EA043449B1 - ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ КАНАЛ-ОПСИНА-2 (Chop2) И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

Abstract

В изобретении предлагаются композиции и наборы реагентов, включающие по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты или полипептидную молекулу, кодирующую мутантный белок ChR2. Способы по изобретению включают введение объекту композиции, включающей мутантный ChR2, для сохранения, улучшения или восстановления фотопреобразования. Предпочтительно композиции и способы по изобретению предлагаются объекту с нарушенным зрением, восстанавливая таким образом зрение до нормального уровня.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится в основном к области молекулярной биологии. Идентифицированы мутации в гене канал-опсина-2 (Channelopsin-2) (Chop2). Композиции, включающие мутантный ген Chop2, используются в терапевтических способах для улучшения и восстановления потери зрения.

Предшествующий уровень техники

Сетчатка состоит из фоторецепторов (или фоторецепторных клеток, палочковидных и конусных). Фоторецепторы представляют собой высокоспециализированные нейроны, которые отвечают за фотопреобразование или превращение света (в форме электромагнитного излучения) в электрические и химические сигналы, которые стимулируют каскад событий внутри зрительной системы, генерируя в конечном счете представление нашего мира.

Утрата или дегенерация фоторецепторов подвергает существенному риску, если не ингибирует полностью, фотопреобразование визуальной информации внутри сетчатки. Утрата фоторецепторных клеток и/или утрата функционирования фоторецепторных клеток представляет собой первичную причину ослабленной зрительной активности, ослабленной светочувствительности и слепоты. В данной области назрела необходимость в получении композиций и способа, которые восстанавливают фоточувствительность сетчатки объекта, который испытал потерю зрения.

Сущность изобретения

В изобретении предлагается решение назревшей необходимости получения способа для восстановления и/или повышения светочувствительности фоторецепторных клеток путем экспрессии предпочтительных мутаций и/или их комбинации, гена канал-опсина-2 (Chop2), и затем предлагаются способы генной терапии на основе гена канал-опсина-2 (Chop2).

Генная терапия на основе гена канал-опсина-2 (Chop2) предлагает превосходную стратегию для восстановления фоточувствительности сетчатки после дегенерации фоторецепторов. Белковый продукт гена Chop2, когда он связывается с изомеризуемыми под действием света хромофорами, все трансретинали, образует функциональный светорегулируемый канал, называемый канал-родопсин-2 (ChR2). Нативный ChR2 демонстрирует низкую светочувствительность. Недавно сообщалось, что два мутанта ChR2, L132C и Т159С, значительно повышают их светочувствительность (Kleinlogel et al. (2011), Nat. Neurosci., 14:513-8; Berndt et al. (2011), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 108:7595-600; Prigge et al. (2012), J. Biol. Chem., 287(38)3104:12, содержание каждой из которых включено в данный документ ссылкой в полном объеме). Свойства этих двух мутантов ChR2 (т.е. L132C и Т159С) исследовали и сравнивали с рядом двойных мутантов в этих двух сайтах для идентификации подходящих кандидатов для терапевтических способов. Композиции, включающие одну или несколько из этих мутаций, предлагаются нуждающемуся в этом объекту с целью восстановления зрения. Конкретно, целевые мутации в гене Chop2 вводятся в клетку и/или интегрируются в геномную ДНК клетки для улучшения или восстановления зрения. Целевые мутации в гене Chop2, которые вводятся в клетку для улучшения или восстановления зрения, также могут оставаться эписомными, не интегрируясь в геномную ДНК.

Мутации в аминокислотных положениях L132 или Т159 Chop2 (и, таким образом, полученный в результате ChR2) значительно снижают пороговую светочувствительность, которая требуется для того, чтобы вызвать ChR2-опосредованный фототок. Двойные мутанты в аминокислотных положениях L132 и Т159 дополнительно повышают фототок при низких интенсивностях света, превышая значения, соответствующие одиночным мутациям. Ганглиозные клетки сетчатки, экспрессирующие двойные мутанты в положениях L132 и Т159, могут отвечать на интенсивности света, которые попадают в интервал условий естественного дневного освещения, но все равно поддерживают адекватное и высокое временное разрешение, которое подходит для восстановления эффективного зрения. Таким образом, мутантный белок Chop2 по настоящему изобретению, который образует мутантные ChR2, обладающие улучшенной чувствительностью, используется индивидуально или в комбинации для восстановления зрения.

Конкретно, в изобретении предлагается полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L). В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) или аланин (А). Когда аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С), полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID NO: 13. Когда аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А), то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID NO: 20.

В изобретении предлагается полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 159 SEQ ID NO: 26 не является треонином (Т). В некоторых во- 1 043449 площениях выделенной полипептидной молекулы аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С), серин (S) или аланин (А). Когда аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С), то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID NO: 14. Когда аминокислота в положении 159 представляет собой серин (S), то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID NO: 17. Когда аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А), то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID NO: 23.

В изобретении предлагается выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L). В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) и аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С). В предпочтительном воплощении выделенной полипептидной молекулы, полипептидная молекула включает или состоит из SEQ ID NO: 16. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, включающий или состоящий из SEQ ID NO: 16. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, включающий или состоящий из SEQ ID NO: 16, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает или состоит из SEQ ID NO: 15.

В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L), а аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) и аминокислота в положении 159 представляет собой серин (S). Выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L) и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), может включать или состоять из SEQ ID NO: 19. Альтернативно или дополнительно выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L) и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) и где аминокислота в положении 159 представляет собой серин (S), может включать или состоять из SEQ ID NO: 19. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, который включает или состоит из SEQ ID NO: 19. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты включает или состоит из SEQ ID NO: 18.

В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А) и аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С). Выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 представляет собой треонин (Т), может включать или состоять из SEQ ID NO: 22. Альтернативно или дополнительно выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), где аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А) и где аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С), может включать или состоять из SEQ ID NO: 22. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, который включает или состоит из SEQ ID NO: 22. Предпочтительно эта молекула нуклеиновой кислоты включает или состоит из SEQ ID NO: 21.

В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L) и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) и аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А). Выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L) и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), может включать или состоять из SEQ ID NO: 25. Альтернативно или дополнительно выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 не является лейцином (L) и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) и где аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А), может включать или состоять из SEQ ID NO: 25. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, который включает или состоит из SEQ ID NO: 25. Предпочтительно эта молекула нуклеиновой кислоты включает или состоит из SEQ ID NO: 24.

В изобретении предлагается любая из выделенных полипептидных молекул, описанных в данном документе, где полипептидная молекула кодирует мутантный белок Chop2, который образует мутантный

- 2 043449

ChR2, который вызывает ток в ответ на пороговую интенсивность света, которая ниже, чем пороговое значение белка ChR2 дикого типа. Кроме того, ток проводит катионы. Типичные катионы включают в частности, ионы Н+, Na+, K+ и Са2+. ChR2 дикого типа и мутантные белки, описанные в данном документе, неспецифично проводят катионы. Следовательно, ток проводит один или несколько из следующих ионов: Н+, Na+, K+ и Са2+.

В изобретении предлагается любая из выделенных полипептидных молекул, описанных в данном документе, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель. В изобретении также предлагается композиция, включающая по меньшей мере одну выделенную полипептидную молекулу, описанную в данном документе. Композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.

В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой из выделенных полипептидов, описанных в данном документе. Кроме того, выделенная молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. В изобретении также предлагается композиция, включающая по меньшей мере одну выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. Композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.

В изобретении предлагается клетка, где клетка включает выделенную полипептидную молекулу по изобретению или контактирует с ней. Кроме того, в изобретении предлагается клетка, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенную полипептидную молекулу по изобретению, или контактирует с ней. В изобретении предлагается композиция, включающая, по существу состоящая из или состоящая из, клетки, которая включает выделенную полипептидную молекулу по изобретению или молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенную полипептидную молекулу по изобретению. Клетка по изобретению может контактировать с выделенным полипептидом in vitro, ex vivo, in vivo или in situ. В некоторых воплощениях изобретения клетка представляет собой фоторецептор; горизонтальную клетку; биполярную клетку; амакриновую клетку и особенно AII-амакриновую клетку; или ганглиозную клетку сетчатки, включая фоточувствительную ганглиозную клетку сетчатки. Предпочтительно клетка представляет собой ганглиозную клетку сетчатки, фоточувствительную ганглиозную клетку сетчатки, биполярную клетку, биполярную клетку ON-типа, палочковидную биполярную клетку или AII амакриновую клетку. В некоторых аспектах изобретения клетка представляет собой фоторецептор, биполярную клетку, палочковидную биполярную клетку, коническую биполярную клетку ON-типа, ганглиозную клетку сетчатки, фоточувствительную ганглиозную клетку сетчатки, горизонтальную клетку, амакриновую клетку или AII-амакриновую клетку.

В изобретении предлагается способ улучшения или восстановления зрения, включающий введение объекту любой из композиций, описанных в данном документе. В изобретении дополнительно предлагается профилактический способ сохранения зрения, включающий введение объекту любой из композиций, описанных в данном документе.

Способы, описанные в данном документе, также могут применяться к тем объектам, которые являются здоровыми, слепыми (частично или полностью), и/или к объектам с дегенерацией сетчатки (отличающейся потерей палочковидных и/или конусных фоторецепторных клеток), но могут зависеть от активности фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки для определения уровня освещенности окружающей среды. Например, способы, описанные в данном документе, могут использоваться для сохранения, улучшения или восстановления активности фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки, которые опосредуют преобразование световой информации для синхронизации суточных ритмов с 24-часовым циклом свет/темнота, пупиллярного контроля и рефлексов и для световой регуляции высвобождения мелатонина.

В некоторых воплощениях способов изобретения объект может иметь нормальное зрение или нарушенное зрение. Альтернативно или дополнительно объект может повергаться риску развития глазного заболевания, которое приводит к нарушению зрения. Например, объект может иметь наследственную историю глазных заболеваний, включающих макулярную дегенерацию и пигментный ретинит. Объект может иметь риск быть подвергнутым поражению глаз, которое вызывает повреждение фоточувствительных клеток в сетчатке. Объект может иметь генетический маркер или генетическое/врожденное заболевание, которое приводит в результате к нарушенному зрению, слабому зрению, к частичной слепоте, или к полной слепоте. Объект может иметь рефракционный дефект, который приводит в результате к миопии (близорукость) или к гипертрофии (дальнозоркость).

Композиции или способы по изобретению могут вводиться объекту или системно или местно. Предпочтительным путем местного введения является интравитреальная инъекция.

Другие признаки и преимущества изобретения будут понятны на основе следующего подробного описания и формулы изобретения и охвачены ими.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены репрезентативные регистрации токов, вызванных светом, из (WT) ChR2 дикого типа, мутантов L132C, L132C/T159C и L132C/159S в клетках НЕК для сравнения их светочувствительности (А). Световые стимулы (фотоны/см²/с при 460 нм) генерировали с помощью ксеноновой дуго- 3 043449 вой лампы и ослабляли с помощью нейтрально-серого светофильтра: ND4.0 (2,8х10¹⁴), ND3.0 (1,4х10¹⁵),

ND2.5 (4,8х10¹⁵); ND2.0 (1,6x1016), ND1.0 (1,3х10¹⁷), ND0 (1,2х10¹⁸). (В) Те же следы тока представлены при различных шкалах тока. Следы, указанные стрелками, вызваны одной и той же интенсивностью света (ND2.5).

На фиг. 2 представлены репрезентативные регистрации токов, вызванных светом, из (WT) ChR2 дикого типа, мутантов L132C, L132C/T159C и L132C/159S, на 10 мс светового пульса (1,2х10¹⁸ фотонов/см²/с при 460 нм) в клетках НЕК для сравнения временной зависимости их дезактивации (время затухания после выключения света).

На фиг. 3 представлены репрезентативные регистрации мультиканального чипа опосредованных WT ChR2, L132C, L132C/T159C и L132C/T159S спайковых активностей из ганглиозных клеток сетчатки в тотальном препарате сетчатки для сравнения их световой чувствительности. Световые стимулы (фотоны/см²/с) генерировали с помощью 473 нм лазера голубой области спектра и ослабляли с помощью нейтрально-серого светофильтра: ND0 (6,3x1016), ND1.0 (7,4х10¹⁵), ND1.5 (2,7х10¹⁵), ND2.0 (7,3х10¹⁴), ND2.5 (3,2х10¹⁴), ND3.0 (8,5х10¹³), ND3.5 (3,8х10¹³) и ND4.0 (9,5х10¹²).

На фиг. 4 представлены репрезентативные регистрации мультиканального чипа опосредованных WT ChR2, L132C, L132C/T159C и L132C/T159S спайковых активностей из ганглиозных клеток сетчатки в тотальном препарате сетчатки для сравнения их временной динамики. В каждой панели представлен двумерный массив точек 10 последовательных вызванных светом спайков, происходящих от одного нейрона (верх) и гистограммы средней степени импульсов (низ). Световые импульсы с различной частотой генерировали с помощью лазерного источника 473 нм в голубой области спектра с интенсивностями примерно на одну логарифмическую единицу выше пороговой интенсивности каждого мутанта. Регистрации WT ChR2 и L132C представлены в (А), и регистрации L132C/T159C и L132C/T159S представлены в (В).

Подробное описание

Зрительная система.

Центральная нервная система опосредует зрение (также обозначается в данном документе как визуальный образ) посредством специализированных клеток и уникальных способов сигнальной трансдукции, присутствующей в зрительной системе. Принципиальная ответственность зрительной системы заключается в преобразовании света в форме электромагнитного излучения в образ или изображение окружающей среды. Дополнительно к зрительной функции системы зрительная система также регулирует зрачковый световой рефлекс (PLR), подгонку суточного ритма к периодическим циклам свет/темнота и высвобождение гормона мелатонина.

