, и каждая лунка выдерживается в течение 30 мин со 100 мкл свиной противокроличьей IgG-щелочной фосфатазой (ALP), разбавленного 1000-10000-кратно водным раствором А. Затем планшеты должны быть трижды отмыты водным раствором A и в заключение выдержаны в веществе, с которым ALP может специфически реагировать, превращая его в окрашенный продукт. Раствор вещества может представлять собой, например, пнитрофенилфосфат 1 мкг/мл в 1М диэтаноламина плюс 0,5 мМ MgCl₂, рН 9,8. Тогда концентрация продукта (интенсивность окрашивания) в лунке является пропорциональной количеству антигемоглобина-F в той лунке, а количество антител в свою очередь является обратно пропорциональным количеству гемоглобина-F пациента или контрольного образца. Интенсивность окрашивания может быть точно определена посредством микротитровальных планшет-ридеров светопоглощающего типа или даже оценена на глаз.

Специалисту в данной области техники очевидно, что именно фермент пероксидаза хрена (HRP), а не ALP, присоединяется ко вторичным антителам. В данном аспекте, однако, HRP не может быть использован, так как гемоглобин, который будет присутствовать в тех же лунках планшета для микротитрования, также представляет собой фермент пероксидазы и будет давать ошибочно высокие значения окрашенного продукта.

Насколько авторам изобретения известно, конкурентный ELISA, использующий поликлональную антисыворотку кролика в сочетании с ALP, не был ранее использован для измерения фетального гемоглобина-F.

Руководство пользователя, содержащее инструкции, касающиеся методики, точных значений, разбавлений, концентраций, периодов выдерживания и температур каждой стадии и реагента, будут предоставлены с набором. Также предоставляются предварительно покрытые планшеты для микротитрования, растворы оксигемоглобина-F или общего гемоглобина для покрытия и серии разведенных стандартов, раствор антигемоглобина-F кролика или антиобщего гемоглобина кролика, раствор антикроличьего IgGALP свиньи, раствор ALP-вещества и водный раствор А.

Оксигемоглобин-F или общий гемоглобин будут получены в лабораториях авторов изобретения, как описано далее. Красные кровяные клетки из 50 мл крови хорды человека (получение Hb-F) или крови взрослого человека (получение общего Hb) выделяют центрифугированием (1200xg, 10 мин) и отмывают 4 раза с 10 объемами фосфатного буферного солевого раствора (PBS, 10 мМ фосфата, рН 7,4; 120 мМ NaCl и 3 мМ KCl). Затем клетки крови растворяют посредством ресуспендирования в гипотоническом буфере (20 объемов Н₂О:1 объем PBS), имеющемся в запасе. Мембраны отделяют от цитозоли посредством центрифугирования (14000xg, 20 мин), и супернатант диализируют 3 раза против 15 мМ Трис-HCl, рН 8,0 при 4°С. Двести мл ДЕАЕ-Сефарозы (GE Healthcare) заполняют в колонку и диализированный супернатант переносят в гель и разделяют посредством градиента, состоящего из 15 мМ Трис-HCl, рН 8,0 плюс 0,2М NaCl. Фракции собирают и измеряют поглощение при 280, 577 и 630 нм для идентификации и определения концентрации оксигемоглобина-F или общего оксигемоглобина [Winterbourn, 1990]. Раствор для покрытия и стандартные серии получают посредством разбавления в водном растворе А.

Антиобщий гемоглобин кролика куплен у Dako, Denmark, a антигемоглобин-F кролика получают посредством иммунизации кроликов очищенной γ-цепью гемоглобина (Hb-γ) и извлечения крови у кроликов в соответствии со стандартными протоколами. Иммунизацию и извлечение крови проделывают коммерческим способом (аутсорсинг). Hb-γ очищают от Hb-F в лаборатории авторов изобретения посредством диссоциирования и отделения α- и γ-цепей, главным образом, следуя протоколам Kajita et al. [1969] и Noble [1971]. Калий-фосфат (0,1 мл 1М KH₂PO₄) и хлорид натрия (0,2 мл 2М NaCl) добавляют к 10 мл 3% (м/о) раствора гемоглобина-F. Пятьдесят мг п-бензоата ртути растворяют в 0,2 мл 1М NaOH и к

- 11 031877 нему добавляют 1 мл воды. Данные два раствора смешивают, осторожно титруют с 1М уксусной кислоты до рН 4,5 и оставляют на холоде на ночь, слегка перемещая. Следующим утром рН доводят до 7 с 1М NaOH и центрифугируют (5000xg, 10 мин, 10°С). Осадок в пробирке удаляют, а супернатант диализируют против 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Диализированный образец затем переносят в колонку с 10 мл ДЕАЕСефарозы (GE Healthcare), который предварительно уравновесили с 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5. После внесения образца, колонку ополаскивают 50 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, а затем соляно-буферным градиентом, состоящим из 100 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 и 100 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 плюс 0,2М NaCl. Внесение образца, отмывание и градиентное элюирование проделывают при скорости потока 40 мл/ч и собирая 3 мл фракций. Концентрации α- и γ-цепей каждой элюированной фракции затем оценивают посредством поглощения света при 415 нм, SDS-PAGE, нативного PAGE и аминоконцевого секвенирования белков. Фракции, содержащие чистую γ-цепей, объединяют, добавляют 2-меркаптоэтанол до 50 мМ для диссациации п-бензотата ртути из полуцистинов. П-бензоат ртути затем удаляют из белка посредством обессоливания на колонке Sephadex G-25 (PD-10, GE Healthcare), элюируя 0,1М фосфата натрия рН 7,5 плюс 50 мМ 2-меркаптоэтанола. В заключение, элюированные белковые фракции диализируют против 0,1М фосфата натрия, рН 7,5.

Антикроличий IgG-ALP свиньи покупают в Sigma, тогда как раствор веществ и водный раствор А получают в лаборатории авторов изобретения из имеющихся в продаже химических веществ.

В качестве альтернативы ELISA фетального гемоглобина может представлять собой ELISA типа сэндвича с использованием для покрытия моноклональных или поликлональных антител, специфичных к Eb-γ, клинического образца с соответствующим разбавлением или серий стандартного фетального гемоглобина на инкубационной стадии 1 и антигемоглобин-ALP кролика на второй инкубационной стадии.

В качестве альтернативы, белковый чип, покрытый моноклональными антителами, специфично реагирующими с Eb-γ, могут быть применены в наборе для диагностики в качестве средства измерения концентрации фетального гемоглобина в клинических образцах.

Касательно v) веществ и композиций для использования для предотвращения и/или лечения РЕ.

В соответствии с открытиями, публикуемыми в данном документе, что свободный фетальный гемоглобин является индикатором РЕ и что понижение уровня Hb F (или уровня Hb в целом), вероятно, снижает какое-либо прогрессирование болезни, предполагается, что любые вещества, которые имеют i) способность ингибировать образование свободного Hb (свободного Hb F или любого другого Hb), ii) способность связывать свободный Hb (свободный Hb F или любой другой Hb) или iii) способный понижать концентрацию свободного Hb в кровотоке (свободного Hb F или любого другого Hb) , будут представлять собой потенциальное вещество для эффективного лечения и/или предотвращения РЕ. Соответственно, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предоставлено применение по меньшей мере одного составного элемента, выбранного из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин; средств, связывающих/разрушающих гем; средств, связывающих железо; средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина, разрушение гема и/или образование комплекса с железом; и/или средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз для лечения РЕ. Более того, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предоставлено применение такого вещества для производства фармацевтического препарата для лечения или профилактики преэклампсии.

Термины лечение или профилактика в своих разнообразных грамматических формах в отношении настоящего изобретения относятся к предотвращению, исцелению, вызыванию обратного развития, смягчению, облегчению, улучшению, ингибированию, минимизированию, подавлению или остановке (1) отрицательного воздействия преэклампсии, (2) прогрессирования заболевания или (3) причинного фактора заболевания.

Гемоглобин является ответственным за насыщение кислородом, но свободный гемоглобин в кровотоке является токсичным для тканей за счет изменения васкулярного окислительно-восстановительного баланса в процессе самоокисления гема из его двухвалентного в трехвалентное состояние [Motterlini et al., 1995] и возможно через индукцию глобин-сосредоточенных свободных радикалов [Svistunenko et al., 1997].

Авторы изобретения предполагают, что повышение уровней свободного гемоглобина в крови женщин с преэклампсией служит не только маркером болезни, но является также ответственным или частично ответственным за протекание болезни, наблюдаемое обычно у таких пациенток. Следовательно, свободный гемоглобин является также возможной целью при лечении преэклампсии. Даже если свободный фетальный гемоглобин рассматривается как маркер для РЕ, предполагается, что снижение свободного гемоглобина, в целом, (т.е. фетального гемоглобина, а также более неспецифичного гемоглобина, такого как, например, зрелый гемоглобина человека) будет минимизировать прогрессирование или лечение РЕ.

В определенном варианте осуществления данного аспекта средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляет собой альфа 1-микроглобуолин. В дальнейшем данное вещество будет называться альфа 1-микроглобуолин или а₁-микроглобуолин и обозначаться a₁m. Другими названиями для данного вещества, которые использовались в научной литературе, являются белок

- 12 031877

НС (ответственный за гетерогенность; комплексообразующий у человека), АМВР-белок и альфа 1микрогликопротеин, но данные названия являются синонимичными к a₁m.

В определенном варианте осуществления данного аспекта средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляют собой антитела, специфичные к гемоглобину и/или тему.

Соответственно, настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или профилактики преэклампсии, причем такой способ включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, эффективного количества одного или нескольких таких веществ, упомянутых выше, включая по меньшей мере один составной элемент, выбранный из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин и/или средств, связывающих/разрушающих гем и/или средств, связывающих железо; средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема и/или образование комплекса с железом; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз. Обычно вещество может быть введено в виде фармацевтической композиции, содержащей активное вещество в сочетании с одним или более фармацевтически доступными наполнителями.

Более того, настоящее изобретение предоставляет применение по меньшей мере одного составного элемента, выбранного из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин и/или средств, связывающих/разрушающих гем, средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема и/или образование комплекса с железом; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз, для производства фармацевтического препарата для лечения или профилактики преэклампсии; и способ лечения или профилактики преэклампсии, причем такой способ включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, эффективного количества фармацевтического препарата, содержащего по меньшей мере один составной элемент, выбранный из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин и/или средств, связывающих/разрушающих гем и/или веществ, образующих комплекс с железом, средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема и/или образование комплекса с железом; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз. В данных аспектах целью является понижение количества свободного гемоглобина и продукта его разрушения гема, например, в материнской крови, для предотвращения повреждения тканей и дополнительного прогрессирования болезни.

Средства, связывающие гемоглобин, и/или средства, связывающие/разрушающие гем, представляют собой соединения, которые демонстрируют свойства связывания/разрушения гемоглобина и/или гема. Вещества, образующие комплекс с железом, представляют собой соединения, которые связывают свободное железо и предотвращают его участие в восстановительно-окислительных реакциях.

В одном варианте осуществления средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее/разрушающее гем, представляют собой a₁m. Этот небольшой белок плазмы или ткани представляет собой средство, связывающее гем [Allhorn et al., 2002; Larsson et al., 2004] и акцептор радикалов [Akerstrom et al., 2007], а форма, разрушающая гем, t-a₁m, индуцируется протеолитическим удалением Стерминального тетрапептида, LIPR, когда a₁m смешивают со свободным гемоглобином [Allhorn et al., 2002]. Он также может связываться с гемоглобином в плацентах (см. ниже). Свободный гемоглобин и активные формы кислорода являются причиной усиленного продуцирования a₁m в клетках печени и клетках крови [Olsson et al., 2007]. Вследствие этого a₁m является потенциальным гем- и гемоглобиновым антагонистом, который может защитить от гем- и гемоглобин индуцированного повреждения соединениям клеток и тканей. Примеры 5.4-5.7 предоставляют этому дополнительное доказательство. Таким образом, пример 5.4 показывает, что пациентки, страдающие преэклампсией, отвечают на болезнь повышением уровней a₁m, пример 5.5 показывает, что a₁m ингибирует и восстанавливает геминдуцированное окислительное повреждение клеток и тканей, пример 5.6 описывает модель плаценты in vitro, где тестирования терапевтических веществ могут проводиться с пошаговым приближением к тестированиям in vivo, пример 5.7 показывает, что гемоглобин связан a₁m в ткани плаценты.

Другие вещества, которые как предполагают, являются потенциально активными веществами для лечения или предотвращения РЕ, представляют собой нижеследующие.

Средства, связывающие гемоглобин.

Антитела.

