EA036015B1 - Растения, обладающие повышенной толерантностью к гербицидам - Google Patents

Растения, обладающие повышенной толерантностью к гербицидам Download PDF

Info

Publication number
EA036015B1
EA036015B1 EA201590004A EA201590004A EA036015B1 EA 036015 B1 EA036015 B1 EA 036015B1 EA 201590004 A EA201590004 A EA 201590004A EA 201590004 A EA201590004 A EA 201590004A EA 036015 B1 EA036015 B1 EA 036015B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ppo
plant
cas
methyl
seq
Prior art date
Application number
EA201590004A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590004A1 (ru
Inventor
Рафаель Апонтэ
Штефан Треш
Маттиас Витшель
Енс Лерхль
Джиль Мэри Паулик
Чэд Броммер
Тобиас Зайсер
Дарио Масса
Original Assignee
Басф Агро Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Басф Агро Б.В. filed Critical Басф Агро Б.В.
Publication of EA201590004A1 publication Critical patent/EA201590004A1/ru
Publication of EA036015B1 publication Critical patent/EA036015B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/02—Amaranthaceae or Chenopodiaceae, e.g. beet or spinach
    • A01H6/024—Beta vulgaris [beet]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/04—Amaryllidaceae, e.g. onion
    • A01H6/045—Allium cepa [onion]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A01H6/1464—Helianthus annuus [sunflower]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/34—Cucurbitaceae, e.g. bitter melon, cucumber or watermelon 
    • A01H6/348—Cucurbita, e.g. squash or pumpkin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4636—Oryza sp. [rice]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/54—Leguminosae or Fabaceae, e.g. soybean, alfalfa or peanut
    • A01H6/542—Glycine max [soybean]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/74—Rosaceae, e.g. strawberry, apple, almonds, pear, rose, blackberries or raspberries
    • A01H6/7409—Fragaria, i.e. strawberries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/825—Solanum lycopersicum [tomato]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/827—Solanum tuberosum [potato]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/84—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms six-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03004—Protoporphyrinogen oxidase (1.3.3.4)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу борьбы с нежелательными растениями на месте культивирования растений, включающему стадию обеспечения в указанном месте культивируемого растения, которое содержит как минимум одну нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированную протопорфириниоген оксидазу (мут-ППО), которая устойчива или толерантна к ППО ингибирующему гербициду, и стадию применения в указанном месте эффективного количества указанного гербицида, где нуклеотидная последовательность а) включает последовательность SEQ ID NO: 1 или 3 или её вариант, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или 3, и где кодированная мут-ППО представляет собой вариант SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором a) аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln и b) аминокислота в позиции 420 представляет собой Val, Met, Ala, Ile Leu. Изобретение далее относится к растениям, имеющим повышенную толерантность к ППО ингибирующим гербицидам, способу борьбы с нежелательными растениями на месте культивирования указанного растения. Также изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей мут-ППО полипетид, к мут-ППО полипетиду, предоставляющему указанному растению повышенную устойчивость или толерантность к ППО ингибирующему гербициду, к клетке трансгенного растения, к трансгенному растению, к семени, произведенному трансгенным растением, которые имеют повышенную устойчивость к ППО-ингибирующему гербициду, к способам получения указанных трансгенных клеток растений и трансгенного растения с повышенной устойчивостью к ППО-ингибирующему гербициду.

Description

Область изобретения
Данное изобретение относится вообще к способам создания у растений сельскохозяйственного уровня толерантности к гербициду. В частности, изобретение относится к растениям, имеющим повышенную толерантность к ППО ингибирующим гербицидам, способу борьбы с нежелательными растениями на месте культивирования указанного растения, содержащего нуклеиновую кислоту согласно изобретению, кодирующую мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-ППО). Также изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей мут-ППО полипептид, к мут-ППО полипептиду, предоставляющему указанному растению повышенную устойчивость или толерантность к ППО ингибирующему гербициду, к клетке трансгенного растения, к трансгенному растению, к семени, произведенному трансгенным растением, которые имеют повышенную устойчивость к ППО-ингибирующему гербициду, к способам получения указанных трансгенных клеток растений и трансгенного растения с повышенной устойчивостью к ППО-ингибирующему гербициду.
Предпосылки изобретения
Гербициды, которые ингибируют протопорфириноген оксидазу (на которую здесь ссылаются как на протоке или ППО; ЕС:1.3.3.4), ключевой энзим в биосинтезе протопорфирина IX, используются для селективного контроля сорняков начиная с 1960-х гг. ППО катализирует последнюю общую стадию в биосинтезе хлорофилла и гемма, которая представляет собой окисление протопорфириногена IX в протопорфирин IX. (Matringe et al., 1989, Biochem. 1, 260: 231). ППО ингибирующие гербициды включают много различных структурных классов молекул (Duke et al., 1991, Weed Sci., 39: 465; Nandihalli et al., 1992, Pesticide Biochem. Physiol., 43: 193; Matringe et al., 1989, FEBS Lett., 245: 35; Yanase и Andoh, 1989, Pesticide Biochem. Physiol., 35: 70). Эти гербицидные соединения включают простые дифениловые эфиры {например, лактофен, (+-)-2-этокси-1-метил-2-оксоэтил 5-{2-хлор-4-(трифторметил)фенокси}-2-нитробензоат; ацифлуорфен, 5-{2-хлор-4-(трифторметил)фенокси}-2-нитробензойную кислоту; ее сложный метиловый эфир или оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4-(трифтор-бензол)}, оксидиазолы, (например, оксидиазон, 3-{2,4-дихлор-5-(1-метилэтокси)фенил}-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4оксaдиaзол-2-(3H)-он), циклические имиды (например, S-23142, №(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид; хлорофталим, №(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилпиразолы (например, TNPP-этил, этил 2-{1-(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси}пропионат; М&В 39279), производные пиридина (например, LS 82-556), и фенопилат и его O-фенилпирролидино- и пиперидинокарбаматные аналоги. Многие из этих соединений конкурентноспособно ингибируют нормальные реакции, катализируемые энзимами, по-видимому действуя как субстратные аналоги.
Применение ППО ингибирующих гербицидов приводит к аккумулированию протопорфириногена IX в хлоропласте и митохондрии, про который полагают, что он утекает в цитозол, где он окисляется пероксидазой. Если экспонировать на свету, протопорфирин IX вызывает образование синглетного кислорода в цитозоле и образование других реакционных кислородных частиц, которые могут вызывать пероксидацию липида и разрыв мембран, вызывающий быструю гибель клетки (Lee et al., 1993, Plant Physiol., 102:881).
Не все ППО энзимы являются чувствительными к гербицидам, которые ингибируют растительные ППО энзимы. Как Escherichia coli, так и Bacillus subtilis ППО энзимы (Sasarmen et al., 1993, Can. J. Microbiol., 39: 1155; Dailey et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 813) являются устойчивыми к этим гербицидным ингибиторам. Сообщалось о мутанте одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii, устойчивом к фенилимидному гербициду S-23142 (Kataoka et al., 1990, J. Pesticide Sci., 15:449; Shibata et al., 1992, в Research in Photosynthesis, Vol. Ill, N. Murata, ed. Kluwer: Netherlands, p. 567-70). Оказалось, что как минимум один из этих мутантов имеет измененную ППО активность, которая приводит к устойчивости не только к гербицидному ингибитору, на котором проводилась селекция мутанта, но также к другим классам протокс ингибиторов (Oshio et al., 1993, Z. Naturforsch., 48с: 339; Sato et al., 1994, в ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C.). Также сообщалось о мутантной линии клеток табака, которая устойчива к ингибитору S-21432 (Che et al., 1993, Z. Naturforsch., 48с: 350). Ауксотрофичные E.coIi мутанты были использованы для подтверждения устойчивости к гербицидам клонированных растений к ППО ингибирующим гербицидам.
Три главные стратегии доступны для производства растений, толерантных к гербицидам, т.е. (1) детоксифицирование гербицида с помощью энзима, который трансформирует гербицид или его активный метаболит в нетоксичные продукты, такие как, например, энзимы толерантности к бромоксинилу или к баста (EP 242236, EP 337899); (2) мутирование мишенного энзима в функциональный энзим, который менее чувствителен к гербициду или к его активному метаболиту, таких как, например, энзимы для толерантности к глифосату (EP 293356, Padgette S.R. et al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991); или (3) сверхэкспрессирование чувствительного энзима таким образом, чтобы получить количества мишенного энзима в растении, которого достаточно по отношению к гербициду, с учетом кинетических констант этого энзима, так что имеется достаточно доступного функционального энзима, несмотря на присутствие его ингибитора. Третья стратегия была описана для успешного получения растений, которые были толерантными к ППО ингибиторам (см., например, US 5767373 или US 5939602 и члены их патентной семьи).
- 1 036015
Кроме того, в US 2010/0100988 и WO 2007/024739 раскрыты нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, которые имеют такую энзиматическую активность, что аминокислотная последовательность является устойчивой к ППО ингибиторному гербицидному химикату, в частности к 3-фенилурацил ингибитору специфические ППО мутанты.
До настоящего времени не были описаны толерантные к ППО-гербициду растения, содержащие как минимум одну дикого типа или мутированную ППО нуклеиновую кислоту согласно данному изобретению. Ранее не были описаны толерантные к ППО ингибирующему гербициду сельскохозяйственные растения, содержащие мутацию на геномах, отличных от генома, из которого был получен ППО ген. Поэтому то, что требуется специалистам, состоит в идентификации генов толерантности к ППО ингибирующему гербициду из дополнительных геномов и видов. В чем также есть необходимость в настоящее время, так это сельскохозяйственные растения, имеющие повышенную толерантность к гербицидам, таким как ППО ингибирующие гербициды, и содержащие как минимум одну дикого типа и/или мутированную ППО нуклеиновую кислоту. Также необходимы способы контроля роста сорняков по соседству с такими сельскохозяйственными растениями. Эти композиции и способы позволят использовать технику для спреев, когда применяют гербициды на площадях, содержащих сельскохозяйственные растения, или на сельскохозяйственные растения.
Краткий обзор изобретения
Эта проблема решается с помощью данного изобретения, которое относится к способу борьбы с нежелательными растениями на месте культивирования растения, включающему следующие стадии:
(а) обеспечение в указанном месте культивируемого растения, которое содержит как минимум одну нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-ППО), которая устойчива или толерантна к ППО ингибирующему гербициду;и (b) применение в указанном месте эффективного количества указанного гербицида, где нуклеотидная последовательность включает последовательность SEQ ID NO: 1 или 3 или её вариант, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или 3, и где кодированная мут-ППО представляет собой вариант SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором a) аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln и b) аминокислота в позиции 420 представляет собой Val, Met, Ala, Ile или Leu.
Другой объект изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей мут-ППО полипептид, причем нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3 или её вариант, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или 3, и где кодированный мут-ППО представляет собой вариант SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln и аминокислота в позиции 420 представляет собой Val, Met, Ala, Ile или Leu.
Другой объект изобретения относится к мут-ППО полипептиду, включающему последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором аминокислота в позиции 420 представляет собой Ala, Leu, Ile или Val и аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln, причем указанный мут-ППО полипептид предоставляет растению повышенную устойчивость или толерантность к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с диким типом растения.
Другой объект изобретения относится к клетке трансгенного растения, трансформированной вышеуказанной нуклеиновой кислотой, причем клетка обладает повышенной устойчивостью к ППОингибирующему гербициду по сравнению с клеткой дикого типа растения. Другой объект изобретения относится к трансгенному растению, содержащему указанную клетку растения, в котором экспрессия мут-ППО полипептида, кодирующего нуклеиновую кислоту в растении, приводит к повышенной устойчивости растения к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с диким типом растения.
Другой объект данного изобретения относится к трансгенному растению, содержащему вышеуказанную клетку, в котором экспрессия мут-ППО полипептида, кодирующего нуклеиновую кислоту в растении, приводит к повышенной устойчивости растения к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с диким типом растения.
Другим объектом изобретения является растение, которое экспрессирует мутагенизированный или рекомбинантный мут-ППО полипептид, включающий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором аминокислота в позиции 420 представляет собой Met или Val и аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln, и где указанная мут-ППО придает растению повышенную толерантность к гербициду по сравнению с соответствующим вариантом дикого типа растения, когда проводят его экспрессию.
Растения данного изобретения могут быть трансгенными или нетрансгенными.
- 2 036015
Предпочтительно экспрессия нуклеиновой кислоты данного изобретения в растении приводит к повышенной устойчивости растений к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа растения.
Другой объект данного изобретения относится к семени, произведенному трансгенным растением, содержащим клетку растения данного изобретения, или вышеуказанным растением, причем семя является чистосортным, для повышенной устойчивости к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа семени.
Другой объект данного изобретения относится к способу получения трансгенных клеток растений с повышенной устойчивостью к ППО ингибирующим гербицидам по сравнению с вариантом дикого типа клетки растения, включающему трансформирование клетки растения с помощью экспрессионной кассеты, включающей вышеуказанную нуклеиновую кислоту.
Другой объект данного изобретения относится к способу получения трансгенного растения, включающему (a) трансформирование клетки растения с помощью экспрессионной кассеты, включающей вышеуказанную нуклеиновую кислоту, и (b) создание растения с повышенной устойчивостью к ППО ингибирующему гербициду из клетки растения.
Предпочтительно экспрессионная кассета дополнительно включает регуляторную область инициирования транскрипции и регуляторную область инициирования трансляции, которые являются функциональными в растении.
Изобретение также может быть воплощено в очищенные мут-ППО белки, которые включают описанные здесь мутации, которые полезны при исследованиях с молекулярным моделированием, предназначенных для дальнейшего улучшения толерантности к гербициду. Способы очистки белков хорошо известны и могут быть легко проведены с использованием имеющихся в продаже веществ или специально предназначенных способов, как предложено, например, в книге Protein Biotechnology, Walsh и Headon (Wiley, 1994).
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей Amaranthus tuberculatus (A.tuberculatus), Amaranthus tuberculatus устойчивой (A.tuberculatus R), Arabidopsis thaliana длинной (A.thaliana 2), Spinacia oleracea короткой (S.oleracea 2), Nicotiana tabacum короткой (N.tabacum 2), Glycine max (Glycine max), Arabidopsis thaliana короткой (A.thaliana 1), Nicotiana tabacum длинной (N.tabacum 1), Chlamydomonas reinhardtii длинной (С. reinhardtii 1), Zea mays (Z.mays), Oryza sativa (O.sativa 1), Solanum tuberosum (S.tuberosum), Cucumis sativus (C.sativus), Cichorium intybus (C.intybus 1), Spinacia oleracea длинной (S.oleracea 1), Polytomella sp. Pringsheim 198.80 (Polytomella) ППО последовательностей. Сохраненные области показаны в виде светло-серых, серых и черных.
На фиг. 2 показана селекция штаммов Chlamydomonas reinhardtii, устойчивых к ППО ингибирующему гербициду 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2Hбензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диону (CAS 1258836-72-4).
(A) Мутагенизированные клетки помещают слоем на твердую среду без селекционного агента.
(B) Мутагенизированные клетки помещают слоем на твердую среду, содержащую 1х10-7 М ППО ингибирующего гербицида 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диона (CAS 1258836-72-4).
Клетки, которые устойчивы к ППО ингибирующему гербициду, образуют колонии (обведенные кружком и пронумерованные 31 и 32), в то время как чувствительные клетки не растут. Большее число колоний на пластине A по сравнению с пластиной B, указывает на то, что колонии на пластине В устойчивы к ППО ингибирующему гербициду 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диону (CAS 1258836-72-4).
На фиг. 3 показаны ростовые характеристики отобранных штаммов Chlamydomonas reinhardtii, как видно из фиг. 2 устойчивых к ППО ингибирующему гербициду 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6-ил)-1,3,5-триαзинан-2,4-диону (CAS 1258836-72-4).
(A) Кривая зависимости от дозы для клеток дикого типа, обработанных ППО ингибирующим гербицидом 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-mрифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дионом (CAS 1258836-72-4) с соответственной IC50.
(B) Кривая зависимости от дозы для мутагенизированных клеток (штамм 17), обработанных ППО ингибирующим гербицидом 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро2H-бензо[b][1,4]оксaзин-6-ил)-1,3,5-триaзинaн-2,4-дионом (CAS 1258836-72-4) с соответственной IC50. Штаммм 17 (B), устойчивый к ППО ингибирующему гербициду 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диону (CAS 1258836-72-4), показывает значительно более низкий IC50 по сравнению с диким типом клеток.
На фиг. 4 показаны дикого типа и трансгенные T1 растения соя-бобов, обработанные указанным расходным количеством спрея (г а.и./га) ППО ингибирующего гербицида с 1% MSO.
A: означает дикого типа растение соя-бобов.
B: означает растение соя-бобов, трансформированное нуклеиновой кислотой, кодирующей
- 3 036015 мут-ППО SEQ ID NO: 2, в которой лейцин в позиции 397 замещен на аспарагиновую кислоту и фенилаланин в позиции 420 замещен на валин.
означает не обработанный спреем, означает обработанный 150 г сафлуфенацила, означает обработанный 100 г 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диона (CAS 1258836-72-4), означает обработанный 150 г флумиоксазина, означает обработанный 600 г фомесафена.
Таблица 1
Ключ к списку последовательностей
поел. ИД №: Оп и с а н и е Ор г а н и з м Ген № доступа
1 П П О нуклеиновая кислота Amaranthus (амарант) PPX2L_WC DQ386114
2 П П О аминокислота Amaranthus (амарант) ABD52326
3 П П О нуклеиновая кислота Amaranthus (амарант) PPX2L_AC DQ386117
4 П П О аминокислота Amaranthus (амарант) ABD52329
5 П П О нуклеиновая кислота Amaranthus (амарант) PPX2L_CC_R DQ386118
6 П П О аминокислота Amaranthus (амарант) ABD52330
7 П П О нуклеиновая кислота Amaranthus (амарант) PPX2L_AC_R DQ386116
8 П П О аминокислота Amaranthus (амарант) ABD52328
9 П П О нуклеиновая кислота Arabidopsis PPX AB007650
10 П П О аминокислота Arabidopsis BAB08301
11 П П О нуклеиновая кислота Nicotiana (табак) ρρχΐ AF044128
12 П П О аминокислота Nicotiana (табак) AAD02290
13 П П О нуклеиновая Cichorium (цикорий) PPX1 AF160961
- 4 036015
кислота
14 П П О аминокислота Cichorium (цикорий) AF160961_1
15 П П О нуклеиновая кислота Spinacia (шпинат) SO-POX1 AB029492
16 П П О аминокислота Spinacia (шпинат) BAA96808
17 П П О нуклеиновая кислота Spinacia (шпинат) SO-POX2 AB046993
18 П П О аминокислота Spinacia (шпинат) BAB60710
19 П П О нуклеиновая кислота Solanum П П OX AJ225107
20 П П О аминокислота Solanum CAA12400
21 П П О нуклеиновая кислота Zea (кукуруза) ZM_BFc0091 B03 BT063659
22 П П О аминокислота Zea (кукуруза) ACN28356
23 П П О нуклеиновая кислота Zea (кукуруза) prpo2 NM_001111534
24 П П О аминокислота Zea (кукуруза) NP_001105004
25 П П О нуклеиновая кислота Chlamydomonas Ppx1 AF068635
26 П П О аминокислота Chlamydomonas AAC79685
27 П П О нуклеиновая кислота Polytomella П П О AF332964
28 П П О аминокислота Polytomella AF332964_1
29 П П О нуклеиновая кислота Sorghum (сорго) Hyp. Protein XM_002446665
30 П П О аминокислота Sorghum (сорго) XP_002446710
31 П П О нуклеиновая кислота Chlorella (хлорелла)
- 5 036015
32 П П О аминокислота Chlorella (хлорелла) 51538
33 ППО нуклеиновая кислота Oryza Π Π 0X1 ΑΒ057771
34 ППО аминокислота Oryza ΒΑΒ39760
35 ППО нуклеиновая кислота Amaranthus (амарант) ΡΡΧ2 DQ386113
36 ППО аминокислота Amaranthus (амарант) ABD52325
37 ППО нуклеиновая кислота Arabidopsis (амарант) Π Π ΟΧ ΝΜ_178952
38 ППО аминокислота Arabidopsis ΝΡ_849283
39 ППО нуклеиновая кислота Nicotiana (табак) ρρχΙΙ AF044129
40 ППО аминокислота Nicotiana (табак) AAD02291
41 ППО нуклеиновая кислота Glycine (с о я ) hemG ΑΒ025102
42 ППО аминокислота Glycine (с о я ) ΒΑΑ76348
43 ППО нуклеиновая кислота Cucumis Csn Π Ο ΑΒ512426
44 ППО аминокислота Cucumis ΒΑΗ 84864.1
45 ППО нуклеиновая кислота Oryza (рис) Hyp. Protein AL606613
46 ППО аминокислота Oryza (рис) CAE01661
Подробное описание
Используемые в описании и прилагаемых пунктах изобретения формы в единственном числе включают также ссылки на них во множественном числе, если контекст не указывает явно иное, например, выражение включающий в себя, состоит, состоит из следует понимать как включение указанного элемента, целого или стадии, или группы элементов, целых или стадий, однако не означает исключение любого другого элемента, целого или стадии, или любой другой группы элементов, целых или стадий.
Данное изобретение относится к способу контроля нежелательной вегетации в месте культивирования растений, этот способ включает стадии:
(a) обеспечение в указанном месте растения, которое содержит как минимум одну нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую дикий тип протопорфириноген оксидазы или мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-ППО), которое устойчиво или толерантно к ППО ингибирующему гербициду;
(b) применение в указанном месте эффективного количества указанного гербицида.
Термин контроль нежелательной вегетации следует понимать как означающий уничтожение сорняков и/или иные действия, замедляющие или ингибирующие нормальный рост сорняков. Под сорняками в широком понимании этого слова следует понимать такие растения, которые произрастают в местах, где они нежелательны. Сорняки согласно данному изобретению включают, например, двудольные и однодольные сорняки.
Двудольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки родов: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus и Taraxacum.
Однодольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки родов: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus и Apera.
- 6 036015
Кроме того, сорняки согласно данному изобретению могут включать, например, сельскохозяйственные растения, которые произрастают в нежелательных местах. Например, случайное растение кукурузы, которое находится в поле, на котором растут преобладающе растения соя-бобов, можно рассматривать как сорняк, если растение кукурузы нежелательно на поле растений соя-бобов.
Термин растение используется в самом широком смысле, насколько оно относится к органическому материалу, и подразумевает включение в себя эукариотических организмов, которые являются членами царства растений, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, сосудистые растения, овощи, зерновые культуры, цветы, деревья, травы, кустарники, лиственные травы, виноград, папоротники, мхи, грибы и водоросли, и т.д., а также клоны, ответвления и части растений, используемые для бесполого размножения (т.е. черенки, дудки, ростки, корневища, подземные стволы, чурбаки, венцы, луковицы, клубнелуковицы, клубни, ризомы, растения/ткани произведенные в тканевой структуре и т.д.). Термин растение далее охватывает растения целиком, предков и потомков растений и части растений, включая семена, всходы, стволы, листья, корни (включая клубни), цветы, цветочки, плоды, цветоножки, стебельки, тычинки, пыльники, рыльца, пестики, завязи, лепестки, чашелистики, плодолистики, верхущку корня, шапку корня, волоски корня, волоски листьев, волоски семян, пыльцу зерна, микроспору, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоэму, паренхиму, эндосперм, спутниковую клетку, охранную клетку и любые другие известные органы, ткани и клетки растения и ткани и органы, причем каждый из вышеупомянутых содержит представляющую интерес ген/нуклеиновую кислоту. Термин растение также охватывает клетки растения, суспензионные культуры, мозолевые ткани, эмбрионы, меристематическую область, гаметофиты, спорофиты, цветочную пыльцу и микроспоры, опять же, причем каждый из вышеупомянутых содержит представляющую интерес ген/нуклеиновую кислоту.
Растения, которые особенно полезны в способах данного изобретения, включают все растения, которые принадлежат к надсемейству Viridiplantae, в частности однодольные и двудольные растения, включая пищевые или фуражные бобы, декоративные растения, сельскохозяйственные культуры, деревья или кустарники, выбираемые из списка, который включает Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (т.е. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (т.е. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [канола, рапс с маслянистыми семенами, турнепс]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (т.е. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (т.е. Glycine max, Soja hispida или Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (т.е. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (т.е. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (т.е. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (т.е. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (т.е. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium или Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (т.е. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum или Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., амарант, артишок, спаржа, брокколи, брюссельская капуста, капуста кочанная, канола, морковь, капуста цветная, сельдерей, collard greens, лен, капуста кормовая, чечевица, масличный рапс, окра, лук, картофель, рис, соя-бобы, клубника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, томаты, тыква, чай и водоросли, среди других.
Согласно предпочтительному варианту данного изобретения растение представляет сельскохозяйственное растение. Примеры сельскохозяйственных растений включают среди других соя-бобы, подсолнечник, канолу, люцерну, семенной рапс, хлопчатник, томаты, картофель или табак. Далее предпочти- 7 036015 тельно, что растение является однодольным растением, таким как сахарный тростник. Далее предпочтительно, что растение является зерновой культурой, такой как рис, кукуруза, пшеница, ячмень, просо, рожь, сорго или овес.
В предпочтительном варианте растение было предварительно получено способом, включающим рекомбинантное препарирование растения путем введения и сверхэкспрессии дикого типа или мут-ППО трансгена согласно данному изобретению, как более детально описано ниже.
В другом предпочтительном варианте растение было предварительно получено способом, включающим in situ мутагенизирование клеток растения для получения клеток растения, которые экспрессируют мут-ППО.
Как раскрыто здесь, нуклеиновые кислоты данного изобретения находят применение для увеличения толерантности к гербицидам у растений, которые содержат в своих геномах ген, кодирующий толерантность к гербициду в диком типе или мут-ППО белке. Такой ген может быть эндогенным геном или трансгеном, как описано ниже. Кроме того, в некоторых вариантах нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть перетасованы с любой комбинацией полинуклеотидных последовательностей, представляющих интерес, для того чтобы создать растения с желательным фенотипом. Например, нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть перетасованы с любым другим полинуклеотидом, кодирующим полипептиды, имеющие пестицидную и/или инсектицидную активность, такие как, например, Bacillus thuringiensis токсиновые белки (описанные в патентах U.S. 5366892; 5747450; 5737514; 5,723,756; 5593881 и в статье Geiser et al., (1986), Gene 48: 109), 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза (EPSPS), глифосат ацетил трансфераза (GAT), цитохром Р450 монооксигеназа, фосфинотрицин ацетил трансфераза (PAT), ацетогидрокси кислоты синтаза (AHAS; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактат синтаза или ALS), гидроксифенил пируват диоксигеназа (HPPD), фитоен десатураза (PD) и дикамбу, разрушающие энзимы, как раскрыто в WO 02/068607, или феноксиуксусную кислоту и феноксипропионовую кислоту, разрушающие энзимы, как раскрыто в WO 2008/141154 или WO 2005/107437. Созданные комбинации могут также включать многократные копии любого из представляющих интерес нуклеотидов.
Как правило, термин гербицид, используемый здесь, означает активный ингредиент, который убивает, контролирует или другим образом неблагоприятно модифицирует рост растений.
Предпочтительное количество или концентрация гербицида является эффективным количеством или эффективной концентрацией. Под эффективным количеством и эффективной концентрацией подразумевается количество и концентрация соответственно, которое достаточно для убивания или ингибирования роста подобных дикого типа растений, тканей растений, клеток растений или клеток хозяина, однако это указанное количество не должно убивать или опасно ингибировать рост устойчивых к гербициду растений, тканей растений, клеток растений или клеток хозяина данного изобретения. Типично, эффективное количество гербицида является количеством, которое рутинно применяется в системе сельскозяйственного производства для уничтожения представляющих интерес сорняков. Такие количества известны специалистам. Гербицидная активность проявляется гербицидами, полезными в данном изобретении, когда их применяют непосредственно на растение или на место роста растения на любой стадии роста, или перед посадкой или всходами. Наблюдаемый эффект зависит от подлежащего контролю вида растений, стадии роста растения, параметрам применения разбавления и размеров капель спрея, размеров частиц твердых компонентов, условий окружающей среды во время применения, специфичных применяемых соединений, специфичных вспомогательных средств и применяемых носителей, типа почвы и т.п., а также от количества применяемого химического препарата. Эти и другие факторы могут быть подогнаны, как известно специалистам, для способствования неселективному или селективному гербицидному действию. Как правило, предпочтительно применение гербицидов после всходов на относительно незрелую нежелательную вегетацию для достижения максимального контроля сорняков.
Под толерантным к гербициду или устойчивым к гербициду растением подразумевают растение, которое является толерантным или устойчивым как минимум к одному гербициду при уровне, который будет нормально убивать или ингибировать рост нормального или дикого типа растения. Под толерантным к гербициду диким типом или мут-ППО белком или устойчивым к гербициду диким типом или мут-ППО белком подразумевается, что ППО белок показывает более высокую ППО активность по отношению к ППО активности дикого типа ППО белка, если в присутствии как минимум одного гербицида, о котором известно, что он вмешивается в ППО активность, и при концентрации или уровне гербицида, о которой известно, что она ингибирует ППО активность дикого типа и мут-ППО белка. Кроме того, ППО активность такого толерантного к гербициду или устойчивого к гербициду мут-ППО белка может быть здесь отнесена к толерантной к гербициду или устойчивой к гербициду ППО активности.
Как правило, если ППО ингибирующие гербициды A и/или гербицидные соединения B, как описано здесь, которые могут быть применены в контексте данного изобретения, способны образовать геометрические изомеры, например E/Z изомеры, то возможно применение как чистых изомеров, так и их смесей в композициях согласно данному изобретению. Если ППО ингибирующие гербициды A и/или гербицидные соединения B, как описано здесь, имеют один или несколько хиральных центров и, как следствие, присутствуют как энантиомеры, так и диастереомеры, то можно применять как чистые энантиомеры и диастереомеры, так и их смеси в композициях согласно данному изобретению. Если ППО ингибирую- 8 036015 щие гербициды A и/или гербицидные соединения B, как описано здесь, имеют ионизируемые функциональные группы, то их можно также применять в виде их сельскохозяйственно приемлемых солей. Пригодными являются, как правило, соли таких катионов и соли присоединения к кислотам таких кислот, чьи катионы и анионы соответственно не оказывают вредного эффекта на активность активных соединений. Предпочтительными катионами являются ионы щелочных металлов, предпочтительно лития, натрия и калия, щелочноземельных металлов, предпочтительно кальция и магния, и переходных металлов, предпочтительно марганца, меди, цинка и железа, далее аммония и замещенного аммония, в котором один из четырех водородных атомов замещен на (С1-С4)алкил, гидрокси(С1-С4)алкил, (С1-С4)алкокси-(С1-С4)алкил, гидрокси(С1-С4)алкокси-(С1-С4)алкил, фенил или бензил, предпочтительно аммоний, метиламмоний, изопропиламмоний, диметиламмоний, диизопропиламмоний, триметиламмоний, гептиламмоний, додециламмоний, тетрадециламмоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, тетрабутиламмоний, 2-гидроксиэтиламмоний (оламиновая соль), 2-(2-гидроксиэт-1-окси)эт-1-иламмоний (дигликольаминовая соль), ди(2-гидроксиэт-1-ил)аммоний (диоламиновая соль), трис-(2-гидроксиэтил)аммоний (троламиновая соль), трис-(2-гидроксипропил)аммоний, бензилтриметиламмоний, бензилтриэтиламмоний, N.N.N-триметилэтаноламмоний (холиновая соль), кроме того, фосфониевые ионы, сульфониевые ионы, предпочтительно три((С1-С4)алкил)сульфоний, такой как триметилсульфоний, и сульфоксониевые ионы, предпочтительно три((С1-С4)алкил)сульфоксоний, и, наконец, соли полиосновных аминов, такие как КАбис-(3-аминопропил)метиламин и диэтилентриамин. Анионами полезных солей присоединения к кислотам являются в первую очередь хлориды, бромиды, фториды, йодиды, гидросульфаты, метилсульфаты, сульфаты, дигидрофосфаты, гидрофосфаты, нитраты, бикарбонаты, карбонаты, гексафторсиликат, гексафторфосфат, бензоат, а также анионы (С1-С4)алкановых кислот, предпочтительно формат, ацетат, пропионат и бутират.
ППО ингибирующие гербициды A и/или гербицидные соединения B, как описано здесь, имеющие карбоксильную группу, могут применяться в виде кислоты, в виде сельскозяйственно приемлемой соли, как сказано выше, или в виде сельскохозяйственно приемлемого производного, например в виде амида, такого как моно- или ди(С1-С6)алкиламиды или ариламиды, в виде сложного эфира, например в виде аллилового сложного эфира, пропаргилового сложного эфира, (С1-С10)алкилового сложного эфира, алкоксиалкилового сложного эфира, тефуриловых ((тетрагидрофуран-2-ил)метиловых) сложных эфиров, а также сложных тиоэфиров, например в виде сложных (С1-С10)алкилтиоэфиров. Предпочтительными моно- и ди(С1-С6)алкиламидами являются метил- и диметиламиды. Предпочтительными ариламидами являются, например, анилиды и 2-хлоранилиды. Предпочтительными сложными алкиловыми эфирами являются, например, метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, изобутиловый, пентиловый, мексиловый (1-метилгексиловый), мептиловый (1-метилгептиловый), гептиловый, октиловый или изооктиловый (2-этилгексиловый) сложный эфир. Предпочтительными сложными (С1-С4)алкокси(С1-С4)алкиловыми эфирами являются линейные или разветвленные сложные (С1-С4)алкоксиэтиловые эфиры, например сложный 2-метоксиэтиловый, 2-этоксиэтиловый, 2-бутоксиэтиловый (бутотиловый), 2-бутоксипропиловый или 3-бутоксипропиловый эфир. Примером линейного или разветвленного сложного (С1-С10)алкилтиоэфира является сложный этилтиоэфир.