Клетки сетчатки являются первыми клетками зрительной или нервной системы, которые встречаются со светом (электромагнитное излучение различной длины волны и интенсивности). Фотоны проходят через роговую оболочку глаз, зрачок и хрусталик перед достижением сетчатки. Сетчатка имеет уникальную структуру, так как фоторецепторные клетки, которые непосредственно поглощают фотоны, локализованы на внешнем слое сетчатки. Фотоны, которые проходят к хрусталику, сначала встречаются с внутренним слоем ганглиозных клеток сетчатки (небольшая часть которых является фоточувствительной посредством экспрессии опсина, меланопсина) и промежуточным слоем биполярных клеток перед достижением внешнего слоя фоторецепторных клеток (также известных палочковидные и конусные клетки). Палочковидные фоторецепторы действуют в условиях уменьшения освещения (скотопическое зрение), в то время как фоторецепторы действуют в условиях яркого освещения (фотопическое зрение) и отвечают за цветовое зрение. Конические фоторецепторы непосредственно соединяются посредством синапса с коническими биполярными клетками ON- и OFF-типа, которые, в свою очередь, непосредственно соединяются посредством синапса с ганглиозными клетками сетчатки ON- и OFF-типа. Палочковидные фоторецепторы соединяются посредством синапса с палочковидными биполярными клетками (уникальный тип клеток, которые относятся к ON-типу), которые соединяются посредством синапса с Anамакриновыми клетками. An-амакриновые клетки затем передают зрительные сигналы на конические биполярные клетки ON-типа посредством щелевидного соединения и на конические биполярные клетки OFF-типа, а также на ганглиозные клетки OFF-типа посредством ингибирующих глицинергических синапсов. Ганглиозные клетки сетчатки отвечают за связывание зрительной информации с нейронами мозга.

Фотопреобразование.

Внутри сетчатки фоторецепторные клетки поглощают фотоновые частицы и трансформируют исходные данные частоты и длины волны света в химические и затем в электрические сигналы, которые передают эту исходную информацию посредством зрительной и нервной систем. Конкретно, белок опсин, локализованный на поверхности фоторецептора (палочковидная, коническая и/или фоточувствительная ганглиозная клетка сетчатки) поглощает фотон и инициирует внутриклеточный сигнальный каскад, который приводит к гиперполяризации фоторецептора. В темноте белок опсин не поглощает фотоны, фоторецепторы деполяризованы. Зрительные сигналы фоторецепторов затем передаются через биполярные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки в высшие зрительные центры в мозге. Кон- 4 043449 кретно, когда палочковидные и конические фоторецепторы деполяризованы (в темноте), они вызывают деполяризацию палочковидных биполярных клеток конических биполярных клеток ON-типа, но вызывают гиперполяризацию конических биполярных клеток OFF-типа, которые, в свою очередь, вызывают деполяризацию AII-амакриновых клеток и повышают спайки ганглиозных клеток сетчатки ON-типа и уменьшают спайки ганглиозных клеток сетчатки OFF-типа. Противоположный эффект наблюдается (для палочковидных, ON- и OFF-биполярных клеток, AII-амакриновых клеток и ON- и OFF-ганглиозных клеток), когда палочковидные и конусные фоторецепторы гиперполяризованы (в ответ на свет).

Световая информация обрабатывается и уточняется значительным образом путем функционирования фоторецепторов, биполярных клеток, горизонтальных клеток, амакриновых клеток и ганглиозных клеток сетчатки. Для усложнения данной системы фоторецепторы обнаружены в трех основных вариациях, включающих палочки, конусы (из которых три типа отвечают особенно существенно за различие длин волн света) и фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки. Таким образом, первый слой обработки информации происходит на уровне фоторецепторов, которые дифференциально отвечают на определенные длины волн и интенсивности света. Биполярные клетки сетчатки получают информацию от обоих типов клеток, фоторецепторных и горизонтальных. Горизонтальные клетки сетчатки получают информацию от множества фоторецепторных клеток и, таким образом, интегрируют информацию между типами клеток и через расстояния в сетчатке. Биполярные клетки дополнительно интегрируют информацию непосредственно из фоторецепторных клеток и горизонтальных клеток путем получения в основном ступенчатых потенциалов к ганглиозным клеткам сетчатки, хотя некоторые недавние исследования указывают на то, что некоторые биполярные клетки могут генерировать потенциалы действия. Конические биполярные клетки образуют соединения посредством синапса с ганглиозными клетками сетчатки и амакриновыми клетками, в то время как палочковидные биполярные клетки образуют соединение посредством синапса с AII-амакриновыми клетками. Аналогично горизонтальным клеткам большинство амакриновых клеток интегрирует информацию латерально внутри сетчатки. В отличие от горизонтальных клеток, большинство амакриновых клеток представляют собой ингибирующие (GABA-эргические) интернейроны. Амакриновые клетки также более специализированы, чем горизонтальные клетки, так как каждая амакриновая клетка образует специфичное соединение посредством синапса с конкретным типом биполярной клетки (одна из десяти разновидностей биполярной клетки). Конкретно, AII-амакриновая клетка представляет собой критический вставочный нейрон в скотопическом сигнальном пути (при скотопическом зрении, когда конические фоторецепторы не реагируют). An-амакриновые клетки получают синаптический вход из палочковидных биполярных клеток и затем передают на себе сигналы сигнальному пути конических клеток посредством ON- и OFF-конических биполярных клеток к ON-и OFF-ганглиозным клеткам, как описано выше. Таким образом, экспрессия Chop2, и образование в результате ChR2, в палочковидных биполярных клетках или в AII-амакриновых клетках может создавать как ON-, так и OFF-ответы в ганглиозных клетках сетчаки. Кроме того, ганглиозные клетки сетчатки интегрируют информацию из биполярных клеток и из амакриновых клеток. Хотя ганглиозные клетки сетчатки значительно варьируют по размеру, проводимости и ответу на зрительное стимулирование (например, поле зрения), все ганглиозные клетки сетчатки распространяют длинный аксон в мозг. За исключением минимальной части ганглиозных клеток сетчатки, которые передают не зрительную информацию, касающуюся зрачкового светового рефлекса и навязывание суточного ритма, вся совокупность аксонов, распространяющаяся от ганглиозных клеток сетчатки, образует второй черепной нерв, зрительный перекрест и зрительный тракт центральной нервной системы. Следовательно, значительное количество обработки информации происходит в самой сетчатке.

Фоторецепторные клетки экспрессируют эндогенные белки опсины, такие как родопсин. Мутантные белки Chop2 по изобретению могут экспрессироваться в любом типе клеток и образуют функциональные ChR2-каналы. Предпочтительно клетка представляет собой клетку сетчатки. Типичные клетки включают в частности фоторецепторные клетки (например, палочки, конусы и фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки), горизонтальные клетки, биполярные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки сетчатки.

Канал-опсин-2 (Chop2).

Канал-опсин-2 (Chop2) был впервые выделен из зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii. Канал-описин-2 представляет собой белок, содержащий семь трансмембранных доменов, который становится светорегулируемым (светочувствительным), когда связывается с хромофором полностью-трансретиналь. Chop2, будучи связанным с молекулой ретиналя посредством связи с основанием Шиффа, образует светорегулируемый, неспецифичный, выпрямляемый внутри катионный канал, называемый канал-родопсином-2 (Chop2 ретинальиден, сокращенно ChR2).

При обозначении в данном документе канал-опсин-2 или Chop2 относится к гену, который кодирует канал-опсин-2, который затем образует канал-родопсин-2 (ChR2), связанный с ретиналем. Генные конструкты по настоящему изобретению относятся главным образом к канал-опсину-2 (т.е. без ретиналя), и все варианты Chop2, раскрытые в данном документе, образуют функциональные варианты каалродопсина-2. Способы, раскрытые в данном документе, могут включать доставку Chop2 к клеткам без экзогенного ретиналя. Понятно, что при экспрессии Chop2 в клетках (т.е. в нейронах сетчатки), эндоген- 5 043449 но доступный ретиналь связывается с Chop2 дикого типа или с мутантными Chop2 по настоящему изобретению с образованием функциональных светорегулируемых каналов, WT ChR2 или мутантных ChR2.

Как таковые, белки Chop2, при обозначении в данном документе, также могут быть синонимами с ChR2.

При использовании в данном документе, канал-родопсин-2 или ChR2 относятся к ретинальсвязанному функциональному светочувствительному каналу. В одном воплощении, связанный ретиналь может обеспечиваться экзогенно. В предпочтительном воплощении связанный ретиналь обеспечивается на эндогенном уровне, доступном в клетке. Настоящее изобретение также охватывает функциональные каналы канал-родопсина-2, образованные с помощью полипептидов и полинуклеотидов, кодирующих мутанты Chop2, описанные в данном документе.

При освещении предпочтительной дозой светового излучения, ChR2 открывает пору канала, через который ионы Н⁺, Na⁺, K⁺, и/или Са²⁺ перетекают в клетку из внеклеточного пространства. Активация канала ChR2, как правило, вызывает деполяризацию клетки, экспрессирующей канал. Деполяризованная клетка продуцирует ступенчатые потенциалы и/или потенциалы действия для переноса информации от Chop2/ChR2-экспрессирующей клетки к другим клеткам сетчатки или мозга.

Форма ChR2 дикого типа или мутантного ChR2 с высокой временной разрешающей способность находятся в центральном фокусе нейробиологических исследований. При экспрессии в нейроне млекопитающего, ChR2 опосредует светоконтролируемую деполяризацию in vitro или ex vivo культур. ChR2 дикого типа или мутантные ChR2 с высокой временной разрешающей способностью (последние обычно демонстрируют низкую светочувствительность) представляют несколько проблем, которые должны быть разрешены для возможности их применения с целью восстановления зрения. Для цели восстановления зрения ChR2 с высокой светочувствительностью является более целесообразным, чем ChR2 с высокой временной разрешающей способностью.

Белки ChR2 дикого типа требуют для полной активации освещения высокой интенсивности голубой области спектра (т.е. 1018-10¹⁹ фотонов с^-1 см^-2 при длине волны 480 нм). Продолжительное освещение данного типа может разрушить клетки.

Кинетика белка ChR2 дикого типа является недостаточно оптимальной для максимальной эффективности канала.

Эффективность может повышаться путем модификации одной или нескольких аминокислот белка ChR2 дикого типа или для удлинения продолжительности открытого состояния канала, или для повышения единиц проводимости канала, или и то и другое. Одноканальная проводимость ChR2 дикого типа небольшая. Таким образом, нейронная активация in vivo будет требовать или высокой экспрессии канала дикого типа, или очень интенсивной активации с использованием предпочтительной длины волны голубой области спектра. Более простое решение может быть найдено путем изменения проводимости канала или удлинения продолжительности времени открытия канала. Каждый из этих механизмов и, конкретно, комбинация этих механизмов, дает возможность использования более низкой и безопасной интенсивности света для достижения одинакового уровня клеточной деполяризации.

Например, мутантные белки ChR2 по изобретению достигают более высокой светочувствительности посредством удлинения продолжительности открытого состояния канала. Следовательно, каждый мутантный канал ChR2 проводит более высокий фототок, чем канал ChR2 дикого типа при активации одинаковых интенсивностей света. Таким образом, мутантные каналы активируются с помощью интенсивностей света, которые ниже, чем те, что требуются для активации каналов ChR2 дикого типа. Количественно, детектируемая активность спайка ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих мутантные белки ChR2, могут вызываться световой интенсивностью, которая на 1,5-2 log единиц ниже, чем световая интенсивность, требуемая, чтобы вызвать активность спайка из ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих ChR2 дикого типа. Таким образом, световые интенсивности, требуемые для активации мутантных белков ChR2, близки к интервалу нормального дневного освещения или попадают в него.

Следующие последовательности обеспечивают частные примеры мутантных и белков Chop2 дикого типа и полинуклеотиды, кодирующие указанные WT и мутантные белки Chop2 по изобретению, и образующие WT и мутантные ChR2 по изобретению.

Chop2 (WT) дикого типа по изобретению могут кодироваться следующей мРНК-последовательностью светорегулируемого ионного канала хламиопсина 4 Chlamydomonas reinhardtii (COP4) (GenBank № XM_001701673 и SEQ ID NO: 1.