Могут быть получены моноклональные антитела с сильным связыванием гемоглобина и блокированием окислительно-восстановительной ферментной активности гемоглобина. Антитела могут быть получены посредством иммунизации in vivo или in vitro или выбраны из предварительно существующих библиотек. Антитела могут быть выбраны для специфичности против альфа-, бета- или гаммаглобиновых цепей или против общих участков цепей данных глобинов. Антитела могут быть модифицированы для того, чтобы сделать их пригодными для лечения людей, т.е. обеспечить каркасом человеческого иммуноглобулина. Могут быть использованы любые части антител: Fv-, Fab-фрагменты или целый иммуноглобулин.

Г аптоглобулин.

Гаптоглобулин представляет собой гликопротеин, обнаруженный в плазме крови. Существуют три

- 13 031877 формы гаптоглобулина, Hp1-1, Hp2-1 и Нр2-2. Все формы связываются с гемоглобином и образуют НрHb комплекс. Нр-Hb комплекс имеет более слабую окислительно-восстановительную ферментную активность, чем свободный гемоглобин, и вследствие этого, является причиной меньшего окислительного повреждения. Связывание с Hb предотвращает, например, потерю железа гем группы.

CD163.

CD163 представляет собой фагоцитарный рецептор, обнаруженный на макрофагах, моноцитах и ретикулоэндотелиальной системе, выстилающей кровеносные сосуды. Рецептор распознает Нр-Hb комплекс и опосредует эндоцитоз и его доставку к лизосомам, разрушение посредством НО-1 (см. ниже) и секвестрацию свободного железа клеточным ферритином. Вследствие этого CD163 участвует в элиминировании гемоглобин-индуцированного окислительного стресса.

Средства, связывающие/разрушающие гем.

Г емопексин.

Г емопексин представляет собой гликопротеин (60 кДа), обнаруженный в плазме крови человека, и который элиминирует свободный гем из плазмы крови посредством сильного его связывания (Kd приблизительно 1 пмоль/л) и транспортировки гема в печень для разрушения в ретикулоэндотелиальной системе.

Гем-оксигеназа.

Гем-оксигеназа представляет собой клеточный гем-связывающий и разрушающий ферментный комплекс, который преобразует гем в биливердин, монооксид углерода и свободное железо. Последний секвестируется клеточным ферритином, а биливердин восстанавливается редуктазой биливердина в билирубин, который, в конечном счете, выделяется в мочу. Были описаны три вида генов оксигеназы гема, с очень различными структурами, НО-1, НО-2 и НО-3. НО-1 является наиболее важным. Данный ген активируется, практически, во всех клетках тела гемоглобином, свободным гемом, гипоксией, свободными радикалами, ROS (активными формами кислорода) и многими другими возбуждающими сигналами. НО1 является сильным антиоксидантом по причине того, что он элиминирует оксиданты гема и железа, но также по причине того, что он продуцирует билирубин, который имеет анти-окислительное действие против некоторых аксидантов.

Альбумин.

Альбумин представляет собой 66 кДа белок в плазме крови человека, который может связывать гем. Нет свидетельства о клеточном захвате и разрушении комплекса альбумин-гем, и действие альбумина возможно состоит в том, чтобы выступать в качестве хранилища гема, предотвращая, таким образом, гем от вхождения в мембраны эндотелиальных клеток, базальные мембраны сосудов и т.д.

Средства, связывающие железо.

Трансферрин.

Трансферрин представляет собой наиболее важный переносчик железа в крови. Комплекс трансферрин-железо опознается и связывается клеточными рецепторами, которые интернализируют и диссоциируют комплекс.

Ферритин.

Данный мультимерный белок, состоящий из 24 субъединиц двух типов, представляет собой главное межклеточное хранилище свободного железа. Он имеет высокую железо-сохраняющую способность, 4500 атомов железа/молекулу ферритина. Связанное ферритином железо наиболее сильно предохраняется от окислительных и восстановительных реакций, а вследствие этого, от вызванного окислением повреждения.

В дополнительном варианте осуществления средство, связывающее гемоглобин, представляет собой антитело, специфичное для гемоглобина и/или гема.

В конкретных вариантах осуществления фармацевтический препарат содержит комбинацию средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих гем, и/или веществ, секвестирующих железо.

Вещества, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема, включают, но не ограничиваются подобным белку гаптоглобином, гемопексином и оксигеназой гема.

Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут быть введены плацентарному животному, такому как человек, другому примату или млекопитающему мясо-молочному животному. Предпочтительным животным для введения является человек или хозяйственно ценное животное или крупный рогатый скот.

Введение может быть выполнено различными путями, в зависимости от того, какое животное лечить, состояния животного, нуждающегося в указанном лечении и конкретном показателе для лечения. Путь введения может быть пероральным, ректальным, парентеральным или через назогастральный зонд. Примерами парентеральных путей введения являются внутривенная, внутрибрюшинная, внутримышечная или подкожная инъекция.

Состав фармацевтического препарата должен быть выбран в зависимости не только от фармацевтических свойств активных ингредиентов, но также от их физико-химических свойств и вида способа введения. Различные способы составления фармацевтических препаратов хорошо известны специалистам в

- 14 031877 данной области.

Для парентеральных композиций предпочтительны жидкие композиции или твердые композиции, разработанные для восстановления их, например, жидкой средой перед применением. Подходящие вспомогательные средства включают растворители (например, воду, водную среду, спирты, растительные масла, липиды, органические растворители подобные пропиленгликолю и т.п.), регуляторы осмотического давления (например, хлорид натрия, маннитол и т.п.), солюбилизаторы, вещества, регулирующие рН, консерванты (если требуется), усилители абсорбции и т.д.

Для пероральных композиций композиции могут быть в твердой, полутвердой или жидкой формах. Подходящие композиции включают твердые лекарственные формы (например, таблетки, включающие все виды таблеток, саше и капсулы), порошки, гранулы, пеллеты, шарики, сиропы, микстуры, суспензии, эмульсии и т.п.

Подходящие вспомогательные средства включают, например, наполнители, связующие вещества, разрыхлители, смазывающие вещества и т.д. (для твердых лекарственных форм или композиций в твердой форме), растворители, такие как, например, вода, органические растворители, растительные масла и т.д., для жидкой или полу твердой форм. Более того, могут быть добавлены добавки, такие как вещества, регулирующие рН, вещества, исправляющие вкус лекарственных средств, отдушки, стабилизирующие вещества и т.д.

Более того, могут быть включены специфичные переносчики для выделения активного вещества в специфичной части тела. Например, комплекс антитело-а₁т, где антитело нацелено на плаценту (хоминг) посредством его специфичности для плацентарного эпитопа; стволовая клетка или рекомбинантная клетка со свойствами плацентарного хоминга, например интегрин-рецепторы, специфичные для плаценты и с искусственно созданной или естественной способностью секретировать большое количество (/.,111. Лечение было бы более эффективным, если бы лекарство было сконцентрировано в плаценте.

Термин эффективное количество в связи с изобретением относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения. Он означает предварительно заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемыми вспомогательными веществами и разбавителями; т.е. носителем или средствами введения. Дополнительно, он означает количество, достаточное для снижения, и наиболее предпочтительно, предотвращения клинически значимого дефицита в активности и ответе хозяина. В качестве альтернативы, терапевтически эффективное количество, достаточное для того, чтобы вызвать клинически значимое улучшение состояния хозяина. Специалистам в данной области понятно, что количество соединения может изменяться в зависимости от его специфической активности. Подходящий размер дозы может содержать предварительно определенное количество активной композиции, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемыми разбавителями; т.е. носителем или вспомогательным веществом. Дополнительно, доза, предполагаемая к введению, будет изменяться в зависимости от используемого действующего начала или начал лекарственного вещества, возраста, массы и т.д. пациента, подлежащего лечению, но, в целом, будет в пределах диапазона от 0,001 до 1000 мг/кг массы тела/день. Более того, доза зависит от способа введения.

Касательно vi) HLA-DPA1 в качестве биомаркера.

Дополнительный аспект изобретения относится к обнаружению, что фетальные клетки могут инициировать материнский иммунный ответ, поскольку они являются различными. Роль семейства генов HLA заключается в том, чтобы презентировать чужеродные антигены материнской иммунной системе. Женщины, которые экпрессируют HLA-DPA1 гены, могут видеть фетальные клетки на ранней стадии, что могло бы помочь их защите от дальнейшего повреждения. (На стадиях, о которых сообщается в данном документе, авторы наблюдали, что женщины с обнаруженной, но не развивающейся РЕ, экспрессировали HLA-DPA1.)

Соответственно, HLA-DPA1 могут быть использованы в качестве непрямого индикатора для фетального гемоглобина и/или для РЕ. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предоставлен способ прогнозирования преэклампсии, включающий следующие стадии: (а) получение биологического образца у беременной особи млекопитающего женского пола; (b) измерение уровня человеческого лейкоцитарного антигена DPA1 (HLA-DPA1), в указанном биологическом образце; и (с) сравнение уровня HLA-DPA1 в образце с контрольным значением. Предполагают, что, если присутствуют вышеуказанные композиции HLA, у особи, возможно, имеется меньший риск развития РЕ (со свободным фетальным НВ или без него), тогда как если особь не имеет данного защитного HLA, то она подвержена большему риску, особенно, если также повышен уровень свободного фетального Hb.

В определенном варианте осуществления данного аспекта стадии (а)-(с) осуществляют для того, чтобы определить, подвержена или не подвержена указанная беременная особь женского пола повышенному риску развития преэклампсии, или подвержена или не подвержена повышенному риску развития тяжелой формы преэклампсии.

В определенном варианте осуществления данного аспекта экспрессия или сильная экспрессия HLADPA1 указывает на лучшее прогнозированию, чем без экспрессии HLA-DPA1.

- 15 031877

В последнем аспекте настоящего изобретения предоставлен набор для анализа для прогнозирования и способствования прогнозировании преэклампсии в соответствии со способом прогнозирования для преэклампсии, в соответствии с изобретением, содержащий средства для определения в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола уровней HLA-DPA1 и инструкции по применению указанных средств определения.

Изобретение будет теперь описано более подробно.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает расширенную модель развития преэклампсии, основанную на обнаружениях HbF и Hb-А в материнской плазме крови, выделении информации о появлении Hb-F и Hb-А и возможном их использовании в качестве маркеров различных стадий болезни;

фиг. 2А - плаценту на раннем сроке беременности (ультразвук), В показывает кровообращение плода в ворсинках, резко снижающееся в интервиллезном пространстве, наполненном материнской кровью, а С показывает наименьшую функциональную единицу-ворсинку с кровообращением плода;

фиг. 3А - кровообращение плода в ворсинках, резко снижающееся в интервиллезном пространстве, наполненном слабо оксигенированной материнской кровью (более темным), В показывает, что в клетках-трофобластах активными формами кислорода (ROS) индуцируется апоптоз (овальные штрихи), а С показывает поврежденный плацентарный барьер крови;

фиг. 4 - результаты количественного определения мРНК Hba, Hby, Hb/ и HLA-DPA1 в плаценте методом ПЦР в режиме реального времени;

фиг. 5 - изображения гибридизаций in situ из образцов плаценты человека и плацентарной площадки;

фиг. 6 представляет собой типичное изображение экспрессии белка Hby в плаценте;

фиг. 7 показывает диаграмму рассеивания уровней мРНК Hby в материнской плаценте, отобранной перед родами, у женщины с РЕ, количественно определенного посредством ПЦР в режиме реального времени. Диаграмма показывает значение Ct по левой оси, давая оценку количества уровней мРНК Hby в образце;

фиг. 8 - типичные гель-изображения для Hb5. А) Образец РЕ, где пятно Hb5 ясно видно (стрелка). В) Гель из контрольного образца, где пятно Hb5 отсутствует (кружок);

фиг. 9 - значения мРНК Hb5 в плаценте, количественно определенные с.|ПЦР. представленные на диаграмме рассеивания;

фиг. 10 - изображения in situ преэклампсированной плаценты, экспрессирующей мРНК Hb5;

фиг. 11 - гибридизации in situ образцов плаценты и плацентарной площадки (левая панель). Темное поле изображает экспрессию мРНК гемоглобина в типичном образце преэклампсированной плаценты и контроле. Экспрессия мРНК гемоглобина была особенно видна в и вокруг кровеносных сосудов (головки стрелок). Некоторые рассеянные клетки в интервиллезном пространстве видны в РЕ. Иммуногистохимия (правая панель) показывает накопление свободного фетального гемоглобина (стрелка) в просвете (lu) працентарной васкулатуры;

фиг. 12 - общие концентрации гемоглобина в плазме женщин с преэкламптической беременностью (n=30) и нормальной беременностью (n=30). Концентрации были измерены посредством ELISA с использованием антител против зрелого гемоглобина (Hb-А), разбавление плазмы 1000х;