Примерами ППО ингибирующих гербицидов, которые могут быть использованы согласно данному изобретению, являются ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, азафенидин, бенкарбазон, бензфендизон, бифенокс, бутафенацил, карфентразон, карфентразон-этил, хлометоксифен, цинидон-этил, флуазолат, флуфенпир, флуфенпир-этил, флумиклорак, флумиклорак-пентил, флумиоксазин, флуорогликофен, флуорогликофен-этил, флутиацет, флутиацет-метил, фомесафен, галосафен, лактофен, оксадиаргил, оксадиазон, оксифлуорфен, пентоксазон, профлуазол, пираклонил, пирафлуфен, пирафлуфен-этил, сафлуфенацил, сульфентразон, тидиазимин, тиафенацил, хлорнитрофен, флумипроп, флуоронитрофен, флупропацил, фурилоксифен, нитрофлуорфен, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-( 1 -метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3 ил)фенокси]-2-пиридил-окси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), №этил-3-2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамцд (CAS 452098-92-9), №тетрагидрофурфурил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметил-фенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1карбоксамид (cAs 915396-43-9), №этил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамид (CAS
452099-05-7), №тетрагидрофурфурил-3 -(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пцразол-1 карбоксамид (cAs 452100-03-7),
3-[7-фтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5-диметил-6-тиоксо[ 1,3,5]триазинан-2,4-дион (CAS 451484-50-7),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4),
2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7-тетрагидроизоиндол-1,3-дион (CAS 1300118-96-0),
- 9 036015
1-метил-6-трифторметил-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин6-ил)-1 Н-пиримидин-2,4-дион, метил (Е)-4-[2-хлор-5-[4-хлор-5-(дифторметокси)-1Н-метилпиразол-3-ил]-4-фторфенокси]-3метоксибут-2-еноат [CAS 948893-00-3],
3-[7-хлор-5-фтор-2-(трифторметил)-Ш-бензимидазол-4-ил]-1-метил-6-(трифторметил)-Шпиримидин-2,4-дион (CAS 212754-02-4) и урацилы формулы III
где R30 и R31 независимо один от другого означают F, Cl или CN;
R32 означает O или S;
R33 означает H, F, Cl, CH3 или OCH3;
R34 означает CH или N;
R35 означает O или S;
R36 означает H, CN, CH3, CF3, OCH3, OC2H5, SCH3, SC2H5, (CO)OC2H или CH2R38, где R38 означает F, Cl, OCH3, SCH3, SC2H5, CH2F, CH2Br или CH2OH;
R37 означает (C1-C6-αлкил)амино-, (C1-C6-диαлкил)аминогруппу, (NH)OR39, OH, OR40 или SR40, где R39 означает CH3, C2H5 или фенил;
R40 означают независимо один от другого (С^С^алкил, (С2-С6)алкенил, (С3-С6)алкинил, (C1-C6)галоидaлкил, (C1-C6)алкокси(C1-C6)алкил, (C1-C6)алкокси(C1-C6)алкокси(C1-C6)алкил, (C2-C6)цианоалкил, (C1-C4)алкоксикарбонил(C1-C4)алкил, (C1-C4)αлкилкарбониламиногруппу, (С1-С6)алкилсульфинил^-С^алкил, (C1-C6)aлкилсульфонил(C1-C6)aлкил, (C1-C6)диалкокси(C1-C6)алкил, (C1-C6)алкилкарбонилокси^-С^алкил, фенилкарбонил^-С^алкил, три((C1-C3)алкил)силил(C1-C6)алкил, три((C1-C3)алкил)силил(C1-C6)алкенил, три((C1-C3)алкил)силил(C1-C6)алкинил, три((СгС3)алкил)силилC1-C6-алкокси(C1-C6)алкил, диметиламиногруппу, тетрагидропиранил, тетрагидрофуранил(С1-С3)алкил, фенил(С1-С6)алкокси(С1-С6)алкил, фенил(С1-С3)алкил, пиридил(С1-С3)алкил, пиридил, фенил, причем пиридилы и фенилы независимо один от другого замещены от одного до пяти заместителями, выбираемыми из группы, включающей галоид, (С1-С3)алкил или (С1-С2)галоидалкил; (С3-С6-)циклоалкил или (С3-С6)циклоалкил(С1-С4)алкил, причем циклоалкилы независимо один от другого не замещены или замещены от одного до пяти заместителями, выбираемыми из группы, включающей галоид, (С1-С3)алкил и (С1-С2)галоидалкил, включая их сельскохозяйственно приемлемые соли щелочных металлов или аммониевые соли.
К предпочтительным ППО ингибирующим гербицидам, которые можно применять согласно данному изобретению относятся:
ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, азафенидин, бенкарбазон, бензфендизон, бутафенацил, карфентразоне-этил, цинидон-этил, флуфенпир-этил, флумиклоракпентил, флумиоксазин, флуорогликофен-этил, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксадиазон, оксифлуорфен, пентоксазон, пирафлуфен-этил, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), №этил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 45209892-9), №тетрагидрофурфурил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1карбоксамид (CAS 915396-43-9), №этил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифтор-метилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS
452099-05-7), №тетрагидрофурфурил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметил-фенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1карбоксамид (CAS 452100-03-7),
3-[7-фтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5-диметил-6-тиоксо[ 1,3,5]триазинан-2,4-дион (CAS 451484-50-7),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Hбензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4),
2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7тетрагидроизоиндол-1,3-дион (CAS 1300118-96-0),
1-метил-6-трифторметил-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин6-ил)-Ш-пиримидин-2,4-дион (CAS 1304113-05-0),
3-[7-хлор-5-фтор-2-(трифторметил)-Ш-бензимидазол-4-ил]-1-метил-6-(трифторметил)-Шпиримидин-2,4-дион (CAS 212754-02-4) и
- 10 036015 урацилы формулы III.1 (соответствующие урацилам формулы III, где R30 означает F; R31 означает
Cl; R32 означает O; R33 означает H; R34 означает CH; R35 означает O и R37 означает OR40):
где R36 означает OCH3, OC2H5, SCH3 или SC2H5;
R40 означает (С1-С6)алкил, (С2-С6)алкенил, (С3-С6)алкинил, (С1-С6)галоидалкил, (С1-С6)алкокси(С1С6)алкил, (С1-С6)алкокси(С1-С6)алкокси(С1-С6)алкил, (С1-С3)цианоалкил, фенил(С1-С3)алкил, пиридил(С1-С3)алкил, (С3-С6)циклоалкил или (С3-С6)циклоалкил(С1-С4)алкил, причем циклоалкилы не замещены или замещены от одного до пяти заместителями, выбираемыми из группы, включающей галоид, (С1-С3)алкил и (С1-С2)галоидалкил; и урацилы формулы III.2 (соответствующие урацилам формулы III, где R30 означает F; R31 означает Cl; R32 означает O; R33 означает Н; R34 означает N; R35 означает O и R37 означает OR40, где R40 означает (С1-С6)алкил):
Более предпочтительными ППО ингибирующими гербицидами, которые могут применяться согласно данному изобретению, являются:
ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, карфентразоне-этил, цинидон-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
3-[7-фтор-3 -оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо [ 1,4]оксазин-6-ил] -1,5 -диметил-6-тиоксо[1,3,5]триазинан-2,4-дион (CAS 451484-50-7),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Нбензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4),
2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7тетрагидроизоиндол-1,3-дион (CAS 1300118-96-0),
1-метил-6-трифторметил-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин6-ил)-1Н-пиримидин-2,4-дион (CAS 1304113-05-0) и урацилы формулы III.1.1 (соответствующие урацилам формулы III, где R30 означает F; R31 означает Cl; R32 означает O; R33 означает Н; R34 означает CH; R35 означает О; R36 означает OCH3 и R37 означает OR40):
где R40 означает (С1-С6)алкил, (С2-С6)алкенил, (С3-С6)алкинил, (C1-C6)галоидалкил, (С1-С6)алкокси(С1-С6)алкил, (С1-С6)алкокси(С1-С6)алкокси(С1-С6)алкил, (С1-С3)цианоалкил, фенил(С1-С3)алкил, пиридил(С1-С3)алкил, (С3-С6)циклоалкил или (С3-С6)циклоалкил(С1-С4)алкил, причем циклоалкилы не замещены или замещены от одного до пяти заместителями, выбираемыми из группы, включающей галоид, (С1-С3)алкил и (С1-С2)галоидалкил;
означает предпочтительно CH3, CH2CH2OC2H5, CH2CHF2, циклогексил, (1-метилциклопропил)метил или CH2 (пиридин-4-ил);
урацилы формулы III.2.1 (соответствующие урацилам формулы III, где R30 означает F; R31 означает Cl; R32 означает O; R33 означает H; R34 означает N; R35 означает O и R37 означает OR40, где R40 означает CH3):
и урацилы формулы III.2.2 (соответствующие урацилам формулы III, где R30 означает F; R31 означа- 11 036015 ет Cl; R32 означает O; R33 означает H; R34 означает N; R35 означает O и R37 означает OR40, где R40 означает
C2H5):
Особенно предпочтительными ППО ингибирующими гербицидами являются ППО ингибирующие гербициды A.1 - A.14 приведенные в табл. A.
Таблица A
А.1 Ацифлуорфен
А.2 Бутафенацил
А.З Карфентразон-этил
А.4 Цинидон-этил
А.5 Флумиоксазин
А.6 флутиацет-метил
А.7 Фомесафен
А.8 Лактофен
А.9 Оксадиаргил
А.10 Оксифлуорфен
А.11 Сафлу фенацил
А.12 Сульфентразон
А.13 Этил [3 - [2 -хлор-4-фтор-5 -(1 -метил-6-трифторметил-2,4 -диоксо -1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6)
А.14 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Нбензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4)
ППО ингибирующие гербициды, описанные выше, которые полезны при осуществлении данного изобретения, часто лучше применять в сочетании с одним или более других гербицидов для обеспечения контроля более широкого разнообразия нежелательной вегетации. Например, ППО ингибирующие гербициды могут далее применяться в сочетании с дополнительными гербицидами, к которым сельскохозяйственное растение естественно толерантно или к которым оно устойчиво через экспрессию одного или более дополнительных трансгенов, как отмечено выше. В случае, когда применяют в сочетании с другими нацеленными гербицидами, заявленные теперь соединения могут быть приготовлены в виде препарата с другим гербицидом или другими гербицидами, в виде смеси в большом резервуаре с другим гербицидом или другими гербицидами или применены последовательно с другим гербицидом или другими гербицидами.
Подходящими компонентами для смеси являются, например, выбираемые из гербицидов классов b1) - b15).
В) Гербициды классов b1) - b15):
b1) ингибиторы биосинтеза липидов;
b2) ацетолактат синтазы ингибиторы (ALS ингибиторы);
b3) ингибиторы фотосинтеза;
b4) ингибиторы протопорфириноген-IX оксидазы, b5) отбеливания гербициды;
b6) энолпирувил шикимат 3-фосфат синтазы ингибиторы (EPSP ингибиторы);
b7) глутамин синтазы ингибиторы;
b8) 7,8-дигидроптероат синтазы ингибиторы (DHP ингибиторы);
b9) ингибиторы митоза; b10) ингибиторы синтеза очень длинноцепных жирных кислот (VLCFA ингибиторы);
b11) ингибиторы биосинтеза целлюлозы;
b12) разъединяющие гербициды;
b13) ауксиновые гербициды;
b14) ингибиторы транспорта ауксина и b15) другие гербициды, выбираемые из группы, включающей бромобутид, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, цинметилин, кумилурон, далапон, дазомет, дифензокват, дифензокват-метилсульфат, диметипин, DSMA, димрон, эндотал и его соли, этобензанид, флампроп, флампроп-изопропил, флампроп-метил, флампроп-М-изопропил, флампроп-М-метил, флуренол, флуренол-бутил, флурпримидол, фосамин, фосамин-аммоний, инданофан, индазифлам, малеиновый гидразид, мефлуидид, метам, метиозолин (CAS 403640-27-7), метил-азид, метилбромид, метил-димрон, метилйодид, MSMA, олеиновая кислота, оксацикломефон, пеларгоновая кислота, пирибутикарб, квинокламин, триазифлам, тридифан и 6хлор-3-(2-циклопропил-6-метилфенокси)-4-пиридазинол (CAS 499223-49-3) и его соли и сложные эфиры,
- 12 036015 включая их сельскохозяйственно приемлемые соли или производные.
К примерам гербицидов В, которые могут применяться в сочетании с ППО ингибирующими гербицидами согласно данному изобретению, относятся:
b1) из группы ингибиторов биосинтеза липида:
ACC-гербициды, такие как аллоксидим, аллоксидим-натрий, бутроксидим, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргил, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, диклофоп, диклофоп-метил, феноксапроп, феноксапроп-этил, феноксапроп-Р, феноксапроп-Р-этил, флуазифоп, флуазифоп-бутил, флуазифоп-Р, флуазифоп-Р-бутил, галоксифоп, галоксифоп-метил, галоксифоп-Р, галоксифоп-Р-метил, метамифоп, пиноксаден, профоксидим, пропаквизафоп, квизалфоп, квизалфоп-этил, квизалфоп-тефурил, квизалфоп-Р, квизалфоп-Р-этил, квизалфоп-Р-тефурил, сетоксидим, тепралоксидим, тралкоксидим,
4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3 -ил)-5-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-2H-пиран3(6Н)-он (CAS 1312337-72-6);
4-(2',4'-дuхлор-4-цuклоnроnuл[1,1'-бuфенил]-3-uл)-5-гugроксu-2,2,6,6-mеmрамеmuл-2H-nuран-3(6H)он (CAS 1312337-45-3);
4-(4'-хлор-4-эτил-2'-фτор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5-гидрокси-2,2,6,6-τеτрамеτил-2H-πиран-3(6H)-он (CAS 1033757-93-5);
4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-2,2,6,6-тетраметил-2H-пиран-3,5(4Н,6H)-дион (CAS 1312340-84-3);
5-(ацетилокси)-4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-2H-пиран-3-он (CAS 1312337-48-6);
5-(ацетилокси)-4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил-[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил2H-пиран-3-он;
5-(ацетилоксu)-4-(4'-хлор-4-эmuл-2'-фтор[1,1'-бuфенuл]-3-uл)-3,6-дuгиgро-2,2,6,6-mетраметuл-2Hпиран-3-он (CAS 1312340-82-1);
5-(ацетилокси)-4-(2',4'-дихлор-4-эmил[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6-mеmраметил-2H-nиран3-он (CAS 1033760-55-2);
метиловый эфир 4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-5-оксо-2H-пuран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1312337-51-1);
метиловый эфир 4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил-[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-5-оксо-2H-пuран-3-илкарбоновой кислоты;
метиловый эфир 4-(4'-хлор-4-этил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-5оксо-2H-πиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1312340-83-2);
метиловый эфир 4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-5-оксо2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1033760-58-5) и не ACC гербициды, такие как бенфуресат, бутилат, циклоат, далапон, димепиперат, EPTC, эспрокарб, этофумесат, флупропанат, молинат, орбенкарб, пебулат, просульфокарб, TCA, тиобенкарб, тиокарбазил, триаллат и вернолат;
b2) из группы ALS ингибиторов:
сульфонилмочевины, такие как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, бенсульфуронметил, хлоримурон, хлоримурон-этил, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфурон, этаметсульфурон-метил, этоксисульфурон, флазасульфурон, флуцетосульфурон, флупирсульфурон, флупирсульфурон-метил-натрий, форамсульфурон, галосульфурон, галосульфурон-метил, имазосульфурон, йодосульфурон, йодосульфурон-метил-натрий, иофенсульфурон, иофенсульфурон-натрий, мезосульфурон, метазосульфурон, метсульфурон, метсульфурон-метил, никосульфурон, ортосульфамурон, оксасульфурон, примисульфурон, примисульфурон-метил, пропирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, пирозосульфурон-этил, римсульфурон, сульфометурон, сульфометурон-метил, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тифенсульфурон-метил, триасульфурон, трибенурон, трибенурон-метил, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, трифлусульфурон-метил и тритосульфурон, имидазолиноны, такие как имазаметабенз, имазаметабенз-метил, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин и имазетапир, триазолопиримидиновые гербициды и сульфониланилиды, такие как хлорансулам, хлорансуламметил, диклосулам, флуметсулам, флорасулам, метосулам, пенокссулам, пиримисульфан и пирокссулам, пиримидинилбензоаты, такие как биспирибак, биспирибак-натрий, пирибензоксим, пирифталид, пириминобак, пириминобак-метил, пиритиобак, пиритиобак-натрий,
1-метилэтиловый эфир 4-[[[2-[(4,6-диметокси-2-пиримидинил)окси]фенил]метил]амино]бензойной кислоты (CAS 420138-41-6), пропиловый эфир 4-[[[2-[(4,6-диметокси-2-пиримидинил)окси]фенил]метил]амино]бензойной кислоты (CAS 420138-40-5), №(4-бромфенил)-2-[(4,6-диметокси-2-пиримидинил)окси]-бензолметанамин (CAS 420138-01-8), сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды, такие как флукарбазон, флукарбазоннатрий, пропоксикарбазон, пропоксикарбазон-натрий, тиенкарбазон и тиенкарбазон-метил; и триафамон.
Среди этих, предпочтительный вариант данного изобретения относится к таким смесям, которые содержат как минимум один имидазолиноновый гербицид;
- 13 036015 b3) из группы ингибиторов фотосинтеза:
амикарбазон, ингибиторы фотосистемы II, т.е. триазиновые гербициды, включая хлоротриазины, триазиноны, триазиндионы, метилтиотриазины и пиридазиноны, такие как аметрин, атразин, хлоридазон, цианазин, десметрин, диметаметрин, гексазинон, метрибузин, прометон, прометрин, пропазин, симазин, симетрин, тербуметон, тербутилазин, тербутрин и триэтазин, арилмочевина, такая как хлоробромурон, хлоротолурон, хлороксурон, диметурон, диурон, флуометурон, изопротурон, изоурон, линурон, метамитрон, метабензтиазурон, метобензурон, метоксурон, монолинурон, небурон, сидурон, тебутиурон и тиадиазурон, фенилкарбаматы, такие как десмедифам, карбутилат, фенмедифам, фенмедифам-этил, нитрильные гербициды, такие как бромофеноксим, бромоксинил и его соли и сложные эфиры, иоксинил и его соли и сложные эфиры, урацилы, такие как бромацил, ленацил и тербацил, и бентазон и бентазоннатрий, пиридат, пиридафол, пентанохлор и пропанил, и ингибиторы фотосистемы I, такие как дикват, дикват-дибромид, паракват, паракват-дихлорид и паракват-диметилсульфат.
Среди этих, предпочтительный вариант данного изобретения относится к таким смесям, которые содержат как минимум один арилмочевиновый гербицид.
Среди этих, также предпочтительный вариант данного изобретения относится к таким смесям, которые содержат как минимум один триазиновый гербицид.
Среди этих, также предпочтительный вариант данного изобретения относится к таким смесям, которые содержат как минимум один нитрильный гербицид;
b4) из группы протопорфириноген-IX оксидазы ингибиторов:
ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, азафенидин, бенкарбазон, бензфендизон, бифенокс, бутафенацил, карфентразоне, карфентразоне-этил, хлометоксифен, цинидон-этил, флуазолат, флуфенпир, флуфенпир-этил, флумиклорак, флумиклорак-пентил, флумиоксазин, флуорогликофен, флуорогликофенэтил, флутиацет, флутиацет-метил, фомесафен, галосафен, лактофен, оксадиаргил, оксадиазон, оксифлуорфен, пентоксазон, профлуазол, пираклонил, пирафлуфен, пирафлуфен-этил, сафлуфенацил, сульфентразон, тидиазимин, тиафенацил, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-( 1 -метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3 ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), №этил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 45209892-9), №тетрагидрофурфурил-3 -(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1 карбоксамид (cAs 915396-43-9), №этил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS
452099-05-7), №тетрагидрофурфурил-3 -(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1 карбоксамид (cAs 452100-03-7),
3-[7-фтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5-диметил-6-тиоксо[1,3,5]триазинан-2,4-дион, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4),
2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксαзин-6-ил)-4,5,6,7-тетрагидроизоиндол- 1,3-дион,
-метил-6-трифторметил-3 -(2,2,7-трифтор-3 -оксо-4-nроп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо [ 1,4]оксазин6-ил)-Ш-пиримидин-2,4-дион (CAS 1304113-05-0), метил (E)-4-[2-хлор-5-[4-хлор-5-(дифторметокси)-1H-метилпиразол-3-ил]-4-фторфенокси]-3метоксибут-2-еноат [CAS 948893-00-3] и
3-[7-хлор-5-фтор-2-(трифторметил)-Ш-бензимидазол-4-ил]-1-метил-6-(трифторметил)-Шпиримидин-2,4-дион (CAS 212754-02-4);
b5) из группы отбеливающих гербицидов:
PDS ингибиторы: бефлубутамид, дифлуфеникан, флуридон, флурохлоридон, флуртамон, норфлуразон, пиколинафен и 4-(3-трифторметилфенокси)-2-(4-трифторметилфенил)пиримидин (CAS 180608-33-7),
HPPD ингибиторы: бензобициклон, бензофенап, кломазон, изоксафлутол, мезотрион, пирасульфотол, пиразолинат, пиразоксифен, сулкотрион, тефурилтрион, темботрион, топрамезон и бициклопирон, отбеливатели с неизвестной мишенью: аклонифен, амитрол и флуметурон;
b6) из группы EPSP синтазы ингибиторов:
глифосат, глифосат-изопропиламмоний, глифосат-калий и глифосат-тримезий (сульфосат);
b7) из группы глутамин синтазы ингибиторов:
биланафос (биалафос), биланафос-натрий, глуфосинат, глуфосинат-Р и глуфосинат-аммоний;
b8) из группы DHP синтазы ингибиторов: асулам;
b9) из группы ингибиторов митоза:
соединения группы K1: динитроанилины, такие как бенфлуралин, бутралин, динитрамин, эталфлуралин, флухлоралин, оризалин, пендиметалин, продиамин и трифлуралин, фосфорамидаты, такие как амипрофос, амипрофос-метил и бутамифос, бензойноксилотные гербициды, такие как хлортал, хлортал- 14 036015 диметил, пиридины, такие как дитиопир и тиазопир, бензамиды, такие как пропизамид и тебутам;
соединения группы K2: хлорпрофам, профам и карбетамид, среди этих предпочтительны соединения группы K1, в частности, динитроанилины;
b10) из группы VLCFA ингибиторов:
хлорацетамиды, такие как ацетохлор, алахдлор, бутахлор, диметахлор, диметенамид, диметенамид-Р, метазахлор, метолахлор, метолахлор-S, петоксамид, претилахлор, пропахлор, пропизохлор и тенилхлор, оксиацетанилиды, такие как флуфенацет и мефенацет, ацетанилиды, такие как дифенамид, напроанилид и напропамид, тетразолиноны, такие как фентразамид, и другие гербициды, такие как анилофос, кафенстрол, феноксасульфон, ипфенкарбазон, пиперофос, пироксасульфон и изоксазолиновые соединения формул II.1-II.9
Изоксазолиновые соединения формулы (I)I известны к настоящему времени, например, из
WO 2006/024820, WO 2006/037945, WO 2007/071900 и WO 2007/096576;
среди VLCFA ингибиторов предпочтение отдается хлорацетамидам и оксиацетамидам;
b11) из группы ингибиторов биосинтеза целлюлозы:
хлортиамид, дихлобенил, флупоксам, индазифлам, триазифлам, изоксабен и 1-циклогексил-5пентафторфенилокси-14-[1,2,4,6] -тиатриазин-3-иламин;
b12) из группы разъединительных гербицидов:
диносеб, динотерб и DNOC и его соли;
b13) из группы гербицидов ауксина:
2,4-D и ее соли и сложные эфиры, такие как клацифос, 2,4-DB и ее соли и сложные эфиры, аминоциклопирахлор и его соли и сложные эфиры, аминопиралид и его соли, такие как аминопиралид-трис-(2гидроксипропил)аммоний и его сложные эфиры, беназолин, беназолин-этил, хлорамбен и его соли и сложные эфиры, кломепроп, клопиралид и его соли и сложные эфиры, дикамба и его соли и сложные эфиры, дихлорпроп и его соли и сложные эфиры, дихлорпроп-Р и его соли и сложные эфиры, флуроксипир, флуроксипир-бутометил, флуроксипир-мептил, галауксифен и его соли и сложные эфиры (CAS 943832-60-8); MCPA и его соли и сложные эфиры, MCPA-тиоэтил, МСРВ и его соли и сложные эфиры, мекопроп и его соли и сложные эфиры, мекопроп-Р и его соли и сложные эфиры, пиклорам и его соли и сложные эфиры, квинклорак, квинмерак, TBA (2,3,6) и его соли и сложные эфиры и триклопир и его соли и сложные эфиры;
b14) из группы ингибиторов транспорта ауксина: дифлуфензопир, дифлуфензопир-натрий, напталам и напталам-натрий;
b15) из группы других гербицидов: бромобутид, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, цинметилин, кумилурон, циклопириморат (CAS 499223-49-3) и его соли и сложные эфиры, далапон, дазомет, дифензокват, дифензокват-метилсульфат, диметипин, DSMA, димрон, эндотал и его соли, этобензанид, флампроп, флампроп-изопропил, флампроп-метил, флампроп-М-изопропил, флампроп-М-метил, флуренол, флуренол-бутил, флурпримидол, фосамин, фосамин-аммоний, инданофан, индазифлам, малеиновый гидразид, мефлуидид, метам, метиозолин (CAS 403640-27-7), метилазид, метилбромид, метил-димрон, метилйодид, MSMA, олеиновая кислота, оксацикломефон, пеларгоновая кислота, пирибутикарб, квинокламин, триазифлам и тридифан.
- 15 036015
Предпочтительными гербицидами В, которые могут применяться в смесях с ППО ингибирующими гербицидами согласно данному изобретению, являются:
b1) из группы ингибиторов биосинтеза липида:
клетодим, клодинафоп-пропаргил, циклоксидим, цигалофоп-бутил, диклофоп-метил, феноксапропР-этил, флуазифоп-Р-бутил, галоксифоп-Р-метил, метамифоп, пиноксаден, профоксидим, пропаквизафоп, квизалфоп-Р-этил, квизалфоп-Р-тефурил, сетоксидим, тепралоксидим, тралкоксидим,
4-(4'-хлор-4-циклоnроnил-2'-фтор[1,Γ-бuфенuл]-3-ил)-5-гuдроkсu-2,2,6,6-теΊраметил-2H-nиран3(6Н)-он (CAS 1312337-72-6);
4-(2',4'-дuхлор-4-цuклопропuл[1,1'-бuфенил]-3-uл)-5-гugроксu-2,2,6,6-теmрαмеmuл-2H-пuрαн-3(6H)он (CAS 1312337-45-3);
4-(4'-хлор-4-эτил-2'-фτор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5-гидрокси-2,2,6,6-τеτрамеτил-2H-πиран-3(6H)-он (CAS 1033757-93-5);
4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-2,2,6,6-тетраметил-2H-пиран-3,5(4Н,6H)-дион (CAS 1312340-84-3);
5-(ацетилокси)-4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-2H-пиран-3-он (CAS 1312337-48-6);
5-(ацетилокси)-4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил-[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил2H-пиран-3-он;
5-(αдетилоkсu)-4-(4'-хлор-4-эmuл-2'-фтор[1,1'-бuфенuл]-3-uл)-3,6-дuгиgро-2,2,6,6-тетрαметuл-2Hпиран-3-он (CAS 1312340-82-1);
5-(αдетилокси)-4-(2',4'-дихлор-4-эmил[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6-теmрαметил-2H-nирαн3-он (CAS 1033760-55-2);
метиловый эфир 4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-5-оксо-2H-пuран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1312337-51-1);
метиловый эфир 4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил5-оксо-2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты;
метиловый эфир 4-(4'-хлор-4-этил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-5оксо-2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1312340-83-2);
метиловый эфир 4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-5-оксо2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1033760-58-5);
бенфуресат, димепиперат, EPTC, эспрокарб, этофумесат, молинат, орбенкарб, просульфокарб, тиобенкарб и триаллат;
b2) из группы ALS ингибиторов:
амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон-метил, биспирибак-натрий, хлоримурон-этил, хлорсульфурон, клорансулам-метил, циклосульфамурон, диклосулам, этаметсульфурон-метил, этоксисульфурон, флазасульфурон, флорасулам, флукарбазон-натрий, флуцетосульфурон, флуметсулам, флупирсульфурон-метил-натрий, форамсульфурон, галосульфурон-метил, имазаметабенз-метил, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, имазосульфурон, йодосульфурон, йодосульфурон-метилнатрий, йофенсульфурон, йофенсульфурон-натрий, мезосульфурон, метазосульфурон, метосулам, метсульфурон-метил, никосульфурон, ортосульфамурон, оксасульфурон, пенокссулам, примисульфуронметил, пропоксикарбазон-натрий, пропирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон-этил, пирибензоксим, пиримисульфан, пирифталид, пириминобак-метил, пиритиобак-натрий, пирокссулам, римсульфурон, сульфометурон-метил, сульфосульфурон, тиенкарбазон-метил, тифенсульфурон-метил, триасульфурон, трибенурон-метил, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон-метил, тритосульфурон и триафамон;
b3) из группы ингибиторов фотосинтеза:
аметрин, амикарбазон, атразин, бентазон, бентазон-натрий, бромоксинил и его соли и сложные эфиры, хлоридазон, хлоротолурон, цианазин, десмедифам, дикват-дибромид, диурон, флуометурон, гексазинон, иоксинил и его соли и сложные эфиры, изопротурон, ленацил, линурон, метамитрон, метабензтиазурон, метрибуцин, паракват, паракват-дихлорид, фенмедифам, пропанил, пиридат, симазин, тербутрин, тербутилазин и тидиазурон;
b4) из группы протопорфириноген-IX оксидазы ингибиторов:
ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, азафенидин, бенкарбазон, бензфендизон, бутафенацил, карфентразоне-этил, цинидон-этил, флуфенпир-этил, флумиклорак-пентил, флумиоксазин, флуорогликофенэтил, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксадиазон, оксифлуорфен, пентоксазон, пирафлуфен-этил, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-( 1 -метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3 ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100);
№этил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 45209892-9);
- 16 036015
N-тетрагидрофурфурил-З -(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1 карбоксамид (CAS 915396-43-9);
№этил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS
452099-05-7);
№тетрагидрофурфурил-3 -(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1 карбоксамид (CAS 452100-03-7);
3-[7-фтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5-диметил-6-тиоксо[1,3,5] триазинан-2,4 -дион;
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4);
2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7тетрагидроизоиндол-1,3 -дион;
-метил-6-трифторметил-3 -(2,2,7 -трифтор-3 -оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо [ 1,4]оксазин6-ил)-Ш-пиримидин-2,4-дион и
3-[7-хлор-5-фтор-2-(трифторметил)-Ш-бензимидазол-4-ил]-1-метил-6-(трифторметил)-Шпиримидин-2,4-дион (CAS 212754-02-4);
b5) из группы отбеливающих гербицидов:
аклонифен, бенфлубутамид, бензобициклон, кломазон, дифлуфеникан, флуорохлоридон, флуртамон, изоксафлутол, мезотрион, норфлуразон, пиколинафен, пирасульфотол, пиразолинат, сулкотрион, тефурилтрион, темботрион, топрамезон, бициклопирон, 4-(3-трифторметилфенокси)-2-(4трифторметилфенил)пиримидин (CAS 180608-33-7), амитрон и флуметурон;
b6) из группы EPSP синтазы ингибиторов:
глифосат, глифосат-изопропиламмоний, глифосат-калий и глифосат-тримезий (сульфосат);
b7) из группы глутамин синтазы ингибиторов: глуфосинат, глуфосинат-Р, глуфосинат-аммоний;
b8) из группы DHP синтазы ингибиторов: асулам;
b9) из группы ингибиторов митоза:
бенфлуралин, дитиопир, этафлуралин, оризалин, пендиметалин, тиазопир и трифлуралин;
b10) из группы VLCFA ингибиторов:
ацетохлор, алахлор, анилофос, бутахлор, кафенстрол, диметенамид, диметенамид-Р, фентразамид, флуфенацет, мефенацет, метазахлор, метолахлор, S-метолахлор, напроанилид, напропамид, претилахлор, феноксасульфон, ипфенкарбазон, пироксасульфон, тенихлор и изоксазолиновые соединения формул II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 и II.9, как упомянуто выше;
b11) из группы ингибиторов биосинтеза целлюлозы:
дихлобенил, флупоксам, изоксабен и 1-циклогексил-5-пентафторфенилокси-14-[1,2,4,6]тиатриазин3-иламин;
b13) из группы гербицидов ауксина:
2,4-D и его соли и сложные эфиры, аминоциклопирахлор и его соли и сложные эфиры, аминопиралид и его соли, такие как аминопиралид-трис-(2-гидроксипропил)аммоний и его сложные эфиры, клопиралид и его соли и сложные эфиры, дикамба и его соли и сложные эфиры, дихлорпроп-Р и его соли и сложные эфиры, флуроксипир-мептил, галауксифен и его соли и сложные эфиры (CAS 943832-60-8), MCPA и его соли и сложные эфиры, МСРВ и его соли и сложные эфиры, мекопроп-Р и его соли и сложные эфиры, пиклорам и его соли и сложные эфиры, квинклорак, квинмерак и триклопир и его соли и сложные эфиры;
b14) из группы ингибиторов транспорта ауксинов:
дифлуфензопир и дифлуфензопир-натрий;
b15) из группы других гербицидов:
бромобутид, цинметилин, кумилурон, циклопириморат (CAS 499223-49-3) и его соли и сложные эфиры, далапон, дифензокват, дифензокват-метилсульфат, DSMA, димрон (= даймурон), флампроп, флампроп-изопропил, флампроп-метил, флампроп-М-изопропил, флампроп-М-метил, инданофан, индазифлам, метам, метилбромид, MSMA, оксацикломефон, пирибутикарб, триазифлам и тридифан.