- 6 043449 gcagcaccat acttgacatc tgtcgccaag caagcattaa acatggatta tggaggcgcc ctgagtgccg ttgggcgcga gctgctattt gtaacgaacc cagtagtcgt caatggctct

121 gtacttgtgc ctgaggacca gtgttactgc gcgggctgga ttgagtcgcg tggcacaaac

181 ggtgcccaaa cggcgtcgaa cgtgctgcaa tggcttgctg ctggcttctc catcctactg

241 cttatgtttt acgcctacca aacatggaag tcaacctgcg gctgggagga gatctatgtg

301 tgcgctatcg agatggtcaa ggtgattctc gagttcttct tcgagtttaa gaacccgtcc

361 atgctgtatc tagccacagg ccaccgcgtc cagtggttgc gttacgccga gtggcttctc

421 acctgcccgg tcattctcat tcacctgtca aacctgacgg gcttgtccaa cgactacagc

481 aggcgcacca tgggtctgct tgtgtctgat attggcacaa ttgtgtgggg cgccacttcc

541 gccatggcca ccggatacgt caaggtcatc ttcttctgcc tgggtctgtg ttatggtgct

601 aacacgttct ttcacgctgc caaggcctac atcgagggtt accacaccgt gccgaagggc

661 cggtgtcgcc aggtggtgac tggcatggct tggctcttct tcgtatcatg gggtatgttc

721 cccatcctgt tcatcctcgg ccccgagggc ttcggcgtcc tgagcgtgta cggctccacc

781 gtcggccaca ccatcattga cctgatgtcg aagaactgct ggggtctgct cggccactac

841 ctgcgcgtgc tgatccacga gcatatcctc atccacggcg acattcgcaa gaccaccaaa

901 ttgaacattg gtggcactga gattgaggtc gagacgctgg tggaggacga ggccgaggct

961 ggcgcggtca acaagggcac cggcaagtac gcctcccgcg agtccttcct ggtcatgcgc

1021 gacaagatga aggagaaggg cattgacgtg cgcgcctctc tggacaacag caaggaggtg

1081 gagcaggagc aggccgccag ggctgccatg atgatgatga acggcaatgg catgggtatg

1141 ggaatgggaa tgaacggcat gaacggaatg ggcggtatga acgggatggc tggcggcgcc

1201 aagcccggcc tggagctcac tccgcagcta cagcccggcc gcgtcatcct ggcggtgccg

1261 gacatcagca tggttgactt cttccgcgag cagtttgctc agctatcggt gacgtacgag

1321 ctggtgccgg ccctgggcgc tgacaacaca ctggcgctgg ttacgcaggc gcagaacctg

1381 ggcggcgtgg actttgtgtt gattcacccc gagttcctgc gcgaccgctc tagcaccagc

1441 atcctgagcc gcctgcgcgg cgcgggccag cgtgtggctg cgttcggctg ggcgcagctg

1501 gggcccatgc gtgacctgat cgagtccgca aacctggacg gctggctgga gggcccctcg

1561 ttcggacagg gcatcctgcc ggcccacatc gttgccctgg tggccaagat gcagcagatg

1621 cgcaagatgc agcagatgca gcagattggc atgatgaccg gcggcatgaa cggcatgggc

1681 ggcggtatgg gcggcggcat gaacggcatg ggcggcggca acggcatgaa caacatgggc

1741 aacggcatgg gcggcggcat gggcaacggc atgggcggca atggcatgaa cggaatgggt

1801 ggcggcaacg gcatgaacaa catgggcggc aacggaatgg ccggcaacgg aatgggcggc

1861 ggcatgggcg gcaacggtat gggtggctcc atgaacggca tgagctccgg cgtggtggcc

1921 aacgtgacgc cctccgccgc cggcggcatg ggcggcatga tgaacggcgg catggctgcg

1981 ccccagtcgc ccggcatgaa cggcggccgc ctgggtacca acccgctctt caacgccgcg

2041 ccctcaccgc tcagctcgca gctcggtgcc gaggcaggca tgggcagcat gggaggcatg

2101 ggcggaatga gcggaatggg aggcatgggt ggaatggggg gcatgggcgg cgccggcgcc

2161 gccacgacgc aggctgcggg cggcaacgcg gaggcggaga tgctgcagaa tctcatgaac

2221 gagatcaatc gcctgaagcg cgagcttggc gagtaaaagg ctggaggccg gtactgcgat

2281 acctgcgagc tcgcgcgcct gactcgtcgt acacacggct caggagcacg cgcgcgtgga

2341 cttctcaacc tgtgtgcaac gtatctagag cggcctgtgc gcgaccgtcc gtgagcattc

2401 cggtgcgatc ttcccgcctt cgcaccgcaa gttcccttcc tggccctgct gcgcctgacg

2461 catcgtccga acggaagggc ggcttgatca gtaaagcatt gaagactgaa gtcgtgcgac

2521 cgtagtgcta tggctctgca cgtaagtggg cgctgccctg cttactacgc attgcccaag

2581 actgcttcct tttggtggcc gaggccctgg tcccacatca ttcatttgca taacgtactg

2641 tttagttaca tacgctttgc ttaacctcga caattgcaac atgggctgag agtccgtacg

2701 gcggctatgg acgaaggtgt tatcggatgt gattaggaat ctcggttgaa aggcttcgag

2761 aaagtgagct tcatctgtgg cttctgttgg ggtcatcaag aagaacgacg gtaaggcaaa

2821 cgaggtaaaa gtggcacgtc tttgtgcaca acgggcccgt ggagagtggg ggagtgcatg

2881 tgtgcggtcc taacacgcga gtgcaaagcg ggcttttctg gagctgggtt acggtctggc

2941 tcggcaactg ctctgtgttt taaccacagc ttcggaagtc tgggtatgtt ttgttggcag

3001 aaacatttgg gtaacttgag ggtgattcgt ctggagtcgg acaacatggc tgccgtccgt

3061 gtgcagggac ggtaatcaat gagctggagc tgtgatgctc accacacgtt gcatacccct

3121 gcttacaaaa acactttgat gtcgtggcca aactatgcgt gagcaaagag ttaaagaggc

3181 atgagtgcat ggttgcggac gtgcgcaaca attgcatcaa gtatttgacg ccttcaagcc

3241 aacaagtgcg cgcgcggcaa cttgattaac acgccggacg cagtggtggg ggcgtgtaca

3301 gtgtttatga gctgccattc tgcgatccgt agtgttaggt tgcgtgtgac gccgcgcggc

3361 tgtgggccct tacatggaga gttgggtgct tcaccacacg gttggcgccg ctgaagggtg

3421 tgctatgttt tggtaaagcc ggggccctga agaccgcaac cgtagaaccg tactgaaagg

3481 gtgtcagccc ggggtaactg gatgccctgg gacatagcta ttaatgttga agtgaagccg

3541 tcaagccgag tgccgtgcgc cgctgtatca ccaaggcccg tecta

ChR2 (WT) дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью светорегулируемого ионного канала хламиопсина 4 (СОР4) (GenBank № XP 001701725 и SEQ ID NO: 2).

- 7 043449 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr

121 yaewlltcpv ilihlsnltg Isndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl

181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl

241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv

301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq аагаалшшп

361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq

421 Isvtyelvpa Igadntlalv tqaqnlggvd fvlihpeflr drsstsilsr Irgagqrvaa

481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg

541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma

601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggrm nggmaapqsp gmnggrlgtn

661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem

721 Iqnlmneinr Ikrelge

Chop2 (WT) дикого типа по изобретению могут кодироваться следующей последовательностью гена белка, связывающего ретиналь, Chlamydomonas reinhardtii (cop4) (GenBank № AF461397 и SEQ ID NO: 3).

gcatctgtcg ccaagcaagc attaaacatg gattatggag gcgccctgag tgccgttggg cgcgagctgc tatttgtaac gaacccagta gtcgtcaatg gctctgtact tgtgcctgag

121 gaccagtgtt actgcgcggg ctggattgag tcgcgtggca caaacggtgc ccaaacggcg

181 tcgaacgtgc tgcaatggct tgctgctggc ttctccatcc tactgcttat gttttacgcc

241 taccaaacat ggaagtcaac ctgcggctgg gaggagatct atgtgtgcgc tatcgagatg

301 gtcaaggtga ttctcgagtt cttcttcgag tttaagaacc cgtccatgct gtatctagcc

361 acaggccacc gcgtccagtg gttgcgttac gccgagtggc ttctcacctg cccggtcatt

421 ctcattcacc tgtcaaacct gacgggcttg tccaacgact acagcaggcg caccatgggt

481 ctgcttgtgt ctgatattgg cacaattgtg tggggcgcca cttccgccat ggccaccgga

541 tacgtcaagg tcatcttctt ctgcctgggt ctgtgttatg gtgctaacac gttctttcac

601 gctgccaagg cctacatcga gggttaccac accgtgccga agggccggtg tcgccaggtg

661 gtgactggca tggcttggct cttcttcgta tcatggggta tgttccccat cctgttcatc

721 ctcggccccg agggcttcgg cgtcctgagc gtgtacggct ccaccgtcgg ccacaccatc

781 attgacctga tgtcgaagaa ctgctggggt ctgctcggcc actacctgcg cgtgctgatc

841 cacgagcata tcctcatcca cggcgacatt cgcaagacca ccaaattgaa cattggtggc

901 actgagattg aggtcgagac gctggtggag gacgaggccg aggctggcgc ggtcaacaag

961 ggcaccggca agtacgcctc ccgcgagtcc ttcctggtca tgcgcgacaa gatgaaggag

1021 aagggcattg acgtgcgcgc ctctctggac aacagcaagg aggtggagca ggagcaggcc

1081 gccagggctg ccatgatgat gatgaacggc aatggcatgg gtatgggaat gggaatgaac

1141 ggcatgaacg gaatgggcgg tatgaacggg atggctggcg gcgccaagcc cggcctggag

1201 ctcactccgc agctacagcc cggccgcgtc atcctggcgg tgccggacat cagcatggtt

1261 gacttcttcc gcgagcagtt tgctcagcta tcggtgacgt acgagctggt gccggccctg

1321 ggcgctgaca acacactggc gctggttacg caggcgcaga acctgggcgg cgtggacttt

1381 gtgttgattc accccgagtt cctgcgcgac cgctctagca ccagcatcct gagccgcctg

1441 cgcggcgcgg gccagcgtgt ggctgcgttc ggctgggcgc agctggggcc catgcgtgac

1501 ctgatcgagt ccgcaaacct ggacggctgg ctggagggcc cctcgttcgg acagggcatc

1561 ctgccggccc acatcgttgc cctggtggcc aagatgcagc agatgcgcaa gatgcagcag

1621 atgcagcaga ttggcatgat gaccggcggc atgaacggca tgggcggcgg tatgggcggc

1681 ggcatgaacg gcatgggcgg cggcaacggc atgaacaaca tgggcaacgg catgggcggc

1741 ggcatgggca acggcatggg cggcaatggc atgaacggaa tgggtggcgg caacggcatg

1801 aacaacatgg gcggcaacgg aatggccggc aacggaatgg gcggcggcat gggcggcaac

1861 ggtatgggtg gctccatgaa cggcatgagc tccggcgtgg tggccaacgt gacgccctcc

1921 gccgccggcg gcatgggcgg catgatgaac ggcggcatgg ctgcgcccca gtcgcccggc

1981 atgaacggcg gccgcctggg taccaacccg ctcttcaacg ccgcgccctc accgctcagc

2041 tcgcagctcg gtgccgaggc aggcatgggc agcatgggag gcatgggcgg aatgagcgga

2101 atgggaggca tgggtggaat ggggggcatg ggcggcgccg gcgccgccac gacgcaggct

2161 gcgggcggca acgcggaggc ggagatgctg cagaatctca tgaacgagat caatcgcctg

2221 aagcgcgagc ttggcgagta a

Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью белка, связывающего ретиналь, Chlamydomonas reinhardtii (cop4) (GenBank № AAM15777 и SEQ ID NO: 4).

mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr

121 yaewlltcpv ilihlsnltg Isndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl

181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl

241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv

301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn

361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq

421 Isvtyelvpa Igadntlalv tqaqnlggvd fvlihpeflr drsstsilsr Irgagqrvaa

481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg

541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma

601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn

661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem

721 Iqnlmneinr Ikrelge

Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей мРНК-последовательностью

- 8 043449 сенсорного опсина В Chlamydomonas reinhardtii (CSOB) (GenBank № AF508966 и SEQ ID NO: 5).

ttgacatctg tcgccaagca agcattaaac atggattatg gaggcgccct gagtgccgtt gggcgcgagc tgctatttgt aacgaaccca gtagtcgtca atggctctgt acttgtgcct