фиг. 13 - определение Hb-F Вестерн-блоттингом в плазме двух пациенток с преэклампсией (РЕ 1 и 2) и двух контрольных индивидуумов с нормальной беременностью (контроль 1 и 2). Образцы плазмы обрабатывали альбумин-экстрагирующими шариками, как описано, а затем применяли (15 мкл), не разбавленными, по методике электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)/Вестерн-блоттинга. Для того чтобы иметь возможность оценить концентрацию в мкг/мл, 0,1 мкг очищенного Hb-F применяли на отдельной полосе (очищенный Hb-F);

фиг. 14 - кровообращение плода с клетками, синтезирующими гемоглобин (белые овалы с черными точками). Из-за нарушения плацентарного барьера фетальные клетки просачиваются в интервиллезное пространство и, таким образом, в кровоток матери;

фиг. 15 - концентрации общей a₁m в плазме женщин с преэкламптическими беременностями (n=30) и нормальными беременностями (n=30). Концентрации измеряли посредством RIA, с разбавлением плазмы 500х;

фиг. 16А - клеточно-защитные свойства a₁m против гем- и ROS-индуцированного окисления. Клетки К562 метили окислительно-чувствительным зондом H2DCFDA, отмывали и инкубировали с a₁m (2,5 или 10 мкМ), AGP (2,5 или 10 мкМ) или аскорбатом (10 мкМ) перед добавлением 10 мкМ гема. Клетки инкубировали в течение 2 ч и анализировали FACS. В. Клетки К562 культивировали с a₁m (2,5 или 10 мкМ) или контрольным белком («^-кислый гликопротеин, AGP) (10 мкМ) перед добавлением 200 мкМ гема и культивировали 4 ч. Клеточную суспензию собирали, смешивали с иодидом пропидия и анализировали FACS;

фиг. 17 - восстановление карбонильных групп на окисленном коллагене посредством a₁m. Коллаген, нанесенный на плашки для микротитрования, окисляли посредством инкубирования с 50 мкМ гема в

- 16 031877 течение 17 ч. После отмывания добавили 0,1, 0,3 или 1 мкМ овальбумина или аскорбата и инкубировали в течение 2 ч. Карбонильные группы измеряли посредством ELISA. Каждый столбец представляет средние из трех значений +/-СО;

фиг. 18 - улавливание клеточного гема посредством a₁m. Эритролейкемийные клетки человека (К562) культивировали либо с буфером или с 10 мкМ гема в течение 30 мин, отмывали и ресуспендировали в свежей культуральной среде. А: Затем клетки инкубировали с a₁m (2 или 10 мкМ) в течение 2 ч, после чего культуральную среду сохраняли. Клетки отмывали и солюбилизировали посредством суспендирования в буфере, содержащем 1% NP-40. Затем культуральную среду и клеточную суспензию спектрофотометрически анализировали посредством считывания спектра поглощения (300-700 нм). В: Также визуально анализировали различные культуры. Клетки инкубировали либо с буфером или 10 мкМ гема в течение 30 мин (стадия 1), отмывали и затем инкубировали с буфером, 10 мкМ a₁m или 10 мкМ AGP в течение 2 ч (стадия 2), отмывали и солюбилизировали, как описано выше;

фиг. 19 показывает перфузию in vitro здоровой плаценты в течение 120 мин с раствором Hb-А (2 мкг/мл) на фетальной стороне (пустые символы) и только с буфером на материнской стороне (закрашенные символы) (1-я перфузия) и в течение 120 мин на обеих сторонах только с буфером (2-я перфузия). Образцы отбирали равномерно, и концентрацию Hb-А измеряли посредством ELISA (левая диаграмма), a₁m с RIA (правая диаграмма), а фетального Hb-А Вестерн-блоттингом (правое фото);

фиг. 20 - электрофорез в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг комплекса гемоглобин-α₁m, извлеченного из ткани плаценты. Плаценту здорового донора гомогенизировали и центрифугировали при 100000 G в течение 60 мин. Супернатант вводили в колонку с анти-α₁m Аффигелем, которую промывали и элюировали 0,1М глицин-HCl, рН 2,3. Элюат отделяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле, который либо окрашивали Кумасси (две левые дорожки), или переносили на мембраны PVDF и блоттировали с анти-α₁m или анти-Hb-А;

фиг. 21 - результат исследования в Танзании. Показан общий гемоглобин (мкг/мл) в моче перед родами.

Следующие примеры приводятся для иллюстрации изобретения. Должно быть понятно, однако, что не предполагается ограничивать изобретение конкретными условиями и подробностями, описанными в данных примерах.

Пример 1.

Обнаружение РНК Hb и белка в плаценте.

Количественный ПЦР-РВ, гибридизация in situ и иммуногистохимию проводили для анализа мРНК Hba, Hbe и Hby и экспрессии белка в образцах плаценты у пациенток с РЕ и контрольной группы.

Отбор образцов.

Ткань плаценты отбирали в Отделении Акушерства и Гинекологии Больницы Лундского Университета. Взятие материала, выполненное с письменного согласия, было одобрено Этическим Комитетом Наблюдательного Совета для изучения людей-пациентов. В исследование включали ткани плаценты 10 преэклампсированных, 15 нормальных беременных, 5 пациенток с билатеральной узурацией и 5 пациенток с билатеральной узурацией, а также преэклампсией. Также отбирали образцы плацентарных площадок (см. ниже) у 5 пациенток с РЕ и 5 контрольной группы. Преэклампсию определяли как артериальное давление >140/90 мм рт.ст., и протеинурия >0,3 г/л. Были исключены пациентки с существенной гипертензией или другими системными заболеваниями. Образцы плаценты отбирали при рождении, немедленно замораживали и сохраняли при -80°С.

Отбор образцов тканей и операции с ними.

Образцы плаценты отбирали немедленно после родов. Кубик размером 10x10x10 мм ворсистой ткани удаляли из центральной части плаценты, избегая микроскопических областей некроза и инфаркта. Кубики размером 10x10x10 мм ткани матки отбирали у женщин, перенесших кесарево сечение. Образцы немедленно замораживали сухим льдом и сохраняли при -80°С до извлечения РНК. Ткань не размораживали перед извлечением РНК или криосекцией, для того чтобы обеспечить максимально возможную целостность РНК.

Извлечение РНК.

Общую РНК извлекали из замороженной ткани с использованием Trizol® (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Протеогликан и полисахариды удаляли посредством выполнения высокосолевого осаждения 0,8М цитратом натрия и 1,2М хлоридом натрия. Целостность РНК определяли посредством денатурирования электрофорезом в 1% агарозном геле с 6,7% формалином и 1xMOPS буфером. Образцы сохраняли в воде без рибонуклеаз при -80°С до использования. Перед использованием образцы осаждали еще раз и отмывали 70% этанолом для того, чтобы удалить остатки Тризола.

Амплификация ПЦР в режиме реалвного времени.

кДНК синтезировали с обратной транскриптазой в соответствии с протоколами от Applied Biosystems. Использовали 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг общей РНК, 1хбуфера TaqMan RT, 5,5 мМ MgCl₂, 500 мкМ dNTP, 2,5 мМ случайно выбранных гексамеров, 0,4 ед./мкл ингибитора РНКазы

- 17 031877 и 1,25 ед./мкл обратной транскриптазы MultiScribe. Реакционные смеси инкубировали при 25°С в течение 10 мин, при 48°С в течение 30 мин и в заключение 5 мин при 95°С. Образцы хранили при -20°С до проведения анализа.

Транскрипты генов анализировали посредством ПЦР в режиме реального времени с использованием системы определения последовательностей ABI PRISM® 7000 (Applied Biosystems). Праймеры и зонды разработали с использование программного обеспечения Primer Express® или заказали у Assays onDesign/Demand™ (Applied Biosystems). Праймеры намечали различные экзоны генов интереса, чтобы избежать усиления контаминации геномной ДНК. Реакции проводили в 25 мкл конечного объема, содержащего: 1xUniversal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,25 мкмоль/л зонда, 0,9 мкмоль/л прямого и обратного праймеров соответственно и 1 мкл 10 нг/мкл аликвоты ДНК. Условия теплового цикла были инициированы посредством активации UNG при 50°С в течение 2 мин и начального денатурирования при 95°С в течение 10 мин. Затем провели 40 циклов: 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин. Два негативных контроля без матрицы включали в каждый комплект амплификации, β-актин использовали в качестве ориентира для нормализации сигнала от образца. Количественная обработка была достигнута посредством создания калибровочной кривой с использованием серийных 4-кратных разведений матрицы ДНК (0,08-80 нг). Результаты выражены как соотношения с β-актином в качестве деноминатора.

Гибридизация in situ (ISHH).

Гибридизации проводили, как предварительно описано [Hansson et al., 2005]. Замороженные срезы, которые сохраняли при -80°С до их использования, были установлены размороженными на предметные стекла, обработанные сиаловой кислотой. Свежезамороженную ткань использовали для предельного увеличения определения мРНК. Срезы фиксировали, обезвоживали, обезжиривали и гибридизировали, как ранее описано [Bradley et al., 1992]. Гибридизацию проводили в течение 20-24 ч при 55°С 2x106 свм денатурированного зонда 35S-KPHK на 80 мкл гибридизационного буфера (20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 300 мМ NaCl, 50% формамида, 10% дикстрансульфата, 1xDenhardt 25 мкг/мл тРНК дрожжей, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 250 мкг/мл общей РНК дрожжей (фракция XI, Sigma), 150 мМ дитиотреитола (DTT), 0,15% тиосульфата натрия (NTS) и 0,15% додецилсульфата натрия (SDS). После промывок предметные стекла устанавливали на Kodak Hyperfilm Biomax MR на 2 дня, после чего их покрывали ядерной трековой эмульсией (NTB-3, Kodak). Покровные стекла выдерживали в течение 3 (Hba2, Hby2) и соответственно 4 (Hbx) недель при 4°С, после чего их проявляли в Dektol (Kodak), фиксировали и контрастно окрашивали красителем Гиемса.

Иммуногистохимия.

Свежезамороженные срезы образцов плаценты толщиной 14 мкм фиксировали посредством погружения в 4% буферный формальдегид в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали в блокинг-растворе (Powerblock; Zymed) в течение 30 мин при комнатной температуре. После отмывания PBS срезы переносили в антитела против человеческого фетального гемоглобина, разбавленные 1:500 (Bethyl Laboratories), которые нарабатывали в овце. Вслед за инкубированием в течение часа при комнатной температуре срезы промывали и переносили на час при комнатной температуре в разбавленные 1:1000 антитела против овечьих CY3, наработанные в осле (Jackson laboratories). Затем срезы отмывали, покрывали 0,1М Трис и рассматривали под микроскопом с обращенной флуоресценцией Leica DMA 6000. Изображения были получены с использованием программного обеспечения Volocity.

Результаты.

Фиг. 4 показывает количественное определение Hba, Hby and Hb/ в плаценте методом ПЦР в режиме реального времени. Все значения были нормализованы по отношению к количеству β-актина и представлены как диаграммы рассеивания. (А) Экспрессия мРНК Hba плаценты. Были обнаружены значительные изменения между РЕ в сравнении с контролем (р=0,004) и между РЕ/узурация (РЕ с узурацией) в сравнении с контролем (р=0,03). (В) Значения Hby относительно мРНК показывают значительные изменения между РЕ в сравнении с контролем (р=0,003) и между РЕ/узурация в сравнении с контролем (р=0,03). (С) Hbe показал наличие значительной сверхэкспрессии РЕ в сравнении с контролем (р=0,02) и РЕ/узурация в сравнении с контролем (р=0,04).

Подводя итог, было обнаружено, что уровни мРНК Hba (р=0,004), Hby (р=0,003) и (р=0,02) значительно увеличены в образцах РЕ в сравнении с контролем (фиг. 4 А, В, С), а также в образцах с узурацией по сравнению с контролем (Hba p=0,02, Hby р=0,03 и Hb(i р=0,04). (Μόβ не был представлен в матрице, но изучался по причине изменений, выявленных для Hba и Hby.)

Фиг. 5 показывает результаты гибридизации in situ образцов плаценты и плацентарной площадки. Она показывает изображение плаценты человека, демонстрируя участок ворсинчатой ткани (V) плаценты и ниже участок плацентарной площадки (М) со спиральными артериями (S) между ними. (А) Изображение светлого поля экспрессии мРНК Hba является типичным для образца преэкламптической плаценты. Экспрессия Hba была особенно различима в кровеносных сосудах и вокруг них. Однако также различимы несколько рассредоточенных клеток в интервиллезном пространстве. (В) Изображение темного поля того же участка. (С) Изображение темного поля экспрессии мРНК Hba типичной контрольной плаценты

- 18 031877 в сравнении с плацентами РЕ показывает меньшее количество Hba экспрессирующих клеток в интервиллезном пространстве. (D) Изображение светлого поля образца типичной матки пациентки с РЕ. Экспрессия Hba видна только в спиральных артериях, в ткани матки экспрессия не видна. (Е) Тот же участок матки в темном поле. (F) Образец матки контрольной плаценты. Экспрессия мРНК Hba является подобной экспрессии, наблюдаемой в матке РЕ.