Более предпочтительные гербицидами В, которые могут применяться в смесях с ППО ингибирующими гербицидами согласно данному изобретению, являются:
b1) из группы ингибиторов биосинтеза липида:
клодинафоп-пропаргил, циклоксидим, цигалофоп-бутил, феноксапроп-Р-этил, пиноксаден, профоксидим, тепралоксидим, тралкоксидим,
4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3 -ил)-5-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-2H-пиран3(6Н)-он (CAS 1312337-72-6);
4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил[1,1'-бифенил]-3-ил)-5-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-2H-пиран-3(6H)он (CAS 1312337-45-3);
4-(4'-хлор-4-этил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-2H-пuран-3(6H)-он (CAS 1033757-93-5);
- 17 036015
4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-2,2,6,6-тетраметил-2Н-пиран-3,5(4Н,6Н)-дион (CAS
1312340-84-3);
5-(ацетилокси)-4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-2Н-пиран-3-он (CAS 1312337-48-6);
5-(ацетилокси)-4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил-[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил2Н-пиран-3-он;
5-(ацетилокси)-4-(4'-хлор-4-этил-2'-фтор[1,Г-бифенил]-3-ил)-3,6-дагидро-2,2,6,6-тетраметил-2Нпиран-3-он (CAS 1312340-82-1);
5-(ацетилокси)-4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-3,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-2H-пиран3-он (CAS 1033760-55-2);
метиловый эфир 4-(4'-хлор-4-циклопропил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6тетраметил-5-оксо-2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1312337-51-1);
метиловый эфир 4-(2',4'-дихлор-4-циклопропил[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил5-оксо-2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты;
метиловый эфир 4-(4'-хлор-4-этил-2'-фтор[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-5оксо-2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1312340-83-2);
метиловый эфир 4-(2',4'-дихлор-4-этил[1,1'-бифенил]-3-ил)-5,6-дигидро-2,2,6,6-тетраметил-5-оксо2H-пиран-3-илкарбоновой кислоты (CAS 1033760-58-5), эспрокарб, просульфокарб, тиобенкарб и триаллат;
b2) из группы ALS ингибиторов:
бенсульфурон-метил, биспирибак-натрий, циклосульфамурон, диклосулам, флуметсулам, флупирсульфурон-метил-натрий, форамсульфурон, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, имазосульфурон, йодосульфурон, йодосульфурон-метил-натрий, иофенсульфурон, иофенсульфуроннатрий, мезосульфурон, метазосульфурон, никосульфурон, пенокссулам, пропоксикарбазон-натрий, прописульфурон, пиразосульфурон-этил, пирокссулам, римсульфурон, сульфосульфурон, тиенкарбазонметил, тритосульфурон триафамон;
b3) из группы ингибиторов фотосинтеза:
аметрин, атразин, диурон, флуометурон, гексазинон, изопротурон, линурон, метрибуцин, паракват, паракват-дихлорид, пропанил, тербутрин и тербутилазин;
b4) из группы протопорфириноген-IX оксидазы ингибиторов:
ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-( 1 -метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3 ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
3-[7-фтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5-диметил-6тиоксо [ 1,3,5]-триазинан-2,4-дион,
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-mрифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4),
2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксαзин-6-ил)-4,5,6,7тетрагидроизоиндол-1,3-дион и
-метил-6-трифторметил-3 -(2,2,7-трифтор-3 -оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо [ 1,4]оксазин6 -ил) -1H -пиримидин-2,4-дион;
b5) из группы отбеливающих гербицидов:
кломазон, дифлуфеникан, флурохлоридон, изоксафлутол, мезотрион, пиколтнафен, сулкотрион, тефурилтрион, темботрион, топрамезон, бициклопирон, амитрол и флуметурон;
b6) из группы EPSP синтазы ингибиторов:
глифосат, глифосат-изопропиламмоний и глифосат-тримезий (сульфосат);
b7) из группы глутамин синтазы ингибиторов:
глуфосинат, глуфосинат-Р и глуфосинат-аммоний;
b9) из группы ингибиторов митоза: пендиметалин и трифлуралин;
b10) из группы VLCFA ингибиторов:
ацетохлор, кафенстрол, диметенамид-Р, фентразамид, флуфенацет, мефенацет, метазахлор, метолахлор, S-метолахлор, феноксасульфон, ипфенкарбазон и пироксасульфон; таким же образом, предпочтение отдается изоксазолиновым соединениям формул II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 и II.9, упомянутым выше;
b11) из группы ингибиторов биосинтеза целлюлозы: изоксабен;
b13) из группы гербицидов ауксина:
2,4-D и его соли и сложные эфиры, такие как клацифос, и аминоциклопирахлор и его соли и сложные эфиры, аминопиралид и его соли и сложные эфиры, клопиралид и его соли и сложные эфиры, дикамба и его соли и сложные эфиры, флуроксипир-мептил, квинклорак и квинмерак;
- 18 036015 b14) из группы ингибиторов транспорта ауксина:
дифлуфензопир и дифлуфензопир-натрий, Ь15) из группы других гербицидов: димрон (= даймурон), инданофан, индазифлам, оксазикломефон и триазифлам.
Кроме того, может оказаться полезным, когда ППО ингибирующие гербициды применяют в смеси с соединением В, описанным выше, также добавление в смесь защитных веществ. Защитные вещества являются химическими соединениями, которые предотвращают или уменьшают повреждение полезных растений, не оказывая большого влияния на гербицидное действие гербицидов в отношении нежелательных растений. Их можно применять или до посева (т.е. для обработки семян, ростков или рассады), или при предвсходовом применении или послевсходовом применении на полезных растениях.
Кроме того, защитные вещества C, ППО ингибирующие гербициды и/или гербициды В могут применяться одновременно или последовательно.
К подходящим защитным веществам относятся, например:
(хинолин-8-окси)уксусные кислоты,
1-фенил-5-галоидалкил-1И-1,2,4-триазол-3-карбоновые кислоты,
-фенил-4,5 -дигидро-5 -алкил-1 И-пиразол-3,5 -дикарбоновые кислоты,
4,5 -дигидро-5,5 -диарил-3 -изоксазолкарбоновые кислоты, дихлорацетамиды, альфа-оксиминофенилацетонитрилы, ацетофеноноксимы,
4,6-дигалоид-2-фенилпиримидины,
Х-[[4-(аминокарбонил)фенил]сульфонил]-2-бензойные амиды,
1,8-нафталевый ангидрид, 2-галоид-4-(галоидалкил)-5-тиазолкарбоновые кислоты, фосфортиолаты и N-алкил-О-фенилкарбаматы и их сельскохозяйственно приемлемые соли и их сельскохозяйственно приемлемые производные, такие как амиды, сложные эфиры и сложные тиоэфиры при условии, что они содержат кислотную группу.
Примерами предпочтительных защитных веществ С являются беноксакор, клоквинтоцет, циометринил, ципросульфамид, дихлормид, дициклонон, диэтолат, фенхлоразол, фенклорим, флуразол, флуксофеним, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, мефенат, нафталевый ангидрид, оксабетринил, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспиро[4.5]декан (MON4660, CAS 71526-07-3) и 2,2,5-триметил-3(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (R-29148, CAS 52836-31-4).
Более предпочтительными защитными веществами С являются беноксакор, клоквинтоцет, ципросульфамид, дихлормид, фенхлоразол, фенклорим, флуразол, флуксофеним, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, нафталевый ангидрид, оксабетринил, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспиро[4.5]декан (MON4660, CAS 71526-07-3) и 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (R-29148, CAS 52836-31-4).
Еще более предпочтительными защитными веществами C являются беноксакор, клоквинтоцет, ципросульфамид, дихлормид, фенхлоразол, фенклорим, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, нафталевый ангидрид, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспиро[4.5]декан (MON4660, CAS 71526-07-3) и 2,2,5-триметил3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (R-29148, CAS 52836-31-4).
Также предпочтительными защитными веществами C являются беноксакор, клоквинтоцет, ципросульфамид, дихлормид, фенхлоразол, фенклорим, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, 4-(дихлорацетил)1-окса-4-азаспиро[4.5]декан (MON4660, CAS 71526-07-3) и 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3оксазолидин (R-29148, CAS 52836-31-4).
Особенно предпочтительными защитными веществами C, которые в качестве компонента C являются составной частью смеси согласно данному изобретению, являются защитные вещества C, которые определены выше; в частности защитные вещества C.1 - C.12 перечисленные в табл. C.
Таблица C
Защитное вещество С
С.1 беноксакор
С.2 клоквинтоцет
С.З ципросульфамид
С.4 дихлормид
С.5 фенхлоразол
С.6 фенклорим
С.7 фурилаз ол
С.8 изоксади фе н
С.9 м е фе н п и р
С. 10 ангидрид нафталевой кислоты
С.11 4-(д ихлорацетил )-1-о к с а -4-а з а с п и р о [4.5]д е к а н (MON4660, CAS 71526-07-3)
С.12 2,2,5-т р и м е т и л -3-(д и х л о р а ц е т и л )-1,3- оксазолидин (R-29148, CAS 52836-31-4)
- 19 036015
ППО ингибирующие гербициды и активные соединения B групп b1)-b15) и активные соединения C являются известными гербицидами и защитными веществами, см., например, The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/); Farm Chemicals Handbook, 2000, volume 86, Meister Publishing Company, 2000; B. Hock, C. Fedtke, R.R. Schmidt, Herbizide, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995; W.H. Ahrens, Herbizide Handbook, 7th edition, Weed Science Society of America, 1994; и K.K. Hatzios, Herbizide Handbook, Supplement for the 7th edition, Weed Science Society of America, 1998. 2,2,5-Триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин [CAS No. 52836-31-4] также именуется как R-29148. 4-(Дихлорацетил)-1-окса-4-азаспиро[4.5]декан [CAS No. 71526-07-3] также именуется как AD-67 и MON 4660.
Отнесение активных соединений к соответствующим механизмам действия основано на современном уровне знаний. Если несколько механизмов действия связаны с одним активным соединением, то соединение относят только к одному механизму действия.
Активные соединения B и C, имеющие карбоксильную группу, могут применяться в виде кислоты, в виде подходящей сельскохозяйственной соли, упомянутой выше, или также в виде подходящего для сельского хозяйства производного в смесях согласно данному изобретению.
В случае дикамба, подходящие соли включают такие, у которых противоион представляет собой сельскохозяйственно приемлемый катион. Например, подходящими солями дикамба являются дикамбанатрий, дикамба-калий, дикамба-метиламмоний, дикамба-диметиламмоний, дикамбаизопропиламмоний, дикамба-дигликольамин, дикамба-оламин, дикамба-диоламин, дикамба-троламин, дикамба-Ы,№бис-(3-аминопропил)метиламин и дикамба-диэтилентриамин.
Примерами подходящих сложных эфиров являются дикамба-метил и дикамба-бутотил.
Подходящие соли 2,4-D являются 2,4-О-аммоний, 2,4-О-диметиламмоний, 2,4-О-диэтиламмоний, 2,4-О-диэтаноламмоний (2,4-О-диоламин), 2,4-О-триэтаноламмоний, 2,4-О-изопропиламмоний, 2,4-О-триизопропаноламмоний, 2,4-О-гептиламмоний, 2,4-О-додециламмоний, 2,4-О-тетрадециламмоний, 2,4-О-триэтиламмоний, 2,4-О-трис-(2-гидроксипропил)аммоний, 2,4-О-трис-(изопропил)аммоний, 2,4-О-троламин, 2,4-О-литий, 2,4-О-натрий.
К примерам подходящих сложных эфиров 2,4-D относятся 2,4-О-бутотил, 2,4-О-2-бутоксипропил, 2,4-О-3-бутоксипропил, 2,4-О-бутил, 2,4-О-этил, 2,4-О-этилгексил, 2,4-О-изобутил, 2,4-О-изооктил, 2,4-О-изопропил, 2,4-О-мептил, 2,4-О-метил, 2,4ГО-октил, 2,4ГО-пентил, 2,4ГО-пропил, 2,4-О-тефурил и клацифос.
Подходящими солями 2,4-DB являются, например, 2,4-DB-натрий, 2,4-DB-калий и 2,4-DBдиметиламмоний. Подходящими сложными эфирами 2,4-DB являются, например, 2,4-ОВ-бутил и 2,4-ЭВ-изоктил.
Подходящими солями дихлорпропа являются, например, дихлорпроп-натрий, дихлорпроп-калий и дихлорпроп-диметиламмоний. Примерами подходящих сложных эфиров дихлорпропа являются дихлорпроп-бутотил и дихлорпроп-изоктил.
Подходящие соли и сложные эфиры MCPA включают MCPA-бутотил, MCPA-бутил, MCPA-диметиламмоний, MCPA-диоламин, MCPA-этил, MCPA-тиоэтил, MCPA-2-этилгексил, MCPA-изобутил, MCPA-изоктил, MCPA-изопропил, MCPA-изопропиламмоний, MCPA-метил, MCPA-оламин, MCPA-калий, MCPA-натрий и MCPA-троламин.
Подходящей солью МСРВ является МСРВ натрий. Подходящим сложным эфиром МСРВ является МСРВ-этил.
Подходящими солями клопиралида являются клопиралид-калий, клопиралид-оламин и клопиралидтрис-(2-гидроксипропил)аммоний. Примером подходящего сложного эфира клопиралида является клопиралид-метил.
Примерами подходящих сложных эфиров флуроксипира являются флуроксипир-мептил и флуроксипир-2-бутокси-1-метилэтил, причем, флуроксипир-мептил более предпочтителен.
Подходящими солями пиклорама являются пиклорам-диметиламмоний, пиклорам-калий, пиклорам-триизопропаноламмоний, пиклорам-триизопропиламмоний и пиклорам-троламин. Подходящим сложным эфиром пиклорама является пиклорам-изоктил.
Подходящей солью триклопира является триклопир-триэтиламмоний. Подходящими сложными эфирами триклопира являются, например, триклопир-этил и триклопир-бутотил.
Подходящие соли и сложные эфиры хлорамбена включают хлорамбен-аммоний, хлорамбендиоламин, хлорамбен-метил, хлорамбен-метиламмоний и хлорамбен-натрий.
Подходящие соли и сложные эфиры 2,3,6-TBA включают 2,3,6-TBA-диметиламмоний, 2,3,6-TBAлитий, 2,3,6-TBA-калий и 2,3,6-TBA-натрий.
Подходящие соли и сложные эфиры аминопиралида включают аминопиралид-калий и аминопиралид-трис-(2-гидроксипропил)аммоний.
Подходящими солями глифосата являются, например, глифосат-аммоний, глифосат-диаммоний, глифосат-диметиламмоний, глифосат-изопропиламмоний, глифосат-калий, глифосат-натрий, глифосаттримезий, а также этаноламиновые и диэтаноламиновые соли, более предпочтительны глифосатдиаммоний, глифосат-изопропиламмоний и глифосат-тримезий (сульфосат).
- 20 036015
Подходящей солью глуфосината является, например, глуфосинат-аммоний.
Подходящей солью глуфосината-Р является, например, глуфосинат-Р-аммоний.
Подходящими солями и сложными эфирами бромоксинила являются, например, бромоксинилбутират, бромоксинил-гептаноат, бромоксинил-октаноат, бромоксинил-калий и бромоксинил-натрий.
Подходящими солями и сложными эфирами иоксинила являются, например, иоксинил-октаноат, иоксинил-калий и иоксинил-натрий.
Подходящие соли и сложные эфиры мекопропа включают мекопроп-бутотил, мекопропдиметиламмоний, мекопроп-диоламин, мекопроп-этадил, мекопроп-2-этилгексил, мекопроп-изоктил, мекопроп-метил, мекопроп-калий, мекопроп-натрий и мекопроп-троламин.
Подходящими солями мекопропа-Р являются, например, мекопроп-Р-бутотил, мекопроп-Рдиметиламмоний, мекопроп-Р-2-этилгексил, мекопроп-Р-изобутил, мекопроп-Р-калий и мекопроп-Рнатрий.
Подходящей солью дифлуфензопира является, например, дифлуфензопир-натрий.
Подходящей солью напталама является, например, напталам-натрий.
Подходящими солями и сложными эфирами аминоциклопирахлора являются, например, аминоциклопирахлор-диметиламмоний, аминоциклопирахлор-метил, аминоциклопирахлор-триизопропаноламмоний, аминоциклопирахлор-натрий и аминоциклопирахлор-калий.
Подходящей солью квинклорака является, например, квинклорак-диметиламмоний.
Подходящей солью квинмерака является, например, квинмерак-диметиламмоний.
Подходящей солью имазамокса является, например, имазамокс-аммоний.
Подходящими солями имазапика являются, например, имазапик-аммоний и имазапикизопропиламмоний.
Подходящими солями имазапира являются, например, имазапир-аммоний и имазапиризопропиламмоний.
Подходящей солью имазаквина является, например, имазаквин-аммоний.
Подходящими солями имазетапира являются, например, имазетапир-аммоний и имазетапиризопропиламмоний.
Подходящей солью топрамезона является, например, топрамезон-натрий.
Под предпочтительными вариантами данного изобретения, упомянутыми здесь ниже, следует понимать как предпочтительные или независимо один от другого или в смеси одного с другим.
Согласно предпочтительному варианту данного изобретения смесь включает в качестве компонента В как минимум один, более предпочтительно точно один гербицид В.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает как минимум два, более предпочтительно точно два гербицида В, отличных один от другого.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает как минимум три, более предпочтительно точно три гербицида В, отличных один от другого.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает в качестве компонента A как минимум один, более предпочтительно точно один ППО ингибирующий A, более предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразон-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100; 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигuдро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), особенно предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигuдро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), и в качестве компонента B как минимум один, предпочтительно точно один гербицид B.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает в качестве компонента A как минимум один, более предпочтительно точно один ППО ингибирующий A, более предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигuдро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительны сафлуфенацил, 1,5-диметил-6-тиоксо-3(2,2,7-mрифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b]-[1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4дион (CAS 1258836-72-4) и как минимум два, более предпочтительно точно два гербицида В, отличные один от другого.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает в качестве компонета A как минимум один, более предпочтительно точно один ППО ингибирующий A, более предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил,
- 21 036015 сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-диметил-6-тиоксо-3(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4) и как минимум три, предпочтительно точно три гербицида В, отличающихся один от другого.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидонэтил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5диметил-6-тиоксо-3 -(2,2,7-Ίрифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6-ил)1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и более предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b1), в частности, выбираемое из группы, которая включает клетодим, клодинафоп-пропаргил, циклоксидим, цигалофоп-бутил, феноксапроп-Р-этил, флуазифоп, пинокаден, профоксидим, квизалофоп, сетоксидим, тепралоксидим, тралкоксидим, эспрокарб, просульфокарб, тиобенкарб и триаллат.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидонэтил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5диметил-6-тиоксо-3 -(2,2,7-Ίрифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6-ил)1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b2), в частности, выбираемое из группы, которая включает бенсульфурон-метил, биспирибак-натрий, клорансулам-метил, циклосульфамурон, диклосулам, флуметсулам, флупирсульфурон-метил-натрий, форамсульфурон, галосульфурон-метил, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, имазосульфурон, йодосульфурон, йодосульфурон-метил-натрий, мезосульфуронметил, метазосульфурон, никосульфурон, пенокссулам, пропоксикарбазон-натрий, пиразосульфуронэтил, пиритиобак-натрий, пирокссулам, римсульфурон, сульфосульфурон, тиенкарбазон-метил, тифенсульфурон-метил, трифлоксисульфурон и тритосульфурон.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидонэтил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5диметил-6-тиоксо-3 -(2,2,7-Ίрифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6-ил)1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно автивное соединение из группы b3), в частности, выбираемое из группы, которая включает аметрин, атразин, бентазон, бромоксинил, диурон, флуометурон, гексазинон, изопротурон, линурон, метрибузин, паракват, паракват-дихлорид, прометрин, пропанил, тербутрин и тербутилазин.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидонэтил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5диметил-6-тиоксо-3 -(2,2,7-Ίрифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6-ил)1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b4), в частности, выбираемое из группы, которая включает ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, азафенидин, бенкарбазон, бензфендизон, бифенокс, бутафенацил, карфентразон, карфентразон-этил, хлометоксифен, цинидон-этил, флуазолат, флуфенпир, флуфенпир-этил, флумиклорак, флумиклорак-пентил, флумиоксазин, флуорогликофен, флуорогликофен-этил, флутиацет, флутиацет-метил, фомесафен, галосафен, лактофен, оксадиаргил, оксадиазон, оксифлуорфен, пентоксазон,
- 22 036015 профлуазол, пираклонил, пирафлуфен, пирафлуфен-этил, сафлуфенацил, сульфентразон, тидиазимин, тиафенацил, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), №этил-3-(2,6-дихлор-4трифтор-метилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 452098-92-9), N-тетрагидрофурфурил3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 915396-43-9), N-этил3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 452099-05-7), №тетрагидрофурфурил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 452100-03-7), 3-[7-фтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5диметил-6-тиоксо[1,3,5]триазинан-2,4-дион, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CaS 1258836-72-4), 2-(2,2,7трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7-тетрагидроизоиндол-1,3дион, 1 -метил-6-трифторметил-3 -(2,2,7-трифтор-3 -оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2H-бензо [1,4]оксазин-6-ил)-Ш-пиримидин-2,4-дион, метил (E)-4-[2-хлор-5-[4-хлор-5-(дифторметокси)-1H-метилпиразол-3-ил]-4-фтор-фенокси]-3-метокси-бут-2-еноат [CAS 948893-00-3], 3-[7-хлор-5-фтор-2(трифторметил)-Ш-бензимидазол-4-ил]-1-метил-6-(трифторметил)-Ш-пиримидин-2,4-дион (CAS 212754-02-4).
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилоки]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b5), в частности, выбираемое из группы, которая включает кломазон, дифлуфеникан, флуорохлоридон, изоксафлутол, мезотрион, пиколинафен, сулкотрион, тефурилтрион, темботрион, топрамезон, бициклопирон, амитрол и флуметурон.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b6), в частности, выбираемое из группы, которая включает глифосат, глифосат-изопропиламмоний и глифосат-тримезий (сульфосат).
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b7), в частности, выбираемое из группы, которая включает глуфосинат, глуфосинат-Р и глуфосинат-аммоний.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b9), в частности, выбираемое из группы, которая включает пендиматалин и трифлуралин.
- 23 036015
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b]-[1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b10), в частности, выбираемое из группы, которая включает ацетохлор, кафенстрол, диметенамид-Р, фентразамид, флуфенацет, мефенацет, метазахлор, метолахлор, S-метолахлор, феноксасульфон и пироксасульфон. Подобным образом, предпочтение отдается смесям, которые включают, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100), 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-mрифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2Hбензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b10), в частности, выбираемое из группы, которая включает изоксазолиновые соединения формул II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 и II.9, как описано выше.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[Ь][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b13), в частности, выбираемое из группы, которая включает 2,4-D и его соли и сложные эфиры, аминоциклопирахлор и его соли и сложные эфиры, аминопиралид и его соли, такие как аминопиралид-трис-(2-гидроксипропил)аммоний, и его сложные эфиры, клопиралид и его соли и сложные эфиры, дикамба и его соли и сложные эфиры, флуроксипир-мептил, квинклорак и квинмерак.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[Ь][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соеднение из группы Ь14), в частности, выбираемое группы, которая включает дифлуфензопир и дифлуфензопир-натрий.
Согласно другому предпочтительному варианту изобретения смесь включает, в дополнение к ППО ингибирующему A, предпочтительно ацифлуорфен, ацифлуорфен-натрий, бутафенацил, цинидон-этил, карфентразоне-этил, флумиоксазин, флутиацет-метил, фомесафен, лактофен, оксадиаргил, оксифлуорфен, сафлуфенацил, сульфентразон, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100),
1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[Ь][1,4]оксазин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), более предпочтительно сафлуфенацил, 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4), как минимум одно и предпочтительно точно одно гербицидно активное соединение из группы b15), в частности, выбираемое из группы, которая включает димрон (= даймурон), инданофан, индазифлам, оксацикломефон и триазифлам.
Здесь и ниже термин бинарная смесь включает смеси, которые содержат одно или более, например 1, 2 или 3, активных соединений из ППО ингибирующих А и любой один или более, например 1, 2 или 3, гербицидов B.
- 24 036015
В бинарных смесях, содержащих как минимум один ППО ингибирующий A в качестве компонента
A и как минимум один гербицид B, весовое отношение активных соединений A:B находится, как правило, в интервале от 1:1000 до 1000:1, предпочтительно в интервале от 1:500 до 500:1, более предпочтительно в интервале от 1:250 до 250:1 и еще более предпочтительно в интервале от 1:75 до 75:1.
Особенно предпочтительными гербицидами B являются гербициды B, как определено выше, в частности гербициды B.1 - B.229 приведенные в табл. B.
Таблица В
Гербицид В Гербицид В
В.1 Клетодим В.26 Циклосульфамурон
В.2 Кло динафо п-про парги л В.27 Диклосулам
В.З Циклоксидим В.28 Флорасулам
В.4 Цигалофоп-бутил В.29 Флуметсулам
В.5 Феноксапроп-этил В.ЗО Флупирсульфурон-метил-натрий
В.6 Феноксапроп-Р-этил В.31 Форамсульфурон
В.7 Флуазифоп В.32 Г алосульфурон-метил
В.8 Метамифоп В.ЗЗ Имазамокс
В.9 Пиноксаден В.34 Имазамокс-аммоний
В.10 Пофоксидим В.35 Имазапик
В.11 Квизалофоп В.36 Имазапик-аммоний
В.12 Сетоксидим В.37 Имазапик-изопропиламмоний
В.13 Т епралоксидим В.38 Имазапир
В.14 Тралкоксидим В.39 Имазапир-аммоний
В.15 Эспрокарб В.40 Имазапир-изопропиламмоний
В.16 Этофумесат В.41 Имазаквин
В.17 Молинат В.42 Имазаквин-аммоний
В.18 Просу льфокарб В.43 Имазетапир
В.19 Тиобенкарб В.44 Имазетапир-аммоний
В.20 Триаллат В.45 Имазетапир-изопропиламмоний
В.21 Бенсу льфурон-метил В.46 Имазосульфурон
В.22 Биспирибак-натрий В.47 Иодосульфурон-метил-натрий
В.23 Клорансу лам-метил В.48 Иофенсульфурон
В.24 Хлорсульфурон В.49 Иофенсу льфурон-натрий
В.25 Клоримурон В.50 Мезосульфурон-метил
- 25 036015
B.51 Метазосульфурон
B.52 Метсульфурон-метил
B.53 Метосулам
B.54 Никосульфурон
B.55 Пенокссулам
B.56 Пропоксикарбазон-натрий
B.57 Пиразосульфурон-этил
B.58 Пиршбензоксим
B.59 Пирифталид
B.60 Пиритиобак-натрий
B.61 Пирокссулам
B.62 Пропирисульфурон
B.63 Римсульфурон
B.64 Сульфосульфурон
B.65 Т иенкарбазон-метил
B.66 Т иенсульфурон-метил
B.67 Трибенурон-метил
B.68 Трифлоксисульфурон
B.69 Тритосу льфурон
B.70 Триафамон
B.71 Аметрин
B.72 Атразин
B.73 Бентазон
B.74 Бромоксинил
B.75 Бромоксинил-октаноат
B.76 Бромоксинил-гептаноат
B.77 Бромоксинил-калий
B.78 Диурон
B.79 Флуометурон
B.80 Г ексазинон
B.81 Изопротурон
B.82 Линурон
B.83 Метамитрон
B.84 Метрибузин
B.85 Прометрин
B.86 Пропанил
B.87 Симазин
B.88 Тербутилазин
B.89 Тербутрин
B.90 Паракват-дихлорид
B.91 Ацифлуорфен
B.92 Ацифлуорфен-натрий
B.93 Азафенидин
B.94 Бенкарбазон
B.95 Бензфендизон
B.96 Бифенокс
B.97 Бутафенацил
В.98 Карфентразон
В.99 Карфентразон-этил
В.100 Хлометоксифен
В.101 Цинидон-этил
В.102 Флуазолат
В.103 Флуфенпир
В.104 Флуфенпир-этил
В.105 Флумиклорак
В.106 Флумиклорак-пентил!
В.107 Флумиоксазин
В.108 Флуорогликофен
В.109 Флуорогликофен-этил
В.110 Флутиацет
В.111 флутиацет-метил
В.112 Фомесафен
В.113 Галосафен
В.114 Лактофен
В.115 Оксадиаргил
В.116 Оксадиазон
В.117 Оксифлуорфен
В.118 Пентоксазон
В.119 Профлуазол
В.120 Пираклонил
В.121 Пирафлуфен
В.122 Пирафлу фен-этил
В.123 Сафлу фенацил
В.124 Ссульфентразон
В.125 Тидиазимин
В.126 Тиафенацил
В.127 Этил [3 -[2-хлор-4-фтор-5-( 1 -метил6 -трифторметил-2, 4 -диоксо -1,2,3,4 тетрагидропиримидин-3 ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6)
В.128 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7трифтор-3 -оксо-4-(проп-2-инил)3,4-дигидро-2Н-бензо [Ь] [1,4]оксазин-6 -и л) -1,3,5 -триазинан-2,4 дион (CAS 1258836-72-4)
В.129 N-этил-З-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5 -метил- 1Нпиразол-1-карбоксамид (С AS 452098-92-9)
В.130 N-тетрагидрофурфурил-З -(2,6дихлор-4-трифторметилфенокси) -5 метил-1 //-п иразо л-1 -карбоксамид (CAS 915396-43-9)
В.131 N-этил-З -(2 -хлор-6 -фтор-4 трифторметилфенокси) -5 -метил1Я-пиразол-1-карбоксамид (СAS 452099-05-7)
- 26 036015
В. 132 Ы-тетрагидрофурфурил-3-(2-хлор-6фтор-4-трифторметилфенокси) -5 метил-1 //-п иразо л-1 -карбоксамид (CAS 452100-03-7)
В. 133 3 -[7-фтор-3 -оксо -4 -(προπ-2-инил) - 3,4-дигидро-2Н-бензо [ 1,4] оксазин- 6 -ил] -1,5 -диметил-6 -тиоксо - [1,3,5] триазинан-2,4 -дио и
В. 134 2-(2,2,7-Трифтор-3-оксо-4-проп-2инил-3,4-дигидро-2Н- бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7тетрагидро-изо индол-1,3 -дион
В. 135 1 -Метил-6-трифторметил-З -(2,2,7 трифтор -3 -оксо -4 -проп-2 -инил-3,4 дигидро-2Н-бензо [ 1,4] оксазин-6ил)-1Н-пиримидин-2,4-дион
В. 136 метил (Е)-4-[2-хлор-5-[4-хлор-5(дифторметокси) -1 //-мсти лпиразол-3 -ил] -4-фтор-фенокси] -3 метоксибут-2-еноат [CAS 94889300-3]
В. 137 3 -[7-хлор-5 -фтор-2-(трифторметил) 1Н-бензимидазол-4-ил] -1 -метил-6(трифтормети л) -1Н -пиримидин-2,4 дион (CAS 212754-02-4)
В. 138 Бензобициклон
В. 139 Кломазон
В.140 Дифлуфеникан
В.141 Флуорохлоридон
В. 142 Изоксафлутол
В.143 Мезо трион
В. 144 Норфлуразон
В.145 Пиколинафен
В.146 Сулкотрион
В.147 Тефурилтрион
В.148 Темботрион
В.149 Топрамезон
В. 150 Т опрамезон-натрий
В.151 Бициклопирон
В. 152 Амитрол
В. 153 Флуометурон
В. 154 Глифосат
В. 155 Г лифосат-аммоний
В. 156 Г лифосат-диметиламмо ний
В. 157 Г лифосат-изопропиламмоний
В. 158 Глифосат-тримезий (сульфосат)
В. 159 Г лифосат-калий
В. 160 Глуфосинат
В.161 Г луфосинат-аммоний
В. 162 Глуфосинат-Р
В. 163 Г луфосинат-Р-аммоний
В.209 Квинмерак
В.210 Квинмерак-диметиламмоний
В.211 Аминоциклопирахлор
В.212 Аминоциклопирахлор-калий
В.213 Аминоциклопирахлор-метил
В.214 Дифлуфензопир
В.215 Дифлуфензопир-натрий
В.216 Димрон
В.217 Инданофан
В.218 Индазифлам
В.219 Оксацикломефон
В.164 Пендиметалин
В.165 Трифлуралин
В.166 Ацетохлор
В.167 Бутахлор
В.168 Кафенстрол
В.169 Диметенамид-Р
В.170 Фентразамид
В.171 Флу фенацет
В.172 Мефенацет
В.173 Метазахлор
В.174 Метолахлор
В.175 S-метолахлор
В.176 Претилахлор
В.177 Феноксасульфон
В.178 Изоксабен
В.179 Ипфенкарбазон
В.180 Пироксасульфон
В.181 2,4-D
В.182 2,4-О-изобутил
В.183 2,4-О-диметиламмоний
В.184 2,4-D-N,N,N- триметилэтаноламмоний
В.185 Аминопиралид
В.186 Аминопиралид-метил
В.187 Аминопиралид-трис(2гидроксипропил)аммоний
В.188 Клопиралид
В.189 Клопиралид-метил
В.190 Клопиралид-о ламин
В.191 Дикамба
В.192 Дикамба-бутотил
В.193 Дикамба-дигликольамин
В.194 Дикамба-диметиламмоний
В.195 Дикамба-диоламин
В.196 Дикамба-изопропиламмоний
В.197 Дикамба-калий
В.198 Дикамба-натрий
В.199 Дикамба-тро ламин
В.200 Дикамба-Ν,Ν -бис-(3 аминопропил)метиламин
В.201 Дикамба-диэтилентриамин
В.202 Флуроксипир
В.203 Флуроксипир-мептил
В.204 МСРА
В.205 МСР А-2-этилгексил
В.206 МСРА-диметиламмоний
В.207 Квинклорак
В.208 Квинклорак-диметиламмоний
В.220 Триазифлам
В.221 II. 1
В.222 II.2
В.223 П.З
В.224 II.4
В.225 II.5
В.226 II.6
В.227 II.7
В.228 II.8
В.229 II.9
- 27 036015
Более предпочтительны смеси 1.1 - 1.229, включающие ацифлуорфен и вещество(а), как определено в соответствующем ряду табл. B-1.