121 gaggaccagt gttactgcgc gggctggatt gagtcgcgtg gcacaaacgg tgcccaaacg

181 gcgtcgaacg tgctgcaatg gcttgctgct ggcttctcca tcctactgct tatgttttac

241 gcctaccaaa catggaagtc aacctgcggc tgggaggaga tctatgtgtg cgctatcgag

301 atggtcaagg tgattctcga gttcttcttc gagtttaaga acccgtccat gctgtatcta

361 gccacaggcc accgcgtcca gtggttgcgt tacgccgagt ggcttctcac ctgcccggtc

421 attctcattc acctgtcaaa cctgacgggc ttgtccaacg actacagcag gcgcaccatg

481 ggtctgcttg tgtctgatat tggcacaatt gtgtggggcg ccacttccgc catggccacc

541 ggatacgtca aggtcatctt cttctgcctg ggtctgtgtt atggtgctaa cacgttcttt

601 cacgctgcca aggcctacat cgagggttac cacaccgtgc cgaagggccg gtgtcgccag

661 gtggtgactg gcatggcttg gctcttcttc gtatcatggg gtatgttccc catcctgttc

721 atcctcggcc ccgagggctt cggcgtcctg agcgtgtacg gctccaccgt cggccacacc

781 atcattgacc tgatgtcgaa gaactgctgg ggtctgctcg gccactacct gcgcgtgctg

841 atccacgagc atatcctcat ccacggcgac attcgcaaga ccaccaaatt gaacattggt

901 ggcactgaga ttgaggtcga gacgctggtg gaggacgagg ccgaggctgg cgcggtcaac

961 aagggcaccg gcaagtacgc ctcccgcgag tccttcctgg tcatgcgcga caagatgaag

1021 gagaagggca ttgacgtgcg cgcctctctg gacaacagca aggaggtgga gcaggagcag

1081 gccgccaggg ctgccatgat gatgatgaac ggcaatggca tgggtatggg aatgggaatg

1141 aacggcatga acggaatggg cggtatgaac gggatggctg gcggcgccaa gcccggcctg

1201 gagctcactc cgcagctaca gcccggccgc gtcatcctgg cggtgccgga catcagcatg

1261 gttgacttct tccgcgagca gtttgctcag ctatcggtga cgtacgagct ggtgccggcc

1321 ctgggcgctg acaacacact ggcgctggtt acgcaggcgc agaacctggg cggcgtggac

1381 tttgtgttga ttcaccccga gttcctgcgc gaccgctcta gcaccagcat cctgagccgc

1441 ctgcgcggcg cgggccagcg tgtggctgcg ttcggctggg cgcagctggg gcccatgcgt

1501 gacctgatcg agtccgcaaa cctggacggc tggctggagg gcccctcgtt cggacagggc

1561 atcctgccgg cccacatcgt tgccctggtg gccaagatgc agcagatgcg caagatgcag

1621 cagatgcagc agattggcat gatgaccggc ggcatgaacg gcatgggcgg cggtatgggc

1681 ggcggcatga acggcatggg cggcggcaac ggcatgaaca acatgggcaa cggcatgggc

1741 ggcggcatgg gcaacggcat gggcggcaat ggcatgaacg gaatgggtgg cggcaacggc

1801 atgaacaaca tgggcggcaa cggaatggcc ggcaacggaa tgggcggcgg catgggcggc

1861 aacggtatgg gtggctccat gaacggcatg agctccggcg tggtggccaa cgtgacgccc

1921 tccgccgccg gcggcatggg cggcatgatg aacggcggca tggctgcgcc ccagtcgccc

1981 ggcatgaacg gcggccgcct gggtaccaac ccgctcttca acgccgcgcc ctcaccgctc

2041 agctcgcagc tcggtgccga ggcaggcatg ggcagcatgg gaggcatggg cggaatgagc

2101 ggaatgggag gcatgggtgg aatggggggc atgggcggcg ccggcgccgc cacgacgcag

2161 gctgcgggcg gcaacgcgga ggcggagatg ctgcagaatc tcatgaacga gatcaatcgc

2221 ctgaagcgcg agcttggcga gtaaaaggct ggaggccggt actgcgatac ctgcgagctc

2281 gcgcgcctga ctcgtcgtac acacggctca ggagcacgcg cgcgtggact tctcaacctg

2341 tgtgcaacgt atctagagcg gcctgtgcgc gaccgtccgt gagcattccg gtgcgatctt

2401 cccgccttcg caccgcaagt tcccttcctg gccctgctgc gcctgacgca tcgtccgaac

2461 ggaagggcgg cttgatcagt aaagcattga agactgaagt cgtgcgaccg tagtgctatg

2521 gctctgcacg taagtgggcg ctgccctgct tactacgcat tgcccaagac tgcttccttt

2581 tggtggccga ggccctggtc ccacatcatt catttgcata acgtactgtt tagttacata

2641 cgctttgctt aacctcgaca attgcaacat gggctgagag tccgtacggc ggctatggac

2701 gaaggtgtta tcggatgtga ttaggaatct cggttgaaag gcttcgagaa agtgagcttc

2761 ttctgtggct tctgttgggg tcatcaagaa gaacgacggt aaggcaaacg aggtaaaagt

2821 ggcacgtctt tgtgcacaac gggcccgtgg agagtggggg agtgcatgtg tgcggtccta

2881 acacgcgagt gcaaagcggg cttttctgga gctgggttac ggtctggctc ggcaactgct

2941 ctgtgtttta accacagctt cggaagtctg ggtatgtttt gttggcagaa acatttgggt

3001 aacttgaggg tgattcgtct ggagtcggac aacatggctg ccgtccgtgt gcagggacgg

3061 taatcaatga agctgaagct gtgatgctca ccacacgttg catacccctg cttacaaaaa

3121 cactttgatg tcgtggccaa actatgcgtg agcaaagagt taaagaggca tgagtgcatg

3181 gttgcggacg tgcgcaacaa ttgcatcaag tatttgacgc cttcaagcca acaagtgcgc

3241 gcgcggcaac ttgattaaca cgccggacgc agtggtgggg gcgtgtacag tgtttatgag

3301 ctgccattct gcgatccgta gtgttaggtt gcgtgtgacg ccgcgcggct gtgggccctt

3361 acatggagag ttgggtgctt caccacacgg ttggcgccgc tgaagggtgt gctatgtttt

3421 ggtaaagccg gggccctgaa gaccgcaacc gtagaaccgt actgaaaggg tgtcagcccg

3481 gggtaactgg atgccctggg acatagctat taatgttgaa gtgaagccgt caagccgagt

3541 gccgtgcgcc gctgtatcac caaggcccgt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa

Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью сенсорного опсина В Chlamydomonas reinhardtii (CSOB) (GenBank. № AAM44040 и SEQ ID NO: 6).

mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr

121 yaewlltcpv ilihlsnltg Isndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl

181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl

- 9 043449

241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv

301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn

361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq

421 Isvtyelvpa Igadntlalv tqaqnlggvd fvlihpeflr drsstsilsr Irgagqrvaa

481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg

541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma

601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn

661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem

721 Iqnlmneinr Ikrelge

Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей мРНК-последовательностью опсина-2 простейшего типа Chlamydomonas reinhardtii acop2 (GenBank № AB058891 и SEQ ID NO: 7).

catctgtcgc caagcaagca ttaaacatgg attatggagg cgccctgagt gccgttgggc gcgagctgct atttgtaacg aacccagtag tcgtcaatgg ctctgtactt gtgcctgagg

121 accagtgtta ctgcgcgggc tggattgagt cgcgtggcac aaacggtgcc caaacggcgt

181 cgaacgtgct gcaatggctt gctgctggct tctccatcct actgcttatg ttttacgcct

241 accaaacatg gaagtcaacc tgcggctggg aggagatcta tgtgtgcgct atcgagatgg

301 tcaaggtgat tctcgagttc ttcttcgagt ttaagaaccc gtccatgctg tatctagcca

361 caggccaccg cgtccagtgg ttgcgttacg ccgagtggct tctcacctgc ccggtcattc

421 tcattcacct gtcaaacctg acgggcttgt ccaacgacta cagcaggcgc accatgggtc

481 tgcttgtgtc tgatattggc acaattgtgt ggggcgccac ttccgccatg gccaccggat

541 acgtcaaggt catcttcttc tgcctgggtc tgtgttatgg tgctaacacg ttctttcacg

601 ctgccaaggc ctacatcgag ggttaccaca ccgtgccgaa gggccggtgt cgccaggtgg

661 tgactggcat ggcttggctc ttcttcgtat catggggtat gttccccatc ctgttcatcc

721 tcggccccga gggcttcggc gtcctgagcg tgtacggctc caccgtcggc cacaccatca

781 ttgacctgat gtcgaagaac tgctggggtc tgctcggcca ctacctgcgc gtgctgatcc

841 acgagcatat cctcatccac ggcgacattc gcaagaccac caaattgaac attggtggca

901 ctgagattga ggtcgagacg ctggtggagg acgaggccga ggctggcgcg gtcaacaagg

961 gcaccggcaa gtacgcctcc cgcgagtcct tcctggtcat gcgcgacaag atgaaggaga

1021 agggcattga cgtgcgcgcc tctctggaca acagcaagga ggtggagcag gagcaggccg

1081 ccagggctgc catgatgatg atgaacggca atggcatggg tatgggaatg ggaatgaacg

1141 gcatgaacgg aatgggcggt atgaacggga tggctggcgg cgccaagccc ggcctggagc

1201 tcactccgca gctacagccc ggccgcgtca tcctggcggt gccggacatc agcatggttg

1261 acttcttccg cgagcagttt gctcagctat cggtgacgta cgagctggtg ccggccctgg

1321 gcgctgacaa cacactggcg ctggttacgc aggcgcagaa cctgggcggc gtggactttg

1381 tgttgattca ccccgagttc ctgcgcgacc gctctagcac cagcatcctg agccgcctgc

1441 gcggcgcggg ccagcgtgtg gctgcgttcg gctgggcgca gctggggccc atgcgtgacc

1501 tgatcgagtc cgcaaacctg gacggctggc tggagggccc ctcgttcgga cagggcatcc

1561 tgccggccca catcgttgcc ctggtggcca agatgcagca gatgcgcaag atgcagcaga

1621 tgcagcagat tggcatgatg accggcggca tgaacggcat gggcggcggt atgggcggcg

1681 gcatgaacgg catgggcggc ggcaacggca tgaacaacat gggcaacggc atgggcggcg

1741 gcatgggcaa cggcatgggc ggcaatggca tgaacggaat gggtggcggc aacggcatga

1801 acaacatggg cggcaacgga atggccggca acggaatggg cggcggcatg ggcggcaacg

1861 gtatgggtgg ctccatgaac ggcatgagct ccggcgtggt ggccaacgtg acgccctccg

1921 ccgccggcgg catgggcggc atgatgaacg gcggcatggc tgcgccccag tcgcccggca

1981 tgaacggcgg ccgcctgggt accaacccgc tcttcaacgc cgcgccctca ccgctcagct

2041 cgcagctcgg tgccgaggca ggcatgggca gcatgggagg catgggcgga atgagcggaa

2101 tgggaggcat gggtggaatg gggggcatgg gcggcgccgg cgccgccacg acgcaggctg

2161 cgggcggcaa cgcggaggcg gagatgctgc agaatctcat gaacgagatc aatcgcctga

2221 agcgcgagct tggcgagtaa aaggctggag gccggtactg cgatacctgc gagctcgcgc

2281 gcctgactcg tcgtacacac ggctcaggag cacgcgcgcg tggacttctc aacctgtgtg

2341 caacgtatct agagcggcct gtgcgcgacc gtccgtgagc attccggtgc gatcttcccg

2401 ccttcgcacc gcaagttccc ttcctggccc tgctgcgcct gacgcatc

Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей асор2 мРНК-последовательностью Chlamydomonas reinhardtii, кодирующей аминокислотную последовательность опсина-2 простейшего типа (GenBank № BAB68567 и SEQ ID NO: 8).

mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr

121 yaewlltcpv ilihlsnltg Isndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl

181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl

241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv

301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn

361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq

421 Isvtyelvpa Igadntlalv tqaqnlggvd fvlihpeflr drsstsilsr Irgagqrvaa

481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg

541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma

601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn

661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem

721 Iqnlmneinr Ikrelge

ChR2-мутанты.

В настоящем изобретении предлагаются Chop2-мутанты, где одна или несколько аминокислот под

- 10 043449 вергнуты мутации. В некоторых воплощениях Chop2 представляет собой полноразмерный полипептид, такой как SEQ ID NO: 2, 4, 6 и 8, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную мутацию. В некоторых воплощениях, мутация располагается в аминокислоте 132 и/или аминокислоте 159. В некоторых предпочтительных воплощениях, аминокислота в положении 132 подвергается мутации с лейцина на цистеин или аланин. В некоторых предпочтительных воплощениях, аминокислота в положении 159 подвергается мутации с треонина на аланин, цистеин или серин. Во всех воплощениях, Chop2-мутанты образуют функциональный канал ChR2.

Настоящее изобретение также охватывает белки Chop2 и нуклеиновые кислоты, которые кодируют биологически активный фрагмент или консервативную аминокислотную замену или другой мутантный вариант Chop2. Частные примеры применяемых фрагментов включают полипептиды, кодирующие аминокислоты 1-315 дикого типа Chop2, т.е. SEQ ID NO: 26, где по меньшей мере одна аминокислота подвергнута мутации или консервативной замене, например, в аминокислотных положениях 132 и/или 159. Более короткие фрагменты Chop2 дикого типа, где по меньшей мере одна аминокислота подвергнута мутации или консервативной замене (т.е. в аминокислотных положениях 132 и/или 159), также могут использоваться в настоящем изобретении. Соответственно, полипептиды Chop2 и нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению дополнительно включают в частности биологически активные фрагменты, кодирующие аминокислоты 1-315, 1-310, 1-300, 1-275, 1-250, 1-225, 1-200, 1-175, или 1-160 Chop2 дикого типа, где по меньшей мере одна аминокислота подвергнута мутации или консервативной замене, например в аминокислотных положениях 132 и/или 159. В других воплощениях, полипептиды Chop2 и нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут составлять по длине примерно или до 315 аминокислот, 310 аминокислот, 300 аминокислот, 275 аминокислот, 250 аминокислот, 225 аминокислот, 200 аминокислот, 175 аминокислот или 160 аминокислот.

Одиночный мутант Chop2 по изобретению может кодироваться следующим синтетическим конструктом генной последовательности hVChR1-mKate-betahChR2 (L132C) (GenBank № JN836746 и SEQ ID NO: 9), содержащим следующие аннотации, GFP последовательность обозначена жирным, последовательность L132C Chop2 подчеркнута.

atggattacc ctgtggcccg gtccctgatt gtaagatacc ccaccgatct gggcaatgga accgtgtgca tgcccagagg acaatgctac tgcgaggggt ggctgaggag ccggggcact

121 agtatcgaaa aaaccatcgc tatcaccctc cagtgggtag tgttcgctct gtccgtagcc

181 tgtctcggct ggtatgcata ccaagcctgg agggctacct gtgggtggga ggaagtatac

241 gtggccctga tcgagatgat gaagtccatc atcgaggctt tccatgagtt cgactcccca

301 gccacactct ggctcagcag tgggaatggc gtagtgtgga tgagatatgg agagtggctg

361 ctgacctgtc ccgtcctgct cattcatctg tccaatctga ccgggctgaa agatgactac

421 tccaagagaa caatgggact gctggtgagt gacgtggggt gtattgtgtg gggagccacc

481 tccgccatgt gcactggatg gaccaagatc ctctttttcc tgatttccct ctcctatggg

541 atgtatacat acttccacgc cgctaaggtg tatattgagg ccttccacac tgtacctaaa

601 ggcatctgta gggagctcgt gcgggtgatg gcatggacct tctttgtggc ctgggggatg

661 ttccccgtgc tgttcctcct cggcactgag ggatttggcc acattagtcc ttacgggtcc

721 gcaattggac actccatcct ggatctgatt gccaagaata tgtggggggt gctgggaaat

781 tatctgcggg taaagatcca cgagcatatc ctgctgtatg gcgatatcag aaagaagcag

841 aaaatcacca ttgctggaca ggaaatggag gtggagacac tggtagcaga ggaggaggac

901 gggaccgcgg tcgccaccat ggtgtctaag ggcgaagagc tgattaagga gaacatgcac

961 atgaagctgt acatggaggg caccgtgaac aaccaccact tcaagtgcac atccgagggc

1021 gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct

1081 ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aaccttcatc

1141 aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg

1201 gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc

1261 caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttccc atccaacggc

1321 cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggcctcca ccgagatgct gtaccccgct