Подводя итог, гибридизация in situ выявляет клетки с ярко выраженным ядром, экспрессирующие Hba и Hby, которые были рассеяны по всему интервиллезному пространству, как в РЕ, так и в контрольных образцах. Оказалось, что плаценты пациенток с РЕ имеют больше клеток, содержащих Hb, чем контрольные образцы (фетальный Hb), а сигналы на клетку возникали более интенсивно, чем в контрольных. В нескольких из изученных образцов Hb-положительные клетки были связаны со стенками кровеносных сосудов с несколькими клетками, находящимися свободно в просвете. Было обнаружено множество отдельных клеток в интервиллезном пространстве. Основываясь на их морфологии, локализации и распространении, можно заключить, что они не являются трофобластами.

Фиг. 6 представляет собой типичное изображение экспрессии белка Hby в плаценте. Экспрессия белка указана красным флуоресцентным маркером. В плаценте РЕ наблюдается сильная экспрессия Hby в просвете сосудов (lu), но Hby также экспрессируется эндотелием сосудов (стрелка) (А). Однако плацента от контрольных пациенток с нормальным давлением не демонстрирует экспрессию Hby в просвете сосудов (В), но Hby (т.е. свободный фетальный гемоглобин) экспрессируется эндотелием сосудов (стрелка). Единица масштаба изображения составляет 25 мкм.

Подводя итог, экспрессия Hby была преимущественно выявлена в просвете плацентарных кровеносных сосудов образцов плаценты РЕ, но также вблизи эндотелиальных клеток стенок сосудов. Контрольные образцы плаценты показали экспрессию Hby в эндотелии сосудов без экспрессии в просвете сосуда.

Обсуждение.

Количественная ПЦР в режиме реального времени показала повышенную экспрессию мРНК Hba и Hby в РЕ по сравнению с контролем. Гибридизация in situ показала повышенное количество клеток, экспрессирующих гемоглобин в образцах плаценты РЕ по сравнению с контрольными пациентами. Тот факт, что клетки, экспрессирующие гемоглобин, находились во взаимосвязи со стенками сосудов, может либо указывать на то, что клетки мигрируют в сосуды или из них или что существуют связывающие участки на стенках сосудов для данных клеток. Тот факт, что сосуды матки обеднены клетками с ярко выраженным ядром, экспрессирующими мРНК Hb, по сравнению с сосудами плаценты, которые обогащены ими, позволяет предположить, что данные клетки не могут быть материнского происхождения. Данные, полученные авторами изобретения, о том, что мРНК Hby (фетального) представлена в плацентарных Hb-положительных клетках, а также низкое число клеток, экспрессирующих НЬ в просвете кровеносных сосудов матки, указывают на то, что именно фетальные клетки являются ответственными за повышенную экспрессию Hb, наблюдаемую в плацентах и крови при РЕ.

Если фетальные клетки, продуцирующие Hb, которые описаны авторами изобретения, имеют быстрый кругооборот, то они могут высвобождать высокий уровень гема во вневорсинчатое пространство и кровеносные сосуды плаценты. Действительно, иммуногистохимия, выполненная авторами изобретения, выявила высокий уровень гемоглобина в просвете кровеносных сосудов плаценты РЕ. С другой стороны, контрольная плацента не выявила высвобождение гемоглобина в кровеносные сосуды. Гемолиз в некротических и тромботических зонах плаценты РЕ может добавлять туда количество свободного гемоглобина и ухудшать показатели.

Свободный гем представляет собой сильное окислительно-восстановительное вещество, которое может вызывать серьезные повреждения посредством образования активных форм кислорода (ROS). Гем окисляет некоторые липиды, включая липопротеины с низкой плотностью (LDL), превращая их в цитотоксические пероксиды, которые вызывают повреждение эндотелия. Более того, гем может напрямую повреждать клеточные мембраны, перфорируя их и окисляя белки мембран, что приводит к повышению мембранной проницаемости и цитолизу.

Таким образом, инфильтрация плаценты большими количествами Hb позитивных клеток (т.е. фетальных клеток) является настораживающим признаком. Гем, высвобождающийся данными клетками, может быть достаточно вредным и может быть ответственным за многие из плацентарных патологий, связанных с РЕ.

В заключение, не имея желания связывать себя теорией, полагают, что данные, полученные авторами изобретения, позволяют предположить, что гены Hb являются сверхэкспрессируемыми в субпопуляции клеток в преэкламптической плаценте. Продуцирование веществ, стимулирующих гемопоэз плацентраными клетками в ответ на пониженную перфузию и возможную локальную гипоксию, может вносить вклад в формирование, привлечение и распространение клеток. Несмотря на то что, по-видимому, они присутствуют в плаценте женщин с нормальным течением беременности, их увеличение в плаценте пациенток с РЕ является фактом, заслуживающим рассмотрения. Если они имеют быстрый кругооборот и избыточно высвобождают свой Hb (и гем), они могут повреждать расположенные рядом структуры,

- 19 031877 включая эндотелий сосудов.

Пример 2.

Определение фетального Hb в материнской крови.

Для анализа мРНК Hb в образцах крови пациенток, страдающих РЕ, была проведена количественная ПЦР в режиме реального времени.

ПЦР в режиме реального времени.

РНК экстрагировали с использованием мининабора вирусных РНК QIAamp (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Кратко, 3,6 мл буфера AVL смешивали с 36 мкл РНК-носителя (Qiagen) переворачиванием пробирки 10 раз. 1 мл образца плазмы центрифугировали при 1150 g в течение 10 мин. К раствору буфера AVL добавляли 900 мкл плазмы и 3,6 мкл 99% этанола. Приблизительно 650 мкл раствора добавляли на колонку QIAamp и центрифугировали при 6000 g в течение 1 мин. Это повторяли до тех пор, пока на колонку не добавляли объем общей плазмы. Колонку однократно промывали буфером AW1, затем центрифугировали при 6000 g в течение 1 мин, вслед за чем промывали буфером AW2, затем центрифугировали при 20000 g в течение 3 мин. РНК элюировали 50 мкл воды без РНКазы.

Количество РНК фетального Hb определяли посредством ПЦР в режиме реального времени. Результаты.

Фиг. 7 показывает диаграмму рассеивания уровней мРНК фетального Hby материнской плазмы, взятой перед родами у женщины, страдающей РЕ, количественно определенных посредством ПЦР в режиме реального времени. Диаграмма показывает значение Ct на левой оси, давая оценку количества уровней мРНК Hby в образце. Это показывает, что возможно не только измерить уровни белка гемоглобина γ в образцах материнской крови, но также количеств мРНК.

Пример 3.

Определение профиля экспрессии белка преэкламптической плаценты с использованием 2Dгельэлектрофореза.

Для того чтобы провести скрининг дифференцированно экспрессируемых белков в плаценте РЕ в сравнении с контрольными плацентами, авторы изобретения собирали образцы плаценты во время родов женщин, страдающих РЕ (n=30) и здоровых женщин контрольной группы (n=30). Используя технологию протеомики (электрофореза в 2-мерном геле), авторы изобретения сравнивали уровни экспрессии гемоглобина-дельта (Hb5) в различных образцах плаценты.

Пациентки и сбор образцов.

женщин, госпитализированных в Отделение Акушерства и Гинекологии Больницы Лундского Университета, были включены в исследование и разделены на две группы: РЕ (n=30) и контрольная (n=30) (табл. 2). Диагноз РЕ ставили при артериальном давлении >140/90 мм рт.ст. и протеинурии >0,3 г/л, или повышении артериального давления более чем на 20 мм рт.ст. по сравнению с первым триместром беременности. Сразу после удаления плаценты отбирали кубик размерами 10x10x10 мм ткани плаценты. Образцы немедленно замораживали сухим льдом и сохраняли при -80°С. Пациенты с другими системными заболеваниями были исключены из исследования. Исследование было одобрено Этическим Комитетом Наблюдательного Совета для изучения людей-пациенток, а все женщины дали письменное информированное согласие.

Таблица 2

	Контроль	РЕ
η	30	30 ns
Возраст матерей (годы)	31,7 + 5, 2	30,9+5,3 ns

Внутриутробный возраст плода (дни)	271,3±10,Θ	266,6±11,2 ns
Систолическое давление (мм рт.ст*)	116,3±11,3	149,8±12,It
Диастолическое давление (мм рт.ст *)	67,3+4,4	103,3+7,9f
Протеинурия (г/л)	ND	1,4±2,Of
Масса плаценты (г)	686, 8±144, 8	630,±128,0 ns

РЕ - преэклампсия;

ND - не определено;

ns - нет значительной разницы между группами;

j - тест Манна-Виттни, показывающий значимость между группами, равную р<0,0001. Экстракция белка.

Белок был экстрагирован с использованием Trizol® (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко, ткань плаценты гомогенизировали в Тризоле на льду и затем центрифугировали

- 20 031877 при 12000g в течение 10 мин при 4°С. Белковую фракцию отделяли с использованием хлороформа и осаждали с использованием 2-пропанола. Капли осажденного белка отмывали три раза в 1,5 мл 0,3М гуанидингидрохлорида и один раз в 1,5 мл 75% этанола. Осадок растворяли в 0,8М мочевины и 2% CHAPS и измеряли концентрацию белка с использованием методики спектрофотометрии. Белки сохраняли при

-20°С до использования.

Осаждение белка.

Перед изоэлектрическим фокусированием образцы осаждали ацетоном для инактивации протеолитических ферментов, удаления соли и примесных веществ. 400 мкг экстрагированного из каждой плаценты белка смешивали с ледяным ацетоном до окончательной концентрации, равной 80% ацетона. Образцы инкубировали в течение 1 ч при -20°С с последующим центрифугированием при 9000xg в течение 2 мин. Ацетон удаляли и белковому осадку давали возможность высохнуть на воздухе.

Двухмерный гель электрофорез.

Сухие полоски иммобилина (180x3x0,5 мм, рН 3-10 NL, GE Healthcare Life Sciences) регидратировали в 350 мкл солюбилизационного раствора, содержащего 8М мочевины, 2% CHAPS, 10 мМ дитиотреитола (DTT) и 2% буфера IPG 3-10 вместе с 400 или 800 мкг образцов при комнатной температуре в течение ночи. Стадию IEF выполняли при 20°С с использованием Multiphor II и проводили в соответствии со следующим планом: (1) 150 В в течение 1 ч, (2) 300 В в течение 3 ч и (3) 3000 В пока не достигали приблизительно 60000 в час. Полоски уравновешивали в течение 10 мин в растворе, содержащим 65 мМ DTT, 6М мочевины, 30% (м/о) глицерина, 2% (м/о) додецилсульфата натрия (SDS) и 50 мМ Трис-HCl рН 8,8. Также выполняли стадию второго уравновешивания в течение 10 мин в таком же растворе за исключением DTT, который заменяли 259 мМ йодацетамида. Полоски были замочены в буфере для электрофореза (24 мМ Трис основания, 0,2М глицина и 0,1% SDS) непосредственно перед вторым измерением. Полоски применяли на 12,5% гомогенном слое геля Duracryl (240x190x1 мм или 290x245x1 мм). Полоски накладывали с раствором 1% агарозы в буфере для электрофореза (выдерживали при 60°С). Электрофорез проводили либо с использованием гелевого устройства Hoefer DALT (Amersham Pharmacia Biotech, Сан Франциско, КА, США) при 20°С и постоянных 80 В в течение 19 ч или с использованием гелевого устройства с применением того же буфера для электрофореза, как описано выше, и выполняли при 20°С при 18 мА пока окрашенный фронт не достигал дна геля. Время исполнения составляло приблизительно 17 ч.

Окрашивание геля.

Гели окрашивали серебром, а после окрашивания гели высушивали с использованием сушильного устройства для геля (Slab gel Dryer SGD2000, Savant).

Спот-анализ.

Гели сканировали с использованием CanoScan 995OF (Canon). Спот-анализ выполняли с использованием PDQUEST (версия 7.1.0) системы анализа двумерного геля (Bio-Rad discovery series, Bio-Rad Laboratories, Сандбиберг, Швеция).

Идентификация с помощью масс-спектрометрии.