Таблица В-1
Смеси 1.1 - 1.229
Смесь№. Гербиц идВ
1.1 В.1 1.28 В.28 1.55 В.55
1.2 В.2 1.29 В.29 1.56 В.56
1.3 В.З 1.30 В.30 1.57 В.57
1.4 В.4 1.31 В.31 1.58 В.58.
1.5 В.5 1.32 В.32 1.59 В.59
1.6 В.6 1.33 В.33 1.60 В.60
1.7 В.7 1.34 В.34 1.61 В.61
1.8 В.8 1.35 В.35 1.62 В.62
1.9 В.9 1.36 В.36 1.63 В.63
1.10 В.10 1.37 В.37 1.64 В.64
1.11 В.11 1.38 В.38 1.65 В.65
1.12 В.12 1.39 В.39 1.66 В.66
1.13 В.13 1.40 В.40 1.67 В.67
1.14 В.14 1.41 В.41 1.68 В.68
1.15 В.15 1.42 В.42 1.69 В.69
1.16 В.16 1.43 В.43 1.70 В.70
1.17 В.17 1.44 В.44 1.71 В.71
1.18 В.18 1.45 В.45 1.72 В.72
1.19 В.19 1.46 В.46 1.73 В.73
1.20 В.20 1.47 В.47 1.74 В.74
1.21 В.21 1.48 В.48 1.75 В75
1.22 В.22 1.49 В.49 1.76 В.76
1.23 В.23 1.50 В.50 1.77 В.77
1.24 В.24 1.51 В.51 1.78 В.78
1.25 В.25 1.52 В.52 1.79 В.79
1.26 В.26 1.53 В.53 1.80 В.80
1.27 В.27 1.54 В.54 1.81 В.81
- 28 036015
1.82 В.82 1.130 В.130 1.178 В.178
1.83 В.83 1.131 В.131 1.179 В.179
1.84 В.84 1.132 В.132 1.180 В.180
1.85 В.85 1.133 В.133 1.181 В.181
1.86 В.86 1.134 В.134 1.182 В.182
1.87 В.87 1.135 В.135 1.183 В.183
1.88 В.88 1.136 В.136 1.184 В.184
1.89 В.89 1.137 В.137 1.185 В.185
1.90 В.90 1.138 В.138 1.186 В.186
1.91 В.91 1.139 В.139 1.187 В.187
1.92 В.92 1.140 В. 140 1.188 В.188
1.93 В.93 1.141 В.141 1.189 В.189
1.94 В.94 1.142 В. 142 1.190 В.190
1.95 В.95 1.143 В.143 1.191 В.191
1.96 В.96 1.144 В. 144 1.192 В.192
1.97 В.97 1.145 В.145 1.193 В.193
1.98 В.98 1.146 В. 146 1.194 В.194
1.99 В.99 1.147 В. 147 1.195 В.195
1.100 В. 100 1.148 В.148 1.196 В.196
1.101 В.101 1.149 В.149 1.197 В.197
1.102 В. 102 1.150 В.150 1.198 В.198
1.103 В.103 1.151 В.151 1.199 В.199
1.104 В. 104 1.152 В.152 1.200 В.200
1.105 В.105 1.153 В.153 1.201 В.201
1.106 В. 106 1.154 В.154 1.202 В.202
1.107 В. 107 1.155 В.155 1.203 В.203
1.108 В.108 1.156 В.156 1.204 В.204
1.109 В.109 1.157 В.157 1.205 В.205
1.110 В.НО 1.158 В.158 1.206 В.206
1.111 В.111 1.159 В.159 1.207 В.207
1.112 В.112 1.160 В. 160 1.208 В.208
1.113 В.113 1.161 В.161 1.209 В.209
1.114 В.114 1.162 В. 162 1.210 В.210
1.115 В.115 1.163 В.163 1.211 В.211
1.116 В.116 1.164 В. 164 1.212 В.212
1.117 В.117 1.165 В.165 1.213 В.213
1.118 В.118 1.166 В. 166 1.214 В.214
1.119 В.119 1.167 В. 167 1.215 В.215
1.120 В. 120 1.168 В.168 1.216 В.216
1.121 В.121 1.169 В.169 1.217 В.217
1.122 В. 122 1.170 В. 170 1.218 В.218
1.123 В.123 1.171 В.171 1.219 В.219
1.124 В. 124 1.172 В. 172 1.220 В.220
1.125 В.125 1.173 В.173 1.221 В.221
1.126 В. 126 1.174 В. 174 1.222 В.222
1.127 В. 127 1.175 В.175 1.223 В.223
1.128 В.128 1.176 В. 176 1.224 В.224
1.129 В.129 1.177 В. 177 1.225 В.225
1.226 В.226
1.227 В.227
1.228 В.228
1.229 В.229
Также особенно предпочтительны смеси 2.1 - 2.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A ацифлуорфен-натрий.
Также особенно предпочтительны смеси 3.1 - 3.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A азафенидин.
Также особенно предпочтительны смеси 4.1 - 4.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A бенкарбазон.
Также особенно предпочтительны смеси 5.1 - 5.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A бензфендизон.
Также особенно предпочтительны смеси 6.1 - 6.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A бифенокс.
Также особенно предпочтительны смеси 7.1 - 7.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.227 только тем, что они содержат в качестве компонента A бутафенацил.
- 29 036015
Также особенно предпочтительны смеси 8.1 - 8.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A карфентразон.
Также особенно предпочтительны смеси 9.1 - 9.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A карфентразон-этил.
Также особенно предпочтительны смеси 10.1 - 10.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A хлометоксифен.
Также особенно предпочтительны смеси 11.1 - 11.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A цинидон-этил.
Также особенно предпочтительны смеси 12.1 - 12.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флуазолат.
Также особенно предпочтительны смеси 13.1 - 13.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флуфенпир.
Также особенно предпочтительны смеси 14.1 - 14.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флуфепир-этил.
Также особенно предпочтительны смеси 15.1 - 15.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флумиклорак.
Также особенно предпочтительны смеси 16.1 - 16.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флумиклорак-пентил.
Также особенно предпочтительны смеси 17.1 - 17.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флумиоксазин.
Также особенно предпочтительны смеси 18.1 - 18.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флуорогликофен.
Также особенно предпочтительны смеси 19.1 - 19.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флуорогликофен-этил.
Также особенно предпочтительны смеси 20.1 - 20.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флутиацет.
Также особенно предпочтительны смеси 21.1 - 21.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A флутиацет-метил.
Также особенно предпочтительны смеси 22.1 - 22.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A фомесафен.
Также особенно предпочтительны смеси 23.1 - 23.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A галосафен.
Также особенно предпочтительны смеси 24.1 - 24.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A лактофен.
Также особенно предпочтительны смеси 25.1 - 25.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A оксадиаргил.
Также особенно предпочтительны смеси 26.1 - 26.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A оксадиазон.
Также особенно предпочтительны смеси 27.1 - 27.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1,1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A оксифлуорфен.
Также особенно предпочтительны смеси 28.1 - 28.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A пентоксазон.
Также особенно предпочтительны смеси 29.1 - 29.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A профлуазол.
Также особенно предпочтительны смеси 30.1 - 30.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A пираклонил.
Также особенно предпочтительны смеси 31.1 - 31.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A пирафлуфен.
Также особенно предпочтительны смеси 32.1 - 32.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A пирафлуфен-этил.
Также особенно предпочтительны смеси 33.1 - 33.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A сафлуфенацил.
Также особенно предпочтительны смеси 34.1 - 34.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A сульфентразон.
Также особенно предпочтительны смеси 35.1 - 35.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A тидиазимин.
Также особенно предпочтительны смеси 36.1 - 36.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента A тиафенацил.
Также особенно предпочтительны смеси 37.1 - 37.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (CAS 353292-31-6; S-3100).
- 30 036015
Также особенно предпочтительны смеси 38.1 - 38.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b]-[1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион (CAS 1258836-72-4).
Также особенно предпочтительны смеси 39.1 - 39.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А Н-этил-3-(2/)-дихлор-4трифторметилфенокси)-5-метил-Ш-пиразол-1-карбоксамид (CAS 452098-92-9).
Также особенно предпочтительны смеси 40.1 - 40.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А №тетрагидрофурфурил-3-(2,6дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамид (CAS 915396-43-9).
Также особенно предпочтительны смеси 41.1 - 41.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А №этил-3-(2-хлор-6-фтор-4трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамид (CAS 452099-05-7).
Также особенно предпочтительны смеси 42.1 - 42.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А №тетрагидрофурфурил-3-(2хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамид (CAS 452100-03-7).
Также особенно предпочтительны смеси 43.1 - 43.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А 3-[7-фтор-3-оксо-4-(проп-2инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил]-1,5-диметил-6-тиоксо-[1,3,5]триазинан-2,4-дион.
Также особенно предпочтительны смеси 44.1 - 44.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А метил (Е)-4-[2-хлор-5-[4-хлор5-(дифторметокси)-1Н-метилпиразол-3-ил]-4-фторфенокси]-3-метоксибут-2-еноат (CAS 948893-00-3).
Также особенно предпочтительны смеси 45.1 - 45.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А 3-[7-хлор-5-фтор-2(трифторметил)-1Н-бензимидазол-4-ил]-1-метил-6-(трифторметил)-1Н-пиримидин-2,4-дион (CAS 212754-02-4).
Также особенно предпочтительны смеси 46.1 - 46.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А 2-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп2-инил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-4,5,6,7-тетрагидроизоиндол-1,3-дион.
Также особенно предпочтительны смеси 47.1 - 47.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они содержат в качестве компонента А 1-метил-6-трифторметил-3(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-проп-2-инил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]-оксазин-6-ил)-1Н-пиримидин-2,4-дион.
Также особенно предпочтительны смеси 48.1 - 48.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат беноксакор в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 49.1 - 49.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат клоквинтоцет в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 50.1 - 50.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат ципросульфамид в качестве защитного вещества С.
Также особенно предпочтительны смеси 51.1 - 51.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат дихлормид в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 52.1 - 52.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат фенхлоразол в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 53.1 - 53.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат фенклорим в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 54.1 - 54.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат фурилазол в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 55.1 - 55.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат изоксадифен в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 56.1 - 56.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат мефенпир в качестве защитного вещества C.
Также особенно предпочтительны смеси 57.1 - 57.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат 4-(дихлорацетил)-1-окса-4азаспиро[4.5]декан (MON4660, CAS 71526-07-3) в качестве защитного вещества C.
- 31 036015
Также особенно предпочтительны смеси 58.1 - 58.229, которые отличаются от соответствующих смесей 1.1 - 1.229 только тем, что они дополнительно содержат 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3оксазолидин (R-29148, CAS 52836-31-4) в качестве защитного вещества C.
Вообще предпочтительно применение соединения данного изобретения в смеси с гербицидами, которые являются селективными по отношению к сельскохозяйственной культуре, подлежащей обработке, и которые дополняют спектр сорняков, контролируемых этими соединениями при применяемых расходных количествах. Далее также вообще предпочтительно применение соединений данного изобретения и других дополнительных гербицидов в то же самое время или в виде смешанного препарата, или в виде смеси, приготавливаемой в большом резервуаре.
Было обнаружено, что полинуклеотидные молекулы и полипептиды данного изобретения охватывают полинуклеотидные молекулы и полипептиды, включающие нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая является достаточно идентичной к нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или 3, или аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2 или 4. Термин достаточно идентичный используется здесь для ссылки на первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая содержит достаточное или минимальное число идентичных или эквивалентных (т.е. с похожими боковыми цепями) аминокислотных остатков или нуклеотидов по отношению ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что эти первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий структурный домен и/или общую функциональную активность.
Как правило, идентичность последовательности относится к степени, в которой две оптимально выровненные ДНК или аминокислотные последовательности являются инвариантными по всему окну выравнивания компонентов, т.е. нуклеотидов или аминокислот. Идентичная доля для выровненных сегментов тестируемой последовательности и последовательности для сравнения определяется числом идентичных компонентов, которые присутствуют в обеих выровненных последовательностях, деленным на общее число компонентов в сравниваемом сегменте последовательности, например, полная сравниваемая последовательность или меньшая определенная часть сравниваемой последовательности. Процент идентичности равен идентичной доле, умноженной на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам и может быть проведено с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith и Waterman), алгоритм выравнивания гомологии Нидлмана-Вунша (Needleman и Wunsch), способ поиска сходства Пеарсона и Липпмана (Pearson и Lipman) и предпочтительно компьютеризованных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступных как часть GCG, Wisconsin Package, (Accelrys Inc. Burlington, Mass.).
Полинуклеотиды и олигонуклеотиды.
Под изолированным полинуклеотидом, включая ДНК, РНК или их комбинацию, с единичной или двойной прядью, в сенс или антисенс ориентации или комбинации обеих, dsPHK или другие, подразумевается полинуклеотид, который, как минимум, частично отделен от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он ассоциирован или связан в его нативном состоянии. Предпочтительно изолированный полинуклеотид как минимум на 60% свободен, более предпочтительно как минимум на 75% свободен, еще более предпочтительно как минимум на 90% свободен от других компонентов, с которыми он естественно ассоциирован. Как и ожидается опытными специалистами, изолированный полинуклеотид может быть экзогенным полинуклеотидом, присутствующим, например, в трансгенном организме, который, естественно, не должен включать этот полинуклеотид. Кроме того, термин полинуклеотид(ы), нуклеиновокислотная(ые) последовательность(и), нуклеотидная(ые) последовательность(и), нуклеиновая(ые) кислота(ы), молекула нуклеиновой кислоты используются здесь взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидам, или рибонуклеотидам или деоксирибонуклеотидам или к комбинации обоих, в полимерной неразветвленной форме любой длины.
Термин мут-ППО нуклеиновая кислота относится к ППО нуклеиновой кислоте, имеющей последовательность, которая мутировала из дикого типа ППО нуклеиновой кислоты и которая придает повышенную толерантность к ППО ингибирующему гербициду в растении, в котором она была экспрессирована. Кроме того, термин мутированная протопорфириноген оксидаза (мут-ППО) относится к замещению аминокислоты дикого типа в первичных последовательностях SEQ ID NO: 2 или 4 или варианте. Экспрессия мутированной аминокислоты будет использована ниже для обозначения аминокислоты, которая замещена на другую аминокислоту, таким образом обозначая место мутации в первичной последовательности белка.
Термин вариант по отношению к последовательности (т.е. полипептидная или нуклеиновокислотная последовательность, такая как, например, транскрипцию регулирующая нуклеотидная последовательность изобретения) предполагает, что имеются в виду в существенной мере похожие последовательности. Поскольку нуклеотидные последовательности включают открытый считываемый каркас, варианты включают такие последовательности, которые, в связи с тем, что дегенерирован генетический код, кодируют идентичную аминокислотную последовательность нативного белка. Естественно возникающие
- 32 036015 аллельные варианты, такие как эти, могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных технологий молекулярной биологии, таких как, например, полимеразных цепных реакций (PCR) и гибридизационных технологий. Вариант нуклеотидных последовательностей также включает синтетически полученные нуклеотидные последовательности, такие как генерированные, например, при использовании направленного по месту мутагенеза и для открытых считываемых каркасов, кодируя нативный белок, а также такие, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотное замещение по отношению к нативному белку. Вообще варианты нуклеотидных последовательностей данного изобретения имеют как минимум 30, 40, 50, 60 до 70%, например, предпочтительно 71, 72, 73%, 74, 75, 76, 77, 78 до 79%, как правило, как минимум 80%, например, 81-84%, как минимум 85%, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 до 98 и 99% идентичности нуклеотидной последовательности к нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45. Процент (%) идентичности полинуклеотида определяют с помощью GAP (Needleman и Wunsch, 1970) анализа (GCG программа) со штрафом создания щели = 5 и со штрафом расширения щели = 0,3. Если не оговорено по-другому, то рассматриваемая последовательность имеет как минимум 45 нуклеотидов в длину и GAP (общего профиля доступа) анализ выравнивает две последовательности в области как минимум 45 нуклеотидов. Предпочтительно рассматриваемая последовательность имеет как минимум 150 нуклеотидов в длину, и GAP анализ выравнивает две последовательности по области как минимум 150 нуклеотидов. Более предпочтительно рассматриваемая последовательность имеет как минимум 300 нуклеотидов в длину? и GAP анализ выравнивает две последовательности по области как минимум 300 нуклеотидов. Еще более предпочтительно, когда GAP анализ выравнивает две последовательности по их полной длине.
Полипептиды.
Под существенно очищенным полипептидом или очищенным полипептидом подразумевают, что он был отделен от одного или более липидов, нуклеиновых кислот, других полипептидов или других загрязняющих молекул, с которыми он соединен в его нативном состоянии. Предпочтительно, чтобы существенно очищенный полипептид был как минимум на 60% свободен, более предпочтительно как минимум на 75% свободен и еще более предпочтительно как минимум на 90% свободен от других компонентов, с которыми он естественно соединен. Как себе могут представить опытные специалисты, очищенный полипептид может быть рекомбинантно полученным полипептидом. Термины полипептид и белок вообще используют взаимозаменяемо, и они относятся к одиночной полипептидной цепи, которая может быть или не может быть модифицирована добавлением не аминокислотных групп. Понятно, что такие полипептидные цепи могут соединяться с другими полипептидами или белками или другими молекулами, такими как кофакторы. Термин белки и полипептиды, как используется здесь, также включает варианты, мутанты, модификации, аналоги и/или производные полипептидов данного изобретения, как описано здесь.
Процент (%) идентичности полипептида определяют способом GAP (Needleman и Wunsch, 1970) анализа (GCG программа) со штрафом создания щели = 5 и со штрафом расширения щели = 0,3. Рассматриваемая последовательность имеет как минимум 25 аминокислот в длину, и GAP анализ выравнивает две последовательности по области как минимум 25 аминокислот. Более предпочтительно рассматриваемая последовательность имеет как минимум 50 аминокислот в длину, и GAP анализ выравнивает две последовательности по области как минимум 50 аминокислот. Еще более предпочтительно рассматриваемая последовательность имеет как минимум 100 аминокислот в длину, и GAP анализ выравнивает две последовательности по области как минимум 100 аминокислот. А еще более предпочтительно рассматриваемая последовательность имеет как минимум 250 аминокислот в длину, и GAP анализ выравнивает две последовательности по области как минимум 250 аминокислот. Наиболее предпочтительно GAP анализ выравнивает две последовательности по всей их длине.
По отношению к определенному полипептиду должно быть определено, что числа процентов идентичности более высокие, чем таковые, которые обеспечены выше, будут охватывать предпочтительные варианты. Так, приемлемо в свете минимальных чисел процентной идентичности, что является предпочтительным, когда ППО полипептид данного изобретения может включать аминокислотную последовательность, которая является как минимум на 40%, более предпочтительно как минимум на 45%, более предпочтительно как минимум на 50%, более предпочтительно как минимум на 55%, более предпочтительно как минимум на 60%, более предпочтительно как минимум на 65%, более предпочтительно как минимум на 70%, более предпочтительно как минимум на 75%, более предпочтительно как минимум на 80%, более предпочтительно как минимум на 85%, более предпочтительно как минимум на 90%, более предпочтительно как минимум на 91%, более предпочтительно как минимум на 92%, более предпочтительно как минимум на 93%, более предпочтительно как минимум на 94%, более предпочтительно как минимум на 95%, более предпочтительно как минимум на 96%, более предпочтительно как минимум на 97%, более предпочтительно как минимум на 98%, более предпочтительно как минимум на 99%, более предпочтительно как минимум на 99,1%, более предпочтительно как минимум на 99,2%, более предпочтительно как минимум на 99,3%, более предпочтительно как минимум на 99,4%, более предпочтительно как минимум на 99,5%, более предпочтительно как минимум на 99,6%, более предпочтительно как ми- 33 036015 нимум на 99,7%, более предпочтительно как минимум на 99,8%, еще более предпочтительно как минимум на 99,9% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4.
Под вариантом полипептида подразумевают полипептид, полученный из белка SEQ ID NO: 2 или 4 путем стирания (так называемого усечения) или добавления одной или более аминокислот к N-конечному и/или C-конечному концу нативного белка; стирания или добавления одной иди более аминокислот в одном или более месте в нативном белке или замещения одной или более аминокислот в одном или более месте в нативном белке. Такие варианты могут проистекать, например, из генетического полиморфизма или манипуляций человека. Способы таких манипуляций вообще известны специалистам.
Производные белка охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и энзимы, имеющие аминокислотные замещения, стирания и/или встраивания относительно немодифицированного рассматриваемого белка и имеющие похожую биологическую или функциональную активность, как и немодифицированные белки, из которых они были получены.
Гомологи белка включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и энзимы, имеющие аминокислотные замещения, стирания и/или встраивания относительно имеющегося в виду немодифицированного белка и имеющие похожую биологическую и функциональную активность, как и не модифицированный белок, из которого они получены.
Стирание относится к удалению одной или нескольких аминокислот из белка.
Встраивание относится к одному или нескольким аминокислотным остаткам, введенным в заранее предназначенное место белка. Встраивания могут включать N-конечную и/или C-конечную фузию, а также встраивания внутрь последовательности единичной или мультиплетной аминокислоты. Как правило, встраивания внутрь аминокислотной последовательности являются меньшими, чем N- или C-конечные фузии, с порядком от 1 до 10 остатков. К примерам N- или C-конечных фузий белков или полипептидов относятся связывающий домен или активационный домен транскрипционного активатора, такой как используемый в дрожжевой двухгибридной системе, фаговых покровных белках, (гистидин)-6таг, глютатион S-трансфераза-таг, белок A, связывающий мальтозу белок, дигидрофолатредуктаза, таг· 100 эпитоп, c-myc эпитоп, FLAG®-эпитоп, lacZ, CMP (связывающий пептид калмодулин), HA эпитоп, белок C эпитопа и VSV эпитопа. Замещение относится к замещению аминокислот белка другими аминокислотами, имеющими похожие свойства (такие как похожая гидрофобность, гидрофильность, антигенность, предрасположенность к образованию или разрыву α-спиральных структур или β-листовых структур). Аминокислотные замещения обычно проводятся единичными остатками, однако могут быть и кластерными, в зависимости от функциональных напряжений, помещенных после полипептида, и могут простираться от 1 до 10 аминокислот; встраивания обычно имеют порядок от 1 до 10 аминокислотных остатков. Аминокислотные замещения являются предпочтительно консервативными аминокислотными замещениями. Таблицы консервативных аминокислотных замещений хорошо известны специалистам (см., например, Creighton (1984), Proteins. W.H. Freeman и Company (Eds).
Таблица 2
Примеры консервативных аминокислотных замещений
Остаток Консервативные замещения Остаток Консервативные замещения
Ala (аланин) Ser (серин) Leu (лейцин) Не (изолейцин); Vai (валин)
Агд (аргинин) Lys (лизин) Lys (лизин) Агд (аргинин); Gin (глутамин)
Asn (аспарагин) Gin (глутамин); His (гистидин) Met (метионин) Leu (лейцин); Не (изолейцин)
Asp (аспарагиновая кислота) Glu (глутаминовая кислота) Phe (фенилаланин) Met (метионин); Leu (лейцин); Туг (тирозин)
Gin (глутамин) Asn (аспарагин) Ser (серин) Thr (треонин); Gly (глицин)
Cys (цистеин) Ser (серин) Thr (треонин) Ser (серин); Vai (валин)
Glu (глутаминовая кислота) Asp (аспарагиновая кислота) Тгр (триптофан) Туг (тирозин)
Gly (глицин) Pro (пролин) Туг (тирозин) Тгр (триптофан); Phe (фенилаланин)
His (гистидин) Asn (аспарагин); Gin (глутамин) Vai (валин) Не (изолейцин); Leu (лейцин)
Не (изолейцин) Leu (лейцин), Vai (валин)
Аминокислотные замещения, стирания и/или встраивания можно легко проводить, используя технологию синтеза пептидов, хорошо известную специалистам, такую как твердофазный синтез пептидов и тому подобные, или путем рекомбинантных превращений ДНК. Методы превращения ДНК последовательностей с осуществлением вариантов замещения, встраивания или стирания в белке хорошо известны специалистам. Например, технология получения мутаций замещения в специально предназначенных ме- 34 036015 стах ДНК хорошо известна специалистам и включает M13 мутагенез, мутагенез Т7-гена in vitro (USB,
Cleveland, OH), направленный по месту мутагенез с быстрым замещением (Stratagene, San Diego, CA),
PCR-опосредованный направленный по месту мутагенез или другие направленные по месту протоколы мутагенеза.
Производные далее включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые могут по сравнению с аминокислотными последовательностями естественно встречающихся форм белка, такими как представляющий интерес белок, включать замещение аминокислот не встречающимися в природе аминокислотными остатками или присоединение не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Производные белка также включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, естественно встречающиеся измененные (гликозилированные, ацилированные, пренилированные, фосфорилированные, миристоилированные, сульфатированные и т.д.) или не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, измененные по сравнению с аминокислотными последовательностями естественно встречающихся форм полипептидов. Производное может также включать один или более не аминокислотных заместителей или присоединений по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой оно получено, например репортерная молекула или другой лиганд, ковалентно или не ковалентно связанный с аминокислотной последовательностью, такой как репортерная молекула, которая присоединена для облегчения его обнаружения, и не естественно появляющиеся аминокислотные остатки по отношению к аминокислотной последовательности естественно существующего белка. Кроме того, производные также включают фузии естественно встречающихся форм белка с прикрепленными в виде меток пептидами, такими как FLAG, HIS6 или тиоредоксин (обзор по прикрепленным в виде меток пептидам, см. в Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).
Ортологи и паралоги связаны с эволюционными концепциями, используемыми для описания наследственных взаимоотношений генов. Паралоги являются генами внутри того же биологического вида, из которого они получены путем дубликации одного наследственного гена; ортологи являются генами из отличных организмов, которые образуются путем видообразования и также получаются из обычных наследственных генов. Не ограничивающий список примеров таких ортологов показан в табл. 1.
Специалистам хорошо известно, что паралоги и ортологи могут составлять доли различных доменов, укрывающих подходящие аминокислотные остатки в заданных местах, таких как связывающие карманы для определенных субстратов или связывающие мотивы для взаимодействия с другими белками.
Термин домен относится к ряду аминокислот сохраненных в специфических положениях вдоль выравнивания последовательностей эволюционно родственных белков. В то время как аминокислоты в других положениях могут варьироваться между гомологами, аминокислоты, которые в высокой степени сохранены в специфических положениях, индицируют аминокислоты, которые являются существенными для структуры, стабильности или функции белка. Идентифицируемые с высокой степенью их сохраняемости при выравнивании последовательностей семейства белковых гомологов, они могут быть использованы в качестве идентификаторов для того, чтобы определить, относится ли любой рассматриваемый полипептид к ранее идентифицированному семейству полипептидов.
Термин мотив или консенсусная последовательность относится к короткой сохраненной области в последовательности эволюционно родственных белков. Мотивы часто представляют собой в высокой степени сохраненные части доменов, однако могут включать только часть домена или быть локализованы вне сохраненного домена (в том случае, когда все аминокислоты мотива оказываются вне определенного домена).
Существуют специальные базы данных для идентификации доменов, например SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5857-5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res., 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res., 31, 315-318), Prosite (Bucher и Bairoch (1994) и обобщенный профильный синтаксис для биомолекулярных последовательностей мотивов и их функций в автоматической интерпретации последовательностей (в) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology; Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., p. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res., 32:D134-D137, (2004)); или Pfam (Bateman et al., Nucl. Acids Research, 30(1): 276-280, (2002)). Ряд инструментов in silico анализа белковых последовательностей можно получить из ExPASy протиомикс сервера (Шведский институт биоинформатики (Gasteiger et al.,, ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucl. Acids Res., 31:37843788, (2003)). Домены и мотивы можно также идентифицировать с помощью рутинной техники, такой как выравнивание последовательностей.
Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны специалистам, эти способы включают GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA TFASTA. GAP использует алгоритм НидлманаВунша (Needleman и Wunsch, (1970), J. Mol. Biol., 48: 443-453) для нахождения всеобщего (т.е. охватывающего полные последовательности) отнесения двух последовательностей, который максимизирует число сравниваемых пар и минимизирует число щелей. BLAST алгоритм (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol., 215: 403-10) рассчитывает проценты идентичности последовательности и выполняет статистический анализ сходства двух последовательностей. Программное обеспечение для осуществления BLAST
- 35 036015 анализа открыто доступно через Национальный Центр Биотехнологической Информации (National Centre for Biotechnology Information (NCBI)). Гомологи могут быть легко идентифицированы с использованием, например, алгоритма выравнивания ClustalW мультиплетной последовательности (версия 1.83), с параметрами ошибки попарного выравнивания и способом меток в процентах. Общие проценты сходства и идентичности могут быть также определены с использованием способов из пакета программного обеспечения MatGAT (Campanella et al., ВМС Bioinformatics, 2003, Jul 10; 4:29, MatGAT: применение, которое создает матрицы похожести/идентичности, используя белковые или ДНК последовательности). Незначительное редактирование вручную может быть проведено для оптимизации выравнивания между сохраненными мотивами, как это очевидно специалистам. Кроме того, вместо использования полной длины последовательностей для идентификации гомологов могут также использоваться специфические домены. Величины идентичности последовательностей могут быть определены по всей нуклеиновокислотной или аминокислотной последовательности или по выбранным доменам или сохраненному(ым) мотиву(ам), используя упомянутые выше программы с использованием параметров ошибок (отклонений). Для локального выравнивания особенно полезен алгоритм Смита-Ватермана (Smith T.F., Waterman M.S., (1981), J. Mol. Biol., 147(1); 195-7).
Изобретатели данного изобретения обнаружили, что замещение одного или более ключевых аминокислотных остатков может заметно увеличить толерантность или устойчивость к гербициду по сравнению с активностью дикого типа ППО энзимов с SEQ ID NO: 2 или 4. Предпочтительными замещениями мут-ППО являются такие, которые увеличивают толерантность к гербициду растения, однако оставляют в существенной мере неизмененной биологическую активность оксидазной активности.
Соответственно, в другом объекте данного изобретения ключевой аминокислотный остаток ППО энзима и его вариант замещен любой другой аминокислотой.
В предпочтительном варианте ключевой аминокислотный остаток ППО энзима и его вариант замещен сохраненной аминокислотой, как показано в табл. 2.
Специалистам должно быть понятно, что аминокислоты, локализованные тесно поблизости от позиций аминокислот, упомянутых ниже, могут быть также замещены. Так, в другом варианте изобретения вариант SEQ ID NO: 2 или 4, вариант его включает мут-ППО, в котором одна аминокислота, находящаяся в ±3, ±2 или ±1 аминокислотной позиции от ключевой аминокислоты, замещена любой другой аминокислотой.
Основываясь на хорошо известные технологии, могут быть развиты высоко характеристические образцы последовательности, с помощью которых найдены дальнейшие мут-ППО претенденты с желательной активностью.
Поиск дальнейших мут-ППО претендентов с использованием подходящих образцов последовательностей также охватывается данным изобретением. Опытному читателю должно быть понятно, что представленные примеры последовательностей не ограничены точным расстоянием между двумя смежными аминокислотными остатками этих примеров. Каждое расстояние между двумя соседями в указанных выше примерах может, например, меняться независимо один от другого вплоть до ±10, ±5, ±3, ±2 или ±1 аминокислотных позиций без существенного влияния на желательную активность.
Кроме того, применяя способ направленного по месту мутагенеза, изобретатели данного изобретения идентифицировали специфические комбинации мутаций, причем комбинации относятся к замещению фенилаланинового остатка в позиции 420 в SEQ ID NO: 2 или 4, комбинированной со вторым замещением лейцина в позиции 397 в SEQ ID NO: 2 или 4.
Так, в более предпочтительном варианте изобретения вариант или производное мут-ППО SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 выбирают из комбинированных аминокислотных замещений, приведенных в табл. 3 a.