1381 gacggcggcc tggaaggcag agccgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gggccacctg

1441 atctgcaact tgaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc

1501 ggcgtctact atgtggacag aagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac

1561 gtcgagcagc acgaggtggc tgtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac

1621 aaacttaatt gcctgcagga gaagaagtca tgcagccagc gcatggccga attccggcaa

1681 tactgttgga acccggacac tgggcagatg ctgggccgca ccccagcccg gtgggtgtgg

1741 atcagcctgt actatgcagc tttctacgtg gtcatgactg ggctctttgc cttgtgcatc

1801 tatgtgctga tgcagaccat tgatccctac acccccgact accaggacca gttaaagtca

1861 ccgggggtaa ccttgagacc ggatgtgtat ggggaaagag ggctgcagat ttcctacaac

1921 atctctgaaa acagctctag acaggcccag atcaccggac gtccggagac tgagacattg

1981 с с a с cggtgg actacggggg ggccctgagc gctgtgggca gagaactcct gttcgtgaca

2041 aatccagtcg tggtgaacgg ctccgtactc gtacccgagg atcagtgcta ttgcgcagga

2101 tggatcgaga gcagaggcac aaacggcgca cagactgcat ccaacgtgct ccagtggttg

2161 gccgcaggct tttccattct cctgctcatg ttttacgcct accagacttg gaagtccaca

2221 tgtggctggg aggaaatcta cgtgtgtgca atcgaaatgg tgaaggtgat cctggagttt

2281 ttcttcgaat ttaaaaaccc aagcatgctg tacctggcta ctggccacag agtgcagtgg

2341 ctgcggtatg ccgaatggct gctgacttgc ccagtgattt gcatccacct gtccaacctg

2401 actgggctgt ctaacgatta cagtaggaga acaatgggac tgctcgtatc cgacatcggc

2461 actatcgtat ggggcgcaac tagtgccatg gccactggat acgtgaaagt gatcttcttc

- 11 043449

2521 tgcctgggac tctgctacgg agcaaacaca ttttttcatg ccgcaaaagc atatatcgag

2581 gggtatcata ccgtcccaaa gggccggtgt agacaagtgg tgactggcat ggcttggctg

2641 ttcttcgtgt cctgggggat gtttcccatc ctctttatcc tgggcccaga aggcttcggg

2701 gtgctgagtg tgtatggcag taccgtagga cacactatca ttgacctgat gagcaaaaac

761 tgctgggggc tgctcggcca ctacctgaga gtactcatcc acgagcatat cctgattcat

2821 ggcgatatcc ggaaaactac caagctcaat atcgggggca ccgagattga agtggagaca

2881 ctcgtggagg acgaggccga ggccggagca gtgaacaaag gcactggcaa gtatgcctcc

2941 agagaatcct ttctggtgat gcgggacaaa atgaaggaga aaggcattga tgtacggtgc

3001 agtaatgcca aagccgtcga gactgatgtg tag

Одиночный мутант ChR2 по изобретению может кодироваться следующим синтетическим конструктом аминокислотной последовательности hVChR1-mKate-betahChR2 (L132C) (GenBank № AER29839 и SEQ ID NO: 10), содержащим следующие аннотации, GFP-последовательность обозначена жирным шрифтом, последовательность L132C Chop2 подчеркнута.

mdypvarsli vryptdlgng tvcmprgqcy cegwlrsrgt siektiaitl qwvvfalsva clgwyayqaw ratcgweevy valiemmksi ieafhefdsp atlwlssgng vvwmrygewl

121 Itcpvllihl snltglkddy skrtmgllvs dvgcivwgat samctgwtki Ifflislsyg

181 mytyfhaakv yieafhtvpk gicrelvrvm awtffvawgm fpvlfllgte gfghispygs

241 aighsildli aknmwgvlgn ylrvkihehi llygdirkkq kitiagqeme vetlvaeeed

301 gtavatmvsk geelikenmh mklymegtvn nhhfkctseg egkpyegtqt mrikweggp

361 Ipfafdilat sfmygsktfi nhtqgipdff kqsfpegftw ervttyedgg vltatqdtsl

421 qdgcliynvk irgvnfpsng pvmqkktlgw eastemlypa dgglegradm alklvggghl

481 icnlkttyrs kkpaknlkmp gvyyvdrrle rikeadkety veqhevavar ycdlpsklgh

541 klnclqekks csqrmaefrq ycwnpdtgqm Igrtparwvw islyyaafyv vmtglfalci

601 yvlmqtidpy tpdyqdqlks pgvtlrpdvy gerglqisyn isenssrqaq itgrpetetl

661 ppvdyggals avgrellfvt npvvvngsvl vpedqcycag wiesrgtnga qtasnvlqwl

721 aagfsilllm fyayqtwkst cgweeiyvca iemvkvilef ffefknpsml ylatghrvqw

781 Iryaewlltc pvicihlsnl tglsndysrr tmgllvsdig tivwgatsam atgyvkviff

841 clglcygant ffhaakayie gyhtvpkgrc rqvvtgmawl ffvswgmfpi Ifilgpegfg

901 vlsvygstvg htiidlmskn cwgllghylr vlihehilih gdirkttkln iggteievet

961 Ivedeaeaga vnkgtgkyas resflvmrdk mkekgidvrc snakavetdv

Одиночный мутант Chop2 по изобретению может кодироваться следующей генной последовательностью синтетического конструкта hVChR1-mKate-betahChR2 (L132C) (GenBank. № JN836745 и SEQ ID NO: 11), содержащего следующие аннотации, GFP-последовательность обозначена жирным шрифтом, последовательность L132C Chop2 подчеркнута.

atggattacc ctgtggcccg gtccctgatt gtaagatacc ccaccgatct gggcaatgga accgtgtgca tgcccagagg acaatgctac tgcgaggggt ggctgaggag ccggggcact

121 agtatcgaaa aaaccatcgc tatcaccctc cagtgggtag tgttcgctct gtccgtagcc

181 tgtctcggct ggtatgcata ccaagcctgg agggctacct gtgggtggga ggaagtatac

241 gtggccctga tcgagatgat gaagtccatc atcgaggctt tccatgagtt cgactcccca

301 gccacactct ggctcagcag tgggaatggc gtagtgtgga tgagatatgg agagtggctg

361 ctgacctgtc ccgtcctgct cattcatctg tccaatctga ccgggctgaa agatgactac

421 tccaagagaa caatgggact gctggtgagt gacgtggggt gtattgtgtg gggagccacc

481 tccgccatgt gcactggatg gaccaagatc ctctttttcc tgatttccct ctcctatggg

541 atgtatacat acttccacgc cgctaaggtg tatattgagg ccttccacac tgtacctaaa

601 ggcatctgta gggagctcgt gcgggtgatg gcatggacct tctttgtggc ctgggggatg

661 ttccccgtgc tgttcctcct cggcactgag ggatttggcc acattagtcc ttacgggtcc

721 gcaattggac actccatcct ggatctgatt gccaagaata tgtggggggt gctgggaaat

781 tatctgcggg taaagatcca cgagcatatc ctgctgtatg gcgatatcag aaagaagcag

841 aaaatcacca ttgctggaca ggaaatggag gtggagacac tggtagcaga ggaggaggac

901 gggaccgcgg tcgccaccat ggtgtctaag ggcgaagagc tgattaagga gaacatgcac

- 12 043449

961 atgaagctgt acatggaggg caccgtgaac aaccaccact tcaagtgcac atccgagggc

1021 gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct

1081 ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aaccttcatc

1141 aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg

1201 gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc

1261 caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttccc atccaacggc

1321 cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggcctcca ccgagatgct gtaccccgct

1381 gacggcggcc tggaaggcag agccgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gggccacctg

1441 atctgcaact tgaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc

1501 ggcgtctact atgtggacag aagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac

1561 gtcgagcagc acgaggtggc tgtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac

1621 aaacttaatt gcctgcagga gaagaagtca tgcagccagc gcatggccga attccggcaa

1681 tactgttgga acccggacac tgggcagatg ctgggccgca ccccagcccg gtgggtgtgg

1741 atcagcctgt actatgcagc tttctacgtg gtcatgactg ggctctttgc cttgtgcatc

1801 tatgtgctga tgcagaccat tgatccctac acccccgact accaggacca gttaaagtca

1861 ccgggggtaa ccttgagacc ggatgtgtat ggggaaagag ggctgcagat ttcctacaac

1921 atctctgaaa acagctctag acaggcccag atcaccggac gtccggagac tgagacattg

1981 ccaccggtgg actacggggg ggccctgagc gctgtgggca gagaactcct gttcgtgaca

2041 aatccagtcg tggtgaacgg ctccgtactc gtacccgagg atcagtgcta ttgcgcagga

2101 tggatcgaga gcagaggcac aaacggcgca cagactgcat ccaacgtgct ccagtggttg

2161 gccgcaggct tttccattct cctgctcatg ttttacgcct accagacttg gaagtccaca

2221 tgtggctggg aggaaatcta cgtgtgtgca atcgaaatgg tgaaggtgat cctggagttt

2281 ttcttcgaat ttaaaaaccc aagcatgctg tacctggcta ctggccacag agtgcagtgg

2341 ctgcggtatg ccgaatggct gctgacttgc ccagtgattc tgatccacct gtccaacctg

2401 actgggctgt ctaacgatta cagtaggaga acaatgggac tgctcgtatc cgacatcggc

2461 actatcgtat ggggcgcaac tagtgccatg gccactggat acgtgaaagt gatcttcttc

2521 tgcctqggac tctqctacqq aqcaaacaca ttttttcatg ccgcaaaagc atatatcgag

2581 gggtatcata ccgtcccaaa gggccggtgt agacaagtgg tgactggcat ggcttggctg

2641 ttcttcgtgt cctgggggat gtttcccatc ctctttatcc tgggcccaga aggcttcggg

2701 gtgctgagtg tgtatggcag taccgtagga cacactatca ttgacctgat gagcaaaaac

2761 tgctgggggc tgctcggcca ctacctgaga gtactcatcc acgagcatat cctgattcat

2821 ggcgatatcc ggaaaactac caagctcaat atcgggggca ccgagattga agtggagaca

2881 ctcgtggagg acgagqccqa gqccqgagca gtgaacaaag gcactqgcaa gtatgcctcc

2941 agagaatcct ttctggtgat gcgggacaaa atgaaggaga aaggcattga tgtacggtgc

3001 agtaatgcca aagccgtcga gactgatgtg tag

Одиночный мутант Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью синтетического конструкта hVChR1-mKate-betahChR2 (L132C) (GenBank № AER29838 и SEQ ID NO: 12), содержащего следующие аннотации, GFP-последовательность обозначена жирным шрифтом, последовательность L132C Chop2 подчеркнута.

mdypvarsli vryptdlgng tvcmprgqcy cegwlrsrgt siektiaitl qwvvfalsva clgwyayqaw ratcgweevy valiemmksi ieafhefdsp atlwlssgng vvwmrygewl

121 Itcpvllihl snltglkddy skrtmgllvs dvgcivwgat samctgwtki Ifflislsyg

181 mytyfhaakv yieafhtvpk gicrelvrvm awtffvawgm fpvlfllgte gfghispygs

241 aighsildli aknmwgvlgn ylrvkihehi llygdirkkq kitiagqeme vetlvaeeed

301 gtavatmvsk geelikenmh mklymegtvn nhhfkctseg egkpyegtqt mrikweggp

361 Ipfafdilat sfmygsktfi nhtqgipdff kqsfpegftw ervttyedgg vltatqdtsl

421 qdgcliynvk irgvnfpsng pvmqkktlgw eastemlypa dgglegradm alklvggghl

481 icnlkttyrs kkpaknlkmp gvyyvdrrle rikeadkety veqhevavar ycdlpsklgh

541 klnclqekks csqrmaefrq ycwnpdtgqm Igrtparwvw islyyaafyv vmtglfalci

601 yvlmqtidpy tpdyqdqlks pgvtlrpdvy gerglqisyn isenssrqaq itgrpetetl

661 ppvdyggals avgrellfvt npvvvngsvl vpedqcycag wiesrgtnga qtasnvlqwl

721 aagfsilllm fyayqtwkst cgweeiyvca iemvkvilef ffefknpsml ylatghrvqw

781 Iryaewlltc pvilihlsnl tglsndysrr tmgllvsdig tivwgatsam atgyvkviff

841 clglcygant ffhaakayie gyhtvpkgrc rqvvtgmawl ffvswgmfpi Ifilgpegfg

901 vlsvygstvg htiidlmskn cwgllghylr vlihehilih gdirkttkln iggteievet

961 Ivedeaeaga vnkgtgkyas resflvmrdk mkekgidvrc snakavetdv

Одиночный мутант L132C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 132 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 13).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV

301 EDEAEAGAVN KGTGK

- 13 043449

Одиночный мутант Т159С Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 159 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 14).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK

Двойной мутант L132C/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 15).

atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc

121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct

181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc

241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc

301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga

361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc

421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggctgcatt

481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg

541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat

601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc

661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg

721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg

781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat

841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg

901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa

Двойной мутант L132C/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID NO: 16).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK

Одиночный мутант Т159С Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 159 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 17).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGSI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK

Двойной мутант L132C/T159S Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 18).

atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc

121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct

181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc

241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc

301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga

361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc

421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggcagcatt

481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg

541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat

601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc

661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg

721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg

781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat

841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg

901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa

Двойной мутант L132C/T159S Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID NO: 19).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGSI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL· IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK

- 14 043449

Одиночный мутант L132A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 132 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 20).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV IAIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL· IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV

301 EDEAEAGAVN KGTGK

Двойной мутант L132A/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 21).