Исследуемые пятна отмывали 0,5 мл воды Milli-Q с последующими четырьмя отмываниями 0,5 мл 40% ацетонитрила (ACN) в 25 мМ бикарбоната аммония в течение 30 мин каждое. Затем кусочки геля высушивали в концентраторе SpeedVac перед деградированием белков на характеристические фрагменты трипсином (степень чистоты реактива для секвенирования, Promega) в 25 мМ бикарбоната аммония в течение ночи при 37°С. Ферментативную обработку завершали посредством добавления 20 мкл 2% трифторуксусной кислоты, которая также экстрагировала пептиды из геля. После 2 ч при комнатной температуре, пептиды очищали от буфера для ферментативной обработки с использованием С18 Ziptips (Миллипор). Кратко, твердая фаза была кондиционирована с использованием 2x10 мкл 50% ACN, 0,1% TFA в воде Milli-Q. Органический растворитель смывали посредством двух отмываний 10 мкл 0,1% TFA. Образцы аспирировали и распределяли несколько раз с последующими двумя отмываниями 0,1% TFA для удаления солей и несвязанного вещества. Очищенные пептиды элюировали непосредственно на образцы мишени (Anchorchip target, Bruker Daltonik), куда было добавлено 0,7 мкл матрикса, 2,5дигидроксибензойной кислоты (3 мкг/мл в 30% ACN). Масс-спектры положительно заряженных ионов записывали на устройстве Bruker Reflex III (Bruker Daltonik), работающем в рефлекторном режиме. Общие из 160-210 одиночных коротких спектров были аккумулированы из каждого образца. Для обработки данных использовали комплекты программного обеспечения XMASS 5,0 и MS Biotools, предоставленные производителями. Известные продукты автопротеолиза из трипсина использовали для внутренней калибровки.

Анализ методом тандемной МС.

0,5 мкл каждого из пептидных экстрактов наносили в виде пятен непосредственно на мишень MALDI из нержавеющей стали и оставляли высыхать. 0,5 мкл матричного раствора, содержащего 5 мкг/мл а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, 50% ацетонитрила, 0,1% TFA и 50 мМ лимонной кислоты добавляли и давали возможность высохнуть. Спектры MALDI-TOF-MS и MS/MS записывали с использованием масс-спектрометра 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, Фрамингем, СА, США) в по- 21 031877 ложительном рефлекторном режиме. Производили внутреннюю калибровку полученных МС спектров с использованием двух пептидов после автопротеолиза трипсином с значениями m/z, равными 842,51 и 2211,097. Проводили идентификацию белка с использованием программного обеспечения GPS Explorer с внутренней поисковой системой Mascot (Matrix Science, London, UK) {Perkins, 1999 #132} исследующей статистически неопределимую базу данных NCBI. Параметрами, определенными для поиска, являлись: таксоны, млекопитающие; пропущенные расщепления, 1; допустимая масса пептида, +/-30 м.д.; допустимая масса заряженного фрагмента, +/-0,15 Да; различные модификации, отсутствия.

Исследование базы данных.

Для идентификации белка, последовательности белка человека были исследованы в базе данных NCBI с использованием Profound Peptide Mapping (версия 4.10.5, The Rockefeller University Edition) и Mascot Software (Matrix Science Ltd.).

Вестерн-блоттинг.

Вестерн-блоттинг выполняли на 12% Бис-Трис гелях (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией производителя. Кратко, 20 мкг белка с 2,5 мл образца буфера LDS (Invitrogen, США) помещали в гель и выдерживали в течение 50 мин при 200 В в подвижном буфере 1xMOPS. Последующий гель для электрофореза блоттировали на мембрану PDVF (Bio-Rad, США) в течение 1 ч при 30 В, после чего мембрану инкубировали в Трис забуференном физиологическом растворе (TBS), содержащем 0,1% Tween 20® (ICN Biomedichals Inc., Огайо, США) и 2% сухого молока (Bio-Rad, США) в течение ночи при 4°С.

Блот инкубировали с первичными мышиными моноклональными антителами и IgG1 (противчеловеческого Hby (разбавленными 1:8000 в TBS-T с 2% сухим молоком) (Nordic Biosite AB, Швеция) в течение 1 ч, после чего мембрану отмывали один раз в течение 15 мин в TBS-T и 3x5 мин в TBS-T.

Вслед за отмыванием блот инкубировали с козьими противомышиными вторичными антителами IgG1-HRP (разбавленными 1:5000 в TBS-T) (SDS Santa Cruz Biotechnology, США) в течение 1 ч, после чего мембрану отмывали, как описано выше. В дальнейшем мембрану подвергали усиленной хемилюминисценции ECL+ (GE Healthcare Biosciences, Великобритания) в течение 3 мин. Авторадиографическую пленку (Hyperfilm ECL, Amersham, США) применяли для блоттинга в течения 1 мин для получения удовлетворительной выдержки.

Извлечение РНК.

Общую РНК извлекали в соответствии с инструкцией производителя с использованием РНКазы (Qiagen) из 10 образцов РЕ и 10 контрольных образцов от таких же пациенток, как описано выше. Кратко, образцы плаценты были гомогенизированы с использованием TissueLyzer в лизирующем буфере РНКазы (RLTbuffer и β-меркаптоэтанол) (Qiagen). Образцы осаждали в 70% этаноле и затем разделяли на фракции с использованием миниколонок РНКазы в соответствии с протоколом производителя. Образцы были элюированы в 50 мкл Н₂О без РНКазы.

ПЦР в режиме реального времени (подобно описанной выше).

кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя (Applied Biosystems). Кратко, использовали 50 мкл реакционной смеси (0,5 мкг общей РНК, 1хбуфера TaqMan RT, 5,5 мМ MgCl₂, 500 мкМ dNTP, 2,5 мМ случайно выбранных гексамеров, 0,4 ед./мкл ингибитора РНКазы и 1,25 ед./мкл обратной транскриптазы MultiScribe). Реакционные смеси инкубировали при 25°С (10 мин), при 48°С (30 мин) и в заключение при 95°С (5 мин). Образцы хранили при -20°С до проведения анализа.

Необходимые транскрипты генов количественно определяли посредством количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием системы определения последовательностей ABI PRISM® 7000 (Applied Biosystems). Праймеры и зонды для TF (анализ ID: Hs00169070_m1) и Hb5 (анализ ID: Hs00426283_m1) были заказаны у Assays-on-Demand™ (Applied Biosystems). Праймеры покрывали по меньшей мере одну границу экзона для того, чтобы избежать усиления контаминации геномной ДНК. Реакции выполняли в 25 мкл конечного объема, содержащего конечные концентрации: 1xUniversal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,25 мкмоль/л зонда, 0,9 мкмоль/л прямого и обратного праймеров соответственно, и 2,2 мкл аликвоты ДНК. Тепловой цикл был инициирован посредством активации UNG при 50°С в течение 2 мин и начального денатурирования при 95°С в течение 10 мин. Вслед за денатурированием провели 40 циклов: 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин. Два негативных контроля без матрицы включали в каждый комплект амплификации, β-актин использовали в качестве ориентира для стандартизации сигнала от образца. Количественное определение было достигнуто посредством создания калибровочной кривой с использованием серийных 4-кратных разведений матрицы ДНК (0,08-80 нг). Результаты выражены как соотношения с β-актином в качестве единицы измерения.

Гибридизация in situ (подобно описано выше).

Гибридизации проводили на 18 образцах РЕ и 19 контрольных образцах. Криостатные срезы были установлены размороженными на предметные стекла, обработанные сиаловой кислотой, которые сохраняли при -80°С до их использования. Свежезамороженную ткань использовали для предельного увеличения определения мРНК. Срезы фиксировали, обезвоживали, обезжиривали и гибридизировали. Гибри

- 22 031877 дизацию проводили в течение 20-24 ч при 55°С с 2х 106 и/мин денатурированного зонда 35S-KPHK на 80 мкл гибридизационного буфера (20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 1 мМ ЭДДА (рН 8,0), 300 мМ NaCl, 50% формамида, 10% декстрансульфата, IxDenhardt 25 мкг/мл тРНК дрожжей, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 250 мкг/мл общей РНК дрожжей (фракция XI, Sigma), 150 мМ DTT, 0,15% тиосульфата натрия (NTS) и 0,15% SDS. Отмытые в дальнейшем предметные стекла устанавливали на Kodak Hyperfilm Biomax MR на 2 дня, после чего их покрывали ядерной трековой эмульсией (NTB, Kodak). Покровные стекла выдерживали в течение 4 недель при 4°С, после чего их проявляли в Dektol (Kodak), фиксировали и контрастно окрашивали красителем Г иемза.

Результаты.

Экстрагированные белки плаценты разделяли посредством 2D-PAGE для того, чтобы изучить различия в экспрессии белка между пациентками, страдающими РЕ, и здоровыми контрольными женщинами. В первой экспериментальной модели 400 мкг образцов помещали на IPG-полосу и проводили второе измерение с использованием гелевого устройства Hoefer DALT. Только одно пятно было обнаружено со значительным различием между двумя группами. Для того чтобы идентифицировать пятно, 800 мкг образцов помещали на гели и обрабатывали все четыре образца, два образца РЕ и два контрольных образца. Для количественного анализа проводили второе измерение. При этом второе дифференциально выраженное пятно определяли невооруженным глазом в образцах РЕ (фиг. 8). Два белковых пятна, представляющих интерес, вырезали из гелей, подвергали ферментативной обработке и идентифицировали с использованием MALDI-TOF MS. Первый белок идентифицировали как трансферрин, а второй - как гемоглобин.

Установить подкласс гемоглобина с помощью данных MALDI не представлялось возможным. Вот почему это пятно было в дальнейшем подвергнуто последующему анализу с использованием метода тандемной МС. Данные тандемной МС показали, что полученные последовательности принадлежат дельтацепи гемоглобина (Hb5). В соответствии с определением белка, ПЦР в режиме реального времени также показала значительное повышение экспрессии гена для Hb5 в плацентах РЕ (р=0,04) в сравнении с контролем (фиг. 9).

Гибридизация in situ показала отдельные клетки, экспрессирующие мРНК Hb5 по всему интервиллезному пространству. Клетки, экспрессирующие мРНК Hb5, были особенно различимы в кровеносных сосудах плаценток и вокруг них. Похоже, что плаценты РЕ имеют больше клеток, экспрессирующих мРНК Hb5, рассеянных за пределами сосудов, чем контрольные. В клетках-трофобластах сигнал не был определен. Клеточная морфология клеток, экспрессирующих Hb5, была усеяна микрокристаллами серебра, покрывающими положительные клетки (фиг. 10).

Обсуждение.

Текущие данные, полученные авторами изобретения, подтверждают плацентарный гемопоэз посредством демонстрируемой в данном документе повышенной экспрессии белка Hb5, а также соответствующей экспрессии генов при РЕ.

В плаценте повышенные уровни мРНК Hb5 транслируются в белок, как показали в данном документе авторы изобретения, для того чтобы накапливаться в плаценте РЕ. Однако необязательно, чтобы продуцированные цепи Hb были встроены в молекулы Hb, функционирующие за счет связанных порфириновых колец и иона Fe. Транспорт и усвоение клеткой железа обеспечивает трансферрин (TF). В данном документе 2D-гели авторов изобретения также показали, что плацента РЕ обеднена внутриклеточным TF. Данная нехватка белка TF в РЕ плаценте может отражать нарушенный транспорт железа в популяцию клеток, экспрессирующих Hb5. Таким образом, клетки, продуцирующие Hb, следовательно могут быть лишены обеспечения их железом, что ведет к накоплению цепей Hb и/или дисфункциональных молекул Hb в плаценте РЕ. Любопытно, что не происходило накопления гемоглобина в контрольных плацентах, хотя даже гибридизация in situ показала экспрессию мРНК для Hb5. В отличие от РЕ плаценты здоровая плацента способна регулировать продуцирование Hb либо посредством регуляции трансляции мРНК, деградации белка или просто являясь экстрамедуллярным органом гемопоэза. Дефект синтеза Hb может привести к дефекту эритробластов, тезис возможно является менее устойчивы и легко разваливается на части, что в свою очередь ведет к большему количеству свободного Hb.

Пример 4.

Обнаружение экспрессии РНК HLA-DPA1.

Для анализа экспрессии РНК HLA-DPA1 выполняли количественную ПЦР в режиме реального времени.

Сбор образцов; взятие тканей и подготовка; экстрагирование РНК; и амплификацию ПЦР в режиме реального времени выполняли, как описано в примере 1 с необходимыми изменениями.

Результаты.

У главного комплекса гистосовместимости, II класса, DP альфа 1 (HLA-DPA1) была значительно повышена регуляция в группе с узурацией по сравнению со всеми другими группами (р=0,01 по сравнению с РЕ без узурации, р=0,02 по сравнению с РЕ с узурацией, и р=0,01 в сравнении с контролем) (см. фиг. 4D).