- 36 036015
Таблица 3 a
SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 (комбинированные аминокислотные замещения, полученные путем направленного по месту мутагенеза)
Номер комбинации SEQ ID NO: Ключевая аминокислотная позиция комбинации Предпочтительное з амещение
1 2 или 4 Leu397 (лейцин) Gly (глицин)
Phe420 (фенилаланин) Met (метионин)
2 2 Leu397 (лейцин) Ala (аланин)
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 2 или 4 Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Leu397 (лейцин) Phe420 (фенилаланин) Met (метионин) Ser (серин) Met (метионин) Thr (треонин) Met (метионин) Cys (цистеин) Met (метионин) Vai (валин) Met (метионин) Не (и з о л е й ц и н ) Met (метионин) Met (метионин) Met (метионин) Pro (пролин) Met (метионин) Phe (фенилаланин) Met (метионин) Туг (тирозин) Met (метионин) Тгр (триптофан) Met (метионин) Asp (аспараг иновая кислота) Met (метионин) Glu (глутаминовая кислота) Met (метионин)
15 2 или 4 Leu397 (лейцин) Asn (аспараг ин)
Phe420 (фенилаланин) Met (метионин)
16 2 или 4 Leu397 (лейцин) Gin (глутамин)
Phe420 (фенилаланин) Met (метионин)
17 2 Leu397 (лейцин) His (г и с т и д и н )
- 37 036015
или 4 Phe420 (фенилаланин) Met (метионин)
18 2 или 4 Leu397 (лейцин) Lys (л и з и н )
Phe420 (фенилаланин) Met (метионин)
19 2 или 4 Leu397 (лейцин) Arg (а р г и н и н )
Phe420 (фенилаланин) Met (метионин)
20 2 или 4 Leu397 (лейцин) Gly (глицин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
21 2 или 4 Leu397 (лейцин) Ala (а л а н и н )
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
22 2 или 4 Leu397 (лейцин) Ser (серин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
23 2 или 4 Leu397 (лейцин) Thr (треонин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
24 2 или 4 Leu397 (лейцин) Cys (цистеин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
25 2 или 4 Leu397 (лейцин) Val (валин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
26 2 или 4 Leu397 (лейцин) Не (и з о л е й ц и н )
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
27 2 или 4 Leu397 (лейцин) Met (метионин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
28 2 или 4 Leu397 (лейцин) Pro (пролин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
29 2 или 4 Leu397 (лейцин) Phe (фенилаланин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
30 2 или 4 Leu397 (лейцин) Туг (тирозин)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
31 2 или 4 Leu397 (лейцин) Тгр (триптофан)
Phe420 (фенилаланин) Val (валин)
32 2 или 4 Leu397 (лейцин) Asp (аспараг иновая кислота)
Phe420 Val (валин)
- 38 036015
(фенилаланин)
33 2 или 4 Leu397 (лейцин) Glu (глутаминовая кислота)
Phe420 (фенилаланин) Vai (валин)
34 2 или 4 Leu397 (лейцин) Asn (аспараг ин)
Phe420 (фенилаланин) Vai (валин)
35 2 или 4 Leu397 (лейцин) Gin (глутамин)
Phe420 (фенилаланин) Vai (валин)
36 2 или 4 Leu397 (лейцин) His (г и с т и д и н )
Phe420 (фенилаланин) Vai (валин)
37 2 или 4 Leu397 (лейцин) Lys (лизин)
Phe420 (фенилаланин) Vai (валин)
38 2 или 4 Leu397 (лейцин) Arg (а р г и н и н )
Phe420 (фенилаланин) Vai (валин)
В другом более предпочтительном варианте изобретения вариант или производное мут-ППО SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 выбирают из комбинированных аминокислотных замещений, приведенных в табл. 3b.
Таблица 3 b
SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 (комбинированные аминокислотные замещения)
Номер комбинации SEQ ID NO: Ключевая аминокислотная позиция комбинации Предпочтительные замещения
39 2 и л и 4 Leu397 Asp, Glu, Gin, Asn
Leu400 Ala, He, Vai, Met
40 2 и л и 4 Leu397 Asp, Glu, Gin, Asn
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
41 2 и л и 4 Phe204 Ala, Leu, lie, Vai
Leu397 Asp, Glu, Gin, Asn
42 2 и л и 4 Thr208 Ser
Leu400 Ala, He, Vai, Met
43 2 и л и 4 Leu400 Ala
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
44 2 и л и 4 Phe204 He
Leu400 Ala, He, Vai, Met
- 39 036015
45 2 и л и 4 The208 Ser
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
46 2 и л и 4 Phe204 He
Thr208 Ser
47 2 и л и 4 Phe204 He
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
48 2 и л и 4 Leu400 Ala, He, Val, Met
Phe420 Val, Met, Ala, He, Leu
49 2 и л и 4 Phe204 He
Phe420 Val, Met, Ala, He, Leu
50 2 и л и 4 Phe420 Val, Met, Ala, He, Leu
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
51 2 и л и 4 Arg 128 Ala, Leu, lie, Val
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
52 2 и л и 4 Thr208 Ser
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
53 2 и л и 4 Phe204 He
The208 Ser
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
54 2 и л и 4 Phe204 He
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
55 2 и л и 4 Thr208 Ser
Leu400 Ala, He, Val, Met
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
56 2 и л и 4 Phe204 He
Thr208 Ser
Leu400 Ala, He, Val, Met
57 2 и л и 4 Phe204 He
Leu400 Ala, He, Val, Met
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
58 2 и л и 4 Thr208 Ser
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Leu400 Ala, He, Val, Met
59 2 и л и 4 Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Leu400 Ala, He, Val, Met
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
60 2 и л и 4 Phe204 He
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Leu400 Ala, He, Val, Met
61 2 и л и 4 Phe204 He
Thr208 Ser
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Val
62 2 и л и 4 Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Leu400 Ala, He, Val, Met
- 40 036015
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
63 2 и л и 4 Leu397 Asp, Glu, Gin, Asn
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
64 2 и л и 4 Phe204 lie
Leu397 Asp, Glu, Gin, Asn
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
65 2 и л и 4 Phe204 lie
Thr208 Ser
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
66 2 и л и 4 Thr208 Ser
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
67 2 и л и 4 Phe204 lie
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
68 2 и л и 4 Arg 128 Ala, Leu, lie, Vai
Leu400 Ala, He, Vai, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
69 2 и л и 4 Arg 128 Ala, Leu, lie, Vai
Leu397 Asp, Glu, Gin, Asn
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
70 2 и л и 4 Arg 128 Ala, Leu, lie, Vai
Phe204 lie
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
71 2 и л и 4 Arg 128 Ala, Leu, lie, Vai
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
72 2 и л и 4 Thr208 Ser
Leu400 Ala, He, Vai, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
73 2 и л и 4 Leu400 Ala, He, Vai, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
74 2 и л и 4 Phe204 lie
Leu400 Ala, He, Vai, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
75 2 и л и 4 Phe204 lie
Thr208 Ser
Leu400 Ala, He, Vai, Met
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
76 2 и л и 4 Phe204 lie
Thr208 Ser
Phe420 Met, Ala, Leu, He, Vai
Phe457 Met, Ala, Leu, He, Vai
77 2 и л и Arg 128 Ala, Leu, lie, Vai
- 41 036015
4 Phe204 Ile
Phe420 Met, Ala, Leu, Ile, Val
Phe457 Met, Ala, Leu, Ile, Val
78 2 и л и 4 Phe204 Ile
Leu400 Ala, Ile, Val, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, Ile, Val
Phe457 Met, Ala, Leu, Ile, Val
79 2 и л и 4 Phe204 Ile
Thr208 Ser
Leu397 Asp, Glu, Gln, Asn
Leu400 Ala, Ile, Val, Met
80 2 и л и 4 Phe204 Ile
Thr208 Ser
Leu400 Ala, Ile, Val, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, Ile, Val
Phe457 Met, Ala, Leu, Ile, Val
81 2 и л и 4 Arg 128 Ala, Leu, Ile, Val
Phe204 Ile
Leu400 Ala, Ile, Val, Met
Phe420 Met, Ala, Leu, Ile, Val
Phe457 Met, Ala, Leu, Ile, Val
Понятно, что любая аминокислота, которая упомянута в табл. 3, может быть использована в качестве заместителя. Испытания по тестированию функциональности таких мутантов являются доступными специалистам и соответственно описаны в разделе примеров данного изобретения.
В предпочтительном варианте аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности ППО SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 в одной или более из следующих позиций: 397, 420.
Примеры различий этих аминокислотных позиций включают, но не ограничиваются ими, один или более из следующих:
аминокислота в позиции 397 является отличной от лейцина (Leu);
аминокислота в позиции 420 является отличной от фенилаланина (Phe).
В некоторых вариантах мут-ППО энзим SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 включает одно или более из следующего:
аминокислота в позиции 397 является Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln;
аминокислота в позиции 420 является Val, Met, Ala, Ile или Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант, производное, ортолог, паралог или гомолог ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Tyr, Trp, Asp, Glu, Asn, Gln, His, Lys или Arg и аминокислота в позиции 420 является Met, Ala, Leu, Ile или Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, гомолог, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 явля
- 42 036015 ется Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант, производное, ортолог, паралог или гомолог ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант, производное, ортолог, паралог или гомолог ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант, производное, ортолог, паралог или гомолог ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Ile.
- 43 036015
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Val.
- 44 036015
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Tyr, Trp, Asp, Glu, Asn, Gln, His, Lys, Arg и аминокислота в позиции 420 является Met, Ala, Leu, Ile, Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gly и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Ile.
- 45 036015
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ala и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ser и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Thr и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Cys и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Val и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Ile и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Met и аминокислота в позиции 420 является Val.
- 46 036015
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Pro и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант, производное, ортолог, паралог или гомолог ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Tyr и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Trp и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asn и аминокислота в позиции 420 является Val.
- 47 036015
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является His и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Lys и аминокислота в позиции 420 является Val.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Met.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Ala.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Leu.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Ile.
В другом предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Arg и аминокислота в позиции 420 является Val.
В более предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Val.
В более предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Glu и аминокислота в позиции 420 является Met.
В более предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Val.
В более предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Gln и аминокислота в позиции 420 является Met.
В более предпочтительном варианте мут-ППО включает последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, вариант ее, в которой аминокислота в позиции 397 является Asp и аминокислота в позиции 420 является Val.
В пределах знаний специалистов находится идентификация сохраненных областей или мотивов общих для гомологов, ортологов и паралогов, кодированных SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45, таких как приведенные в табл. 1. Будучи идентифицированными, такие сохраненные области, которые могут представлять собой пригодные связывающие мотивы, аминокислоты, соответствующие аминокислотам, приведенным в табл. 3a и 3b, могут быть выбраны для замещения любой другой аминокислотой, предпочтительно сохраненными аминокислотами, как показано в табл. 2, и более предпочтительно аминокислотами табл. 3a и 3b.
- 48 036015
Под контрольной клеткой или подобным, дикого типа растением, тканью растения, клеткой растения или клеткой хозяина понимают растение, ткань растения, клетку растения или клетку хозяина соответственно, у которых отсутствуют характеристики устойчивости к гербицидам и/или характерный полинуклеотид данного изобретения, который раскрыт здесь. Использование термина дикий тип не должно в связи с этим предполагать, что у растения, ткани растения, клетки растения или другой клетки хозяина отсутствуют рекомбинантные ДНК в их геномах и/или что они не обладают характеристиками устойчивости к гербицидам, которые отличны от таковых, раскрытых здесь.
Устойчивость или толерантность можно определить путем создания трансгенного растения или клетки хозяина, предпочтительно клетки растения, включающей нуклеиновокислотную последовательность библиотеки со стадии a) и сравнения этого трансгенного растения с контрольным растением или клеткой хозяина, предпочтительно клеткой растения.
Доступны много способов, хорошо известных специалистам, для получения подходящих претендентных нуклеиновых кислот для идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей мутППО из ряда различных возможных источниковых организмов, включая микробы, растения, грибы, водоросли, смешанные культуры и т.д., а также источников ДНК из окружающей среды, таких как почва. Эти способы включают, среди прочего, приготовление библиотек сДНК или геномных ДНК, использование подходящих вырожденных олигонуклеотидных инициаторов, использование проб, базирующихся на известных последовательностях или комплементарных опытах (например, для выращивания в присутствии тирозина), а также таких, как использование мутагенеза или тасования, для того чтобы обеспечить рекомбинированные или тасованные мут-ППО кодирующие последовательности.
Нуклеиновые кислоты, включающие претендентную и контрольную ППО кодирующие последовательности, можно экспрессировать в дрожжах, в линии хозяина бактерии, в водоросли или в высшем растении, таком как табак или Arabidopsis, и провести скрининг относительных уровней внутренне присущей толерантности ППО кодирующих последовательностей согласно видимому индикатору фенотипа трансформированной линии растения в присутствии различных концентраций выбранного ППО ингибирующего гербицида. Реакция на дозу и относительные сдвиги в реакции на дозу, связанные с этим индикаторным фенотипом (образование коричневого окрашивания, рост ингибирования, гербицидный эффект и т.д.), удобно выражаются в терминах, например GR50 (концентрация, при которой рост уменьшается на 50%) или MIC (минимальная ингибирующая концентрация) величины возрастают по величине в соответствии с внутренне присущей толерантностью экспрессированной ППО. Например, при относительно быстрой системе испытаний, базирующейся на трансформации бактерии, такой как Е.сой, каждая мут-ППО кодирующая последовательность может быть экспрессирована, например, такая как DNA последовательность под экспрессионным контролем контролируемого промотора, такого как lacZ промотор, и принимая во внимание, например, при использовании синтетической ДНК такие воздействия, как использование кодона, для того чтобы получить сравнимый по возможности уровень экспрессии различных ППО последовательностей. Такие линии экспрессирующих нуклеиновых кислот, включающие альтернативные претендентные ППО последовательности, можно поместить в различные концентрации выбранных ППО ингибирующих гербицидов, при необходимости, в среду, дополненную тирозином, и определить относительные уровни внутренне присущей толерантности экспрессированных ППО энзимов на основе степени и MIC для ингибирования с образованием коричневого, охронотичного пигмента.
В другом варианте претендентные нуклеиновые кислоты, трансформированные в растительный материал для создания трансгенного растения, регенерируют в морфологически нормальные фертильные растения, которые затем измеряют на различие толерантности к выбранным ППО-ингибирующим гербицидам.
Специалистам хорошо известны многие пригодные способы трансформирования с использованием подходящих селекционных маркеров, таких как канамицин, бинарные векторы, такие как из Agrobacterium, и регенерации растения, такого как, например, из дисков табачных листьев. При желании, контрольную популяцию растений таким же образом трансформируют нуклеиновой кислотой, экспрессируя контрольную ППО. Альтернативно, ^трансформированное двудольное растение, такое как Arabidopsis или Tobacco, может быть использовано в качестве контроля, так как оно в любом случае экспрессирует собственный эндогенный ППО. Среднее и распределение уровней толерантности к гербицидам ряда первичных событий трансформаций растений или их прогенов к ППО ингибирующим гербицидам, описанное выше, определяют нормальным образом, опираясь на повреждение растения, меристематические симптомы отбеливания и т.д. при ряде различных концентраций гербицидов. Эти данные могут быть выражены в терминах, например, GR50 величин, получаемых из кривых доза/отклик, в которых дозу откладывают на x-оси и процент убивания, гербицидный эффект, число появившихся зеленых растений и т.д. откладывают на y-оси, причем возросшие GR50 значения соответствуют повышенному уровню собственной присущей толерантности экспрессированных ППО. Гербициды в зависимости от обстоятельств могут применяться перед всходами или после всходов.
Термин экспрессия/экспрессирование или экспрессия гена означает транскрипцию специфического гена или специфических генов или специфической генной конструкции. Термин экспрессия или экспрессия гена, в частности, означает транскрипцию гена или генов или генной конструкции в струк- 49 036015 турные РНК (rPHK, tPHK) или мРНК с или без последующей трансляции последней в белок. Процесс включает транскрипцию ДНК и обработку результирующего мРНК продукта.
Для получения желательного эффекта, т.е. растений, которые толерантны или устойчивы к ППО ингибирующему гербициду, производному гербициду данного изобретения, должно быть понятно, что как минимум одна нуклеиновая кислота должна быть сверхэкспрессированной способами и путями, которые известны специалистам.
Термин повышенная экспрессия или сверхэкспрессия, как используется здесь, означает форму экспрессии, которая является дополнительной к оригинальному дикого типа уровню экспрессии. Способы повышения экспрессии генов и генных продуктов хорошо задокументированы по видам и включают, например, сверхэкспрессию, управляемую подходящими промоторами, использование транскрипционных усиливающих агентов или трансляционных усиливающих агентов. Изолированные нуклеиновые кислоты, которые служат в качестве промоторных или усиливающих элементов, могут быть введены в подходящую позицию (типично выше по течению) негетерологической формы полинуклеотида таким образом, чтобы регулировать сверхэкспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий полипептид. Например, эндогенные промоторы могут быть изменены in vivo путем мутации, стирания и/или замещения (см. Kmiec, US 5565350; Zarling et al., WO 93/22443) или могут быть введены изолированные промоторы в клетку растения в подходящей ориентации и в подходящем расстоянии от гена данного изобретения, для того чтобы контролировать экспрессию гена.
Если желательна экспрессия полипептида, то, как правило, желательно включение области полиаденилирования у 3'-конца области, кодирующей полинуклеотид. Область полиаденилирования может быть получена из естественного гена, из ряда других растительных генов или из Т-ДНК. 3'-концевая последовательность, которую следует добавить, может быть получена, например, из гена нопалин синтазы или октопин синтазы, или, альтернативно, из другого растительного гена, или менее предпочтительно из любого другого эукариотического гена.
Интронная последовательность может быть также добавлена к 5'-нетранслированной области (UTR) или кодирующей последовательности частично кодирующей последовательности, для того чтобы увеличить число зрелых сообщений, которые аккумулируются в цитозоле. Было показано, что включение способного к сращиванию интрона в транскрипционную единицу как в растительную, так и в животную экспрессионные конструкции приводит к увеличению уровней экспрессии гена как в мРНК, так и в белке до 1000-кратных (Buchman и Berg, (1988), Mol. Cell biol., 8: 4395-4405; Callis et al., (1987), Genes Dev., 1:1183-1200). Такое интронное повышение экспрессии гена является типически самым большим, если размещают вблизи 5'-конца транскрипционной единицы. Использование кукурузных интронов Adh1-S интрон 1, 2 и 6, бронзы-1 интрона известно специалистам. Для общей информации см. The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling и Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
Термин введение или трансформация, как ссылаются здесь, охватывает перенос экзогенного полинуклеотида в клетку хозяина безотносительно от использованного способа переноса. Растительные ткани, способные к последующему клональному размножению в результате или органогенеза, или эмбриогенеза, могут быть трансформированы с помощью генетических конструкций данного изобретения, и из них регенерируют целое растение. Характерные выбранные ткани могут варьироваться в зависимости от доступной клональной системы размножения и лучше подходящей для того, чтобы подходящие виды были трансформированы. Примеры целевых тканей включают диски листьев, цветочную пыльцу, эмбрионы, семядоли, гипокотили, мегагаметофиты, каллусовую ткань, существующие меристематические ткани (например, верхушечная меристема, пазушные зародыши и корневые меристемы) и индуцированные меристемные ткани (например, меристема семядоли и меристема гипокотиля). Полинуклеотид может быть временно или стабильно введен в клетку хозяина и может быть установлен не интегрировано, например, в качестве плазмида. Альтернативно он может быть интегрирован в геном хозяина. Результирующая трансформированная растительная клетка может быть затем использована для регенерации трансформированного растения известным специалистам образом.
Перенос чужих генов в геном растения называется трансформацией. Трансформация вида растения представляет сейчас рутинную технику. Преимущественно может быть использован любой из нескольких способов трансформации, для того чтобы ввести представляющий интерес ген в прародительскую клетку. Способы, описанные для трансформации и регенерации растений из растительных тканей или растительных клеток, могут быть использованы для временной или стабильной трансформации. Способы трансформации включают использование липосом, электропорации, химикалиев, которые увеличивают свободное поглощение ДНК, инъекцию ДНК напрямую в растение, пушку для бомбардировки частицами, трансформации, используя вирусы или цветочную пыльцу и микропроекцию. Способы могут быть выбраны из кальций/полиэтиленгликолевого способа для протопластов (Krens, F.A. et al., (1982), Nature, 296, 72-74; Negrutiu I. et al., (1987), Plant Mol. Biol., 8:363-373); электропорации протопластов (Shillito R.D. et al., (1985), Bio/Technol., 3, 1099-1102); микроинъекции в растительный материал (Crossway А. et al., (1986), Mol. Gen Genet., 202:179-185); бомбардировки частицами, покрытыми ДНК или РНК (Klein T.M. et al., (1987), Nature, 327:70), инфекции (не-интегративной) вирусами и т.п. Трансгенные растения, включая трансгенные сельскохозяйственные растения, предпочтительно получают че- 50 036015 рез Agrobacterium-опосредованную трансформацию. Полезный способ трансформации представляет собой трансформацию в растении. Наконец, можно, например, позволить agrobacteria воздействовать на семена растений или привить agrobacteria растительной меристеме. Оказалось особенно целесообразным в согласии с данным изобретением позволить суспензии трансформированной agrobacteria воздействовать на неповрежденное растение или, как минимум, на первичный цветок. Растение затем выращивают до получения семян обработанного растения (Clough и Bent, Plant J., (1998), 16, 735-743). Способы Agrobacterium-опосредованной трансформации риса включают хорошо известные способы трансформации риса, такие как описанные в одном из следующих источников: Европейская патентная заявка EP 1198985 A1, Aldemita и Hodges (Planta, 199: 612-617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol., 22 (3):491-506, 1993), Hiei et al., (Plant J., 6(2):271-282, 1994), эти раскрытия включены здесь в качестве ссылки в полном объеме. В случае трансформации кукурузы предпочтителен способ, который описан или Ishida et al. (Nat. Biotechnol., 14(6):745-50, 1996), или Frame et al. (Plant Physiol., 129(1):13-22, 2002), причем эти раскрытия включены здесь в качестве ссылки в полном объеме. Эти способы далее описаны, например, в статье В. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, в книге: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung и R. Wu, Academic Press (1993), 128-143, и в Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 42, (1991) 205-225). Нуклеиновая кислота или конструкция, подлежащая экспрессии, предпочтительно клонируется в вектор, который пригоден для трансформирования Agrobacterium tumefaciens, например pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res., 12, (1984), 8711). Agrobacteria, трансформированная таким вектором, может быть затем использована известным образом для трансформации растений, таких как растения, используемые в качестве моделей, подобные Arabidopsis (Arabidopsis thaliana в пределах охвата данного изобретения не рассматривается как сельскохозяйственное растение), или сельскохозяйственные растения, такие как, например, растения табака, например, путем погружения растолченных листьев или рубленных листьев в агробактериальный раствор и последующего их культивирования в подходящей среде. Трансформация растений посредством Agrobacterium tumefaciens описана, например, Hofgen и Willmitzer в Nucl. Acid Res., (1988) 16, 9877 или известна, среди прочего, из F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, в книге Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15-38.
В дополнение к трансформации соматических клеток, которые затем подлежат регенерации в неповрежденные растения, также возможно трансформирование клеток меристем растения и, в частности, таких клеток, которые развиваются в гаметы. В этом случае трансформированные гаметы следуют естественному развитию растения, давая начало трансгенным растениям. Так, например, семена Arabidopsis обрабатывают агробактерией и получают семена от развившихся растений, из которых определенная часть оказалась трансформированной и, таким образом, трансгенной [Feldman, K.A. и Marks M.D., (1987), Mol. Gen Genet., 208:274-289; Feldmann K., (1992), в книге: C. Koncz, N.-H. Chua и J. Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research, Word Scientific, Singapore, p. 274-289]. Альтернативные способы основываются на повторном удалении соцветий и инкубировании места вырезания в центре розетки с трансформированной агробактерией, в соответствии с этим трансформированные семена могут быть получены аналогичным образом в более позднее время (Chang, (1994), Plant J., 5:551-558; Katavic, (1994), Mol. Gen Genet., 245: 363-370). Однако очень эффективным способом является способ вакуумной инфильтрации с его модификациями, такими как способ окунания цветка. В случае вакуумной инфильтрации Arabidopsis неповрежденные растения при пониженном давлении обрабатывают агробактериальной суспензией [Bechthold, N., (1993), C R Acad Sci. Paris Life Sci., 316:1194-1199], в то время как в случае способа окунания цветка развивающуюся ткань цветка недолго инкубируют с обработанной поверхностно-активным веществом агробактериальной суспензией [Clough, S.J. и Bent A.F., (1998), The Plant J., 16, 735-743]. Определенную долю трансгенных семян собирают в качестве урожая в обоих случаях, и эти семена могут отличаться от нетрансгенных растений путем выращивания при описанных выше селективных условиях. Кроме того, подходящая трансформация пластидов является предпочтительной, так как пластиды являются наследующими по материнской линии, что в большинстве сельскохозяйственных культур уменьшает или устраняет риск переноса трансгенов через пыльцу. Трансформация генома хлоропласта, как правило, достигается с помощью процесса, который схематически представлен в Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology, 22(2), 225-229]. Кратко говоря, последовательности, подлежащие трансформированию, клонируют вместе с селекционным маркерным геном между боковыми последовательностями, гомологическими к хлоропластовому геному. Эти гомологические боковые последовательности направляют место специфического интегрирования в пластом. Пластидные трансформации были описаны для многих различных видов растений и обзор по этому вопросу приведен в Bock, (2001), Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology, J. Mol. Biol., 2001, Sep 21; 312(3):425-38 или в Maliga, P., (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology, Trends Biotechnol., 21, 20-28. О дальнейшем биотехнологическом прогрессе недавно сообщалось в форме маркера свободного пластидного трансформанта, который может быть получен путем временного соинтегрированного маркерного гена (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology, 22(2), 225-229). Генетически измененная клетка растения может быть регенерирована всеми способами, с которыми хорошо знакомы специалисты. Подходящие способы можно найти в упомянутых выше публикациях S.D. Kung и R. Wu, Potrykus или Hofgen и
- 51 036015
Willmitzer.
Как правило, после трансформации проводят отбор растительных клеток или групп клеток по присутствию одного или более маркеров, которые закодированы растительно-экспрессионными генами, соперенесенными с представляющими интерес генами, после чего трансформированный материал регенерируют в целое растение. Для того чтобы отобрать трансформированные растения, растительный материал, полученный при трансформации, подвергают, как правило, условиям отбора, так что трансформированные растения можно отличить от ^трансформированных растений. Например, семена, полученные описанным выше способом, могут быть высажены и после начального периода роста подвергнуты отбору (селекции) путем опрыскивания. Другая возможность состоит в выращивании семян, при необходимости после стерилизации, на агаровых пластинках с использованием подходящих селекционных агентов, так что только трансформированные семена могут вырастать в растения. Альтернативно, проводят скрининг трансформированных растений на присутствие селективного маркера, такого как один из описанных выше.
В дальнейшем возможные трансформированные растения с ДНК переносом и регенерацией могут быть также определены, например, при использовании Southern анализа на присутствие представляющих интерес генов, число копий и/или геномную организацию. Альтернативно или дополнительно, можно провести мониторинг экспрессионных уровней вновь введенной ДНК с использованием Northern и/или Western анализа, обе технологии хорошо известны специалистам в этой области.
Созданные трансформированные растения могут быть размножены различными путями, такими как клональное размножение или классические технологии размножения. Например, первое поколение (или T1) трансформированного растения может быть самоопылено и отобрана гомозиготная вторая генерация (или T2) трансформированных растений, и T2 растения могут быть далее размножены с помощью классических технологий размножения. Созданные трансформированные организмы могут принимать ряд форм. Например, они могут быть химерами трансформированных клеток и не трансформированных клеток; клональными трансформантами (например, все клетки трансформированы с содержанием экспрессионной кассеты); живцами трансформированных и не трансформированных тканей (например, в растениях трансформированный корневой побег превращается в не трансформированный росток).
Предпочтительно мут-ППО нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, которая включает:
a) полинуклеотид, как показано в SEQ ID NO: 1 или 3, или его вариант;
b) полинуклеотид, кодирующий полипептид, как показано в SEQ ID NO: 2 или 4, или его вариант.
Предпочтительно экспрессия нуклеиновой кислоты в растении приводит к повышенной устойчивости растения к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа растения.
В другом варианте изобретение относится к растению, предпочтительно трансгенному растению, включающему клетку растения согласно данному изобретению, в котором экспрессия нуклеиновой кислоты в растении приводит к повышенной устойчивости растения к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа растения.
Описанные здесь растения могут быть или трансгенными сельскохозяйственными растениями или не трансгенными растениями.
Для целей данного изобретения термины трансгенный, трансген или рекомбинантный означают по отношению, например, к нуклеиновокислотной последовательности, экспрессионную кассету, генную конструкцию или вектор, включающий нуклеиновокислотную последовательность, или организм, трансформированный нуклеиновокислотной последовательностью, экспрессионной кассетой или вектором согласно данному изобретению, все такие конструкции связаны с рекомбинантными способами, в которых:
(a) нуклеиновокислотные последовательности, которые кодируют белки, полезные в способах данного изобретения; или (b) генетическая контрольная(ые) последовательность(и), которая оперативно связана с нуклеиновокислотной последовательностью согласно данному изобретению, например промотор; или (c) a) и b) не локализованы в их естественном генетическом окружении или были модифицированы рекомбинантными способами, существует возможность для модификации принимать форму, например, замещения, дополнения, стирания, перестановки или введения одного или более нуклеотидных остатков.
Под естественным генетическим окружением понимают по смыслу естественный геномный или хромосомный локус в оригинальном растении или присутствие в геномной библиотеке. В случае геномной библиотеки естественное генетическое окружение нуклеиновокислотной последовательности предпочтительно сохраняется, как минимум, частично. Окружающие фланги нуклеиновокислотной последовательности как минимум на одной стороне имеют длину последовательности как минимум 50 п.о. (пар оснований), предпочтительно как минимум 500 п.о., более предпочтительно как минимум 1000 п.о., еще более предпочтительно как минимум 5000 п.о. Естественно встречающаяся экспрессионная кассета, например естественно встречающаяся комбинация естественного промотора нуклеиновокислотных последовательностей с соответствующей нуклеиновокислотной последовательностью, кодирующей полипеп- 52 036015 тид, полезный в способах данного изобретения, как определено выше, становится трансгенной экспрессионной кассетой, когда эта экспрессионная кассета модифицирована не естественными, синтетическими (искусственными) способами, такими как, например, мутагенная обработка. Подходящие способы описаны, например, в US 5565350 или WO 00/15815.
Под трансгенным растением для целей данного изобретения, таким образом, следует понимать, как указано выше, такое, у которого нуклеиновая кислота, используемая в способе изобретения, находится не в ее естественном локусе в геноме этого растения, существует возможность того, что нуклеиновая кислота может быть экспрессирована гомологично или гетерологично. Однако, как упоминалось, трансгенный также означает, что, в то время как нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению или используемые в способе данного изобретения находились в их естественной позиции в геноме растения, последовательность была модифицирована по отношению к естественной последовательности и/или что регуляторные последовательности естественных последовательностей были изменены. Под трансгенным предпочтительно следует понимать как означающее экспрессию нуклеиновых кислот согласно данному изобретению в не естественном локусе в геноме, т.е. имеет место гомологическая или предпочтительно гетерологическая экспрессия нуклеиновых кислот. Предпочтительные трансгенные растения упомянуты здесь. Кроме того, термин трансгенный относится к любому растению, клетке растения, каллуса, ткани растения или части растения, которая содержит весь или часть как минимум одного рекомбинантного полинуклеотида. Во многих случаях весь или часть как минимум одного рекомбинантного полинуклеотида стабильно интегрирована в хромосому или стабильный экстрахромосомный элемент, так что он передается последующим поколениям. Для целей данного изобретения термин рекомбинантный полинуклеотид относится к полинуклеотиду, который был изменен, перегруппирован или модифицирован с помощью генной инженерии. Примеры включают любой клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, которые соединены или присоединены к гетерологическим последовательностям. Термин рекомбинантный не относится к изменениям полинуклеотидов, которые являются результатом естественно происходящих событий, таких как спонтанные мутации, или не спонтанный мутагенез, за которым следует селективное размножение.
Растения, содержащие мутации, возникающие при не спонтанном мутагенезе, и селективно размноженные, отнесены здесь к не трансгенным растениям и включены в данное изобретение. В вариантах, в которых растение является трансгенным и включает многочисленные мут-ППО нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты могут быть получены из различных геномов или из одного и того же генома. Альтернативно, в вариантах, в которых растение не является трансгенным и включает многочисленные мутППО нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты локализованы в различных геномах или в одном и том же геноме.
В некоторых вариантах данное изобретение включает устойчивые к гербицидам растения, которые получены мутационным размножением. Такие растения включают полинуклеотид, кодирующий мутППО, и являются толерантными к одному или более ППО ингибирующих гербицидов. Такие способы включают, например, экспонирование растений или семян в присутствии мутагена, в частности химического мутагена, такого как, например, этилметансульфонат (ЭМС), и селекции растений, которые имеют повышенную толерантность как минимум к одному или более ППО ингибирующим гербицидам.
Однако данное изобретение не ограничивается толерантными к гербициду растениями, которые получают в результате способов мутагенеза, включая химический мутаген ЭМС. Любые способы мутагенеза, известные специалистам, могут быть использованы для получения устойчивых к гербициду растений данного изобретения. Такие способы мутагенеза включают, например, любой один или более из следующих мутагенов: радиация, такая как X-лучи, гамма-лучи (например, кобальт 60 или цезий 137), нейтроны (например, продукты ядерного распада урана 235 в атомном реакторе), бета-радиация (например, эмитированная радиоизотопами, такими как фосфор 32 или углерод 14), ультрафиолетовое излучение (предпочтительно от 250 до 290 нм) и химический мутагенез, такой как аналоги основания (например, 5-бромоурацил), родственные соединения (например, 8-этоксикофеин), антибиотики (например, стрептонигрин), алкилирующие агенты (например, серные горчицы, азотные горчицы, эпоксиды, этиленамины, сульфаты, сульфонаты, сульфоны, лактоны), азиды, гидроксиламин, азотистая кислота или акридины. Устойчивые к гербициду растения могут быть также получены при использовании способов тканевых культур для отбора клеток растений, включающих мутации, устойчивые к гербицидам, и последующего регенерирования из них устойчивых к гербицидам растений, см., например, патенты США № 5773702 и 5859348, каждый из которых включен здесь во всей полноте в качестве ссылки. Другие подробности мутационного размножения можно найти в книге Principals of Cultivar Development, Fehr, 1993, Macmillan Publishing Company, раскрытые там сведения включены здесь в качестве ссылки.
В дополнение к приведенным выше определениям, термин растение подразумевает охват сельскохозяйственных растений на любой стадии зрелости или развития, а также любых тканей или органов (частей растения), взятых или полученных из любого такого растения, за исключением другого, о котором ясно указано в контексте. Части растения включают, но не ограничиваются ими, стволы, корни, цветы, семяпочки, тычинки, листья, эмбрионы, меристематические области, ткани каллуса, пыльниковые культуры, гаметофиты, спорофиты, пыльцу, микроспоры, протопласты и т.п.