ATGGACTACG GGGGGGCTCT GTCTGCTGTC GGGAGGGAAC TGCTGTTTGT GACTAACCCT

GTCGTCGTGA ACGGGAGTGT GCTGGTCCCT GAGGACCAGT GCTACTGTGC CGGCTGGATC

121 GAATCACGCG GAACCAACGG GGCCCAGACA GCTAGCAATG TGCTGCAGTG GCTGGCCGCT

181 GGGTTTAGTA TCCTGCTGCT GATGTTCTAC GCCTATCAGA CTTGGAAGTC AACCTGCGGC

241 TGGGAGGAAA TCTACGTGTG CGCTATTGAG ATGGTGAAAG TGATCCTGGA GTTCTTCTTC

301 GAGTTCAAGA ACCCAAGCAT GCTGTACCTG GCTACTGGAC ACCGAGTGCA GTGGCTGAGA

361 TATGCAGAAT GGCTGCTGAC ATGCCCCGTC ATCGCCATTC ACCTGTCCAA CCTGACAGGC

421 CTGAGCAATG ACTACTCCAG GAGAACTATG GGACTGCTGG TGTCCGACAT CGGCTGCATT

481 GTCTGGGGAG CAACTTCTGC TATGGCAACC GGATACGTGA AGGTCATCTT TTTCTGCCTG

541 GGGCTGTGCT ATGGCGCAAA TACCTTTTTC CACGCAGCCA AGGCCTACAT TGAGGGGTAT

601 CATACCGTGC CAAAAGGCCG GTGCCGACAG GTGGTCACAG GAATGGCTTG GCTGTTTTTC

661 GTCTCTTGGG GAATGTTTCC CATCCTGTTC ATTCTGGGGC CTGAAGGGTT CGGCGTGCTG

721 TCTGTCTACG GAAGTACAGT GGGGCATACT ATCATTGACC TGATGTCCAA AAACTGTTGG

781 GGCCTGCTGG GACACTATCT GAGAGTGCTG ATCCACGAGC ATATCCTGAT TCATGGCGAT

841 ATTCGGAAGA CCACAAAACT GAATATCGGC GGAACCGAGA TTGAAGTGGA AACACTGGTG

901 GAAGACGAGG CTGAGGCTGG GGCTGTGAAC AAGGGGACTG GCAAA

Двойной мутант L132A/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID NO: 22).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV IAIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK

Одиночный мутант Т159А Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 159 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 23).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGAI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK

Двойной мутант L132C/T159A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 24).

atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc

121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct

181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc

241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc

301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga

361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc

421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggcgccatt

481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg

541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat

601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc

661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg

721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg

781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat

841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg

901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa

Двойной мутант L132C/T159A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID NO: 25).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGAI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV

301 EDEAEAGAVN KGTGK

- 15 043449

Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 26).

MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA

GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR

121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL

181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL

241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV

301 EDEAEAGAVN KGTGK

Мутантные белки ChR2 по изобретению также демонстрируют более медленную кинетику каналов. Было обнаружено, что более высокая светочувствительность коррелирует с каналами с более медленной кинетикой, выявляя соотношение между светочувствительностью и кинетикой каналов. Белки Chop2, которые образуют белки ChR2 по настоящему изобретению, также могут включать дополнительные мутации или модификации, которые могут улучшать кинетику каналов, или повышать степень дезактивации ChR2. Особенно предпочтительные мутанты ChR2 уравновешивают порог светочувствительности с кинетикой каналов.

Композиции и наборы реагентов.

Композиции и наборы реагентов по изобретению включают по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты или полипептидную молекулу, которая кодирует мутантный белок Chop2, и полученный в результате ChR2, по изобретению. По меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты или полипептидная молекула, которая кодирует мутантный белок Chop2 по изобретению, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Наборы реагентов по изобретению дополнительно включают инструкции по введению объекту композиции по изобретению.

Терапевтические применения.

Мутации осуществляли на кодон-оптимизированном сшитом белке Chop2-GFP для создания одиночных и двойных мутаций в сайтах L132 (Лейцин 132) и Т159 (треонин 159). Функциональные свойства каждого мутанта ChR2 или их комбинации сначала исследовали в клетках HEK. Получали ΛΛV2-вирусные векторы, несущие конструкты мутантного Chop2-GFP, управляемые CЛG-промотором, и инъецировали интравитреально в глаза взрослой мыши. Опосредованный мутантным Chop2 ответ на свет исследовали с помощью регистрации мультиэлектродных чипов из тотального препарата сетчатки.

Одиночный мутант ChR2, т.е. L132 и Т159С, значительно снижал пороговую светочувствительность, которая требуется для того, чтобы вызвать ChR2-опосредованный фототок. Кроме того, было обнаружено, что несколько вариантов двойных мутантов ChR2, включающих L132C/T159C, L132Л/T159C, и L132C/T159S дополнительно повышают фототок выше результатов любого одиночного мутанта ChR2 при низкой интенсивности света. Двойные мутанты демонстрировали более медленное выключение, которое, вероятно, способствует повышенному фототоку при низкой интенсивности света. Спайковую активность ганглиозных клеток сетчатки, опосредованную двойным мутантом L132C/T159C, наблюдали при интенсивности света 10¹³ фотонов/см²/с и при длине волны 473 нм. Данный уровень света составляет примерно на 1,5-2 log единиц ниже, чем уровень света, который требуется для того, чтобы вызвать спайковую активность с помощью ChR2 дикого типа. Запуск спайковой активности ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих L132C/T159C, может следовать за частотой мерцания света до 15 Гц. Продолжающиеся исследования представляют собой оценку продолжительной экспрессии и безопасность мутантных ChR2 по изобретению в нейронах сетчатки.

Кроме того, было обнаружено, что экспрессия мутантных белков Chop2 и полученных в результате белков ChR2 по настоящему изобретению не вызывает нейротоксичности до двух месяцев после вирусной инфекции мышей, демонстрируя безопасность настоящего изобретения для терапевтического применения.

Векторы для применения в настоящем изобретении, могут включать различные вирусные векторы, такие как плазмиды и рекомбинантные вирусы, т.е. рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (гЛЛV), рекомбинантные аденовирусы, рекомбинантные ретровирусы, рекомбинантные лентивирусы и другие вирусы, известные в данной области.

В некоторых воплощениях, экспрессия белков Chop2 по настоящему изобретению управляется конститутивным промотором, т.е. CЛG-промотором, CMV-промотором, LTR. В других воплощениях промотор является индуцируемым или клеточноспецифичным. Клеточноспецифичные промоторы, которые дают возможность экспрессии белка Chop2 в специфических субпопуляциях клеток, т.е. в нейронных клетках сетчатки или в деградирующих клетках может быть предпочтительным. Эти клетки могут включать, в частности ганглиозные клетки сетчатки, фоторецепторные клетки, биполярные клетки, палочковидные биполярные клетки, конические биполярные клетки ON-типа, фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки, горизонтальные клетки, амакриновые клетки или Л11-амакриновые клетки. Клеточноспецифичные промоторы известны в данной области. Особенно предпочтительные клеточноспецифичные промоторы включают в частности mGluR6, NK-3 и Pcp2 (L7).

В некоторых воплощениях использование различных генов опсина дополнительно к мутантным белкам Chop2 по настоящему изобретению и направленная генная экспрессия могут дополнительно по- 16 043449 вышать светочувствительность или улучшать зрение. Зрительная информация обрабатывается посредством сетчатки двумя путями: ON-путь, который передает сигнал включения света ON, и OFF-путь, который передает сигнал выключения света OFF. Существование ON- и OFF-пути важно для усиления контрастной чувствительности. Зрительный сигнал в ON-пути является переключателем из ON-конусных биполярных клеток на ON-ганглиозные клетки. И ON-конусные биполярные клетки, и ON-ганглиозные клетки деполяризуются в ответ на свет. С другой стороны, зрительный сигнал в OFF-пути переносится от OFFконусных биполярных клеток к OFF-ганглиозным клеткам. И OFF-конусные биполярные клетки, и OFFганглиозные клетки гиперполяризуются в ответ на свет. Палочковидные биполярные клетки, которые отвечают за способность видеть при слабом свете (скотопическое зрение), представляют собой ON биполярные клетки (деполяризованные в ответ на свет). Палочковидные биполярные клетки передают зрительный сигнал через AII-амаркриновые клетки (клетки сетчатки ON-типа) к ON- и OFF-конусным биполярны клеткам.

Соответственно, дуалистическая родопсиновая система может использоваться для суммирования ON- и OFF-путей в целом с зрительной обработкой и остротой зрения. Вкратце, белок Chop2 по настоящему изобретению может специфично направляться к нейронам сетчатки ON-типа (т.е. ганглиозные клетки ON-типа и/или биполярные клетки ON-типа), в то время как сенсор гипополяризации света (т.е. галогенродопсин или другой хлоридный насос, известный в данной области) может направляться к нейронам сетчатки OFF-типа (т.е. ганглиозные клетки OFF-типа и/или биполярные клетки OFF-типа) для создания ON- и OFF-пути. Специфическая направленность к предпочтительным субпопуляциям может достигаться посредством использования различных клеточноспецифичных промоторов. Например, экспрессия Chop2 может управляться mGluR6-промотором для направленной экспрессии в нейронах сетчатки ON-типа (т.е. ганглиозные клетки ON-типа и/или биполярные клетки ON-типа), в то время как экспрессия канала гиперполяризации, такого как галогенродопсин, управляется NK-3-промотором для направленной экспрессии в нейронах сетчатки OFF-типа (т.е. ганглиозные клетки OFF-типа и/или биполярные клетки OFF-типа).

Альтернативный способ для восстановления ON- и OFF-путей в сетчатке достигается с помощью экспрессии сенсора деполяризации света, такого как ChR2, в палочковидных биполярных клетках или в AII-амакриновых клетках. В данном способе деполяризация палочковидных биполярных клеток или AII-амакриновых клеток может приводить к ON- и OFF-ответу на уровень конусных биполярных клеток и ниже по сигнальным путям ганглиозных клеток сетчатки. Таким образом, поддерживаются ON- и OFF-пути, которые свойственны сетчатке.

Настоящее изобретение может относиться к фармацевтической композиции или к лекарственному средству, подходящему для введения объекту или пациенту. Подходящие пути введения включают, например, интравитреальную, внутриглазную или субретинальную инъекцию.

Такие составы включают фармацевтически и/или физиологически приемлемый переносчик, разбавитель, носитель или эксципиент, такой как буферная соль или другие буферы, например, HEPES, для поддержания физиологического рН. Для обсуждения таких компонентов и их состава; см. в основном Gennaro, А.Е., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 2003 или последнее издание). См. также WO 00/15822. Если препарат должен храниться в течение продолжительного времени, то он может быть заморожен, например, в присутствии глицерина.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, вводится объекту, имеющему зрительное заболевание или слепоту, с помощью подходящего пути, предпочтительно интравитреальной или субретинальной инъекцией в зависимости от слоя сетчатки, который является мишенью.

Описание Bennett и сотрудников (процитировано в данном документе) касается направленного воздействия на пигментный эпителий сетчатки - наиболее дистальный слой от витреального пространства. Согласно настоящему изобретению, конструкт Chop2 или полипептид направленно воздействует на клетки сетчатки, т.е. ганлиозные клетки сетчатки или биполярные клетки. Такие клетки, как известно, в достаточной степени хорошо доступны для интравитреальной инъекции, как раскрыто в данном документе. Интравитреальная и/или субретинальная инъекция может обеспечивать необходимый доступ к биполярным клеткам, особенно в обстоятельствах, в которых слой фоторецепторных клеток отсутствует, благодаря дегенерации, что происходит в некоторых формах дегенерации, которые предназначено преодолеть с помощью настоящего изобретения.

Для тестирования способности вектора экспрессировать Chop2-мутанты по настоящему изобретению, специфически в нейронах сетчатки млекопитающего, с помощью AAV-опосредованной доставки, комбинация предпочтительной промоторной последовательности, связанной с репортерным геном, таким как LacZ или GFP, связанным с SV40 поли А-последовательностью, может быть вставлена в плазмиду и упакована в rAAV вирусные частицы, сконцентрирована, тестирована на аденовирусную контаминацию и определен титр rAAV с использованием анализа инфекции. В правые глаза ряда тестированных объектов, предпочтительно инбредных мышей, может инъецироваться субретинально примерно 1 мкл препарата rAAV (например, выше, чем примерно 10¹⁰ инфекционных единиц на 1 мл). Две недели спустя правые (тестируемые) и левые (контроли) глаза половины животных можно удалить, фиксировать и окрасить с помощью подходящего субстрата или антитела или другого вещества для обнаружения присут

- 17 043449 ствия репортерного гена. Большинство тестируемых сетчаток в инъецированных глазах демонстрируют фокально окрашенный участок, например, синий для LacZ/Xgal, или зеленый для GFP согласно субретинальной полости инъецированного вируса, создавая локализованное отслоение сетчатки. Все контрольные глаза могут быть негативными по отношению к продукту репортерного гена. Экспрессию репортерного гена, исследованную на мышах, умерщвленных в латеральные периоды, детектировали в течение по меньшей мере 10 недель после инъекции, что предполагает стабильную экспрессию репортерного трансгена.

В одном воплощении конструкты Chop2 упаковываются в аденовирусные векторы для трансгенной доставки. Эффективное количество rAAV-вирионов, несущих последовательность, кодирующую Chop2-ДНК под контролем выбранного промотора, предпочтительно конститутивного CMV-промотора или клеточноспецифичного промотора, такого как mGluR6, предпочтительно находится в интервале примерно от 10¹⁰ примерно до 10¹³ rAAV-инфекционных единиц в объеме примерно от 150 примерно до 800 мкл на инъекцию. rAAV-инфекционные единицы могут измеряться согласно McLaughlin, S.K. et al., 1988, J. Virol., 62:1963. Более предпочтительно эффективное количество составляет примерно от 10¹⁰ примерно до 10¹² rAAV-инфекционных единиц, и объем инъекции предпочтительно составляет примерно от 250 примерно до 500 мкл. Другие дозировки и объемы, предпочтительно внутри этих интервалов, но возможно и вне их, могут быть выбраны врачом-практиком, принимая во внимание физическое состояние объекта (предпочтительно человека), который повергается лечению, включая возраст, вес, состояние здоровья и характер и тяжесть конкретного зрительного расстройства.