- 23 031877

Обсуждение.

Женщины с выявленной узурацией в дальнейшем имеют повышенный риск развития РЕ во время своей беременности. Однако тот факт, что не у всех женщин с узурацией развивается РЕ, означает, что у них могут экспрессироваться гены, которые защищают либо репрессируют гены, которые им вредят. Как микроматрица, так и кПЦР показали повышенную экспрессию HLA-DPA1 в группе с узурацией в сравнении со всеми другими группами. HLA-DPA1 представляет собой часть класса II семейства главного комплекса гистосовместимости (МНС), элементы которого являются ответственными за презентирование чужеродных антигенов как часть адаптивного иммунного ответа. Молекулы только класса I МНС типов G и Е HLA экспрессируются в клетках трофобластов. Полагают, что они изменяют материнский иммунный ответ при взаимодействии матери и плода, защищая плод от материнского иммунного ответа. Таким образом, HLA-DPA1, молекулы класса II МНС не могут производится трофобластами. Вместо этого материнскую реакцию может представлять собой присутствие фетальных клеток в плаценте.

Известно, что фетальные клетки поступают в систему кровообращения матери во время беременности, а их уровни повышаются в течение нормально протекающей беременности, предполагая непрерывное поступление фетальных клеток в материнскую систему через плацентарный барьер. При РЕ количество фетальных клеток в материнской системе кровообращения повышено в сравнении с беременностями с нормальным давлением. Как замечено выше, повышенная экспрессия HLA-DPA1 в группе с узурацией позволяет предположить, что материнская иммунная система может реагировать на чужеродные антигены в плаценте, конкретно на фетальные клетки. Таким образом, HLA-DPA1 могут участвовать в создании иммунологического барьера, который предотвращает фетальные клетки от попадания в системы матери посредством идентификации клеток и выделения их для разрушения. Если бы клетки, экспрессирующие Hb, наблюдаемые в экспериментах авторов изобретения, были бы фетального происхождения, HLA-DPA1 могли бы также предотвратить проникновение данных клеток в плаценту, тем самым, защищая плаценту от избыточного продуцирования гемоглобина и свободного гема.

Пример 5.

Концентрации гемоглобина и а₁-микроглобулина в плазме и моче, антиокисление посредством α₁микроглобулина и плацентарной перфузии in vitro.

Материалы и способы.

Г емоглобин.

Гемоглобин был приобретен у Sigma. Оксигемоглобин А был получен в лаборатории авторов изобретения следующим образом. Красные кровяные клетки были выделены из 50 мл крови человека посредством центрифугирования (1200xg, 10 мин) и отмыты 4 раза 10 объемами забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, 10 мМ фосфата, рН 7,4; 120 мМ NaCl и 3 мМ KCl). Затем кровяные клетки были разрушены посредством ресуспендирования в гипотоническом буфере (20 об. Н₂О:1 об. PBS) на льду. Мембраны отделили от цитозоля посредством центрифугирования (14000xG, 20 мин), и супернатант подвергли диализу 3 раза против 15 мМ Трис-HCl, рН 8,0 при 4°С. Двести мл DEAESephandex A-50 (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Швеция) наносили в колонку, и диализированный супернатант вводили в гель и отделяли посредством градиента, состоящего из 15 мМ Трис-HCl, рН 8,0 и 15 мМ Трис-HCl, рН 8,0 плюс 0,2М NaCl. Фракции собрали и измерили коэффициент поглощения при 280 нм, 577 нм и 630 нм для того, чтобы идентифицировать и определить концентрацию оксигемоглобина А. Оксигемоглобин F получали из хордальной крови человека с использованием такого же протокола.

Белки и антитела.

Рекомбинантный человеческий а₁-микроглобулин (a₁m) экспрессировали в E.coli, очищали и рефолдировали, как описано [Kwasek et al., 2007]. Кроличий антимышиный иммуноглобулин, кроличий антигемоглобин и свиной антикроличий иммуноглобулин-щелочная фосфотаза (ALP) были приобретены в Dako (Дания). Мышиные моноклональные антитела против гамма-цепи гемоглобина были приобретены в Santa Cruz Biotechnologies lnc (кат №. sc-21756). Кроличий анти-человеческий a₁m и козий антикроличий иммуноглобулин были получены соответственно, как описано [Elbashir et al., 1990, Bjorck et al., 1977]. Моноклональные мышиные антитела против человеческого a₁m (BN11.10) были получены, как описано [Babiker-Mohamed et al., 1991].

Мечение йодом.

Белки были мечены ¹²⁵I (Bio-Nuclear AB, Стокгольм, Швеция) с использованием метода с хлорамином Т [Greenwood et al, 1963]. Меченые белки были отделены от свободного иодида посредством фильтрации в геле в колонке Sephadex G-25 (PD-10, GE Healthcare). Специфические активности составляли приблизительно 0,3 МБк на мкг белка для a₁m и 0,5 МБк на 1 мкг белка для иммуноглобулинов.

Пациентки и сбор образцов.

Образцы плаценток и крови были собраны у женщин, поступивших в Больницу Лундского Университета (30 контрольных, 30 РЕ). Отбор образцов проводили с письменного согласия и одобрения Этическим Комитетом Наблюдательного Совета. Преэклампсия была определена при артериальном давлении свыше 140/90 мм рт.ст. и протеинурии свыше 0,3 г/л {Milne, 2005 #89}. Пациентки только с билатеральной узурацией были отобраны в группу с узурацией без РЕ. После родов извлекали ворсинчатую ткань в

- 24 031877 виде кубика размерами 10x10x10 мм и немедленно помещали в сухой лед. Образцы хранили при -80°С до момента использования. Образцы крови собирали перед родами и хранили с использованием Paxgene

Blood RNA System (Qiagen, Валенсия, США) при -20°С до использования. Различные параметры данных групп описаны в табл. 2. В дополнение образцы 10 пациенток и 10 женщин контроля исследования в

Танзании были рассмотрены в примерах 5 (см. табл. 1).

ELISA.

Концентрации гемоглобина А были измерены с использованием сравнительного иммуносорбентного анализа с применением фиксированных ферментов (ELISA), как описано для твердофазного радиоиммунного анализа (SPRIA) с использованием буферов, процедуры отмывания и периодов инкубирования, как описано [Nilson et al. , 1986]. Гемоглобин (Sigma) был покрыт при 4 мкг/мл, планшеты отмывали и инкубировали со смесью кроличьего антигемоглобина и либо стандартного оксигемоглобина-А или неизвестных образцов, отмытых, инкубированных со свиным-антикроличьим IgG-ALP (Dako), отмытым и в завершение инкубированным с субстратом. Соответствующие разбавленные растворы каждой стадии и реагент титровали по отдельности. Коэффициент поглощения считывали при 415 нм (Bio-Rad Model 550, считывающее устройство для микропланшетов). Объем, используемый для каждой стадии инкубирования, составлял 100 мкл. Все эксперименты проводили с троекратным повторением.

RIA.

Концентрации a₁m определяли посредством радиоиммуноанализа (RIA), как описано [Plesner et al. 1975; Akerstrom, 1985]. Кратко, козью антисыворотку против человеческого a₁m (0,2 мл, разв. 1:6000) смешивали с a₁m, меченным ¹²⁵I (0,1 мл, приблизительно 0,05 пг/мл) и неизвестными образцами или стандартными концентрациями a₁m (0,2 мл). Разбавленные растворы получали в 0,1М фосфата натрия, рН 7,5 плюс 0,1% BSA (RIA буфер). После инкубирования в течение ночи при комнатной температуре a₁m, связанный с антителами, осаждали посредством добавления 0,3 мл бычьей сыворотки и 1,6 мл 15% полиэтиленгликоля в RIA буфер, центрифугируя при 1500xG в течение 40 мин и анализируя активность ¹²⁵I осадков в гамма счетчике Wallac Wizard 1470 (Perkin Elmer Life Sciences).

Определение концентраций Hb-F.

Концентрации гемоглобина F плазмы определяли посредством Вестерн-блоттинга после извлечения альбумина плазмы с использованием Montage Albumin Deplete Kit (cat no. LSKAD0024; Millipore). Кратко, шарики из десяти колонок собирали в одну пробу, промывали PBS и разделяли на 50 идентичных аликвот. После центрифугирования супернатант каждой аликвоты сливали и добавляли 40 мкл плазмы (разбавленной 1:1 PBS) и дважды инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Пробирки центрифугировали, супернатант сохраняли, а шарики последовательно отмывали 1 мл 0,1М глицин-HCl, рН 2,3 и 1 мл 0,1М Трис-HCl, рН 8. После центрифугирования и удаления супернатанта добавляли плазму и снова инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После центрифугирования и удаления осадка отделяли 10 мкл, таким образом, альбумин-истощенной плазмы посредством SDS-PAGE (Т=13,5%; С=3,3%) и подвергали блоттингу с мышиной античеловечьей γ-цепью Hb-F, разбавленной 600x, а затем с кроличьим антимышиным Ig (1 мкг/мл) и козьим антикроличьим IgG, меченным ¹²⁵I, как описано ниже. Количественную оценку гемоглобина F получали посредством денситометрии положительных полос с использованием программного обеспечения Image Gauge V4.0 (Fuji, Tokyo, Japan) и стандартного гемоглобина F (15 и 75 нг/лунку). Концентрации гемоглобина F в моче определяли с использованием того же протокола, но исключая стадии с Montage Albumin Deplete Kit.

Вестерн-блоттинг.

SDS-PAGE (Т=12%, С=3,3%) выполняли, как описано [Laemmli, 1970]. Гели проходили в восстанавливающих условиях с использованием высокомолекулярного стандарта массы (Rainbow markers, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Великобритания). Отделенные белки переносили в поливинилидендифторидные (PVDF) мембраны (Immobilon, Millipore, Bedford, MA, USA), как описано [Matsudaira, 1987]. Затем мембраны инкубировали с соответствующими антителами и проводили Вестерн-блоттинг с использованием вторичных козьих антикроличьих иммуноглобулинов, меченных ¹²⁵I, как предварительно описано Wester et al [1997], и проявляли изображения на мембранах с использованием системы фосфоизображения Fuji FLA 3000 (Fujifilm Sweden AB, Стокгольм, Швеция).

Экстрагирование ткани плаценты и получение молекул a₁m.

Молекулы, содержащие a₁m, были очищены от ткани плаценты, как описано [Berggard et al., 1999]. Приблизительно 200 г человеческой плаценты пациентки с явно нормальным сроком родов, взятой в течение 3 ч после родов, гомогенизировали в 200 мл 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,25М сахарозы, 2 мМ ЭДТА, пепстатине, 1 мг/л, антипаине, 5 мг/л, и лейпептине, 10 мг/л, с использованием устройства PotterElvehjem с плотно пригнанным тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 10000 G в течение 10 мин. Данный осадок промывали посредством повторного суспендирования 1:1 в гомогенизационном буфере и рецентрифугирования при 10000 G в течение 10 мин. Супернатант центрифугировали при 100000 G в течение 90 мин. Данный осадок, содержащий мембраны плаценты и белки, связанные с мембраной, растворяли в 40 мл гомогенизационного буфера, также содержащего 0,5% (о/м) Nonidet P-40 (BDH Chemicals), и центрифугировали при 20000 G в течение 30 мин, для того чтобы удалить дисперс- 25 031877 ный материал. Все стадии выполняли на льду или при 4°С. Проводили иммуносорбентную аффинную хроматографию с моноклональными мышиными анти-уш, BN11.10, фиксированными на Affigel Hz (20 мг/мл) в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad Laboratories, Ричмонд, СА, США).

Перфузия плаценты in vitro.

На сегодняшний день не существует адекватных животных моделей для РЕ. С целью изучить воздействие свободного гемоглобина авторы изобретения создали модель двусторонней плацентарной перфузии в сотрудничестве с Henning Schneider, Greifswald, Германия. Двусторонняя плацентарная перфузия представляет собой стабильную модель для того, чтобы изучать плацентарный кровоток in vitro [Schneider et al., 1985]. В последнее время модель использовали для того, чтобы имитировать РЕ посредством стимулирования образования ROS ксантином и ксантиноксидазой [Di Santo et al., 2007]. Самые последние данные авторов изобретения показывают, что плаценты, перфузируемые ксантином, имеют генный профиль, подобный плацентам РЕ.

Человеческая плацента является искусственно префузированной оксигенированной средой. Как материнское, так и фетальное кровообращение перфузированы (отсюда двусторонняя) с помощью перистальтических насосов. Среду двух отдельных кровотоков контролировали на предмет утечек. Среду и ткань плаценты анализировали вышеуказанной технологией.

Пример 5.1.

Уровень гемоглобина А повышен в преэкламптической плазме.