- 53 036015
Растение данного изобретения включает как минимум одну мут-ППО нуклеиновую кислоту или сверхэкспрессированную дикого типа ППО нуклеиновую кислоту и имеет повышенную толерантность к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа растения. Существует возможность того, что растения данного изобретения имеют многие дикого типа или мут-ППО нуклеиновые кислоты из различных геномов, поскольку эти растения могут содержать более чем один геном. Например, растение содержит два генома, обычно относимые как A и B геномы. В связи с тем, что ППО является необходимым метаболическим энзимом, предполагают, что каждый геном имеет как минимум один ген, кодирующий ППО энзим (например, как минимум один ППО ген). Как использовано здесь, термин локус ППО гена относится к позиции ППО гена в геноме и термины ППО ген и ППО нуклеиновая кислота относятся к нуклеиновой кислоте, кодирующей ППО энзим. ППО нуклеиновая кислота в каждом геноме отличается в ее нуклеотидной последовательности от ППО нуклеиновой кислоты на другом геноме. Специалисты могут определить геном происхождения каждой ППО нуклеиновой кислоты путем скрещивания генов и/или способами определения последовательностей или способами ферментативного расщепления экзонуклеазы, которые известны специалистам.
Данное изобретение включает растения, охватывающие один, два, три или более мут-ППО аллелей, причем растение имеет повышенную толерантность к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа растения. Мут-ППО могут охватывать нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, включающей такой полинуклеотид, как определено в SEQ ID NO: 1 или 3, или их вариант, полинуклеотид кодирующий такой полипептид, как определено в SEQ ID NO: 2 или 4, или их вариант.
Аллели или аллельные варианты являются альтернативными формами данного гена, локализованными в той же хромосомной позиции.
Аллельные варианты охватывают единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNPs), а также небольшие встраивания/стирания полиморфизмы (INDELs). Размеры INDELs обычно меньше чем 100 п.о. (пар оснований). SNPs и INDELs формируют самый большой ряд вариантов последовательностей в естественно встречающихся полиморфных линиях большинства организмов.
Термин разновидность относится к группе растений внутри вида, определяемых наличием общего ряда характеристик или свойств, принимаемых специалистами в качестве достаточных для различения одного культурного сорта растения или разнообразия от другого культурного сорта растения или разнообразия. Ни в одном из терминов не предполагается, что все растения любого данного культурного сорта растения или разнообразия являются генетически идентичными на каждом из всех генов или молекулярных уровней или что любое данное растение будет гомозиготным во всех локусах. Культурный сорт растения или разнообразие рассматривается чистосортный для определенного свойства, если чистосортный культурный сорт растения или разнообразие является самоопыляемым, все прогены имеют это свойство. Термины линия размножения или линия относятся к группе растений внутри культурного сорта растения, определяемых наличием общего ряда характеристик или свойств, принимаемых специалистами в качестве достаточных для различения одной линии размножения или линии от другой линии размножения или линии. Ни в одном из терминов не предполагается, что все растения любой данной линии размножения или линии являются генетически идентичными на каждом из всех генов или молекулярных уровней или что любое данное растение будет гомозиготным во всех локусах. Линия размножения или линия рассматривается как чистосортная для определенного свойства, если чистосортная линия или размноженная линия является самоопыляемой, все прогены имеют это свойство. В данном изобретении свойство возникает в результате мутации в ППО гене растения или семени.
Устойчивые к гербицидам растения данного изобретения, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие мут-ППО полипептиды, также находят применение в способах увеличения устойчивости к гербицидам растения путем обычного размножения растений, включая половую репродукцию. Эти способы включают скрещивание первого растения, которое является устойчивым к гербициду растением данного изобретения, со вторым растением, которое может быть или не быть устойчивым к тому же самому гербициду или гербицидам, что и первое растение, или может быть устойчивым к гербициду или гербицидам, отличным от таковых первого растения. Второе растение может быть любым растением, которое способно производить жизнеспособные потомственные растения (например, семена), когда его скрещивают с первым растением. Типично, но неизбежно, когда первое растение и второе растение относятся к тому же самому виду. Способы могут при необходимости включать селекцию потомственных растений, которые включают мут-ППО полипептиды первого растения и характеристики устойчивости к гербициду второго растения. Потомственные растения, полученные способом данного изобретения, обладают повышенной устойчивостью к гербициду, если сравнивать с первым или вторым растением или с обоими. В том случае, когда первое и второе растения устойчивы к различным гербицидам, потомственные растения будут иметь комбинированные характеристики толерантности к гербицидам первого и второго растений. Способы данного изобретения могут далее включать одно или более поколений перекрестного скрещивания потомственных растений первого скрещивания с растением той же самой линии или генотипа, как первое растение или как второе растение. Альтернативно, потомки первого скрещивания или любого последующего скрещивания могут быть скрещены с третьим растением, которое относится к
- 54 036015 отличающейся линии или генотипу, чем первое или второе растение. Данное изобретение также обеспечивает растения, органы растений, ткани растений, клетки растений, семена и не человеческие клетки хозяина, которые трансформированы как минимум одной полинуклеотидной молекулой, экспрессионной кассетой или трансформационным вектором данного изобретения. Такие трансформированные растения, органы растений, ткани растений, клетки растений, семена и не человеческие клетки хозяина имеют повышенную толерантность или устойчивость как минимум к одному гербициду при уровнях гербицида, которые убивают или ингибируют рост не трансформированных растений, органов растений, тканей растений, клеток растений, семян и не человеческих клеток хозяина соответственно. Предпочтительно трансформированные растения, органы растений, ткани растений, клетки растений и семена данного изобретения представляют собой Arabidopsis thaliana и сельскохозяйственные растения.
Понятно, что соединение данного изобретения может содержать дикий тип ППО нуклеиновой кислоты в дополнение к мут-ППО нуклеиновой кислоте. Можно себе представить, что линии, толерантные к ППО ингибирующему гербициду, могут содержать мутацию только в одном множественном ППО изоэнзиме. Поэтому данное изобретение включает растение, содержащее одну или более мут-ППО нуклеиновых кислот в дополнение к одной или более дикого типа ППО нуклеиновых кислот.
В другом варианте изобретение относится к семени, произведенному трансгенным растением, содержащим клетку растения данного изобретения, причем семя растения является чистосортным для повышенной устойчивости к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа семени.
В другом варианте изобретение относится к способу получения клетки трансгенного растения с повышенной устойчивостью к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа клетки растения, включающему трансформирование клетки растения экспрессионной кассетой, содержащей мут-ППО нуклеиновую кислоту.
В другом варианте изобретение относится к способу получения трансгенного растения, включающему:
(a) трансформирование клетки растения экспрессионной кассетой, содержащей мут-ППО нуклеиновую кислоту; и (b) создание растения с повышенной устойчивостью к ППО ингибирующему гербициду из этой клетки растения.
Следовательно, мут-ППО нуклеиновыми кислотами данного изобретения обеспечены экспрессионные кассеты для экспрессии представляющих интерес растений. Кассета включает регуляторные последовательности, оперативно связанные с мут-ППО нуклеиновокислотной последовательностью данного изобретения. Термин регуляторный элемент, как использовано здесь, относится к полинуклеотиду, который способен регулировать транскрипцию оперативно связанного полинуклеотида. Он включает, но не ограничивается ими, промоторы, усиливающие агенты, интроны, 5' UTRs и 3' UTRs. Под оперативно связанным понимают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, причем промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию ДНК последовательности, соответствующей второй последовательности. Как правило, оперативно связанный означает, что нуклеиновокислотные последовательности будучи связанными являются непрерывными и, если необходимо связать две кодирующие белок области, непрерывны и находятся в том же самом считывающем каркасе. Кассета может дополнительно содержать как минимум один дополнительный ген, для того что быть сотрансформированной в организм. Альтернативно, дополнительный(ые) ген(ы) может(гут) быть обеспечен(ы) на множественных экспрессионных кассетах.
Такая экспрессионная кассета обеспечивается множеством ограничивающих мест для встраивания мут-ППО нуклеиновокислотной последовательности, которая должна быть под транскрипциональным регулированием регуляторной области. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать селекционные маркерные гены.
Экспрессионная кассета данного изобретения должна включать в 5'-3' направлении транскрипции транскрипционную и трансляционную инициационную область (например, промотор), мут-ППО нуклеиновокислотную последовательность данного изобретения и транскрипциональную или трансляциональную завершающую область (например, завершающую область), функциональную в растениях. Промотор может быть родным или аналоговым или чужим или гетерологическим по отношению к растениюхозяину и/или к мут-ППО нуклеиновокислотной последовательности данного изобретения. Кроме того, промотор может быть естественной последовательностью или, альтернативно, синтетической последовательностью. Если промотор является чужим или гетерологическим к растению-хозяину, то это подразумевает, что промотор не обнаружен в родном растении, в которое введен этот промотор. Если промотор является чужим или гетерологическим по отношению к мут-ППО нуклеиновокислотной последовательности данного изобретения, то подразумевается, что этот промотор не является родным или естественно встречающимся промотором для оперативно связанной мут-ППО нуклеиновокислотной последовательности данного изобретения. Как использовано здесь, химерный ген включает кодирующую последовательность, оперативно связанную с транскрипционной инициационной областью, которая является гетерологической по отношению к кодирующей последовательности.
- 55 036015
Если это может оказаться предпочтительным для экспрессии мут-ППО нуклеиновых кислот данного изобретения, использующих гетерологические промоторы, то может быть использована родная промоторная последовательность. Такие конструкции будут менять экспрессионные уровни мут-ППО белка в растении или клетке растения. Таким образом, фенотип растения или клетки растения изменяется.
Завершающая область может быть родной с транскрипционной инициационной областью, может быть родной с оперативно связанной мут-ППО последовательностью, представляющей интерес, может быть родной с растением-хозяином или может быть получена из другого источника (например, чужого или гетерологического для промотора, мут-ППО нуклеиновокислотной последовательности представляющей интерес, для растения-хозяина или любой их комбинации). Подходящие завершающие области могут быть доступны из Ti-плазмида A.tumefaciens, такие как завершающие области октопин синтазы и нопалин синтазы, см. также Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 262:141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64:671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev., 5:141-149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91:151-158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17:7891-7903 и Joshi et al., (1987), Nucleic Acids Res., 15:9627-9639, где соответственно ген(ы) может быть оптимизирован для увеличенной экспрессии в трансформированном растении. Дело в том, что гены могут быть синтезированы, используя предпочтительные для растения кодоны для улучшенной экспрессии, см., например, Campbell и Gowri, (1990), Plant Physiol., 92:1-11 относительно обсуждения использования предпочтительных для хозяина кодонов. Способы доступны специалистам для синтеза предпочтительных для растения генов, см., например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Murray et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17:477-498, включенные здесь в качестве ссылки.
Известны дополнительные модификации последовательности для повышения экспрессии гена в клетке хозяина. Они включают удаление последовательности, кодирующей ложные сигналы полиаденелирования, сигналы места сращивания экзон-интрона, подобные транспозону повторы и другие, такие как хорошо характеризуемые последовательности, которые могут быть вредны для экспрессии гена. G-C содержание последовательности может быть отрегулировано до уровней средних для данной клетки хозяина, как рассчитано по отношению к известным генам, экспрессированным в клетке хозяина. Если возможно, последовательность модифицируют для избегания предсказанных шпилек вторичных мРНК структур. Нуклеотидные последовательности для повышенной экспрессии гена могут также использоваться в экспрессионных векторах растения. Они включают интроны кукурузы Adh1, интрон1 гены (Callis et al., Genes and Development, 1: 1183-1200, 1987) и ведущие последовательности, (W-последовательность) из вирусов Tobacco Mosaic Virus (TMV), Maize Chlorotic Mottle Virus и Alfalfa Mosaic Virus (Gallie et al., Nucleic Acids Res., 15:8693-8711, 1987, и Skuzeski et al., Plant Mol. Biol., 15:6579, 1990). Было показано, что первый интрон из редуцированного-1 локуса кукурузы увеличивает экспрессию генов в химерных генных конструкциях. В патентах США № 5424412 и 5593874 раскрыто использование специфических интронов в генных экспрессионных конструкциях, a Gallie et al., (Plant Physiol., 106:929-939, 1994) также показали, что интроны являются полезными для регулирования экспрессии гена на специфической основе ткани. Для дальнейшего повышения или для оптимизации мутППО генной экспрессии экспрессионные векторы растения данного изобретения могут также содержать ДНК последовательности, содержащие матричные присоединительные области (MARs). Клетки растений, трансформированные такой модифицированной экспрессионной системой, затем могут показывать сверхэкспрессию или устанавливающую экспрессию нуклеотидной последовательности данного изобретения.
Экспрессионные кассеты данного изобретения могут дополнительно содержать 5' ведущие (лидерные) последовательности в конструкции экспрессионной кассеты. Такие ведущие последовательности могут вызывать увеличение трансляции. Трансляционные лидеры известны специалистам и включают пикорнавирусные лидеры, например EMCV лидер (энцефаломиокардитис 5' некодирующая область) (Elroy-Stein et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6126-6130);
поливирусные лидеры, например TEV лидер (Tobacco Etch Virus) (Gallie et al., (1995), Gene, 165(2):233-238), MDMV лидер (Maize Dwarf Mosaic Virus) (Virology, 154:9-20), и человеческий белок иммуноглобулина, связывающий тяжелые цепи (BiP) (Macejak и др., (1991), Nature, 353:90-94);
нетрансляционный лидер из покровной белковой мРНК мозаичного вируса люцерны (AMV РНК 4) (Jobling et al., (1987), Nature, 325:622-625);
табачного мозаичного вируса лидер (TMV) (Gallie et al., (1989), в книге Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), p. 237-256); и кукурузный хлорозных пятен вируса лидер (MCMV) (Lommel et al., (1991), Virology, 81:382-385), см. также Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiol., 84:965-968.
Другие известные способы повышения трансляции также могут быть использованы, например, интроны и т.п.
При изготовлении экспрессионной кассеты можно манипулировать различными ДНК фрагментами так, что обеспечиваются ДНК последовательности в надлежащей ориентации и, как присуще, в подходящем читающем каркасе. В сторону этого конца могут быть использованы адаптеры или линкеры, для того чтобы соединить ДНК фрагменты, или могут быть использованы другие манипуляции, для того
- 56 036015 чтобы обеспечить ограничительные участки, переместить избыточные ДНК, переместить ограничительные участки или т.п. Для этой цели могут быть вовлечены in vitro мутагенез, восстановление инициатора, ограничение, отжиг, перезамещения, например перемещения и трансверсии.
В практике данного изобретения может быть использован ряд промоторов. Промоторы могут быть выбраны, основываясь на желательном исходе. Нуклеиновые кислоты могут комбинироваться с определяющими, предпочтительными для ткани или другими промоторами для экспрессии в растениях. Такие определяющие промоторы включают, например, промотор ядра в Rsyn7 промоторе и другие определяющие промоторы, раскрытые в WO 99/43838 и U.S. 6072050; ядра CaMV 35S промотор (Odell et al., (1985), Nature, 313:810-812); риса актин (McElroy et al., (1990), Plant Cell, 2: 163-171); убиквитин (Christensen et al., (1989), Plant Mol. Biol., 12:619-632 и Christensen et al., (1992), Plant Mol. Biol., 18:675-689); pEMU (Last et al., (1991), Theor. Appl. Genet., 81:581-588); MAS (Velten et al., (1984), EMBO J., 3:2723-2730); ALS промотор (U.S. 5659026) и т.п. Другие определяющие промоторы включают, например, приведенные в патентах США № 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611.
Предпочтительные тканевые промоторы могут быть использованы для целевой повышенной мутППО экспрессии внутри определенной ткани растения. Такие предпочтительные тканевые промоторы включают, но не ограничиваются ими, предпочтительные листьевые промоторы, предпочтительные корневые промоторы, предпочтительные семенные промоторы и предпочтительные стеблевые промоторы. Предпочтительные тканевые промоторы описаны в работах Yamamoto et al., (1997), Plant J., 12(2):255265; Kawamata et al., (1997), Plant Cell Physiol., 38(7):792-803; Hansen et al., (1997), Mol. Gen Genet., 254(3):337-343; Russell et al., (1997), Transgenic Res., 6(2):157-168; Rinehart et al., (1996), Plant Physiol., 112(3): 1331-1341; Van Camp et al., (1996), Plant Physiol., 112(2):525-535; Canevascini et al., (1996), Plant Physiol., 112(2):513-524; Yamamoto et al., (1994), Plant Cell Physiol., 35(5):773-778; Lam, (1994), Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al., (1993), Plant Mol. Biol., 23(6):1129-1138; Matsuoka e/ [alpha]/. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(20):9586-9590 и Guevara-Garcia et al., (1993), Plant J. 4(3):495-505. Такие промоторы могут быть модифицированы, если необходимо, для слабой экспрессии. В одном варианте представляющие интерес нуклеиновые кислоты нацелены на хлоропласт для экспрессии. При этом образе действий, когда представляющая интерес нуклеиновая кислота не напрямую встроена в хлоропласт, экспрессионная кассета будет дополнительно содержать мишенную хлоропластовую последовательность, включающую нуклеотидную последовательность, которая кодирует хлоропластовый переходный пептид, для того чтобы направить представляющий интерес генный продукт в хлоропласты. Такие переходные пептиды известны специалистам. Касательно хлоропластовых мишенных последовательностей, оперативно связанный означает, что нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая переходный пептид (например, хлоропластовая мишенная последовательность), связана с мут-ППО нуклеиновой кислотой данного изобретения таким образом, что две последовательности являются прилегающими и находятся в том же самом читающем каркасе. См., например, Von Heijne et al., (1991), Plant Mol. Biol. Rep., 9:104-126; Clark et al., (1989), J. Biol. Chem., 264:17544-17550; Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiol., 84:965-968; Romer et al., (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun., 196:1414-1421 и Shah et al., (1986), Science, 233:478-481. В том случае, когда мут-ППО белки данного изобретения включают родные хлоропластовые переходные пептиды, любой хлоропластовый переходный пептид, известный специалистам, может быть вращен в аминокислотную последовательность зрелого мут-ППО белка данного изобретения путем оперативного связывания хлоропластовой мишенной последовательности в 5'-конец нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый мут-ППО белок данного изобретения. Хлоропластовые мишенные последовательности известны специалистам и включают хлоропластовые малые субъединицы рибулозе-1,5-бисфосфат карбоксилазы (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al., (1996), Plant Mol. Biol., 30:769-780; Schnell et al., (1991), J. Biol. Chem., 266(5):3335-3342); 5-(энолпирувил)шикимат-3-фосфат синтазы (EPSPS) (Archer et al., (1990), J. Bioenerg. Biomemb., 22(6):789-810); триптофан синтазы (Zhao et al., (1995), J. Biol. Chem., 270(11):6081-6087); пластоцианина (Lawrence et al., (1997), J. Biol. Chem., 272(33):20357-20363); хорисмат синтазы (Schmidt et al., (1993), J. Biol. Chem., 268(36):27447-27457) и легкого урожайного хлорофилла a/b связывающий белок (LHBP) (Lamppa et al., (1988), J. Biol. Chem., 263:14996-14999). См. также Von Heijne et al., (1991), Plant Mol. Biol. Rep., 9:104-126; Clark et al., (1989), J. Biol. Chem., 264:17544-17550; Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiol., 84:965-968; Romer et al., (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun., 196:1414-1421 и Shah et al., (1986), Science, 233:478-481.
Способы трансформации хлоропластов известны специалистам. См., например, Svab et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8526-8530; Svab и Maliga, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-917; Svab и Maliga, (1993), EMBO J., 12:601-606. Способ опирается на доставку пушкой для частиц ДНК содержащего селекционного маркера и нацеливание ДНК на пластидный геном через гомологическую рекомбинацию. Кроме того, трансформация пластида может сопровождаться трансактивацией трансгена молчания, вносимого пластидом в результате предпочтительной экспрессии ткани ядерно кодированной и пластидом направляемой РНК полимеразы. О такой системе сообщалось в статье McBride et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:7301-7305. Представляющие интерес нуклеиновые кислоты, нацеленные на хлоропласт, могут быть оптимизированы для экспрессии в хлоропласте, для того чтобы принять во вни- 57 036015 мание различие в использовании кодона между ядрами растения и его органеллой. При этом образе действий представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для хлоропласта кодонов. См., например, патент США № 5380831, включенный здесь в качестве ссылки.
Предпочтительно экспрессионная кассета данного изобретения дополнительно включает регуляторную область инициирования транскрипции и регуляторную область инициирования трансляции, которые являются функциональными в растении.
В связи с тем, что полинуклеотиды данного изобретения находят применение в селективных маркерных генах для трансформации растения, экспрессионные кассеты данного изобретения могут включать другие селективные маркерные гены для селекционных или трансформированных клеток. Селективные маркерные гены, включая таковые данного изобретения, используют для селекции (отбора) трансформированных клеток или тканей. Маркерные гены включают, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам, такие как кодирующие неомицин фосфотрансферазу II (NEO) и гигромицин фосфотрансферазу (HPT), а также такие гены, которые придают устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глуфосинат аммоний, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). См., как правило, Yarranton, (1992), Curr. Opin. Biotech., 3:506-511; Christophers et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; Yao et al., (1992), Cell, 71:63-72; Reznikoff, (1992), Mol. Microbiol., 6:2419-2422; Barkley et al., (1980) в The Operon, p. 177-220; Hu et al., (1987), Cell, 48:555-566; Brown et al., (1987), Cell, 49:603-612; Figge et al., (1988), Cell, 52:713-722; Deuschle et al., (1989), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:5400-5404; Fuerst et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2549-2553; Deuschle et al., (1990), Science, 248:480-483; Gossen, (1993), Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1917-1921; Labow et al., (1990), Mol. Cell. Biol., 10:3343-3356; Zambretti et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3952-3956; Bairn et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5072-5076; Wyborski et al., (1991), Nucleic Acids Res., 19:4647-4653; Hillenand-Wissman, (1989), Topics Mol. Struc. Biol., 10:143-162; Degenkolb et al., (1991), Antimicrob. Agents Chemother., 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al., (1988), Biochemistry, 27:1094-1104; Bonin, (1993), Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Oliva et al., (1992), Antimicrob. Agents Chemother., 36:913-919; Hlavka et al., (1985), Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al., (1988), Nature, 334:721-724. Эти раскрытия включены здесь в качестве ссылки. Приведенный выше список селективных маркерных генов не является ограничивающим. Любой селективный маркерный ген может быть использован в данном изобретении.
Изобретение далее обеспечивает изолированный рекомбинантный экспрессионный вектор, включающий экспрессионную кассету, которая включает мут-ППО нуклеиновую кислоту, как описано выше, причем экспрессия вектора в клетке хозяина приводит к повышенной толерантности к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа клетки хозяина. Как используется здесь, термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она оказалась связанной. Одним типом вектора является плазмид, который относится к круговой с двойной прядью ДНК петле, в который могут быть вставлены дополнительные ДНК сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, в который дополнительные ДНК сегменты могут быть вставлены в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации и эписомальные векторы млекопитающих животных). Другие векторы (например, не эписомальные векторы млекопитающих животных) интегрированы в геном клетки хозяина после введения в клетку хозяина и тем самым реплицируются вместе с геномом хозяина. Сверх того определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы относят здесь к экспрессионным векторам. Как правило, экспрессионные векторы, используемые в рекомбинантной ДНК технике, часто находятся в форме плазмидов. В существующей в настоящее время спецификации плазмид и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмид обычно чаще всего используется в форме вектора. Тем не менее, изобретение преднамеренно включает такие другие формы экспрессионных векторов, как вирусные векторы (например, репликационно дефективные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые обеспечивают эквивалентные функции.
Рекомбинантный экспрессионный вектор данного изобретения включает нуклеиновую кислоту данного изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке хозяина, а это означает, что рекомбинантный экспрессионный вектор включает одну или более регуляторных последовательностей, выбираемых на основе клеток хозяина, подлежащих использованию при экспрессии, которые оперативно связаны с нуклеиновокислотной последовательностью, которую подлежит экспрессировать. Регуляторные последовательности включают такие, которые направляют определяющую экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток хозяина, и такие, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках хозяина или при определенных условиях. Специалисты понимают, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор подлежащей трансформированию клетки хозяина, желаемый уровень экс- 58 036015 прессии полипептида и т.д. Экспрессионные векторы данного изобретения могут быть введены в клетку хозяина для того, чтобы произвести полипептиды или пептиды, включающие фузию (сплавление) полипептидов или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, как описано здесь (например, мут-ППО полипептиды, сплавленные полипептиды и т.д.).
В предпочтительном варианте данного изобретения мут-ППО полипептиды экспрессируют в растениях и клетках растений, таких как клетки одноклеточных растений (таких как водоросли) (см. Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology, 1(3):239-251 и приведенные там ссылки) и клетки высших растений (например, сперматофиты, такие как сельскохозяйственные растения). Мут-ППО полинуклеотид может быть введен в клетку растения средствами, включающими трансфекцию, трансформацию или трансдукцию, электропорацию, бомбардировку частицами, агроинфекцию, биолистикс и т.п.
Подходящие способы трансформации или трансфекции клетки хозяина можно найти в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и других лабораторных справочниках, таких как Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. В связи с тем, что повышенная толерантность к ППО ингибирующим гербицидам является общим желательным свойством, которое должно быть унаследовано широким разнообразием растений, таких как кукуруза, пшеница, рожь, овес, тритикале, рис, ячмень, соя-бобы, арахис, хлопчатник, рапс на семена и канола, маниока, перец, подсолнечник и тагеты, пасленовые растения, такие как картофель, табак, баклажан и томаты, Vicia-виды, горох, люцерна, кустарниковые растения (кофе, какао, чай), Salix-виды, деревья (масличная пальма, кокосовая пальма), многолетние травы и кормовые сельскохозяйственные растения, эти сельскохозяйственные растения также являются предпочтительными целевыми растениями для генетической инженерии в качестве одного из дальнейших вариантов данного изобретения. В предпочтительном варианте растение является сельскохозяйственным растением. Кормовые сельскохозяйственные растения включают, но не ограничиваются ими, пырей, канареечник Канарский, трава вида Bromus, трава вида дикой ржи, мятлик, орчардграсс, люцерна, салфоин, трава трефоил, низкорослый клевер, красный клевер и сладкий клевер.
В одном варианте данного изобретения трансфекция мут-ППО полинуклеотида в растение достигается переносом гена опосредованным Agrobacterium. Одним способом трансформации, известным специалистам, является окунание цветущего растения в раствор Agrobacteria, причем Agrobacteria содержит мут-ППО нуклеиновую кислоту, за которым следует размножение трансформированных гаметов. Трансформация растения, опосредованная Agrobacterium, может быть выполнена с использованием, например, GV3101(pMP90) (Koncz и Schell, 1986, Mol. Gen. Genet., 204:383-396) или LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens линии. Трансформация может быть выполнена с помощью стандартной техники трансформации и регенерации (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res., 13:4777-4788; Gelvin, Stanton В. и Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. и Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Например, рапсовое семя может быть трансформировано путем трансформации семядоли или гипокотиля (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report, 8:238-242; De Block et al., 1989, Plant Physiol., 91:694-701). Использование антибиотиков для селекции Agrobacterium и растений зависит от бинарного вектора и Agrobacterium линии, использованных для трансформации. Селекцию рапсового семени нормально проводят, используя канамицин в качестве селективного маркера растения.
Перенос гена на лен, опосредованный Agrobacterium, можно провести, например, посредством техники, описанной Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report, 13:282-285. Кроме того, трансформация соябобов может быть проведена с использованием, например, техники, описанной в европейском патенте EP 0424047, патенте США № 5322783, европейском патенте EP 0397687, патенте США № 5376543 или 5169770. Трансформация кукурузы может быть достигнута путем бомбардировки частицами, поглощением ДНК, опосредованным полиэтиленгликолем или посредством техники силикон карбидных волокон. (См., например, справочник Freeling и Walbot The maize handbook Springer Verlag: New York (1993), ISBN 3-540-97826-7). Специфические примеры трансформации кукурузы представлены в патенте США № 5990387, и специфические примеры трансформации пшеницы представлены в PCT заявке WO 93/07256.
Согласно данному изобретению представленный мут-ППО полинуклеотид может быть встроен в клетку растения стабильно в том случае, когда он встроен в не хромосомный автономный репликон или интегрирован в хромосомы растения. Альтернативно, встроенный мут-ППО полинуклеотид может присутствовать во внехромосомном не репликативном векторе и временно экспрессирован или временно активен. В одном варианте может быть создан гомологический рекомбинантный микроорганизм, в котором мут-ППО полинуклеотид интегрирован в хромосому, приготавливают вектор, который содержит как минимум часть ППО гена, в который введено стирание, добавление или замещение в связи с изменением, например функциональным разрушением, эндогенного ППО гена и созданием мут-ППО гена. Для создания точки мутации через гомологическую рекомбинацию ДНК-РНК гибриды могут быть использованы в технике, известной как химерапластика (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27(5):1323-1330
- 59 036015 и Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist, 87(3):240-247). Другие гомологические рекомбинантные процедуры в Triticum-видах также хорошо известны специалистам и предусмотрены для использования здесь.
В гомологическом рекомбинантном векторе мут-ППО ген может быть установлен на фланге у его 5'- и 3'-концов с помощью дополнительной молекулы нуклеиновой кислоты ППО гена для того, чтобы позволить появлению гомологической рекомбинации между экзогенным мут-ППО геном, переносимым вектором, и эндогенным ППО геном в микроорганизме или растении. Дополнительная фланговая ППО молекула нуклеиновой кислоты имеет достаточную длину для успешной гомологической рекомбинации с эндогенным геном. Типично несколько сотен пар оснований вплоть до 1000 пар оснований фланговой ДНК (обе у 5'- и 3'-концов) включены в вектор (см., например, Thomas, K.R. и Capecchi, M.R., 1987, Cell, 51:503 относительно описания гомологических рекомбинантных векторов или Strepp et al., 1998, PNAS, 95 (8):4368-4373 относительно основанной на сДНК рекомбинации в Physcomitrella patens). Однако, поскольку мут-ППО ген нормально отличается от ППО гена всего на несколько аминокислот, фланговая последовательность не всегда необходима. Гомологический рекомбинационный вектор вводят в микроорганизм или растение (например, через полиэтиленгликолем опосредованную ДНК) и клетки, в которых введенный мут-ППО ген гомологически рекомбинировал с эндогенным ППО геном, отбирают (селекционируют), используя технику, известную специалистам.
В другом варианте могут быть получены рекомбинантные микроорганизмы, которые содержат селективные системы, которые позволяют регулируемую экспрессию введенного гена. Например, включение мут-ППО гена в вектор ставит его под контроль lac оперона, позволяющего экспрессию мут-ППО гена только в присутствии IPTG. Такая регуляторная система хорошо известна специалистам.
Другой аспект данного изобретения относится к клеткам хозяина, в которые был введен рекомбинантный экспрессионный вектор данного изобретения. Термины клетка хозяина и рекомбинантная клетка хозяина здесь используются взаимозаменяемо. Понятно, что такие термины относятся не только к определенной субъектной клетке, но они также применимы к потомку или к потенциальному потомку такой клетки. В связи с тем, что некоторые модификации могут появиться в последующих поколениях, или в связи с мутацией, или в связи с влиянием окружающей среды, такие потомки не могут фактически быть идентичными родительской клетке, но все еще включены в охват терминов, как использовано здесь. Клетка хозяина может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, мут-ППО полинуклеотид может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как C.glutamicum, клетках насекомых, клетках грибов или клетках млекопитающих (таких как клетки яичника китайского хомяка (CHO) или COS клетки), водорослях, ресничках, клетках растений, грибах или других микроорганизмах, таких как C.glutamicum. Другие подходящие клетки хозяина известны специалистам.
Клетка хозяина данного изобретения, такая как прокариотическая или эукариотическая клетка хозяина в культуре, может быть использована для получения (т.е. экспрессии) мут-ППО полинуклеотида. Соответственно, данное изобретение далее обеспечивает способы получения мут-ППО полипептидов, используя клетки хозяина данного изобретения. В одном варианте способ включает культурирование клетки хозяина данного изобретения (в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий мут-ППО полипептид или в геном которого был введен ген, кодирующий дикий тип или мут-ППО полипептид) в подходящей среде до тех пор, пока не будет произведен мут-ППО полипептид. В другом варианте способ далее включает выделение мут-ППО полипептидов из среды или клетки хозяина. Другой аспект данного изобретения относится к выделенным мут-ППО полипептидам и их биологически активной доле. Выделенный или очищенный полипептид или биологически активная доля его в существенной мере свободен от какого-либо клеточного материала, когда его получают путем рекомбинантной ДНК техники, или свободен от химических предшественников или других химических реактивов, когда его получают химическим синтезом. Выражение в существенной мере свободен от клеточного материала предусматривает препарирование мут-ППО полипептида, при котором полипептид отделяют от каких-либо клеточных компонентов клеток, в которых он получен естественным путем или рекомбинантно. В одном из вариантов выражение в существенной мере свободен от клеточного материала включает препарирование мут-ППО полипептида, имеющего менее чем около 30% (по сухому весу) не-мут-ППО материала (также называемого здесь как загрязняющий полипептид), более предпочтительно менее чем около 20% не-мут-ППО материала, еще более предпочтительно менее чем около 10% не-мут-ППО материала и наиболее предпочтительно менее чем около 5% не-мут-ППО материала.