Также может быть целесообразно введение дополнительных доз (бустеров) нуклеиновой кислоты или rAAV-композиций. Например, в зависимости от продолжительности трансгенной экспрессии в глазной клетке-мишени может вводиться второй курс лечения через 6 месяцев или ежегодно и может повторяться аналогичным образом. Нейтрализующие антитела к AAV, как ожидается, не будут генерироваться благодаря используемым дозам и путям введения, позволяя таким образом повторные раунды лечения.

Необходимость таких дополнительных доз моет отслеживаться врачами-практиками с использованием, например, хорошо известных электрофизиологических и других тестов функции сетчатки и зрения и тестов зрительного поведения. Профессиональный врач будет способен выбрать подходящие тесты, применяя стандартные навыки, известные в данной области. Может быть целесообразным инъецировать больший объем композиции или в однократной дозе или в многократных дозах для дальнейшего улучшения соответствующих конечных параметров.

Глазные заболевания.

Глазные расстройства, для которых предназначены настоящие белки Chop2, и полученные в результате белки ChR2, которые могут использоваться для улучшения одного или нескольких параметров зрения, включают в частности аномалии развития, которые влияют как на ранние, так и на поздние сегменты глаза. Расстройства передних сегментов включает глаукому, катаракту, дистрофию роговицы кератоконус. Расстройства задних сегментов включают расстройства со слепотой, вызванные некорректным функционированием и/или гибелью фоторецепторов, что вызвано дистрофией и деградацией сетчатки. Расстройства сетчатки включают врожденную постоянную ночную слепоту, возрастную макулярную дегенерацию, врожденные конические дистрофии и большую группу расстройств, связанных с пигментным ретинитом (RP). Эти расстройства включают генетически предрасположенную гибель фоторецепторных клеток, палочек и конусов в сетчатке, наблюдаемую в разном возрасте. Среди них встречаются тяжелые ретинопатии, такие как подтипы RP, которые прогрессируют с возрастом и вызывают слепоту в детстве и в ранней молодости, и RP-ассоциированные заболевания, такие как генетические подтипы LCA, которые часто приводят в результате к потере зрения в детстве уже на первом году жизни. Более поздние расстройства, как правило, характеризуются существенным уменьшением и часто полной потерей фоторецепторных клеток, палочек и конусов (Trabulsi, E.I., ed., Genetic Diseases of the Eye, Oxford University Press, NY, 1998).

Конкретно, белки Chop2 и ChR2 по настоящему изобретению, применяемые для лечения и/или восстановления, по меньшей мере, частичного зрения у объектов, которые потеряли зрение благодаря глазным расстройствам, таким как RPE-ассоциированные ретинопатии, которые характеризуются продолжительным сохранением структуры глазной ткани, несмотря на потерю функции, и ассоциацией между функциональной потерей и дефектом или отсутствием нормального гена в глазных клетках объекта. Известно множество таких глазных расстройств, таких как детский приступ онхоцеркоза, пигментный ретинит, макулярная дегенерация и диабетическая ретинопатия, а также глазные заболевания со слепотой, известные в данной области. Понятно, что эти и другие расстройства, а также расстройства со слепотой по неизвестной в настоящее время причине, которые позже характеризуются с помощью такого же описания, как приведено выше, также могут подвергаться успешному лечению с помощью белков Chop2 и ChR2 по настоящему изобретению. Таким образом, конкретное глазное расстройство, подвергаемое лечению с помощью настоящего изобретения, может включать вышеупомянутые расстройства и ряд заболеваний, которые еще не охарактеризованы должным образом.

Оптогенетика.

Перспективная область оптогенетики включает комбинацию генетических и оптических методов

- 18 043449 для контроля специфических событий в клетках-мишенях живой ткани. Оптогенетика может использоваться для диких млекопитающих и других животных. Кроме того, временная точность (временная шкала - миллисекунды) оптогенетических методов достаточна для функционирования в интактных биологических системах.

В настоящем изобретении предлагается Chop2-генная терапия для сохранения тканей сетчатки глаза путем введения в клетки сетчатки нуклеиновой кислоты или полипептида, кодирующего по меньшей мере одну мутантную форму Chop2. Мутантные белки Chop2/ChR2 по изобретению конкретно адаптированы для активации светом при более низкой интенсивности света, чем соответствующие белки дикого типа. Соответственно, мутантные белки Chop2/ChR2 по изобретению могут использоваться для активации клеток сетчатки и зрительной системы с использованием менее разрушительных источников освещения. Мутантные белки Chop2/ChR2 также проводят больше фототока при активации, приводя в результате к более стойкому или эффективному ответу клеток, экспрессирующих мутантные Chop2/ChR2.

Например, мутантные белки Chop2 по изобретению вводят объекту посредством местной интравитреальной или субретинальной, инъекции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидную молекулу мутантного Chop2, мутантного Chop2, или клетки, экспрессирующей Chop2/ChR2. Клетки сетчатки объекта экспрессируют мутантные белки Chop2 в плазматической мембране. Когда трансфицированные или трансформированные клетки сетчатки встречаются со световым излучением, то трансфицированные или трансформированные клетки сетчатки передают улучшенный или восстановленный сигнал.

Эти способы могут использоваться у объектов с нормальным и/или нарушенным зрением. Мутанты Chop2/ChR2 по изобретению могут сохранять, улучшать или восстанавливать зрение. Кроме того, мутанты Chop2/ChR2 по изобретению используются для сохранения, улучшения или восстановления передачи не зрительной информации от фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки в мозг.

Термин зрение при использовании в данном документе определяется как способность организма эффективно детектировать свет в виде стимула для дифференцировки или функционирования. Подразумевается, что зрение охватывает следующее.

1. Детектирование или восприятие света - способность заметить присутствие или отсутствие света.

2. Светопроекция - способность заметить направление, от которого исходит световой стимул.

3. Разрешение - способность детектировать различные уровни яркости (т.е. контраст) на дифракционной или буквенной мишени.

4. Распознавание - способность распознать форму зрительной мишени путем отнесения к различным уровням контраста на мишени.

Таким образом, зрение включает способность облегчать детектирование присутствия или отсутствия света. Полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие мутантный Chop2 по настоящему изобретению, могут использоваться для улучшения или восстановления зрения, где улучшение или восстановление зрения включает, например, повышение детектирования и восприятия света, повышение светочувствительности или фоточувствительности в ответ на световой стимул, повышение способности замечать направление, от которого исходит источник света, повышение способности детектирования различных уровней яркости, повышение способности распознавать форму зрительной мишени, и повышение индуцированного зрительного потенциала или передачи от сетчатки в кору головного мозга. Как таковое, улучшение или восстановление зрения может или не может включать полное восстановление зрения, т.е. где зрение пациента, подвергнутого лечению с помощью настоящего изобретения, восстанавливается до степени зрения здорового индивидуума. Зрительное восстановление, описанное в исследованиях на животных ниже, может по отношению к людям помещать индивидуума на нижний предел зрительной функции путем повышения одного аспекта зрения (т.е. светочувствительности или индуцированного зрительного потенциала) без восстановления полноты зрения. Тем не менее помещение на такой уровень имело бы существенную пользу, так как данные индивидуумы могли бы тренироваться двигаться и потенциально могли бы решать задачи низкого порядка, которые обеспечили бы им гораздо более высокий уровень зрительной независимости по сравнению с полной слепотой. Даже общее распознавание света может использоваться индивидуумами с нарушением зрения, которое улучшается с использованием композиций и способов по настоящему изобретению, для выполнения конкретных ежедневных задач и улучшает общую мобильность, возможности и качество жизни.

Степень восстановления зрения может определяться посредством измерения зрения перед и предпочтительно после введения вектора, включающего, например, ДНК, кодирующую Chop2. Зрение может измеряться с использованием любого из ряда методов, хорошо известных в данной области, и способов, которые еще не разработаны. Зрение, улучшенное или восстановленное с помощью настоящего изобретения, может измеряться с помощью любого из следующих зрительных ответов.

1. Ответ в виде детектирования света объектом после экспонирования со световым стимулом, в котором искомые данные надежного ответа представляют собой проявления или движения в общем направлении света объектом при включении света.

2. Ответ в виде проецирования света объектом после экспонирования со световым стимулом, где искомые данные представляют собой надежный ответ проявления или движения индивидуума в конкретном направлении света при включении света.

- 19 043449

3. Разрешение объектом светового по сравнению с темным зрительным стимулом, что измеряют по способности объекта разрешать световой по сравнению с темным зрительным стимулом, которую выявляют с помощью:

a) присутствия демонстрируемого надежного оптокинетически полученного нистагмоидного движения взгляда и/или связанных с этим движений головы или тела, что демонстрирует слежение за целью (см. выше); и/или

b) присутствия надежной способности различать зрительный стимул и проявлять такое различие вербальными или не вербальными способами, включающими, например, указание или нажатие на ручку или кнопку.

4. Электрической регистрации ответа зрительной коры головного мозга на стимул в виде вспышки света или на эталонный зрительный стимул, этот ответ представляет собой конечную точку электрической передачи от восстановленной сетчатки к зрительной коре, также обозначается как индуцированный зрительный потенциал (VEP). Измерение может быть представлено с помощью электрической регистрации на поверхности кожи головы в участке зрительной коры головного мозга, на кортикальной поверхности и/или регистрации внутри клеток зрительной коры головного мозга.

Таким образом, улучшение или восстановление зрения согласно настоящему изобретению может включать, в частности, повышение амплитуды или кинетики фототоков или электрического ответа на световые стимулы в клетках сетчатки, повышение светочувствительности (т.е. снижение порога интенсивности света, требуемого для инициации фототока или электрического ответа на световой стимул, требуя таким образом, свет меньше или слабее, чтобы вызвать фототок) клеток сетчатки, повышение количества или амплитуды вызванного светом спайка или возбуждений спайка, повышение ответа на свет зрительной коры головного мозга, который включает повышение индуцированного зрительного потенциала, передаваемого из сетчатки или клеток сетчатки в зрительную кору головного мозга или в мозг.

Могут использоваться как in vitro, так и in vivo исследования для оценки различных параметров настоящего изобретения, включая известные животные модели человеческих глазных расстройств со слепотой. Используются многочисленные животные модели человеческой ретинопатии, например детской слепоты. Примеры, предлагаемые в данном документе, позволяют специалисту в данной области легко определить, что данный метод может аналогично использоваться при лечении ряда расстройств сетчатки.

В то время как более ранние чужие исследования демонстрировали, что дегенерация сетчатки может быть замедлена с помощью методов генной терапии, настоящее изобретение демонстрирует определенное физиологическое восстановление функции, которое, как ожидается, генерирует или улучшает различные параметры зрения, включая поведенческие параметры.

Измерение поведения может быть получено с использованием известных животных моделей и тестов, например, действия в водном лабиринте, где объект, которому проводят сохранение или восстановление зрения до различной степени, плывет на свет (Hayes, J.M. et al., 1993, Behav. Genet., 23:395-403).

В моделях, в которых слепота индуцируется во взрослом возрасте, или наследственная слепота развивается достаточно медленно, так что индивидуум видел до потери зрения, может проводиться тренировка объекта на различных тестах. В этом случае, когда эти тесты вводят повторно после потери зрения для тестирования эффективности настоящих композиций и способов на предмет их восстанавливающих зрение эффектов, животным не нужно разучивать задачи de novo, как в слепом состоянии. Другие поведенческие тесты не требуют обучения и основаны на инстинктивности некоторых поведенческих черт. Примером является тест оптокинетический нистагм (Balkema G.W. et al., 1984, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 25:795-800; Mitchiner J.C. et al., 1976, Vision Res., 16:1169-71).

Настоящее изобретение также может использоваться в комбинации с другими формами терапии зрения, известными в данной области, для улучшения или восстановления зрения.

Например, использование зрительных протезов, которые включают имплантаты сетчатки, кортикальные имплантаты, имплантаты бокового коленчатого ядра или имплантаты зрительного нерва. Таким образом, дополнительно к генетической модификации живых нейронов сетчатки с использованием настоящих способов, объект, который подвергается лечению, может обеспечиваться зрительным протезом до, во время или после применения молекулярного метода. Эффективность зрительного протезирования может быть улучшена путем тренировки индивидуума, усиливая таким образом потенциальный вклад трансформации Chop2 клеток пациента, как предполагается в данном документе. Методы тренировки, такие как обучающая тренировка, характеризующаяся тренировкой объекта для распознавания (i) различных уровней светового и/или эталонного стимулирования, и/или (ii) стимулы окружающей среды от обычного источника света или объекта, как понятно специалисту в данной области; и тренировки ориентации и мобильности, характеризующиеся тренировкой объекта для зрительного детектирования локальных субъектов и более эффективного движения среди указанных субъектов, чем без тренировки. Фактически, здесь применимы любые методы зрительного стимулирования, которые обычно используются в области реабилитации слабого зрения.

- 20 043449

Примеры

Пример 1. Генерирование конструктов меченного мутантного Chop2.

Мутации осуществляли на кодон-оптимизированном сшитом белке Chop2-GFP для создания одиночных и двойных мутаций в сайтах L132 (Лейцин 132) и Т159 (Треонин 159). Несколько мутантов генерировали, например, одиночные мутанты, такие как L132A, L132C, Т159А, Т159С и T159S, и двойные мутанты, такие как L132C/T159C, L132C/T159S, L132A/T159C и L132C/T159A. Трансгены Chop2-GFP клонировали в вектор rAAV под контролем промотора CAG с использованием методов, известных в данной области.