Результаты.

Результаты показаны на фиг. 11, 12. Определение концентраций общего гемоглобина плазмы 30 пациенток, страдающих преэклампсией, и 30 контрольных беременностей посредством ELISA показало почти двукратное повышение в группе преэклампсии. Среднее значение+/-стандартное отклонение у пациенток составило 3,01+/-0,39 мкг/мл, а в контрольной группе 4,44+/-1,0. Данное отличие является значимым (Р<0,05).

Пример 5.2.

Уровень гемоглобина F повышен в преэкламптической плазме и моче.

Фетальный гемоглобин плазмы и мочи выявляли Вестерн-блоттингом как 15-кДа полосу, реагирующую с антигамма-цепью. Фиг. 13 показывает пример способа Вестерн-блоттинга, примененного к плазме двух пациенток (РЕ 1 и 2) и двух женщин контроля (контроль 1 и 2). Предел чувствительности способа составлял приблизительно 5 мкг/мл в плазме и 1 мкг/мл в моче. Концентрации Hb-F оценивали посредством денситометрии, и табл. 1 показывает частоту встречаемости Hb-F в образцах плазмы и мочи у РЕ и контрольных групп. Полоса была видна в плазме 9 пациенток, тогда как ни у одного из контрольных индивидуумов не было положительной реакции. Таким образом, 9 пациенток и ни одна из женщин контроля не имели фетального гемоглобина в плазме более чем 5 мкг/мл. Допуская, что концентрации в плазме у женщин контроля составляли 0,04 мкг/мл, как полагает исследование Turpeinen et al. [1992], т.е. нормальная концентрация в плазме, результаты авторов изобретения показывают 125-кратное увеличение фетального гемоглобина у 20% пациенток с РЕ. У 8 пациенток и 2 из контроля моча содержала полосу (табл. 3). Эти два индивидуума контроля были обнаружены среди танзанийских женщин с высокой вероятностью инфекций малярии. Слабая положительная полоса на 67 кДа, наиболее вероятно представляющая альбумин, была видна с равной интенсивностью во всех образцах.

Таблица 3. Частота встречаемости индивидуумов с Hb-F в плазме >5 мкг/мл и в моче >1 мкг/мл

Временная зависимость гемоглобина А и F плазмы.

Гипоксия является возможным ранним патогенным фактором преэклампсии по причине, например, прерывистой перфузии, ненормльной имплантации или истощения. Гипоксия может активировать экспрессию Hb-F как в фетальных, так и в зрелых гемопоэтозных стволовых и клетках предшественниках [Narayan et al., 2005]. Наряду с повреждением физических барьеров плаценты это может приводить к просачиванию фетальных клеток, а также свободного Hb-F в материнское кровообращение между стадией 1 и 2 (см. фиг. 15). По мере прогрессирования заболевания количество будет увеличиваться, что можно наблюдать, как повышение уровней свободного фетального гемоглобина. Когда стенки материнских сосудов повреждаются свободным фетальным гемоглобином, материнские кровяные клетки также будут начинать отмирать. Это будет приводить к повышению уровней свободного материнского гемоглобина, дополнительно раскручивая негативную спираль заболевания. Гипотезой является то, что Hb-F предшествует общему Hb.

- 26 031877

Пример 5.4.

(дт является повышенным в преэкламптической плазме и моче.

Небольшой белок плазмы и ткани (j-микроглобулин (a1m) представляет собой средство, связывающее гем [Allhorn et al., 2002; Larsson et al. , 2004] и акцептор радикалов [Akerstrom et al., 2007], а форма, разрушающая гем, t-a₁m, индуцируется посредством протеолитического подавления Стерминального тетрапептида LIPR, когда (1m смешивается со свободным гемоглобином [Allhorn et al., 2002]. Свободный гемоглобин и активные формы кислорода являются причиной повышенного продуцирования a1m в клетках печении и клетках крови [Allhorn et al., 2002]. Вследствие этого (1m является потенциальным антагонистом гема и гемоглобина, который может защищать от повреждения клетки и соединения тканей, вызываемого гемом и агемоглобином.

По согласованию с данной гипотезой мы обнаружили, что концентрации ατιι в плазме и моче пациенток с преэклампсией по сравнению с контрольными беременностями являются повышенными со значением Р<0,01 как для плазмы, так и для мочи (фиг. 15). Средняя концентрация ατιι в плазме (+/-СО) у пациенток составляла 19,1 (+/-5,5) мкг/мл, а в контроле 16,1 (+/-3,7) мкг/мл. Средняя концентрация a1m в моче (+/-СО) у пациенток составляла 9,4 (+/-5,5) мкг/мл, а в контроле 5,3 (+/-4,6) мкг/мл. Данные результаты показывают, что 1) организм отвечает на преэкламптическое поражение посредством повышения продуцирования a1m, повышая, таким образом, концентрацию в плазме, и 2) гемоглобин, гем, железо и/или ROS являются составными частями повреждения, поскольку a1m регулируется по восходящей в клетках посредством повышения гемоглобина, гема, железа и/или ROS. Вследствие этого, скорее всего a1m представляет собой защитную реакцию организма против преэкламптического поражения. Следовательно, повышение концентраций a1m до даже более высоких уровней, например 32 мкг/мл, что является удвоением нормальной концентрации, должно оказывать антипреэкламптическое воздействие, а a1m, вследствие этого, представляет собой потенциальное лекарство для лечения заболевания.

Пример 5.5.

a1m защищает клетки и компоненты тканей посредством антиокисления и связывания гема.

Антиоксидантные свойства a1m проиллюстрированы на фиг. 16 и 17. Сперва было показано, что добавленный внеклеточно a1m может понижать окислительно-восстановительный заряд клеточного цитозоля и тиоловых групп цитозольного белка и ингибировать окисление данных соединений гемом и ROS. Добавленный внеклеточно a1m также ингибирует лизис клеток (т.е. смерть клеток), вызываемый гемом (фиг. 16). Окислительная модификация коллагена и липопротеинов низкой плотности (LDL) вовлечена в патогенез многих заболеваний и может также являться мишенью Hb-индуцированного окисления при преэклампсии. a1m ингибировал гем- и ROS-индуцированное окисление коллагена, LDL, липидов мембран и целых клеток. a1m также удалял предварительно образовавшиеся продукты окисления коллагена и LDL (фиг. 17). Возможный механизм данных действий может представлять собой редуктазные свойства a1m, восстанавливая оксиданты, окислительные модификации или и те и другие.

Для того чтобы изучить механизмы цитопротекторного действия a 1m, авторы изобретения провели серии экспериментов, для того чтобы проанализировать взаимодействия между белком и связанным с клеткой гемом. Сперва клетки инкубировали с 10 мкМ гема в течение 30 мин, избыточный гем отмывали и добавляли a1m или контрольные белки в концентрации, равной 2 или 10 мкМ, и инкубировали в течение 2 ч. Культуральную среду сохраняли, клетки отмывали и солюбилизировали, и как среду, так и солюбилизированные клетки анализировали посредством спектрофотометрии (фиг. 18А) и визуально (фиг. 18В). Гем был замечен как сильное коричневое окрашивание клеток и типичный спектр поглощения с неотчетливым пиком приблизительно 400 нм. При добавлении a1m гем был почти полностью удален из клеток, и вместо этого обнаружился в среде. Контрольный липокалин AGP не оказывал никакого влияния на связанный с клеткой гем. Авторы изобретения предполагают, что уровни свободного гема при преэклампсии могут достигать 10 мкМ и выше, по меньшей мере, локально и что клетки, подвергающиеся токсическим воздействиям свободного гема, включают эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды.

Как описано в некоторых случаях выше, полагают, что окислительные повреждения свободным гемоглобином, свободным гемом и ROS, производимые автоокислением гемоглобина и гема, составляют основные патологические факторы развития преэклампсии. Коллаген и мембраны клеток эндотелия и цитозоли, конечно, представляют собой важные мишени окислительных повреждений. Результаты данного примера делают вероятным то, что может ингибировать и восстанавливать повреждение, сделанное свободным гемоглобином, гемом и ROS также in vivo и, следовательно, могут действовать как терапевтическое средство при преэклампсии.

Пример 5.6.

Перфузия in vitro гемоглобина вызывает просачиваемость плаценты и восходящую регуляцию a1m.

Преэклампсию изучали с использованием модели перфузии плаценты in vitro с двумя отдельными системами кровообращения, с фетальной и материнской сторонами, соответственно. Сначала промывали обе системы кровообращения. Затем плаценту перфузировали в течение 120 мин раствором Hb-А (2

- 27 031877 мкг/мл) с фетальной стороны и в течение 120 мин только буфером с материнской стороны (1-я перфузия) и в течение 120 мин только буфером с обеих сторон (2-я перфузия). Постоянно из обоих кровообращений брали небольшие аликвоты и измеряли концентрации Hb-A, Hb-F и a₁m. Как показано на фиг. 19 (левая сторона), Hb-А быстро появлялся на материнской стороне в процессе 1-й перфузии и, в меньшей степени, в процессе 2-й перфузии. Это могло быть результатом просачиваемости или эндогенного продуцирования Hb-А в ткани плаценты или и того и другого, a₁m также появлялся на материнской стороне в течении обоих периодов перфузии фиг. 19 (правая сторона). Это предполагает, что a₁m продуцируется в ткани плаценты в результате перфузии гемоглобина. В итоге, Hb-F появлялся в материнском кровообращении в конце 1-й перфузии (120 мин), наиболее вероятно, в результате продуцирования в плаценте и просачиваемости в материнское кровообращение.

Таким образом, модель перфузии in vitro может вследствие этого быть использована для изучения воздействия свободного гемоглобина в фетальном кровообращении на функционирование плацентарного барьера, защитных воздействий a₁m и защитного клеточного ответа ткани.

Пример 5.7.

Новая молекула в плаценте, состоящая из a₁m и гемоглобина, связанных друг с другом.

Предварительно было показано, что a₁m может воровать гем-группу у гемоглобина при смешивании двух молекул в растворе [Allhorn et al., 2002; Larsson et al., 2004]. Для достижения этого in vivo молекулы гемоглобина и a₁m должны быть нужны друг другу. Наличие такой молекулы гемоглобин-α₁m было визуализировано в экстрактах плаценты после выделения видов молекул, содержащих a₁m, с последующим анализом анти-Hb блоттингом (фиг. 20). 43-кДа полоса реагирует на антитела против как a₁m, так и Hb-А. Полоса была показана посредством пептидного картирования Maldi-MS на содержание a₁m и как альфа-так и бета-глобиновых цепей (не показано). Размер молекулы предполагает, что каждая молекула состоит из одной цепи a₁m и еще одной цепи, которая может являться либо Hba, или Hby. Полосу нельзя увидеть после добавления меркаптоэтанола, что указывает на то, что цепи удерживаются вместе посредством дисульфидной связи.

Ссылки.

Akerstrom В. J. Biol. Chem. 260 (1985) 4839-4844.

Akerstrom В, Maghzal G, Winterbourn CC, Kettle AJ. J Biol

Chem. 282 (2007) 31493-31503.

Allhorn M, Berggard T, Nordberg J, Olsson ML, Akerstrdm B.

Blood. 99 (2002) 1894-1901.

Babiker-Mohamed H, Forsberg M, Olsson ML, Winquist O, Nilson BHK, Logdberg L, Akerstrom B. Scand J Immunol 34 (1991) 655-666.

Berggard T, Enghild JJ, Badve S, Salafia CM, Logdberg L,

Akerstrom B. Am J Repr Immunol 41 (1999)52-60.

Bjbrck L·, Cigen R, Berggard B, Low B, Berggard I. Scand J

Immunol 6 (1977) 1063-1069. Bradley DJ et al. J Neurosci 12 (1992) 2288-2302

J. J. Brosens, R. Pijnenborg, I. A. Brosens, Am J Obstet

Gynecol. 187, 1416 (2002).

Coligan JE, (ed) Current Protocols in Immunology, Wiley

- 28 031877

Interscience.

C. J. M, de Groot, R. N. Taylor, Annals of Medicine 25,

243 (1993).

Di Santo Ξ, Sager R, Andres AC, Guller S, Schneider H.

Placenta (2007).

Douglas and Redman, Br Med J 309 (1994)1395-1400

Elbashir Ml, Nilson В,	Akesson P,	Bjorck L, Akerstrom,	B.
J Immunol Methods 135 (1990)	171-179.
J. P. Granger, В. I.	Alexander,	W. A. Bennett,	R.	A.
Khalil, Am J Hypertens. 14,	178S (2001)
Greenwood FC, Hunter WM	, Glover J	S. Biochem. J, 89	(1963)

114-123. S. R. Hansson et al., Mol Human Reproduction, (2005).