Если мут-ППО полипептид или его биологически активная доля получен рекомбинантным путем, то он также предпочтительно в существенной мере свободен от среды культуры, т.е. среда культуры составляет менее чем около 20%, более предпочтительно менее чем 10% и более предпочтительно менее чем 5% объема препарирования полипептида. Выражение в существенной мере свободен от химических предшественников или других химических реактивов включает препарирование мут-ППО полипептида, при котором полипептид отделяют от химических предшественников или других химических реактивов, которые вовлечены в синтез полипептида. В одном варианте выражение в существенной мере свободен от химических предшественников или других химических реактивов включает препарирование
- 60 036015 мут-ППО полипептида, содержащего менее чем около 30% (по сухому весу) химических предшественников или не-мут-ППО химических реактивов, более предпочтительно менее чем около 20% химических предшественников или не-мут-ППО химических реактивов, еще более предпочтительно менее чем около 10% химических предшественников или не-мут-ППО химических реактивов и наиболее предпочтительно менее чем около 5% химических предшественников или не-мут-ППО химических реактивов. В предпочтительных вариантах выделенный полипептид или биологически активная доля его означает отсутствие загрязняющих полипептидов из того же самого организма, из которого получен мут-ППО полипептид. Типично, такие полипептиды получают при рекомбинантной экспрессии, например, мут-ППО полипептида в отличающихся растениях или в микроорганизмах, таких как C.glutamicum, ресничках, водорослях или грибах.
Как описано выше, данное изобретение предлагает композиции и способы повышения толерантности к ППО ингибированию сельскохозяйственного растения или семени по сравнению с вариантом дикого типа растения или семени. В предпочтительном варианте толерантность к ППО ингибированию сельскохозяйственного растения или семени увеличена так, что растение или семя может устоять при применении ППО ингибирующего гербицида в количестве предпочтительно приблизительно 1-1000 г а.в./га, более предпочтительно 1-200 г а.в./га, еще более предпочтительно 5-150 г а.в./га и наиболее предпочтительно 10-100 г а.в./га. Как использовано здесь, устоять при применении ППО ингибирующего гербицида означает, что растение не убивается или не повреждается или умеренно повреждается при таком применении. Специалистам понятно, что применяемые количества могут варьироваться в зависимости от условий окружающей среды, таких как температура или влажность, и в зависимости от выбранного типа гербицида (активного вещества = а.в.).
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способы, которые могут включать использование как минимум одного ППО ингибирующего гербицида, при необходимости, в смеси с одним или более гербицидными соединениями B и, при необходимости, с защитным веществом C, как подробно описано выше.
В этих способах ППО ингибирующий гербицид может быть применен любым известным специалистам способом, включая, но не ограничиваясь ими, обработку семян, обработку почвы и обработку листьев. Перед обработкой ППО ингибирующий гербицид может быть превращен в обычные препараты, например растворы, эмульсии, суспензии, пылевидные препараты, порошки, пасты и гранулы. Используемая форма зависит от определенной предназначенной цели; в каждом случае следует заботиться о тонком и ровном распределении соединения согласно данному изобретению.
При обеспечении растений, обладающих повышенной толерантностью к ППО ингибирующему гербициду, может быть использовано широкое разнообразие препаратов для защиты растений от сорняков, так что увеличивается рост растений и уменьшается конкуренция за питательные вещества. ППО ингибирующий гербицид можно применять сам по себе для предвсходового, послевсходового, предпосадочного и во время посадки контроля сорняков на площадях, окружающих описанные здесь сельскохозяйственные растения, или может быть использован препарат ППО ингибирующего гербицида, который содержит другие добавки. ППО ингибирующий гербицид можно также применять для обработки семян. Добавки, имеющиеся в препарате ППО ингибирующего гербицида, включают другие гербициды, моющие средства, вспомогательные вещества, агенты для опрыскивания, агенты для прилипания, стабилизирующие агенты и т.п. Препарат ППО ингибирующего гербицида может быть влажным или сухим препаратом и может включать, но не ограничиваясь ими, текучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. ППО ингибирующий гербицид и препарат гербицида можно применять в соответствии с обычными способами, например опрыскиванием, орошением, распылением и т.п.
Подходящие препараты описаны подробно в PCT/EP 2009/063387 и PCT/EP 2009/063386, которые включены здесь в качестве ссылки.
Следует также понимать, что сказанное выше также относится к предпочтительным вариантам данного изобретения и что здесь могут быть сделаны многочисленные изменения без отклонения от общего охвата данного изобретения. Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые ни в коем случае не предполагают ограничение его охвата. Напротив, должно быть ясно понятно, что можно обращаться к различным другим вариантам, модификациям и его эквивалентам, которые после прочтения этого описания могут казаться сами по себе специалистам, не отклоняющимися от сути данного изобретения и/или охвата прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Направленный по месту мутагенез в Amaranthus ППО.
Клонирование Aramanthus ППО.
Amaranthus tuberculatus кодирающая последовательность для ППО-чувствительной и -устойчивой изоформ и все мутантные комбинации и многократные мутации (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7) были синтезированы и клонированы фирмой Geneart (Geneart AG, Regensburg, Германия).
Плазмиды были выделены из E.coIi TOP10 путем проведения минпрепарирования плазмида и подтверждены ДНК упорядочением последовательностей.
- 61 036015
Экспрессия и очистка рекомбинантной дикого типа и мутантной ППО.
(Взято из Franck E. Dayan, Pankaj R. Daga, Stephen O. Duke, Ryan M. Lee, Patrick J. Tranel, Robert J.
Doerksen, Biochemical and structural consequences of a glycine deletion in the α-8 helix of protoporphyrinogen oxidase, Biochimica et Biophysica Acta, 1804 (2010), 1548-56).
Клоны в pRSET векторе были трансформированы в BL21(DE3)-pLysS линию E.coIL Клетки выращивали в 250 мл LB с 100 мкг/мл карбенициллина, встряхивая в течение ночи при температуре 37°C. Культуры были разбавлены в 1 л LB с антибиотиком и выращивали при температуре 37°C, встряхивая в течение 2 ч, индуцировали 1 мМ IPTG и выращивали при температуре 25°C, встряхивая в течение более 5 ч. Урожай клеток собирали центрифугированием при 1600xg, промывали 0,09% NaCl и хранили при температуре -80°C.
Клетки подвергали лизису, используя французский пресс при 140 МПа в 50 мМ фосфате натрия рН 7,5, 1 М NaCl, 5 мМ имидазола, 5% глицерина и 1 мкг/мл леупептина. При следующем лизисе добавляют 0,5 U бензонаса (Novagen, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) и PMSF (конечная концентрация 1 мМ). Удаляют осколки клеток центрифугированием при 3000xg. His-мишенные ППО белки очищают на активированной никелем Hitrap Chelating HP колонке (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ), уравновешенной 20 мМ фосфата натрия рН 8,0, 50 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ EDTA и 17% глицерина.
ППО элюируют с помощью 250 мМ имидазола. Активный белок опресняют на PD-10 колонке (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ), уравновешенной 20 мМ фосфат натрия буфером, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA и 17% глицерина. Каждый литр культуры обеспечивал приблизительно 10 мг чистой ППО, которую хранили при температуре -20°C перед использованием в опытах.
Опыт по ППО активности.
Опыт с ППО энзимом (нерекомбинантным). ППО белок (EC 1.3.3.4) был экстрагирован из колеоптилей или ростков (150 г вес в свежем виде) выросшей в темноте кукурузы, черного паслена, утреннего цветка (morning glory) и velvetleaf рассады, как описано ранее (Grossmann et al., 2010). Перед снятием урожая рассаде дали возможность зеленеть в течение 2 ч на свету, для того чтобы достигнуть высшей специфической активности энзима в тилакоидных фракциях при низких концентрациях хлорофилла. При высоких концентрациях хлорофилла появляется значительное тушение флуоресценции, которое ограничивает количество зеленых тилакоидов, которые можно использовать при тестировании. Растительные материалы гомогенизируют на холоде с помощью блэндера Брауна, используя отношение веса в свежем состоянии к объему, равное 1:4. Гомогенизационный буфер состоит из трис-(гидроксиметил)аминометана (трис)-НС1 (50 мМ; рН 7,3), сахарозы (0,5 М), хлористого магния (1 мМ), этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (1 мМ) и альбумина бычьей сыворотки (2 г/л). После фильтрования через четыре слоя Miracloth получают сырые препараты пластида путем центрифугирования при 10000xg в течение 5 мин и ресуспензирования в гомогенизационном буфере и последующего центрифугирования при 150xg в течение 2 мин для удаления сырых клеточных осколков. Надосадочную жидкость центрифугируют при 4000xg в течение 15 мин и фракцию катышей ресуспендируют в 1 мл буфера, содержащего трис-HCl (50 мМ; рН 7,3), EDTA (2 мМ), леупептин (2 мкМ), пепстатин (2 мкМ) и глицерин (200 мл/л) и хранят до использования при температуре -80°C. Белок определяют в экстракте энзима с посмощью альбумина бычьей сыворотки в качестве стандарта. ППО активность определяют флуорометрически путем мониторинга скорости образования Прото из химически восстановленного протопорфириногена IX при условиях начальной скорости. Смесь для опыта состоит из трис-HCl (100 мМ; рН 7,3), EDTA (1 мМ), дитиотреитола (5 мМ), Tween 80 (0,085%), протопорфириногена IX (2 мкМ) и 40 мкг экстрагированного белка в общем объеме 200 мкл. Реакцию инициируют добавлением субстрата протопорфириногена IX при температуре 22°C. Сафлуфенацил, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3, 4-дигидро-2Н-бензо[Ъ][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион, флумиоксазин, бутафенацил, ацифлуорфен, лактофен, бифенокс, сульфентразон плюс ингибитор фотосинтеза диурон, который использовали в качестве негативного контроля были приготовлены в растворе диметилсульфоксида (ДМСО) (0,1 мМ концентрация ДМСО в опыте) и добавлены к смеси опыта с концентрацией от 0,005 пМ до 5 мкМ перед инкубацией. Мониторинг флуоресценции проводили напрямую со смесью опыта, используя прибор POLARstar Optima/Galaxy (фирмы BMG) с возбуждением при длине волны 405 нм, и мониторинг эмиссии проводили при длине волны 630 нм. Неэнзиматическая активность в присутствии инактивированного нагревом экстракта была ничтожной. Ингибирование активности энзима, индуцированное гербицидом, выражают в процентах ингибирования по отношению к необработанному контролю. Молярные концентрации соединения, которые требуются для 50% ингибирования энзима (IC50 значения), были рассчитаны путем подстановки полученных значений в уравнение зависимости ответа от дозы с использованием анализа нелинейной регрессии.
Опыт с ППО энзимом (рекомбинантным).
Прото был получен от фирмы Sigma-Aldrich (Milwaukee,WI). Протоген был получен согласно Якобсам (N.J. Jacobs, J.M. Jacobs, Assay for enzymatic protoporphynogen oxidation, a late step in heme synthesis, Enzyme, 28 (1982), 206-219). Опыты были проведены в 100 мМ фосфате натрия рН 7,4 с 0,1 мМ
- 62 036015
EDTA, 0,1% Tween 20, 5 мкМ FAD и 500 мМ имидазола. Кривая ответа на дозу с ППО ингибиторами сафлуфенацилом, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(nроп-2-инил)-3,4-дигидро-2Hбензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триαзинан-2,4-дионом, флумиоксазином, бутафенацилом, ацифлуорфеном, лактофеном, бифеноксом, сульфентразоном плюс ингибитор фотосинтеза диурон, который был использован в качестве негативного контроля, и МС-15608 были получены в присутствии 150 мкМ протогена. Ширина линии возбуждения и эмиссии была установлена 1,5 и 30 нм соответственно. Все опыты были проделаны двукратно и трехкратно и измерения проводили на приборе POLARstar Optima/Galaxy (BMG) с возбуждением при длине волны 405 нм и мониторинг эмиссии проводили при длине волны 630 нм. Молярные концентрации соединения, которые требуются для 50% ингибирования энзима (IC50 значения), были рассчитаны путем подстановки полученных значений в уравнение зависимости ответа от дозы с использованием анализа нелинейной регрессии.
Значения ответа на дозу (IC50) для замещенных ППО энзимов оказались выше, чем значение IC50 для дикого типа (незамещенного) ППО энзима (табл. 4a). Это указывает на то, что эти замещенные ППО энзимы имеют присущую им устойчивость к тестируемым ППО ингибирующим гербицидам. Замещенные ППО энзимы dG210 и R128L являются известными замещенными энзимами, найденными в Amaranthus tuberculatus и Ambrosia artemisiifolia соответственно, и было показано, что они отвечают за устойчивость ППО растений к множеству ППО гербицидов (Dayan et al., 2010, Biochimica et Biophysica Acta, 1804:1548). Это указывает на то, что другие перечисленные замещенные ППО энзимы, которые также имеют более высокое значение IC50, чем dG210 или R128L, также являются замещенными ППО энзимами, которые отвечают в растении за устойчивость растений по отношению к множеству ППО ингибирующих гербицидов (табл. 4a). Все замещенные ППО энзимы показывают сопоставимые энзимную активность, изменение единиц флуоресценции за минуту (FU/мин) по сравнению с диким типом ППО энзима (табл. 4a). Кроме того, все значения активности для замещенных ППО энзимов больше, чем у замещенных ППО энзимов dG210 или R128L. Замещенные ППО энзимы dG210 и R128L являются достаточно активными для действия в растении, как показано выше. Это указывает на то, что все замещенные ППО энзимы показывают также достаточную активность для действия в растении.
Таблица 4
IC50 (M) значения у дикого типа и аминокислотно-замещенного ППО энзима для ингибиторов сафлуфенацила и 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Hбензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диона
Аминокислотное замещение поел. ИД № Относительная активность энзима (FU/мин) Сафлуфенацил 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7трифтор-З-оксо-4(проп-2-инил)-3,4дигидро-2Нбензо[Ь][1,4]оксазин -6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион
IC50 (М)
К ППО гербициду чувствительный nnO2WC 2 1000 1,86Е-09 5J7E-10
К ППО гербициду чувствительный ППО2 АС 4 800 1,78Е-10 5,96Е-11
dG210 6 и 8 80 1,60Е-06 2,12Е-09
R128L 2 и4 700 2,22Е-07 7,73Е-10
R128A, L397D 2 и4 100 1.00Е-05 5,90Е-09
R128L, L397D 2 и4 нд НД = не детектирован
F204I, T208S 2 и4 745 5,89Е-11 1,29Е-10
F204I, L397D 2 и4 нд нд
F204I, L400A 2 и4 150 4,57Е-11
F204I, F420V 2 и 4 265 4,69Е-09
F204I, F457M 2 и4 200 1,89Е-11 7,52Е-11
T208S, L397D 2 и 4 150 4,08Е-07 1.25Е-10
T208S, L400A 2 и4 нд нд
T208S, F420V 2 и4 520 8,48Е-07 2,34Е-09
T208S, F457M 2 и4 550 1,02Е-10 1,95Е-10
L397D, L400A 2 и4 нд нд
- 63 036015
L397R, F420M 2 и4 нд нд
L397N, F420M 2 и4 90 1,63Е-08
L397D, F420M 2 и4 120 >0,00001 2,95Е-08
L397A, F420V 2 и4 нд нд
L397R, F420V 2 и4 нд нд
L397N, F420V 2 и4 нд нд
L397Q, F420V 2 и4 90 >0,00001 1,01Е-07
L397K, F420V 2 и4 нд нд
L397F, F420V 2 и4 нд нд
L397P, F420V 2 и4 НД нд
L397W, F420V 2 и4 нд нд
L397V, F420V 2 и4 150 1,21Е-08
L397H, F420V 2 и4 НД нд
L397I, F420M 2 и4 410 1,98Е-10
L397M, F420K 2 и4 нд НД
L397M, F420M 2 и4 250 2,32Е-10
L397F, F420M 2 и4 НД нд
L397S, F420M 2 и4 210 3,ЗЗЕ-09
L397W, F420M 2 и4 НД нд
L397Y, F420M 2 и4 НД нд
L397I, F420V 2 и4 100 4,09Е-09
L397A, F420M 2 и4 150 4,53Е-09
L397C, F420M 2 и4 370 1,79Е-09
L397D, F420V 2 и4 60 >0,00001 1, 16Е-06
L397C, F420V 2 и4 150 5,54Е-08
L397E, F420V 2 и4 105 >0,00001 1,41 Е-07
L397G, F420V 2 и4 нд нд
L397H, F420V 2 и4 НД нд
L397M, F420V 2 и4 140 8,79Е-09
L397S, F420V 2 и4 110 4,26Е-08
L397T, F420V 2 и4 150 1,31 Е-08
L397Q, F420M 2 и4 110 1,00Е-06 5,41 Е-09
L397E, F420M 2 и4 340 1,00Е-06 6,03Е-09
L397G, F420M 2 и4 80 6,06Е-08
L397P, F420M 2 и4 нд нд
L397T, F420M 2 и4 НД нд
L397V, F420M 2 и4 400 1,05Е-09
L397D, F457M 2 и4 НД НД
L400A, F420V 2 и4 НД нд
L400A, F457M 2 и4 160 1,35Е-11
F420V, F457M 2 и4 105 1,02Е-09
R128A, F204I, F420V 2 и4 нд нд
R128A, T208S, F420V 2 и4 200 >0,00001 1,25Е-08
R128A, L397D,F420V 2 и4 НД нд
R128A, L400A,F420V 2 и4 НД нд
- 64 036015
R128A, F420V, F457M 2 и4 НД нд
F204I, T208S, L397D 2 и4 100 5.52Е-11
F204I, T208S, L400A 2 и4 105 2.64Е-11
F204I, T208S, F420V 2 и4 80 3.87Е-09
F204I, T208S, F457M 2 и4 200 4,21Е-11
F204I, T208S, F457M 2 и4 470 5,11Е-11 1,70Е-10
F204I, L397D, L400A 2 и4 нд нд
F204I, L397D, F420V 2 и4 НД нд
F204I, L397D, F457M 2 и4 нд нд
F204I, L400A, F420V 2 и4 100 I 8,23Е-08
F204I, L400A, F457M 2 и4 нд нд
F204I, F420V, F457M 2 и4 80 2,10Е-09
T208S, L397D, L400A 2 и4 нд нд
T208S, L397D, F420V 2 и4 нд нд
T208S, L397D, F457M 2 и4 нд нд
T208S, L400A, F420V 2 и4 нд нд
T208S, L400A, F457M 2 и4 60 9,68Е-12
T208S, F420V, F457M 2 и4 90 3,41 Е-09
L397D, L400A, F420V 2 и4 нд нд
L397D, L400A, F457M 2 и4 нд нд
L397D, F420V, F457M 2 и4 нд нд
L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
R128A, F204I, T208S, F420V 2 и4 нд нд
R128A, F204I, F420V, F457M 2 и4 80 4,63Е-08
R128A, F204I, L397D, F420V 2 и4 нд нд
R128A, F204I, L400A, F420V 2 и 4 нд нд
R128A, T208S, L397D, F420V 2 и4 нд нд
R128A, T208S, L400A, F420V 2 и4 нд нд
R128A, T208S, F420V, F457M 2 и4 нд нд
R128A, L397D, F420V, F457M 2 и4 нд нд
R128A, L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L397D, L400A 2 и4 80 2,38Е-09
F204I, T208S, L397D, F420V 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L397D, F457M 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L400A, F420V 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L400A, F457M 2 и4 100 2,88Е-11
F204I, T208S, F420V, F457M 2 и4 200 4,72Е-09
F204I, L397D, L400A, F420V 2 и4 нд нд
F204I, L397D, L400A, F457M 2 и4 нд нд
F204I, L397D, F420V, F457M 2 и4 нд нд
F204I, L400A, F420A, F457M 2 и4 60 I 3,69Е-08
- 65 036015
T208S, L397D, L400A, F420V 2 и4 нд нд
T208S, L397D, L400A, F457M 2 и4 нд нд
T208S, L397D, F420V, F457M 2 и4 нд нд
T208S, L400A, F420V, F457M 2 и4 НД нд
L397D, L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
R128A, F204I, T208S, L400A, F420V 2 и4 нд нд
R128A, F204I, T208S, L397D, F420V 2 и4 нд нд
R128A, F204I, T208S, F420V, F457M 2 и4 нд нд
R128A, F204I, L397D, F420V, F457M 2 и4 нд нд
R128A, T208S, L397D, F420V, F457M 2 и 4 нд нд
R128A, T208S, L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L397D, L400A, F420V 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L397D, L400A, F457M 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L397D, F420V, F457M 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L400A, F420V, F457M 2 и4 60 9,24Е-08
F204I, L397D, L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
T208S, L397D, L400A, F420V, F457M 2 и 4 нд нд
R128A, F204I, L400A, F420V, F457M 2 и4 50 4,05Е-07
R128A, F204I, T208S, L397D, F420V, F457M 2 и4 НД нд
R128A, F204I, T208S, L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
F204I, T208S, L397D, L400A, F420V, F457M 2 и4 нд нд
Пример 2. Генная инженерия толерантных к ППО ингибирующим гербицидам растений, имеющих ППО последовательности дикого типа или мутированные.
Растения соя-бобов (Glycine max) или кукурузы (Zea mays) с производными ППО, толерантными к гербицидам, получают способом, который описан Olhoft et al., (патент США US 2009/0049567). Для того чтобы трансформировать соя-бобы или Arabidopsis thaliana, дикого типа или мутированные ППО последовательности клонируют с помощью стандартной техники клонирования, как описано в Sambrook et al., (Molecular cloning, (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press), в бинарный вектор, содержащий устойчивую маркерную генную кассету (AHAS) и мутированную ППО последовательность (помеченную как GOI) между убиквитинной промоторной (PcUbi) и нопалин синтазы терминаторной (NOS) последовательностями. Для того чтобы трансформировать кукурузу, дикого типа или мутированные ППО последовательности клонируют с помощью стандартной техники клонирования, как описано в Sambrook et al., (Molecular cloning, (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press) в бинарный вектор, содержащий устойчивую маркерную генную кассету (AHAS) и мутированную ППО последовательность (помеченную как GOI) между кукурузной убиквитинной промоторной (ZmUbi) и нопалин синтазы терминаторной (NOS) последовательностями. Бинарные плазмиды вводят в Agrobacterium tumefaciens для трансформации растения. Плазмидные конструкции вводят в соя-бобовые аксиллярные меристемные клетки у первичного узла эксплантатов сеянцев через Agrobacterium-опосредованную трансформацию. После инокуляции и совместного культивирования с Agrobacteria эксплантаты переносят в ростовую интродукционную среду без селекции на 1 неделю. Затем эксплантаты переносят в ростовую индукционную среду с 1-3 мкМ имазапир (фирмы Arsenal) на 3 недели для селекции трансформированных клеток. Эксплантаты со здоровыми каллус/росток подушками у первичного узла затем переносят в увеличивающую рост среду, содер
- 66 036015 жащую 1-3 мкМ имазапира, пока росток вытянется или эксплантат погибнет. Трансгенные растеньица, у которых появились корни, подвергают TaqMan анализу на присутствие трансгенов, переносят в почву и выращивают до зрелости в теплице. Трансформацию растений кукурузы проводят способами, описанными McElver и Singh (WO 2008/124495). Конструкция вектора трансформации растения, содержащего мутированные ППО последовательности, вводится в незрелые эмбрионы кукурузы путем Agrobacteriumопосредованной трансформации.
Селекцию трансформированных клеток проводят в селекционной среде, дополненной 0,5-1,5 мкМ имазетапира, в течение 3-4 недель. Трансгенные растеньица регенерируют в регенерирующей растения среде и впоследствии окореняют. Трансгенные растеньица подвергают TaqMan анализу на присутствие трансгенов, а затем их пересаживают в горшечную смесь для выращивания и выращивают до зрелости в теплице. Arabidopsis thaliana трансформируют диким типом или мутированной ППО последовательностями способом окунания цветов, как описано McElver и Singh (WO 2008/124495). Трансгенные Arabidopsis растения подвергают TaqMan анализу для определения числа интеграционных локусов. Трансформация Oryza sativa (рис) проводится путем трансформации протопласта, как описано Peng et al. (US 6653529). T0 или T1 трансгенные растения соя-бобов, кукурузы и риса, содержащие мутированные ППО последовательности, тестируют на улучшенную толерантность к гербицидам у ППО-производных при исследованиях в теплице и исследованиях на небольших участках со следующими ППО ингибирующими гербицидами: сафлуфенацил, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион флумиоксазин, бутафенацил, ацифлуорфен, лактофен, бифенокс, сульфентразон плюс ингибитор фотосинтеза диурон, который был использован в качестве негативного контроля.
Трансгенные растения Arabidopsis thaliana были испытаны на улучшенную толерантность к сафлуфенацилу, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диону, флумиоксазину, бутафенацилу, ацифлуорфену, лактофену, бифеноксу, сульфентразону плюс ингибитору фотосинтеза диурону, который был использован в качестве негативного контроля, на пластинках с 48-углублениями. Для этого T2 семена стерилизуют на поверхности путем протирания в течение 5 мин в этаноле + вода (70 + 30 по объему), промывают один раз этанолом + вода (70 + 30 по объему) и два раза стерильной деионизованной водой. Семена ресуспендируют в 0,1% агаре, растворенном в воде (в/о). В каждое углубление пластинки помещают четыре или пять семян на твердую питательную среду, включающую вполовину сильный Мурасиге-Скуга питательный раствор, рН 5,8 (Murashige и Skoog, (1962), Physiologia Plantarum, 15:473-497). Соединения растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляют к среде перед отверждением (конечная ДМСО концентрация 0,1%). Пластинки с многочисленными углублениями инкубируют в ростовой комнате при температуре 22°C, относительной влажности воздуха 75% и 110 мкмоль фот * м-2 * с-1 с фотопериодом 14:10 ч света:темноты. Ингибирование роста определяют через 7-10 дней после посева по сравнению с диким типом растений. Дополнительно тестируют трансгенные T1 Arabidopsis растения на улучшенную толерантность к ППО ингибирующим гербицидам при тепличных исследованиях со следующими ППО ингибирующими гербицидами: сафлуфенацилом, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дионом, флумиоксазином, бутафенацилом, ацифлуорфеном, лактофеном, бифеноксом, сульфентразоном плюс ингибитором фотосинтеза диуроном, который был использован в качестве негативного контроля. Результаты приведены в табл. 5.
Таблица 5
Рейтинг повреждения 0 - 100%
(0 = нет повреждений, 100 = п о л н ы й контроль)
300 I 150 I 75
Линия Оценка ДПО (Д П О = Д н е й После Обработки t) поел. ИД № Замещение 1,5-д и м е т и л -6-т и о к с о 3-(2,2,7-т р и фт о р -З-о к с о 4-(п р о п -2-и нил )-3,4д и г и д р о -2Нбензо [Ь][1,4]-о к с а з и н -6и л )-1,3,5-т риазинан -2,4дион г /г а +1 %Д МСО
1 7 2и 4 L397D, F420V 100 30 98
1 19 2и 4 L397D, F420V 98 65 95
2 7 2и 4 L397D, F420V 30 98 100
2 19 2и 4 L397D, F420V 60 100 100
3 7 2и 4 L397D, F420V 35 98 80
3 19 2и 4 L397D, F420V 80 100 95
Пример 3. Условия тканевой культуры.
Опыт in vitro мутагенеза тканевой культуры был развит для выделения и охарактеризовывания ткани растения (например, кукурузных и рисовых тканей), которая толерантна к протопорфириноген окси
- 67 036015 дазу (ППО) ингибирующим гербицидам, (например, сафлуфенацил, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион, флумиоксазин, бутафенацил, ацифлуорфен, лактофен, бифенокс, сульфентразон). В опыте используется сомаклональная вариация, которая обнаружена в in vitro тканевой культуре. Спонтанные мутации, полученные из сомаклональной вариации, могут быть увеличены путем химического мутагенеза и последующей селекции поэтапно, увеличивая концентрацию гербицида.
Данное изобретение обеспечивает условия тканевых культур для обнадеживающего роста ломкого, эмбриогенного каллуса кукурузы или риса, который является регенерируемым. Каллусы были инициированы из четырех различных культур кукурузы или риса, охватывающих Zea mays и Japonica (Taipei 309, Nipponbare, Koshihikari) и Indica (Indica 1) разнообразия соответственно. Семена стерилизуют на поверхности в 70%-ном этаноле в течение около 1 мин, за которым следует 20% коммерческий хлорокс отбеливатель в течение 20 мин. Семена промывают стерильной водой и помещают в индуцирующую каллус среду. Были протестированы различные индуцирующие каллус среды. Список ингредиентов для тестируемых сред представлен в табл. 6.
Таблица 6
Инг редие н т Фирма поста в щи к R001M R025M R026M R327M R008M MS711R
В5 витамины Sigma 1,0 X
MS с о л и Sigma 1,0Х 1,0 X 1,0 X 1,0 X
MS витамины Sigma ТОХ ТОХ
N6 с о л и s Phytotech 4,0 г /л 4,0г /л
N6 витамины Phytotech 1,0 X 1,0 X
L-пролин Sigma 2,9 г /л 0,5 г /л 1,2 г /л
Ка з а ми ηοκ и с л о т ы BD 0,3 г /л 0,3 г /л 2 г /л
Казеин г идролиз а т Sigma 1,0 г /л
L-Asp моног идр а т Phytotech 150 м г /л
Никотино в а я кислота Sigma 0,5 м г /л
Пиридокс и н HCI Sigma 0,5 м г /л
Тиамин HCI Sigma 1,0мг /л
Ми о - Sigma 100 м г /л
- 68 036015
иноситол
MES Sigma 500 M г /л 500 м г /л 500 м г /л 500 м г /л 500 м г /л 500 м г /л
Мальтоза VWR 30 г /л 30 г /л 30 г /л 30 г /л
Сорбитол Duchefa 30 г /л
Сахароз а VWR 10 г /л 30 г /л
NAA Duchefa 50 м к г /л
2.4-D Sigma 2,0 м г /л 1.0 м г /л
МдС12-6Н2О VWR 750 м г /л
-pH 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,7
Г е л ь р и т Duchefa 4,0 г /л 2,5 г /л
Агароза т и п 1 Sigma 7,0 г /л 10 г /л 10 г /л
-Автокла в 15 мин 15 м и н 15 м и н 15 м и н 15 м и н 20 м и н
Кинетин Sigma 2,0 м г /л 2,0 м г /л
NAA Duchefa 1,0 м г /л 1,0 м г /л
АВА Sigma 5,0 м г /л
Це фо такс и м Duchefa 0,1 г /л 0,1 г /л 0,1 г /л
Ванкомиц и н Duchefa 0,1 г /л 0,1 г /л 0,1 г /л
G418 Дисульфа т Sigma 20 м г /л 20 м г /л 20 м г /л
R001M индуцирующая каллус среда была выбрана после тестирования многих вариантов. Культуры хранились в темноте при температуре 30°C. Эмбриогенный каллус был пересеян в свежую среду через 10-14 дней.
Пример 4. Селекция толерантного к гербициду каллуса.
Один раз были определены условия культуры ткани, дальнейшее установление условий селекции проводят путем анализа выживания тканей по кривым убивания под воздействием сафлуфенацила, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксαзин-6ил)-1,3,5-триазинан-2,4-диона, флумиоксазина, бутафенацила, ацифлуорфена, лактофена, бифенокса, сульфентразона, плюс ингибитора фотосинтеза диурона, который был использован в качестве негативного контроля. Проводят внимательное рассмотрение аккумулирования гербицида в ткани, а также его устойчивости и стабильности в клетках и культурной среде. В результате этих экспериментов может быть установлена сублетальная доза для первоначальной селекции мутированного материала.
После того как установлена начальная доза сафлуфенацила, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксaзин-6-ил)-1,3,5-триaзинан-2,4-диона флумиоксазина, бутафенацила, ацифлуорфена, лактофена, бифенокса, сульфентразона плюс ингибитора фотосинтеза диурона, который был использован в качестве негативного контроля, в селекционной среде проводят отбор тканей постадийным образом путем увеличения концентрации ППО ингибитора с каждым переносом, после того как клетки сильно восстанавливают этот рост в присутствии токсичных доз. Полученный каллус далее пересаживают в субкультуру каждые 3-4 недели к R001M с селекционным агентом. Свыше 26000 каллусов стали субъектом селекции для 4-5 субкультур, пока селекционное давление было выше токсичного уровня, как определено кривыми по убиванию и наблюдениями непрерывной культуры.
Альтернативно, жидкие культуры инициируют из каллусов в MS711R со слабым встряхиванием и недельными субкультурами. После того как жидкие культуры установлены, селекционный агент добавляют в колбу при каждой субкультуре. Следующие 2-4 цикла жидкой селекции культуры переносят на фильтры с твердой R001M средой для дальнейшего роста.
Пример 5. Регенерация растений.
Толерантные ткани регенерируют и характеризуют молекулярно на предмет мутации ППО генных последовательностей и/или биохимически на измененную ППО активность в присутствии селекционного агента. Кроме того, для генов, вовлеченных напрямую и/или опосредовано в пути биосинтеза тетрапиррола и/или метаболизма, также были определены последовательности для охарактеризования мутаций. Наконец, для энзимов, которые изменяют поведение (например, метаболизм, транслокацию, транспорти
- 69 036015 ровку), также были определены последовательности для охарактеризования мутаций.
Следующие полученные при гербицидной селекции каллусы были регенерированы с использованием режима среды R025M в течение 10-14 дней, R026M в течение около 2 недель, R327M, до тех пор пока не разовьются хорошо оформленные ростки, и R008S, до тех пор пока ростки хорошо окоренятся для переноса их в теплицу. Регенерация проводилась на свету. Не добавлялось никакого селекционного агента во время регенерации.
Как только было установлено наличие сильных корней, МО регенеранты пересаживают в теплицу в квадратные или круглые горшки. Пересаженные растения помещают под прозрачный пластмассовый колпак, пока они не адаптируются к условиям теплицы. В теплице был установлен цикл день/ночь с температурой 27°C/21°C (80°F/70°F) со светом от 600 ваттной натриевой лампы высокого давления дополнительный свет установлен на 14 ч длительности дня. Растения поливали согласно необходимости в зависимости от погоды и ежедневно удобряли.