Пример 2. In vitro анализ конструктов мутантных Chop2.

Функциональные свойства каждого мутанта Chop2 или их комбинации сначала исследовали в клетках HEK. Конструкты Chop2 доставляли к клеткам HEK с помощью, например, аденовирусной инфекции. При экспрессии WT или мутантного Chop2 образуются функциональные каналы WT и мутантный ChR2. Измерения светочувствительности и другие свойства каналов ChR2 оценивали, как описано в данном документе. Световые стимулы (фотоны/см²/с при 460 нм) генерировали с помощью ксеноновой дуговой лампы и ослабляли с помощью нейтрально-серого светофильтра: ND4.0 (2,8х10¹⁴), ND3.0 (1,4х10¹⁵), ND2.5 (4,8χ 10¹⁵), ND2.0 (1,6x1016), ND1.0 (1,3х 10¹⁷), ND0 (1,2х10¹⁸). Ток, вызванный светом, измеряли из ChR2 дикого типа, Т159С, L132C, L132C/T159C и L132C/T159S. Пэтч-клемп регистрацию осуществляли с использованием методов, известных в данной области.

Репрезентативные регистрации из этого эксперимента, сравнивающего светочувствительность между конструктами Chop2, показывали, что мутации только в L132 или в комбинации с мутацией в Т159 демонстрируют повышенный фототок по сравнению с WT (фиг. 1А и 1В). На фиг. 1В представлены одинаковые следы тока в различном масштабе для более ясной иллюстрации различия в амплитуде фототока между WT ChR2 и мутантными ChR2. Фиг. 1В специфично сравнивает следы тока, полученные в результате светостимулирования с использованием нейтрально-серого светофильтра (ND 2.5), что эквивалентно 4,8х10¹⁵ фотонов/см²/с; следы обозначали стрелками. Амплитуда фототока мутанта L132C выше, чем WT; амплитуда фототока двойного мутанта L132C/T159C выше, чем L132C; и амплитуда фототока мутанта L132C/T159S выше, чем L132/T159C. Следы тока мутантов ChR2, особенно двойных мутантов L132C/T159C и L132C/T159S, также демонстрируют более медленную дезактивацию по сравнению с WT и L132C.

На фиг. 2 представлены репрезентативные регистрации вызванных светом токов из WT ChR2, L132C, L132C/T159C и L132C/T159S после стимулирования с помощью 10 мс светового импульса (1,2х10¹⁸ фотонов/см²/с при длине волны 460 нм) для сравнения временной зависимости дезактивации после выключения света. Мутант ChR2 демонстрирует динамику дезактивации, причем двойной мутант L132C/T159S имеет самую продолжительную дезактивацию. Более высокая светочувствительность, как продемонстрировано с помощью L132C/T159C и L132C/T159S, может коррелировать с каналом с более медленной кинетикой.

Пример 3. In vivo глазное введение и анализ конструктов мутантных Chop2.

Получали AAV2-вирусные векторы, несущие конструкты мутантного Chop2-GFP, управляемые CAG-промотором, и инъецировали интравитреально в глаза взрослой мыши C57BL/6J. Взрослую мышь анестезировали с помощью IP-инъекции кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Под препаровальной лупой делали разрез с помощью ножниц через веко для экспонирования склеры. Делали небольшое отверстие в участке склеры позади зрачка с помощью иглы и инъецировали суспензию вирусного вектора 0,8-1,5 мкл в концентрации приблизительно 10¹¹ геномных частиц/мл в интравитреальное пространство через отверстие с использованием шприца Hamilton с тупоконечной иглой калибра 32-gauge. Для каждого животного обычно инъецировали только в один глаз с использованием вирусного вектора, несущего конструкт Chop2, а в другой глаз не инъецировали или инъецировали с использованием контрольных вирусных векторов, несущих только GFP. При экспрессии WT или мутантного Chop2 по настоящему изобретению образуются функциональные WT или мутантные ChR2 каналы, применяющие эндогенный ретиналь, и свойства этих белков ChR2 оценивали, как описано в данном документе.

ChR2-опосредованные ответы на свет исследовали с помощью регистрации мультиэлектродного чипа из цельных препаратов сетчатки. Световые стимулы (фотоны/см²/с) генерировали с помощью лазера голубой области света 473 нм и ослабляли с помощью нейтрально-серых светофильтров: NDO (6,3х10¹⁶), ND1.0 (7,4х10¹⁵), ND1.5 (2,7х10¹⁵), ND2.0 (7,3х10¹⁴), ND2.5 (3,2х10¹⁴), ND3.0 (8,5х10¹³), ND3.5 (3,8х10¹³) и ND4.0 (9,5х10¹²).

Регистрации мультиэлектродного чипа основаны на процедурах, опубликованных Tian and Copenhagen (2003). Вкратце, сетчатку иссекали и помещали фоторецепторами вниз на нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу (Millipore Corp., Bedford, MA). Закрепленную сетчатку помещали в регистрирующую камеру МЕА-60 мультиэлектродного чипа с диаметром камеры 30 мкм, с электродами, разделенными на 200 мкм (Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany), вместе со слоем ганглиозных клеток, обращенным к регистрирующим электродам. Сетчатку продолжительно перфузировали в кислородосодержащем внеклеточном растворе при 34°С во время всех экспериментов. Внеклеточный

- 21 043449 раствор содержал (в мМ): NaCl, 124; KCl, 2,5; CaCl₂, 2; MgCl₂, 2; NaH₂PO₄, 1,25; NaHCO₃, 26; и глюкозу, (рН 7,35 с 95% О₂ и 5% СО₂). Регистрации обычно начинали через 60 мин после помещения сетчатки в регистрационную камеру. Интервал между началом каждого светового стимула составлял 10-15 с. Сигналы фильтровали в интервале 200 Гц (низкий порог) и 20 кГц (высокий порог). Ответы от индивидуальных нейронов анализировали с использованием пакета программ Offline Sorter (Plexon, Inc., Dallas, TX).

Одиночные мутанты Chop2/ChR2, т.е. L132 и Т159С, значительно снижали пороговую интенсивность света, чем требовалось для того, чтобы вызвать ChR2-опосредованный фототок. Кроме того, несколько двойных мутантов, включающих L132C/T159C, L132A/T159C и L132C/T159S, как было обнаружено, дополнительно повышают фототок при низких интенсивностях света. Различные нейтральносерые светофильтры использовали для ослабления световых стимулов для дифференцировки вызванных светом ответов конструктов Chop2 при слабом свете. Спайковую активность ганглиозных клеток сетчатки, опосредованную мутантами по настоящему изобретению, наблюдали при интенсивностях света примерно на 1,5-2 log единицы ниже, чем уровень света, который требуется для того, чтобы вызывать спайковую активность с помощью ChR2 дикого типа (фиг. 3). Конкретно, WT ChR2 не демонстрировал никакой спайковой активности в ответ на световые стимулы с нейтрально-серыми светофильтром 2,5 (3,2х10¹⁴ фотонов/см²/с), в то время как мутанты ChR2 (L132C, L132C/T159C и L132C/T159S) демонстрируют спайковую активность. Фактически мутанты ChR2 еще демонстрировали спайковую активность в ответ на свет с нейтрально-серым светофильтрами 3,0 и 3,5. Таким образом, мутанты ChR2 по настоящему изобретению обладают более высокой светочувствительностью и, таким образом, требуется значительно более низкая интенсивность света, чтобы вызывать ChR2-опосредованный фототок. Кроме того, двойные мутанты ChR2 обладают более высокой светочувствительностью, чем одиночные мутанты, т.е. L132C. Кроме того, возбуждение спайка ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих L132C/T159C и L132/T159S, может следовать за частотой мерцания света до 15 и 5 Гц соответственно (фиг. 4).

Мутант L132C/T159A демонстрирует высокую светочувствительность, вероятно, он наиболее светочувствительный среди этих мутантов, но он также демонстрирует исключительно медленное выключение (канал продолжает быть открытым в течение многих секунд после выключения света). Интересно, что он может быть выключен быстрее с использованием света длинной длины волны, такого как свет желтой области спектра. Мутант L132C/T159A (кодируемый SEQ ID NO: 24 и 25) демонстрирует значительный потенциал.

С учетом соотношения между светочувствительностью и кинетикой канала мутанты Chop2/ChR2, которые демонстрируют баланс между светочувствительностью и кинетикой канала, такие как L132C/T159C или L132C/T159S, могут подходить для применения в восстановлении зрения.

Пример 4. Анализ конструктов мутантов Chop2 в мышиных моделях заболевания.

Мышиные модели дегенеративных глазных заболеваний известны в данной области. Например, гомозиготные rd1 (rd1/rd1) мыши широко применяются для модели фоторецепторной дегенерации. Мыши Rd1 несут нуль-мутацию в фосфодиэстеразе циклического GMP, PDE6, аналогично некоторым формам пигментного ретинита у людей. Другие хорошо изученные мышиные модели глазного заболевания, которые могут представлять конкретный интерес для демонстрации безопасности и эффективности мутанта ChR2, включают rds (также известные как Prph^Rd2), rd3, rd4, rd5, rd6, rd7, rd8, rd9, Pde6b^rd10 или cpf11.

Конструкты Chop2-GFP по настоящему изобретению могут быть инъецированы интравитреально в глаза новорожденных (Р1) или взрослых мышей в возрасте 2-12 месяцев. Сигнал GFP может наблюдаться в Chop2-6ЕР-инъецированной сетчатке для определения уровня экспрессии ChR2 или экспрессии в конкретной популяции клеток, таких как ганглиозные клетки сетчатки. Экспрессию мутантного Chop2-GFP можно отслеживать в течение определенного времени, т.е. 3-6 месяцев или 1 год после вирусной инфекции. Регистрации патч-клемп и мультиканального чипа можно осуществлять с использованием методов, известных в данной области и описанных в данном документе для измерения вызванных светом ответов мутантный Chop2-6ЕР-экспрессирующих клеток in vivo .

Дополнительные методы и тесты для тестирования восстановления светочувствительности зрения хорошо изучены в данной области. Индуцированные зрительные потенциалы от Chop2-GFP-экспрессирующих клеток или зрительной коры головного мозга можно исследовать, как описано в РСТ-публикации WO 2007/131180. Другие тесты включают поведенческую оценку остроты зрения у мышей, т.е. виртуальный оптомоторный тест и визуальный водный лабиринт.

Пример 5. Анализ продолжительной экспрессии и безопасности введения конструктов мутантных Chop2 в нейроны сетчатки.

Нейротоксичность оценивали на C57BL/6J взрослых мышах, инъецированных конструктами Chop2 по настоящему изобретению. Безопасность экспрессии мутантов Chop2 в сетчатке оценивали с помощью иммуноокрашивания и подсчета клеток после экспонирования с жестким ультрафиолетом в течение двух недель. Было обнаружено, что ни одна из мышей не проявила симптомов нейротоксичности в течение периода до двух месяцев после инъекции.

Дополнительные продолжающиеся исследования представляют собой оценку продолжительной экспрессии и безопасности мутантов Chop2/ChR2 по изобретению в нейронах сетчатки.

- 22 043449

Другие воплощения

Хотя изобретение дано вместе с подробным описанием, представленное выше описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем притязаний изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах представленной ниже формулы изобретения.

Патентная и научная литература, на которую делались ссылки в данном документе, представляет собой знания, доступные специалистам в данной области. Все патенты США и опубликованные и не опубликованные патентные заявки США, процитированные в данном документе, включены ссылкой. Все опубликованные иностранные патенты и патентные заявки, процитированные в данном документе, включены ссылкой. Все опубликованные ссылки, документы, рукописи и научная литература, процитированная в данном документе, включены в данный документ ссылкой.

Хотя настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на его предпочтительные воплощения, специалистам в данной области будет понятно, что различные изменения в форме и деталях могут быть внесены без отхода от объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.

Claims (16)

1. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 представляет собой цистеин (С) и аминокислота в положении 159 SEQ ID NO: 26 представляет собой цистеин (С) или серин (S).

2. Вектор экспрессии по п.1, где вектор экспрессии представляет собой вектор на основании аденоассоциированного вируса (AAV).

3. Вектор экспрессии по п.2, где вектор AAV представляет собой вектор AAV2.

4. Вектор экспрессии по пп.1, 2 или 3, где полипептид содержит цистеин (С) в положениях 132 и 159 SEQ ID NO: 26.

5. Вектор экспрессии по п.4, где полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 и полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15.

6. Вектор экспрессии по пп.1, 2 или 3, где полипептид содержит цистеин (С) в положении 132 и серин (S) в положении 159 SEQ ID NO: 26.

7. Вектор экспрессии по п.6, где полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 18.

8. Способ улучшения или восстановления зрения у субъекта, включающий введение субъекту вектора экспрессии по любому из пп.1-7.

9. Способ по п.8, где субъект имеет нормальное зрение.

10. Способ по п.8, где субъект страдает глазным заболеванием.

11. Способ по п.10, где глазное заболевание представляет собой макулярную дегенерацию или пигментный ретинит.

12. Способ по любому из пп.8-11, где указанное улучшение или восстановление зрения включает любое из следующего: повышение светочувствительности, снижение порога интенсивности света, требуемого для вызова фототока, и повышение индуцированного зрительного потенциала в зрительной коре головного мозга.

13. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID NO: 26 представляет собой аланин (А) и аминокислота в положении 159 SEQ ID NO: 26 представляет собой цистеин (С).

14. Вектор экспрессии по п.13, где вектор экспрессии представляет собой вектор на основании адено-ассоциированного вируса (AAV).

15. Вектор экспрессии по п.14, где вектор AAV представляет собой вектор AAV2.

16. Вектор экспрессии по пп.13, 14 или 15, где полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и где полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21.