T. H. Hung, J. N. Skepper, D. S. Charnock-Jones, G. J. Burton, Circ Res 90, 1274 (Jun 28, 2002).

Kajita A, Taniguchi K, Shukuya K. Biochim Biophys Acta 175 (1969) 41-48.

Kwasek A, Osmark P, Allhorn M, Lindqvist A, Akerstrom B, Wasylewski Z. Protein Expr. Purif. 53(2007)145-152.

Laemmli UK. Nature 227 (1970) 680-685.

Larsson J, Allhorn M, Akerstrom B. Arch Biochem. Biophys. 432 (2004) 196-204.

H. Lipstein, С. C. Lee, R. S. Crupi, Am J Emerg Med. 21, 223 (May, 2003) .

Matsudaira P. J. Biol. Chem. 262 (1987) 10035-10038.

Motterlini et al., Am J Physiol 269 (1995) 648-655.

Narayan AD., Ersek A., Campbell TA., Colon DM, Pixley JS, Zanjani ED. Br J Haematol 128(2005)562-570.

Nilson B, Bjorck L and Akerstrom B. J Immunol Methods 91 (1986) 275-281.

Noble RW. J Biol Chem 246 (1971) 2972-2976.

Olsson MG, Allhorn M, Olofsson T, Akerstrom B. Free Rad Biol Med 42 (2007) 842-851.

E. W. Page, Am J Obstet Gynecol. 37, 291 (1939) .

Plesner I, Norgaard-Pedersen B, Boenisch T. Scand J Clin Lab Invest 35 ¢1975) 729-735.

J.	M. Roberts et	al.	., Am J Obstet Gynecol	161	, 1200
(1989) .	J. M. Roberts,	C.	A. Hubei, Lancet 354,	788	(Sep 4,
1999).	J. M. Roberts,	D.	W. Cooper, Lancet 357,	53	(2001)

Schneider H, Huch A, Contrib Gynecol Obstet 13 (1985) 40.

A. H. Shennan, L. Poston, L. C. Chappell, P. T. Seed, Lancet 357, 1534 (2001/5/12, 2001).

J. M. Stevens, Med J Aust. 2, 949 (Dec 20-27, 1975) .

H. Strevens etal., BrJObstet Gynaecol. 110, 831 (sep,

2003) Svistunenko et al., J Biol Chem 272 (1997) 7114-7121

Turpeinen U, Stenman U-H. Determination of fetal hemoglobin by time-resolved immunofluorometric assay. Clin Chem 38 (1992) 2013-2018.

Winterboum CC. Oxidative reactions of hemoglobin. Methods Enzymol. 186 (1990) 265-272.

Пункты (конкретные варианты осуществления изобретения).

1. Способ диагностики или способствования диагностике преэклампсии, включающий в себя следующие стадии:

(a) получение биологического образца от беременной особи млекопитающего женского пола;

(b) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фе-

- 29 031877 тального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в указанном биологическом образце; и (c) сравнение уровня свободного фетального гемоглобина в образце с контрольным значением или сравнение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с контрольным значением, для того чтобы определить, страдает или не страдает преэклампсией указанная беременная особь или имеется у нее или не имеется повышенный риск развития преэклампсии.

2. Способ по п.1, где указанное контрольное значение представляет собой уровень свободного фетального гемоглобина или соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах из контрольной группы, где более высокий уровень свободного фетального гемоглобина или более высокий уровень указанного соотношения в образце относительно контрольного значения указывает на то, что указанная беременная особь страдает преэклампсией или у нее имеется повышенный риск развития преэклампсии.

3. Способ по любому одному из пп.1, 2, где указанный биологический образец является кровью.

4. Способ по любому одному из пп.1, 2, где указанный биологический образец является мочой.

5. Способ по любому одному из пп.1, 2, где указанный биологический образец является тканью плаценты.

6. Способ по любому одному из пп.1-5, где уровень свободного фетального гемоглобина измеряют посредством измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (Hby) в образце.

7. Способ по любому одному из пп.1-6, где уровень свободного фетального гемоглобина измеряют с использованием иммунологического анализа.

8. Способ по п.7, где иммунологическим анализом является ELISA.

9. Способ по любому одному из пп.1-6, где уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения РНК свободного фетального гемоглобина.

10. Способ по п.9, где РНК свободного фетального гемоглобина измеряют, используя ПЦР в режиме реального времени.

11. Способ по любому одному из пп.1-10, где указанным млекопитающим является человек.

12. Способ контроля прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий в себя:

(a) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, полученном от беременной особи млекопитающего женского пола;

(b) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, полученном от указанной беременной особи млекопитающего женского пола в более поздний момент времени; и (c) сравнение значений, измеренных на стадиях (а) или (b), где повышение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или повышение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии; а понижение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или понижение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.

13. Способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий в себя следующие стадии:

(a) измерения уровня свободного фетального гемоглобина или измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, полученном от беременной особи млекопитающего женского пола перед лечением;

(b) измерения уровня свободного фетального гемоглобина или измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, полученном от той же беременной особи млекопитающего женского пола после лечения; и (c) сравнения уровня или уровней, определенных в (а) , с уровнем или уровнями, определенными в (b), где понижение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или понижение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает, что лечение является эффективным для излечения преэклампсии.

14. Набор для анализа для диагностики и способствования диагностике преэклампсии в соответствии со способом по любому одному из пп.1-11, содержащий средства для измерения уровня свободного фетального гемоглобина в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола, и

- 30 031877 инструкции по применению указанных средств определения.

15. Набор для анализа по п.14, где уровень свободного фетального гемоглобина измеряют посредством измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (Hby).

16. Набор для анализа по пп.14, 15, который дополнительно содержит средства для определения уровня общего фетального гемоглобина.

17. Способ диагностики или способствования диагностике преэклампсии, включающий в себя следующие стадии:

(a) получение биологического образца от беременной особи млекопитающего женского пола;

(b) измерение уровня свободного гемоглобина или измерение уровня субъединицы свободного гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в указанном биологическом образце; и (c) сравнение уровня свободного гемоглобина в образце с контрольным значением или сравнение соотношения между уровнем субъединицы свободного гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце со контрольным значением, для того чтобы определить, страдает или не страдает преэклампсией указанная беременная особь или имеется у нее или не имеется повышенный риск развития преэклампсии.

18. Способ по п.17, где указанное контрольное значение представляет собой уровень свободного гемоглобина или соотношение между уровнем субъединицы свободного гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах из контрольной группы, где более высокий уровень свободного гемоглобина или более высокий уровень указанного соотношения в образце относительно контрольного значения указывает, что указанная беременная особь страдает преэклампсией или у нее имеется повышенный риск развития преэклампсии.

19. Способ по любому одному из пп.17, 18, где указанный биологический образец является кровью.

20. Способ по любому одному из пп.17, 18, где указанный биологический образец является мочой.

21. Способ по любому одному из пп.17, 18, где указанный биологический образец является тканью плаценты.

22. Способ по любому одному из пп.17-21, где уровень свободного гемоглобина измеряют посредством измерения уровня альфа-цепи гемоглобина (Hba), бета-цепи гемоглобина (Hb/), дельта-цепи гемоглобина (Hb5), гамма-цепи гемоглобина (Hby) и/или общего свободного гемоглобина в образце.

23. Способ по любому одному из пп.17-22, где уровень свободного гемоглобина измеряют с использованием иммунологического анализа.

24. Способ по п.23, где иммунологическим анализом является ELISA.

25. Способ по любому одному из пп.17-22, где уровень свободного гемоглобина определяют посредством измерения РНК свободного гемоглобина.

26. Способ по п.25, где РНК свободного гемоглобина измеряют, используя ПЦР в режиме реального времени.

27. Способ по любому одному из пп.17-26, где указанным млекопитающим является человек.

28. Способ контроля прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий в себя:

(a) измерение уровня свободного гемоглобина в первом биологическом образце, полученном от беременной особи млекопитающего женского пола; и (b) измерение уровня свободного гемоглобина во втором биологическом образце, полученном от указанной беременной особи млекопитающего женского пола в более поздний момент времени, где повышение уровня свободного гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии; а понижение уровня свободного гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.

29. Способ по п.28, где уровень свободного гемоглобина измеряют посредством измерения уровня альфа-цепи гемоглобина (Hba), бета-цепи гемоглобина (Hb/), дельта-цепи гемоглобина (Hb5), гаммацепи гемоглобина (Hby) и/или общего свободного гемоглобина.

30. Способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий в себя следующие стадии:

(a) измерения уровня свободного гемоглобина в первом биологическом образце, полученном от беременной особи млекопитающего женского пола перед лечением;

(b) измерения уровня свободного гемоглобина во втором биологическом образце, полученном от той же беременной особи млекопитающего женского пола после лечения; и (c) сравнения уровня, определенного на (а), с уровнем, определенным на (b), где повышение уровня свободного гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного гемоглобина в первом указывает, что лечение эффективно для излечения преэклампсии.

31. Способ по п.30, где уровень свободного гемоглобина измеряют посредством измерения уровня альфа-цепи гемоглобина (Hba), бета-цепи гемоглобина (Hb/), дельта-цепи гемоглобина (Hb5), гаммацепи гемоглобина (Hby) и/или общего свободного гемоглобина.

32. Набор для анализа для диагностики или способствования диагностике преэклампсии в соответствии со способом по любому одному из пп.17-27, содержащий средства для обнаружения в биологиче-

- 31 031877 ском образце беременной особи млекопитающего женского пола уровней свободного гемоглобина и инструкции по применению указанных средств обнаружения.

33. Набор для анализа по п.32, где уровень свободного гемоглобина измеряют посредством измерения уровня альфа-цепи гемоглобина (Hba), бета-цепи гемоглобина (Ήόβ), дельта-цепи гемоглобина (Hb5), гамма-цепи гемоглобина (Hby) и/или общего свободного гемоглобина.

34. Применение композиции, содержащей по меньшей мере одну составную часть, выбранную из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих гем; средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз, для производства фармацевтических препаратов для лечения или профилактики преэклампсии.

35. Применение вещества по п.34, где указанные средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляют собой альфа 1-микроглобулин.

36. Применение вещества по п.34, где указанные средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляют собой антитела, специфичные для гемоглобина и/или гема.

37. Способ лечения или профилактики преэклампсии, причем такой способ включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, эффективного количества фармацевтического препарата, содержащего по меньшей мере одну составную часть, выбранную из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих гем; средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз.

38. Способ по п.37, где указанные средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляют собой альфа 1-микроглобулин.

39. Способ по п.37, где указанные средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляют собой антитела, специфичные для гемоглобина и/или гема.

40. Способ прогнозирования преэклампсии, включающий в себя следующие стадии:

(a) получение биологического образца у беременной особи млекопитающего женского пола;

(b) измерение уровня человеческого лейкоцитарного антигена DPA1 (HLA-DPA1), в указанном биологическом образце; и (c) сравнение уровня HLA-DPA1 в образце с контрольным значением.

41. Способ по п.40, где стадии от (а) до (с) осуществляют для того, чтобы определить имеется или не имеется у указанной беременной особи повышенный риск развития преэклампсии, или имеется у нее или не имеется повышенный риск развития тяжелой формы преэклампсии.

42. Способ по любому одному из пп.40, 41, где экспрессия или сильная экспрессия HLA-DPA1 указывает на лучший прогноз, чем отсутствие экспрессии HLA-DPA1.

43. Набор для анализа для прогнозирования или способствования прогнозированию преэклампсии в соответствии со способом по любому одному из пп.40-42, содержащий средства для определения уровней HLA-DPA1 в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола и инструкции по применению указанных средств обнаружения.

Claims (9)

1. Применение альфа-1-микроглобулина для профилактики или лечения преэклампсии.

2. Применение альфа-1-микроглобулина для производства фармацевтической композиции для профилактики или лечения преэклампсии.

3. Применение по п.2, где композиция дополнительно содержит антитело, стволовую клетку или рекомбинантную клетку, которые нацеливают указанный альфа-1-микроглобулин на плаценту.

4. Способ профилактики или лечения преэклампсии, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей альфа-1-микроглобулин.

5. Способ по п.4, где фармацевтическая композиция предназначена для парентерального применения.

6. Способ по п.4, где фармацевтическая композиция предназначена для перорального применения.

7. Способ по п.5, где парентеральное применение выбрано из перечня, состоящего из внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной и подкожной инъекции.

8. Способ по п.4, где композиция находится в форме жидкой композиции или твердой композиции, разработанной для восстановления ее водой перед введением.

9. Способ по п.4, где композиция находится в лекарственной форме, выбранной из порошков, гранул, пеллетов, шариков, сиропов, микстур, суспензий и эмульсий.