Пример 6. Анализ последовательности.
Собирали ткани листьев от клонированных растений, отделенных для пересадки, и анализировали по отдельности. Геномную ДНК экстрагировали, используя набор Wizard® 96 Magnetic DNA Plant System kit (фирмы Promega, патент США № 6027945 и 6368800) согласно указаниям производителя. Выделенную ДНК подвергают PCR расширению с использованием подходящих передовых и реверсных праймеров (инициаторов).
PCR расширение проводят, используя Hotstar Taq ДНК полимеразу (фирмы Qiagen), с использованием посадочной термоциклической программы следующим образом: 96°C в течение 15 мин, затем следуют 35 циклов (96°C, 30 с; 58-0,2°C в каждом цикле, 30 с; 72°C, 3 мин и 30 с), 10 мин при 72°C.
PCR продукты были проверены на концентрацию и размеры фрагментов посредством агарозного гелевого электрофореза. Дефосфорилированные PCR продукты были проанализированы с помощью прямой последовательности, используя PCR праймеры (ДНК фирм Landmarks или Entelechon). Файлы следовых хроматограмм (.scf) были проанализированы на мутации по отношению к дикого типа гену, используя вектор NTI Advance 10™ (фирмы Invitrogen). Опираясь на информацию о последовательности, были идентифицированы мутации в некоторых особях. Анализ последовательности проводят по репрезентативным хроматограммам и соответствующим AlignX выравниваниям с заданием ошибок и редактированием для вызова вторичного пика.
Пример 7. Демонстрация толерантности к гербициду.
Отобранные мутанты и дички пересаживают в небольшие горшки. Сорта растений дикого типа проращивают из семени для сохранения в качестве контроля.
Примерно через 3 недели после пересаживания M0 регенеранты опрыскивают, используя следовый опрыскиватель, сафлуфенацилом, 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дионом, флумиоксазином, бутафенацилом, ацифлуорфеном, лактофеном, бифеноксом, сульфентразоном (плюс диурон), дополненных 0,1% метилированного масла семян. После того как растения адаптировались к условиям теплицы, подмножество было опрыскано дополнительным сафлуфенацилом или 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3-оксо-4(nроп-2-инил)-3,4-дигиgро-2H-бензо[b][1,4]-оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дионом. Сразу после опрыскивания растения выдерживают в засушливых условиях в течение 24 ч до того, как их снова польют и удобрят. Опрысканные растения фотографируют и оценивают гербицидное повреждение через 1 и 3 недели после обработки. Не было обнаружено повреждения или были обнаружены слабые уровни повреждения у растений, содержащих гетерозиготную мутацию, в то время как контрольные растения и тканевые культуры дички (регенерированные растения отрицательны для мутаций последовательности) имели тяжелые повреждения после обработки.
Оценки толерантности для кукурузы и соя-бобов приведены в табл. 7a-7c.
- 70 036015
Таблица 7 a
Кукуруза
- 71 036015
- 72 036015
- 73 036015
- 74 036015
- 75 036015
- 76 036015
- 77 036015
- 78 036015
- 79 036015
- 80 036015
- 81 036015
- 82 036015
- 83 036015
- 84 036015
Соя
Таблица 7b
Аминокислотное замещение по- ел . ид № с а фл у фе н а ц и л (г а .в ./г а ) 1,5-д иметил-6т и о к с о -3-(2,2,7т р и фт о р -З-о к с о-4(п р о п -2-и нил )-3,4-
д и г и д р о -2Нбензо [Ь][1,4]о к с а з и н 6-и л )-1,3,5-т риазинан 2,4-д ион (г а .в ./г а )
0 12,5 25 50 100 200 12,5 25 50 75
Нет Не т | 0 9 9 9 9 9 7 8 9 9
Нет 40 1 8 9 8 * * 8 8 * *
1 9 9 * * * 8 9 * *
0 3 6 9 * * 6 6 * *
2 4 6 8 * * 6 7 * *
1 9 9 9 * * 7 7 * *
0 9 9 9 * * 8 8 * *
0 8 9 8 * * 8 * * *
0 8 9 9 * * 7 9 * *
0 7 9 9 * * 8 9 * *
0 9 9 9 * * 8 9 * *
0 9 9 9 * * 9 9 * *
0 8 9 8 * * 7 8 * *
0 9 9 9 * * 8 9 * *
L369D, F392V 40 0 9 9 9 * * 8 9 * *
0 7 9 9 * * 8 8 * *
0 4 5 6 * * 5 6 * *
0 5 6 7 * * 8 8 * *
0 9 9 9 * * 7 9 * *
0 6 7 7 * * 8 7 * *
0 4 4 5 * * 5 4 * *
2 5 6 6 * * 6 7 * *
* 4 5 6 * * 4 6 * *
0 5 6 6 * * 5 7 * *
0 4 5 5 * * 4 6 * *
0 * 6 9 9 * * 8 8 *
* * 5 6 6 * * 6 7 *
Нет 2 0 2 4 7 * * 3 5 * *
0 4 3 7 * * 7 7 * *
0 4 7 8 * * 6 6 * *
0 7 9 9 * * 6 8 * *
1 7 8 9 * * 7 8 * *
0 8 7 9 * * 5 6 * *
0 5 8 9 * * 7 * * *
5 7 8 9 * * 7 * * *
0 5 7 6 * * 6 7 * *
L397D 2 2 * 7 9 9 * * 8 9 *
1 * 2 4 4 * * 4 5 *
1 * 9 9 9 * * 8 8 *
1 * 2 3 4 * * 4 4 *
0 * 5 6 6 * * 5 5 *
0 * 3 5 5 * * 4 5 *
* * 2 4 6 * * 5 6 *
L397E 2 0 5 3 3 * * 5 5 * *
- 85 036015
- 86 036015
Таблица 7 c
Соя-бобы, толерантность к ППО ингибирующим соединениям дикого типа и трансгенные выделенные
T1 индивидуумы из двух независимых событий
Аминокислотное замещение поел ИД № Сафлуфенацил 1,5-диметил-6тиоксо-3-(2,2,7трифтор-З-оксо-4(проп-2-инил)-3,4дигидро-2Нбензо[Ь][1,4]оксазин -6-ил)-1,3,5триазинан-2,4-дион Фомесафен Ф л ум и 0 КС азин Сульфентразон Сульфентразон Оксифлуор -фен Оксифлуор -фен
Не опрыскан 150 г а.в./га 100 г а.в./га 600 г а.в./га 150 г а.в./га 350 г а.в./га 700 г а.в./ га 600 г а.в./га 1200 г а.в./га
Нет Нет 0 9 9 5 9 9 9 8 9
0 9 9 5 9 9 9 7 9
0 9 9 4 9 7 9 8 9
0 9 9 4 9 7 9 9 9
0 9 9 4 9 8 9 7 8
1 9 8 5 9 9 9 8 9
* 9 9 4 9 9 9 9 9
* 9 9 5 9 9 9 7 8
L397D_ F420V 2 Событие А 0 3 9 1 9 9 2 4 5
0 5 4 2 6 * 3 4 5
0 3 4 0 6 6 7 5 4
0 4 4 0 5 3 7 6 4
0 6 4 1 5 5 4 6 3
0 4 9 0 4 3 4 9 4
* 3 4 2 4 5 6 4 4
* 5 4 4 6 6 4 4 5
L397D_ F420V 2 Событие В 1 3 4 2 5 4 4 6 5
0 2 3 4 6 4 5 4 5
0 3 3 1 6 4 5 8 4
0 3 3 3 5 5 4 4 5
0 4 4 2 6 5 5 4 4
0 4 3 1 4 4 6 5 6
* 3 4 3 5 6 6 4 5
* 4 4 3 4 4 5 6 5
Ниже приведены определения оценки повреждений, которые измерены выше:
Оценка, описание повреждений.
- Нет повреждений.
- Минимальное повреждение, только несколько клочков повреждения листьев или хлороза.
- Минимальное повреждение со слегка более сильным хлорозом. Все точки роста остаются не поврежденными.
- Слегка более сильное повреждение тканей вторичных листьев, но первичные листья и точки роста еще не повреждены.
- Вся морфология растения слегка отлична, некоторый хлороз и некроз во вторичных точках роста и тканях листьев. Стебли не повреждены. Подрост очень возможен в течение 1 недели.
- Вся морфология растения четко отлична, некоторый хлороз и некроз на нескольких листьях и точках роста, но первичные точки роста не повреждены. Ткани стеблей еще зеленые. Подрост очень вероятен в течение 1 недели.
- Сильное повреждение можно видеть на новых растущих листочках. Растение имеет высокую вероятность выжить только посредством подроста в различных точках роста. Большинство листьев являются хлорозными/некрозными, но стеблевые ткани еще зеленые. Может происходить подрост, но с заметными проявлениями повреждений.
- Большинство активных точек роста являются некрозными. Возможна единственная точка роста, которая выжила, и может быть частично хлорозной или зеленой и частично некрозной. Два листа могут быть только хлорозными с некоторой зеленью; остальная часть растения, включая стебель, является некрозной.
- Растение почти погибло, и все точки роста являются некрозными. Один лист может быть хлорозным с небольшой зеленью. Остальная часть растения некрозна.
- Растение погибло.
* - Не тестировано.
Пример 8. Гербицидная селекция с использованием тканевой культуры.
Выбирают среду для использования и получают кривые гибели, как подробно указано выше. Для селекции была использована различная техника. Использовалась или постадийная селекция или сразу
- 87 036015 применяли летальный уровень гербицида. В каждом случае все каллусы переносят для каждого нового цикла селекции. Селекция состояла из 4-5 циклов культуры с 3-5 неделями для каждого цикла. Каллусы помещают на найлоновые мембраны для облегчения переноса (листы с порами 200 мкм, фирм Biodesign, Saco, Maine). Мембраны разрезали для помещения в чашки Петри размером 100x20 мм и обрабатывали в автоклаве перед использованием, помещали 25-35 каллусов (средний вес/каллус был 22 мг) на каждую пластинку. Кроме того, ряд каллусов были объектом селекции в жидкой культурной среде с недельной субкультурой, после чего следовала дальнейшая селекция на полутвердой среде.
Селекцию мутантных линий проводили с использованием сафлуфенацила, 1,5-диметил-6-тиоксо-3(2,2,7-трифтор-3 -оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b] [ 1,4]оксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4диона, флумиоксазина, бутафенацила, ацифлуорфена, лактофена, бифенокса, сульфентразона.
Эффективность получения мутантов была высокой, опираясь или на процентное содержание каллусов, которые давали начало регенерируемой, мутантной линии, или на число линий, как определено 1 г использованной ткани.
Пример 9. Скрининг мутагенизированных клеток водорослей для идентификации толерантных к гербициду клонов и идентификации причинных мутаций в ППО генах.
Для того чтобы создавать мутации в ППО генах, которые придают устойчивость к ППО ингибирующим гербицидам, можно использовать скрининг популяции химически или УФ мутагенизированных клеток. Особенно полезны одноклеточные организмы, такие как Chlamydomonas reinhardtii, для идентификации доминантных мутаций, которые придают устойчивость к гербициду (Kataoka M. et al., 1990, J. of Pest. Sci., 15:449-451; Oshio H. et al., 1993, Zeitschrift fur Naturforschung, 48:339-344).
Клетки водоросли Chlamydomonas reinhardtii линий CC-503 и CC-1691 (Duke University, Durham, USA) были размножены в TAP среде (Gorman и Levine, 1965, PNAS, 54: 1665-1669) при постоянном встряхивании при 100 об/мин, температуре 22°C и облучении светом 30 мкмоль фот * м-2 * с-2. Скрининг соединений проводили при облучении светом 450 мкмоль фот * м-2 * с-2. Чувствительные линии Chlamydomonas reinhardtii были мутагенизированы 0,14 М этилметансульфоната (ЭМС) в течение 1 ч, как описано Лопесом (Loppes, 1969, Mol. Gen. Genet., 104: 172-177). Толерантные линии были идентифицированы путем скрининга мутагенизированных клеток на пластинках с твердой TAP средой, содержащих ППО ингибирующий гербицид, такой как сафлуфенацил или 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7трифтор-3 -оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b] [ 1,4]оксазин-6-ил)- 1,3,5-триазинан-2,4-дион при летальных для дикого типа концентрациях, зависящих от активности соединения в CC-503 или CC-1691 линии.
Стандартная техника была использована для выделения РНК и сДНК синтеза, как описано в Sambrock et al. (Molecular cloning, (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Расширение ППО генов из дикого типа и устойчивого Chlamydomonas reinhardii из геномной ДНК или копии ДНК в качестве шаблона было проведено стандартной PCR техникой с ДНК олигонуклеотидами, которые приведены в табл. 5. Полученные в результате ДНК молекулы были клонированы в стандартном программированном векторе (pJET1) и программированы стандартной программной техникой. Мутации идентифицируют путем сравнения дикого типа и мутантной ППО последовательностей с помощью инструмента выравнивания последовательностей Align X (вектор NTI Advance Software версия 10.3, фирма Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Таблица 8
PCR праймер для расширения Cr ППО
Название праймера Последовательность праймера (5’ 3’ )
Сг_П П О 1_Fw ATGATGTTGACCCAGACTCCTGGGAC
Сг_П П О 1_Rv TTAGGCCTTGACTGCGGCCTTGGAC

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ борьбы с нежелательными растениями на месте культивирования растения, этот способ включает стадии:
    a) обеспечение в указанном месте культивируемого растения, которое содержит как минимум одну нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-ППО), которая устойчива или толерантна к ППО ингибирующему гербициду; и
    b) применение в указанном месте эффективного количества указанного гербицида, где нуклеотидная последовательность a) включает последовательность SEQ ID NO: 1 или 3 или её вариант, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или 3, и где кодированная мутППО представляет собой вариант SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором:
    a) аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln;
    b) аминокислота в позиции 420 представляет собой Val, Met, Ala, Ile или Leu.
  2. 2. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая мут-ППО полипептид, причем нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3 или её вариант, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или 3, и где кодированный мут-ППО полипептид представляет собой вариант SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln и аминокислота в позиции 420 представляет собой Val, Met, Ala, Ile или Leu.
  3. 3. Мут-ППО полипептид, включающий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором аминокислота в позиции 420 представляет собой Ala, Leu, Ile или Val и аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln, причем указанный мут-ППО полипептид предоставляет растению повышенную устойчивость или толерантность к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с диким типом растения.
  4. 4. Клетка трансгенного растения, трансформированная нуклеиновой кислотой, как определено в п.3, обладающая повышенной устойчивостью к ППО-ингибирующему гербициду по сравнению с клеткой дикого типа растения.
  5. 5. Трансгенное растение, содержащее клетку растения, как определено в п.4, в котором экспрессия мут-ППО полипептида, кодирующего нуклеиновую кислоту в растении, приводит к повышенной устойчивости растения к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с диким типом растения.
  6. 6. Растение, которое экспрессирует мутагенизированный или рекомбинантный мут-ППО полипептид, включающий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в котором аминокислота в позиции 420 представляет собой Met или Val и аминокислота в позиции 397 представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Met, Pro, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Asn, Asp, Glu или Gln, и где указанная мут-ППО придает растению повышенную толерантность к гербициду по сравнению с соответствующим вариантом дикого типа растения, когда проводят его экспрессию.
  7. 7. Семя, произведенное трансгенным растением, содержащим клетку растения, как определено в п.4, или растением, как определено в п.5 или 6, где семя является чистосортным, для повышенной устойчивости к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа семени.
  8. 8. Способ получения трансгенных клеток растений с повышенной устойчивостью к ППО ингибирующему гербициду по сравнению с вариантом дикого типа клетки растения, включающий трансформирование клетки растения с помощью экспрессионной кассеты, включающей нуклеиновую кислоту, как определено в п.2.
  9. 9. Способ получения трансгенного растения, включающий (a) трансформирование клетки растения с помощью экспрессионной кассеты, включающей нуклеиновую кислоту, как определено в п.2; и (b) создание растения с повышенной устойчивостью к ППО ингибирующему гербициду из клетки растения.
  10. 10. Способ по любому из пп.8, 9, в котором экспрессионная кассета дополнительно включает регуляторную область инициирования транскрипции и регуляторную область инициирования трансляции, которые являются функциональными в растении.
EA201590004A 2012-06-19 2013-06-19 Растения, обладающие повышенной толерантностью к гербицидам EA036015B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261661364P 2012-06-19 2012-06-19
EP12172557 2012-06-19
PCT/EP2013/062744 WO2013189984A2 (en) 2012-06-19 2013-06-19 Plants having increased tolerance to herbicides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590004A1 EA201590004A1 (ru) 2015-05-29
EA036015B1 true EA036015B1 (ru) 2020-09-14

Family

ID=48669967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590004A EA036015B1 (ru) 2012-06-19 2013-06-19 Растения, обладающие повышенной толерантностью к гербицидам

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10100329B2 (ru)
EP (1) EP2861742B1 (ru)
JP (2) JP2015519913A (ru)
KR (1) KR102320526B1 (ru)
CN (1) CN104662155B8 (ru)
AR (1) AR091489A1 (ru)
AU (1) AU2013279363B2 (ru)
BR (1) BR112014031832A2 (ru)
CA (3) CA2875941C (ru)
CO (1) CO7160071A2 (ru)
CR (1) CR20150013A (ru)
EA (1) EA036015B1 (ru)
EC (1) ECSP15001671A (ru)
ES (1) ES2909315T3 (ru)
IL (1) IL236044B (ru)
IN (1) IN2014MN02498A (ru)
MD (1) MD4683C1 (ru)
MX (1) MX357709B (ru)
MY (1) MY173455A (ru)
PH (1) PH12014502821B1 (ru)
PL (1) PL2861742T3 (ru)
PY (1) PY1326784A (ru)
UA (1) UA120741C2 (ru)
UY (1) UY34867A (ru)
WO (1) WO2013189984A2 (ru)
ZA (1) ZA201500284B (ru)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012080975A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AU2014307664A1 (en) 2013-08-12 2016-02-18 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides (PPO)
EP3033426A4 (en) 2013-08-12 2017-08-02 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
US10308953B2 (en) 2013-12-18 2019-06-04 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
US10023590B2 (en) 2014-04-17 2018-07-17 Basf Se Substituted pyridine compounds having herbicidal activity
US9545108B2 (en) 2014-08-28 2017-01-17 Sumitomo Chemical Company, Limited Herbicidal composition
AU2015363925B2 (en) 2014-12-16 2019-05-02 Farmhannong Co., Ltd. Methods for conferring or enhancing herbicide resistance on plants and/or alga with protoporphyrinogen oxidase variants
CA2989531A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
DK3331997T5 (da) 2015-08-03 2024-10-07 Monsanto Technology Llc Fremgangsmåder og sammensætninger til herbicidtolerans i planter
US10563220B2 (en) * 2015-12-21 2020-02-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for efficient targeting of transgenes
CR20180597A (es) 2016-05-20 2019-05-07 Basf Agro Bv Péptidos de tránsito dual para el direccionamiento a polipéptidos
AU2017284726B2 (en) 2016-06-16 2020-04-09 Farmhannong Co., Ltd. Protoporphyrinogen oxidase variants and methods and compositions for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using the same
IL263413B2 (en) * 2016-06-16 2024-02-01 Farmhannong Co Ltd Methods and preparations for imparting and/or accelerating tolerance to herbicides using variants of protoporphyringonane oxidase
WO2018019860A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
PE20190838A1 (es) * 2016-07-29 2019-06-17 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la expresion genica en plantas
CN110382702A (zh) 2016-12-20 2019-10-25 巴斯夫农业公司 具有增加的除草剂耐性的植物
WO2019106568A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
BR112020011963A2 (pt) * 2017-12-15 2020-11-24 Farmhannong Co., Ltd. composição e método para conferir e/ou intensificar tolerância contra herbicidas através do uso de variantes de ppo
BR112020011954A2 (pt) 2017-12-15 2020-11-24 Farmhannong Co., Ltd. composição e método para conferir e/ou intensificar tolerância de herbicidas usando variantes de protoporfirinogênio ix oxidase de cianobactérias
US10772329B2 (en) 2018-12-26 2020-09-15 Sumitomo Chemical Company, Limited Method of controlling weeds
CN109722487B (zh) * 2019-02-15 2021-02-02 中国农业科学院植物保护研究所 抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒
JP2022044851A (ja) * 2019-04-09 2022-03-18 住友化学株式会社 有限伸育性ダイズの栽培地における雑草防除方法
CN116568673A (zh) 2020-11-24 2023-08-08 先正达农作物保护股份公司 除草化合物
CN118956784A (zh) 2021-04-02 2024-11-15 青岛清原种子科学有限公司 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用
EP4320122A1 (en) 2021-04-07 2024-02-14 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
AU2022340861A1 (en) 2021-09-03 2024-03-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plants having increased tolerance to herbicides
EP4408165A1 (en) 2021-09-27 2024-08-07 Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc Non-transgenic sunflower plants having increased tolerance to herbicides
US20250212879A1 (en) 2022-03-11 2025-07-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
PY2334474A (es) 2022-05-20 2023-11-21 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
AR129821A1 (es) 2022-07-13 2024-10-02 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
AR131474A1 (es) 2022-12-22 2025-03-26 Basf Agro Bv Métodos de control de plantas indeseables con herbicidas ppo y combinaciones en plantas de cultivo tolerantes a herbicidas
EP4658770A1 (en) 2023-02-03 2025-12-10 Syngenta Crop Protection AG Herbicide resistant plants
JP2026507059A (ja) 2023-02-24 2026-02-27 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 除草剤組成物
EP4669107A1 (en) 2023-02-24 2025-12-31 Syngenta Crop Protection AG HERBICIDE COMPOSITIONS
CN120752221A (zh) 2023-03-17 2025-10-03 先正达农作物保护股份公司 除草三嗪衍生物
WO2024200525A1 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Basf Agro B. V. Method for controlling parasitic weeds (orobanche) in protoporphyrinogen oxidase (ppo)-inhibitor tolerant sunflower crop
EP4698556A1 (en) 2023-04-19 2026-02-25 Syngenta Crop Protection AG Herbicide resistant plants
AU2024292019A1 (en) 2023-07-20 2026-01-15 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
AU2024293377A1 (en) 2023-07-20 2026-01-22 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2025031862A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Basf Se Herbicidal compositions comprising saflufenacil
WO2025031864A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Basf Se Herbicidal compositions comprising trifludimoxazin
WO2025098807A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Basf Se Herbicidal compositions comprising glyphosate
WO2025114125A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Basf Se Herbicidal compositions comprising glufosinate
WO2025124944A1 (en) 2023-12-12 2025-06-19 Basf Se Herbicidal compositions comprising 2,4-d
WO2025153595A1 (en) 2024-01-17 2025-07-24 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2025172127A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Basf Se Herbicidal compositions comprising imazethapyr
WO2025172125A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Basf Se Herbicidal compositions comprising pyroxasulfone
WO2025176575A1 (en) 2024-02-23 2025-08-28 Basf Se Herbicidal compositions comprising dimethenamid
WO2025180968A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Basf Se Herbicidal compositions comprising mesotrione
WO2025209887A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 Basf Se Herbicidal compositions comprising topramezone
WO2025228721A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxaflutole
WO2025237738A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Basf Se Herbicidal compositions comprising clethodim
WO2025237737A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Basf Se Herbicidal compositions comprising acetochlor
WO2025237741A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Basf Se Herbicidal compositions comprising diclosulam
WO2026027723A1 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants
EP4696139A1 (en) 2024-08-12 2026-02-18 Basf Se Herbicidal compositions comprising herbicide b

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939602A (en) * 1995-06-06 1999-08-17 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US20100100988A1 (en) * 2005-08-25 2010-04-22 Patrick Tranel Herbicide Resistance Gene, Compositions and Methods
WO2011018486A2 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Basf Se Herbicidally active composition comprising benzoxazinones
WO2012080975A1 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
ATE57390T1 (de) 1986-03-11 1990-10-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
BE1000563A6 (fr) 1987-05-18 1989-02-07 Cedres Castro Herminio S Dispositif accessoire, retractable dans un wc du type traditionnel destine a l'hygiene du corps.
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
US5198013A (en) 1988-02-05 1993-03-30 Sagami Chemical Research Center Benzoxazinone compounds and herbicidal composition containing the same
FR2629098B1 (fr) 1988-03-23 1990-08-10 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimerique de resistance herbicide
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
EP0452269B1 (en) 1990-04-12 2002-10-09 Syngenta Participations AG Tissue-preferential promoters
PL295547A1 (ru) 1990-04-26 1992-10-05 Plant Genetic Systems Nv
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
DE69227911T2 (de) 1991-08-02 1999-05-12 Kubota Corp., Tokio/Tokyo Neuer mikroorganismus und insektizid
CA2116449C (en) 1991-08-27 2005-04-05 Vaughan Alan Hilder Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
AU2781892A (en) 1991-10-07 1993-05-03 Ciba-Geigy Ag Particle gun for introducing dna into intact cells
TW261517B (ru) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
JPH07506252A (ja) 1992-04-24 1995-07-13 エス・アール・アイ・インターナシヨナル 真核細胞内でのイン・ビボ相同配列ターゲッティング
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
JP2909796B2 (ja) 1993-12-28 1999-06-23 ローム株式会社 サーマルプリントヘッドおよびその製造方法
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5767373A (en) * 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
DE19505995A1 (de) 1995-02-21 1996-08-22 Degussa Verfahren zur Herstellung von Thietanonen
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US6084155A (en) * 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
WO1997004088A1 (en) 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
AU724893B2 (en) 1996-02-28 2000-10-05 Syngenta Participations Ag DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US5948917A (en) 1996-03-26 1999-09-07 Nippon Soda Co., Ltd. 3-(isoxazol-5-yl)-substituted benzoic acid derivative and method for production thereof
WO1997041117A1 (en) 1996-04-26 1997-11-06 Nippon Soda Co., Ltd. Novel benzene derivatives substituted by heterocycles and herbicides
BR9708828A (pt) 1996-04-26 1999-08-03 Nippon Soda Co Composto e composição herbicida
WO1997041116A1 (en) 1996-04-26 1997-11-06 Nippon Soda Co., Ltd. Benzene derivatives substituted by heterocycles and herbicides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
US5773702A (en) 1996-07-17 1998-06-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US5859348A (en) 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
EP1007703A1 (en) 1996-12-27 2000-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation
JP4451933B2 (ja) * 1996-12-27 2010-04-14 住友化学株式会社 遺伝子操作による植物へのｐｐｏ阻害性除草剤耐性付与法
US6027945A (en) 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
ZA98371B (en) 1997-01-31 1999-07-16 Du Pont Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides.
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US5939360A (en) 1997-07-08 1999-08-17 Nippon Soda Co., Ltd. Compound and herbicidal composition for weed control
CA2303403A1 (en) 1997-09-11 1999-03-18 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to photobleaching herbicide
CA2315546C (en) 1998-02-26 2008-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Constitutive maize promoters
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
DE69942750D1 (de) 1999-07-22 2010-10-21 Nat Inst Agrobio Res Verfahren zur superschnellen transformation von monokotyledonen
EP1200611A1 (en) * 1999-08-13 2002-05-02 Syngenta Participations AG Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase
DE19939095A1 (de) 1999-08-18 2001-02-22 Univ Eberhard Karls Von Coxsackieviren abgeleitetes Vektorsystem für Gentransfer
AU2001260114A1 (en) 2000-03-14 2001-09-24 Syngenta Participations Ag Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AU5920601A (en) 2000-04-28 2001-11-12 American Cyanamid Co Use of the maize x112 mutant ahas 2 gene and imidazolinone herbicides for selection of transgenic monocots, maize, rice and wheat plants resistant to the imidazolinone herbicides
HU229494B1 (en) 2000-05-04 2014-01-28 Basf Ag Uracil substituted phenyl sulfamoyl carboxamides
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
CN100537764C (zh) 2001-10-19 2009-09-09 住友化学工业株式会社 除草剂代谢蛋白质,其基因及其应用
RU2372404C2 (ru) 2001-10-19 2009-11-10 Сумитомо Кемикал Компани, Лимитед Метаболизирующий гербицид белок, его ген и их применение
PT2308977E (pt) 2004-04-30 2013-05-13 Dow Agrosciences Llc Novo gene de resistência a herbicida
CA2567779A1 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Basf Plant Science Gmbh Improved transformation of soybean
DE602005019752D1 (de) 2004-09-03 2010-04-15 Syngenta Ltd Isoxazolinderivate und deren verwendung als herbizide
ES2333977T3 (es) 2004-10-05 2010-03-03 Syngenta Limited Derivados de isoxazolina y su uso como herbicidas.
US20070021515A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 United States (as represented by the Secretary of Agriculture) Expandable starch-based beads and method of manufacturing molded articles therefrom
US7671254B2 (en) 2005-08-25 2010-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
BRPI0616416A2 (pt) 2005-09-26 2011-06-21 Nippon Soda Co protoporfirinogênio oxidase tendo atividade de conferir resistência contra acifluorfen e gene da mesma
GB0526044D0 (en) 2005-12-21 2006-02-01 Syngenta Ltd Novel herbicides
GB0603891D0 (en) 2006-02-27 2006-04-05 Syngenta Ltd Novel herbicides
US20070214515A1 (en) 2006-03-09 2007-09-13 E.I.Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide encoding a maize herbicide resistance gene and methods for use
CA2682349C (en) 2007-04-04 2017-08-22 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
CA2686835C (en) 2007-05-09 2020-04-21 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
WO2008150473A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Syngenta Participations Ag Cytochrome p450 genes conferring herbicide resistance
CN101215289A (zh) 2008-01-11 2008-07-09 南开大学 具有PPO抑制活性及除草活性的3-取代苯基-吡唑并[3,4-d][1,2,3]三嗪-4-酮类化合物
CN102203091B (zh) 2008-10-29 2014-08-13 巴斯夫欧洲公司 具有除草作用的取代吡啶
EP2443102B1 (en) 2009-06-19 2013-04-17 Basf Se Herbicidal benzoxazinones
UA112969C2 (uk) 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
US20120122223A1 (en) 2010-08-03 2012-05-17 Cibus Us Llc Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes
EP2621924B1 (en) 2010-10-01 2015-03-04 Basf Se Herbicidal benzoxazinones
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AU2014307664A1 (en) 2013-08-12 2016-02-18 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides (PPO)
EP3033426A4 (en) 2013-08-12 2017-08-02 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
US10308953B2 (en) 2013-12-18 2019-06-04 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939602A (en) * 1995-06-06 1999-08-17 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US20100100988A1 (en) * 2005-08-25 2010-04-22 Patrick Tranel Herbicide Resistance Gene, Compositions and Methods
WO2011018486A2 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Basf Se Herbicidally active composition comprising benzoxazinones
WO2012080975A1 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO, GE-FEI; ZUO, YANG; YANG, SHENG-GANG; YANG, GUANG-FU: "Protoporphyrinogen Oxidase Inhibitor: An Ideal Target for Herbicide Discovery", CHIMIA INTERNATIONAL JOURNAL FOR CHEMISTRY, SCHWEIZERISCHE CHEMISCHE GESELLSCHAFT, CH, vol. 65, no. 12, 1 December 2011 (2011-12-01), CH, pages 961 - 969, XP009172290, ISSN: 0009-4293, DOI: 10.2533/chimia.2011.961 *
X. LI: "Development of Protoporphyrinogen Oxidase as an Efficient Selection Marker for Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Maize", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, vol. 133, no. 2, 11 September 2003 (2003-09-11), pages 736 - 747, XP055078106, ISSN: 00320889, DOI: 10.1104/pp.103.026245 *

Also Published As

Publication number Publication date
UA120741C2 (uk) 2020-02-10
ES2909315T3 (es) 2022-05-06
IN2014MN02498A (ru) 2015-07-17
EP2861742A2 (en) 2015-04-22
IL236044A0 (en) 2015-01-29
CA3210121C (en) 2025-10-07
MD20150003A2 (ru) 2015-06-30
PH12014502821A1 (en) 2015-02-02
US11441154B2 (en) 2022-09-13
ECSP15001671A (es) 2015-11-30
JP2018186826A (ja) 2018-11-29
CN104662155A (zh) 2015-05-27
US10100329B2 (en) 2018-10-16
ZA201500284B (en) 2016-12-21
MX2014015943A (es) 2015-10-29
AR091489A1 (es) 2015-02-11
UY34867A (es) 2013-12-31
KR20150023748A (ko) 2015-03-05
JP2015519913A (ja) 2015-07-16
CA3210121A1 (en) 2013-12-27
AU2013279363B2 (en) 2018-02-08
US20230279420A1 (en) 2023-09-07
CA2875941C (en) 2023-10-10
PH12014502821B1 (en) 2021-09-22
WO2013189984A3 (en) 2014-02-20
MX357709B (es) 2018-07-20
AU2013279363A1 (en) 2015-01-15
CA3276095A1 (en) 2026-03-02
EP2861742B1 (en) 2021-12-29
MD4683B1 (ru) 2020-03-31
PL2861742T3 (pl) 2022-05-02
MD4683C1 (ru) 2020-12-31
BR112014031832A2 (pt) 2019-03-06
KR102320526B1 (ko) 2021-11-04
MY173455A (en) 2020-01-26
CO7160071A2 (es) 2015-01-15
CN104662155B (zh) 2020-11-27
WO2013189984A2 (en) 2013-12-27
CA2875941A1 (en) 2013-12-27
IL236044B (en) 2020-04-30
EA201590004A1 (ru) 2015-05-29
JP6698758B2 (ja) 2020-05-27
CN104662155B8 (zh) 2021-03-12
US20150299725A1 (en) 2015-10-22
PY1326784A (es) 2016-06-01
US20190062778A1 (en) 2019-02-28
CR20150013A (es) 2015-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230279420A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US12570994B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US12529066B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US10801035B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
CN106029890A (zh) 对除草剂具有增强的耐受性的植物
US20260117243A1 (en) Plants Having Increased Tolerance to Herbicides
WO2025160032A2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM