EA044245B1

EA044245B1 - КОМПОЗИЦИИ иРНК КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА C5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Info

Publication number: EA044245B1
Application number: EA201591707
Authority: EA
Inventors: Кевин Фитцжеральд; Джеймс Батлер; Брайан БЕТТЕНКОРТ; Анна Бородовский; Сатиянараяна Кучиманчи; Клаус Хариссе; Мутхиах Манохаран; Мартин Майер; Каллантхоттатхил Г. Раджив; Дональд ФОСТЕР
Original assignee: Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2023-08-04

Abstract

Изобретение относится к иРНК, например двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (dsRNA), композициям, нацеленным на ген компонента комплемента С5, а также способам применения таких иРНК, например dsRNA, композициям для ингибирования экспрессии С5 и для лечения субъектов, страдающих заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например ночной пароксизмальной гемоглобинурией.

Description

Перечень последовательностей

Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и, таким образом, включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Указанная копия файла с кодировкой ASCII, созданная 10 марта 2014 г., имеет название 121301-00520 SL.txt, и ее размер составляет 734486 байт.

Уровень техники

Комплемент был впервые обнаружен в 1890-х годах, когда было обнаружено способствование или комплектное уничтожение бактерий термостабильными антителами, присутствующими в нормальной сыворотке (Walport, M.J. (2001) N Engl J Med. 344:1058). Система комплемента состоит из более чем 30 белков, которые либо присутствуют в виде растворимых белков в крови, или присутствуют в виде белков, ассоциированных с мембраной. Активация комплемента приводит к последовательному каскаду ферментативных реакций, известных как пути активации комплемента, в результате чего формируются мощные анафилотоксины C3a и С5а, которые вызывают множество физиологических реакций, варьирующих от хемоаттракции до апоптоза. Первоначально считалось, что комплемент играет важную роль во врожденном иммунитете, в результате чего устанавливается надежная и быстрая реакция против вторжения патогенных микроорганизмов. Тем не менее, в последнее время становится все более очевидным, что комплемент также играет важную роль в адаптивном иммунитете с участием Т- и В-клеток, которые помогают в ликвидации патогенных микроорганизмов (Dunkelberger J.R. и Song W.C. (2010) Cell Res. 20:34; Molina H., et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA. 93:3357), в поддержании иммунологической памяти, предотвращающей повторное вторжение патогенов, и участвует в многочисленных патологических состояниях человека (Qu, H., et al. (2009) Mol Immunol. 47:185; Wagner, E. и Frank M.M. (2010) Nat Rev Drug Discov. 9:43).

Активация комплемента, как известно, происходит по трем разным путям: альтернативному, классическому и лектиновому (фиг. 1) с участием белков, которые преимущественно существуют в виде неактивных зимогенов, которые затем последовательно отщепляются и активируются. Все пути активации комплемента ведут к отщеплению молекулы С5 с образованием анафилатоксина С5а и С5Ь, который впоследствии формирует терминальный комплекс комплемента (С5Ь-9). С5а оказывает преобладающую провоспалительную активность путем взаимодействия с рецептором C5aR (CD88) классического Gбелка, а также с рецептором C5L2 (GPR77) белка, отличающегося от G-белка, экспрессируемых на различных иммунных и не иммунных клетках. С5Ь-9 вызывает цитолиз посредством формирования мембраноатакующего комплекса (MAC), при этом субъединицы литического MAC и растворимый С5Ь-9 обладают множеством не цитолитических иммунных функций. Эти два эффектора комплемента, С5а и С5Ь-9, образованные при отщеплении от С5, являются ключевыми компонентами системы комплемента, ответственные за распространение и/или инициирование патологии при различных заболеваниях, включая ночную пароксизмальную гемоглобинурию, ревматоидный артрит, травмы впоследствии ишемии и нейродегенеративные заболевания.

На сегодняшний день доступно только одно терапевтическое средство, нацеленное на С5-С5а компоненты, для лечения заболеваний, связанных с компонентом комплемента С5, которое представляет собой антитело к С5, экулизумаб (Soliris®). Хотя экулизумаб показал эффективность при лечении пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH) и атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), и в настоящее время оценивается в клинических испытаниях для лечения дополнительных заболеваний, связанных с компонентом комплемента С5, терапия экулизумабом требует еженедельных инфузий высоких доз, с дальнейшими инфузиями раз в две недели, с ежегодной стоимостью приблизительно 400000 $. Соответственно, существует потребность в данной области в альтернативной терапии и комбинированной терапии для субъектов, имеющих заболевание, связанное с компонентом комплемента С5.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям иРНК, которые воздействуют на опосредованное РНКиндуцированным комплексом сайленсинга (RISC) отщепление РНК-транскриптов гена С5. Ген С5 может находиться в пределах клетки, например, клетки в пределах субъекта, такого как человек. Настоящее изобретение также относится к способам и комбинированной терапии для лечения субъекта с нарушениями, на которое можно оказать благоприятное воздействие путем ингибирования или снижения экспрессии гена С5, например, заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, такого как ночная пароксизмальная гемоглобинурия (PNH) и атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS) с помощью композиций иРНК, которые воздействуют на отщепление, опосредованное комплексом сайленсинга, индуцированным РНК (RISC), РНК-транскриптов гена С5 для ингибирования экспрессии гена С5.

- 1 044245

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к средству, представляющему собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где dsRNA содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к средству, представляющему собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где dsRNA содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающийся не более чем на 3 нуклеотида от любой из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23.

В одном варианте осуществления смысловая и антисмысловая цепи содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из А-118320, А-118321, А-118316, А-118317, А-118332, А-118333, А118396, А-118397, А-118386, А-118387, А-118312, А-118313, А-118324, А-118325, А-119324, А-119325, А-119332, А-119333, А-119328, А-119329, А-119322, А-119323, А-119324, А-119325, А-119334, А-119335, А-119330, А-119331, А-119326, А-119327, А-125167, А-125173, А-125647, А-125157, А-125173, и А125127. В другом варианте осуществления смысловая и антисмысловая цепи содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательностей в любой из таблиц 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23. В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к средству, представляющему собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где средство, представляющее собой dsRNA, содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA (SEQ ID NO:62) и где антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU (SEQ ID NO:113). В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как описано ниже.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к двухцепочечному средству RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, где практически все нуклеотиды смысловой цепи и практически все нуклеотиды антисмысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами и где смысловая цепь конъюгирована с лигандом, присоединенным на 3'-конце.

В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой цепи и все нуклеотиды антисмысловой цепи содержат модификации.

В одном варианте осуществления практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого дезокси-тимина (dT) нуклеотида. В другом варианте осуществления практически все нуклеотиды антисмысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого дезокситимин (dT) нуклеотида. В другом варианте осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой короткую последовательность дезокси-тимин (dT) нуклеотидов. В другом варианте осуществления смысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце. В одном варианте осуществления антисмысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце. В еще одном варианте осуществления смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными через разветвленный двухвалентный или трехвалентный линкер на 3'-конце.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 3'-концевого дезокси-тимин (dT) нуклеотида, 2'-O-метил модифицированного нуклеотида, 2'-фтор модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, абазического нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида морфолино, фосфорамидата, нуклеотида, содержащего основу не природного происхождения, нуклеотида, содержащего 5'-фосфотиоатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с производным холестерина или бис-дециламидной группой додекановой кислоты.

В другом варианте осуществления модифицированные нуклеотиды содержат короткую последовательность 3'-концевого дезокси-тимин (dT) нуклеотида.

- 2 044245

В одном варианте осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 17 нуклеотидов в длину. В другом варианте осуществления участок комплементарности составляет от 19 до 21 нуклеотидов в длину.

В одном варианте осуществления участок комплементарности составляет 19 нуклеотидов в длину.

В одном варианте осуществления каждая цепь составляет не более 30 нуклеотидов в длину.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одна цепь содержит 3'-выступ по меньшей мере 1 нуклеотида. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна цепь содержит 3'-выступ по меньшей мере 2 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, дополнительно содержит лиганд.

В одном варианте осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой цепи средства, представляющего собой dsRNA.

В одном варианте осуществления лиганд представляет собой производное N-ацетилгалактозамина (GalNAc).

В одном варианте осуществления лиганд представляет собой но ^^он _{н н}

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, конъюгировано с лигандом, как показано на следующей схеме:

3'

AcHN £ Η Н где X представляет собой О или S.

В одном варианте осуществления X представляет собой О.

В одном варианте осуществления участок комплементарности состоит из одной из антисмысловых последовательностей в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, выбрано из группы, состоящей из AD-58123, AD-58111, AD-58121, AD-58116, AD-58133, AD-58099, AD-58088, AD-58642, AD58644, AD-58641, AD-58647, AD-58645, AD-58643, AD-58646, AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD62646, AD-62650 и AD-62651.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к средству, представляющему собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где средство, представляющее собой dsRNA, содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA (SEQ ID NO:62) и где антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUUdTdT (SEQ ID NO:2899).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к средству, представляющему собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где средство, представляющее собой dsRNA, содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfauaL96 (SEQ ID NO:2876) и где антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT (SEQ ID NO:2889).

- 3 044245

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает двухцепочечное средство RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, где двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ n_p -N_a -(X X X) _±-N_b -Y Υ Υ —N_b — (Ζ Ζ Z)j -N_a - n_q 3 ' антисмысловая: 3’ n_p ' -N_a ' - (X 'X 'X ') _k-N_b '-Υ Ύ Ύ ' -N_b ' - (Ζ ' Ζ ' Z ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо не модифицированы, или их комбинации, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;

каждый из N_b и N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо не модифицированы, или их комбинации;

каждый из np, np', nq и nq', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов;

модификации N_b отличаются от модификации Y, а модификации N_b' отличаются от модификации Y'; и где смысловая цепь конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом.

В одном варианте осуществления i равняется 0; j равняется 0; i равняется 1; j равняется 1; как i, так и j равняется 0 или как i, так и j равняется 1.

В одном варианте осуществления k равняется 0; l равняется 0; k равняется 1; l равняется 1; как k, так и l равняется 0 или как k, так и l равняется 1.

В одном варианте осуществления XXX комплементарен Х'Х'Х', YYY комплементарен Y'Y'Y', и ZZZ комплементарен Z'Z'Z'.

В одном варианте осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой нити или рядом с ним.

В одном варианте осуществления мотив Y'Y'Y' находится в 11, 12 и 13 положениях антисмысловой цепи от 5'-конца.

В одном варианте осуществления Y' представляет собой 2'-О-метил.

В одном варианте осуществления формула (III) представлена формулой (IIIa): смысловая: 5' n_p -N_a -YYY -N_a - n_q 3 ' антисмысловая: 3' n_p,-N_a,- ΥΎΎ'- N_a>- n_q- 5' (Illa).

В другом варианте осуществления формула (III) представлена формулой (IIIb): смысловая: 5' n_p -N_a -YYY -N_b -ZZZ -N_a - n_q 3' антисмысловая: 3' n_p--N_a-- Υ Ύ ¹Y ' -N_b--Z ' Z ' Z ' - N_a-- n_q- 5' (IIIb), где каждый из N_b и N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-5 модифицированных нуклеотидов.

В еще одном варианте осуществления формула (III) представлена формулой (IIIc): смысловая: 5' n_p -N_a -XXX -N_b -YYY -N_a - n_q 3' антисмысловая: 3' n_p--N_a-- X'X'X'-N_b-- Y'Y'Y'- N_a-- n_q- 5' (IIIc), где каждый из N_b и N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-5 модифицированных нуклеотидов.

В другом варианте осуществления формула (III) представлена формулой (IIId):

Iсмысловая: 5’ n_p -N_a -X X X- N_b -Υ Υ Υ -N_b -Ζ Ζ Ζ -N_a - n_q 3’ антисмысловая: 3' n_p--N_a-- X'X'X'- N_b--Y ' Y ' Y '-N_b--Z ' Z ' Z ' - N_a-- n_q- 5' (IIId), где каждый из N_b и N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-5 модифицированных нуклеотидов, и каждый из Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления двухцепочечный участок составляет в длину 15-30 пар нуклеотидов.

В одном варианте осуществления двухцепочечный участок составляет в длину 17-23 пар нуклеотидов. В другом варианте осуществления двухцепочечный участок составляет в длину 17-25 пару нуклеотидов. В другом варианте осуществления двухцепочечный участок составляет в длину 23-27 пары нук- 4 044245 леотидов. В еще одном варианте осуществления двухцепочечный участок составляет в длину 19-21 пар нуклеотидов. В другом варианте осуществления двухцепочечный участок составляет в длину 21-23 пару нуклеотидов.

В одном варианте осуществления каждая цепь содержит 15-30 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления модификации нуклеотидов выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтила, 2'-O-алкила, 2'-O-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'-дезокси, 2'гидроксила и их комбинаций.

В другом варианте осуществления модификациями нуклеотидов представляют собой 2'-O-метил или 2'-фтор модификации.

В одном варианте осуществления лигандом является одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. В одном варианте осуществления лиганд представляет собой

В одном варианте осуществления лиганд прикреплен к 3'-концу смысловой цепи.

В одном варианте осуществления средство RNAi конъюгировано с лигандом, как показано на следующей схеме:

В одном варианте осуществления средство дополнительно содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь.

В одном варианте осуществления фосфотиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится на 3'-конце одной цепи.

В одном варианте осуществления цепь представляет собой антисмысловую цепь. В другом варианте осуществления цепь представляет собой смысловую цепь.

В одном варианте осуществления фосфотиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится на 5'-конце одной цепи.

В одном варианте осуществления фосфотиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится как на 5'-, так и на 3'-конце одной цепи.

В одном варианте осуществления цепь представляет собой антисмысловую цепь.

В одном варианте осуществления пара оснований в 1 положении 5'-конца антисмысловой цепи дуплекса является парой оснований AU.

В одном варианте осуществления нуклеотиды Y имеют 2'-фтор-модификацию.

В одном варианте осуществления нуклеотиды Y' имеют 2'-O-метил-модификацию.

В одном варианте осуществления р’>0.

В одном варианте осуществления р-2.

В одном варианте осуществления q'=0, p=0, q=0, и выступающие нуклеотиды р' комплементарны целевой мРНК.

В другом варианте осуществления q'=0, p-0, q-0, и выступающие нуклеотиды р' не комплементарны целевой мРНК.

В одном варианте осуществления смысловая цепь содержит в общей сложности 21 нуклеотид, а антисмысловая цепь содержит в общей сложности 23 нуклеотида.

- 5 044245

В одном варианте осуществления по меньшей мере один np' связан с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи.

В одном варианте осуществления все np' связаны с соседними нуклеотидами посредством фосфотиоатных связей.

В одном варианте осуществления средство RNAi выбрано из группы средств RNAi, перечисленных в табл. 4, табл. 18, табл. 19 или табл. 23. В другом варианте осуществления средство RNAi выбрано из группы, состоящий из AD-58123, AD-58111, AD-58121, AD-58116, AD-58133, AD-58099, AD-58088, AD58642, AD-58644, AD-58641, AD-58647, AD-58645, AD-58643, AD-58646, AD-62510, AD-62643, AD62645, AD-62646, AD-62650 и AD-62651.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает двухцепочечное средство RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, где указанное двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где указанная антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей компонент комплемента С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где указанное двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ n_p -N_a -(X X X) i-N_b -YYY -N_b - (Ζ Z Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3' n_p '-N_a ' - (X'X'X ') _k-N_b '-Υ Ύ Ύ '-N_b ' - (Ζ ' Ζ ' Ζ ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из N_b и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо не модифицированы, или их комбинации;

каждый из np, np', n_q и n_q', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', YY'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, и где модификации являются 2'-Oметил- или 2'-фтор-модификациями;

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает двухцепочечное средство RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, где указанное двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где указанная антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей компонент комплемента С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где указанное двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ n_p -N_a - (X X X) i-N_b -YYY -N_b -(Ζ Z Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3’ n_p ' -N_a ' - (X 'X 'X ') _k-N_b '-Y Ύ Ύ ' -N_b ' - (Ζ ' Ζ ' Z ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из n_p, n_q, и n_q', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

каждый из р, q и q' независимо равняется 0-6;

n_p'>0, и по меньшей мере один np' связан с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи;

каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, и где модификации являются 2'-Oметил- или 2'-фтор-модификациями;

модификации Nb отличаются от модификации Y, а модификации Nb' отличаются от модификации Y'; и где смысловая цепь конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом.

- 6 044245

смысловая: 5’ n_p -N_a - (X X X) i-N_b -YYY -N_b -(Z Z Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3’ n_p '-N_a ' - (X'X'X ') _k-N_b '-Y ' Y ' Y '-N_b ' - (Z ' Z ' Z ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из np, nq, и nq', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

каждый из р, q и q' независимо равняется 0-6;

модификации N_b отличаются от модификации Y, а модификации N_b' отличаются от модификации Y'; и где смысловая цепь конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом, где лигандом является одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает двухцепочечное средство RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, где указанное двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где указанная антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей компонент комплемента С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где указанное двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ n_p -N_a - (X X X) i-N_b -YYY -N_b -(Z Z Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3’ n_p ' -N_a ' - (X 'X 'X ') _k-N_b '-Y Ύ Ύ ' -N_b ' - (Z ' Z ' Z ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р, q и q' независимо равняется 0-6;

n_p'>0, и по меньшей мере один n_p' связан с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи;

модификации N_b отличаются от модификации Y, а модификации N_b' отличаются от модификации Y';

где смысловая цепь содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь; и где смысловая цепь конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом, где лигандом является одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает двухцепочечное средство RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, где указанное двухцепочечное средство

- 7 044245

RNAi содержит смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где указанная антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей компонент комплемента С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где указанное двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5' n_p -N_a -Y Y Y - N_a - n_q 3' антисмысловая: 3' n_p'-N_a'- ΥΎΎ'- N_a'- n_q' 5' (Illa), где каждый из n_p, nq, и nq', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

каждый из р, q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из N_a и N_a' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо не модифицированы, или их комбинации, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;

каждый из YYY и YY'Y' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, и где модификации являются 2'-O-метил- или 2'-фтормодификациями;

В одном аспекте настоящее изобретение относится к двухцепочечному средству RNAi для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, где практически все нуклеотиды смысловой цепи содержат модификации, выбранные из группы, состоящей из 2'-O-метuл модификации и 2'фтор модификации, где смысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце, где практически все нуклеотиды антисмысловой цепи содержат модификации, выбранные из группы, состоящей из 2'-O-метuл модификации и 2'-фтор модификации, где антисмысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце, и где смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными через разветвленный двухвалентный или трехвалентный линкер на 3'-конце.

В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой цепи и все нуклеотиды антисмысловой цепи представляют собой модифицированные нуклеотиды. В другом варианте осуществления каждая цепь содержит 19-30 нуклеотидов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей средство, представляющее собой dsRNA, по настоящему изобретению.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, кодирующему по меньшей мере одну цепь средства, представляющего собой dsRNA, где средство, представляющее собой dsRNA, содержит участок комплементарности к по меньшей мере части мРНК, кодирующей компонент комплемента С5, где dsRNA составляет в длину 30 пар оснований или меньше, и где средство, представляющее собой dsRNA, нацелено на мРНК с целью отщепления.

В одном варианте осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину. В другом варианте осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотида в длину. В другом варианте осуществления каждая цепь содержит 19-30 нуклеотидов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор по настоящему изобретению.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования экспрессии гена компонента комплемента С5, содержащей средство, представляющее собой dsRNA, по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления средство RNAi вводят в не забуференном растворе.

В одном варианте осуществления не забуференный раствор представляет собой физиологический раствор или воду.

В одном варианте осуществления средство RNAi вводят в буферном растворе.

В одном варианте осуществления буферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат, или любую их комбинацию.

В другом варианте осуществления буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

- 8 044245

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей двухцепочечное средство RNAi по настоящему изобретению и липидный состав.

В одном варианте осуществления липидный состав включает LNP. В другом варианте осуществления липидный состав включает MC3.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей средство антисмыслового полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 19, 18, 20, 21 и 23.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей средство смыслового полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 19, 18, 20, 21 и 23.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к средству модифицированного антисмыслового полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 4, 6, 18, 19, 21 и 23.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к средству модифицированного смыслового полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из смысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 4, 6, 18, 19, 21 и 23.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, осуществляя тем самым лечение субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, предотвращая тем самым по меньшей мере один симптом у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающийся не более чем на 3 нуклеотида от любой из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, 23, осуществляя тем самым лечение субъекта.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающийся не более чем на 3 нуклеотида от любой из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, предотвращая тем самым по меньшей мере один симптом у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие, которые включают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухцепочечного средства RNAi, где двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, где практически все нуклеотиды антисмысловой цепи и практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, и где смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими лигандами на 3'-конце.

- 9 044245

В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой цепи и все нуклеотиды антисмысловой цепи представляют собой модифицированные нуклеотиды.

В одном варианте осуществления введение представляет собой подкожное введение.

В одном варианте осуществления практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого dT нуклеотида. В другом варианте осуществления практически все нуклеотиды антисмысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого дезокси-тимин (dT) нуклеотида. В другом варианте осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой короткую последовательность дезокси-тимин (dT) нуклеотидов. В другом варианте осуществления смысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце. В одном варианте осуществления антисмысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце. В еще одном варианте осуществления смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными через разветвленный двухвалентный или трехвалентный линкер на 3'-конце.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие, которые включают введение субъекту профилактически эффективного количества двухцепочечного средства RNAi, где двухцепочечное средство RNAi содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, где практически все нуклеотиды антисмысловой цепи и практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, и где смысловая цепь конъюгирована с одним лигандом на 3'-конце.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ п_р -N_a - (X X X) i-N_b -Y Y Y -N_b - (Ζ Ζ Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3’ п_р ' -N_a ' - (X 'X 'X ') _k-N_b '-Υ Ύ Ύ ' -N_b ' - (Ζ ' Ζ ' Ζ ' ) _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из np, np', n_q и nq', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

- 10 044245 каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', YY'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов;

модификации N_b отличаются от модификации Y, а модификации N_b' отличаются от модификации

Y'; и где смысловая цепь конъюгирована с по меньшей мере одним лигандом; с помощью которого осуществляется лечение субъекта, при котором осуществляется лечение субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из N_b и N_b независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо не модифицированы, или их комбинации;

модификации Nb отличаются от модификации Y, а модификации Nb' отличаются от модификации Y'; и где смысловая цепь конъюгирована с по меньшей мере одним лигандом; с помощью которого предотвращается по меньшей мере один симптом у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, тем самым предотвращая по меньшей мере один симптом у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие.

В одном варианте осуществления введение dsRNA субъекту приводит к уменьшению внутрисосудистого гемолиза, стабилизации уровня гемоглобина и/или снижению скопления белка С5.

В одном варианте осуществления заболевание представляет собой заболевание, связанное с компонентом комплемента С5. В одном варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, выбрано из группы, состоящей из ночной пароксизмальной гемоглобинурии (PNH), атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), астмы, ревматоидного артрита (RA), синдрома антифосфолипидных антител, волчаночного нефрита, ишемически-реперфузионного повреждения, типичного или инфекционного гемолитико-уремического синдрома (tHUS), болезни плотного осадка (DDD), оптиконевромиелита (NMO), мультифокальной моторной нейропатии (MMN), рассеянного склероза (MS); дегенерации желтого пятна (например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD)); синдрома, включающего гемолиз, повышение активности печеночных ферментов и снижение числа тромбоцитов (HELLP-синдром); пурпуры тромботической тромбоцитопенической (ТТР); спонтанной потери плода; пауци-иммунного васкулита; буллезного эпидермолиза; рецидивирующей потери плода; преэклампсии, черепно-мозговой травмы, миастении, болезни холодовых агглютининов, дерматомиозита буллезного пемфигоида, связанного с Шига-подобным токсином Е. coli гемолитико-уремического синдрома, C3-нефропатии, васкулита, связанного с антителами к цитоплазме нейтрофилов; реакций отторжения трансплантата, вызванных гуморальными и сосудистыми механизмами, дисфункции трансплантата, инфаркта миокарда, аллогенной трансплантации, сепсиса, заболевания коронарной артерии, дерматомиозита, болезни Грейвса, атеросклероза, болезни Альцгеймера, сепсиса, связанного с системным воспалительным ответом, септического шока, травмы спинного мозга, гломерулонефрита, тиреоидита Хашимото, диабета I типа, псориаза, пузырчатки, аутоиммунной гемолитической анемии (AIHA), ITP, синдрома Гудпасчера, болезни Дегоса, антифосфолипидного синдрома (APS), катастрофического APS (CAPS), сердечно-сосудистых нарушений, миокардита, цереброваскулярного нарушения, перифериче- 11 044245 ских сосудистых нарушений, реноваскулярной гипертензии, нарушений брыжеечных/кишечных сосудов, васкулита, нефрита Шенлейна-Геноха, васкулита, связанного с системной красной волчанкой, васкулита, связанного с ревматоидным артритом, васкулита, связанного с иммунными комплексами, болезни Такаясу, дилатационной кардиомиопатии, диабетической ангиопатии, болезни Кавасаки (артериита), венозной газовой эмболии (VGE) и рестеноза после установки стента, вращательной атерэктомии, перепончатой нефропатии, синдрома Гийена-Барре и чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (РТСА). В другом варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой ночную пароксизмальную гемоглобинурию (PNH). В еще одном варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS).

В одном варианте осуществления субъектом является человек.

В другом варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают введение субъекту антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента.

В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует расщепление компонента комплемента С5 на фрагменты С5а и С5Ь. В другом варианте осуществления антитело к компоненту комплемента С5 представляет собой экулизумаб.

В другом варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают введение субъекту менингококковой вакцины.

В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 900 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 900 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 900 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 1200 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 1200 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В одном варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 900 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 1200 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 1200 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 900 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 900 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 600 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 600 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В еще одном варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В одном варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 300 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают плазмоферез или замещение плазмы у субъекта. В одном таком варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 600 мг или в дозе менее чем приблизительно 300 мг.

В другом варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают инфузию плазмы субъекту. В одном таком варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг.

В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг. В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг.

В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе, выбранной из группы, состоящей из 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг.

В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту путем внутривенной инфузии.

В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту подкожно.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг.

- 12 044245

В другом варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозе от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозе, выбранной из группы, состоящей из 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту один раз в неделю. В другом варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту два раза в неделю. В другом варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту два раза в месяц.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту подкожно.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, и экулизумаб вводят субъекту подкожно. В другом варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, и экулизумаб вводят субъекту одновременно.

В одном варианте осуществления сначала вводят субъекту средство, представляющее собой dsRNA, в период времени, достаточный для снижения уровня компонента комплемента С5 у субъекта, и затем вводят экулизумаб в дозе менее чем приблизительно 600 мг.

В одном варианте осуществления уровень компонента комплемента С5 у субъекта снижен на по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%.

В одном варианте осуществления экулизумаб вводят в дозе приблизительно 100-500 мг.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают измерение уровней гемоглобина и/или LDH у субъекта.

В одном варианте осуществления dsRNA конъюгирована с лигандом.

В одном варианте осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой цепи dsRNA.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, содержащим смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5; и поддержание клетки, полученной на стадии (а) в течение времени, достаточного для разрушения транскрипта мРНК гена С5, тем самым ингибируя экспрессию гена С5 в клетке.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, содержащим смысловую цепь и антисмысловую цепь, где антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающийся не более чем на 3 нуклеотида от любой из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23; и поддержание клетки, полученной на стадии (а) в течение времени, достаточного для разрушения транскрипта мРНК гена С5, тем самым ингибируя экспрессию гена С5 в клетке.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, включающими приведение клетки в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, содержащим смысловую цепь и антисмысловую цепь, содержащую участок комплементарности, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, где практически все нуклеотиды антисмысловой цепи и практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами и где смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими лигандами на 3'-конце; и поддержание клетки, полученной на первой стадии в течение времени, достаточного для разрушения транскрипта мРНК гена С5, тем самым ингибируя экспрессию гена С5 в клетке.

В одном варианте осуществления практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого dT нуклеотида. В другом варианте осуществления практически все нуклеотиды антисмысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого дезокси-тимин (dT) нуклеотида. В другом варианте осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой короткую последовательность дезокси-тимин (dT) нуклеотидов. В другом варианте осуществления смысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце. В одном варианте осуществления ан- 13 044245 тисмысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце. В еще одном варианте осуществления смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными через разветвленный двухвалентный или трехвалентный линкер на 3'-конце.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, содержащим смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ n_p -N_a - (X X X) i-N_b -Y Y Y -N_b - (Ζ Ζ Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3’ n_p ' -N_a ' - (X 'X 'X ') _k-N_b '-Y Ύ Ύ ' -N_b ' - (Ζ ' Ζ ' Z ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', YYY и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов;

модификации N_b отличаются от модификации Y, а модификации Nb' отличаются от модификации Y'; и где смысловая цепь конъюгирована с по меньшей мере одним лигандом; и поддержание клетки, полученной на стадии (а) в течение времени, достаточного для разрушения транскрипта мРНК гена С5, тем самым ингибируя экспрессию гена С5 в клетке.

В одном варианте осуществления клетка находится в субъекте.

В одном варианте осуществления, субъект-человек страдает от заболевания, связанного с компонентом комплемента С5.

В одном варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, выбрано из группы, состоящей из ночной пароксизмальной гемоглобинурии (PNH), атипичного гемолитикоуремического синдрома (aHUS), астмы, ревматоидного артрита (RA), синдрома антифосфолипидных антител, волчаночного нефрита, ишемически-реперфузионного повреждения, типичного или инфекционного гемолитико-уремического синдрома (tHUS), болезни плотного осадка (DDD), оптиконевромиелита (NMO), мультифокальной моторной нейропатии (MMN), рассеянного склероза (MS); дегенерации желтого пятна (например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD)); синдрома, включающего гемолиз, повышение активности печеночных ферментов и снижение числа тромбоцитов (HELLP-синдром); пурпуры тромботической тромбоцитопенической (ТТР); спонтанной потери плода; пауци-иммунного васкулита; буллезного эпидермолиза; рецидивирующей потери плода; преэклампсии, черепно-мозговой травмы, миастении, болезни холодовых агглютининов, дерматомиозита буллезного пемфигоида, связанного с Шига-подобным токсином Е. coli гемолитико-уремического синдрома, C3нефропатии, васкулита, связанного с антителами к цитоплазме нейтрофилов; реакций отторжения трансплантата, вызванных гуморальными и сосудистыми механизмами, дисфункции трансплантата, инфаркта миокарда, аллогенной трансплантации, сепсиса, заболевания коронарной артерии, дерматомиозита, болезни Грейвса, атеросклероза, болезни Альцгеймера, сепсиса, связанного с системным воспалительным ответом, септического шока, травмы спинного мозга, гломерулонефрита, тиреоидита Хашимото, диабета I типа, псориаза, пузырчатки, аутоиммунной гемолитической анемии (AIHA), ITP, синдрома Гудпасчера, болезни Дегоса, антифосфолипидного синдрома (APS), катастрофического APS (CAPS), сердечнососудистых нарушений, миокардита, цереброваскулярного нарушения, периферических сосудистых нарушений, реноваскулярной гипертензии, нарушений брыжеечных/кишечных сосудов, васкулита, нефрита Шенлейна-Геноха, васкулита, связанного с системной красной волчанкой, васкулита, связанного с ревматоидным артритом, васкулита, связанного с иммунными комплексами, болезни Такаясу, дилатационной кардиомиопатии, диабетической ангиопатии, болезни Кавасаки (артериита), венозной газовой эмболии (VGE) и рестеноза после установки стента, вращательной атерэктомии, перепончатой нефропатии, синдрома Гийена-Барре и чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (РТСА). В другом варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой

- 14 044245 ночную пароксизмальную гемоглобинурию (PNH). В другом варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS).

В одном варианте осуществления способы дополнительно включают приведение клетки в контакт с антителом к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует расщепление компонента комплемента С5 на фрагменты С5а и С5Ь.

В одном варианте осуществления, антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой экулизумаб.

В одном варианте осуществления способы дополнительно включают приведение клетки в контакт с менингококковой вакциной.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 900 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 900 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 900 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 1200 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 1200 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В еще одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 900 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 900 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 600 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 600 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 300 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают плазмоферез или замещение плазмы у субъекта. В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 600 мг. В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают инфузию плазмы субъекту. В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг.

В другом варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом в дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом в дозе, выбранной из группы, состоящей из 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг.

В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту путем внутривенной инфузии. В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту подкожно.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг.

В другом варианте осуществления клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, в дозе от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, в дозе, выбранной из группы, состоящей из 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг.

- 15 044245

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, один раз в неделю. В другом варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту два раза в неделю. В другом варианте осуществления клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, два раза в месяц.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, и экулизумабом одновременно.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту сначала в период времени, достаточный для снижения уровня компонента комплемента С5 у субъекта, а экулизумаб вводят затем в дозе менее чем приблизительно 600 мг.

В одном варианте осуществления уровень компонента комплемента С5 у субъекта снижается на по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%.

В одном варианте осуществления сначала клетку приводят в контакт со средством, представляющим собой dsRNA, в период времени, достаточный для снижения уровня компонента комплемента С5 в клетке, и затем клетку приводят в контакт с экулизумабом в дозе менее чем приблизительно 600 мг.

В одном варианте осуществления уровень компонента комплемента С5 в клетке снижается на по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%.

В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с экулизумабом в дозе приблизительно 100-500 мг/кг.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии С5 у субъекта. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, тем самым ингибируя экспрессию С5 у субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии С5 у субъекта. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающийся не более чем на 3 нуклеотида от любой из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19,, 20, 21 и 23, тем самым ингибируя экспрессию С5 у субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающаяся не более чем на 3 нуклеотида от нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, где практически все нуклеотиды антисмысловой цепи и практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами и где смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими лигандами на 3'конце, тем самым ингибируя экспрессию гена С5 у субъекта.

В одном варианте осуществления практически все нуклеотиды смысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-О-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого dT нуклеотида. В другом варианте осуществления практически все нуклеотиды антисмысловой цепи являются модифицированными нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из 2'-О-метил модификации, 2'-фтор модификации и 3'-концевого дезокси-тимин (dT) нуклеотида. В другом варианте осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой короткую последовательность дезокси-тимин (dT) нуклеотидов. В другом варианте осуществления смысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце. В одном варианте осуществления антисмысловая цепь содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце. В еще одном варианте осуществления смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными через разветвленный двухвалентный или трехвалентный линкер на 3'-конце.

- 16 044245

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии С5 у субъекта. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, содержащего смысловую цепь, комплементарную антисмысловой цепи, где антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей С5, где каждая цепь составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где двухцепочечное средство RNAi представлено формулой (III):

смысловая: 5’ n_p -N_a -(X X X) i-N_b -Y Y Y -N_b - (Ζ Ζ Z)j -N_a - n_q 3 ’ антисмысловая: 3' n_p ' -N_a ' - (X 'X 'X ') _k-N_b '-Y Ύ Ύ ' -N_b ' - (Ζ ' Ζ ' Z ') _b-N_a ' - n_q ' 5’ (III), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо не модифицированы, или их комбинации;

каждый из n_p, n_p', n_q и n_q', каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', ΥΎΎ и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов;

модификации Nb отличаются от модификации Υ, а модификации Nb' отличаются от модификации Υ'; и где смысловая цепь конъюгирован с по меньшей мере одним лигандом, тем самым ингибируя экспрессию С5 у субъекта.

В одном варианте осуществления способы дополнительно включают введение субъекту антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают введение субъекту менингококковой вакцины.

В одном варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 600 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 600 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В другом варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого.

В еще одном варианте осуществления возраст субъекта меньше чем 18 лет и экулизумаб вводят субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 300 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого.

- 17 044245

В одном варианте осуществления способы дополнительно включают плазмоферез или замещение плазмы у субъекта. В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 600 мг. В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг.

В одном варианте осуществления способы дополнительно включают инфузию плазмы субъекту. В одном варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг.

В другом варианте осуществления экулизумаб вводят субъекту в дозе, выбранной из группы, состоящей из 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозе от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. В другом варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозе, выбранной из группы, состоящей из 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой dsRNA, конъюгировано с лигандом.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение трех путей комплемента: альтернативного, классического и лектинового.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий процентную долю компонента комплемента С5, оставшуюся у мышей линии C57BL/6 после разовой дозы 10 мг/кг указанных иРНК.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий процентную долю компонента комплемента С5, оставшуюся у мышей линии C57BL/6 после разовой дозы 10 мг/кг указанных иРНК.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий процентную долю компонента комплемента С5, оставшуюся у мышей линии C57BL/6 через 48 ч после разовой дозы 10 мг/кг указанных иРНК.

Фиг. 5А представляет собой график, показывающий процентную долю гемолиза, оставшуюся в дни 4 и 7 у крыс после разового подкожного введения AD-58642 в дозе 2,5 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг.

На фиг. 5В представлены данные вестерн-блоттинга, показывающие количество компонента комплемента С5, оставшееся на день 7 у крыс после разового подкожного введения AD-58642 в дозе 2,5 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг.

Фиг. 6А и 6В представляют собой графики, показывающие процентную долю компонента комплемента С5, оставшуюся у мышей линии C57BL/6 через 5 дней после разовой дозы AD-58642 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг.

Фиг. 7А и 7В представляют собой графики, показывающие процентную долю гемолиза, оставшуюся на 5-й день у мышей линии C57BL/6 после разовой дозы AD-58642 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг.

- 18 044245

На фиг. 8 представлены данные вестерн-блоттинга, показывающие количество компонента комплемента С5, оставшееся на день 5 у мышей линии C57BL/6 после разовой дозы AD-58642 1,25 мг/кг,

2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий количество белка компонента комплемента С5, оставшееся на день 5 и 9 в сыворотке мышей после разовой дозы AD-58641 0,625 мг/кг, 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5,0 мг/кг или 10 мг/кг. Нижний предел количественного определения (LLOQ) в ходе анализа показан в виде пунктирной линии.

Фиг. 10 представляет собой график, показывающий количество белка компонента комплемента С5, оставшееся на день 8 в сыворотке мышей после введения AD-58641 в дни 0, 1, 2, и 3 в дозе 0,625 мг/кг, 1,25 мг/кг или 2,5 мг/кг. Нижний предел количественного определения (LLOQ) в ходе анализа показан в виде пунктирной линии.

На фиг. 11A и 11В показана эффективность и кумулятивный эффект повторного введения соединения AD-58641 у крыс. Фиг. 11A представляет собой график, показывающий гемолитическую активность, сохранившуюся в сыворотке крыс на день 0, 4, 7, 11, 14, 18, 25 и 32 после повторного введения в дозе 2,5 мг/кг/доза или 5,0 мг/кг/доза, q2w х3 (два раза в неделю в течение 3 недель). На фиг. 11В представлены данные вестерн-блоттинга, показывающие количество белка компонента комплемента С5, оставшегося в сыворотке животных.

Фиг. 12 представляет собой график, показывающий количество белка компонента комплемента С5 в сыворотке макаков-крабоедов в различные моменты времени до, во время и после двух циклов подкожного введения AD-58641 в дозе 2,5 мг/кг или 5 мг/кг каждый третий день в количестве восьми доз. Уровни белка С5 приводили к среднему из трех образцов до введения препарата.

Фиг. 13 представляет собой график, показывающий процентную долю гемолиза, оставшуюся в сыворотке макаков-крабоедов в различные моменты времени до, во время и после двух циклов подкожного введения AD-58641 в дозе 2,5 мг/кг или 5 мг/кг каждый третий день в количестве восьми доз. Процентную долю гемолиза рассчитывали по отношению максимального гемолиза к фоновому гемолизу в контрольных образцах.

Фиг. 14 представляет собой график, показывающий процентную долю белка компонента комплемента С5, оставшуюся на день 5 в сыворотке мышей линии C57BL/6 после разовой дозы 1 мг/кг указанных иРНК.

Фиг. 15 представляет собой график, показывающий процентную долю белка компонента комплемента С5, оставшуюся на день 5 в сыворотке мышей линии C57BL/6 после разовой дозы 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг или 2,0 мг/кг указанных иРНК.

Фиг. 16 представляет собой график, показывающий процентную долю белка компонента комплемента С5, оставшуюся в сыворотке мышей линии C57BL/6 на день 6, 13, 20, 27 и 34 после разовой дозы 1 мг/кг указанных иРНК.

Фиг. 17 представляет собой график, показывающий процентную долю гемолиза, оставшуюся в сыворотке крыс в различные моменты времени после введения дозы 5 мг/кг указанных соединений в день 0, 4 и 7.

На фиг. 18А показана последовательность нуклеотидов компонента комплемента 5 (С5) Homo sapiens (SEQ ID NO:1); на фиг. 18В показана последовательность нуклеотидов компонента комплемента 5 (С5) Масаса mulatta (SEQ ID NO:2); на фиг. 18С показана последовательность нуклеотидов компонента комплемента 5 (С5) Mus musculus (SEQ ID NO:3); на фиг. 18D показана последовательность нуклеотидов компонента комплемента 5 (С5) Rattus norvegicus (SEQ ID NO:4); на фиг. 18Е показано обратное дополнение SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:5); на фиг. 18Е показано обратное дополнение SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO: 6); на фиг. 18С показано обратное дополнение SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:7); и на фиг. 18Н показано обратное дополнение SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO:8).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к средствам, представляющим собой иРНК, которые воздействуют на опосредованное РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC) отщепление РНКтранскриптов гена компонента комплемента С5.

иРНК по настоящему изобретения содержат цепь РНК (антисмысловую цепь), содержащую участок, составляющий приблизительно 30 нуклеотидов или менее в длину, например, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 нуклеотидов в длину, при этом участок, по сути, комплементарен по меньшей мере части транскрипта мРНК гена С5. Применение этих иРНК обеспечивает целевое разрушение мРНК гена С5 у млекопитающих. Очень низкие дозы иРНК С5, в частности, могут специфически и эффективно опосредовать интерференцию РНК (RNAi), что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена С5. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что иРНК, нацеленные на С5, могут опосредовать RNAi in vitro и in vivo, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена С5. Таким образом, способы и композиции, включающие эти иРНК, полезны при лечении субъекта,

- 19 044245 у которого снижение уровня и/или активности белка С5 окажет благоприятное воздействие, например, субъекта, страдающего заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, таким как ночная пароксизмальная гемоглобинурия (PNH).

Настоящее изобретение также относится к способам и комбинированной терапии для лечения субъекта с нарушением, на которое можно оказать благоприятное воздействие путем ингибирования или снижения экспрессии гена С5, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, такого как ночная пароксизмальная гемоглобинурия (PNH) и атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS) с помощью композиций иРНК, которые воздействуют на опосредованное РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC) отщепление РНК-транскриптов гена компонента комплемента С5.

Настоящее изобретение также относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома, например, гемолиза, у субъекта, страдающего нарушением, при котором ингибирование или снижение экспрессии гена С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, такого как ночная пароксизмальная гемоглобинурия (PNH) и атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS). Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям иРНК, которые воздействуют на опосредованное РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC) отщепление РНК-транскриптов гена компонента комплемента С5. Ген С5 может находиться в пределах клетки, например, клетки в пределах субъекта, такого как человек.

Комбинированная терапия по настоящему изобретению включает введение субъекту, страдающему заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, средства RNAi по настоящему изобретению и дополнительного терапевтического средства, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к компоненту комплемента С5, например, экулизумаба.

Комбинированные терапии по настоящему изобретению снижают уровень С5 у субъекта (например, приблизительно на 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или приблизительно 99%) путем нацеливания на мРНК С5 средства iRNA по настоящему изобретению и, соответственно, позволяют снизить требуемое терапевтически (или профилактически) эффективное количество экулизумаба при лечении субъекта, тем самым уменьшают расходы на лечение и позволяют применять более легкие и более удобные способы введения экулизумаба, такие как подкожное введение.

Нижеследующее подробное описание раскрывает способы получения и применения композиций, содержащих иРНК, для ингибирования и экспрессии гена С5, а также композиции, применения и способы лечения субъектов, страдающих заболеваниями или нарушениями, при которых ингибирование и/или снижение экспрессии этого гена окажет благоприятное воздействие.

I. Определения.

Для того чтобы настоящее изобретение можно было более легко понять, вначале даны определения соответствующим терминам. Кроме того, следует отметить, что в случаях, когда в данном документе перечисляются значение или диапазон значений переменной, подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

Форму единственного числа используют в данном документе для обозначения одного или нескольких (т.е. по меньшей мере одного) грамматических объектов статьи. В качестве примера, элемент означает один элемент или несколько элементов, например, множество элементов.

Выражение включающий используют в данном документе для обозначения фразы включающий без ограничения и используют взаимозаменяемо с ней.

Выражение или используют в данном документе для обозначения выражения и/или и используют взаимозаменяемо с ним, если контекст явно не указывает иное.

Применяемый в данном документе компонент комплемента С5, используемый взаимозаменяемо с выражением С5, относится к хорошо известному гену и полипептиду, также известному в данной области техники как CPAMD4, C3- и PZP-подобной белок, содержащий домен альфа-2-макроглобулина, аналог анафилотоксина С5а, гемолитический комплемент (Hc) и единица комплемента С5. Последовательность транскрипта мРНК С5 человека можно найти, например, в GenBank, № GI: 38016946 (NM_001735.2; SEQ ID NO:1). Последовательность мРНК С5 макак можно найти, например, в GenBank, № GI: 297270262 (ХМ_001095750.2; SEQ ID NO:2). Последовательность мРНК С5 мыши можно найти, например, в GenBank, № GI: 291575171 (NM_010406.2; SEQ ID NO:3). Последовательность мРНК С5 крысы можно найти, например, в GenBank, № GI: 392346248 (ХМ_345342.4; SEQ ID NO:4). Дополнительные примеры последовательностей мРНК С5 легко доступны в публичных базах данных, например, GenBank.

Выражение С5, применяемое в данном документе, также относится к встречающимся в природе вариациям последовательностей ДНК гена С5, таким как однонуклеотидный полиморфизм в гене С5. Были определены многочисленные SNP в гене С5 и могут быть найдены, например, в dbSNP NCBI (см., например, ncbi.nlm.nih.gov/snp). Не ограничивающие примеры SNP в гене С5 можно найти в dbSNP NCBI, номера доступа rs121909588 и rs121909587.

Применяемая в данном документе целевая последовательность относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной в процессе транскрипции гена С5, в

- 20 044245 том числе к мРНК, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. В одном варианте осуществления целевая часть последовательности будет, по меньшей мере, достаточно длинной, чтобы служить в качестве подложки для иРНК-направленного отщепления на или вблизи этой части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образующейся при транскрипции гена С5.

Целевая последовательность может составлять приблизительно 9-36 нуклеотидов в длину, например, приблизительно 15-30 нуклеотидов в длину. Например, целевая последовательность может составлять приблизительно 15-30 нуклеотидов, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 1520, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 1929, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 2024,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 нуклеотидов в длину. Диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам и длинам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Применяемое в данном документе выражение цепь, содержащая последовательность относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая характеризуется последовательностью, обозначаемой с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.

Каждый из G, С, А, Т и U, как правило, означает нуклеотид, который содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил в качестве основания, соответственно. Однако, будет понятно, что выражение рибонуклеотид или нуклеотид также может означать модифицированный нуклеотид, который подробнее описан ниже, или имитирующий нуклеотид заменяющий фрагмент (см, например, табл. 2). Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть замещены другими фрагментами без изменения в значительной степени свойств спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий фрагмент. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть замещены в нуклеотидных последовательностях dsRNA, описанных в настоящем изобретении, нуклеотидами, содержащими, например, инозин. В другом примере аденин и цитозин в любой точке олигонуклеотида могут быть замещены гуанином и урацилом, соответственно, с образованием неоднозначного спаривания оснований G-U с целевой мРНК. Последовательности, содержащие такие заменяющие фрагменты, подходят для композиций и способов, описанных в настоящем изобретении.

Выражения иРНК, средство RNAi, средство, представляющее собой иРНК, средство РНКинтерференции, применяемые в данном документе взаимозаменяемо, означают средство, которое содержит РНК в том значении, в котором это выражение описано в данном документе, и которое опосредует нацеленное отщепление РНК-транскрипта через путь РНК-индуцированного комплекса сайленсинга (RISC). иРНК направляет специфичное в отношении последовательности разрушение мРНК посредством процесса, известного как РНК-интерференция (RNAi). иРНК модулирует, например, ингибирует экспрессию С5 в клетке, например, клетке субъекта, как, например, субъекта-млекопитающего.

В одном варианте осуществления средство RNAi по настоящему изобретению включает одноцепочечную РНК, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например, целевой последовательностью мРНК С5, с направлением отщепления целевой РНК. Не желая привязываться к теории, считают, что длинная двухцепочечная РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, подобный рибонуклеазе III типа фермент, участвует в процессинге dsRNA на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными выступами на 3'-конце в два основания (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). siRNA затем встраиваются в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, позволяя комплементарной антисмысловой цепи направлять распознавание мишени (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой мРНК одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к одноцепочечной РНК (siRNA), образованной внутри клетки, и которая способствует образованию RISC-комплекса с осуществлением сайленсинга целевого гена, т.е. гена С5. Соответственно, выражение siRNA также используют в данном документе для обозначения RNAi, описанной выше.

В другом варианте осуществления средство RNAi может быть одноцепочечной siRNA, которую вводят в клетку или организм для ингибирования целевой мРНК. Одноцепочечные средства RNAi связываются с Argonaute 2, обладающим эндонуклеазной активностью в комплексе RISC, который затем отщепляет целевую мРНК. Одноцепочечные siRNA, как правило, составляют 15-30 нуклеотидов и химически модифицированы. Строение и испытание одноцепочечных siRNA описаны в патенте США № 8101348 и в Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки. Любые антисмысловые нуклеотидные последовательности, описанные в данном документе, можно использовать в качестве одноцепочечной siRNA, которая описана в данном документе или которая химически модифицирована способами, описанными в Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894.

- 21 044245

В другом варианте осуществления иРНК для применения в композициях, применениях и способах по настоящему изобретению является двухцепочечной РНК и в данном документе ее называют двухцепочечным средством RNAi, молекулой двухцепочечной РНК (dsRNA), средством, представляющим собой dsRNA или dsRNA. Выражение dsRNA означает комплекс молекул рибонуклеиновых кислот с дуплексной структурой, содержащий две встречно-параллельные и, по сути, комплементарные цепи нуклеиновых кислот, рассматриваемые как имеющие смысловую и антисмысловую ориентацию по отношению к целевой РНК, т.е. гену С5. В некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению двухцепочечная РНК (dsRNA) запускает расщепление целевой РНК, например, мРНК через пост-транскрипционный механизм сайленсинга генов, называемый в данном документе РНКинтерференцией или RNAi.

В общем, большинство нуклеотидов каждой цепи молекулы dsRNA являются рибонуклеотидами, но, как описано подробно в данном документе, каждая или обе цепи могут также включать один или несколько нуклеотидов, не являющихся рибонуклеотидами, например, дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, применяемое в данном описании, средство RNAi может включать рибонуклеотиды с химическими модификациями; средство RNAi может включать значительные модификации множества нуклеотидов. Такие модификации могут включать все типы модификаций, раскрытых в данном документе или известных в области техники. Любые такие модификации, которые применяются в молекуле типа siRNA, охвачены выражением средство RNAi в контексте данных описания и формулы изобретения.

Дуплексный участок может быть любой длины, при которой возможно специфичное разрушению желаемой целевой РНК через путь RISC и может составлять от приблизительно 9 до 36 пар оснований в длину, например, приблизительно 15-30 пар оснований в длину, например, приблизительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или пар оснований в длину, например, приблизительно 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 1520, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 1929, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 2024,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 пар оснований в длину. Диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам и длинам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут быть различными частями одной большей молекулы РНК или они могут быть отдельными молекулами РНК. В тех случаях, когда две цепи являются частью одной большей молекулы и, следовательно, соединены непрерываемой цепью нуклеотидов от 3'конца одной цепи до 5'-конца соответствующей другой цепи, образующих дуплексную структуру, соединяющую цепь РНК, называют шпилькой петли. Шпилька петли может содержать по меньшей мере один неспаренный нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления шпилька петли может содержать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или более неспаренных нуклеотидов.

В тех случаях, когда две, по сути, комплементарные цепи dsRNA содержат отдельные молекулы РНК, эти молекулы не обязательно могут быть соединены ковалентно. В тех случаях, когда две цепи соединены ковалентно способом, отличным от непрерываемой цепи нуклеотидов от 3'-конца одной цепи до 5'-конца соответствующей другой цепи, образующих дуплексную структуру, то соединяющую структуру называют линкером. Цепи РНК могут иметь одинаковое или различное число нуклеотидов. Максимальное количество пар оснований является количеством нуклеотидов в самой короткой цепи dsRNA минус любые выступы, которые присутствуют в дуплексе. Помимо дуплексной структуры средство RNAi может содержать один или несколько нуклеотидных выступов.

В одном варианте осуществления средство RNAi по настоящему изобретению представляет собой dsRNA из 24-30 нуклеотидов, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например целевой последовательностью мРНК С5, направляя отщепление целевой РНК. Не желая привязываться к теории, длинная двухцепочечная РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, подобный рибонуклеазе III типа фермент, участвует в процессинге dsRNA на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными выступами на 3'-конце в два основания (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). siRNA затем встраиваются в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, позволяя комплементарной антисмысловой цепи направлять распознавание мишени (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой мРНК одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).

Применяемое в данном документе выражение нуклеотидный выступ относится к по меньшей мере одному неспаренному нуклеотиду, который выпячивается из дуплексной структуры иРНК, например, dsRNA. Например, когда 3'-конец одной цепи dsRNA выходит за пределы 5'-конца другой цепи или vice versa, существует нуклеотидный выступ. dsRNA может содержать выступ по меньшей мере одного нук

- 22 044245 леотида; альтернативно выступ может содержать по меньшей мере два нуклеотида, по меньшей мере три нуклеотида, по меньшей мере четыре нуклеотида, по меньшей мере пять или более нуклеотидов. Нуклеотидный выступ может содержать или состоять из аналога нуклеотида/нуклеозида, включая дезоксинуклеотид/нуклеозид. Выступ(ы) может быть на смысловой цепи, антисмысловой цепи или любой их комбинации. Кроме того, нуклеотид(ы) выступа может находиться на 5'-конце, 3'-конце или обоих концах, либо антисмысловой, или смысловой цепи dsRNA.

В одном варианте осуществления антисмысловая цепь dsRNA содержит 1-10 нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или нуклеотидов, выступающих на 3'-конце и/или 5'-конце. В одном варианте осуществления смысловая цепь dsRNA содержит 1-10 нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или нуклеотидов, выступающих на 3'-конце и/или 5'-конце. В другом варианте осуществления один или несколько нуклеотидов выступа замещаются нуклеозид-тиофосфатом.

Затупленный конец или тупой конец означают, что на конце двухцепочечного средства RNAi нет неспаренных нуклеотидов, т.е. нет нуклеотидного выступа. Средство RNAi с тупыми концами представляет собой dsRNA, которая является двухцепочечной по всей длине, т.е. не имеет нуклеотидного выступа на любом конце молекулы. Средства RNAi по настоящему изобретению включают средства RNAi с нуклеотидными выступами на одном конце (т.е. средства с одним выступом и одним тупым концом) или с нуклеотидными выступами на обоих концах.

Выражение антисмысловая цепь или направляющая цепь означает цепь иРНК, например, dsRNA, которая включает участок, который, по сути, комплементарен целевой последовательности, например, мРНК С5. Применяемое в данном документе выражение участок комплементарности относится к участку антисмысловой цепи, который, по сути, комплементарен последовательности, например целевой последовательности, например, последовательности нуклеотидов, С5, как определено в данном документе. В тех случаях, когда участок комплементарности не полностью комплементарен целевой последовательности, несовпадения могут присутствовать во внутренних или концевых участках молекулы. Как правило, наиболее приемлемые несовпадения располагаются в концевых участках, например, в пределах 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца иРНК.

Выражение смысловая цепь или пассажирская цепь, применяемое в данном документе, означает цепь иРНК, которая включает участок, который, по сути, комплементарен участку антисмысловой цепи, в том значении, в котором это выражение описано в данном документе.

Применяемое в данном документе выражение участок отщепления относится к участку, который расположен вплотную к сайту расщепления. Сайт расщепления является сайтом мишени, по которому происходит расщепление. В некоторых вариантах осуществления участок отщепления содержит три основания на любом конце сайта расщепления и расположенных вплотную к нему. В некоторых вариантах осуществления участок отщепления содержит два основания на любом конце сайта расщепления и расположенных вплотную к нему. В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления главным образом находится в сайте, граничащем с нуклеотидами 10 и 11 антисмысловой нити, и участок отщепления содержит нуклеотиды 11, 12 и 13.

Применяемое в данном документе, и если не указано иное, выражение комплементарный при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности означает способность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно специалисту в данной области. Такие условия, например, могут быть жесткими условиями, где жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES, рН 6,4, 1 мМ EDTA, 50°C или 70°C в течение 12-16 ч с последующим отмыванием (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Можно применять другие условия, такие как физиологически соответствующие условия, которые могут встречаться в организме. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих для анализа комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизированных нуклеотидов.

Комплементарные последовательности в пределах иРНК, например, в пределах dsRNA, описанных в данном документе, включают спаренные основания олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащие первую нуклеотидную последовательность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащую вторую нуклеотидную последовательность по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут быть отнесены к полностью комплементарным по отношению друг к другу в данном документе. Однако, когда первую последовательность в данном документе характеризуют как по сути, комплементарную по отношению ко второй последовательности, тогда две последовательности могут быть полностью комплементарными или они могут образовывать одну или несколько, но, как правило, не более 5, 4, 3 или 2 несовпадающих пар оснований при гибридизации с образованием дуплекса до 30 пар оснований, сохраняя способность к гибридизации при условиях, наиболее соответствующих их конечному применению, например, ингибированию экспрессии гена через путь RISC. Однако, когда два олигонуклеотида предназначены образовывать при гибридизации один или несколько од

- 23 044245 ноцепочечных выступов, то такие выступы не будут считаться несовпадениями применительно к определению комплементарности. Например, dsRNA, содержащая один олигонуклеотид с длиной 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид с длиной 23 нуклеотида, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может при этом называться полностью комплементарной для целей, описанных в данном документе.

Комплементарные последовательности, применяемые в данном документе, могут также включать или могут быть образованы полностью из пар оснований, составленных не по модели Уотсона-Крика, и/или пар оснований, образованных из неестественных и модифицированных нуклеотидов, в такой степени, при которой выполняются вышеуказанные требования по отношению к их способности гибридизоваться. Такие пары оснований, составленные не по модели Уотсона-Крика, включают без ограничения неоднозначное или Хугстиновское спаривание оснований G:U.

Выражения комплементарный, полностью комплементарный и по сути, комплементарный в данном документе можно применять по отношению к совпадению оснований между смысловой цепью и антисмысловой цепью dsRNA или между антисмысловой цепью средства, представляющего собой иРНК, и целевой последовательностью, как будет понятно из контекста их применения.

Применяемый в данном документе полинуклеотид, который по сути, комплементарен по меньшей мере части матричной РНК (мРНК), означает полинуклеотид, который, по сути, комплементарен непрерывной части мРНК, представляющей интерес (например, мРНК, кодирующей С5). Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части мРНК С5 если последовательность, по сути, комплементарна непрерывающейся части мРНК, кодирующей С5.

В общем, большинство нуклеотидов каждой цепи являются рибонуклеотидами, но, как описано подробно в данном документе, каждая или обе цепи могут также включать один или несколько нуклеотидов, не являющихся рибонуклеотидами, например, дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, иРНК может включать рибонуклеотиды с химической модификацией. Такие модификации могут включать все типы модификаций, раскрытых в данном документе или известных в области техники. Любые такие модификации, которые используются в молекуле иРНК, охвачены выражением иРНК в контексте данных описания и формулы изобретения.

В одном аспекте настоящего изобретения средство для применения в способах и композициях по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечную молекулу антисмысловой РНК, которая ингибирует целевую мРНК с помощью механизма ингибирующего действия антисмысловых РНК. Молекула одноцепочечной антисмысловой РНК комплементарна последовательности в целевой мРНК. Одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды могут ингибировать трансляцию стехиометрическом образом при спаривание оснований с мРНК и физически препятствуя механизму трансляции, см. Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Молекула одноцепочечной антисмысловой РНК может составлять от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину и иметь последовательность, комплементарную целевой последовательности. Например, молекула одноцепочечной антисмысловой РНК может содержать последовательность, которая представляет собой по меньшей мере приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из любой из антисмысловых последовательностей, описанных в данном документе.

Выражение липидная наночастица или LNP относится к пузырьку, содержащему липидный слой, заключающий фармацевтически активную молекулу, такую как молекула нуклеиновой кислоты, например, иРНК или плазмида, из которой транскрибируется иРНК. LNP описаны, например, в патентах США №№ 6858225, 6815432, 8158601 и 8058069, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

Применяемый в данном документе субъект представляет собой животное, такое как млекопитающее, включая приматов (таких как человек, примат, отличный от человека, например, обезьяна и шимпанзе), не-приматов (таких как корова, свинья, верблюд, лама, лошадь, коза, кролик, овца, хомяк, морская свинка, кошка, собака, крыса, мышь, лошадь и кит) или птиц (например, утка или гусь). В одном варианте осуществления субъектом является человек, такой как человек, подвергаемый лечению или диагностике заболевания, нарушения или состояния, при которых снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие; человек, имеющий риск развития заболевания, нарушения или состояния, при которых снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие; человек, переносящий заболевание, нарушение или состояние, при которых снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие; и/или человек, подвергаемый лечению заболевания, нарушения или состояния, при которых снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, как описано в данном документе.

Применяемые в данном документе выражения осуществлять лечение или лечение относятся к полезному или желаемому результату, включая без ограничения ослаблению или облегчению одного или нескольких симптомов, связанных с нежелательной активацией пути комплемента (например, гемолиза и/или хронического воспаления); уменьшению степени нежелательной активации пути комплемента; стабилизации (т.е. без ухудшения) состояния хронического воспаления и/или гемолиза; облегчению или временному ослаблению нежелательной активации пути комплемента (например, хронического воспале- 24 044245 ния и/или гемолиза), что либо установлено, либо не установлено. Лечение также может означать продление жизни по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствие лечения.

Выражение ниже в контексте уровня компонента комплемента С5 у субъекта, или маркера заболевания, или симптома относится к статистически значимому снижению такого уровня. Снижение может быть на, например, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или более и, предпочтительно, вплоть до уровня, принятого в пределах нормального для человека без такого нарушения.

Применяемое в данном документе предотвращение или осуществление профилактики, используемое в отношении заболевания, нарушения или его состояния, при которых снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, относится к снижению вероятности того, что у субъекта будет развиваться симптом, связанный с таким заболеванием, нарушением или состоянием, например, симптом нежелательной активации комплемента, например, хроническое воспаление, гемолиз и/или тромбоз. Вероятность развития тромбоза снижается, например, когда у индивидуума, имеющего один или несколько факторов риска к развитию тромбоза, либо не развивается тромбоз, или тромбоз развивается в меньшей степени тяжести по отношению к популяции, имеющей те же факторы риска и не получающей лечение, как описано в данном документе. Неспособность развития заболевания, нарушения или состояния, или снижение развития симптома, связанного с таким заболеванием, нарушением или состоянием (например, по меньшей мере на приблизительно 10% по клинически принятой шкале для этого заболевания или нарушения), или демонстрирование запаздывающих симптомов с опозданием (например, дни, недели, месяца или года) считается эффективным предотвращением.

Применяемое в данном документе выражение болезнь, связанная с компонентом комплемента С5 представляет собой заболевание или нарушение, которое вызвано или связано с активацией комплемента. Такие заболевания, как правило, связаны с воспалением и/или активацией иммунной системы, например, лизисом, опосредованным атакующим мембрану комплексом, анафилаксией и/или гемолизом. Неограничивающие примеры заболеваний, связанных с компонентом комплемента С5, включают ночную пароксизмальную гемоглобинурию (PNH), атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), астму, ревматоидный артрит (RA), синдром антифосфолипидных антител, волчаночный нефрит, ишемическиреперфузионное повреждение, типичный или инфекционный гемолитико-уремический синдром (tHUS), болезнь плотного осадка (DDD), оптиконевромиелит (NMO), мультифокальную моторную нейропатию (MMN), рассеянный склероз (MS); дегенерацию желтого пятна (например, связанная с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD)); синдром, включающий гемолиз, повышение активности печеночных ферментов и снижение числа тромбоцитов (HELLP-синдром); пурпуру тромботическую тромбоцитопеническую (ТТР); спонтанную потерю плода; пауци-иммунный васкулит; буллезный эпидермолиз; рецидивирующую потерю плода; преэклампсию, черепно-мозговую травму, миастению, болезнь холодовых агглютининов, дерматомиозит буллезный пемфигоид, связанный с Шига-подобным токсином Е. coli гемолитико-уремический синдром, C3-нефропатию, васкулит, связанный с антителами к цитоплазме нейтрофилов (например, гранулематоз с полиангиитом (ранее известный как гранулематоз Вегенера), синдром Черджа-Стросс и микроскопический полиангиит); реакции отторжения трансплантата, вызванные гуморальными и сосудистыми механизмами, дисфункцию трансплантата, инфаркт миокарда (например, повреждение тканей и ишемия при инфаркте миокарда), аллогенную трансплантацию, сепсис (например, неблагоприятный исход сепсиса), заболевания коронарной артерии, дерматомиозит, болезнь Грейвса, атеросклероз, болезнь Альцгеймера, сепсис, связанный с системным воспалительным ответом, септический шок, травма спинного мозга, гломерулонефрит, тиреоидит Хашимото, диабет I типа, псориаз, пузырчатку, аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), ITP, синдром Гудпасчера, болезнь Дегоса, антифосфолипидный синдром (APS), катастрофический APS (CAPS), сердечно-сосудистые нарушения, миокардит, цереброваскулярные нарушения, периферические (например, опорно-двигательного аппарата) сосудистые нарушения, реноваскулярную гипертензию, нарушения брыжеечных/кишечных сосудов, васкулит, нефрит Шенлейна-Геноха, васкулит, связанный с системной красной волчанкой, васкулит, связанный с ревматоидным артритом, васкулит, связанный с иммунными комплексами, болезнь Такаясу, дилатационную кардиомиопатию, диабетическую ангиопатию, болезнь Кавасаки (артериит), венозную газовую эмболию (VGE) и рестеноз после установки стента, вращательную атерэктомию, перепончатую нефропатию, синдром Гийена-Барре и чрескожную транслюминальную коронарную ангиопластику (РТСА) (см., например, Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316; Holers and Thurman (2004) Molecular Immunology 41:147-152; публикация патента США № 20070172483).

В одном варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой ночную пароксизмальную гемоглобинурию (PNH). PNH может быть классической PNH или PNH в условиях синдрома недостаточности другого костного мозга и/или миелодиспластического синдрома (MDS), например, цитопении. В другом варианте осуществления заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS).

- 25 044245

II. иРНК по изобретению.

Настоящее изобретение относится к иРНК, ингибирующим экспрессию гена компонента комплемента С5. В одном варианте осуществления средство, представляющее собой иРНК, включает молекулы двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (dsRNA) для ингибирования экспрессии гена С5 в клетке, например, клетке субъекта, например, млекопитающего, такого как человек, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH. dsRNA содержит антисмысловую цепь, имеющую участок комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части мРНК, образованной при экспрессии гена С5. Участок комплементарности составляет приблизительно 30 нуклеотидов или менее в длину (например, приблизительно 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 или 18 нуклеотидов или менее в длину). При контакте с клеткой, экспрессирующей ген С5, иРНК ингибирует экспрессию гена С5 (например, гена С5 человека, примата, отличного от примата или птицы) по меньшей мере на приблизительно 10%, что оценивали с помощью, например, PCR или анализа на основе разветвленной ДНК (bDNA), или анализом на основе белков, например, с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием, например, методов вестерн-блоттинга или проточной цитометрии.

dsRNA включает две цепи РНК, которые комплементарны и гибридизованы с образованием дуплексной структуры при условиях, в которых dsRNA будут применять. Одна цепь dsRNA (антисмысловая цепь) содержит участок комплементарности, который, по сути, является комплементарным, и, как правило, полностью комплементарный целевой последовательности. Целевая последовательность может быть получена из последовательности мРНК, образующейся при экспрессии гена С5. Другая цепь (смысловая цепь) содержит участок, который является комплементарным антисмысловой цепи, при этом две цепи гибридизуются и образуют дуплексную структуру при объединении в подходящих условиях. Как описано в данном документе и как известно в данной области техники, комплементарные последовательности dsRNA также могут содержаться в виде комплементарных себе участков одной молекулы нуклеиновой кислоты, вместо того, чтобы располагаться на отдельных олигонуклеотидах.

Как правило, дуплексная структура содержит от 15 до 30 пар оснований в длину, например, в пределах 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29,

18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24,

19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29,

21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 пар оснований в длину. Диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам и длинам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Аналогично, участок комплементарностицелевой последовательности составляет в пределах 15 и 30 нуклеотидов в длину, например, в пределах 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 нуклеотидов в длину. Диапазоны и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам и длинам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления dsRNA составляет от приблизительно 15 до приблизительно 20 нуклеотидов в длину, или от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину. В общем, dsRNA является достаточно длинной, чтобы служить в качестве субстрата для фермента Dicer. Например, как хорошо известно в данной области техники, dsRNA с длиной более, чем приблизительно 21-23 нуклеотидов в длину, могут служить субстратами для Dicer. Как также будет понятно обычному специалисту, участок РНК, представляющий собой цель для отщепления, чаще всего будет частью более крупной молекулы РНК, часто молекулы мРНК. Где это уместно, частью мРНК-мишени является непрерывная последовательность целевой мРНК достаточной длины, чтобы позволить ей быть субстратом для RNAi-направленного отщепления (т.е. отщепление через путь RISC).

Специалисту в данной области также будет понятно, что дуплексный участок является основной функциональной частью dsRNA, например, дуплексный участок от приблизительно 9 до 36 пар оснований, например, приблизительно 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 932, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 1528, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 1826, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 1921, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-

26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 пар оснований. Таким образом, в одном варианте осуществления до того момента, пока участок подвергается обработке в функциональный дуплекс из, например, 15-30 пар оснований, что направляет желаемую РНК для отщепления, молекула РНК или комплекс молекул РНК, имеющие дуплексный участок больше, чем 30 пар оснований, представляют собой dsRNA. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что в одном варианте осуществления miRNA представляют собой dsRNA. В другом варианте осуществления dsRNA представляет собой не встречающуюся в природе miRNA. В другом варианте осуществления средство, представляющее собой иРНК, приме-

- 26 044245 няемое для нацеливания на экспрессию С5, не образуется в целевой клетке путем расщепления большей dsRNA.

dsRNA, описанная в данном документе, может дополнительно включать один или несколько одноцепочечных выступов нуклеотидов, например, 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов. dsRNA, имеющие по меньшей мере один нуклеотидный выступ, могут обладать неожиданно высокими ингибирующими свойствами по отношению к их аналогам с тупыми концами. Нуклеотидный выступ может содержать или состоять из аналога нуклеотида/нуклеозида, включая дезоксинуклеотид/нуклеозид. Выступ(ы) может быть на смысловой цепи, антисмысловой цепи или любой их комбинации. Кроме того, нуклеотид(ы) выступа может находиться на 5'-конце, 3'-конце или обоих концах, либо антисмысловой, или смысловой цепи dsRNA.

dsRNA можно синтезировать с помощью стандартных способов, известных в данной области техники, как описывается ниже, например, с применением автоматического синтезатора ДНК, таких как коммерчески доступные у, например, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.

Соединения иРНК по настоящему изобретению можно получать с применением двухэтапной процедуры. Во-первых, отдельные цепи молекулы двухцепочечной РНК получают по отдельности. Затем составные цепи отжигают. Отдельные цепи соединения siRNA можно получать с применением синтеза в жидкой фазе или твердофазного органического синтеза, или обоих. Органический синтез имеет преимущество в том, что можно легко получать олигонуклеотидные цепи, содержащие неприродные или модифицированные нуклеотиды. Одноцепочечные олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно получать с применением синтеза в жидкой фазе или твердофазного органического синтеза, или обоих.

В одном аспекте dsRNA по настоящему изобретению содержит по меньшей мере две нуклеотидных последовательности, смысловую последовательность и антисмысловую последовательность. Смысловая цепь выбрана из группы последовательностей, представленной в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, и антисмысловая цепь, соответствующая смысловой цепи, выбрана из группы последовательностей из любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23. В этом аспекте одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, причем одна из последовательностей, по сути, комплементарна последовательности мРНК, образованной при экспрессии гена С5. Таким образом, в этом аспекте dsRNA будет содержать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая цепь в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, а второй олигонуклеотид описан как антисмысловая цепь, соответствующая смысловой цепи, в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23. В одном варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в отдельных олигонуклеотидах. В другом варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в одном олигонуклеотиде.

Следует понимать, что хотя некоторые из последовательностей в табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23 описаны как модифицированные и/или конъюгированные последовательности, РНК из числа иРНК по настоящему изобретению, например, dsRNA по настоящему изобретению, может содержать любую из последовательностей, указанных в табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, которые не являются модифицированными или конъюгированными, и/или модифицированы и/или конъюгированы иначе, чем описано в данном документе.

Специалисту в данной области хорошо известно, что dsRNA с дуплексной структурой из приблизительно 20 и 23 пар оснований, например, 21 пара оснований, были расценены как особенно эффективные в отношении индукции РНК-интерференции (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Тем не менее, было обнаружено, что более короткие или более длинные дуплексные структуры РНК также могут быть эффективными (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). В вариантах осуществления, описанных выше, в силу характера олигонуклеотидных последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, описанные в данном документе dsRNA могут содержать по меньшей мере одну цепь длиной в 21 нуклеотид минимально. Разумно ожидать, что более короткие дуплексы, имеющие одну из последовательностей любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, минус только несколько нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть одинаково эффективны по сравнению с dsRNAs, описанными выше. Следовательно, dsRNA, имеющие последовательность из по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов, полученных из одной из последовательностей любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена С5 не более чем на приблизительно 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования в сравнении с dsRNA, содержащей полную последовательность, рассматриваются в пределах объема по настоящему изобретению.

Кроме того, РНК, представленные в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, идентифицируют сайт(ы) в С5-транскрипте, который восприимчив к RISC-опосредованному расщеплению. Таким образом, в настоящем изобретении дополнительно описаны иРНК, которые нацелены на один из этих сайтов. Применимо к данному документу, говорят, что иРНК нацелена на конкретный сайт транскрипта РНК, если иРНК способствует расщеплению транскрипта в любом месте этого конкретного сайта. Такая иРНК, как правило, будет содержать по меньшей мере приблизительно 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, соединенных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из участка, прилегающего к выбранной последовательности в гене С5.

- 27 044245

В то время как целевая последовательность, как правило, составляет приблизительно 15-30 нуклеотидов в длину, существует большое разнообразие в пригодности конкретных последовательностей в этом диапазоне для направления расщепления любой заданной целевой РНК. Различные пакеты программного обеспечения и принципы, изложенные в данном документе, обеспечивают руководство по идентификации оптимальных целевых последовательностей для любого данного гена-мишени, но также можно принять эмпирический подход, в котором окно или маска данного размера (в качестве не лимитирующего примера, 21 нуклеотид) буквально или фигурально (в том числе, например, в кремнии), размещены на последовательности целевой РНК для идентификации последовательностей в диапазоне размеров, которые могут служить в качестве целевых последовательностей. Перемещая постепенно окно последовательности одного нуклеотида выше или ниже начального положения целевой последовательности, может быть идентифицирована следующая потенциальная целевая последовательность, пока полный набор возможных последовательностей не определен для любого данного целевого выбранного размера. Этот способ в сочетании с систематическим синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с применением анализов, как описано в данном документе, или как известно в данной области техники) для идентификации тех последовательностей, которые действуют оптимально, может идентифицировать те последовательности РНК, которые при нацеливании со средством, представляющим собой иРНК, опосредуют лучшее ингибирование экспрессии целевого гена. Таким образом, в то время как последовательности идентифицированы, например, в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23 представлены эффективные целевые последовательности, предполагается, что дальнейшая оптимизация эффективности ингибирования может быть осуществлена путем постепенного перемещением окна одного нуклеотида выше или ниже заданных последовательностей для идентификации последовательностей с одинаковыми или улучшенными характеристиками ингибирования.

Кроме того, предполагается, что для любой идентифицированной последовательности, например, в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23, дополнительную оптимизацию можно достичь путем систематического либо добавления, или удаления нуклеотидов с образованием более длинных или более коротких последовательностей и проверки тех последовательностей, образованных в результате перемещения окна более длинного или более короткого размера вверх или вниз по целевой РНК с этой точки. Опять же, присоединение данного подхода к образованию новых целей у кандидатов с тестированием эффективности иРНК на основе тех целевых последовательностей в анализе ингибирования, известными в данной области техники и/или как описано в данном документе, может привести к дальнейшему повышению эффективности ингибирования. В продолжение, такие оптимизированные последовательности можно корректировать путем, например, введения модифицированных нуклеотидов, как описано в данном документе или как известно в данной области техники, добавлением или изменением выступа или другими модификациями, известными в данной области техники и/или описанных в данном документе, для дальнейшей оптимизации молекулы (например, увеличение стабильности в сыворотке или периода полувыведения из кровотока, увеличение термостабильности, улучшение трансмембранной доставки, нацеливание на конкретное положение или тип клетки, увеличение взаимодействия с ферментами пути сайленсинга, увеличение высвобождения из эндосом) в качестве ингибитора экспрессии.

иРНК, как описано в данном документе, может содержать одно или несколько несовпадений с целевой последовательностью. В одном варианте осуществления иРНК, как описано в данном документе, содержит не более чем 3 несовпадения. Если антисмысловая цепь иРНК содержит несовпадения с целевой последовательностью, предпочтительно, чтобы область несовпадения находилась не в центре участка комплементарности. Если антисмысловая цепь иРНК содержит несовпадения с целевой последовательностью, предпочтительно, чтобы несовпадение было ограничено в пределах последних 5 нуклеотидов от либо 5'-, или 3'-конца участка комплементарности. Например, для средства, представляющего собой иРНК, состоящего из 23 нуклеотидов, цепь, комплементарная участку гена С5, как правило, не содержит каких-либо несовпадений в пределах 13 центральных нуклеотидов. Описанные в данном документе способы или способы, известные в данной области техники, можно применять для определения является ли иРНК, содержащая несовпадение с целевой последовательностью, эффективной в ингибировании экспрессии гена С5. Рассмотрение эффективности иРНК с несовпадением в ингибировании экспрессии гена С5 является важным, особенно если конкретный участок комплементарности в гене С5, как известно, имеет изменение полиморфной последовательности в популяции.

III. Модифицированные иРНК по изобретению.

В одном варианте осуществления РНК из числа иРНК по настоящему изобретению, например, dsRNA, является немодифицированной и не содержит, например, химические модификации и/или конъюгации, известные в данной области техники и описанные в данном документе. В другом варианте осуществления РНК из числа иРНК по настоящему изобретению, например, dsRNA, является химически модифицированной для повышения стабильности или других полезных характеристик. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения практически все из нуклеотидов иРНК по настоящему изобретению являются модифицированными. В других вариантах осуществления настоящего изобретения все из нуклеотидов иРНК по настоящему изобретению являются модифицированными. иРНК по настоящему изобретению, в которых практически все нуклеотиды модифицированы являются в значи- 28 044245 тельной степени, но не полностью модифицированными и могут содержать не более 5, 4, 3, 2 или 1 немодифицированных нуклеотидов.

Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо известными в данной области техники, такими как те, которые описаны в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, которая включена в данное описание посредством ссылки. Модификации включают, например, модификации концов, например, 5'-концевые модификации (фосфорилирование, конъюгация, перевернутые связи) или 3'-концевые модификации (сопряжение, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи, и т.д.); модификации оснований, например, замещение стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару с расширенным набором партнеров, удаление оснований (абазические нуклеотиды), или сопряженные основания; модификации сахара (например, в 2'-положении или 4'-положение) или замещение сахара; и/или остовные модификации, включая модификации или замещения фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений, представляющих собой иРНК, применяемые в описанных в данном документе вариантах осуществления, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или межнуклеозидные связи не природного происхождения. РНК, содержащие модифицированные остовы включают, среди прочего, те, которые не содержат атом фосфора в остове. В контексте данного описания и как иногда упоминается в данной области техники, модифицированные РНК, не содержащие атом фосфора в их межнуклеозидном остове, также могут считаться олигонуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления модифицированная иРНК будет содержать атом фосфора в ее межнуклеозидном остове.

Остовы модифицированных РНК включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфодитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метиловые и другие алкил фосфонаты, включая 3'-алкилен фосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты с нормальными 3'-5'-связями, их 2'-5'-связанные аналоги, а также те, полярность которых инвертируется, где соседние пары нуклеозидных единиц связаны через 3'-5'- с 5'3'- или 2'-5'- с 5'-2'-. Также включают различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты.

Иллюстративные патенты США, которые описывают получение вышеуказанных фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США №№ 3687808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496;

5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361;

5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6,239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614;

6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816;

7,273,933; 7,321,029 и патент США № RE39464, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

Остовы модифицированной РНК, которые не включают атом фосфора, представляют собой остовы, которые образуются межнуклеозидными связями коротких алкильных или циклоалкильных цепей, смешанными межнуклеозидными связями гетероатомов и алкильных или циклоалкильных цепей, или межнуклеозидными связями одной или нескольких более коротких гетероатомных или гетероциклических цепей. Они включают те, которые имеют морфолино-связи (формируются частично из части нуклеозида, представляющей собой сахар); силоксановые остовы; сульфид, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетиловые и тиоформацетиловые остовы; метилен-формацетиловые и тиоформацетиловые остовы; алкен-содержащие остовы; сульфаматные остовы; метилен-имино и метилен-гидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, включающие смешанные составные части N, О, S и СН₂.

Иллюстративные патенты США, которые описывают получение вышеуказанных олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №№ 5034506, 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 и 5677439, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

В других вариантах осуществления рассматриваются подходящие РНК-миметики для применения в иРНК, в которой и связь сахара, и межнуклеозидная связь, т.е. остов нуклеотидных единиц, заменяются новыми группами. Единицы оснований поддерживают в течение гибридизации с целевым соединением соответствующей нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерных соединений, РНК-миметик, которое продемонстрировало прекрасные характеристики гибридизации, называют пептидной нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA, остов сахара в РНК замещают амид-содержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Азотистые основания сохраняют и связывают прямо или косвенно с атомами азота аза-группы амидной части остова. Иллюстративные патенты США, которые описывают получение соединениях PNA, включают без ограничения патенты США. №№ 5539082, 5714331, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки. Дополнительные соединениях PNA, подходящие для применения в иРНК по настоящему изобретению, описаны, например, в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, включают РНК с фосфотиоат- 29 044245 ными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами, и, в частности, --CH₂--NH--CH₂-, --CH₂--N(CH₃)--О--CH₂-- [известный как метиленовый (метилимино) или остов MMI], --CH₂--O--N(CH₃)--CH₂--, --CH₂--N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂-- и --N(CH₃)--CH₂--CH₂-- [где родной фосфодиэфирный остов представлен как --О--Р--О--СН2--] из вышеупомянутого патента США. № 5489677 и амидные остовы из вышеупомянутого патента США № 5602240. В некоторых вариантах осуществления РНК, описанные в данном документе, имеют структуру морфолино-остова, как в вышеупомянутом патенте США № 5034506.

Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько замещенных фрагментов, представляющих собой сахара. иРНК например, dsRNA, описанные в данном документе, могут включать один из следующих заместителей в 2'-положении: ОН; F; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, Sили N-алкинил; или О-алкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными Cl-Cl₀-алкилом или C₂-Cl₀-алкенилом и алкинилом. Иллюстративные подходящие модификации включают O[(CH2)_nO]_mCH3, О(CH2)_nOCHз, O(CH2)_nNH2, O(CH2)_nCH3, O(CH2)_nONH2, и О(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂, где n и m равняется от 1 до приблизительно 10. В других вариантах осуществления dsRNA включают один из следующих заместителей в положении 2': C1-C₁₀ низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил либо О-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF3, SOCH3, SO₂CH₃, ONO2, NO2, N₃, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино-, поли алкиламино-, замещенный силил, группа расщепления РНК, репортерная группа, интеркалятор, группа для улучшения фармакокинетических свойств иРНК, или группа для улучшения фармакодинамических свойства иРНК, и другие заместители, обладающие подобными свойствами. В некоторых вариантах осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-О--СН₂СН₂ОСН₃, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) т.е. алкокси-алкоксигруппу. Другая иллюстративная модификация представляет собой 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группа О(CH₂)₂ON(CH₃)₂, также известная как 2'-DMAOE, как описано в примерах в данном документе ниже, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известная в данной области техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-О--CH₂--О--CH₂--N(CH₂)₂.

Другие модификации включают 2'-метокси (2'-ОСН₃), 2'-аминопропокси (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) и 2'-фтор (2'-F). Похожие модификации можно осуществить в других положениях РНК из числа иРНК, в частности, в З'-положении сахара на З'-конце нуклеотида, или в 2'-5'-связанных dsRNA и 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. иРНК также может иметь миметики сахара, такие как фрагменты циклобутила на месте сахара пентофуранозил. Иллюстративные патенты США, которые описывают получение таких структур модифицированного сахара включают без ограничения патенты США №№ 4981957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633 и 5700920, некоторые из которых, как правило, признают настоящую заявку. Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством ссылки.

иРНК также может включать модификации или замещения азотистого основания (часто называемого в данной области техники просто как основание). Применяемые в данном документе немодифицированные или природные азотистые основания включают пуриновые основания аденина (А) и гуанина (G), и пиримидиновые основания тимина (Т), цитозина (С) и урацила (U). Модифицированные азотистые основания включают другие синтетические и природные азотистые основания, такие как дезокситимин (dT), 5-метилцитозин (5-МеС), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкиловые производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкиловые производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5урацил(псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил анал и другие 8замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные соединения урацила и цитозина, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7деазааденин, и З-деазагуанин и З-деазааденин. Дополнительные азотистые основания включают те, которые описаны в патенте США. № 3687808, которые описаны в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; которые описаны в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.L., ed. John. Wiley & Sons, 1990, которые описаны Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 и которые описаны Sanghvi, Y.S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих азотистых оснований особенно полезны для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений, описанных в настоящем изобретении. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и О-6 замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Замещения 5метилцитозина продемонстрировали увеличение стабильности дуплекса нуклеиновой кислоты при 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и являются иллюстративными замещениями оснований, еще более предпочтительно в комбинации с модификацией сахара 2'-О-метоксиэтил.

Иллюстративные патенты США, которые описывают получение некоторых из выше указанных модифицированных азотистых оснований, а также других модифицированных азотистых оснований включают без ограничения указанные выше патенты США №№ 3687808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066;

- 30 044245

5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469;

5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887;

6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672 и 7495088, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

РНК из числа иРНК также могут быть модифицированы с включением одной или нескольких замкнутых нуклеиновых кислот (LNA). Замкнутая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид, содержащий фрагмент модифицированной рибозы, где фрагмент рибозы содержит дополнительный мост, соединяющий 2'- и 4'-атомы углерода. Эта структура эффективно замыкает рибозу в 3'-эндо структурной конформации. Добавление замкнутых нуклеиновых кислот в siRNA продемонстрировало повышение стабильности siRNA в сыворотке и снижение эффектов не целевого действия (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12): 3185-3193).

Иллюстративные патенты США, которые описывают получение нуклеотидов с замкнутыми нуклеиновыми кислотами, включают без ограничения следующие: патенты США №№ 6268490, 6670461, 6794499, 6998484, 7053207, 7084125 и 7399845, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

Потенциальные стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать N(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Нур-C6-NHAc), N-(капроил-4-гидроксипролинол (Нур-С6), N-(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-O-дезокситимидин (эфир), N-(аминокапроил) 4-гидроксипролинол (Нур-C6-амино), 2-докосаноил-уридин-3''-фосфат, инвертированное основание dT(idT) и др. Раскрытие этой модификации можно найти в публикации РСТ № WO 2011/005861.

А. Модифицированные иРНК, содержащие мотивы, по изобретению.

В некоторых аспектах настоящего изобретения двухцепочечные средства RNAi по настоящему изобретению включают средства с химическими модификациями, которые раскрыты, например, в предварительной заявке на патент США № 61/561710, поданной 18 ноября 2011 г., или в заявке PCT/US2012/065691, поданной 16 ноября 2012 г., полное содержание каждой из которой включено в данный документ посредством ссылки.

Как показано в данном документе и в предварительной заявке № 61/561710 или заявке РСТ № PCT/US2012/065691, превосходные результаты могут быть получены путем введения одного или нескольких мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь средства RNAi, в частности, в сайт расщепления или рядом с ним. В некоторых вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить средства RNAi могут быть полностью модифицированы иным способом. Введение таких мотивов нарушает паттерн модификаций, если он имеется, смысловой и/или антисмысловой нити. Средство RNAi, к примеру смысловая нить, может быть необязательно конъюгировано с лигандом, представляющим собой производное GalNAc. Полученные в результате средства RNAi характеризуются превосходной активностью в отношении сайленсинга генов.

Более конкретно, неожиданно было обнаружено, что в тех случаях, когда смысловая нить и антисмысловая цепь двухцепочечного средства RNAi полностью модифицированы так, что имеют один или несколько мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления по меньшей мере одной цепи средства RNAi или рядом с ним, тогда активность средства RNAi в отношении сайленсинга генов была наилучшим образом повышена.

Соответственно, настоящее изобретение предусматривает двухцепочечные средства RNAi, способные ингибировать экспрессию целевого гена (т.е. гена компонента комплемента С5 (С5)) in vivo. Средство RNAi содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь. Каждая цепь средства RNAi может варьироваться в длину от 12 до 30 нуклеотидов. Например, каждая цепь может составлять от 14 до 30 нуклеотидов в длину, от 17 до 30 нуклеотидов в длину, от 25 до 30 нуклеотидов в длину, от 27 до 30 нуклеотидов в длину, от 17 до 23 нуклеотидов в длину, от 17 до 21 нуклеотида в длину, от 17 до 19 нуклеотидов в длину, от 19 до 25 нуклеотидов в длину, от 19 до 23 нуклеотидов в длину, от 19 до 21 нуклеотида в длину, от 21 до 25 нуклеотидов в длину или от 21 до 23 нуклеотидов в длину.

Смысловая цепь и антисмысловая цепь, как правило, образуют двухцепочечный РНК-дуплекс (dsRNA), также называемый в данном документе как средство RNAi. Дуплексный участок средства для RNAi может составлять 12-30 пар нуклеотидов в длину. Например, дуплексный участок может составлять 14-30 пар нуклеотидов в длину, 17-30 пар нуклеотидов в длину, 27-30 пар нуклеотидов в длину, 17-23 пары нуклеотидов в длину, 17-21 пара нуклеотидов в длину, 17-19 пар нуклеотидов в длину, 19-25 пар нуклеотидов в длину, 19-23 пары нуклеотидов в длину, 19-21 пара нуклеотидов в длину, 21-25 пар нуклеотидов в длину или 21-23 пары нуклеотидов в длину. В другом примере дуплексный участок выбран из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 и 27 нуклеотидов в длину.

В одном варианте осуществления средство RNAi может содержать один или несколько выступающих участков и/или блокирующих групп на 3'-конце, 5'-конце или обоих концах одной или обеих цепей. Выступ может составлять 1-6 нуклеотидов в длину, например, 2-6 нуклеотидов в длину, 1-5 нуклеотидов в длину, 2-5 нуклеотидов в длину, 1-4 нуклеотида в длину, 2-4 нуклеотида в длину, 1-3 нуклеотида в длину, 2-3 нуклеотида в длину или 1-2 нуклеотида в длину. Выступы могут быть результатом того, что

- 31 044245 одна нить длиннее другой, или того, что две нити одинаковой длины расположены в шахматном порядке.

Выступ может образовывать несовпадение с целевой мРНК или он может быть комплементарным генным последовательностям, с которыми происходит целевое взаимодействие, или может иметь другую последовательность. Первая и вторая цепи также могут быть соединены, например, дополнительными основаниями с образованием шпильки или при помощи других линкеров, не являющихся основаниями.

В одном варианте осуществления каждый из нуклеотидов в выступающем участке средства RNAi независимо может быть модифицированным или немодифицированным нуклеотидом, в том числе, без ограничения, с сахаром с 2'-модификацией, такой как 2-F, 2'-O-метил, тимидин (Т), 2'-O-метоксиэтил-5метилуридин (Тео), 2'-О-метоксиэтиладенозин (Аео), 2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидин (m5Сео) и любые их комбинации. Например, ТТ может быть выступающей последовательностью для любого конца на любой цепи. Выступ может образовывать несовпадение с целевой мРНК или он может быть комплементарным генным последовательностям, с которыми происходит целевое взаимодействие, или может иметь другую последовательность.

5'- или 3'-выступы смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей средства RNAi могут быть фосфорилированы. В некоторых вариантах осуществления выступающий(ие) участок(и) содержит (содержат) два нуклеотида с фосфотиоатом между двумя нуклеотидами, при этом два нуклеотида могут быть одинаковыми или различными. В одном варианте осуществления выступ присутствует на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В одном варианте осуществления этот 3'-выступ присутствует у антисмысловой цепи. В одном варианте осуществления этот 3'-выступ присутствует у смысловой цепи.

Средство RNAi может содержать только один выступ, который может усиливать интерферирующую активность RNAi без воздействия на его общую стабильность. Например, одноцепочечный выступ может быть расположен на 3'-конце смысловой цепи или, в качестве альтернативы, на 3'-конце антисмысловой цепи. RNAi также может иметь тупой конец, расположенный на 5'-конце антисмысловой цепи (или 3'-конце смысловой цепи) или vice versa. Как правило, антисмысловая цепь RNAi имеет нуклеотидный выступ на 3'-конце, а 5'-конец является тупым. Не желая быть связанными теорией, асимметричный тупой конец на 5'-конце антисмысловой цепи и выступ с 3'-конца антисмысловой цепи способствуют включению направляющей цепи в RISC-процесс.

В одном варианте осуществления средство RNAi представляет собой олигомер с обоими тупыми концами, составляющий 19 нуклеотидов в длину, где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 7, 8, 9 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.

В другом варианте осуществления средство RNAi представляет собой олигомер с обоими тупыми концами, составляющий 20 нуклеотидов в длину, где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 8, 9, 10 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-O-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.

В еще одном варианте осуществления средство RNAi представляет собой олигомер с обоими тупыми концами, составляющий 21 нуклеотидов в длину, где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Р-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 9, 10, 11 от 5'конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.

В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит смысловую цепь из 21 нуклеотида и антисмысловую цепь из 23 нуклеотидов, где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Р-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца; антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца, где один конец средства RNAi тупой, в то время как другой конец содержит выступ из 2 нуклеотидов. Предпочтительно, выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой цепи. В тех случаях, когда выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой цепи, между концевыми тремя нуклеотидами могут быть две фосфотиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий нуклеотид является спаренным нуклеотидом рядом с выступающим нуклеотидом. В одном варианте осуществления средство RNAi дополнительно содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами как на 5'-конце смысловой цепи, так и на 5'-конце антисмысловой цепи. В одном варианте осуществления каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи средства RNAi, в том числе нуклеотиды, которые являются частью мотивов, являются модифицированными нуклеотидами. В одном варианте осуществления каждый остаток независимо модифицирован 2'-О-метилом или 3'-фтором, например, при чередующемся мотиве. Необязательно средство RNAi дополнительно содержит лиганд (предпочтительно GalNAc₃).

В одном варианте осуществления средство RNAi содержит смысловую и антисмысловую цепь, где смысловая цепь составляет 25-30 нуклеотидных остатков в длину, в которой, начиная с 5'-концевого нуклеотида (положение 1), позиции с 1 до 23 первой цепи содержат по меньшей мере 8 рибонуклеоти- 32 044245 дов; антисмысловая цепь составляет 36-66 нуклеотидных остатков в длину и, начиная с 3'-концевого нуклеотида содержит по меньшей мере 8 рибонуклеотидов в позициях, спаренных с позициями 1-23 смысловой цепи с образованием дуплекса; где по меньшей мере 3'-концевой нуклеотид антисмысловой цепи представляет собой неспаренный со смысловой цепью и до 6 последовательных 3'-концевых нуклеотида являются неспаренными со смысловой цепью, тем самым образуя 3'-одноцепочечный выступ из 1-6 нуклеотидов; где 5'-конец антисмысловой цепи содержит от 10-30 последовательных нуклеотидов, неспаренных со смысловой цепью, тем самым образуя 5'-одноцепочечный выступ из 10-30 нуклеотидов; где по меньшей мере 5'-концевые и 3'-концевые нуклеотиды смысловой цепи являются спаренными основаниями с нуклеотидами антисмысловой цепи, при этом смысловая и антисмысловая цепи выровнены для максимальной комплементарности, тем самым образуя практически дуплексный участок между смысловой и антисмысловой цепями; и антисмысловая цепь достаточно комплементарна целевой РНК на протяжение по меньшей мере 19 рибонуклеотидов антисмысловой цепи в длину для уменьшения экспрессии целевого гена при введении двухцепочечной нуклеиновой кислоты в клетку млекопитающего; и где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F-модификаций в трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов происходит в сайте расщепления или рядом с ним. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления или рядом с ним.

В одном варианте осуществления средство RNAi содержит смысловую и антисмысловую цепи, где средство RNAi содержит первую цепь с длиной, которая составляет по меньшей мере 25 и самое большее 29 нуклеотидов, и вторую цепь с длиной, которая составляет самое большее 30 нуклеотидов, по меньшей мере с одним мотивом из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положении 11, 12, 13 от 5'-конца; где 3'-конец первой цепи и 5'-конец второй цепи образуют тупой конец, а вторая цепь на 1-4 нуклеотида длиннее на 3'-конце, чем первая цепь, где дуплексный участок составляет по меньшей мере 25 нуклеотидов в длину, а вторая цепь в достаточной степени комплементарна целевой мРНК на протяжении по меньшей мере 19 нуклеотидов длины второй цепи, для снижения экспрессии целевого гена, где средство RNAi вводят в клетки млекопитающего, и где расщепление средства RNAi при помощи dicer предпочтительно дает в результате siRNA, содержащую 3'-конец второй цепи, снижая, таким образом, экспрессию целевого гена у млекопитающего. Необязательно, средство RNAi дополнительно содержит лиганд.

В одном варианте осуществления смысловая цепь средства RNAi содержит по меньшей мере один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, где один из мотивов находится в сайте расщепления в смысловой цепи.

В одном варианте осуществления антисмысловая цепь средства RNAi может также содержать по меньшей мере один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, где один из мотивов находится в сайте расщепления в смысловой цепи или рядом с ним.

Для средства RNAi с дуплексным участком, составляющим 17-23 нуклеотида в длину, сайт расщепления антисмысловой цепи находится обычно приблизительно в 10, 11 и 12 положении от 5'-конца. Таким образом, мотивы из трех одинаковых модификаций могут находиться в 9, 10, 11 положениях; 10, 11, 12 положениях; 11, 12, 13 положениях; 12, 13, 14 положениях или 13, 14, 15 положениях антисмысловой цепи, при этом отсчет начинается с 1^го нуклеотида от 5'-конца антисмысловой цепи или отсчет начинается с 1^го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи. Сайт расщепления в антисмысловой цепи может также изменяться в соответствии с длиной дуплексного участка RNAi от 5'конца.

Смысловая цепь средства RNAi может содержать по меньшей мере один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления цепи; а антисмысловая цепь может характеризоваться по меньшей мере одним мотивом из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления цепи или рядом с ним. В тех случаях, когда смысловая цепь и антисмысловая цепь образуют дуплекс dsRNA, смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть выравнены так, что один мотив из трех нуклеотидов в смысловой цепи и один мотив из трех нуклеотидов в антисмысловой цепи имеют перекрытие по меньшей мере в один нуклеотид, т.е. по меньшей мере один из трех нуклеотидов мотива в смысловой цепи образует пару оснований по меньшей мере с одним из трех нуклеотидов мотива в антисмысловой цепи. В качестве альтернативы, по меньшей мере два нуклеотида могут перекрываться, или все три нуклеотида могут перекрываться.

В одном варианте осуществления смысловая цепь средства RNAi может содержать несколько мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов. Первый мотив может находиться в сайте расщепления цепи или рядом с ним, а другие мотивы могут быть фланкирующей модификацией. Выражение фланкирующая модификация в данном документе означает мотив, встречающийся в другой части цепи, который отделен от мотива в сайте расщепления той же цепи или рядом с ним. Фланкирующая модификация либо прилегает к первому мотиву, либо отделена по меньшей мере одним или несколькими нуклеотидами. В тех случаях, когда мотивы непосредственно прилегают друг к другу, тогда химическая структура мотивов отличается друг от друга, а когда мотивы разделены одним или несколькими нуклеотидами, тогда химические структуры могут быть одинаковыми или отличными. Могут

- 33 044245 присутствовать две или более фланкирующие модификации. Например, когда присутствует две фланкирующие модификации, то каждая фланкирующая модификация может находится на одном конце по отношению к первому мотиву, который находится в сайте расщепления или рядом с ним или с обеих сторон ведущего мотива.

Подобно смысловой цепи, антисмысловая цепь средства RNAi может содержать несколько мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, при этом по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления цепи или рядом с ним. Данная антисмысловая цепь может также содержать одну или несколько фланкирующих модификаций, при выравнивании подобных фланкирующим модификациям, которые могут присутствовать в смысловой цепи.

В одном варианте осуществления фланкирующая модификация в смысловой цепи или антисмысловой цепи средства RNAi обычно не включает первый один или первые два концевых нуклеотида на 3'конце, 5'-конце или на обоих концах цепи.

В другом варианте осуществления фланкирующая модификация в смысловой цепи или антисмысловой цепи средства RNAi обычно не включает первый один или первые два спаренных нуклеотида в дуплексном участке на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах цепи.

В тех случаях, когда каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи средства RNAi содержит по меньшей мере одну фланкирующую модификацию, фланкирующие модификации могут попадать на один и тот же конец дуплексного участка и иметь перекрытие в один, два или три нуклеотида.

В тех случаях, когда каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи средства RNAi содержит по меньшей мере две фланкирующие модификации, смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть выравнены так, что две модификации, каждая от одной цепи, попадает на один конец дуплексного участка с перекрытием в один, два или три нуклеотида; две модификации, каждая от одной цепи, попадает на другой конец дуплексного участка с перекрытием в один, два или три нуклеотида; две модификации одной цепи попадают по обе стороны от ведущего мотива с перекрытием в один, два или три нуклеотида в дуплексном участке.

В одном варианте осуществления каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи средства RNAi, в том числе нуклеотиды, которые являются частью мотивов, могут быть модифицированы. Каждый нуклеотид может быть модифицирован одинаковой или различной модификацией, которая может включать одно или несколько изменений одного или обоих несвязанных атомов кислорода фосфата и/или одного или нескольких связанных атомов кислорода фосфата; изменение компонента рибозного сахара, например, 2'-гидроксила в рибозном сахаре; полное замещение фосфатного фрагмента на дефосфоризованные линкеры; модификацию или замещение встречающегося в природе основания и замещение или модификацию рибознофосфатного остова.

Поскольку нуклеиновые кислоты являются полимерами из субъединиц, то многие из модификаций встречаются в положении, которое повторяется в нуклеиновой кислоте, например, модификация основания, или фосфатного фрагмента, или несвязанного О фосфатного фрагмента. В некоторых случаях модификация будет встречаться во всех рассматриваемых положениях в нуклеиновой кислоте, но во многих случаях не будет. В качестве примера, модификация может встречаться только в 3'- или 5'-концевом положении, может встречаться только в концевом участке, например, в положении концевого нуклеотида или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи. Модификация может встречаться в двухцепочечном участке, в одноцепочечном участке или в обоих. Модификация может встречаться только в двухцепочечном участке РНК или может встречаться только в одноцепочечном участке РНК. Например, модификация фосфотиоата в несвязанном положении О может встречаться только на одном или обоих концах, может встречаться только в концевом участке, например, в положении концевого нуклеотида или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи, или может встречаться в двухцепочечном и одноцепочечном участках, в частности на конце. 5'-конец или концы могут быть фосфорилированы.

Это может быть возможно, например, для повышения стабильности, для включения конкретных оснований в выступы или для включения модифицированных нуклеотидов или нуклеотидных заместителей в одноцепочечные выступы, например, в 5'- или 3'-выступ или в оба. Например, может быть желательно включить пуриновые нуклеотиды в выступы. В некоторых вариантах осуществления все или некоторые из оснований в 3'- или 5'-выступе могут быть модифицированы, например, при помощи модификаций, описанных в данном документе. Модификации могут включать, например, применение модификаций в 2'-положении рибозного сахара при помощи модификаций, которые известны в данной области, например, применение дезоксирибонуклеотидов, 2'дезокси-2'-фтор-(2'Т) или 2'-О-метил-модифицированных вместо рибозного сахара азотистого основания, и модификации фосфатной группы, например, модификации фосфотиоата. Выступы могут не быть гомологичными с целевой последовательностью.

В одном варианте осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-О-метилом, 2'-О-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-дезокси, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Цепи могут содержать несколько модификаций. В одном варианте осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован 2'-О-метилом или 2'-фтором.

По меньшей мере две различные модификации, как правило, присутствуют в смысловой цепи и ан- 34 044245 тисмысловой цепи. Эти две модификации могут быть 2'-О-метил- или 2'-фтор-модификациями или другими.

В одном варианте осуществления N_a и/или N_b имеет модификации чередующегося паттерна. Выражение чередующийся мотив, применяемое в данном документе, означает мотив с одной или несколькими модификациями, при этом каждая модификация встречается у чередующихся нуклеотидов одной цепи. Выражение чередующийся нуклеотид может означать один на каждые два нуклеотида, или один на каждые три нуклеотида, или сходный паттерн. Например, если каждый из А, В и С представляет собой один тип модификации нуклеотида, то чередующийся мотив может представлять собой АВАВАВАВАВАВ..., ААВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ..., AAABAAABAAAB..., АААВВВАААВВВ... или АВСАВСАВСАВС... и т.д.

Тип модификаций, содержащихся в чередующемся мотиве, может быть одинаковым или различным. Например, если каждый из А, В, С, D представляет собой один тип модификации нуклеотида, то чередующийся паттерн, т.е. модификации каждого второго нуклеотида, может быть одинаковым, но каждая из смысловой цепи или антисмысловой цепи может быть выбрана из нескольких возможных модификаций в чередующемся мотиве, как, например, АВАВАВ..., АСАСАС..., BDBDBD... или CDCDCD... и т.д.

В одном варианте осуществления средство RNAi по настоящему изобретению содержит паттерн модификаций для чередующегося мотива смысловой цепи, сдвинутый относительно паттерна модификации для чередующегося мотива антисмысловой цепи. Сдвиг может быть таким, что модифицированная группа нуклеотидов смысловой цепи соответствует модифицированной другим способом группе нуклеотидов антисмысловой цепи и vice versa. Например, при спаривании смысловой цепи с антисмысловой цепью в дуплекс dsRNA чередующийся мотив в смысловой цепи может начинаться с АВАВАВ от 5'-3'концу цепи, а чередующийся мотив в антисмысловой цепи может начинаться с ВАВАВА от 5'-3'-концу цепи в дуплексном участке. В качестве другого примера, чередующийся мотив в смысловой цепи может начинаться с ААВВААВВ от 5'-3'-концу цепи, а чередующийся мотив в антисмысловой цепи может начинаться с ВВААВВАА от 5'-3'-концу цепи в дуплексном участке, так что между смысловой цепью и антисмысловой цепью присутствует полный или частичный сдвиг паттернов модификаций.

В одном варианте осуществления средство RNAi первоначально содержит паттерн чередующегося мотива 2'-О-метил-модификации и 2'-Р-модификации в смысловой цепи и первоначально имеет сдвиг в отношении паттерна чередующегося мотива 2'-О-метил-модификации и 2'-F-модификации в антисмысловой цепи, т.е. 2'-О-метил-модифицированный нуклеотид в парах оснований смысловой цепью с 2'-Fмодифицированным нуклеотидом в антисмысловой цепи и vice versa. 1 положение в смысловой цепи может начинаться с 2'-F-модификации, а 1 положение в антисмысловой цепи может начинаться с 2'-Ометил-модификации.

Введение одного или нескольких мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь нарушает первоначальный паттерн модификаций, присутствующий в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи. Такое нарушение паттерна модификаций смысловой и/или антисмысловой цепи путем введения одного или нескольких мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в смысловую и/или антисмысловую цепь неожиданно повышает активность относительно сайленсинга генов в отношении целевого гена.

В одном варианте осуществления в тех случаях, когда мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов вводят в любую из цепей, модификация нуклеотида, следующего за мотивом, является модификацией, отличной от модификации мотива. Например, часть последовательности, содержащей мотив, представляет собой ...N_aYYYN_b..., где Y представляет собой модификацию мотива из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, a N_a и N_b представляют собой модификацию нуклеотида, следующего за мотивом YYY, который отличается от модификации Y, и где Na и Nb могут быть одинаковыми или различными модификациями. В качестве альтернативы, Na и/или N_b могут присутствовать или отсутствовать, когда присутствует фланкирующая модификация.

Средство RNAi может дополнительно содержать по меньшей мере одну фосфотиоатную или метилфосфонатую межнуклеотидную связь. Модификация фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи может встречаться у любого нуклеотида смысловой цепи, или антисмысловой цепи, или обеих цепей в любом положении в цепи. Например, модификация межнуклеотидной связи может встречаться у каждого нуклеотида смысловой цепи и/или антисмысловой цепи; каждая модификация межнуклеотидной связи может встречаться в чередующемся паттерне в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи; или смысловая цепь или антисмысловая цепь могут содержать обе модификации межнуклеотидной связи в чередующемся паттерне.

Чередующийся паттерн модификации межнуклеотидной связи смысловой цепи может быть одинаковым или отличным от антисмысловой цепи, и чередующийся паттерн модификации межнуклеотидной связи смысловой цепи может характеризоваться сдвигом относительно чередующегося паттерна модификации межнуклеотидной связи антисмысловой цепи. В одном варианте осуществления двухцепочечное средство RNAi содержит 6-8 фосфотиоатных межнуклеотидных связей. В одном варианте осуществления антисмысловая цепь содержит две фосфотиоатных межнуклеотидных связи на 5'-конце и две фос- 35 044245 фотиоатных межнуклеотидных связи на 3'-конце, и смысловая цепь содержит по меньшей мере две фосфотиоатных межнуклеотидных связи либо на 5'-конце, или 3'-конце.

В одном варианте осуществления RNAi имеет модификацию фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в выступающем участке. Например, выступающий участок может содержать два нуклеотида с фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связью между двумя нуклеотидами. Модификации межнуклеотидной связи также могут быть выполнены для соединения выступающих нуклеотидов с концевыми спаренными нуклеотидами в дуплексном участке. Например, по меньшей мере 2, 3, 4 или все выступающие нуклеотиды могут быть связаны посредством фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи и, необязательно, могут присутствовать дополнительные фосфотиоатные или метилфосфонатные межнуклеотидные связи, соединяющие выступающий нуклеотид со спаренным нуклеотидом, который следует за выступающим нуклеотидом. Например, может быть по меньшей мере две фосфотиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами, где два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий является спаренным нуклеотидом рядом с выступающим нуклеотидом. Эти концевые три нуклеотида могут быть на 3'-конце антисмысловой цепи, 3'-конце смысловой цепи, 5'-конце антисмысловой цепи и/или 5'-конце антисмысловой цепи.

В одном варианте осуществления выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой цепи и между концевыми тремя нуклеотидами присутствуют две фосфотиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий нуклеотид является спаренным нуклеотидом рядом с выступающим нуклеотидом. Необязательно, средство RNAi может дополнительно иметь две фосфотиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами как на 5'-конце смысловой цепи, так и на 5'-конце антисмысловой цепи.

В одном варианте осуществления средство RNAi содержит несовпадение (несовпадения) с мишенью в дуплексе или их комбинации. Несовпадение может встречаться в выступающем участке или дуплексном участке. Пары оснований можно выстраивать исходя из их склонности содействовать диссоциации или плавлению (например, по свободной энергии ассоциации или диссоциации определенного спаривания, наиболее простым подходом является изучение пар по отдельным парам оснований, хотя можно также выполнить анализ следующей соседней пары или подобный). В плане содействия диссоциации: A:U более предпочтительна, чем G:C; G:U более предпочтительна, чем G:C; а ТгС более предпочтительна, чем G:C (1=инозин). Несовпадения, например, неканонические или отличные от канонических типы спаривания (которые описаны в других частях данного документа), более предпочтительны, чем канонические типы спаривания (А:Т, A:U, G:C); и типы спаривания, которые включают универсальные основания, более предпочтительны, чем канонические типы спаривания.

В одном варианте осуществления средство RNAi содержит по меньшей мере одну из первых 1, 2, 3, 4 или 5 пар оснований в дуплексных участках от 5'-конца антисмысловой цепи, независимо выбранную из группы, состоящей из: A:U, G:U, I:C и несовпадающих пар, например, неканонических или отличных от канонических типов спаривания или типов спаривания, которые включает универсальные основания, для содействия диссоциации антисмысловой цепи на 5'-конце дуплекса.

В одном варианте осуществления нуклеотид в 1 положении в дуплексном участке от 5'-конца в антисмысловой цепи выбран из группы, состоящей из A, dA, dU, U и dT. В качестве альтернативы, по меньшей мере одна из первых 1, 2 или 3 пар оснований в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи является парой оснований AU. Например, первая пара оснований в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи является парой оснований AU.

В другом варианте осуществления нуклеотид на 3'-конце смысловой цепи представляет собой дезокситимин (dT). В другом варианте осуществления нуклеотид на 3'-конце антисмысловой цепи представляет собой дезокси-тимин (dT). В одном варианте осуществления присутствует короткая последовательность дезокситимин нуклеотидов, например, два dT нуклеотида на 3'-конце смысловой и/или антисмысловой цепи.

В одном варианте осуществления последовательность смысловой цепи может быть представлена формулой (I):

5' n_p-N_a-(X X X ) i-N_b-Y Y Y -N_b-(Z Ζ Ζ ) j-N_a-n_q 3' (I) где каждый из i и j независимо равняется 0 или 1;

каждый из р и q независимо равняется 0-6;

каждая из Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;

каждая из N_b независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый из np и n_q независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

где N_b и Y имеют неодинаковую модификацию; и каждый из XXX, YYY и ZZZ независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов. Предпочтительно, в YYY все нуклеотиды 2'-F-модифицированы.

В одном варианте осуществления Na и/или N_b имеет модификации чередующегося паттерна.

- 36 044245

В одном варианте осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой цепи или рядом с ним. Например, если средство RNAi содержит дуплексный участок, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив YYY может находиться в сайте расщепления или вблизи него (например, может находиться в положениях 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 или 11, 12, 13) в смысловой цепи, при этом отсчет начинается с 1^го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1^го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.

В одном варианте осуществления i равняется 1, a j равняется 0, или i равняется 0, a j равняется 1, или как i, так и j равняются 1. Смысловая цепь, таким образом, может быть представлена следующими формулами:

5’ n_p-N_a-YYY-N_b-ZZZ-N_a-n_q 3’ (lb) ;

5’ n_p-N_a-XXX-N_b-YYY-N_a-n_q 3’ (Ic); или

5’ n_p-N_a-XXX-N_b-YYY-N_b-ZZZ-N_a-n_q 3’ (Id) .

В тех случаях, когда смысловая цепь представлена формулой (Ib), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая из N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда смысловая цепь представлена формулой (Ic), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая из N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда смысловая цепь представлена формулой (Id), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждая N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый из X, Y и Z может быть одинаковым или отличным от остальных.

В других вариантах осуществления i равняется 0, a j равняется 0, и смысловая цепь может быть представлена формулой

5’ n_p-N_a-YYY- N_a-n_q 3' (la).

В тех случаях, когда смысловая цепь представлена формулой (Ia), каждая N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления последовательность антисмысловой цепи RNAi может быть представлена формулой (II)

5' n_q,-N_a ^r-(Z'Z'Z')_k-N_b'-Y'Y'Y'-N_b'-(X'X'X ' ) _Σ-Ν'_a-n_p ' 3’ (II) где каждый из k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р' и q' независимо равняется 0-6;

каждая из N_a' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;

каждая из Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый из np' и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

где Nb' и Y' имеют неодинаковую модификацию; и каждый из Х'Х'Х', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления N_a' и/или Nb' имеет модификации чередующегося паттерна.

Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления антисмысловой цепи или рядом с ним. Например, если средство RNAi содержит дуплексный участок, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой цепи, при этом отсчет начинается с 1^го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1^го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно, мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.

В одном варианте осуществления в мотиве Y'Y'Y' все нуклеотиды 2'-ОМе-модифицированы.

В одном варианте осуществления k равняется 1, а l равняется 0, или k равняется 0, а l равняется 1, или как k, так и l равняется 1.

- 37 044245

Антисмысловая цепь, таким образом, может быть представлена следующими формулами:

5’ n_q--N_a'-Z 'Z 'Z ’-N_b'-Y'Y'Y’-N_a'-n_pl З'(ПЬ);

5' n_q'-N_a '-Υ Ύ Ύ '-N_b ^г-X'X'X '-Пр- 3' (Ис); или

5' n_q.-N_a'- Z 'Z 'Z '-Nb'-Y^rY^rY^r-N_b'- X'X'X '-N_a '-n_p. 3' (Hd).

В тех случаях, когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIb), N_b' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая из Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIc), N_b' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая из N_a' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда антисмысловая цепь представлена формулой (IId), каждая из N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 02 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая из Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, N_b равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В других вариантах осуществления k равняется 0, а l равняется 0, и антисмысловая цепь может быть представлена формулой

5' n_p.-N_a.-Y'Y'Y'- N_a--n_q> 3' (la).

В тех случаях, когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIa), каждая из Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый из X', Y' и Z' может быть одинаковым или отличным от остальных.

Каждый нуклеотид смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо может быть модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-О-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован 2'-О-метилом или 2'-фтором. Каждая X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-Ометил-модификацию или 2'-фтор-модификацию.

В одном варианте осуществления смысловая цепь средства RNAi может содержать мотив YYY, находящийся в 9, 10 и 11 положениях цепи, в тех случаях, когда дуплексный участок составляет 21 нуклеотид, при этом отсчет начинается с 1^го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1^госпаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'-F-модификацию. Смысловая цепь может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-Б-модификацию.

В одном варианте осуществления антисмысловая цепь может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 цепи, при этом отсчет начинается с 1^го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1^го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-О-метил-модификацию. Антисмысловая цепь может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-Fмодификацию.

Смысловая цепь, представленная любой из вышеприведенных формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует дуплекс с антисмысловой цепью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId), соответственно.

Соответственно, средства RNAi для применения в способах по настоящему изобретению могут содержать смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом каждая цепь содержит от 14 до 30 нуклеотидов, дуплекс RNAi, представленный формулой (III):

каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый из N_a и N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;

каждый из N_b и N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

где каждый из np', np, n_q' и n_q, каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид; и

- 38 044245 каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', ΥΎΎ' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления i равняется 0, a j равняется 0; или i равняется 1, a j равняется 0; или i равняется 0, a j равняется 1; или как i, так и j равняются 0; или как i, так и j равняются 1. В другом варианте осуществления k равняется 0, а l равняется 0; или k равняется 1, а l равняется 0; k равняется 0, а l равняется 1; или как k, так и l равняется 0; или как k, так и l равняется 1.

Иллюстративные комбинации смысловой цепи и антисмысловой цепи, образующих дуплекс RNAi, включают формулы, приведенные ниже:

’ n_p - N_a -Y Y Y -N_a-n_q 3 ’

3’ n_p'-N_a'-Y ' Y ' Υ ' -N_a'n_q' 5’ (Ша)

5’ η_ρ -N_a -YYY -¾ -ZZZ -N_a-n_q 3’

3’ n_p'-N_a'-Y'Y'Y'-Nb'-Z 'Z 'Z '-N_a'n_q' 5’ (Illb) ’ n_p-N_a- X X X -N_b -Y Y Y - N_a-n_q 3 ’

3’ n_p'-N_a'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-N_a'-n_q' 5’ (IIIc) ’ n_p -N_a -XXX -N_b-Y Y Y -N_b- ZZZ -N_a-n_q 3 ’ 3' n_p'-N_a'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-N_a-n_q' 5' (Hid)

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIIa), каждый из N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIIb), каждый из Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый из N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIIc), каждый из Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 02 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый из N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIId), каждый из Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 02 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый из N_a, N_a' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый из N_a, N_a', Nb и Nb' независимо содержит модификации чередующегося паттерна.

Каждый из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) может быть одинаковой или отличной от остальных.

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. В качестве альтернативы, по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIIb) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. В качестве альтернативы, по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.

В тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIIc) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. В качестве альтернативы, по меньшей мере два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.

В одном варианте осуществления модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z', и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.

В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIId), модификациями N_a являются 2'-О-метил- или 2'-фтор-модификации. В другом варианте осуществления в тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIId), модификациями N_a являются 2'-Oметил- или 2'-фтор-модификации, и n_p'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом

- 39 044245 посредством фосфотиоатной связи. В еще одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIId), модификациями N_a являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, а смысловая цепь конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера (описанного ниже). В другом варианте осуществления в тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIId), модификациями N_a являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство RNAi представлено формулой (IIIa), модификациями N_a являются 2'-О-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В одном варианте осуществления средство RNAi является мультимером, содержащим по меньшей мере два дуплекса, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.

В одном варианте осуществления средство RNAi является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или более дуплексов, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.

В одном варианте осуществления два средства RNAi, представленные формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), соединены друг с другом на 5'-конце, и один или оба 3'-конца необязательно конъюгированы с лигандом. Каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген или на два различных гена или каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.

В различных публикациях описаны мультимерные средства для RNAi, которые можно применять в способах по настоящему изобретению. Такие публикации включают WO 2007/091269, патент США № 7858769, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 и WO 2011/031520, полное содержание которых, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.

Как описано более подробно ниже, средство RNAi, содержащее один или нескольких углеводных фрагментов, конъюгированных со средством RNAi, может улучшать одно или несколько свойств средства RNAi. Во многих случаях углеводный фрагмент будет прикреплен к модифицированннй субъединице средства RNAi. Например, рибозный сахар одной или нескольких рибонуклеотидных субъединиц средства, представляющего собой dsRNA, можно замещать другими фрагментами, например, отличным от углевода (предпочтительно циклическим) носителем, к которому присоединен углеводный лиганд. Рибонуклеотидную субъединицу, в которой рибозный сахар субъединицы был замещен таким образом, называют в данном документе субъединицей с модификацией-замещением рибозы (RRMS). Циклический носитель может быть карбоциклической кольцевой системой, т.е. все атомы в кольце являются атомами углерода, или гетероциклической кольцевой системой, т.е. один или несколько атомов в кольце могут быть гетероатомами, например, азотом, кислородом, серой. Циклический носитель может быть моноциклической кольцевой системой или может содержать два или более колец, например, конденсированные кольца. Циклический носитель может быть полностью насыщенной кольцевой системой или он может содержать одну или несколько двойных связей.

Лиганд может быть присоединен к полинуклеотиду через носитель. Носители включают: (i) по меньшей мере одну точку присоединения к остову, предпочтительно две точки присоединения к остову и (ii) по меньшей мере одну связывающую точку присоединения. Выражение точка присоединения к остову, используемое в данном документе, означает функциональную группу, например, гидроксильную группу, или, как правило, связь, доступную для введения носителя в остов и которая подходит для этого, например, фосфат или модифицированный фосфат, например, серосодержащий остов рибонуклеиновой кислоты. Выражение связывающая точка присоединения (ТАР) в некоторых вариантах осуществления означает входящий в кольцо атом циклического носителя, например, атом углерода или гетероатом (отличный от атома, который обеспечивает точку присоединения к остову), с которым связывается выбранный фрагмент. Фрагмент может быть, например, углеводом, например, моносахаридом, дисахаридом, трисахаридом, тетрасахаридом, олигосахаридом и полисахаридом. Необязательно, выбранный фрагмент соединен промежуточной связью с циклическим носителем. Таким образом, цикличе- 40 044245 ский носитель будет часто включать функциональную группу, например, аминогруппу, или, как правило, обеспечивать связь, которая подходит для введения или связывания другого химического структурного элемента, например, лиганда, с составным кольцом.

Средства RNAi можно конъюгировать с лигандом через носитель, где носитель может быть циклической группой или ациклической группой; предпочтительно циклическая группа выбрана из пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, пиперидинила, пиперазинила, [1,3]-диоксолана, оксазолидинила, изоксазолидинила, морфолинила, тиазолидинила, изотиазолидинила, хиноксалинила, пиридазинонила, тетрагидрофурила и декалина; предпочтительно ациклическая группа выбрана из остова, представляющего собой серинол, или остова, представляющего собой диэтаноламин.

В определенных конкретных вариантах осуществления средством RNAi для применения в способах по настоящему изобретению является средство, выбранное из группы, состоящей из средств, перечисленных в любой из табл. 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 и 23. Такие средства могут дополнительно содержать лиганд.

IV. иРНК, конъюгированные с лигандами.

Другая модификация РНК из числа иРНК по настоящему изобретению включает химическое связывание с одним или несколькими лигандами РНК, фрагментами или конъюгатами, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение иРНК. Такие фрагменты включают без ограничения липидные группы, такие как фрагмент холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), тиоэфир, например, берилл-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (SaisonBehmoaras et al., EMbO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:36513654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) или адамантан-уксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), или октадециламин или фрагмент гексиламино-карбонилоксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).

В одном варианте осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время существования средства, представляющего собой иРНК, в которое он введен. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд обеспечивает повышенную аффинность в отношении выбранной мишени, например, молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, например, клеточного компартмента или части органа, ткани, органа или участка тела, например, по сравнению с видами, у которых отсутствует такой лиганд. Предпочтительные лиганды не будут принимать участие в спаривании дуплекса в дуплексной нуклеиновой кислоте.

Лиганды могут включать вещество, встречающееся в природе, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL), или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин, N-ацетилгалактозамин или гиалуроновая кислота) или липид. Лиганд также может быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли-L-аспарагиновую кислоту, поли-к-глутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, N-(2гидроксипропил)меакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, полиамин-пептидомиметик, полиамин-дендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфаспиральный пептид.

Лиганды также включают нацеливающие группы, например, нацеливающее на клетку или ткань средство, например, лектин, гликопротеин, липид или белок, например, антитело, которое связывается с определенным клеточным типом, таким как клетка почки. Нацеливающей группой может быть тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный белок А, углевод-муцин, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентная манноза, поливалентная фукоза, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентная галактоза, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчная кислота, фолат, витамин В12, витамин А, биотин или RGD-пептид, или миметик RGD-пептида.

Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие средства (например, акридины), сшивающие средства (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин),

- 41 044245 полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бисO(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецил-глицерин, борнеол, ментол, 1,3пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченные радиоизотопом маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), помощники транспорта/всасывания (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеотиды (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплекс Eu3+ тетраазамакроциклы), динитрофенил, HRP или АР.

Лигандами могут быть белки, например, гликопротеины, или пептиды, например, молекулы со специфической аффинностью в отношении ко-лиганда, или антитела, например, антитело, которое связывается с определенным клеточным типом, таким как печеночная клетка. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать отличные от пептидов виды, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентную глюкозу, поливалентную галактозу, Nацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу или поливалентную фукозу. Лигандом, например, может быть липополисахарид, активатор МАР-киназы р38 или активатор NF-kB.

Лигандом может быть вещество, например, лекарственное средство, которое может увеличивать поглощение средства, представляющего собой иРНК, клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например, путем разрушения микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственным средством, например, может быть таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинголид А, инданоцин или миосервин.

В некоторых вариантах осуществления лиганд присоединен к иРНК, как описано в данном документе, и действует как фармакокинетический модулятор (PK-модулятор). PK-модуляторы включают липофилы, желчные кислоты, стероиды, фосфолипидные аналоги, пептиды, белок-связывающие средства, PEG, витамины и т.д. Иллюстративные PK-модуляторы включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкил-глицериды, диацил-глицерид, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.д. Олигонуклеотиды, которые содержат некоторое количество фосфотиоатных связей, также, как известно, связываются с сывороточным белком, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды из приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие множество фосфотиоатных связей в остове, также пригодны в настоящем изобретении в качестве лигандов (например, в качестве PK-модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связываются с сывороточными компонентами (например, сывороточными белками) также пригодны для применения в качестве PK-модулирующих лигандов в описанных в данном документе вариантах осуществления.

Лиганд-конъюгированные олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы с применением олигонуклеотида, который несет боковую реакционноспособную функциональность, такие как те, полученные из присоединения связывающей молекулы на олигонуклеотиде (описано ниже). Этот реакционноспособный олигонуклеотид можно непосредственно подвергать взаимодействию с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезированы с наличием любой из разнообразных защитных групп, или лигандами, которые имеют связующий фрагмент, присоединенный к нему.

Олигонуклеотиды, применяемые в конъюгатах по настоящему изобретению, можно получать удобным и обычным способом путем хорошо известного твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, включая, например, Applied Biosystems (Foster City, Calif). Дополнительно или альтернативно могут быть применены любые другие средства для такого синтеза, известные в данной области техники. Также известно применение аналогичных методов для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфотиоаты и алкилированные производные.

Лиганд-конъюгированные олигонуклеотиды и лиганд-молекула, несущая последовательностьспецифические связанные нуклеозиды по настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могут быть собраны на подходящем синтезаторе ДНК с применением стандартных предшественников нуклеотида или нуклеозида, или предшественников нуклеотид- или нуклеозид-коньюгата, которые уже несут связывающий фрагмент, предшественников лиганд-нуклеотида или нуклеозид-коньюгата, которые уже несут молекулу лиганда, или строительных блоков, несущих лиганд, отличный от нуклеозида.

При применении предшественников нуклеотид-конъюгата, которые уже несут связывающий фрагмент, синтез последовательность-специфических связанных нуклеозидов, как правило, завершают и молекулу лиганда затем подвергают взаимодействию со связывающим фрагментом с образованием лиганд-конъюгированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды по настоящему изобретению синтезируют с помощью автоматического синтезатора с применением фосфорамидитов, полученных из лиганд-нуклеозид конъюгатов, в дополнение к стандартным фосфорамидитам и нестандартным фосфорамидитам, которые коммерчески доступны и обычно применяются в синтезе олигонуклеотидов.

- 42 044245

А. Конъюгаты липидов.

В одном варианте осуществления лиганд или коньюгат представляет собой липид или молекулу на основе липида. Такие липиды или липидные молекулы предпочтительно связываются с сывороточным белком, например, сывороточным альбумином человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд делает возможным распределение конъюгата в целевой ткани, например, отличной от ткани почек целевой ткани организма. Например, целевой тканью может быть печень, в том числе паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно использовать другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например, можно использовать напроксен или аспирин. Липид или липидный лиганд может (а) увеличивать устойчивость к разрушению конъюгата, (b) увеличивать нацеливание или транспорт в целевую клетку или клеточную мембрану и/или (с) может быть использован для корректировки связывания с сывороточным белком, например, HSA.

Липидный лиганд можно применять для ингибирования, например, регулирования связывания конъюгата с целевой тканью. Например, менее вероятно, что липид или липидный лиганд, который связывается с HSA более сильно, будет целенаправленно воздействовать на почки и, таким образом, менее вероятно, что он будет выводиться из организма. Липид или липидный лиганд, которые связываются с HSA менее сильно, можно применять для нацеливания конъюгата на почки.

В предпочтительном варианте осуществления липидный лиганд связывается с HSA. Предпочтительно, он связывается с HSA с достаточной аффинностью, так что конъюгат будет предпочтительно распределяться в ткани, отличной от ткани почек. Однако, предпочтительно, чтобы аффинность не была настолько сильной, чтобы связывание HSA-лиганд было необратимым.

В другом предпочтительном варианте осуществления липидный лиганд связывается с HSA слабо или вообще не связывается, так что конъюгат предпочтительно будет распределяться в почке. Другие фрагменты, которые нацелены на клетки почек, также можно использовать вместо или в дополнение к липидным лигандам.

В другом аспекте лигандом является фрагмент, например, витамин, который поглощается целевой клеткой, например, пролиферирующей клеткой. Таковые являются особенно пригодными для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или доброкачественного типа, например, раковых клеток.

Иллюстративные витамины включают витамин А, Е и K. Другие иллюстративные витамины включают витамины группы В, например, фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль, или другие витамины или питательные вещества, поглощаемые целевыми клетками, например, печеночными клетками. Также включены HAS и липопротеин низкой плотности (LDL).

В. Средства, обеспечивающие проникновение в клетку.

В другом аспекте лигандом является средство, обеспечивающее проникновение в клетку, предпочтительно спиральное средство для проникновения в клетку. Предпочтительно, средство является амфипатическим. Иллюстративным средством является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средством является пептид, то он может быть модифицированным, включая пептидилмиметик, инвертомеры, отличные от пептидных или псевдопептидные связи и применение D-аминокислот. Спиральным средством предпочтительно является альфа-спиральное средство, которое предпочтительно характеризуется липофильной и липофобной фазой.

Лигандом может быть пептид или пептидомиметик.

Пептидомиметик (также называемый в данном документе олигопептидомиметиком) является молекулой, способной сворачиваться в определенную трехмерную структуру, подобную естественному пептиду. Прикрепление пептида и пептидомиметиков к средствам, представляющим собой иРНК, может повлиять на фармакокинетическое распределение иРНК, например, путем повышения клеточного распознавания и абсорбции. Фрагмент, представляющий собой пептид или пептидомиметик, может составлять примерно 5-50 аминокислот в длину, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину.

Пептидом или пептидомиметиком, например, может быть пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий главным образом из Tyr, Trp или Phe). Фрагментом, представляющим собой пептид, может быть пептиддендример, стерически затрудненный пептид или перекрестно сшитый пептид. В другом альтернативном варианте фрагмент, представляющий собой пептид, может включать гидрофобную последовательность, контролирующую перенос через мембрану (MTS). Иллюстративным содержащим гидрофобную MTS пептидом является RFGF с аминокислотной последовательностью AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:9). RFGF-аналог (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:10), содержащий гидрофобную MTS, также может быть нацеливающим фрагментом. Фрагмент, представляющий собой пептид, может быть доставляющим пептидом, который может переносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, как было обнаружено, последовательности из Tat-белка HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:11) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:12) способны функционировать в качестве доставляющих пептидов. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайными после

- 43 044245 довательностями ДНК, как, например, пептид, идентифицированный из библиотеки фагового дисплея или комбинаторной библиотеки одна гранула-одно соединение (ОВОС) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Примером пептида или пептидомиметика, связанного со средством, представляющим собой dsRNA, посредством введенной мономерной единицы с целью нацеливания на клетку, является содержащий аргинин-глицин-аспарагиновую кислоту (RGD) пептид или RGD-миметик. Фрагмент, представляющий собой пептид, может характеризоваться длиной в пределах от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот. Фрагменты, представляющие собой пептиды, могут характеризоваться структурной модификацией, такой как для повышения стабильности или управления конформационными свойствами. Можно применять любую из структурных модификаций, описанных ниже.

RGD-пептид для применения в композициях и способах по настоящему изобретению может быть линейным или циклическим, и может быть модифицирован, например, гликозилирован или метилирован для облегчения нацеливания на определенную ткань (ткани). Пептиды, содержащие RGD, и пептидомиметики могут включать D-аминокислоты, а также синтетические RGD-миметики. В дополнение к RGD можно применять другие фрагменты, которые нацелены на лиганд интегрин. Предпочтительные конъюгаты с таким лигандом нацелены на РЕСАМ-1 или VEGF.

Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку способен проникать в клетку, например, микробную клетку, такую как бактериальная или грибная клетка, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептидом, проникающим в микробную клетку, например, может быть α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin P1), содержащий дисульфидную связь пептид (например, α-дефенсин, β-дефенсин или бактенецин), или петид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, также может включать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, пептидом, обеспечивающим проникновение в клетку, может быть двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из домена слитого пептида gp41 HIV-1 и NLS из большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).

С. Конъюгаты углевода.

В некоторых вариантах осуществления композиций и способов по настоящему изобретению предлагается олигонуклеотид иРНК, дополнительно содержащий углевод. Конъюгированная с углеводом иРНК является предпочтительной для доставки in vivo нуклеиновых кислот, а также в композициях, пригодных для терапевтического применения in vivo, как описано в данном документе. Применяемый в данном документе углевод относится к соединению, которое является либо углеводом per se, состоящим из одной или нескольких единиц моносахарида, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (который может быть линейным, разветвленным или циклическим) с кислородом, азотом или атом серы, присоединенных к каждому атому углерода; или соединению, имеющему углеводную часть в качестве его части, состоящей из одной или нескольких единиц моносахарида, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (который может быть линейным, разветвленным или циклическим) с кислородом, азотом или атомом серы, присоединенных к каждому атому углерода. Типичные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие от примерно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 единиц моносахарида) и полисахариды, такие как крахмалы, целлюлоза, гликоген и полисахаридные смолы. Конкретные моносахариды включают сахара С5 и выше (например, С5, C6, С7 или С8); ди- и трисахариды, включают сахара, состоящие из двух или трех единиц моносахаридов (например, С5, C6, С7 или С8).

В одном варианте осуществления конъюгат углевода для применения в композициях и способах по настоящему изобретению представляет собой моносахарид. В одном варианте осуществления моносахарид представляет собой N-ацетилгалактозамин, такой как

Формулы II

- 44 044245

В другом варианте осуществления конъюгат углевода для применения в композициях и способах по настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из:

- 45 044245

- 46 044245

- 47 044245

HO

AcHN

- 48 044245

Еще один иллюстративный конъюгат углевода для применения в вариантах осуществления, описанных в данном документе, включает без ограничения

(Формулу XXIII), где один из X и Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат углевода дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, как описано выше, таких как без ограничения PK-модулятор и/или пептид, обеспечивающий проникновение в клетку.

D. Линкеры.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат или лиганд, описанные в данном документе, могут быть присоединены к олигонуклеотиду иРНК различными линкерами, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.

Выражение линкер или связывающая группа означает органическую группу, которая соединяет две части соединения, например, ковалентно прикрепляет две части соединения. Линкеры обычно содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, звено, такое как NR⁸, С(О), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, или цепочку атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетерооциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинил гетероциклил алкинил, алкиларил, алкениларильная, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, где одна или несколько метиленовых групп могут быть прерваны или удалены по О, S, S(O), SO2, N(R⁸), C(O), замещенный или незамещенный 8 арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероцикл; где R представляет собой водород, ацил, алифатическое соединение или замещенное алифатическое соединение. В одном варианте осуществления линкер составляет между приблизительно 1-24 атомов углерода, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.

Расщепляемая связывающая группа является достаточно стабильной вне клетки, но при поступлении в целевую клетку расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. В предпочтительном варианте осуществления расщепляемая связывающая группа расщепляется по меньшей мере приблизительно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или более, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз быстрее в целевой клетке или при условии первой передачи (которое может, например, быть выбрано для имитирования или представления внутриклеточных условий), чем в крови субъекта, или при условии второй передачи (которое может, например, быть выбрано для имитирования или представления условий, обнаруженных в крови или сыворотке).

Расщепляемые связывающие группы являются чувствительными к средствам расщепления, например, рН, окислительно-восстановительному потенциалу или наличию дегенеративных молекул. Как правило, средства расщепления более распространены или обнаружены на более высоких уровнях или активности внутри клеток, чем в сыворотке крови или крови. Примеры таких дегенеративных средств включают: восстанавливающие средства, которые выбраны для конкретных субстратов или которые не имеют субстратной специфичности, включая, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановительные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушать окислительно-восстановительную расщепляемую связывающую группу путем восстановле- 49 044245 ния; эстеразы; эндосомы или средства, способные создать кислую среду, например, те, которые приводят к рН пять или меньше; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушить кислотно-расщепляемую связывающую группу, действуя как обычная кислота, пептидазы (которые могут быть субстратспецифичными) и фосфатазы.

Расщепляемая связывающая группа, такая как дисульфидная связь, может быть восприимчива к рН. РН сыворотки крови человека составляет 7,4, тогда как среднее внутриклеточное рН составляет немного ниже, в пределах приблизительно 7,1-7,3. Эндосомы характеризуются более кислой средой с рН в пределах 5,5-6,0, а лизосомы характеризуются еще более кислой средой с рН в пределах 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется в условиях предпочтительного рН, тем самым высвобождая катионный липид из лиганда внутрь клетки или в желаемый компартмент клетки.

Линкер может содержать расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой связывающей группы, введенной в линкер, может зависеть от клеткимишени. Например, лиганд, нацеленный на печень, может быть связан с катионным липидом через линкер, который содержит эфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами и, следовательно, линкер будет расщеплен более эффективно в клетках печени, чем в типах клеток, которые не богаты на эстеразу. Другие типы клеток, богатые на эстеразы, включают клетки легкого, коры почек и яичка.

Линкеры, содержащие пептидные связи, могут быть применены для нацеливании на типы клеток, богатых на пептидазы, например, клетки печени и синовиоциты.

Как правило, пригодность расщепляемой связывающей группы кандидата можно оценить путем оценки способности разрушающего средства (или условия) расщеплять связывающую группу кандидата. Также будет желательно также исследовать расщепляемую связывающую группу кандидата на способности противостоять расщеплению в крови или при приведении в контакт с другими тканями, не являющимися целевыми. Таким образом, можно определить относительную чувствительность к расщеплению между первым и вторым условием, где первое выбрано как показатель расщепления в целевой клетке, а второе выбрано как показатель расщепления в других тканях или биологических жидкостях, например, крови или сыворотке. Оценки могут быть выполнены в свободных клеточных системах, в клетках, в клеточной культуре, в органе или ткани культуры, или на животных в совокупности. Может быть полезно произвести первоначальные оценки в свободно-клеточных или культуральных условиях и подтвердить дальнейшими оценками на животных в совокупности. В предпочтительных вариантах осуществления полезные соединения кандидатов расщепляются в по меньшей мере приблизительно 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитирования внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях in vitro, выбранных для имитирования внеклеточный условий).

i. Окислительно-восстановительные расщепляемые связывающие группы.

В одном варианте осуществления расщепляемая связывающая группа представляет собой окислительно-восстановительную расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером восстановительной расщепляемой связывающей группы является дисульфид-связывающая группа (-S-S-). Для определения пригодности расщепляемой связывающей группы кандидата быть восстановительной расщепляемой связывающей группой или, например, быть пригодной для применения в конкретном фрагменте иРНК и конкретном нацеливающем средстве, можно использовать способы, описанные в данном документе. Например, кандидата можно оценивать путем инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другими восстановителями с применением реагентов, известн в данной области техники, которые имитируют скорость расщепления, которое можно наблюдать в клетке, например, целевой клетке. Также кандидата можно оценивать в условиях, выбранных для имитирования условий в крови или сыворотке. В одном варианте осуществления соединения кандидатов расщепляются не более чем на приблизительно 10% в крови. В других вариантах осуществления полезные соединения кандидатов разрушаются в по меньшей мере приблизительно 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитирования внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбранных для имитирования внеклеточный условий). Скорость расщепления соединений кандидатов может быть определена с помощью стандартных анализов ферментативной кинетики в условиях, выбранных для имитации внутриклеточной среды и по сравнению с условиями, выбранными для имитации внеклеточной среды.

ii. Расщепляемые связывающие группы на основе фосфата.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую связывающую группу на основе фосфата. Расщепляемая связывающая группа на основе фосфата расщепляется средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, расщепляющего фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как фосфатазы в клетках. Примерами связывающих групп на основе фосфата являются -O-F^,(O)(OR^k)-O-, -O-P(S)(OR^k)-O-, -O-P(S)(SR^k)-O-, -S-P(O)(OR^k)-O-, -O-P(O)(OR^k)-S-, -S-P(O)(OR^k)-S-, -O-P(S)(OR^k)-S-, -S-P(S)(OR^k)-O-, -O-P(O)(R^k)-O-, -O-P(S)(R^k)-O-, -S-P(O)(R^k)-O-, -S-P(S)(R^k)-O-, -S-P(O)(R^k)-S-, -O-P(S)(R^k)-S-. Предпочтительные варианты осуществления представляют собой -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-,

- 50 044245

-S-P(S)(OH)-O-, -Ο-Ρ(Ο)(Η)-Ο-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительный вариант осуществления представляет собой -О-Р(О)(ОН)-О-. Эти кандидаты могут быть оценены! с применением способов, аналогичных описанным выше.

iii. Кислотно-расщепляемые связывающие группы.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит кислотно-расщепляемую связывающую группу. Кислотно-расщепляемая связывающая группа представляет собой связывающую группу, которая расщепляется в присутствии кислоты. В предпочтительных вариантах осуществления кислотно-расщепляемые связывающие группы расщепляются в кислотных условиях при рН приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже), или с помощью средств, таких как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. Специфические органеллы в клетке, содержимое которых имеет низкое значение рН, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечить условия для расщепления кислотно-расщепляемых связывающих групп. Примеры кислотнорасщепляемых связывающих групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Кислотно-расщепляемые группы могут характеризоваться общей формулой C=NN-, C(O)O или -ОС(О). В предпочтительном варианте осуществления, когда углерод присоединен к кислороду сложного эфира (алкоксигруппе), в этом участвует арильная группа, замещенная алкильная группа или третичный алкил, такой как диметил-пентил или трет-бутил. Эти кандидаты могут быть оценены с применением способов, аналогичных описанным выше.

iv. Связывающие группы на основе сложного эфира.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит связывающую группу на основе сложного эфира. Расщепляемая связывающая группа на основе сложного эфира расщепляется ферментами, такими как эстеразы и амидазы в клетках. Примеры расщепляемых связывающих групп на основе сложного эфира включают без ограничения сложные эфиры алкилена, алкенилена и алкиниленовых групп. Расщепляемые связывающие группы на основе сложного эфира представлены общей формулой С(О)О- или -ОС(О)-. Эти кандидаты могут быть оценены с применением способов, аналогичных описанным выше.

v. Расщепляемые группы на основе пептида.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую связывающую группу на основе пептида. Расщепляемая связывающая группа на основе пептида расщепляется ферментами, такими как пептидазы и протеазы в клетках. Расщепляемые связывающие группы на основе пептида представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами с образованием олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Расщепляемые группы на основе пептида не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь представляет собой особый тип амидной связи, образованной между аминокислотами с образованием пептидов и белков. Расщепляемая группа на основе пептида обычно ограничена пептидной связью (т.е. амидной связью), образованной между аминокислотами с образованием пептидов и белков, и не включает амидную функциональную группу целиком. Расщепляемые связывающие группы на основе пептида представлены общей формулой NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Эти кандидаты могут быть оценены с применением способов, аналогичных описанным выше.

- 51 044245

В одном варианте осуществления иРНК по настоящему изобретению конъюгирована с углеводом через линкер. Неограничивающие примеры углеводных конъюгатов иРНК с линкерами из композиций и способов по настоящему изобретению, включают без ограничения

(Формулы XXVI) ,

(Формулы XXVII),

- 52 044245

(формулы XXX), где один из Y или X представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.

В некоторых вариантах осуществления композиций и способов по настоящему изобретению лиганд представляет собой один или несколько производных GalNAc (N-ацетилгалактозамина), присоединенные через двухвалентный или трехвалентный разветвленный линкер.

В одном варианте осуществления dsRNA по настоящему изобретению конъюгирована с двухвалентным или трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, продемонстрированных в любой из формул (XXXI)-(XXXIV): Формулы XXXI

Формулы XXXII

₍2A__R2A ,_Т2В_|_2В

уЗАЗА

уЗВ рв

Формулы XXXIII ₅ или Формулы XXXIV ;

где q^2A, q^2B, q^3A, q^3B, q^4A, q^4B, q^5A, q^5B и q^5C независимо представляют собой для каждого случая 0-20 и где повторяющиеся единицы могут быть одинаковыми или различными;

каждый из Р^2А, Р^2В, P^3A, P^3B, Р^4А, Р^4В, Р^5А, Р^5В, Р^5С, Т^2А, Т^2В, T^3A, T^3B, Т^4А, Т^4В, Т^4А, Т^5В, Т^5С независимо для каждого случая отсутствует, переставляет собой СО, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), CH₂, CH2NH или СН2О;

Q^2A, Q^2b, Q^3A, Q^3b, Q^4A, Q^4b, Q^5A, Q^5B, Q^5C независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться одним или несколькими из О, S, S(O), SO₂, N(Rⁿ), C(R')=C(R''), С=С или С(О);

каждый из R^2A, R^2B, R^3A, R^3B, R^4A, R^4B, R^5A, R^5B, R^5C независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой NH, О, S, СН2, С(О)О, C(O)NH, NHCH(R^a)C(O), -С(О)-СН(R^a)-NH-, СО, CH=N-O,

- 53 044245 или гетероциклил;

L^2A, L^2B, L^3A, L^3B, L^4A, L^4B, L^5A, L^5B и L^5C представляют собой лиганд; т.е. каждый независимо для каждого случая представляет собой моносахарид (например, GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и R^a представляет собой Н или аминокислотную боковую цепь. Трехвалентные конъюгированные производные GalNac особенно полезны для применения со средствами RNAi для ингибирования экспрессии целевого гена, такие как представлены формулой (XXXV):

Формула XXXV

где L^5A, L^5B и L^5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.

Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных групп линкера, конъюгированных с производными GalNac, включают без ограничения структуры, указанные выше как формулы II, VII, XI, X и XIII.

Иллюстративные патенты США, которые описывают получение коньюгатов РНК, включают без ограничения патенты США №№ 4828979, 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 и 5688941, 6294664, 6320017, 6576752, 6783931, 6900297, 7037646, 8106022, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

Не является необходимым для всех позиций в данном соединении быть равномерно модифицированными, и на самом деле более чем одна из вышеуказанных модификаций может быть включена в отдельное соединение или даже в отдельный нуклеозид в пределах иРНК. Настоящее изобретение также включает соединения иРНК, которые представляют собой химерные соединения.

Соединения химерной иРНК или химеры в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения иРНК, предпочтительно dsRNA, которые содержат два или более химически различных участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одного мономера, т.е. нуклеотида в случае соединения dsRNA. Такие иРНК обычно содержат по меньшей мере один участок, где РНК модифицирована таким образом, чтобы наделить иРНК повышенной устойчивостью к разрушению нуклеазой, увеличенным клеточным поглощением и/или увеличением аффинности связывания в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Дополнительно участок иРНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять РНК:ДНК или РНК:РНК гибриды. В качестве примера, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет РНК-цепь в РНК:ДНК-дуплексе. Активация РНКазы Н, следовательно, приводит к расщеплению целевой РНК, тем самым значительно повышая эффективность ингибирования иРНК при экспрессии гена. Следовательно, сравнимые результаты зачастую можно получить с более короткими иРНК при применении химерных dsRNA по сравнению с фосфотиоатными дезокси гибридизациями dsRNA того же целевого участка. Расщепление РНК-мишени обычно можно обнаружить с помощью гель-электрофореза и, при необходимости, методами гибридизации связанных нуклеиновых кислот, известных в данной области техники.

В некоторых случаях РНК из числа иРНК может быть модифицирована группой, не являющейся лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, были конъюгированы с иРНК в целях повышения активности, клеточного распределения или клеточного поглощения иРНК, способы выполнения таких конъюгаций доступны в научной литературе. Такие фрагменты, не являющиеся лигандами, включали липидные фрагменты, такие как холестерин (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), тиоэфир, например, геkсил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтил-аммоний 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантан-уксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahe

- 54 044245 dron Lett., 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229237), или октадециламин или фрагмент гексиламино-карбонилоксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Иллюстративные патенты США, которые описывают получение таких коньюгатов РНК, были перечислены выше. Типичные протоколы коньюгации включают синтез РНК, несущих амино-линкер в одном или нескольких положениях последовательности. Аминогруппа затем реагирует с молекулой, подлежащей конъюгации, с применением соответствующего сочетания или активирующих реагентов. Реакцию конъюгирования можно выполнять как с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, или после расщепления РНК в фазе раствора.

Очистка конъюгата РНК с помощью HPLC, как правило, приводит к получению чистого конъюгата.

IV. Доставка иРНК по изобретению.

Доставку иРНК по настоящему изобретению к клетке, например, клетке субъекта, такого как субъект-человек (например, субъект, нуждающийся в этом, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5), можно осуществлять различными путями. Например, доставку можно осуществлять путем приведения клетки в контакт с иРНК по настоящему изобретению либо in vitro, либо in vivo. Доставку in vivo также можно осуществлять непосредственно путем введения композиции, содержащей иРНК, например, dsRNA, субъекту. В альтернативном случае, доставку in vivo можно осуществлять опосредованно путем введения одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию иРНК. Такие альтернативные случаи описаны далее ниже.

Как правило, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты (in vitro или in vivo) может быть адаптирован для применения с иРНК по настоящему изобретению (см., например, Akhtar S. and Julian R.L. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 и WO 94/02595, которые включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме). Что касается доставки in vivo, факторы, которые учитывают в контексте доставки молекулы иРНК, включают, например, биологическую стабильность доставленной молекулы, предупреждение неспецифического действия и накопление доставленной молекулы в целевой ткани. Неспецифическое действие иРНК может быть сведено к минимуму путем локального введения, например путем прямой инъекции или вживления в ткань, или местного введения препарата. Локальное введение в место обработки максимально увеличивает локальную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на системные ткани, которые в ином случае могут быть повреждены средством или которые могут разрушить средство, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы иРНК. Несколько исследований показали эффективный нокдаун генных продуктов при введении иРНК локально. Например, было показано, что внутриглазная доставка dsRNA к VEGF путем как инъекции в стекловидное тело макаков-крабоедов (Tolentino, M.J., et al. (2004) Retina 24:132-138), так и субретинальных инъекций мышам (Reich, S.J., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) предупреждает образование новых сосудов в экспериментальной модели возрастной макулярной дистрофии. Кроме того, непосредственная внутриопухолевая инъекция dsRNA мышам уменьшает размер опухоли (Pille, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11:267274) и может увеличивать продолжительность жизни мышей с опухолью (Kim, W.J., et al. (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15:515-523). РНК-интерференция также была успешной при локальной доставке к ЦНС путем непосредственной доставки (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, P.H., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, G.T., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, E.R., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) и к легким путем интраназального введения (Howard, K.A., et al. (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Что касается введения иРНК системно при лечении заболевания, РНК может быть модифицирована или, в качестве альтернативы, доставлена при помощи системы доставки лекарственного средства; оба способа действуют для предупреждения быстрого разрушения dsRNA эндо- и экзонуклеазами in vivo. Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут делать возможным нацеливание композиции с иРНК на целевую ткань, и с их помощью можно избежать нежелательного нецелевого действия. Молекулы иРНК могут быть модифицировать при помощи химической конъюгации с липофильными группами, такими как холестерин, для повышения поглощения клеткой и предупреждения разрушения. Например, иРНК, направленную против АроВ и конъюгированную с фрагментом, представляющим собой липофильный холестерин, вводили системно мышам и получали в результате нокдаун мРНК ароВ как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432:173-178). Как было показано, конъюгация иРНК с аптамером ингибирует рост опухоли и опосредует регресс опухоли на мышиных моделях рака предстательной железы (McNamara, J.O., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). В альтернативном варианте осуществления иРНК можно доставлять с помощью систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы иРНК (отрицательно заряженной) и также увеличивают взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране с обеспечением эффективного поглощения иРНК клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут быть связанными либо с иРНК, либо на них воздействуют для образования пузырька или мицеллы (см., например, Kim S.H., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116), которые заключают в себя иРНК. Образование

- 55 044245 пузырьков или мицелл также предупреждает разрушение иРНК при введении системно. Способы получения и введения катионных комплексов с иРНК находятся в пределах квалификации специалистов в данной области техники (см., например, Sorensen, D.R., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, U.N., et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, A.S. et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, пригодных для системной доставки иРНК, включают DOTAP (Sorensen, D.R., et al. (2003), выше; Verma, UN., et al. (2003), выше), олигофектамин, твердые частицы с нуклеиновой кислотой-липидом (Zimmermann, T.S., et al. (2006) Nature 441:111-114), кардиолипин (Chien, P.Y., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al. (2005) Int J. Oncol. 26:10871091), полиэтиленимин (Bonnet M.E., et al. (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), содержащие Arg-Gly-Asp (RGD) пептиды (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472487) и полиамидоамины (Tomalia, DA., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). В некоторых вариантах осуществления иРНК образуют комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции иРНК и циклодекстринов можно найти в патенте США № 7427605, который включен в данный документ при помощи ссылки в полном объеме.

А. Кодируемые вектором иРНК по изобретению.

иРНК, нацеленные на ген С5, могут экспрессироваться транскрипционными единицами, вставленными в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture, A., et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., международную РСТ публикацию № WO 00/22113, Conrad, международную РСТ публикацию № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (приблизительно от часов до недель) или длительной (от недель до месяцев или дольше) в зависимости от конкретной применяемой конструкции и целевых тканей или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может быть интегрирующим или неинтегрирующим вектором. Трансгены также могут быть сконструированы с возможностью наследования их в виде экстрахромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

Отдельные цепи или цепи иРНК могут транскрибироваться с промотора вектора экспрессии. В целевую клетку можно совместно вводить два отдельных вектора экспрессии (например, путем трансфекции или инфицирования) для экспрессирования двух отдельных цепей с получением, например, dsRNA. В альтернативном случае, каждая отдельная цепь dsRNA может транскрибироваться с участием промоторов, оба из которых расположены в одной и той же плазмиде экспрессии. В одном варианте осуществления dsRNA экспрессируется в виде полинуклеотидов с инвертированным повтором, соединенных линкерной полинуклеотидной последовательностью, таким образом, что dsRNA имеет структуру типа стебель-петля.

Векторы экспрессии с иРНК, как правило, являются ДНК-плазмидами или вирусными векторами. Векторы экспрессии, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно совместимые с клетками позвоночных, можно использовать для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии иРНК, как описано в данном документе. Векторы экспрессии для эукариотических клеток хорошо известны в данной области и доступны из ряда коммерческих источников. Обычно предусмотрены векторы, содержащие удобные сайты рестрикции для вставки необходимого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих иРНК, может быть системной, как, например, путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные из пациента, с последующим обратным введением пациенту или путем любого другого способа, который обеспечивает возможность введения в желательную целевую клетку.

Целевые клетки можно трансфицировать плазмидами экспрессии иРНК в виде комплекса с носителями-катионными липидами (например, олигофектамином) или носителями на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO™). В настоящем изобретением также рассматриваются множественные трансфекции при помощи липидов для типов иРНК-опосредованного нокдауна, нацеленного на различные участки целевой РНК, на протяжении недели или более. Успешное введение векторов в клетки хозяина можно контролировать при помощи разнообразных известных способов. Например, временную трансфекцию можно выявить при помощи репортера, такого как флуоресцентный маркер, к примеру, зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть подтверждена при помощи маркеров, которые придают трансфицированной клетке устойчивость к определенным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), такую как устойчивость к гигромицину В.

Системы вирусных векторов, которые можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе, включают, без ограничения, (а) аденовирусные векторы; (b) ретровирусные векторы, в том числе без ограничения лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Молони и т.д.; (с) векторы на основе аденоассоциированного вируса; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (е) векторы на основе SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) векторы на основе пикорнавируса; (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопокс, например, векторы на основе вируса осповакцины, или авипокс, например, канарипокс или оспы кур; и (j) хел

- 56 044245 пер-зависимый или слабый аденовирус. Также преимущественными могут быть вирусы с нарушенной репликацией. Различные векторы будут или не будут встраиваться в геном клеток. При необходимости, конструкции могут включать вирусные последовательности для трансфекции. В качестве альтернативы, конструкция может быть встроена в векторы, способные к эписомальной репликации, например, векторы на основе EPV и EBV. Для обеспечения экспрессии иРНК в целевых клетках в конструкциях для рекомбинантной экспрессии иРНК, как правило, требуется наличие регуляторных элементов, например, промоторов, энхансеров и т.д. Другие аспекты, учитываемые в отношении векторов и конструкций, описаны далее ниже.

Векторы, пригодные для доставки иРНК, будут включать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии иРНК в желательных целевых клетке или ткани. Регуляторные элементы можно выбирать для получения либо конститутивной, либо регулируемой/индуцибельной экспрессии.

Экспрессия иРНК может быть точно регулируемой, например, путем использования индуцибельной регуляторной последовательности, которая чувствительна к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням циркулирующей глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцибельные экспрессирующие системы, подходящие для управления экспрессией dsRNA в клетках или у млекопитающих, включают, например, регулирование при помощи экдизона, при помощи эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-бета-Dтиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, опираясь на предполагаемое использование трансгена иРНК.

Могут быть использовать вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иРНК. Например, возможно применение ретровирусного вектора (см. Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иРНК, клонируют в один или несколько векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты пациенту. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), в котором описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 к гемопоэтическим стволовым клеткам для придания стволовым клеткам большей устойчивости к химиотерапии. Другими источниками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); и Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе HIV, описанные в патентах США №№ 6143520; 5665557 и 5981276, которые включены в данный документ при помощи ссылки.

Аденовирусы также предусматриваются для применения в доставке иРНК по настоящему изобретению. Аденовирусы представляют собой особенно перспективные проводники, например, для доставки генов к респираторному эпителию. Аденовирусы естественным образом инфицируют респираторный эпителий, где они вызывают заболевание с легким течением. Другими мишенями для основанных на аденовирусах системах доставки являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышца. Аденовирусы обладают преимуществом в том, что способны инфицировать неделящиеся клетки. В Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) представлена обзорная статья о генной терапии на основе аденовирусов. Bout и соавт., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) показали использование аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макак-резус. Дополнительные примеры использования аденовирусов в генной терапии можно найти в Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); публикации PCT WO 94/12649 и Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Подходящий AV вектор для экспрессии иРНК, описанной в настоящем изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV вектора и способ доставки вектора в целевые клетки описаны в Xia Н et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) также можно использовать для доставки иРНК по настоящему изобретению (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); патент США № 5436146). В одном варианте осуществления иРНК может экспрессироваться в виде двух отдельных комплементарных одноцепочечных молекул РНК при помощи рекомбинантного AAV-вектора, например, либо с РНК-промоторами, U6 или H1, либо с промотором цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии dsRNA, описанной в настоящем изобретении, способы конструирования рекомбинантного AV вектора и способы доставки векторов в целевые клетки описаны в Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной заявке на патент № WO 94/13788 и международной заявке на патент № WO 93/24641, полное раскрытие которых включено в данный документ при помощи ссылки.

Другой вирусный вектор, подходящий для доставки иРНК по настоящему изобретению, представляет собой поксвирус, такой как вирус осповакцины, например, аттенуированный вирус осповакцины,

- 57 044245 как, например, модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, авипокс, как, например, оспа кур или канарипокс.

Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или путем замены различных вирусных капсидных белков, в случае необходимости. Например, лентивирусные векторы можно подвергать псевдотипированию поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы можно создать для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов так, чтобы они экспрессировали различные серотипы капсидных белков; см., например, Rabinowitz J.E. et al. (2002), J Virol 76:791-801, полное раскрытие которого включено в данный документ при помощи ссылки.

Фармацевтический препарат вектора может включать вектор в приемлемом разбавителе или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включено средство доставки генов. В альтернативном случае, когда вектор доставки целого гена может вырабатываться нативно рекомбинантными клетками, например, ретровирусными векторами, тогда фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые вырабатывают систему доставки генов.

V. Фармацевтические композиции по изобретению.

Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, которые включают иРНК по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие иРНК, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Фраза фармацевтически приемлемый применяется в данном документе для обозначения соединений, веществ, композиций и/или лекарственных форм, которые в пределах погрешности медицинской оценки, пригодных для применения при взаимодействии с тканями субъекта-человека и субъектаживотного без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соразмерных с разумным соотношением польза/риск.

Фраза фармацевтически приемлемый носитель, применяемая в данном документе, означает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, инертный наполнитель, вспомогательные вещества (например, смазывающее вещество, тальк, магний, стеарат кальция или цинка, или стеариновая кислота) или растворяющее инкапсулирующее вещество, участвующие в переносе и транспортировке в указанного соединения от одного органа или части тела к другому органу или части тела. Каждый носитель должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не быть вредным для субъекта, подвергаемого лечению. Некоторые примеры веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) смазывающие средства, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк; (8) наполнители, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) рН-буферные растворы; (21) сложные полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; (22) наполнители, такие как полипептиды и аминокислоты (23) компонента сыворотки, такие как сывороточный альбумин, HDL и LDL; и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах.

Фармацевтические композиции, содержащие иРНК, пригодны для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или активностью гена С5, например, заболевания, связанного с компонентом комплемента С5. Такие фармацевтические композиции составляют в зависимости от способа доставки. Одним примером являются композиции, которые составлены для системного введения посредством доставки парентеральным путем, например, путем подкожной (SC) или внутривенной (IV) доставки. Другим примером являются композиции, которые составлены для непосредственной доставки в паренхиму головного мозга, например, путем инфузии в головной мозг, как, например, непрерывной инфузии при помощи насоса. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии гена С5. Как правило, приемлемая доза иРНК по настоящему изобретению будет составлять в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 200,0 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента вдень, как правило, в диапазоне от приблизительно 1 до 50 мг на килограмм массы тела в день. Например, dsRNA можно вводить в количестве приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,05 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг или приблизительно 50 мг/кг на разовую дозу.

Например, dsRNA можно вводить в дозе приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1,

- 58 044245

1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7,

3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4,

6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1,

9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, или приблизительно 10 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления dsRNA вводят в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 30 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 45 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 30 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

Например, dsRNA можно вводить в дозе приблизительно 0,1, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или приблизительно 10 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также под- 59 044245 разумеваются как часть настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления dsRNA вводят в дозе от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 30 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 45 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 30 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг. В одном варианте осуществления dsRNA вводят в дозе от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

Например, можно вводить субъекту, например, подкожно или внутривенно, разовое терапевтическое количество иРНК, приблизительно 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят, например, подкожно или внутривенно, несколько доз терапевтического количества иРНК, например, в дозе приблизительно 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65,

- 60 044245

0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7,

1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4,

4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1,

7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7,

9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5,

21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Многодозный режим может включать введение терапевтического количества иРНК ежедневно, например, в течение двух дней, трех дней, четырех дней, пяти дней, шести дней, семи дней или дольше.

В других вариантах осуществления субъекту вводят, например, подкожно или внутривенно, повторную дозу терапевтического количества иРНК, например, в дозе приблизительно 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Режим повторной дозы может включать введение терапевтического количества иРНК на регулярной основе, например, каждый второй день, каждый третий день, каждый четвертый день, два раза в неделю, один раз в неделю, раз в две недели или раз в месяц.

Фармацевтическая композиция может быть введена путем внутривенной инфузии в течение некоторого периода времени, например, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, 22, 23, 24 или примерно 25-минутного периода. Введение могут повторять, например, регулярно, как, например, раз в неделю, раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После первичной схемы лечения, обработку можно вводить менее часто. Например, после введения раз в неделю или раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев, или года, или дольше.

Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в день или иРНК можно вводить в виде двух, трех или более частей дозы через определенные интервалы на протяжении дня, или даже при помощи непрерывной инфузии, или доставки посредством состава с контролируемым высвобождением. В таком случае, количество иРНК, содержащееся в каждой части дозы, должно быть соответственно меньше, чтобы обеспечить общую суточную дозу. Единица дозирования также может быть составлена для доставки в течение нескольких дней, например, при помощи традиционного состава с замедленным высвобождением, который предусматривает замедленное высвобождение иРНК в течение периода в несколько дней. Составы с замедленным высвобождением хорошо известны в данной области и особенно удобны для доставки средств в определенный участок, как, например, таких, которые возможно применять со средствами по настоящему изобретению. В таком варианте осуществления единица дозирования содержит соответствующее кратное число суточной дозы.

В других вариантах осуществления разовая доза фармацевтических композиций может быть длительного действия, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель. В некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению разовую дозу фармацевтических композиций по настоящему изобретению вводят один раз в неделю. В других вариантах осуществления по настоящему изобретению разовую дозу фармацевтических композиций по настоящему изобретению вводят каждые два месяца.

Специалисту в данной области будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозу и временные рамки, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе, без ограничения, тяжесть заболевания или нарушения, типы предшествующего лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать один период лечения или серию периодов лечения. Оценки эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных иРНК, охваченных настоящим изобретением, можно получать, используя традиционные методологии, или на основании проведения исследований in vivo с применением соответствующей животной модели, как описано в другой части данного документа.

Достижения в области генетики мышей обеспечили ряд мышиных моделей для изучения различных заболеваний человека, как, например, нарушения, на которое можно оказать благоприятное воздействие путем снижения экспрессии С5. Такие модели можно использовать для проведения in vivo исследований иРНК, а также для определения терапевтически эффективной дозы. Подходящие мышиные модели известны в данной области и включают, например, мышиную модель коллаген-индуцированного артрита (Courtenay, J.S., et al. (1980) Nature 283, 666-668), ишемии миокарда (Homeister JW и Lucchesi BR (1994) Annu Rev Pharmacol Toxicol 34:17-40), мышиную модель астмы, индуцированной яичным белком (на- 61 044245 пример, Tomkinson A., et al. (2001). J. Immunol. 166, 5792-5800), (NZBxNZW)Fl, MRL/Fas^lpr (MRL/lpr) и мышиную модель BXSB (Theofilopoulos, A.N. и Kono, D.H. 1999. Murine lupus models: gene-specific and genome-wide studies. In Lahita R.G., ed., Systemic Lupus Erythematosus, 3rd edn, p. 145. Academic Press, San

Diego, CA), мышиную модель aHUS (Goicoechea de Jorge et al. (2011) Развитие атипичного гемолитического уремического синдрома зависит от комплемента С5, J Am Soc Nephrol 22:137-145.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, необходимо ли локальное или же системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (например, при помощи трансдермального пластыря), легочным, например, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи ингалятора; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например, посредством вживленного устройства; или интракраниальное, например, интрапаренхиматозное, подоболочечное или интравентрикулярное введение.

иРНК можно доставлять таким образом, чтобы происходило целенаправленное воздействие на конкретную ткань, как, например, печень (например, гепатоциты печени).

Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Традиционные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимы или желательны. Также можно применять покрытые презервативы, перчатки и т.п. Подходящие составы для местного применения включают те, в которых иРНК, описанные в настоящем изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностноактивные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоил фосфатидилхолин (DMPC), дистеароил фосфатидилхолин), отрицательные (например, димиристоил фосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOTMA)). иРНК, описанные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. В качестве альтернативы, иРНК могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают, без ограничения, арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или C₁.₂₀алкиловые сложные эфиры (например, изопропилмиристат (IPM)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного применения подробно описаны в патенте США № 6747014, который включен в данный документ при помощи ссылки.

А. Составы с иРНК, содержащие мембранные молекулярные ансамбли.

иРНК для применения в композициях и способах по настоящему изобретению могут быть составлены для доставки в мембранный молекулярный ансамбль, например, липосому или мицеллу.

Применяемое в данном документе выражение липосома относится к пузырьку, состоящему из амфифильных липидов, расположенных в виде по меньшей мере одного бислоя, например, одного бислоя или множества бислоев. Липосомы включают однослойные и многослойные пузырьки, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водную внутреннюю часть. Водная часть содержит композицию с иРНК. Липофильный материал отделяет водную внутреннюю среду от водной внешней среды, которая, как правило, не включает композицию с иРНК, хотя в некоторых примерах может включать. Липосомы пригодны для переноса и доставки активных ингредиентов к месту приложения действия. Благодаря тому, что мембрана липосомы структурно подобна биологическим мембранам, при применении липосом к тканям бислой липосомы сливается с бислоем клеточных мембран. По мере того как идет слияние липосомы и клетки внутреннее водное содержимое, которое включает иРНК, доставляется в клетку, где иРНК может специфически связываться с целевой РНК и может опосредовать RNAi. В некоторых случаях липосомы также являются специфически нацеленными, например, для направления иРНК в конкретные типы клеток.

Липосомы, содержащие средство RNAi, могут быть получены рядом способов. В одном примере липидный компонент липосомы растворяют в детергенте для образования мицеллы с липидным компонентом. Например, липидный компонент может быть амфипатическим катионным липидом или липидным конъюгатом. Детергент может характеризоваться высокой критической концентрацией мицеллообразования и может быть неионным. Иллюстративные детергенты включают холат, CHAPS, октилглюкозид, дезоксихолат и лауроилсаркозин. Препарат средства RNAi затем добавляют к мицеллам, которые включают липидный компонент. Катионные группы липида взаимодействуют со средством для RNAi и конденсируются вокруг средства RNAi с образованием липосомы. После конденсации детергент удаляют, например, путем диализа, с получением липосомного препарата средства для RNAi.

При необходимости соединение-носитель, которое содействует конденсации, можно добавлять во

- 62 044245 время реакции конденсации, например, путем контролируемого добавления. Например, соединениеноситель может быть полимером, отличным от нуклеиновой кислоты (например, спермином или спермидином). Также можно корректировать рН для содействия конденсации.

Способы получения стабильных полинуклеотидных средств доставки, которые включают комплекс полинуклеотида/катионного липида в качестве структурных компонентов средств доставки, дополнительно описаны, например, в WO 96/37194, полное содержание которой включено в данный документ при помощи ссылки. Образование липосом может также включать один или несколько аспектов иллюстративных способов, описанных в Feigner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; патенте США № 4897355; патенте США № 5171678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; и Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Широко применяемые методики получения липидных агрегатов соответствующего размера для использования в качестве средств доставки включают разрушение ультразвуком и замораживание-оттаивание с экструзией (см., например, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Микрофлюидизацию можно применять в тех случаях, когда желательны стабильно малые (от 50 до 200 нм) и относительно единообразные агрегаты (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Такие способы легко адаптируются для упаковки препарата средства для RNAi в липосомы.

Липосомы делятся на два широких класса. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот с образованием стабильных комплексов. Положительно заряженный комплекс нуклеиновой кислоты/липосомы связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализируется в эндосому. Липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в клеточную цитоплазму, вследствие кислого рН внутри эндосомы (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно-заряженными, захватывают нуклеиновые кислоты вместо образования комплекса с ними. Поскольку как нуклеиновая кислота, так и липид имеют одинаковый заряд, то происходит отталкивание вместо образования комплекса. Тем не менее, некоторая часть нуклеиновых кислот захватывается водной внутренней средой этих липосом. Липосомы с рН-чувствительностью использовали для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих ген тимидинкиназы, к монослоям клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена обнаруживали в целевых клетках (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

Один главный тип липосомных композиций включает фосфолипиды, отличные от полученного естественным образом фосфатидилхолина. Композиции нейтральных липосом, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Композиции анионных липосом, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образованы главным образом из диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомных композиций образован из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.

Примеры других способов для in vitro и in vivo введения липосом в клетки включают патент США № 5283185; патент США № 5171678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Feigner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; и Strauss EMBO J. 11:417, 1992.

Неионные липосомные системы также исследовали для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина-А в слой дермы кожи мышей. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в обеспечении депонирования циклоспорина А в различных слоях кожи (Hu et al. S.Т.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).

Липосомы также включают пространственно стабилизированные липосомы, которые, как применяется в данном документе, означают липосомы, содержащие один или несколько специальных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени жизни в кровотоке по сравнению с липосомами, у которых отсутствуют такие специальные липиды. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются те, в которых часть липидной составляющей, образующей пузырек, липосомы (А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид G_M1, или (В) получена из одного или нескольких гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, в области техники полагают, что по меньшей мере для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-производные липиды, увеличенное время полужизни в кровотоке этих пространственно стабилизированных липосом является следствием сниженного поглощения клетками ретикулоэндотели- 63 044245 альной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Разнообразные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны в данной области. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) описали способность моносиалоганглиозида G_M1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Эти полученные данные были прокомментированы Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патенте США № 4837028 и WO 88/04924, оба из которых принадлежат Allen и соавт., раскрыты липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сложные эфиры сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb и соавт.) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim et al).

В одном варианте осуществления применяют катионные липосомы. Катионные липосомы обладают преимуществом в том, что они способны сливаться с клеточной мембраной. Некатионные липосомы, не смотря на то, что они не могут сливаться настолько эффективно с плазматической мембраной, поглощаются макрофагами in vivo, и их можно использовать для доставки средств для RNAi к макрофагам.

Дополнительные преимущества липосом включают следующее: липосомы, полученные из натуральных фосфолипидов, биосовместимы и биоразрушаемы; липосомы могут включать широкий диапазон воды и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные средства для RNAi во внутренних отделениях от метаболизма и разрушения (Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Важными аспектами в получении липосомных составов являются заряд поверхности липида, размер пузырька и водный объем липосом.

Положительно заряженный синтетический катионный липид, хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), можно использовать для образования малых липосом, которые самопроизвольно взаимодействуют с нуклеиновой кислотой с образованием комплексов липиднуклеиновой кислоты, которые способны сливаться с отрицательно заряженными липидами клеточных мембран клеток культуры тканей, что приводит к доставке средства для RNAi (см., например, Feigner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 и патент США № 4897355 касательно описания DOTMA и его применения с ДНК).

Аналог DOTMA, 1,2-бис-(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропан (DOTAP), можно использовать в комбинации с фосфолипидом с образованием пузырьков, образующих комплекс с ДНК. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Гейтерсберг, Мэриленд) представляет собой эффективное средство для доставки сильно анионных нуклеиновых кислот в клетки культуры живых тканей, которое содержит положительно заряженные DOTMA-липосомы, которые самопроизвольно взаимодействуют с отрицательно заряженными полинуклеотидами с образованием комплексов. Суммарный заряд полученных комплексов является также положительным в тех случаях, когда используют липосомы с достаточным положительным зарядом. Положительно заряженные комплексы, полученные таким способом, самопроизвольно прикрепляются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям, сливаются с плазматической мембраной и эффективно доставляют функциональные нуклеиновые кислоты, например, в клетки культуры тканей. Другой коммерчески доступный катионный липид, 1,2-бис-(олеоилокси)-3,3(триметиламмоний)пропан (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Индианаполис, Индиана), отличается от DOTMA тем, что олеиловые фрагменты связаны сложноэфирными, а не простыми эфирными связями.

Другие опубликованные соединения с катионными липидами включают те, которые были конъюгированы с рядом фрагментов, в том числе, например, карбоксиспермином, который был конъюгирован с одним из двух типов липидов и включает такие соединения, как 5-карбоксиспермилглициндиоктаолеоиламид (DOGS) (Transfectam™, Promega, Мэдисон, Висконсин) и дипальмитоилфосфатидилэтаноламина 5-карбоксиспермил-амид (DPPES) (см., например, патент США № 5171678).

Другой конъюгат с катионным липидом включает полученные производные липида с холестерином (DC-Chol), которые были составлены в виде липосом в комбинации с DOPE (см., Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Как сообщалось, липополилизин, полученный путем конъюгации полилизина с DOPE, является эффективным при трансфекции в присутствии сыворотки (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Для определенных клеточных линий такие липосомы, содержащие конъюгированные катионные липиды, известны проявлением более низкой токсичности и обеспечением более эффективной трансфекции, чем DOTMA содержащие композиции. Другие коммерчески доступные продукты с катионными липидами включают DMRIE и DMRIE-HP (Vical, Ла-Хойя, Калифорния) и Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд). Другие катионные липиды, подходящие для доставки олигонуклеотидов, описаны в WO 98/39359 и WO 96/37194.

Липосомные составы в особенности подходят для местного применения, при этом липосомы проявляют некоторые преимущества по сравнению с другими составами. Такие преимущества включают сниженное побочное действие по отношению к высокой системной абсорбции введенного лекарственного средства, повышенное накопление введенного лекарственного средства в необходимой мишени и воз- 64 044245 можность вводить средство RNAi в кожу. В некоторых вариантах осуществления липосомы используют для доставки средства RNAi к эпидермальным клеткам и также для усиления проникновения средства RNAi в дермальные ткани, например, в кожу. Например, липосомы можно применять местно. Была документально зафиксирована местная доставка лекарственных средств, составленных в виде липосом, в кожу (см., например, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 и du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, С. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R.M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C.Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:78517855, 1987).

Неионные липосомные системы также исследовали для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки лекарственного средства в слой дермы кожи мышей. Такие составы со средством для RNAi пригодны для лечения дерматологического нарушения.

Липосомы, которые включают иРНК, могут быть получены с высокой способностью деформироваться. Такая деформируемость может позволить липосомам проникать через пору, которая меньше, чем средний радиус липосомы. Например, типом деформируемых липосом являются трансферсомы. Трансферосомы можно получить путем добавления поверхностных пограничных активаторов, обычно поверхностно-активных веществ, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы, которые включают средство для RNAi, можно доставлять, например, подкожно путем инъекции для доставки средства для RNAi к кератиноцитам в коже. Для того, чтобы пройти через неповрежденную кожу млекопитающего, липидные пузырьки должны проникнуть через ряд мелких пор, каждая с диаметром менее 50 нм, под воздействием подходящего внутрикожного градиента. Кроме того, благодаря свойствам липидов, такие трансферосомы могут быть самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися, и зачастую могут достигать свои мишени без разделения на фрагменты, и часто могут быть самозагружающимися.

Другие составы, пригодные в настоящем изобретении, описаны в предварительных заявках США с серийными №№ 61/018616, поданной 2 января 2008 г.; 61/018611, поданной 2 января 2008 г.; 61/039748, поданной 26 марта 2008 г.; 61/047087, поданной 22 апреля 2008 г., и 61/051528, поданной 8 мая 2008 г. В РСТ заявке № PCT/US2007/080331, поданной 3 октября 2007 г., также описаны составы, применимые в настоящем изобретении.

Трансферсомы представляют собой еще один тип липосом и представляют собой липидные агрегаты с высокой способностью деформироваться, они являются перспективными кандидатами как средства доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью деформироваться, что они легко могут проникать через поры, меньшие, чем капельки. Трансферсомы являются приспосабливающимися к окружающей среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор в коже), самовосстанавливающимися, зачастую достигают мишеней без разделения на фрагменты и часто могут быть самозагружающимися. Для получения трансферсом можно добавлять поверхностные пограничные активаторы, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы использовали для доставки сывороточного альбумина в кожу. Как было показано, опосредованная трансферсомами доставка сывороточного альбумина была такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.

Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классифицирования и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как естественных, так и синтетических, является использование гидролипидного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как головка) предоставляет наиболее эффективное средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, используемых в составах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, то ее классифицируют как неионное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах, и их можно применять при широком диапазоне значений рН. Обычно их значения HLB находятся в диапазоне от 2 до примерно 18, в зависимости от их структуры. Неионные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные эфиры глицерила, сложные эфиры полиглицерила, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионные алканоамиды и эфиры, как, например, этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры, также включены в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее распростра

- 65 044245 ненными представителями класса неионных поверхностно-активных веществ.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, как, например, омыляющие вещества, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и омыляющие вещества.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают четвертичные соли аммония и этоксилированные амины. Четвертичные соли аммония являются наиболее применяемыми представителями данного класса.

Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести либо положительный, либо отрицательный заряд, то поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.

Было рассмотрено применение поверхностно-активных веществ в готовых лекарственных формах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

иРНК для применения в способах по настоящему изобретению может также предусматриваться в виде мицеллярных составов. Мицеллы в данном документе определены как конкретный тип молекулярного ансамбля, в котором амфипатические молекулы организованы в виде сферической структуры, так что все гидрофобные части молекулы направлены вовнутрь, оставляя гидрофильные части соприкасающимися с окружающей водной фазой. Противоположное расположение имеет место, если окружающая среда гидрофобная.

Смешанный мицеллярный состав, подходящий для доставки через внутрикожные мембраны, может быть получен путем смешивания водного раствора композиции с siRNA, С₈-С₂₂-алкилсульфата щелочного металла и мицеллообразующих соединений. Иллюстративные мицеллообразующие соединения включают лецитин, гиалуроновую кислоту, фармацевтически приемлемые соли гиалуроновой кислоты, гликолевую кислоту, молочную кислоту, вытяжку из ромашки, вытяжку из огурца, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, моноолеин, моноолеаты, монолаураты, масло бурачника, масло первоцвета вечернего, ментол, тригидроксиоксохоланил-глицин и его фармацевтически приемлемые соли, глицерин, полиглицерин, лизин, полилизин, триолеин, эфиры полиоксиэтилена и их аналоги, простые полидоканол-алкиловые эфиры и их аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат и их смеси. Мицеллообразующие соединения можно добавлять во время или после добавления алкилсульфата щелочного металла. Смешанные мицеллы будут образовываться, по сути, при любом виде смешивания ингредиентов, кроме интенсивного перемешивания для получения мицелл с меньшим размером.

В одном способе получают первую мицеллярную композицию, которая содержит композицию с siRNA и по меньшей мере алкилсульфат щелочного металла. Первую мицеллярную композицию затем смешивают по меньшей мере с тремя мицеллообразующими соединениями с образованием смешанной мицеллярной композиции. В другом способе мицеллярную композицию получают путем смешивания композиции с siRNA, алкилсульфата щелочного металла и по меньшей мере одного из мицеллообразующих соединений с последующим добавлением оставшихся мицеллообразующих соединений с интенсивным смешиванием.

Фенол и/или м-крезол можно добавлять к смешанной мицеллярной композиции для стабилизации состава и защиты от роста бактерий. В качестве альтернативы, фенол и/или м-крезол можно добавлять с мицеллообразующими ингредиентами. Изотоническое средство, такое как глицерин, также можно добавлять после образования смешанной мицеллярной композиции.

Для доставки мицеллярного состава в виде спрея состав можно поместить в аэрозольный распылитель и распылитель зарядить газом-вытеснителем. Газ-вытеснитель, который находится под давлением, находится в жидкой форме в распылителе. Соотношения ингредиентов корректируют так, что водная фаза и фаза газа-вытеснителя становятся одной, т.е. присутствует одна фаза. Если присутствует две фазы, то необходимо встряхнуть распылитель перед распылением части содержимого, например, посредством дозирующего клапана. Распыляемая доза фармацевтического средства выталкивается из дозирующего клапана в виде мелкодисперсной струи.

Газы-вытеснители могут включать водородсодержащие хлорфторуглероды, водородсодержащие фторуглероды, простой диметиловый эфир и простой диэтиловый эфир. В определенных вариантах осуществления можно использовать HFA 134а (1,1,1,2-тетрафторэтан).

Конкретные концентрации основных ингредиентов могут быть определены при помощи проведения относительно простых экспериментов. Для абсорбции через ротовую полость часто необходимо увеличить, например, по меньшей мере удвоить или утроить, дозу, предназначенную для инъекции или введения через желудочно-кишечный тракт.

В. Липидные частицы.

- 66 044245 иРНК, например, dsRNA по настоящему изобретению, может быть полностью инкапсулирована в липидном составе, например, LNP или другой частице нуклеиновой кислоты-липида.

Применяемое в данном документе выражение LNP относится к стабильной частице нуклеиновой кислоты-липида. LNP, как правило, содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предупреждает агрегацию частиц (например, конъюгат PEG-липид). LNP весьма пригодны для системных применений, поскольку они характеризуются длительным временем жизни в кровотоке после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). LNP включают pSPLP, которая включает инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который приведен в РСТ публикации № WO 00/03683. Частицы по настоящему изобретению обычно имеют средний диаметр от примерно 50 нм до примерно 150 нм, чаще от примерно 60 нм до примерно 130 нм, чаще от примерно 70 нм до примерно 110 нм, наиболее часто от примерно 70 нм до примерно 90 нм и по сути являются нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда присутствуют в частицах нуклеиновой кислоты-липида по настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиноваой кислоты-липида и способ их получения раскрыт, например, в патентах США №№ 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публикации США № 2010/0324120 и РСТ публикации № WO 96/40964.

В одном варианте осуществления соотношение липида и лекарственного средства (соотношение масса/масса) (например, соотношение липида и dsRNA) будет находиться в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 50:1, от примерно 1:1 до примерно 25:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 10:1, от примерно 5:1 до примерно 9:1 или от примерно 6:1 до примерно 9:1. Диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Катионный липид может представлять собой, например, хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(I-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(I-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,Nтриметиламмония (DOTMA), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2дилинолеоил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-SDMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлористую соль 1,2дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-ТМА.Cl), хлористую соль 1,2-дилинолеоил-3триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-Щ-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или его аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис-(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1 -ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (T ech G1) или их смесь. Катионный липид может содержать от приблизительно 20 мол.% до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.

В другом варианте осуществления можно использовать соединение 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц липид-siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в предварительной заявке на патент США номер 61/107998, поданной 23 октября 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки.

В одном варианте осуществления частицы липид-siRNA включают 40% 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана; 10% DSPC; 40% холестерина; 10% PEG-C-DOMG (мольный процент) с размером частиц 63,0±20 нм и соотношением siRNA/липид 0,027.

Ионизируемый/некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, в том числе, без ограничения, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоил-фосфатидилэтаноламин-4-(М-малеимидометил)-циклогексан-1карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароил-фосфатидил-этаноламин (DSPE), 16-O-монометил-РЕ, 16-О-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять от примерно 5 мол.% до примерно 90 мол.%, примерно 10 мол.% или примерно 58 мол.%, если холестерин включен, от общего содержания липидов, присутствующих в частице.

Конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц, может представлять собой, например, конъюгат полиэтиленгликоль (PEG)-липид, в том числе, без ограничения, PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгат

- 67 044245

PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (Ci₂), PEGдимиристоилоксипропил (Ci₄), PEG-дипальмитилоксипропил (Ci₆) или PEG-дистеарилоксипропил (Ci₈).

Конъюгированный липид, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять от 0 мол.% до примерно 20 мол.% или примерно 2 мол.% общего содержания липидов, присутствующих в частице.

В некоторых вариантах осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид дополнительно включают холестерин в количестве, например, от примерно 10 мол.% до примерно 60 мол.% или примерно 48 мол.% общего содержания липидов, присутствующих в частице.

В одном варианте осуществления липидоид ND98-4HCl (MW 1487) (см. заявку на патент США № 12/056230, поданную 26 марта 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids) можно использовать для получения наночастицы липид-dsRNA (т.е. частиц LNP01). Маточные растворы каждого в этаноле могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-церамид С16, 100 мг/мл. Маточные растворы ND98, холестерина и PEG-церамида С16 можно затем объединять, например, в молярном соотношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водным раствором dsRNA (например, в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла примерно 3545%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла примерно 100-300 мМ. Наночастицы липидdsRNA обычно образуются самопроизвольно при смешивании. В зависимости от необходимого распределения частиц по размеру полученную смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с отсечением по размеру в 100 нм) при помощи, например, экструдера с термоцилиндром, как, например, Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно пропустить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, при помощи диализа или тангенциальной поточной фильтрации. Буфер можно заменить, например, забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) с рН примерно 7, например, рН примерно 6,9, рН примерно 7,0, рН примерно 7,1, рН примерно 7,2, рН примерно 7,3 или рН примерно 7,4.

ND98 isomer!

Формула I

Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, которая, таким образом, включена при помощи ссылки.

Дополнительные иллюстративные составы с липидом-dsRNA описаны в табл. 1.

____________________________________________Таблица 1

Ионизируемый/катионный липид	Катионный липид/некатионный липид/холестерин/конъюга т PEG-липид Соотношение липид:siRNA
1,2-дилиноленилокси-И,Nдиметиламинопропан(DLinDMA)	DLinDMA/DPPC/холестерин/ PEG-cDMA (57,1/7,1/34,4/1,4) липид : siRNA ~ 7:1
2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DPPC/холестерин/PEG- cDMA 57,1/7,1/34,4/1,4 липид : siRNA ~ 7:1

- 68 044245

LNP05	2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/РЕС- DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 липид:siRNA ~ 6:1
LNP0 6	2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/РЕС- DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 липид:siRNA ~ 11:1
LNP07	2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]— диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/РЕС- DMG 60/7,5/31/1,5, липид:siRNA ~ 6:1
LNP0 8	2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]— диоксолан (ХТС)	ХТС/ОБРС/холестерин/РЕб- DMG 60/7,5/31/1,5, липид:siRNA ~ 11:1
LNP0 9	2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]— диоксолан (ХТС)	ХТС/ОБРС/холестерин/РЕб- DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA 10:1
LNP10	(3aR,5s,бaS )-N,N-диметил-2,2ди((9Z,12Z)-октадека-9,12диенил) тетрагидро-ЗаН- циклопента[d][1,3]диоксол-5амин (ALN100)	ALNIOO/DSPC/холестерин/Р EG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA 10:1
LNP11	(6Z,9Z,28Z,31Z)- гептатриаконта-6,9,28,31тетраен-19-ил-4- (диметиламино)бутаноат (МСЗ)	мс- 3/DSPC/XonecTepnn/PEG- DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA 10:1

- 69 044245

	1, 1’-(2-(4-(2-( (2-(бис(2- гидроксидодецил)амино)этил)(2	Tech G1/DSPC/холестерин/PEG-
LNP12	гидроксидодецил)амино)этил)пи перазин-1- ил)этилазанедиил)дидодекан-2- ол (Tech G1)	DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA 10:1 XTC/DSPC/xon/PEG-DMG
LNP13	ХТС	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 33:1 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG
LNP14 LNP15	МСЗ МСЗ	40/15/40/5 липид:siRNA: 11:1 MC3/DSPC/xon/PEGDSG/GalNAc-PEG-DSG 50/10/35/4,5/0,5 липид:siRNA: 11:1 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG
LNP16	МСЗ	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1 МСЗ/ОЗРС/хол/РЕС-ОЗС
LNP17	МСЗ	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 10:1 МСЗ/DSPC/хол/PEG-DMG
LNP18	МСЗ	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 12:1 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG
LNP19	МСЗ	50/10/35/5 липид:siRNA: 8:1 MC3/DSPC/хол/PEG-DPG
LNP2 0	МСЗ	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 10:1 C12-200/DSPC/xon/PEG-DSG
LNP21	С12-200	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1 XTC/DSPC/xon/PEG-DSG
LNP22	ХТС	50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 10:1

DSPC: дистеароилфосфатидилхолин;

DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин;

PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (C14-PEG или PEG-C14) (PEG со ср. мол. весом 2000);

PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со ср. мол. весом 2000);

PEG-cDMA: PEG-карбамоил-1,2-димиристоилоксипропиламин (PEG со ср. мол. весом 2000).

Составы, содержащие SNALP (1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO 2009/127060, поданной 15 апреля 2009 г., которая, таким образом, включена при помощи ссылки.

ХТС-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/148366, поданной 29 января 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/156851, поданной 2 марта 2009 г.; предварительной заявке США, поданной 10 июня 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/228373, поданной 24 июля 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/239686, поданной 3 сентября 2009 г., и международной заявке № PCT/US2010/022614, поданной 29 января 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.

MC3-содержащие составы описаны, например, в публикации США № 2010/0324120, поданной 10 июня 2010 г., полное содержание которой, таким образом, включено при помощи ссылки.

ALNY-100-содержащие составы описаны, например, в международной заявке на патент с номером PCT/US09/63933, поданной 10 ноября 2009 г., которая, таким образом, включена при помощи ссылки.

- 70 044245

С12-200-содержащие составы описаны в предварительной заявке США с серийным № 61/175770, поданной 5 мая 2009 г., и международной заявке № PCT/US10/33777, поданной 5 мая 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.

Синтез ионизируемых/катионных липидов.

Любое из соединений, например, катионные липиды и т.п., используемые в частицах нуклеиновая кислота-липид по настоящему изобретению, можно получить при помощи известных методик органического синтеза, включая способы, описанные более подробно в примерах. Все заместители являются такими, как определено ниже, если не указано иное.

Алкил означает углеводород с прямой цепью или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п.; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; тогда как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и т.п.

Алкенил означает алкил, который определен выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Типичные алкенилы с прямой цепью и разветвленные алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2бутенил и т.п.

Алкинил означает любой алкил или алкенил, которые определены выше, которые дополнительно содержат по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Типичные алкинилы с прямой цепью и разветвленные алкинилы включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и т.п.

Ацил означает любой алкил, алкенил или алкинил, в которых атом углерода в точке присоединения замещен оксогруппой, которая определена ниже. Например, -С(=O)алкил, -С(=O)алкенил и С(=O)алкинил представляют собой ацильные группы.

Гетероцикл означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое, гетероциклическое кольцо, которое является либо насыщенным, ненасыщенным, либо ароматическим и которое содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота необязательно может быть кватернизирован, в том числе бициклические кольца, в которых любой из вышеперечисленных гетероциклов слит с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, которые определены ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п.

Выражения необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный ацил и необязательно замещенный гетероцикл означают, что при замещении по меньшей мере один атом водорода заменяется заместителем. В случае оксо-заместителя (=O) замещаются два атома водорода. В связи с этим, заместители включают оксо, галоген, гетероцикл, -CN, -OR^x, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO2R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SOnR^x и -SOnNR^xR^y, где n равняется 0, 1 или 2, R^x и R^y являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой водород, алкил или гетероцикл, и каждый из указанных заместителей алкила и гетероцикла дополнительно может быть замещен одним или несколькими из оксо, галогена, -ОН, -CN, алкила, -OR^x, гетероцикла, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO2R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -С(=O)NR^xR^y, -SOnR^x и -SOnNR^xR^y

Галоген означает фтор, хлор, бром и йод.

В некоторых вариантах осуществления в способах по настоящему изобретению может потребоваться использование защитных групп. Методика с использованием защитных групп хорошо известна специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Вкратце, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность функциональной группы. Защитную группу можно добавлять к функциональной группе для блокирования ее химической активности во время определенных реакций и затем удалять с открытием исходной функциональной группы. В некоторых вариантах осуществления применяют защитную группу для спиртовой группы. Защитная группа для спиртовой группы представляет собой любую группу, которая уменьшает или устраняет нежелательную химическую активность спиртовой функциональной группы. Защитные группы можно добавлять и удалять при помощи методик, хорошо известных в данной области.

- 71 044245

Синтез формулы А.

В некоторых вариантах осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид по настоящему изобретению составляют при помощи катионного липида формулы А:

^R3 \

где R¹ и R² независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, a R³ и R⁴ независимо представляют собой низший алкил или R³ и R⁴, могут быть совмещены для образовывания необязательно замещенного гетероциклического кольца. В некоторых вариантах осуществления катионный липид представляет собой ХТС, (2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан). Как правило, липид формулы А, приведенной выше, может быть получен при помощи следующих схем реакций 1 или 2, где все заместители являются такими, как определено выше, если не указано иное.

Схема 1

Полученный по схеме 1 липид А, где R¹ и R² независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, a R³ и R⁴ независимо представляют собой низший алкил или R³ и R⁴ могут быть совмещены для образовывания необязательно замещенного гетероциклического кольца. Кетон 1 и бромид 2 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 1 и 2 дает кеталь 3. Обработка кеталя 3 с амином 4 дает липиды формулы А. Липиды формулы А можно превращать в соответствующую аммонийную соль при помощи органической соли формулы 5, где X представляет собой анион, противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или т.п.

Схема 2.

В качестве альтернативы, исходный материал, кетон 1, может быть получен согласно схеме 2. Реактив Гриньяра 6 и цианид 7 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 6 и 7 дает кетон 1. Превращение кетона 1 в соответствующие липиды формулы А является таким, как описано на схеме 1.

Схема 2

Mg-R₁ 4 . о/'²

Ri ^!рз $2

Синтез MC3.

Получение DLin-M-C3-DMA (т.е. (62,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4(диметиламино)бутаноата) было следующим. Раствор (62,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен19-ола (0,53 г), гидрохлорида 4-N,N-диметиламиномасляной кислоты (0,51 г), 4-N,Nдиметиламинопиридина (0,61 г) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали

- 72 044245 разбавленной хлористоводородной кислотой, за которой следовал разбавленный водный бикарбонат натрия. Органические фракции высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель удаляли при помощи роторного вакуумного испарителя. Остаток проходил через колонку с силикагелем (20 г) с использованием градиента элюирования 1-5% метанол/дихлорметан. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и растворитель удаляли с получением бесцветного масла (0,54 г). Синтез ALNY-100

Синтез кеталя 519 [ALNY-100] осуществляли с использованием следующей схемы 3.

Схема 3

Синтез 515.

К перемешиваемой суспензии LiAlH₄ (3,74 г, 0,09852 моль) в 200 мл безводного THF в двугорлой RBF (1 л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моль) в 70 мл THF при 0°C в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем нагревали до появления конденсации в течение 4 ч. Течение реакции контролировали при помощи TLC. После завершения реакции (определяли при помощи TLC) смесь охлаждали до 0°C и гасили аккуратным добавлением насыщенного раствора Na₂SO₄. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и отфильтровывали. Остаток хорошо промывали THF. Фильтрат и осадок, полученный при промывке, смешивали, и разводили 400 мл диоксана и 26 мл конц. HCl, и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Летучие вещества отгоняли в вакууме с получением хлористоводородной соли 515 в виде белого твердого вещества. Выход: 7,12 г. ¹И-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ=9,34 (широкий, 2Н), 5,68 (с, 2Н), 3,74 (м, 1Н), 2,66-2,60 (м, 2Н), 2,50-2,45 (м, 5Н).

Синтез 516.

К перемешанному раствору соединения 515 в 100 мл сухого DCM в 250 мл двухгорлой RBF добавляли NEt₃ (37,2 мл, 0,2669 моль) и охлаждали до 0°C в атмосфере азота. После медленного добавления N(бензилокси-карбонилокси)-сукцинимида (20 г, 0,08007 моль) в 50 мл сухого DCM реакционной смеси позволяли нагреться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 ч, определяли при помощи TLC) смесь промывали последовательно раствором 1н. HCl (1x100 мл) и насыщенным раствором NaHCO₃ (1x50 мл). Органический слой затем высушивали над безводн. Na₂SO₄ и растворитель выпаривали с получением неочищенного материала, который очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем с получением 516 в виде липкой массы. Выход: 11 г (89%). ¹Н-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ=7,36-7,27 (м, 5Н), 5,69 (с, 2Н), 5,12 (с, 2Н), 4,96 (уш., 1Н) 2,74 (с, 3H), 2,60 (м, 2Н), 2,30-2,25 (м, 2Н). LC-MS [М+Н] - 232,3 (96,94%).

Синтез 517А и 517В.

Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моль) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорлой 500 мл RBF и к нему добавляли N-метил-морфолин-N-оксuд (7,6 г, 0,06492 моль), за которым следовали 4,2 мл 7,6% раствора OsO₄ (0,275 г, 0,00108 моль) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~ 3 ч) смесь гасили при помощи добавления твердого Na₂SO₃ и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разводили DCM (300 мл) и промывали водой (2x100 мл), после чего следовал насыщенный раствор NaHCO₃ (1x50 мл), вода (1x30 мл) и в конце соляной раствор (1x50 мл). Органическую фазу высушивали над безводн. Na2SO4 и растворитель удаляли в вакууме. В результате очистки неочищенного материала при помощи колоночной хроматографии с силикагелем получали смесь диастереоизомеров, которые разделяли при помощи преп. HPLC. Выход: - 6 г неочищенного продукта.

517А - пик-1 (белое твердое вещество), 5,13 г (96%). 1Н-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ=7,39-7,31 (м, 5Н), 5,04 (с, 2Н), 4,784,73 (м, 1Н), 4,48-4,47 (д, 2Н), 3,94-3,93 (м, 2Н), 2,71 (с, 3H), 1,72-1,67 (м, 4Н). LC-MS - [М+Н] 266,3, [M+NH4+] - 283,5 присутствует, HPLC-97,86%. Стереохимию подтверждали при помощи рентгенограммы.

Синтез 518.

При помощи процедуры, аналогичной описанной для синтеза соединения 505, соединение 518 (1,2 г, 41%) получали в виде бесцветного масла. ¹Н-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ=7,35-7,33 (м, 4Н), 7,30-7,27 (м, 1Н), 5,37-5,27 (м, 8Н), 5,12 (с, 2Н), 4,75 (м, 1Н), 4,58-4,57 (м, 2Н), 2,78-2,74 (м, 7Н), 2,06-2,00 (м, 8Н), 1,96-1,91 (м, 2Н), 1,62 (м, 4Н), 1,48 (м, 2Н), 1,37-1,25 (уш.м, 36Н), 0,87 (м, 6Н). HPLC - 98,65%.

Общая процедура для синтеза соединения 519.

Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) добавляли по каплям к охлажденному на льду

- 73 044245 раствору LAH в THF (1 М, 2 экв.). После завершения добавления смесь нагревали при 40°C в течение 0,5 ч, затем опять охлаждали на ледяной бане. Смесь аккуратно гидролизовали насыщенным водным Na₂SO₄, затем фильтровали через целит и переводили в масло. С помощью колоночной хроматографии получали чистое 519 (1,3 г, 68%), которое получали в виде бесцветного масла. ¹³С ЯМР δ=130,2, 130,1 (х2), 127,9 (х3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (х2), 29,7, 29,6 (х2), 29,5 (х3), 29,3 (х2), 27,2 (х3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; Electrospray MS (+ve): Молекулярный вес для C44H80NO2 (М+Н)+ вычисл. 654,6, обнаруженный 654,6.

Составы, полученные либо при помощи стандартного способа, либо при помощи способа без экструзии, характеризуются одинаковым образом. Например, составы, как правило, характеризуют при помощи визуального осмотра. Это должны быть белесые прозрачные растворы, в которых нет агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение частиц по размеру липидных наночастиц можно измерять при помощи рассеяния света, используя, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, США). Размер частиц должны быть примерно 20-300 нм, например, 40-100 нм. Распределение частиц по размеру должно быть одновершинным. Общую концентрацию dsRNA в составе, а также захваченную фракцию определяют при помощи анализа на исключение красителя. Образец составленной dsRNA можно инкубировать со связывающимся с РНК красителем, например Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или при отсутствии разрушающего состав поверхностно-активного вещества, например, 0,5% Triton-X100. Общую dsRNA в составе можно определять по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по отношению к калибовочной кривой. Захваченную фракцию определяют путем вычитания содержания свободной dsRNA (которое измерено по сигналу при отсутствии поверхностно-активного вещества) из общего содержания dsRNA. Процент захваченной dsRNA, как правило, составляет >85%. Для состава SNALP размер частиц составляет по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон, как правило, составляет от примерно по меньшей мере 50 нм до примерно по меньшей мере 110 нм, от примерно по меньшей мере 60 нм до примерно по меньшей мере 100 нм или от примерно по меньшей мере 80 нм до примерно по меньшей мере 90 нм.

Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, желатиновые капсулы, пакетики с порошком для приготовления раствора, таблетки или минитаблетки. Необходимыми могут быть загустители, ароматизирующие вещества, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие вещества. В некоторых вариантах осуществления пероральные составы являются такими, в которых dsRNA, описанные в настоящем изобретении, вводятся в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, поверхностно-активными вещества и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли желчных кислот включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил 1-монокапрат, 1додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). В некоторых вариантах осуществления используют комбинации веществ, способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли жирных кислот в комбинации с желчными кислотами/солями желчных кислот. Одной иллюстративной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. dsRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть доставлены перорально, в форме гранул, в том числе распыляемых высушенных частиц, или образуют комплексы с образованием микро- или наночастиц. Комплексообразующие средства для dsRNA включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-производные полиимины, поллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразующие средства включают хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (PTDAE), полиаминостирол (например, р-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианакрилат), поли(изобутилцианакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAEдекстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочную кислоту), сополимер DL- 74 044245 молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные составы для dsRNA и их получение описаны подробно в патенте США № 6887906, публикации США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.

Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), подоболочечного, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие соответствующие добавки, такие как, без ограничения, вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, без ограничения, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции могут быть получены из ряда компонентов, который включает, без ограничения, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. В частности, предпочтительными являются составы, которые целенаправленно воздействуют на печень при лечении заболеваний печени, таких как гепатокарцинома.

Фармацевтические составы по настоящему изобретению, которые в целях удобства могут находиться в виде единичной лекарственной формы, можно получать согласно традиционным методикам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию приведения активных ингредиентов во взаимодействие с фармацевтическим (фармацевтическими) носителем (носителями) или наполнителем (наполнителями). Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного приведения активных ингредиентов во взаимодействие с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, а затем, при необходимости, придания продукту формы.

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в любой из многих возможных лекарственных форм, как, например, без ограничения, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы, жидкие сиропы, пластичные гели, суппозитории и клизмы. Композиции по настоящему изобретению также могут быть составлены в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии дополнительно могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

С. Дополнительные составы.

i. Эмульсии.

Композиции по настоящему изобретению могут быть получены и составлены в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, являются гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой, в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешиваемые жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспрегированные одна в другой. Как правило, эмульсии могут быть эмульсиями по типу либо вода в масле (w/o), либо масло в воде (o/w). В тех случаях, когда водная фаза является мелкораспыленной в общем объеме масляной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу вода в масле (w/o). В качестве альтернативы, в тех случаях, когда масляная фаза является мелкораспыленной в общем объеме водной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу масло в воде (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты вдобавок к диспергированным фазам и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, масляной фазе либо как таковое в качестве отдельной фазы. Фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, могут присутствовать в эмульсиях при необходимости. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят из более чем двух фаз, такие как, например, в случае эмульсий по типу масло-в-воде-в-масле (o/w/o) и вода-в-масле-вводе (w/o/w). Такие сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двухкомпонентные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии o/w включают маленькие водные капельки, составляют эмульсию w/o/w. Аналогично этому система масляных капелек, заключенная в каплях воды, стабилизированных в масляной диспергирующей фазе, обеспечивает эмульсию o/w/o.

Эмульсии характеризуются малой термодинамической устойчивостью либо ее отсутствием. Часто диспергированная или дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергирована в дисперсионной или диспер- 75 044245 гирующей фазе и поддерживается в такой форме при помощи эмульгаторов или вязкости состава. Любая фаза эмульсии может быть полутвердой или твердой, как и в случае подобных эмульсии мазевых основ и кремов. Другие способы стабилизации эмульсий охватывают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы в целом могут быть классифицированы на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные базы и высокодисперные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich NG., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как сурфактанты, нашли широкое применение в составе эмульсий и были рассмотренны в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Соотношение гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активного вещества называют гидролипидным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом в распределении на категории и выборе поверхностно-активных веществ при получении составов. Поверхностноактивные вещества можно классифицировать на различные классы, исходя из природы гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).

Встречающиеся в природе эмульгаторы, используемые в составах эмульсий, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбционные базы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий w/o, при этом сохраняя свою полутвердую консистенцию. Мелкоизмельченные твердые вещества также использовали в качестве подходящих эмульгаторов в особенности в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерила тристеарат.

Большое разнообразие неэмульгирующих материалов также включают в составы эмульсий и улучшают свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, жирные сложные эфиры, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновую кислоту, каррагенан, гуаровую камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии путем образования крепких межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы и путем повышения вязкости дисперсионной фазы.

Поскольку эмульсии часто содержат некоторое количество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, то такие составы часто включают консерванты. Широко используемые консерванты, включенные в составы эмульсий, включают метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, бензалкония хлорид, сложные эфиры ргидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют к составам эмульсий для предупреждения разрушения состава. Используемые антиоксиданты могут быть ловушками свободных радикалов, как, например, токоферолы, алкил галлаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановителями, такими как аскорбиновая кислота и матабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, такими как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.

Применение составов эмульсий посредством дерматологического, перорального и парентерального путей и способы их получения были рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Составы эмульсий для пероральной доставки очень широко применяют из-за удобства составления, а также с позиции эффективности при

- 76 044245 абсорбции и биооступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные средства на основе минеральных масел, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира находятся среди материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий o/w.

ii. Микроэмульсии.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции иРНК и нуклеиновые кислоты составлены в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система воды, масла и амфифильного вещества, которая является отдельным оптически изотропным и термодинамически устойчивым жидким раствором (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсии являются системами, которые получают путем сперва диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавления достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта со средней длиной цепи для образования прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также были описаны как термодинамически устойчивые, изотропически чистые дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, в Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Является ли микроэмульсия эмульсией по типу вода в масле (w/o) или по типу масло в воде (o/w), зависит от свойств используемого масла и поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностноактивного вещества (Schott, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

Активно изучался феноменологический подход с использованием фазовой диаграммы, и с его помощью специалистами в данной области были получены обширные данные о том, как составлять микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению с традиционными эмульсиями микроэмульсии имеют преимущество стабилизации водонерастворимых лекарственных средств в составе термодинамически устойчивых капелек, которые образуются самопроизвольно.

Поверхностно-активные вещества, используемые в получении микроэмульсий, включают без ограничения ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, полиокиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, тетраглицерина монолаурат (ML310), тетраглицерина моноолеат (МО310), гексаглицерина моноолеат (РО310), гексаглицерина пентаолеат (РО500), декаглицерина монокапрат (МСА750), декаглицерина моноолеат (МО750), декаглицерина секвиолеат (SO750), декаглицерина декаолеат (DAO750) отдельно или в комбинации с вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно являющееся спиртом с короткой цепью, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести путем проникновения в пленку из поверхностно-активного вещества и соответственно создания неупорядоченной пленки из-за пустого пространства, образующегося среди молекул поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без применения вторичных поверхностно-активных веществ, и в данной области известны самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий без спирта. Водной фазой, как правило, может быть вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать, без ограничения, материалы, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (С₈-С₁₂) моно-, ди- и триглицериды, полиоксиэтилированные сложные эфиры жирных кислот и глицерила, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С₈-С₁₀-глицериды, растительные масла и силиконовое масло.

Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости лекарственного средства и повышенной абсорбции лекарственных средств. Липидные микроэмульсии (как o/w, так и w/o) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества в виде улучшенной растворимости лекарственного средства, за

- 77 044245 щиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного увеличения абсорбции лекарственного средства за счет индуцированных поверхностно-активным веществом изменений текучести мембран и проницаемости, удобства получения, удобства перорального введения по сравнению с твердой лекарственной формой, улучшенной клинической действенности и пониженной токсичности (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться самопроизвольно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающего воздуха. Это может быть в особенности полезным, когда составляют термолабильные лекарственные средства, пептиды или иРНК. Микроэмульсии также были эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов как при косметических, так и при фармацевтических применениях. Предполагается, что композиции и составы микроэмульсий по настоящему изобретению будут способствовать повышенной системной абсорбции иРНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальное клеточное поглощение иРНК и нуклеиновых кислот.

Микроэмульсии по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), Labrasol и вещества, способствующие проникновению, для улучшения свойств состава и для повышения абсорбции иРНК и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Вещества, способствующие проникновению, используемые в микроэмульсиях по настоящему изобретению, могут классифицироваться, как принадлежащие одной из пяти основных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие неповерхностно-активные вещества (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов был рассмотрен выше.

iii. Микрочастицы.

Средство RNAi по настоящему изобретению может быть включено в частицу, например, микрочастицу. Микрочастицы можно получать при помощи сушки распылением, но также можно получать другими способами, в том числе лиофилизацией, выпариванием, сушкой в псевдосжиженном слое, сушкой в вакууме или при помощи комбинации этих методик.

iv. Вещества, способствующие проникновению.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении применяют разнообразные вещества, способствующие проникновению, для воздействия на эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности иРНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной формах. Однако, как правило, только жирорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрана, через которую проходит проникновения, обработана веществом, способствующим проникновению. Вдобавок к обеспечению диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны вещества, способствующие проникновению, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.

Вещества, способствующие проникновению, можно классифицировать как принадлежащие одной из пяти основных категорий, т.е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатриующие неповерхностно-активные вещества (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из вышеуказанных классов веществ, способствующих проникновению, описан ниже более подробно.

Поверхностно-активные вещества (или сурфактанты) являются химическими структурными единицами, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего повышается абсорбция иРНК через слизистую. Вдобавок к солям желчных кислот и жирным кислотам, вещества, способствующие проникновению, включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфорированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Разнообразные жирные кислоты и их производные, которые действуют как вещества, способствующие проникновению, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (ндекановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин 1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их C1_₂₀ алкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и t-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миистат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (см., например, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 133; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

- 78 044245

Физиологическая роль желчи включает содействие в распределении и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как вещества, способствующие проникновению. Таким образом, выражение соли желчных кислот включают любые встречающиеся в природе компоненты желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (глихолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидро-фузидат (STDHF) натрия, гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Хелатирующие средства, используемые применительно к настоящему изобретению, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металла из раствора путем образования комплексов с ними, в результате чего абсорбция иРНК через слизистую повышается. В отношении их применения в качестве веществ, способствующих проникновению, в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительным преимуществом, также выступая в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку большинство охарактеризованных ДНК-нуклеаз требуют двухвалентный ион металла для катализа и, таким образом, ингибируются хелатирующими средствами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают, без ограничения, двунатриевый этилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомовалинат), Nацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) (см., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

Применяемые в данном документе нехелатирующие неповерхностно-активные соединения, способствующие проникновению, могут быть определены как соединения, которые проявляют небольшую активность в качестве хелатирующих средств или в качестве поверхностно-активных веществ, но которые тем не менее повышают абсорбцию иРНК через слизистую пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс веществ, способствующих проникновению, включает, например, ненасыщенные цикломочевины, производные 1-алкили 1-алкенилазацикло-алканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Средства, которые усиливают поглощение иРНК на клеточном уровне, также можно добавлять к фармацевтическим и другим композициям по настоящему изобретению. Например, катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al, патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка РСТ WO 97/30731), так же, как известно, усиливают клеточное поглощение dsRNA. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции включают среди прочего, например, Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), 293fectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Cellfectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), DMRIE-C™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Freestyle™ MAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), RNAiMAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Oligofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Optifect™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Грензахерштрассе, Швейцария) или Fugene (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент Transfectam® (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-20 (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-50 (Promega; Мэдисон, Висконсин), DreamFect™ (OZ Biosciences; Марсель, Франция), EcoTransfect (OZ Biosciences; Марсель, Франция), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс, США), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; Сан-Диего, Калифорния, USA), реагент для трансфекции PerFectin (Genlan

- 79 044245 tis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlantis; СанДиего, Калифорния, США), RiboFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), PlasFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), UniFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США), SureFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США) или HiFect™ (B-Bridge International, Маунтин-Вью, Калифорния, США).

Для усиления проникновения введенных нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, в том числе гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.

v. Носители.

Определенные композиции по настоящему изобретению также содержат в составе соединенияносители. Применяемые в данном документе выражения соединение-носитель или носитель могут означать нуклеиновую кислоту или ее аналог, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью per se), но распознаются в качестве нуклеиновой кислоты in vivo процессами, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты с биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или путем содействия ее удалению из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может привести к существенному сокращению количества нуклеиновой кислоты, перерабатываемой печенью, почками или другими внесосудистыми депо, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, переработка частично фосфотиоатной dsRNA печеночной тканью может быть снижена при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4' изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфокислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.

vi. Наполнители.

В отличие от соединения-носителя фармацевтический носитель или наполнитель представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любую другую фармакологически инертную среду для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым веществом и его выбирают с учетом предполагаемого способа введения с тем, чтобы обеспечить необходимый объем, консистенцию и т.д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие средства (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или вторичный кислый фосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металла, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмалгликолат и т.д.); и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).

Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не реагируют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами, также можно применять для составления композиций по настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

Составы для местного применения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно использовать фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.

Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

vii. Другие компоненты.

Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно встречающиеся в фармацевтических композициях, при уровнях применения, установленных в данной области. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнитель

- 80 044245 ные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, пригодные для физического составления композиций по настоящему изобретению в различных лекарственных формах, такие как красители, ароматизирующие вещества, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако, такие материалы при добавлении не должны чрезмерно вступать в конфликт с биологическими активностями компонентов композиций по настоящему изобретению. Составы могут быть стерильными и, при необходимости, их можно смешивать со вспомогательными средствами, например, смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями для оказания влияния на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, ароматизаторами и/или душистыми веществами и т.п., которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой (нуклеиновыми) кислотой (кислотами) состава.

Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают (а) одно или несколько соединений, представляющих собой иРНК, и (b) одно или несколько средств, которые действуют по механизму, отличному от RNAi, и которые пригодны в лечении гемолитического нарушения. Примеры таких средств включают, без ограничения, противовоспалительное средство, средства против стеатоза, противовирусное средство и/или средство против фиброза. Кроме того, другие вещества, обычно используемые для защиты печени, такие как силимарин, также можно использовать в сочетании с иРНК, описанными в данном документе. Другие средства, пригодные для лечения заболеваний печени, включают телбивудин, энтекавир и ингибиторы протеазы, такие как телапревир и другие, раскрытые, например, в публикациях заявок на патент США №№ 2005/0148548, 2004/0167116 и 2003/0144217, Tung et al., и в публикации заявки на патент США № 2004/0127488, Hale et al.

Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим действием является терапевтическим индексом, и его можно выражать как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительными являются соединения, которые характеризуются высоким терапевтическим индексом.

Данные, полученные при анализах клеточных культур и исследованиях на животных, можно использовать при составлении ряда доз для применения у людей. В настоящем изобретении доза композиций, описанных в данном документе, как правило, находится в диапазоне циркулирующих концентраций, который включают ED₅₀ с малой токсичностью или без таковой. Доза может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, применяемого в способах, описанных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно первоначально установить по результатам анализов клеточных культур. Доза может быть составлена для животных моделей для получения диапазона концентрации циркулирующего в плазме соединения или, при необходимости, полипептидного продукта целевой последовательности (например, достижения уменьшенной концентрации полипептида), что включает IC₅₀ (т.е. концентрацию исследуемого соединения, при помощи которой достигают полумаксимальное ингибирование симптомов), как устанавливают в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодной дозы у людей. Уровни в плазме можно измерять, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В дополнении к их введению, рассматриваемому выше, иРНК, описанные в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными в лечении патологических процессов, опосредованных экспрессией С5. В любом случае, курирующий врач может корректировать количество и временные рамки введения иРНК, исходя из результатов, наблюдаемых при использовании стандартных средств измерения эффективности, известных в данной области или описанных в данном документе.

VI. Способы ингибирования экспрессии С5.

Настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии С5 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством RNAi, например, двухцепочечным средством RNAi, в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии С5 в клетке, ингибируя, таким образом, экспрессию С5 в клетке.

Приведение клетки в контакт с двухцепочечным средством RNAi можно выполнять in vitro или in vivo. Приведение клетки в контакт со средством RNAi in vivo включает приведение клетки или группы клеток субъекта, например, субъекта-человека, в контакт со средством RNAi. Также возможны комбинации in vitro и in vivo способов приведения в контакт. Приведение в контакт может быть непосредственным или опосредованным, как рассматривалось выше. Более того, приведение в контакт клетки можно

- 81 044245 выполнять посредством нацеливающего лиганда, в том числе любого лиганда, описанного в данном документе или известного в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой углеводный фрагмент, например лиганд, представляющий собой

GalNAc₃, или любой другой лиганд, который направляет средство RNAi к месту, представляющему интерес, например, печени субъекта.

Выражение ингибирование, применяемое в данном документе, используют взаимозаменяемо с сокращением, сайленсингом, понижающей регуляцией и другими подобными выражениями, и оно включает любой уровень ингибирования.

Подразумевают, что фраза ингибирование экспрессии С5 означает ингибирование экспрессии любого гена С5 (такого как, например, ген С5 мыши, ген С5 крысы, ген С5 обезьяны или ген С5 человека), а также вариантов или мутантов гена С5. Таким образом, ген С5 может быть геном С5 дикого типа, мутантным геном С5 или трансгенным геном С5 в контексте клеток, группы клеток или организма, подвергнутых генетической манипуляции.

Ингибирование экспрессии гена С5 включает любой уровень ингибирования гена С5, например, по меньшей мере частичную супрессию экспрессии гена С5. Экспрессия гена С5 может быть оценена на основании уровня или изменения уровня любой переменной, связанной с экспрессией гена С5, например, уровня мРНК С5, уровня белка С5 или, например, СН₅₀ активности, как меры общей гемолитической активности комплемента, АН₅₀ для измерения гемолитической активности альтернативного пути комплемента и/или уровня лактатдегидрогеназы (LDH), как меры внутрисосудистого гемолиза и/или уровня гемоглобина. Уровни С5а-, С5Ь- и растворимого С5b-9-комплекса также можно измерять для оценки экспрессии С5. Данный уровень можно оценивать в отдельной клетке или в группе клеток, в том числе, например, образце, полученном от субъекта.

Ингибирование можно оценивать по снижению абсолютного или относительного уровня одной или нескольких переменных, которые связаны с экспрессией С5, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольным уровнем может быть любой тип контрольного уровня, который используют в области техники, например, исходный уровень до введения препарата или уровень, определенный у подобного субъекта, клетки или образца, которые не обработаны или обработаны контролем (таким как, например, контроль только с буфером или контроль с неактивным средством).

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению экспрессия гена С5 ингибируется по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%.

Доказательством ингибирования экспрессии гена С5 может служить снижение количества мРНК, экспрессируемой первой клеткой или первой группой клеток (такие клетки могут присутствовать, например, в образце, полученном от субъекта), в которых транскрибируется ген С5 и которую или которые обрабатывали (например, посредством приведения клетки или клеток в контакт со средством RNAi по настоящему изобретению или посредством введения средства RNAi по настоящему изобретению субъекту, в организме которого клетки находятся или находились), так что экспрессия гена С5 ингибируется по сравнению со второй клеткой или второй группой клеток, по сути, идентичных первой клетке или группе клеток, но которую или которые не обрабатывали (контрольная(ые) клетка(и)). В предпочтительных вариантах осуществления ингибирование оценивают посредством выражения уровня мРНК в обработанных клетках как процент от уровня мРНК в контрольных клетках с помощью следующей формулы:

(уровень мРНК в контрольных точках) - (уровень мРНК в обработанных клетках) (уровень мРНК в контрольных точках)

В альтернативном случае, ингибирование экспрессии гена С5 можно оценивать по снижению показателя, который функционально связан с экспрессией гена С5, например, экспрессией белка С5, экспрессией гена или белка гепсидина, или уровенем железа в тканях или сыворотке. Сайленсинг гена С5 можно выявить в любой клетке, экспрессирующей С5, либо конститутивно, либо при помощи генной инженерии, и с помощью любого анализа, известного в данной области. Печень является основным местом экспрессии С5. Другие важные места экспрессии включают почки и матку.

Доказательством ингибирования экспрессии белка С5 может служить снижение уровня белка С5, который экспрессируется клеткой или группой клеток (например, уровня белка, экспрессируемого в об- 82 044245 разце, полученном от субъекта). Как объяснялось выше в отношении оценки супрессии мРНК, ингибирование уровней экспрессии белка в обработанной клетке или группе обработанных клеток можно аналогично выражать как процент от уровня белка в контрольной клетке или группе контрольных клеток.

Контрольная клетка или группа контрольных клеток, которые можно применять для оценки ингибирования экспрессии гена С5, включают клетку или группу клеток, которые еще не были в контакте со средством RNAi по настоящему изобретению. Например, контрольная клетка или группа контрольных клеток могут быть получены от отдельного субъекта (например, субъекта-человека или субъектаживотного) перед лечением субъекта средством RNAi.

Уровень мРНК С5, которая экспрессируется клеткой или группой клеток, можно определять при помощи любого способа, известного в данной области, для оценки экспрессии мРНК. В одном варианте осуществления уровень экспрессии С5 в образце определяют путем выявления транскрибируемого полинуклеотида или его части, например, мРНК гена С5. РНК можно извлекать из клеток при помощи методик извлечения РНК, включая, например, извлечение с помощью кислого фенола/гуанидинизотиоцианата (RNAzol В; Biogenesis), наборы для получения РНК RNeasy (Qiagen) или PAXgene (PreAnalytix, Швейцария). Типичные форматы анализов, в которых используется гибридизация рибонуклеиновых кислот, включают ядерные run-on анализы, RT-PCR, анализы защиты от РНКаз (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), нозерн-блоттинг, гибридизацию in situ и микроматричные анализы.

В одном варианте осуществления уровень экспрессии С5 определяют при помощи зонда для нуклеиновой кислоты. Выражение зонд, применяемое в данном документе, означает любую молекулу, которая способна селективно связываться со специфическим С5. Зонды могут быть синтезированы специалистом в данной области техники или получены из соответствующих биологических препаратов. Могут быть особым образом сконструированы зонды, содержащие метку. Примеры молекул, которые можно использовать в качестве зондов, включают, без ограничения, РНК, ДНК, белки, антитела и органические молекулы.

Выделенные мРНК можно использовать при анализах на основе гибридизации или амплификации, которые включают, без ограничения, анализы, представляющие собой саузерн- или нозерн-блоттинг, анализы, представляющие собой полимеразную цепную реакцию (PCR), и матрицы с зондами. Один способ определения уровней мРНК включает приведение выделенной мРНК в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК С5. В одном варианте осуществления мРНК иммобилизуют на твердой поверхности и приводят в контакт с зондом, например, путем пропускания выделенной мРНК через агарозный гель и переноса мРНК из геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза. В альтернативном варианте осуществления зонд(ы) иммобилизуют на твердой поверхности и мРНК приводят в контакт с зондом(ами), например, на генном микрочипе Affymetrix. Специалист в данной области может легко адаптировать известные способы обнаружения мРНК для применения в определении уровней мРНК С5.

Альтернативный способ определения уровня экспрессии С5 в образце включает способ амплификации нуклеиновой кислоты и/или обратной транскрипции (с получением кДНК), например, мРНК в образце, например, при помощи RT-PCR (экспериментальный вариант осуществления изложен в Mullis, 1987, патенте США № 4683202), лигазной цепной реакции (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), самоподдерживающейся репликации последовательностей (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), транскрипционно-опосредованной амплификационной системы (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-бета репликазы (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), репликации по типу катящегося кольца (Lizardi et al., патент США № 5854033), или любой другой способ амплификации нуклеиновой кислоты, за которым следует обнаружение амплифицированных молекул при помощи методик, хорошо известных специалисту в данной области. Такие схемы обнаружения особенно пригодны для обнаружения молекул нуклеиновой кислоты, если такие молекулы присутствуют в очень малых количествах. В конкретных аспектах по настоящему изобретению уровни экспрессии С5 определяют при помощи флуорогенной RT-PCR (т.е. системы TaqMan™ System).

Уровни экспрессии мРНК С5 можно контролировать при помощи мембранного блота (как, например, используемого при анализе гибридизации, такого как нозерн, саузерн, дот и т.п.) или микролунок, опытных пробирок, гелей, гранул или волокон (или любой твердой подложки, содержащей связанную нуклеиновую кислоту). См. патенты США №№ 5770722, 5874219, 5744305, 5677195 и 5445934, которые включены в данный документ при помощи ссылки. Определение уровня экспрессии С5 также может включать применение зондов для нуклеиновой кислоты в растворе.

В предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии мРНК оценивают с применением анализов с разветвленной ДНК (bDNA) или PCR в режиме реального времени (qPCR). Применение таких способов описано и проиллюстрировано в разделе Примеры, представленном в данном документе.

Уровень экспрессии белка С5 можно определить, применяя любой способ, известный в данной области для измерения уровней белка. Такие способы включают, например, электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), тонкослойную хроматографию (TLC), гипердиффузионную хроматографию, реакции преципитации в жидкости или геле, абсорбцион- 83 044245 ную спектроскопию, колориметрические анализы, спектрофотометрические анализы, проточную цитометрию, иммунодиффузию (одиночную или двойную), иммуноэлектрофорез, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммунофлюоресцентные анализы, электрохемилюминисцентные анализы и т.п.

Выражение образец, применяемое в данном документе, означает отбор похожих жидкостей, клеток или тканей, выделенных из организма субъекта, а также жидкостей, клеток или тканей, присутствующих в организме субъекта. Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку и серозные жидкости, плазму, лимфу, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, внутриглазные жидкости и т.п. Образцы тканей могут включать образцы из тканей, органов или локальных участков. Например, образцы можно получить из конкретных органов, частей органов или жидкостей или клеток в этих органах. В определенных вариантах осуществления образцы можно получить из печени (например, всей печени, или определенных сегментов печени, или определенных типов клеток в печени, таких как, например, гепатоциты). В предпочтительных вариантах осуществления образец, полученный от субъекта означает кровь или плазму, полученные от субъекта. В дополнительных вариантах осуществления образец, полученный от субъекта означает ткань печени, полученную от субъекта.

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению средство RNAi вводят субъекту так, что средство RNAi доставляется к конкретному месту в организме субъекта. Ингибирование экспрессии С5 можно оценивать при помощи измерений уровня или изменения уровня мРНК С5 или белка С5 в образце, полученном из жидкости или ткани из конкретного места в организме субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления местом является печень. Местом также может быть подсекция или подгруппа клеток из любого из указанных выше мест. Место также может включать клетки, которые экспрессируют конкретный тип рецептора.

Фраза приведение клетки в контакт со средством RNAi, таким как dsRNA, применяемая в данном документе, включает приведение клетки в контакт любым возможным способом. Приведение клетки в контакт со средством RNAi включает приведение клетки в контакт с иРНК in vitro или приведение клетки в контакт с иРНК in vivo. Приведение в контакт можно осуществлять непосредственно или опосредованно. Таким образом, например, средство RNAi можно приводить в физический контакт с клеткой путем отдельного осуществления способа или, в качестве альтернативы, средство RNAi можно поместить в обстановку, которая позволит средству прийти в контакт с клеткой или послужит причиной этому.

Приведение клетки в контакт in vitro можно выполнять, например, путем инкубирования клетки со средством RNAi. Приведение клетки в контакт in vivo можно выполнять, например, путем введения инъекцией средства RNAi в ткань, в которой находится клетка, или рядом с ней или путем введения инъекцией средства RNAi в другую область, например, кровоток или подкожное пространство так, что средство будет впоследствии достигать ткани, в которой находится клетка, которую необходимо привести в контакт со средством. Например, средство RNAi может содержать лиганд и/или может быть связано с ним, например, GalNAc₃, который направляет средство RNAi к месту, представляющему интерес, например, к печени. Также возможны комбинации in vitro и in vivo способов приведения в контакт. Например, клетку также можно приводить в контакт со средством RNAi in vitro и в дальнейшем пересаживать субъекту.

В одном варианте осуществления приведение клетки в контакт с иРНК включает введение или доставку иРНК в клетку, облегчая или осуществляя поглощение или абсорбцию в клетку. Абсорбция или поглощение иРНК может происходить путем произвольных диффузных или активных клеточных процессов, или с помощью вспомогательных средств или устройств. Введение иРНК в клетку может быть in vitro и/или in vivo. Например, для введения in vivo иРНК может быть введена парентерально в участок ткани или введена системно. Доставку in vivo можно осуществить с помощью системы доставки бета-глюкан, таких как описаны в патентах США №№ 5032401 и 5607677, а также публикации № US 2005/0281781, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. Введение в клетку in vitro включает способы, известные в данной области техники, такие как электропорация и липофекция. Дальнейшие подходы описаны в данном документе ниже и/или как известны в данной области техники.

VII. Способы лечения или предотвращения заболевания, связанного с компонентом комплемента С5.

Настоящее изобретение обеспечивает также терапевтические и профилактические способы, включаюшие введение субъекту, страдающиему заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS, средства, представляющего собой иРНК, фармацевтической композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, или вектора, содержащего иРНК, по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящего изобретения способы дополнительно включают введение субъекту дополнительного терапевтического средства, такого как антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, экулизумаба).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS. Способы лечения (и при- 84 044245 менения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например, человеку, терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой иРНК, нацеленного на ген С5, или фармацевтической композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, нацеленной на ген С5, тем самым осуществляя лечение субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS, которые включают введение субъекту, например, человеку, терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой иРНК, нацеленного на ген С5, или фармацевтической композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, нацеленное на ген С5, и дополнительного терапевтического средства, такого как антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, экулизумаба), тем самым осуществляя лечение субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства, представляющего собой иРНК, например, dsRNA, или вектора по настоящему изобретению, предотвращая тем самым по меньшей мере один симптом у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие. Например, настоящее изобретение предлагает способы предотвращения гемолиза субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства, представляющего собой иРНК, например, dsRNA, или вектора по настоящему изобретению, и дополнительного терапевтического средства, такого как антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, экулизумаба), предотвращая тем самым по меньшей мере один симптом у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

Терапевтически эффективное количество, применяемое в данном документе, подразумевают как включающее количество средства RNAi или антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, экулизумаба), которого при введении субъекту, страдающему заболеванием, связанным с С5, достаточно для эффективного лечения заболевания (например, путем уменьшения, ослабления или поддержания существующего заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания).

Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от средства RNAi, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, пути введения средства, заболевания и его тяжести и анамнеза, возраста, веса, семейного анамнеза, генетического строения, типов предшествующего или сопутствующего лечения, при наличии такового, и других индивидуальных особенностей субъекта, который подлежит лечению.

Профилактически эффективное количество, применяемое в данном документе, подразумевают как включающее количество средства RNAi или антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, экулизумаба), которого при введении субъекту, страдающему заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, но еще (или в настоящее время) не испытавшему или не демонстрирующему симптомы заболевания, и/или который представляет собой объект риска развития заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, например, субъекту, страдающему реакцией отторжения трансплантата и/или после пересадки, например, сенсибилизированное или аллогенное отторжение, субъекту с сепсисом и/или субъекту с инфарктом миокарда, достаточно для предупреждения или ослабления заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания. Ослабление заболевания включает замедление течения болезни или снижение тяжести заболевания, которое разовьется позже. Профилактически эффективное количество может варьировать в зависимости от средства, представляющего собой иРНК, или антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента, пути введения средства, антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента, степени риска развития заболевания и анамнеза заболевания, возраста, веса, семейного анамнеза, генетического строения, типов предшествующего или сопутствующего лечения, при наличии такового, и других индивидуальных особенностей пациента, который подлежит лечению.

Терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество также включает количество средства RNAi или антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязы- 85 044245 вающего фрагмента (например, экулизумаба), которое вызывает некоторый желательный локальный или системный эффект при приемлемом соотношении польза/риск, принятом по отношению к любому лечению. Средства, представляющие собой иРНК, применяемые в способах по настоящему изобретению можно вводить в количестве, достаточном для получения приемлемого соотношения польза/риск, принятого по отношению к такому лечению.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой иРНК, по настоящему изобретению при лечении субъекта, например, субъекта, у которого снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой иРНК, по настоящему изобретению и дополнительного терапевтического средства, например, антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, экулизумаба) при лечении субъекта, например, субъекта, у которого снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению средства, представляющего собой иРНК, например, dsRNA, по настоящему изобретению, нацеленного на ген С5, или фармацевтической композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, нацеленное на ген С5, при производстве лекарственного средства для лечении субъекта, например, субъекта, у которого снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, такого как субъект, страдающий заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению средства, представляющего собой иРНК, например, dsRNA, по настоящему изобретению, нацеленного на ген С5, или фармацевтической композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, нацеленное на ген С5, при производстве лекарственного средства для применения в комбинации с дополнительным терапевтическим средством, таким как антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, экулизумаб), для лечения субъекта, например, субъекта, у которого снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, с заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению иРНК, например, dsRNA по настоящему изобретению для предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению средства, представляющего собой иРНК, например, dsRNA по настоящему изобретению и дополнительного терапевтического средства, такого как антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, экулизумаб), для предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению средства, представляющего собой иРНК, по настоящему изобретению при производстве лекарственного средства для предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению средства, представляющего собой иРНК, по настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для применения в комбинации с дополнительным терапевтическим средством, таким как антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, экулизумаб), для предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, при котором снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS.

В одном варианте осуществления средство, представляющее собой иРНК, нацеленное на С5, вводят субъекту, страдающему заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, таким образом, что уровни С5, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой ткани или жидкости субъекта снижаются на по меньшей мере приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%,

41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%,

60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,

79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98% или по меньшей мере приблизительно 99% или более, и затем вводят субъекту дополнительное терапевтическое средство (как описано ниже).

Дополнительное терапевтическое средство может быть антителом к компоненту комплемента С5,

- 86 044245 или его антигенсвязывающим фрагментом, или его производным. В одном варианте осуществления антитело к компоненту комплемента С5 представляет собой экулизумаб (SOLIRIS®), или его антигенсвязывающий фрагмент, или его производное. Экулизумаб представляет собой гуманизированный моноклональный IgG2/4, легкую каппа-цепь антитела, который специфически связывается с компонентом комплемента С5 с высокой аффинностью и ингибирует расщепление С5 до С5а и С5Ь, тем самым ингибируя образование конечного комплекса комплемента С5Ь-9. Экулизумаб описан в патенте США № 6355245, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки.

Способы по настоящему изобретению, включающие введение субъекту средства, представляющего собой иРНК, по настоящему изобретению и экулизумаба, могут дополнительно содержать введение субъекту менингококковой вакцины.

Дополнительное терапевтическое средство, например, экулизумаб и/или менингококковую вакцину можно вводить субъекту одновременно со средством, представляющим собой иРНК, нацеленным на С5, или в разное время.

Кроме того, дополнительное терапевтическое средство, например, экулизумаб, можно вводить субъекту в одном составе со средством, представляющим собой иРНК, нацеленным на С5, или в другом составе, как средство, представляющее собой иРНК, нацеленное на С5.

Схема приема экулизумаба описана, например, в инструкции на продукт экулизумаб (SOLIRIS®) и в заявке на патент США № 2012/0225056, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки. В иллюстративных способах по настоящему изобретению для лечения заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, например, PNH или aHUS, средство, представляющее собой иРНК, нацеленное на С5, сперва вводят (например, подкожно) субъекту таким образом, что уровни С5 у субъекта уменьшаются (например, на по меньшей мере приблизительно 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%,

42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,

61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,

80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% или более), а затем вводят экулизумаб в дозах, меньших, чем описаны в инструкции на продукт SOLIRIS®. Например, экулизумаб можно вводить субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 900 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 900 мг приблизительно каждые две недели после этого. Экулизумаб также можно вводить субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 900 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через приблизительно одну неделю менее чем приблизительно 1200 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 1200 мг приблизительно каждые две недели после этого. Если субъект младше 18 лет, экулизумаб можно вводить субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 900 мг в течение 4 недель с последующей пятой дозой через одну неделю в дозе менее чем приблизительно 1200 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 1200 мг приблизительно каждые две недели после этого; или если субъект младше 18 лет, экулизумаб можно вводить субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой через приблизительно одну неделю в дозе менее чем приблизительно 900 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 900 мг каждые две недели после этого; или если субъект младше 18 лет, экулизумаб можно вводить субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 2 недель с последующей третьей дозой приблизительно через одну неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 600 мг приблизительно каждые две недели после этого; или если субъект младше 18 лет, экулизумаб можно вводить субъекту в раз неделю в дозе менее чем приблизительно 600 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю в дозе менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого; или если субъект младше 18 лет, экулизумаб можно вводить субъекту раз в неделю в дозе менее чем приблизительно 300 мг в течение 1 недели с последующей второй дозой через приблизительно одну неделю в дозе менее чем приблизительно 300 мг, а затем в дозе менее чем приблизительно 300 мг приблизительно каждые две недели после этого. Если объекту проводят плазмоферез или замещение плазмы, экулизумаб можно вводить субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг (например, если последняя доза экулизумаба составила приблизительно 300 мг) или меньше, чем приблизительно 600 мг (например, если последняя доза экулизумаба составила приблизительно 600 мг или более). Если объекту проводят инфузию плазмы, экулизумаб можно вводить субъекту в дозе менее чем приблизительно 300 мг (например, если последняя доза экулизумаба составила приблизительно 300 мг или более). Более низкие дозы экулизумаба можно вводить либо подкожно, или внутривенно.

При комбинированной терапии по настоящему изобретению, включающей экулизумаб, экулизумаб можно вводить субъекту, например, подкожно в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, или от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг. Например, экулизумаб можно вводить субъекту, например, подкожно в дозе

- 87 044245

0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 2,5 мг/кг, 3 мг/кг, 3,5 мг/кг, 4 мг/кг, 4,5 мг/кг, 5 мг/кг, 5,5 мг/кг, мг/кг, 6,5 мг/кг, 7 мг/кг, 7,5 мг/кг, в дозе 8 мг/кг, 8,5 мг/кг, 9 мг/кг, 9,5 мг/кг, 10 мг/кг, 10,5 мг/кг, мг/кг, 11,5 мг/кг, 12 мг/кг, 12,5 мг/кг, 13 мг/кг, 13,5 мг/кг, 14 мг/кг, 14,5 мг/кг или 15 мг/кг.

Способы и применения по настоящему изобретению включают введение композиции, описанной в данном документе, таким образом, чтобы экспрессия целевого гена С5 уменьшилась, например, на период приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 или 80 ч. В одном варианте осуществления экспрессия целевого гена С5 уменьшается на протяжении длительного срока, например, по меньшей мере приблизительно двух, трех, четырех, пяти, шести, семи дней или более, например, приблизительно одной недели, двух недель, трех недель или приблизительно четырех недель или дольше.

Введение dsRNA согласно способам и применениям по настоящему изобретению может привести к снижению тяжести, признаков, симптомов и/или маркеров таких заболеваний или нарушений у пациента с заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5. Снижение в данном контексте подразумевает статистически значимое снижение такого уровня. Снижение может произойти, например, на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или приблизительно 100%.

Эффективность лечения или предотвращения заболевания можно оценить, например, путем определения прогрессирования заболевания, ремиссии, тяжести симптомов, уменьшения боли, качества жизни, дозы лекарственного средства, необходимого для поддержания эффекта лечения, уровня маркера заболевания или любого другого измеряемого параметра, подходящего для данного заболевания, подвергаемого лечению или нацеленного на его предотвращение. Вполне в пределах способности специалиста в данной области техники контролировать эффективность лечения или профилактики путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров. Например, эффективность лечения гемолитического нарушения можно оценить, например, с помощью периодического контроля уровней LDH и СН₅₀. Сравнение поздних показаний с начальными показаниями обеспечивает врача показаниями, является ли лечение эффективным. Вполне в пределах способности специалиста в данной области техники контролировать эффективность лечения или профилактики путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров. В связи с этим введение иРНК, нацеленной на С5, или ее фармацевтической композиции эффективной против заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, показывает, что введение клинически соответствующим способом приводит к благотворному воздействию на по меньшей мере статистически значимую часть пациентов, такому как улучшению симптомов, лечению, снижению заболеваний, продлению жизни, улучшению качества жизни или другому эффекту, как правило признанному положительным врачами, знакомыми с лечением заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, и связанных причин.

Эффект лечения или предупредительное действие очевидны, когда наблюдается статистически значимое улучшение одного или нескольких показателей болезненного состояния, или по отсутствию усугубления или развития симптомов в тех случаях, когда их, при иных обстоятельствах, прогнозировали. В качестве примера, благоприятное изменение измеряемого показателя заболевания по меньшей мере на 10% и предпочтительно по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50% или более может служить признаком эффективного лечения. Об эффективности данного лекарственного препарата iRNA или состава этого лекарственного препарата можно также судить при помощи экспериментальной животной модели для данного заболевания, которая известна в данной области. При использовании экспериментальной животной модели, эффективность лечения доказана, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера или ослабление симптома.

Кроме того, эффективность может быть оценена при уменьшении тяжести заболевания, что определяется специалистом в данной области диагностики, основываясь на клинически принятой шкале оценки тяжести заболевания, как один из примеров шкала интенсивности боли при ревматоидном артрите (RASS). Любое позитивное изменение, приводящее, например, к уменьшению тяжести заболевания, оцениваемому с использованием соответствующего масштаба, представляет адекватное лечение с применением иРНК или состава, представляющего собой иРНК, как описано в данном документе.

Субъекту можно вводить терапевтическое количество иРНК, например, приблизительно 0,01 мг/кг, 0,02 мг/кг, 0,03 мг/кг, 0,04 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,45 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,55 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,65 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,75 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,85 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,95 мг/кг, 1,0 мг/кг, 1,1 мг/кг, 1,2 мг/кг, 1,3 мг/кг, 1,4 мг/кг, 1,5 мг/кг, 1,6 мг/кг, 1,7 мг/кг, 1,8 мг/кг, 1,9 мг/кг, 2,0 мг/кг, 2,1 мг/кг, 2,2 мг/кг, 2,3 мг/кг, 2,4 мг/кг, 2,5 мг/кг dsRNA, 2,6 мг/кг dsRNA, 2,7 мг/кг dsRNA, 2,8 мг/кг dsRNA, 2,9 мг/кг dsRNA, 3,0 мг/кг dsRNA, 3,1 мг/кг dsRNA, 3,2 мг/кг dsRNA, 3,3 мг/кг dsRNA, 3,4 мг/кг dsRNA, 3,5 мг/кг dsRNA, 3,6 мг/кг dsRNA, 3,7 мг/кг dsRNA, 3,8 мг/кг dsRNA, 3,9 мг/кг dsRNA, 4,0 мг/кг dsRNA, 4,1 мг/кг dsRNA, 4,2 мг/кг dsRNA, 4,3 мг/кг dsRNA, 4,4 мг/кг dsRNA, 4,5 мг/кг dsRNA, 4,6 мг/кг dsRNA, 4,7 мг/кг dsRNA, 4,8 мг/кг dsRNA, 4,9 мг/кг dsRNA, 5,0 мг/кг dsRNA, 5,1 мг/кг dsRNA, 5,2 мг/кг dsRNA, 5,3 мг/кг dsRNA, 5,4 мг/кг dsRNA, 5,5 мг/кг dsRNA, 5,6 мг/кг dsRNA, 5,7 мг/кг dsRNA, 5,8 мг/кг dsRNA, 5,9 мг/кг dsRNA, 6,0 мг/кг dsRNA, 6,1 мг/кг dsRNA, 6,2 мг/кг dsRNA, 6,3 мг/кг dsRNA, 6,4 мг/кг dsRNA, 6,5 мг/кг dsRNA, 6,6 мг/кг dsRNA, 6,7 мг/кг dsRNA, 6,8 мг/кг

- 88 044245 dsRNA, 6,9 мг/кг dsRNA, 7,0 мг/кг dsRNA, 7,1 мг/кг dsRNA, 7,2 мг/кг dsRNA, 7,3 мг/кг dsRNA, 7,4 мг/кг dsRNA, 7,5 мг/кг dsRNA, 7,6 мг/кг dsRNA, 7,7 мг/кг dsRNA, 7,8 мг/кг dsRNA, 7,9 мг/кг dsRNA, 8,0 мг/кг dsRNA, 8,1 мг/кг dsRNA, 8,2 мг/кг dsRNA, 8,3 мг/кг dsRNA, 8,4 мг/кг dsRNA, 8,5 мг/кг dsRNA, 8,6 мг/кг dsRNA, 8,7 мг/кг dsRNA, 8,8 мг/кг dsRNA, 8,9 мг/кг dsRNA, 9,0 мг/кг dsRNA, 9,1 мг/кг dsRNA, 9,2 мг/кг dsRNA, 9,3 мг/кг dsRNA, 9,4 мг/кг dsRNA, 9,5 мг/кг dsRNA, 9,6 мг/кг dsRNA, 9,7 мг/кг dsRNA, 9,8 мг/кг dsRNA, 9,9 мг/кг dsRNA, 9,0 мг/кг dsRNA, 10 мг/кг dsRNA, 15 мг/кг dsRNA, 20 мг/кг dsRNA, 25 мг/кг dsRNA, 30 мг/кг dsRNA, 35 мг/кг dsRNA, 40 мг/кг dsRNA, 45 мг/кг dsRNA или приблительно 50 мг/кг dsRNA. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления, например, когда композиция по настоящему изобретению включает dsRNA, как описано в данном документе, и липид, субъектам можно вводить терапевтическое количество иРНК, например, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,3 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,3 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,4 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,4 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 2,5 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 3 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно от приблизительно 3 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 3,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 4 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 4,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 4 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 4,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 5,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 6 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 6,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 7 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 7,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 8 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 8,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 9 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 9,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

Например, dsRNA может быть введена в дозе приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,

1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6,

3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3,

6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,

9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или приблизительно 10 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобрете ния.

В других вариантах осуществления, например, когда композиция по настоящему изобретению содержит dsRNA, как описано в данном документе, и N-ацетилгалактозамин, субъекту можно вводить терапевтическое количество иРНК, например, в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 30 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 45 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 45 мг/кг, от

- 89 044245 приблизительно 7,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 30 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг. В одном варианте осуществления, где композиция по настоящему изобретению содержит dsRNA, как описано в данном документе, и N-ацетилгалактозамин, субъекту можно вводить терапевтическое количество от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг dsRNA. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

Например, субъектам можно вводить терапевтическое количество иРНК, например, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

иРНК может быть введена путем внутривенной инфузии в течение некоторого периода времени, например, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или примерно 25-минутного периода. Введение могут повторять, например, регулярно, как, например, раз в неделю, раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После первичного режима обработки обработки можно вводить менее часто. Например, после введения раз в неделю или раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев, или года, или дольше.

Введение иРНК может снизить уровень С5, например, в клетке, ткани, крови, моче или других компартментах пациента на по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%,

33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%,

52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,

71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере приблизительно 99% или более.

Перед введением полной дозы иРНК пациентам можно вводить меньшую дозу, как, например,

- 90 044245

5% инфузию и наблюдать их в отношении отрицательного действия, как, например, аллергических реакций. В другом примере пациента можно наблюдать в отношении нежелательного иммуностимулирующего действия, как, например, повышения уровней цитокина (например, TNF-альфа или INF-альфа).

Благодаря ингибирующему действию на экспрессию С5, композиция по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, приготовленная из нее, может повысить качество жизни.

иРНК по настоящему изобретению можно вводить в голой форме или в виде свободной иРНК. Голую иРНК вводят в отсутствие фармацевтической композиции. Голая иРНК может быть в подходящем буферном растворе. Буферный раствор может содержать ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). рН и осмолярность буферного раствора иРНК можно корректировать, с тем чтобы он подходил для введения субъекту.

Альтернативно, иРНК по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтической композиции, например, в составе липосомной dsRNA.

Субъектами, у которых снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, являются те, кто страдает заболеванием или нарушением, связанным с компонент комплемента С5, как описано в данном документе. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает ночной пароксизмальной гемоглобинурией (PNH). В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает астомой. В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает ревматоидным артритом. В еще одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает системной красной волчанкой. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает гломерулонефритом. В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает псориазом. В еще одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает дерматомиозитм буллезного пемфигоида. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает атипичным гемолитико-уремическим синдромом. В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает гемолитико-уремическим синдромом, вызванным Шига-подобным токсином Е. coli. В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает миастенией. В еще одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает оптиконевромиелитом. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает болезнью плотного осадка. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает C3-нефропатией.

В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает связанной с возрастом дегенерацией желтого пятна. В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает болезнью холодовых агглютининов. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает васкулитом, связанноым с антителами к цитоплазме нейтрофилов. В другом варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает реакцией отторжения трансплантата, вызванной гуморальными и сосудистыми механизмами. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает дисфункцией трансплантата. В одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает инфартом миокарда. В другом варианте осуществления заболевание, которым страдает субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, представляет собой сенсибилизированное отторжение трансплантата. В еще одном варианте осуществления субъект, страдающий заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, страдает сепсисом.

Лечение субъекта, у которого снижение и/или ингибирование экспрессии гена С5 окажет благоприятное воздействие, включает терапевтическое и профилактическое (например, субъект перенес операцию сенсибилизированной (или аллогенной) пересадки) лечение.

Кроме того, изобретение относится к способам и применению средства, представляющего собой иРНК, или его фармацевтической композиции (включая способы и применение средства, представляющего собой иРНК, или фармацевтической композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, и антитело к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающий фрагмент) для лечения субъекта, у которого снижение и/или ингибирование экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, у субъекта, страдающего заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, в комбинации с другими фармацевтическими препаратами и/или другими терапевтическими способами, например, известными фармацевтическими и/или терапевтическими способами, такие как, например, те, которые в настоящее время применяют при лечении этих нарушений. Например, в некоторых вариантах осу- 91 044245 ществления иРНК, нацеленную на С5, вводят в комбинации с, например, средством, пригодным при лечении заболевания, связанного с компонентом комплемента С5, как описано в других частях данного документа.

Например, дополнительные терапевтические средства и терапевтические способы, пригодные для лечения субъекта, у которого снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие, например, субъекта, страдающего заболеванием, связанным с компонентом комплемента С5, включают плазмоферез, тромболитическую терапия (например, с применением стрептокиназы), антиагреганты, фолиевую кислоту, кортикостероиды; иммунодепрессанты; эстрогены, метотрексат, 6-МР, азатиоприн, сульфасалазин, месалазин, олсалазин, хлорохин/гидроксихлорохин, пеницилламин, ауротиомалат (внутримышечно и перорально), азатиоприн, колхицин, кортикостероиды (пероральные, ингаляционные и местные инъекции), бета-2 агонисты адренорецепторов (сальбутамол, тербуталин, салметерол), ксантины (теофиллин, аминофиллин), кромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропий и окситропий, циклоспорин, FK-506, рапамицин, микофенолятмофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты, аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие сигнальной функции провоспалительных цитокинов, такие как TNF-α или IL-1 (например, ингибиторы киназы IRAK, NIK, IKK, р38 или MAP), ингибиторы фермента ГЕ-1в-преобразования, ингибиторы фермента TNFa-преобразования (ТАСЕ), ингибиторы сигнальных Т-клеток, таких как ингибиторы киназы, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркантопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, рецепторы растворимых цитокинов и их производные (например, растворимые р55 или р75 TNF-рецепторы и производные p75TNFRIgG (Enbrel™ и p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII и sIL-6R), противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFe), целекоксиб, фолиевая кислота, гидроксихлорохин сульфат, рофекоксиб, этанерцепт, моноклональное антитело инфликси, напроксен, валдекоксиб, сульфасалазин, метилпреднизолон, мелоксикам, метилпреднизолона ацетат, золото, тиомалат натрия, аспирин, триамцинолона ацетонид, пропоксифена напсилат/апап, фолат, набуметон, диклофенак, пироксикам, этодолак, диклофенак натрия, оксапрозин, оксикодона гидрохлорид, гидрокодона битартрат/апап, диклофенак натрия/мизопростол, фентанил, анакинра, рекомбинантный иммуноглобулин человека, трамадола гидрохлорид, салсалат, сулиндак, цианокобаламин/fa/пиридоксин, ацетаминофен, алендронат натрия, преднизолон, сульфат морфина, лидокаина гидрохлорид, индометацин, глюкозамин сульфат/хондроитин, амитриптилина гидрохлорид, сульфадиазин, оксикодона гидрохлорид/ацетаминофен, олопатадина гидрохлорид, мизопростол, напроксен натрия, омепразол, циклофосфамид, моноклональное антитело ритукси, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 ВР, антитело к IL-18, антитело к IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, рофлумиласт, IC-485, CDC-801, мезопрам, циклоспорин, цитокин-супрессивный противовоспалительный лекарственный препарат(ы) (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело к TNFa; Celltech/Bayer); сА2/моноклональное антитело инфликси (химерное антитело к TNFa; Centocor); 75 kdTNFRIgG/этанерсепт (75 кДа рецептор TNF-IgG слитый белок; Immunex, см., например, (1994) Arthr. Rheum. 37: S295; (1996) J. Invest. Med. 44: 235A); 55 кД TNF-IgG (55 кД рецептор TNF-IgG слитый белок Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (не осуществляющее деплецию приматизированное антитело к CD4; IDEC/SmithKline; см., например, (1995) Arthr. Rheum. 38: S185); DAB 486-IL-2 и/или DAB 389-IL-2 (IL-2 слитые белки; Seragen; см., например, (1993) Arthrit. Rheum. 36: 1223); антитело к Тас (гуманизированное антитело к IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; рекомбинантный IL-10, противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 и/или IL-4 агонисты (например, антитела агонистов); IL-1RA (антагонист IL-1-рецептора; Synergen/Amgen); анакинра (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (растворимый TNFсвязывающий белок; см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement)): S284; (1995) Amer. J. Physiol. - Heart and Circ. Physiol. 268: 37-42); R973401 (ингибитор фосфодиэстеразы тип IV; см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S282); MK-966 (СОХ-2-ингибитор; см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S81); илопрост (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S82); метотрексат; талидомид (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S282) и талидомидсвязанные лекарственные препараты (например, Celgen); лефлуномид (противовоспалительный и ингибитор цитокина, см. например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S131; (1996) Inflamm. Res. 45: 103-107); транексамовая кислота (ингибитор активации плазминогена, см, например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S284); Т-614 (ингибитор цитокина; см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S282); простагландин E1 (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S282); тенидап (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат; см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S280); напроксен (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат; см., например, (1996) Neuro. Report 7: 1209-1213); мелоксикам (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); ибупрофен (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); пироксикам (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); диклофенак (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); индометацин (нестероидный противо- 92 044245 воспалительный лекарственный препарат); сульфасалазин (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S281); азатиоприн(см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S281); ингибитор ICE (ингибитор интерлейкин-1а превращающего фермента); ингибитор zap-70 и/или lck (ингибитор тирозинкиназы zap-70 или lck); ингибитор VEGF и/или ингибитор VEGF-R (ингибиторы фактора роста клеток эндотелия сосудов или рецептор фактора роста клеток эндотелия сосудов; ингибиторы ангиогенеза); кортикостероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, SB203580); ингибиторы конвертазы TNF; антитела к IL-12; антитела к IL-18; интерлейкин-11 (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S296); интерлейкин-13 (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S308); ингибиторы интерлейкин-17 (см., например, (1996) Arthr. Rheum. 39 (9 (supplement): S120); золото; пеницилламин; хлорохин; хлорамбуцил; гидроксихлорохин; циклоспорин; циклофосфамид; общее облучение лимфоидной ткани; антитело-глобулин к Т-клеткам; антитела к CD4; CD5-токсины; перорально вводимые пептиды и коллаген; динатрий лобензарит; средства, регулирующие цитокины (CRA) HP228 и НР466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1-антисмысловые фосфотиоатные олигодезоксинуклеотиды (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); растворимый рецептор комплемента 1 (ТР10; Т Cell Sciences, Inc.); преднизолон; орготеин; гликозаминогликан полисульфат; миноциклин; антитела к IL2R, липиды морского и ботанического происхождения (жирные кислоты рыбы и семян растений, см., например, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777); ауранофин; фенилбутазон; меклофенамовая кислота; флуфенамовая кислота; иммуноглобулин для внутривенного введения; зилеутон; азарибин; микофенолокислота (RS-61443); такролимус (FK-506); сиролимус (рапамицин); амиприлоз (терафектин); кладрибин (2-хлордезоксиаденозин); метотрексат; ингибиторы bcl-2 (см. Bruncko, M. et al. (2007) J. Med. Chem. 50(4): 641-662); противовирусные и иммуномодулирующие средства, малую молекулу ингибитора KDR, малую молекулу ингибитора Tie-2; метотрексат; преднизолон; целекоксиб; фолиевую кислоту; гидроксихлорохин сульфат; рофекоксиб; этанерсепт; моноклональное антитело инфликс; лефлуномид; напроксен; валдекоксиб; сульфасалазин; метилпреднизолон; ибупрофен; мелоксикам; ацетат метилпреднизолона; золото тиомалат натрия; аспирин; азатиоприн; триамцинолона ацетонид; пропксифена напсилат/апап; фолат; набуметон; диклофенак; пироксикам; этодолак; диклофенак натрия; оксапрозин; оксикодона гидрохлорид; гидрокодона битартрат/апап; диклофенак натрия/мизопростол; фентанил; анакинра, рекомбинантный глобулин человека; трамадола гидрохлорид; салсалат; сулиндак; цианокобаламин/fa/пиридоксин; ацетаминофен; алендронат натрия; преднизолон; сульфат морфина; лидокаина гидрохлорид; индометацин; глюкозамина сульфат/хондроитин; циклоспорин; амитриптилина гидрохлорид; сульфадиазином; оксикодон гидрохлорид/ацетаминофен; олопатадина гидрохлорид; мизопростол; напроксен натрия; омепразол; микофенолятмофетил; циклофосфамид; моноклональное антитело ритукси; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; антитело к IL 18; антитело к IL 15; BIRB-796; SCIO469; VX-702; AMG-548; VX-740; рофлумиласт; IC-485; CDC-801; мезопрам, альбутерол, сальметерол/флутиказон, монтелукаст натрия, пропионат флутиказона, будесонид, преднизон, ксинафоат салметерола, левалбутерол гидрохлорид, альбутерола сульфат/ипратропиум, натрия фосфат преднизолона, триамцинолона ацетонид, беклометазон дипропионат, ипратропия бромид, азитромицин, пирбутерола ацетат, преднизолон, теофиллин безводный, натрия сукцинат метилпреднизолон, клэритромицин, зафирлукаст, формотерола фумарат, вакцина против вируса гриппа, метилпреднизолон, амоксициллина тригидрат, флунизолид, инъекции против аллергии, кромолин натрия, фексофенадина гидрохлорид, флунизолид/ментол, амоксициллин/клавуланат, левофлоксацин, вспомогательное устройство для ингаляций, гуафенизин, дексаметазона натрия фосфат, моксифлоксацина гидрохлорид, доксициклина гиклат, гуаифенезин/d-меторфан, р-эфедрин/кодеин/хлорфенир, гатифлоксацин, цетиризина гидрохлорид, мометазона фуроат, сальметерола ксинафоат, бензонатат, цефалексин, фенилэфрин/гидрокодон/хлорфенирамин, цетиризина гидрохлорид/псевдоэфедрин, фенилэфрин/кодеин/прометазин, кодеин/прометазин, цефпрозил, дексаметазон, гуаифенезин/псевдоэфедрин, хлорфенирамин/гидрокодон, недокромил натрия, тербуталина сульфат, эпинефрин, метилпреднизолон, метапротеренола сульфат, аспирин, нитроглицерин, метопролола тартрат, эноксапарин натрия, гепарин натрия, клопидогреля бисульфат, карведилол, атенолол, морфина сульфат, метопролола сукцинат, варфарин натрия, лизиноприл, изосорбида мононитрат, дигоксин, квинаприла гидрохлорид/mag carb, буметанид, альтеплаза, эналаприлат, амиодарона гидрохлорид, тирофибана гидрохлорид м-гидрат, дилтиазема гидрохлорид, каптоприл, ирбесартан, валсартана, пропранолола гидрохлорид фуросемид, симвастатин, рамиприл, тенектеплаза, эналаприла малеат, торсемид, ретаваз, лозартан калия, фозиноприл натрия, лидокаина гидрохлорид, эптифибатид, цефазолин натрия, атропина сульфат, аминокапроновую кислоту, спиронолактон, интерферон, соталола гидрохлорид, хлорид калия, докузат натрия, добутамина гидрохлорид, алпразолам, правастатин натрий, аторвастатин кальция, мидазолама гидрохлорид, гидроморфона гидрохлорид, изосорбида динитрат, адреналин, дофамина гидрохлорид, бивалирудин, розувастатин, эзетимиб/симвастатин, авасимиб и карипорид.

Средство, представляющее собой иРНК (и/или антитело к компоненту комплемента С5) и дополнительное терапевтическое средство и/или лечение можно вводить одновременно и/или в одной комбинации, например, парентерально, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть отдельного состава, или в разное время, и/или другим способом, известным в данной области техники или описанных в данном документе.

- 93 044245

Настоящее изобретение также относится к способам применения средства, представляющего собой иРНК, по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей средство, представляющее собой иРНК, по настоящему изобретению для уменьшения и/или ингибировать экспрессии компонента комплемента С5 в клетке. В других аспектах настоящее изобретение относится к иРНК по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей иРНК по настоящему изобретению, для применения при уменьшении и/или ингибировании экспрессии компонента комплемента С5 в клетке. В других аспектах предусматривается применение иРНК по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей иРНК по настоящему изобретению при производстве лекарственного средства для уменьшения и/или ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке.

Способы и применения включают приведение клетки в контакт с иРНК, например, dsRNA по настоящему изобретению и поддержание клетки в течение времени, достаточного для обеспечения расщепления мРНК-транскрипта гена С5, ингибируя, таким образом, экспрессию гена С5 в клетке.

Уменьшение экспрессии гена можно оценить любым из способов, известных в данной области. Например, снижение экспрессии С5 можно определить путем определения уровня экспрессии мРНК С5 с применением обычных способов, известных обычному специалисту в данной области, например, Нозерн-блоттинга, qRT-PCR, путем определения уровня белка С5 с применением обычных способов, известных обычному специалисту в данной области, таких как Вестерн-блоттинг, иммунологические методы, способ проточной цитометрии, ELISA, и/или путем определения биологической активности С5, как при реакции гемолиза СН₅₀ или АН₅₀, и/или путем определения биологической активности одной или нескольких молекул, связанных с системой комплемента, например, продуктами С5, такими как С5а и С5Ь (или in vivo условиях, например, в условиях гемолиза).

В способах и вариантах применения настоящего изобретения клетка может вступать в контакт in vitro или in vivo, т.е. клетка может быть в пределах субъекта. В вариантах осуществления настоящего изобретения, когда клетка находится пределах субъекта, способы могут включать дополнительное приведение клетки в контакт с антителом к компоненту комплемента С5, например, экулизумабом.

Клеткой, пригодной для лечения с применением способов по настоящему изобретению, может быть любая клетка, экспрессирующая ген С5. Клеткой, пригодной для лечения с применением способов по настоящему изобретению, может быть клетка млекопитающего, например, клетка примата (например, клетка человека или клетка примата, отличного от человека, например, клетка обезьяны или клетка шимпанзе), клетка отличного от примата (например, клетка коровы, клетка свиньи, клетка верблюда, клетка ламы, клетка лошади, клетка козы, клетка кролика, клетка овцы, клетка хомяка, клетка морской свинки, клетка кошки, клетка собаки, клетка крысы, клетка мыши, клетка льва, клетка тигра, клетка медведя или клетка буйвола), клетка птицы (например, клетка утки или клетка гуся), или клетка кита. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку человека, например, клетку печени человека.

Экспрессию С5 можно ингибировать в клетке на по меньшей мере 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%,

31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,

50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,

69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,

88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или приблизительно 100%.

Способы и варианты применения in vivo по настоящему изобретению могут включать введение субъекту композиции, содержащей иРНК, где иРНК включает нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части РНК-транскрипта гена С5 млекопитающего, подлежащего лечению. Когда организм, подлежащий лечению, представляет собой млекопитающего, такого как человек, композицию можно вводить любыми способами, известными в данной области техники, включая без ограничения подкожное, внутривенное, оральное, внутрибрюшинное или парентеральное введение, включая внутричерепное (например, внутрижелудочковое, интрапаренхимальное и интратекальное), внутримышечное, трансдермальное, через дыхательные пути (аэрозоль), назальное, ректальное и местное (в том числе трансбуккальное и подъязычное) введение. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят в виде подкожных или внутривенных инфузий или инъекций.

В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством инъекции вещества замедленного всасывания. Инъекция вещества замедленного всасывания может высвобождать иРНК устойчивым образом в течение длительного периода времени. Таким образом, при помощи инъекции вещества замедленного всасывания можно снижать частоту введения доз, необходимых для получения необходимого действия, например, необходимого ингибирования С5, или терапевтического или профилактического действия. Инъекция вещества замедленного всасывания может также предусматривать более устойчивые концентрации в сыворотке. Инъекции вещества замедленного всасывания могут включать подкожные инъекции или внутримышечные инъекции. В предпочтительных вариантах осуществления инъекция вещества замедленного всасывания является подкожной инъекцией.

В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством насоса. Насос может быть внешним насосом или имплантированным хирургическим путем насосом. В определенных вариан

- 94 044245 тах осуществления насос является подкожно имплантированным осмотическим насосом. В других вариантах осуществления насос является инфузионным насосом. Инфузионный насос можно применять для внутривенных, подкожных, артериальных или эпидуральных инфузий. В предпочтительных вариантах осуществления инфузионный насос является подкожным инфузионным насосом. В других вариантах осуществления насос является имплантируемым хирургическим путем насосом, который доставляет иРНК в печень.

Способ введения можно выбрать, исходя из того, необходимо местное или системное лечение, и исходя из области, которая подлежит лечению. Путь и место введения можно выбрать для увеличения нацеленного воздействия.

В одном аспекте настоящее также изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии гена С5 у человека. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей иРНК, например, dsRNA, нацеленной на ген С5 в клетке млекопитающего для применения в ингибировании экспрессии гена С5 у млекопитающего. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению иРНК, например, dsRNA, нацеленной на ген С5 в клетке млекопитающего, при производстве лекарственного средства для ингибирования экспрессии гена С5 у млекопитающего.

Способы и варианты применения включают введение млекопитающему, например, человеку, композиции, содержащей иРНК, например, dsRNA, нацеленной на ген С5 в клетке млекопитающего и поддержание млекопитающего в течение времени, достаточного для обеспечения расщепления мРНКтранскрипта гена С5, ингибируя, таким образом, экспрессию гена С5 у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение субъекту антитела к компоненту комплемента С5, например, экулизумаба.

Уменьшение экспрессии гена можно оценить любым из способов, известных в данной области, например qRT-PCR, описанным в данном документе. Снижение синтеза белка можно оценить любым из способов, известных в данной области, например, ELISA или вестерн-блоттинга, описанных в данном документе. В одном варианте осуществления биопсия печени в виде пункции служит образцом ткани для мониторинга снижения экспрессии гена и/или белка С5. В другом варианте осуществления образец крови служит образцом ткани для мониторинга снижения экспрессии гена и/или белка С5. В других вариантах осуществления ингибирование экспрессии гена С5 контролируют косвенно, например, путем определения экспрессии и/или активности гена в пути биосинтеза С5, включая, например, С5а, С5Ь и растворимый С5Ь-9 (см, например, фиг. 1). Например, активность CD59 можно мониторить для определения ингибирования экспрессии гена С5. Также можно измерять СН₅₀, АН₅₀, образование тромбов и/или лактатдегидрогеназу (LDH) в сыворотке образца, например, крови или образце печени. Подходящие анализы дополнительно описаны в разделе примеров ниже.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или испытании иРНК и способов, описанных в настоящем изобретении, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, которые упоминаются в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта, настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.

Примеры

Пример 1. Синтез иРНК.

Происхождение реагентов.

Если происхождение реагента конкретно не приведено в данном документе, такой реагент можно получать от любого поставщика реагентов для молекулярной биологии со стандартным качеством/чистотой для применения в молекулярной биологии.

Транскрипты.

Осуществляли конструирование siRNA для идентификации siRNA, нацеленной на транскриты С5 человека, макак резус (Масаса mulatta), мыши, крысы, отмеченных в базе данных генов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). В конструировании использовали следующие транскрипты из коллекции RefSeq NCBI: человека - NM_001735.2; макак резус - ХМ_001095750.2; мыши - NM_010406.2; крысы - ХМ_345342.4. Дуплексы SiRNA конструировали в нескольких отдельных партиях, включая без ограничения партии, содержащие дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и макак резус; только транскриптам человека, макак резус и мыши; только транскриптам человека, макак резус, мыши и крысы; и только транскриптам мыши и крысы. Все дуплексы siRNA конструировали с получением 100% идентичности с указанным транскриптом человека и транскриптов других видов, рассмотренных в каждой партии конструкции (выше).

Конструирование siRNA, специфичность и прогноз эффективности.

Прогнозируемую специфичность всех возможных 19mers предсказывали из каждой последовательности. Затем отбирали 19mers кандидаты, не имеющих повторы более, чем 7 нуклеотидов. Эти 2971 кан

- 95 044245 дидата человек/макак резус, 142 человек/макак резус/мышь, 54 человек/макак резус/мышь/крыса и 807 мышь/крыса применяли в обширных исследованиях к соответствующим транскриптомам (определенным, как набор записей NM_ и ХМ_ в пределах наборов RefSeq NCBI человека, макак резуса, собаки, мыши или крысы), с применением исчерпывающего алгоритма полный перебор, реализованного в питон-скрипте BruteForce.ру. Далее скрипт разбирали на транскрипт-олиго выравнивания для создания показателя на основе положения и числа несоответствий между siRNA и любым потенциальным 'нецелевым' транскриптом. Нецелевой показатель взвешивали, чтобы подчеркнуть различия в исходном участке siRNAs, в положениях 2-9 от 5'-конца молекулы.

Каждая пара олиго-транскрипт из полного перебора получала значение несовпадения путем суммирования индивидуальных баллов несовпадения; несовпадения в положении 2-9 считали как 2,8, несовпадения в положениях сайта расщепления 10-11 считали как 1,2, и несовпадения в участке 12-19 считали как 1,0. Дополнительное нецелевое предсказание осуществляли путем сравнения частоты гептамеров и октомеров, полученных из 3 различных, производных исходных гексамеров каждого олигонуклеотида. Гексамеры с позиций 2-7 по отношению к началу 5' применяли для создания 2 гептамеров и одного октамера. Гептамер 1 создавали путем добавления 3'-А к гексамеру; гептамер 2 создавали путем добавления 5'-А к гексамеру; октомер создавали путем добавления А и к 5'-, и к 3'-концам гексамера. Предварительно рассчитывали частоту октамеров и гептамеров в 3'-UTRome человека, макак-резус, мыши или крысы (определяется как подпоследовательность транскриптома из базы данных RefSeq NCBI, где конец кодирующего участка, CDS, четко определен). Частоту октамера приводили в соответствие с частотой гептамера, используя среднее значение из диапазона частот октамера. Затем рассчитывали mirSeedScore путем расчета суммы (3 X подсчет приведенного в соответствие октамера) (2 X подсчет гептамера 2) (1 X подсчет гептамера 1)).

Обе цепи siRNA назначали к категории специфики в соответствии с расчетными баллами: оценка выше 3 квалифицируется как весьма специфическая, при значении 3 как специфическая, и между 2,2 и 2,8 как умеренно специфическая. Дуплексы сортировали по специфике антисмысловой цепи и отбирали те дуплексы, чьи антисмысловые олигонуклеотиды не содержали GC в первом положении, не содержали G в обоих положениях 13 и 14, и содержали 3 или больше U или А в исходном участке.

Для GalNaC-коньюгированных дуплексов конструировали смысловой 21mer и антисмысловой 23mer олигонуклеотиды путем расширения антисмысловых 19mers (описано выше) до 23 нуклеотидов в целевой комплементарной последовательности. Все виды транскриптов, включенные в конструкцию партии, проверяли на комплементарность. Применяли только 23mers, сохранившие 100% комплементарность последовательности по меньшей мере у 2 видов. Для каждого дуплекса определяли смысловые 21mer как обратную комплементарность первых 21 нуклеотидов антисмысловой цепи.

Выбор последовательности siRNA.

Синтезировали и формировали в дуплексы в общей сложности 23 смысловых и 23 антисмысловых, полученных от человек/макак резус, 6 смысловых и 6 антисмысловых, полученных от человек/макак резус/мыши/мышь/крыса, и 13 смысловых и 13 антисмысловых, полученных от мышь/крыса, олигомеров siRNA 19mer.

Вышеуказанные наборы 19mer расширяли до дуплексов 21/23mer для GalNac-коньюгированной конструкции и повторно классифицировали в соответствии с их новыми видовыми соответствиями. Двадцать семь смысловых и 27 антисмысловых, полученных из человек/макак резус, 1 смысловой и 1 антисмысловой, полученных из человек/макак резус/мышь, 3 смысловых и 3 антисмысловых, полученых из человек/макак резус/крыса, 4 смысловых и 4 антисмысловых, полученых из человек/макак резус/мышь/крыса, и 13 смысловых и 13 антисмысловых, полученых из мышь/крыса 21mer (смыслового) и 23mer (антисмыслового) олигонуклеотидов синтезировали и формировали в дуплексы.

Подробный список последовательностей смысловых и антисмысловых цепей С5 приведены в табл. 3-6.

Синтез siRNA.

Общие способы синтеза РНК малого и среднего размера.

РНК-олигонуклеотиды синтезировали в масштабах между 0,2-500 мкмоль с применением коммерчески доступных 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-O-t-бутилдиметилсилил-3'-О-(2-цианоэтил-N,N-диизопропил) фосфорамидит-мономеров уридина, 4-N-ацетилцитидин, 6-N-бензоиладенозина и 2-Nизобутиргуанозина и соответствующих 2'-O-метил и 2'-фторфосфорамидитов, согласно стандартным протоколам синтеза олигонуклеотидов в твердой фазе. Растворы амидита готовили в концентрации 0,10,15 М и применяли 5-этилтио-1Н-тетразол (0,25-0,6 М в ацетонитриле) в качестве активатора. В процессе синтеза вводили фосфотиоатные модификации остова с применением 0,2 М фенилацетил дисульфида (PADS) в лутидин:ацетонитрил (1:1) (об.:об.) или 0,1 М 3-(диметиламинометилен) амино-3H-1,2,4дитиазол-5 тиона (DDTT) в пиридине для стадии окисления. После завершения синтеза последовательности отщепляли от твердой подложки и снимали защиту с применением метиламина с последующим триметиламином 3HF для удаления присутствующих 2'-О-t-бутилдиметилсилил-защитных групп.

Для масштабов синтеза между последовательностей (5-500 мкмоль и полностью 2'-модифицированных 2'-фтор и/или 2'-O-метил или их комбинации), у олигонуклеотов удаляли защитную группу с применением 3:1 (об./об.) этанола и концентрированного (28-32%) водного раствора аммиака либо при

- 96 044245

35°C 16 ч, или при 55°C в течение 5,5 ч. Перед удалением защитной группы аммиака олигонуклеотиды обрабатывали 0,5 М пиперидином в ацетонитриле в течение 20 мин на твердой подложке. Неочищенные олигонуклеотиды анализировали с помощью LC-MS и анионообменной HPLC (IEX-HPLC). Очистку олигонуклеотидов проводили с помощью IEX HPLC в применением: 20 мМ фосфата, 10%-15% ACN, рН 8,5 (буфер А) и 20 мМ фосфата, 10%-15% ACN, 1 M NaBr, pH 8,5 (буфер В). Фракции анализировали на чистоту с помощью аналитической HPLC. Содержащие продукт фракции с приемлемой чистотой объединяли и концентрировали на роторном испарителе до обессоливания. Образцы обессоливали с помощью эксклюзионной хроматографии и лиофилизировали до сухости. Равные молярные количества смысловых и антисмысловых цепей отжигали в 1х PBS-буфере с получением соответствующих дуплексов siRNA.

Для малых масштабов (0,2-1 мкмоль) синтез проводили на синтезаторе MerMade 192 в формате 96 лунок. В случае полностью 2'-модифицированных последовательностей (2'-фтор и/или 2'-О-метил или их комбинаций), у олигонуклеотов удаляли защитную группу с применением метиламина при комнатной температуре в течение 30-60 мин с последующей инкубацией при 60°C в течение 30 мин или с применением 3:1 (об./об.) этанола и концентрированного (28-32%) водного раствора аммиака при комнатной температуре в течение 30-60 мин с последующей инкубацией при 40°C в течение 1,5 ч. Неочищенные олигонуклеотиды затем осаждали в растворе ацетонитрил:ацетон (9:1) и выделяли центрифугированием и декантированием супернатанта. Неочищенный олигонуклеотидный осадок ресуспендировали в 20 мМ буфера NaOAc и анализировали с помощью LC-MS и анионообменной HPLC. Неочищенные олигонуклеотидные последовательности обессоливали в глубоких 96-луночных планшетах на колонке HiTrap Sephadex G25 5 мл (GE Healthcare). Из каждой лунки отбирали 1,5 мл образцов, соответствующих индивидуальной последовательности. Эти очищенные обессоленные олигонуклеотиды анализировали с помощью LC-MS и анионообменной хроматографии. Дуплексы получали путем отжига эквимолярных количеств смысловых и антисмысловых последовательностей на роботе Tecan. Концентрацию дуплексов доводили до 10 мкМ в 1х PBS-буфере.

Синтез GalNAc-коньюгированных олигонуклеотидов для анализа in vivo.

Олигонуклеотиды, коньюгированные с лигандом GalNAc на их 3'-конце, синтезировали в масштабах между 0,2-500 мкмоль с применением твердой подложки, предварительно загруженной Y-образной линкером, несущим 4,4-диметокситритил (DMT)-защитную первичную группу гидрокси для синтеза олигонуклеотида и GalNAc-лиганда, присоединенного через фрагмент.

Для синтеза конъюгатов GalNAc в масштабах между 5-500 мкмоль, указанный протокол синтеза РНК дополняли следующими модификациями: Для подложек синтеза на основе полистирола применяли 5% дихлоруксусную кислоту в толуоле для DMT-расщепления в процессе синтеза. Отщепление от подложки и удаление защиты проводили, как описано выше. Фосфотиоатно-богатые последовательности (обычно >5 фосфотиоатов) синтезированы без удаления конечной 5'-DMT-группы (с DMT) и после расщепления и удаления защитной группы, как описано выше, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC с применением 50 мМ ацетата аммония в воде (буфер А) и 50 мМ ацетат аммония в 80% ацетонитриле (буфер В). Фракции анализировали на чистоту с помощью аналитической HPLC и/или LC-MS. Содержащие продукт фракции с приемлемой чистоты, объединяли и концентрировали на роторном испарителе. DMT-группу удаляли с примененим 20-25% уксусной кислоты в воде до завершения процесса. Образцы обессоливали с помощью эксклюзионной хроматографии и лиофилизировали до сухости. Равные молярные количества смысловых и антисмысловых цепей отжигали в 1х PBS-буфере с получением соответствующих дуплексов siRNA.

Для синтеза малых масштабов конъюгатов GalNAc (0,2-1 мкмоль), включая последовательности с несколькими фосфотиоатными связями, применяли протоколы, описанные выше для синтеза РНК или полностью 2'-Р/2'-ОМе-содержащих последовательностей на платформе MerMade. Синтез проводили на предварительно упакованных колонках, содержащих GalNAc-функционализированную управляемую подложку со стеклянными порами.

Пример 2. Скрининг in vitro.

Клеточная культура и трансфекции.

Клетки Hep3B (АТСС, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до слияния при 37°C в атмосфере 5% СО₂ в минимальной поддерживающей среде Игла (АТСС), дополненной 10% FBS, стрептомицином и глутамином (АТСС), перед отделением от чашки Петри путем обработки трипсином. Клетки промывали и ресуспендировали до 0,25x106 клеток/мл. Во время трансфекций клетки высевали на 96луночный планшет с приблизительно 20000 клеток на лунку.

Первичные гепатоциты мыши (РМН) выделяли непосредственно перед процедурой из самок мышей линии C57BL/6 (Charles River Labortories International, Inc. Willmington, MA), меньше чем за 1 ч до трансфекций, и выращивали в среде первичных гепатоцитов. Клетки ресуспендировали до 0,11x106 клеток/мл в среде InVitroGRO CP Rat (покрытие) (Celsis In Vitro Technologies, номер по каталогу S01494). Во время трансфекций клетки высевали на 96-луночный коллагеновый планшет BD Biocoat (BD, 356407), 10000 клеток на лунку, и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% СО₂.

- 97 044245

Криоконсервированные первичные гепатоциты яванского макака (Celsis В Vitro Technologies,

M003055-P) оттаивали при 37°C на водяной бане непосредственно перед применением и ресуспендировали до 0,26x106 клеток/мл в среде InVitroGRO CP (покрытие) (Celsis В Vitro Technologies, номер по каталогу Z99029). Во время трансфекций клетки высевали на 96-луночный коллагеновый планшет BD Biocoat (BD, 356407), 25000 клеток на лунку, и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Для Hep3B, РМН и первичных гепатоцитов Cynomolgus, трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл of Opti-MEM с 0,2 мкл RNAiMax липофектамина на лунку (Invitrogen, Карлсбад Калифорния, номер по каталогу 13778-150) к 5 мкл каждого дуплекса siRNA в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Смесь затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. 80 мкл полных питательных сред без антибиотика, содержащих соответствующее количество клеток, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК.

Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ для GalNAc-модифицированных последовательностей или при конечной концентрации дуплекса 1 нМ и 0,01 нМ для всех других последовательностей. Эксперименты зависимости дозы-ответ проводили при 3, 1, 0,3, 0,1, 0,037, 0,0123, 0,00412 и 0,00137 нм конечной концентрации дуплекса для первичных гепатоцитов мыши и при 3, 1, 0,3, 0,1, 0,037, 0,0123, 0,00412, 0,00137, 0,00046, 0,00015, 0,00005 и 0,000017 нМ конечной концентрации дуплекса для клеток Hep3B.

Трансфекция посредством свободного поглощения.

Эксперименты свободного поглощения проводили путем добавления 10 мкл дуплексов siRNA в PBS на лунку в 96-луночный планшет. 90 мкл полной среды роста, содержащей соответствующее количество клеток для типа клеток, затем добавляли к siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 500 нМ и 5 нМ и эксперименты в отношении эффекта дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 1000, 333, 111, 37, 12,3, 4,12, 1,37, 0,46 нМ.

Выделение общей РНК с исполвзованием набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, номер по каталогу 610-12).

Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем смешивали в течение 5 мин при 850 об/мин с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость смешивания была одинаковой на протяжении процесса). 10 мкл магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и смешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и смешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и смешивали в течение 1 мин. Гранулы фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Наконец, гранулам давали возможность высохнуть в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 мин при 70°C. Гранулы фиксировали на магните в течение 5 мин. Удаляли 45 мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.

Синтез кДНК с исполвзованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)

Готовили мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н₂О на реакцию. Равные объемы мастермикса и РНК смешивали до конечного объема 12 мкл для in vitro скрининга или 20 мкл для in vivo скрининга образцов. кДНК получали с применением термоциклера Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, Калифирния) посредством следующих стадий: 25°C в течение 10 мин, 37°C в течение 120 мин, 85°C в течение 5 с и хранение при 4°C.

PCR в режиме реального времени.

мкл кДНК добавляли к мастер-миксу, содержащему 2 мкл Н₂О, 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH (Life Technologies, номер по каталогу 4326317Е для клеток Hep3B, номер по каталогу 352339Е для первичных гепатоцитов мыши или обычного зонда для первичных гепатоцитов макаков-крабоеда), 0,5 мкл зонда TaqMan для С5 (Life Technologies, номер по каталогу Hs00156197_m1 для Hep3B клеток или mm00439275_m1 для первичных гепатоцитов мыши или обычного зонда для первичных гепатоцитов яванского макака) и 5 мкл зонда мастер-микс LightCycler 480 (Roche, номер по каталогу 04887301001) на лунку в 384-луночных планшетах (Roche, номер по каталогу 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе Roche LC480 Real Time PCR system (Roche) с применением AACt(RQ)анализа. Для скрининга in vitro каждый дуплекс испытывали с двумя биологическими повторами, если не указано иное, и каждый раз PCR в режиме реального времени проводили в одинаковых технических повторах. Для скрининга in vitro каждый дуплекс испытывали в одном или нескольких экспериментах (3 мыши на группу) и каждый раз PCR в режиме реального времени проводили в одинаковых технических повторах.

- 98 044245

Для вычисления относительного кратного изменения в уровнях мРНК С5, данные в реальном времени анализировали с применением ΔΔCt-способа и нормализовали в соответствии с данными анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC₅₀ вычисляли с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с таковыми для клеток, трансфицированных AD-1955 в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.

Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 представляют собой: СМЫСЛОВАЯ: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 13);

АНТИСМЫСЛОВАЯ: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 14).

Табл. 7 показывает результаты теста разовой дозы в клетках Hep3B, трансфицированных указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам.

Табл. 8 показывает результаты теста трансфекции разовой дозы в первичных гепатоцитах мыши, трансфицированных указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам.

Табл. 9 показывает результаты теста свободного поглощения разовой дозы в первичных гепатоцитах яванского макака указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам.

Табл. 10 показывает результаты теста свободного поглощения разовой дозы в первичных гепатоцитах мыши указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам.

Табл. 11 показывает зависимость доза-ответ в тесте свободного поглощения в первичных гепатоцитах яванского макака указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Указанные значения IC₅₀ представляют значения IC₅₀ относительно необработанных клеток.

Табл. 12 показывает зависимость доза-ответ в тесте свободного поглощения в первичных гепатоцитах мыши указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Указанные значения IC₅₀ представляют значения IC₅₀ относительно необработанных клеток.

Табл. 13 показывает результаты теста разовой дозы в клетках Hep3B, трансфицированных указанными модифицированными и немодифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам. Доза 0,01 нМ представляла собой разовую биологическую трансфекцию и доза 1 нМ представляла собой повторную биологическую трансфекцию.

Табл. 14 показывает результаты теста разовой дозы в первичных гепатоцитах мыши, трансфицированных указанными модифицированными и немодифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам.

Табл. 15 показывает зависимость доза-ответ в клетках Hep3B, трансфицированных указанными модифицированными и немодифицированными иРНК. Указанные значения IC₅₀ представляют значения IC₅₀ относительно необработанных клеток.

Табл. 16 показывает зависимость доза-ответ в первичных гепатоцитах мыши, трансфицированных указанными модифицированными и немодифицированными иРНК. Указанные значения IC₅₀ представляют значения IC₅₀ относительно необработанных клеток.

Таблица 2

Сокращения нуклеотидных мономеров, применяемые в представлении последовательности нуклеиновой кислоты. Следует понимать, что эти мономеры, если они присутствуют в олигонуклеотиде, взаимно связаны 5'-3'-фосфодиэфирными связями

Сокращение	Нуклеотид(ы)
А	Аденозин-3'-фосфат
Af	2'-фтораденозин-3'-фосфат
Af s	2'-фтораденозин-3'-фосфотиоат
As	аденозин-3'-фосфотиоат
С	цитидин-3'-фосфат
Cf	2'-фторцитидин-3'-фосфат

- 99 044245

Cfs	2'-фторцитидин-3 ^т-фосфотиоат
Cs	цитидин-3’-фосфотиоат
G	гуанозин-3 ^т-фосфат
Gf	2'-фторгуанозин-3'-фосфат
Gf s	2’-фторгуанозин-3'-фосфотиоат
Gs	гуанозин-3 ^т-фосфотиоат
T	5'-метилуридин-3 ^т-фосфат
Tf	2'-фтор-5-метилуридин-З'-фосфат
Tfs	2’-фтор-5-метилуридин-З'-фосфотиоат
Ts	5-метилуридин-3’-фосфотиоат
U	уридин-3’-фосфат
Uf	2'-фторуридин-3'-фосфат
Uf s	2’-фторуридин-3'-фосфотиоат
Us	уридин-3’-фосфотиоат
N	любой нуклеотид (G, А, С, Т или U)
a	2'-0-метиладенозин-З'-фосфат
as	2'-0-метиладенозин-З'-фосфотиоат
c	2'-О-метилцитидин-3’-фосфат
cs	2'-О-метилцитидин-3’-фосфотиоат
g	2'-0-метилгуанозин-З’-фосфат
gs	2'-0-метилгуанозин-З'-фосфотиоат
t	2’-О-метил-5-метилуридин-З'-фосфат
ts	2'-О-метил-5-метилуридин-З’-фосфотиоат
u	2'-О-метилуридин-3'-фосфат
US	2'-О-метилуридин-3’-фосфотиоат
S	фосфотиоатная связь
L96	N-[трис(GalNAc-алкил)-амидодеканоил)]-4гидроксипролинол-Нур-(GalNAc-алкил)3
(dt)	дезокси-тимин

Таблица 3

Последовательности немодифицированной смысловой и антисмысловой цепи dsRNA С5_____

ID дуплекса	Смысловая нить	Смысловая немодифицированная последовательность	SEQ ID NO:	Анти- смысловая	Антисмысловая немодифицированная последовательность	SEQ ID NO:	Виды_ название олигонуклеотида¹
AD- 58093.1²UM³	А-118310.1	AAUAACUCACUA UAAUUACUU	15	А-118311.1	AAGUAAUUAUAGUG AGUUAUUUU	66	NM_001735.2_151 7-1539_as
AD-58099.1 им	А-118312.1	UGACAAAAUAAC UCACUAUAA	16	А-118313.1	UUAUAGUGAGUUAU UUUGUCAAU	67	NM_001735.2_151 l-1533_as
AD-58105.1 им	А-118314.1	CUUCCUCUGGAA AUUGGCCUU	17	А-118315.1	AAGGCCAAUUUCCA GAGGAAGCA	68	NM_001735.2_273 3-2755_as
AD-58111.1 им	А-118316.1	GACAAAAUAACU CACUAUAAU	18	А-118317.1	AUUAUAGUGAGUUA UUUUGUCAA	69	NM_001735.2_151 2-1534_as

- 100044245

AD-58117.1 UM	A-118318.1	UCCUCUGGAAAU UGGCCUUCA	19	A-118319.1	UGAAGGCCAAUUUC CAGAGGAAG	70	NM_001735.2_273 5-2757_as
AD-58123.1 UM	A-118320.1	AAGCAAGAUAUU UUUAUAAUA	20	A-118321.1	UAUUAUAAAAAUAU CUUGCUUUU	71	NM_001735.2_784 -806_as
AD-58129.1 UM	A-118322.1	AAAAUGUUUUUG UCAAGUACA	21	A-118323.1	UGUACUUGACAAAA ACAUUUUCU	72	NM_001735.2_474 4-4766_as
AD-58088.1 UM	A-118324.1	AUUUAAACAACA AGUACCUUU	22	A-118325.1	AAAGGUACUUGUUG UUUAAAUCU	73	NM_001735.2_982 -1004_as
AD-58094.1 UM	A-118326.1	AUUCAGAAAGUC UGUGAAGGA	23	A-118327.1	UCCUUCACAGACUU UCUGAAUUU	74	NM_001735.2_457 8-4 600_as
AD-58100.1 UM	A-118328.1	ACACUGAAGCAU UUGAUGCAA	24	A-118329.1	UUGCAUCAAAUGCU UCAGUGUAU	75	NM_001735.2_169 -191_as
AD-58106.1 UM	A-118330.1	GCAGUUCUGUGU UAAAAUGUC	25	A-118331.1	GACAUUUUAACACA GAACUGCAU	76	NM_001735.2_259 l-2613_as
AD-58112.1 UM	A-118332.1	AGGAUUUUGAGU GUAAAAGGA	26	A-118333.1	UCCUUUUACACUCA AAAUCCUUU	77	NM_001735.2_295 5-2977_as
AD-58118.1 UM	A-118334.1	AAUGAUGAACCU UGUAAAGAA	27	A-118335.1	UUCUUUACAAGGUU CAUCAUUUU	78	NM_001735.2_202 5-2047_as
AD-58124.1 UM	A-118336.1	AUCAUUGGAACA UUUUUCAUU	28	A-118337.1	AAUGAAAAAUGUUC CAAUGAUUU	79	NM_001735.2_311 8-3140_as
AD-58130.1 UM	A-118338.1	AGCCAGAAAUUC GGAGUUAUU	29	A-118339.1	AAUAACUC C GAAUU UCUGGCUUG	80	NM_001735.2_231 7-2339_as
AD-58089.1 UM	A-118340.1	UCCCUGGGAGAU AAAACUCAC	30	A-118341.1	GUGAGUUUUAUCUC CCAGGGAAA	81	NM_001735.2_361 8-3 64 0_as
AD-58095.1 UM	A-118342.1	GAAAAUGAUGAA CCUUGUAAA	31	A-118343.1	UUUACAAGGUUCAU CAUUUUCUU	82	NM_001735.2_202 2-2044_as
AD-58101.1 UM	A-118344.1	AUUGCUCAAGUC ACAUUUGAU	32	A-118345.1	AUCAAAUGUGACUU GAGCAAUUC	83	NM_001735.2_918 -940 as
AD-58107.1 UM	A-118346.1	GAGAUUGCAUAU GCUUAUAAA	33	A-118347.1	UUUAUAAGCAUAUG CAAUCUCUG	84	NM_001735.2_469 8-4720_as
AD-58113.1 UM	A-118348.1	GUUAUCCUGAUA AAAAAUUUA	34	A-118349.1	UAAAUUUUUUAUCA GGAUAACUU	85	NM_001735.2_205 -227_as
AD-58119.1 UM	A-118350.1	AGGAAGUUUGCA GCUUUUAUU	35	A-118351.1	AAUAAAAGCUGCAA ACUUCCUCA	86	NM_001735.2_414 7-4169_as
AD-58125.1 UM	A-118352.1	GAAGAAAUUGAU CAUAUUGGA	36	A-118353.1	UC CAAUAUGAUCAA UUUCUUCUA	87	NM_001735.2_555 -577_as
AD-58131.1 UM	A-118354.1	AUCCUGAUAAAA AAUUUAGUU	37	A-118355.1	AACUAAAUUUUUUA UCAGGAUAA	88	NM_001735.2_208 -230_as
AD-58090.1 UM	A-118356.1	UGGAAAAGAAAU CUUAGUAAA	38	A-118357.1	UUUACUAAGAUUUC UUUUCCAAA	89	NM_001735.2_278 6-2808_as
AD-58096.1 UM	A-118358.1	UCUUAUCAAAGU AUAAACAUU	39	A-118359.1	AAUGUUUAUACUUU GAUAAGAUG	90	NM_001735.2_159 6-1618_as
AD-58102.1 UM	A-118360.1	UCCCUACAAACU GAAUUUGGU	40	A-118361.1	AC CAAAUUCAGUUU GUAGGGAGA	91	NM_001735.2_108 2-1104_as

- 101 044245

AD-58108.1 им	А-118362.1	CAGGAGCAAACA UAUGUCAUU	41	A-118363.1	AAUGACAUAUGUUU GCUCCUGUC	92	NM_001735.2 109_as	_87-
AD-58114.1 им	А-118364.1	ACAUGUAACAAC UGUAGUUCA	42	A-118365.1	UGAACUACAGUUGU UACAUGUAC	93	NM_001735.2_ 9-4131_as	_410
AD-58120.1 им	А-118366.1	CAGGAAAUCAUU GGAACAUUU	43	A-118367.1	AAAUGUUCCAAUGA UUUCCUGUU	94	NM_001735.2_ 2-3134_as	_311
AD-58126.1 им	А-118368.1	UUUAAGAAUUUU GAAAUUACU	44	A-118369.1	AGUAAUUUCAAAAU UCUUAAAGU	95	NM_001735.2 -781_as	_759
AD-58132.1 им	А-118370.1	UAUUCUGCAACU GAAUUCGAU	45	A-118371 .1	AUCGAAUUCAGUUG CAGAAUAAC	96	NM_001735.2_ 2-4434_as	_441
AD-58091.1 им	А-118372.1	GCCCUUGGAAAG AGUAUUUCA	46	A-118373.1	UGAAAUACUCUUUC CAAGGGCUU	97	NM_001735.2 6-1908_as	_18 8
AD-58097.1 им	А-118374.1	CCUGAUAAAAAA UUUAGUUAC	47	A-118375.1	GUAACUAAAUUUUU UAUCAGGAU	98	NM_001735.2 -232_as	_210
AD-58103.1 им	А-118376.1	CCCUUGGAAAGA GUAUUUCAA	48	A-118377.1	UUGAAAUACUCUUU CCAAGGGCU	99	NM_001735.2_ 7-1909_as	_18 8
AD-58121.1 им	А-118382.1	UGCAGAUCAAAC ACAAUUUCA	49	A-118383.1	UGAAAUUGUGUUUG AUCUGCAGA	100	NM_010406.2 3-4965_as	_494
AD-58133.1 им	А-118386.1	CAGAUCAAACAC AAUUUCAGU	50	A-118387.1	ACUGAAAUUGUGUU UGAUCUGCA	101	NM_010406.2 5-4967_as	_494
AD-58116.1 им	А-118396.1	GUUCCGGAUAUU UGAACUUUU	51	A-118397.1	AAAAGUUCAAAUAU CCGGAACCG	102	NM_010406.2 0-4522_as	_450
AD-58644.1 им	А-119328 .1	AUUUAAACAACA AGUACCUUU	52	A-119329.1	AAAGGUACUUGUUG UUUAAAUCU	103	NM_001735.2 -1004_as	_982
AD-58651.1 им	А-119328.2	AUUUAAACAACA AGUACCUUU	53	A-119339.1	AAAGGUACUUGUUG UUUAAAUCU	104	NM_001735.2_ -1004_as	_982
AD-58641.1 им	А-119322.1	UGACAAAAUAAC UCACUAUAA	54	A-119323.1	UUAUAGUGAGUUAU UUUGUCAAU	105	NM_001735.2 l-1533_as	_151
AD-58648.1 им	А-119322.2	UGACAAAAUAAC UCACUAUAA	55	A-119336.1	UUAUAGUGAGUUAU UUUGUCAAU	106	NM_001735.2 l-1533_as	_151
AD-58642.1 им	А-119324.1	GACAAAAUAACU CACUAUAAU	56	A-119325.1	AUUAUAGUGAGUUA UUUUGUCAA	107	NM_001735.2_ 2-1534_as	_151
AD-58649.1 им	А-119324.2	GACAAAAUAACU CACUAUAAU	57	A-119337.1	AUUAUAGUGAGUUA UUUUGUCAA	108	NM_001735.2 2-1534_as	_151
AD-58647.1 им	А-119334.1	GUUCCGGAUAUU UGAACUUUU	58	A-119335.1	AAAAGUUCAAAUAU CCGGAACCG	109	NM_010406.2_ 0-4522_as	_450
AD-58654.1 им	А-119334.2	GUUCCGGAUAUU UGAACUUUU	59	A-119342.1	AAAAGUUCAAAUAU CCGGAACCG	110	NM_010406.2 0-4522_as	_450
AD-58645.1 им	А-119330.1	UGCAGAUCAAAC ACAAUUUCA	60	A-119331.1	UGAAAUUGUGUUUG AUCUGCAGA	111	NM_010406.2 3-4965_as	_494
AD-58652.1 им	А-119330.2	UGCAGAUCAAAC ACAAUUUCA	61	A-119340.1	UGAAAUUGUGUUUG AUCUGCAGA	112	NM_010406.2 3-4965_as	_494
AD-58643.1 им	А-119326.1	AAGCAAGAUAUU UUUAUAAUA	62	A-119327.1	UAUUAUAAAAAUAU CUUGCUUUU	113	NM_001735.2 -806_as	_784
AD-58650.1 им	А-119326.2	AAGCAAGAUAUU UUUAUAAUA	63	A-119338.1	UAUUAUAAAAAUAU CUUGCUUUU	114	NM_001735.2 -806_as	_784
AD-58646.1 им	А-119332.1	CAGAUCAAACAC AAUUUCAGU	64	A-119333.1	ACUGAAAUUGUGUU UGAUCUGCA	115	NM_010406.2_ 5-4967_as	_494
AD-58653.1 им	А-119332.2	CAGAUCAAACAC AAUUUCAGU	65	A-119341 .1	ACUGAAAUUGUGUU UGAUCUGCA	116	NM_010406.2 5-4967_as	_494

¹ Название вида олигонуклеотида отражает запись GenBank (например, NM_001735.2) и положение в нуклеотидной последовательности записи GenBank (например, 1517-1539), на которую нацелена антисмысловая цепь.

² Число, следующее после десятичной точки, относится к номеру партии.

³ НМ = Немодифицированный.

- 102 044245

Таблица 4

Последовательности модифицированной GalNAC-коньюгированной и антисмысловой цепи dsRNA C5

ID дуплекса	Смысловая нить	Смысловая последовательность	SEQ ID NO:	Антисмысловая	Антисмысловая последовательность	SEQ ID NO:	Виды_ название олигонуклеотида⁴
AD- 58093.1	А- 118310.1	AfaUfaAfcUfcAfCfUfa UfaAfuUfaCfuUfL96	117	A- 118311.1	aAfgUfaAfuUfaUfaguGfa GfuUfaUfusUfsu	168
AD- 58099.1	А- 118312.1	UfgAfcAfaAfaUfAfAfc UfcAfcUfaUfaAfL96	118	A- 118313.1	uUfaUfaGfuGfaGfuuaUfu UfuGfuCfasAfsu	169
AD- 58105.1	А- 118314.1	CfuUfcCfuCfuGfGfAfa AfuUfgGfcCfuUfL96	119	A- 118315.1	aAfgGfcCfaAfuUfuccAfg AfgGfaAfgsCfsa	170
AD- 58111.1	А- 118316.1	GfaCfaAfaAfuAfAfCfu CfaCfuAfuAfaUfL96	120	A- 118317.1	aUfuAfuAfgUfgAfguuAfu UfuUfgUfcsAfsa	171
AD- 58117.1	А- 118318.1	UfcCfuCfuGfgAfAfAfu UfgGfcCfuUfcAfL96	121	A- 118319.1	uGfaAfgGfcCfaAfuuuCfc AfgAfgGfasAfsg	172
AD- 58123.1	А- 118320.1	AfaGfcAfaGfaUfAfUfu UfuUfaUfaAfuAfL96	122	A- 118321.1	uAfuU f aUf aAf aAf auaUf c UfuGfcUfusUfsu	173
AD- 58129.1	А- 118322.1	AfaAfaUfgUfuUfUfUfg U f cAf aG fuAf cAfL 9 6	123	A- 118323.1	uGfuAfcUfuGfaCfaaaAfa CfaUfuUfusCfsu	174
AD-	А-	AfuUfuAfaAfcAfAfCfa	124	A-	aAfaGfgUfaCfuUfguuGfu	17 5
58088.1	118324.1	AfgUfaCfcUfuUfL96	118325.1	UfuAfaAfusCfsu
AD- 58094.1	А- 118326.1	AfuUfcAfgAfaAfGfUfc UfgUfgAfaGfgAfL96	125	A- 118327.1	uCfcUfuCfaCfaGfacuUfu CfuGfaAfusUfsu	176
AD- 58100.1	А- 118328.1	AfcAfcUfgAfaGfCfAfu UfuGfaUfgCfaAfL96	126	A- 118329.1	uUfgCfaUfcAfaAfugcUfu CfaGfuGfusAfsu	177
AD- 58106.1	А- 118330.1	GfcAfgUfuCfuGfUfGfu UfaAfaAfuGfuCfL96	127	A- 118331.1	gAfcAfuUfuUfaAfcacAfg Af aCfuGfcsAfsu	178
AD- 58112.1	А- 118332.1	AfgGfaUfuUfuGfAfGfu GfuAfaAfaGfgAfL96	128	A- 118333.1	uCfcUfuUfuAfcAfcucAfa AfaUfcCfusUfsu	179
AD- 58118.1	А- 118334.1	AfaUfgAfuGfaAfCfCfu UfgUfaAfaGfaAfL96	129	A- 118335.1	uUf cUfuUf aC f aAf gguU f c AfuCfaUfusUfsu	180
AD- 58124.1	А- 118336.1	AfuCfaUfuGfgAfAfCfa UfuUfuUfcAfuUfL96	130	A- 118337.1	aAfuG f aAf aAf aU f guuC f c AfaUfgAfusUfsu	181
AD- 58130.1	А- 118338.1	Af gC f cAf gAf aAfU fUf c GfgAfgUfuAfuUfL96	131	A- 118339.1	aAfuAfaCfuCfcGfaauUfu CfuGfgCfusUfsg	182
AD- 58089.1	А- 118340.1	UfcCfcUfgGfgAfGfAfu AfaAfaCfuCfaCfL96	132	A- 118341.1	gUfgAfgUfuUfuAfucuCfc CfaGfgGfasAfsa	183

- 103 044245

AD- 58095.1	A- 118342.1	GfaAfaAfuGfaUfGfAfa CfcUfuGfuAfaAfL96	133	A- 118343.1	uUfuAfcAfaGfgUfucaUfc AfuUfuUfcsUfsu	184
AD- 58101.1	A- 118344.1	AfuUfgCfuCfaAfGfUfc AfcAfuUfuGfaUfL96	134	A- 118345.1	aUfcAfaAfuGfuGfacuUfg AfgCfaAfusUfsc	185
AD- 58107.1	A- 118346.1	GfaGfaUfuGfcAfUfAfu GfcUfuAfuAfaAfL96	135	A- 118347.1	uUfuAfuAfaGfcAfuauGfc AfaUfcUfcsUfsg	186
AD- 58113.1	A- 118348.1	GfuUfaUfcCfuGfAfUfa AfaAfaAfuUfuAfL96	136	A- 118349.1	uAfaAfuUfuUfuUfaucAfg GfaUfaAfcsUfsu	187
AD- 58119.1	A- 118350.1	AfgGfaAfgUfuUfGfCfa GfcUfuUfuAfuUfL96	137	A- 118351.1	aAfuAfaAfaGfcUfgcaAfa CfuUfcCfusCfsa	188
AD- 58125.1	A- 118352.1	GfaAfgAfaAfuUfGfAfu CfaUfaUfuGfgAfL96	138	A- 118353.1	uCfcAfaUfaUfgAfucaAfu UfuCfuUfcsUfsa	189
AD- 58131.1	A- 118354.1	AfuCfcUfgAfuAfAfAfa AfaUfuUfaGfuUfL96	139	A- 118355.1	aAfcUfaAfaUfuUfuuuAfu CfaGfgAfusAfsa	190
AD- 58090.1	A- 118356.1	Uf gG f aAf aAf gAfAfAfu CfuUfaGfuAfaAfL96	140	A- 118357.1	uUfuAfcUfaAfgAfuuuCfu UfuUfcCfasAfsa	191
AD- 58096.1	A- 118358.1	UfcUfuAfuCfaAfAfGfu AfuAfaAfcAfuUfL96	141	A- 118359.1	aAfuGfuUfuAfuAfcuuUfg AfuAfaGfasUfsg	192
AD- 58102.1	A- 118360.1	UfcCfcUfaCfaAfAfGfu GfaAfuUfuGfgUfL96	142	A- 118361.1	aC f cAf aAfuU f cAf guuU f g UfaGfgGfasGfsa	193
AD- 58108.1	A- 118362.1	GfaGfgAfgGfaAfAfGfa UfaUfgUfcAfuUfL96	143	A- 118363.1	aAfuGfaCfaUfaUfguuUfg CfuCfcUfgsUfsc	194
AD- 58114.1	A- 118364.1	AfcAfuGfuAfaGfAfAfc UfgUfaGfuUfcAfL96	144	A- 118365.1	uGfaAfcUfaCfaGfuugUfu AfcAfuGfusAfsc	195
AD- 58120.1	A- 118366.1	CfaGfgAfaAfuCfAfUfu GfgAfaGfaUfuUfL96	145	A- 118367.1	aAfaUfgUfuCfcAfaugAfu UfuCfcUfgsUfsu	196
AD- 58126.1	A- 118368.1	UfuUfaAfgAfaUfUfUfu GfaAfaUfuAfcUfL96	146	A- 118369.1	aGfuAfaUfuUfcAfaaaUfu CfuUfaAfasGfsu	197
AD- 58132.1	A- 118370.1	UfaUfuCfuGfcAfAfGfu GfaAfuUfcGfaUfL96	147	A- 118371.1	aUfcGfaAfuUfcAfguuGfc AfgAfaUfasAfsc	198
AD- 58091.1	A- 118372.1	GfcCfcUfuGfgAfAfAfg AfgUfaUfuUfcAfL96	148	A- 118373.1	uGfaAfaUfaCfuCfuuuCfc Af aGfgGfcsUfsu	199
AD- 58097.1	A- 118374.1	C f cUf gAfuAf aAfAfAf a UfuUfaGfuUfaCfL96	149	A- 118375.1	gU f aAf cU f aAf aUfuuuUfuAf uCfaGfgsAfsu	200
AD- 58103.1	A- 118376.1	GfcCfuUfgGfaAfAfGfa GfuAfuUfuCfaAfL96	150	A- 118377.1	uU f gAf aAfuAf cU f cuuU f cC f a AfgGfgsCfsu	201
AD- 58121.1	A- 118382.1	UfgGfaGfaUfcAfAfAfc Af cAf aUfuUf cAfL 9 6	151	A- 118383.1	uGfaAfaUfuGfuGfuuuGfaUfc UfgCfasGfsa	202
AD- 58133.1	A- 118386.1	CfaGfaUfcAfaAfCfAfc AfaUfuUfcAfgUfL96	152	A- 118387.1	aCfuGfaAfaUfuGfuguUfuGfa UfcUfgsCfsa	203
AD- 58116.1	A- 118396.1	GfuUfcCfgGfaUfAfUfu UfgAfaCfuUfuUfL96	153	A- 118397.1	aAf aAf gUfuC f aAf auaUf cC f g GfaAfcsCfsg	204
AD- 58644.1	A- 119328.1	AfsusUfuAfaAfcAfAfUfa Af gUfaCfcUfuUfL96	154	A- 119329.1	asAfsaGfgUfaCfuUfguuGfu UfuAfaAfuscsu	205

- 104 044245

AD- 58651.1	А- 119328.2	Af susUfuAfaAfcAfAfCfa AfgUfaCfcUfuUfL96	155	A- 119339.1	asAfsaGfsgUfsaCfsuUfs guu GfsuUfsuAfsaAfsuscsu	206
AD- 58641.1	А- 119322.1	U f s gsAf cAf aAf aU fAfAf c UfcAfcUfaUfaAfL9 6	156	A- 119323.1	usUfsaUfaGfuGfaGfuuaUfu UfuGfuCfasasu	207
AD- 58648.1	А- 119322.2	U f s gsAf cAf aAf aU fAfAf c UfcAfcUfaUfaAfL9 6	157	A- 119336.1	usUfsaUfsaGfsuGfsaGfsuua UfsuUfsuGfsuCfsasasu	208
AD- 58642.1	А- 119324.1	GfsasCfaAfaAfuAfAfCfu CfaCfuAfuAfaUfL9 6	158	A- 119325.1	asUfsuAfuAfgUfgAfguuAfu UfuUfgUfcsasa	209
AD- 58649.1	А- 119324.2	GfsasCfaAfaAfuAfAfCfu CfaCfuAfuAfaUfL96	159	A- 119337.1	asUfsuAfsuAfsgUfsgAfsguu AfsuUfsuUfsgUfscsasa	210
AD- 58647.1	А- 119334.1	GfsusUfcCfgGfaUfAfUfu UfgAfaCfuUfuUfL96	160	A- 119335.1	asAfsaAfgUfuCfaAfauaUfc CfgGfaAfcscsg	211
AD- 58654.1	А- 119334.2	GfsusUfcCfgGfaUfAfUfu UfgAfaCfuUfuUfL96	161	A- 119342.1	asAfsaAfsgUfsuCfsaAfsaua UfscCfsgGfsaAfscscsg	212
AD- 58645.1	А- 119330.1	UfsgsCfaGfaUfcAfAfAfc AfcAfaUfuUfcAfL9 6	162	A- 119331.1	usGfsaAfaUfuGfuGfuuuGfa UfcUfgCfasgsa	213
AD- 58652.1	А- 119330.2	UfsgsCfaGfaUfcAfAfAfc AfcAfaUfuUfcAfL9 6	163	A- 119340.1	usGfsaAfsaUfsuGfsuGfsuuu GfsaUfscUfsgCfsasgsa	214
AD- 58643.1	А- 119326.1	AfsasGfcAfaGfaUfAfUfu UfuUfaUfaAfuAfL96	164	A- 119327.1	usAfsuUfaUfaAfaAfauaUfc UfuGfcUfususu	215
AD- 58650.1	А- 119326.2	AfsasGfcAfaGfaUfAfUfu UfuUfaUfaAfuAfL96	165	A- 119338.1	usAfsuUfsaUfsaAfsaAfsaua UfscUfsuGfscUfsususu	216
AD- 58646.1	А- 119332.1	CfsasGfaUfcAfaAfCfAfc AfaUfuUfcAfgUfL9 6	166	A- 119333.1	asCfsuGfaAfaUfuGfuguUfuGfa UfcUfgscsa	217
AD- 58653.1	А- 119332.2	CfsasGfaUfcAfaAfCfAfc AfaUfuUfcAfgUfL9 6	167	A- 119341.1	asCfsuGfsaAfsaUfsuGfsugu UfsuGfsaUfscUfsgscsa	218

⁴ Название видов олигонуклеотида и положение в нуклеотидной последовательности GenBank записи, на которую нацелена ан тисмысловая цепь, соответствующая ему, показаны в табл. 3.

Таблица 5

Последовательности немодифицированной смысловой и антисмысловой цепи dsRNA C5

ID дуплекса	Смысловая цепь	Смысловая немодифицированная последовательность	SEQ ID NO:	Антисмысловая	Антисмысловая немодифицированная последовательность	SEQ ID NO:	Виды_ название олигонуклеотида
AD- 58143.1 UM	A- 118423.1	CACUAUAAUUAC UUGAUUU	219	A- 118424.1	AAAUCAAGUAAUUAUAGUG	302	NM_001735.2_15221540_as
AD- 58149.1 UM	A- 118425.1	UAACUCACUAUA AUUACUU	220	A- 118426.1	AAGUAAUUAUAGUGAGUUA	303	NM_001735.2_15171535_as
AD- 58155.1 UM	A- 118427.1	ACAAAAUAACUC ACUAUAA	221	A- 118428.1	UUAUAGUGAGUUAUUUUGU	304	NM—001735.2_15111529—as

- 105 044245

AD- 58161.1 UM	A- 118429.1	UCCUCUGGAAAU UGGCCUU	222	A- 118430.1	AAGGCCAAUUUCCAGAGGA	305	NM_001735.2_2733- 2751_as
AD- 58167.1 UM	A- 118431.1	CAAAAUAACUCA CUAUAAU	223	A- 118432.1	AUUAUAGUGAGUUAUUUUG	306	NM_001735.2_1512- 1530_as
AD- 58173.1 UM	A- 118433.1	CUCUGGAAAUUG GCCUUCA	224	A- 118434.1	UGAAGGCCAAUUUCCAGAG	307	NM_001735.2_2735- 2753_as
AD- 58179.1 UM	A- 118435.1	GCAAGAUAUUUU UAUAAUA	225	A- 118436.1	UAUUAUAAAAAUAUCUUGC	308	NM_001735.2_784802_as
AD- 58185.1 UM	A- 118437.1	AAUGUUUUUGUC AAGUACA	226	A- 118438.1	UGUACUUGACAAAAACAUU	309	NM_001735.2_4744- 4762_as
AD- 58144.1 UM	A- 118439.1	UUAAACAACAAG UACCUUU	227	A- 118440.1	AAAGGUACUUGUUGUUUAA	310	NM_001735.2_9821000_as
AD- 58150.1 UM	A- 118441.1	UCAGAAAGUCUG UGAAGGA	228	A- 118442.1	UCCUUCACAGACUUUCUGA	311	NM_001735.2_45784596_as
AD- 58156.1 UM	A- 118443.1	ACUGAAGCAUUU GAUGCAA	229	A- 118444.1	UUGCAUCAAAUGCUUCAGU	312	NM—001735.2_169187—as
AD- 58162.1 UM	A- 118445.1	AGUUCUGUGUU AAAAUGUC	230	A- 118446.1	GACAUUUUAACACAGAACU	313	NM—001735.2_25912609—as
AD- 58168.1 UM	A- 118447.1	GAUUUUGAGUGU AAAAGGA	231	A- 118448.1	UCCUUUUACACUCAAAAUC	314	NM—001735.2_29552973—as
AD- 58174.1 UM	A- 118449.1	UGAUGAACCUUG UAAAGAA	232	A- 118450.1	UUCUUUACAAGGUUCAUCA	315	NM—001735.2_2025- 2043—as
AD- 58180.1 UM	A- 118451.1	CAUUGGAACAUU UUUCAUU	233	A- 118452.1	AAUGAAAAAUGUUC CAAUG	316	NM—001735.2_31183136—as
AD- 58186.1 UM	A- 118453.1	CCAGAAAUUCGG AGUUAUU	234	A- 118454.1	AAUAACUCCGAAUUUCUGG	317	NM—001735.2_23172335—as
AD- 58145.1 UM	A- 118455.1	CCUGGGAGAUAAA ACUCAC	235	A- 118456.1	GUGAGUUUUAUCUCCCAGG	318	NM_001735.2_3618- 3 63 6_as

- 106 044245

AD- 58151.1 UM	A- 118457.1	AAAUGAUGAACC UUGUAAA	236	A- 118458.1	UUUACAAGGUUCAUCAUUU	319	NM_001735.2_2022- 2040_as
AD- 58157.1 UM	A- 118459.1	UGCUCAAGUCACA UUUGAU	237	A- 118460.1	AUCAAAUGUGACUUGAGCA	320	NM_001735.2_918- 936_as
AD- 58163.1 UM	A- 118461.1	GAUUGCAUAUGCU UAUAAA	238	A- 118462.1	UUUAUAAGCAUAUGCAAUC	321	NM_001735.2_46984716_as
AD- 58169.1 UM	A- 118463.1	UAUCCUGAUAAAA AAUUUA	239	A- 118464.1	UAAAUUUUUUAUCAGGAUA	322	NM_001735.2_205- 223_as
AD- 58175.1 UM	A- 118465.1	GAAGUUUGCAGCU UUUAUU	240	A- 118466.1	AAUAAAAGCUGCAAACUUC	323	NM_001735.2_4147- 4165_as
AD- 58181.1 UM	A- 118467.1	AGAAAUUGAUCAU AUUGGA	241	A- 118468.1	UC CAAUAUGAUCAAUUUCU	324	NM_001735.2_555573_as
AD- 58187.1 UM	A- 118469.1	CCUGAUAAAAAAU UUAGUU	242	A- 118470.1	AACUAAAUUUUUUAUCAGG	325	NM_001735.2_208226_as
AD- 58146.1 UM	A- 118471.1	GAAAAGAAAUCUU AGUAAA	243	A- 118472.1	UUUACUAAGAUUUCUUUUC	326	NM—001735.2_27862804—as
AD- 58152.1 UM	A- 118473.1	UUAUCAAAGUAUA AACAUU	244	A- 118474.1	AAUGUUUAUACUUUGAUAA	327	NM—001735.2_15961614—as
AD- 58158.1 UM	A- 118475.1	CCUACAAACUGAA UUUGGU	245	A- 118476.1	ACCAAAUUCAGUUUGUAGG	328	NM—001735.2_10821100—as
AD- 58164.1 UM	A- 118477.1	GGAGCAAACAUAU GUCAUU	246	A- 118478.1	AAUGACAUAUGUUUGCUCC	329	NM_001735.2_87105—as
AD- 58170.1 UM	A- 118479.1	AUGUAACAACUGU AGUUCA	247	A- 118480.1	UGAACUACAGUUGUUACAU	330	NM—001735.2_41094127—as
AD- 58176.1 UM	A- 118481.1	GGAAAUCAUUGGA ACAUUU	248	A- 118482.1	AAAUGUUCCAAUGAUUUCC	331	NM—001735.2_31123130—as
AD- 58182.1 UM	A- 118483.1	UAAGAAUUUUGAA AUUACU	249	A- 118484.1	AGUAAUUUCAAAAUUCUUA	332	NM—001735.2_759- 777_as

- 107 044245

AD- 58188.1 UM	A- 118485.1	UUCUGCAACUGAA UUCGAU	250	A- 118486.1	AUCGAAUUCAGUUGCAGAA	333	NM_001735.2_4412- 4430_as
AD- 58147.1 UM	A- 118487.1	CCUUGGAAAGAGU AUUUCA	251	A- 118488.1	UGAAAUACUCUUUCCAAGG	334	NM_001735.2_18861904_as
AD- 58153.1 UM	A- 118489.1	UGAUAAAAAAUUU AGUUAC	252	A- 118490.1	GUAACUAAAUUUUUUAUCA	335	NM_001735.2_210- 228_as
AD- 58159.1 UM	A- 118491.1	CUUGGAAAGAGU UUUCAA	253	A- 118492.1	UUGAAAUACUCUUUCCAAG	336	NM_001735.2_1887- 1905_as
AD- 58190.1 UM	A- 118519.1	CACUAUAAUUACU UGAUUU	254	A- 118520.1	AAAUCAAGUAAUUAUAGUG	337	NM_001735.2_1522- 1540_as
AD- 58196.1 UM	A- 118521.1	UAACUCACUAUAA UUACUU	255	A- 118522.1	AAGUAAUUAUAGUGAGUUA	338	NM_001735.2_15171535_as
AD- 58202.1 UM	A- 118523.1	ACAAAAUAACUCA CUAUAA	256	A- 118524.1	UUAUAGUGAGUUAUUUUGU	339	NM_001735.2_15111529—as
AD- 58208.1 UM	A- 118525.1	UCCUCUGGAAAUU GGCCUU	257	A- 118526.1	AAGGCCAAUUUCCAGAGGA	340	NM—001735.2_27332751—as
AD- 58214.1 UM	A- 118527.1	CAAAAUAACUCAC UAUAAU	258	A- 118528.1	AUUAUAGUGAGUUAUUUUG	341	NM—001735.2_1512- 1530—as
AD- 58220.1 UM	A- 118529.1	CUCUGGAAAUUGG CCUUCA	259	A- 118530.1	UGAAGGCCAAUUUCCAGAG	342	NM—001735.2_27352753—as
AD- 58226.1 UM	A- 118531.1	GCAAGAUAUUUUU AUAAUA	260	A- 118532.1	UAUUAUAAAAAUAUCUUGC	343	NM—001735.2_784- 8 02—as
AD- 58231.1 UM	A- 118533.1	AAUGUUUUUGUCA AGUACA	261	A- 118534.1	UGUACUUGACAAAAACAUU	344	NM—001735.2_4744- 4762_as
AD- 58191.1 UM	A- 118535.1	UUAAACAACAAGU ACCUUU	262	A- 118536.1	AAAGGUACUUGUUGUUUAA	345	NM—001735.2_9821000—as
AD- 58197.1 UM	A- 118537.1	UCAGAAAGUCUGU GAAGGA	263	A- 118538.1	UCCUUCACAGACUUUCUGA	346	NM—001735.2_45784596_as

- 108 044245

AD- 58203.1 UM	A- 118539.1	ACUGAAGCAUUUG AUGCAA	264	A- 118540.1	UUGCAUCAAAUGCUUCAGU	347	NM_001735.2_169187_as
AD- 58209.1 UM	A- 118541.1	AGUUCUGUGUUAA AAUGUC	265	A- 118542.1	GACAUUUUAACACAGAACU	348	NM_001735.2_2591- 2 609_as
AD- 58233.1 UM	A- 118565.1	CACUAUAAUUACU UGAUUU	266	A- 118566.1	AAAUCAAGUAAUUAUAGUG	349	NM_001735.2_1522- 1540_as
AD- 58193.1 UM	A- 118567.1	UAACUCACUAUAA UUACUU	267	A- 118568.1	AAGUAAUUAUAGUGAGUUA	350	NM_001735.2_1517- 1535_as
AD- 58199.1 UM	A- 118569.1	ACAAAAUAACUCA CUAUAA	268	A- 118570.1	UUAUAGUGAGUUAUUUUGU	351	NM_001735.2_1511- 1529_as
AD- 58205.1 UM	A- 118571.1	UCCUCUGGAAAUU GGCCUU	269	A- 118572.1	AAGGCCAAUUUCCAGAGGA	352	NM_001735.2_27332751_as
AD- 58211.1 UM	A- 118573.1	CAAAAUAACUCAC UAUAAU	270	A- 118574.1	AUUAUAGUGAGUUAUUUUG	353	NM_001735.2_15121530—as
AD- 58217.1 UM	A- 118575.1	CUCUGGAAAUUGG CCUUCA	271	A- 118576.1	UGAAGGCCAAUUUCCAGAG	354	NM—001735.2_27352753—as
AD- 58223.1 UM	A- 118577.1	GCAAGAUAUUUUU AUAAUA	272	A- 118578.1	UAUUAUAAAAAUAUCUUGC	355	NM—001735.2_784- 8 02—as
AD- 58229.1 UM	A- 118579.1	AAUGUUUUUGUC AGUACA	273	A- 118580.1	UGUACUUGACAAAAACAUU	356	NM—001735.2_4744- 4762_as
AD- 58234.1 UM	A- 118581.1	UUAAACAACAAGU ACCUUU	274	A- 118582.1	AAAGGUACUUGUUGUUUAA	357	NM—001735.2_9821000—as
AD- 58194.1 UM	A- 118583.1	UCAGAAAGUCUGU GAAGGA	275	A- 118584.1	UCCUUCACAGACUUUCUGA	358	NM—001735.2_4578- 4596_as
AD- 58200.1 UM	A- 118585.1	ACUGAAGCAUUU GAUGCAA	276	A- 118586.1	UUGCAUCAAAUGCUUCAGU	359	NM—001735.2_169187—as
AD- 58206.1 UM	A- 118587.1	AGUUCUGUGUUAA AAUGUC	277	A- 118588.1	GACAUUUUAACACAGAACU	360	NM—001735.2_25912609—as

- 109 044245

AD- 58236.1 UM	A- 118423.2	CACUAUAAUUACU UGAUUU	278	A- 118644.1	AAAUCAAGUAAUUAUAGUG	361	NM_001735.2_1522- 1540_as
AD- 58242.1 UM	A- 118425.2	UAACUCACUAUA AUUACUU	279	A- 118645.1	AAGUAAUUAUAGUGAGUUA	362	NM_001735.2_1517- 1535_as
AD- 58248.1 UM	A- 118427.2	ACAAAAUAACUC ACUAUAA	280	A- 118646.1	UUAUAGUGAGUUAUUUUGU	363	NM_001735.2_1511- 1529_as
AD- 58254.1 UM	A- 118429.2	UCCUCUGGAAAU UGGCCUU	281	A- 118647.1	AAGGCCAAUUUCCAGAGGA	364	NM_001735.2_2733- 2751_as
AD- 58260.1 UM	A- 118431.2	CAAAAUAACUCA CUAUAAU	282	A- 118648.1	AUUAUAGUGAGUUAUUUUG	365	NM_001735.2_1512- 1530_as
AD- 58266.1 UM	A- 118433.2	CUCUGGAAAUUG GCCUUCA	283	A- 118649.1	UGAAGGCCAAUUUCCAGAG	366	NM_001735.2_27352753_as
AD- 58272.1 UM	A- 118435.2	GCAAGAUAUUUU UAUAAUA	284	A- 118650.1	UAUUAUAAAAAUAUCUUGC	367	NM_001735.2_784802—as
AD- 58277.1 UM	A- 118437.2	AAUGUUUUUGUC AAGUACA	285	A- 118651.1	UGUACUUGACAAAAACAUU	368	NM—001735.2_4744- 4762_as
AD- 58237.1 UM	A- 118439.2	UUAAACAACAAG UACCUUU	286	A- 118652.1	AAAGGUACUUGUUGUUUAA	369	NM—001735.2_9821000—as
AD- 58243.1 UM	A- 118441.2	UCAGAAAGUCUG UGAAGGA	287	A- 118653.1	UCCUUCACAGACUUUCUGA	370	NM—001735.2_45784596_as
AD- 58249.1 UM	A- 118443.2	ACUGAAGCAUUU GAUGCAA	288	A- 118654.1	UUGCAUCAAAUGCUUCAGU	371	NM—001735.2_169187—as
AD- 58255.1 UM	A- 118445.2	AGUUCUGUGUU AAAAUGUC	289	A- 118655.1	GACAUUUUAACACAGAACU	372	NM—001735.2_25912609—as
AD- 58279.1 UM	A- 118423.3	CACUAUAAUUA CUUGAUUU	290	A- 118667.1	AAAUCAAGUAAUUAUAGUG	373	NM—001735.2_15221540—as
AD- 58239.1 UM	A- 118425.3	UAACUCACUAUA AUUACUU	291	A- 118668.1	AAGUAAUUAUAGUGAGUUA	374	NM—001735.2_1517- 1535—as

- 110 044245

AD- 58245.1 им	А- 118427.3	ACAAAAUAACUC ACUAUAA	292	А- 118669.1	UUAUAGUGAGUUAUUUUGU	375	NM_001735.2_1511- 1529_as
AD- 58251.1 им	А- 118429.3	UCCUCUGGAAAUU GGCCUU	293	А- 118670.1	AAGGCCAAUUUCCAGAGGA	376	NM_001735.2_2733- 2751_as
AD- 58257.1 им	А- 118431.3	CAAAAUAACUCAC UAUAAU	294	А- 118671.1	AUUAUAGUGAGUUAUUUUG	377	NM_001735.2_1512- 1530_as
AD- 58263.1 им	А- 118433.3	CUCUGGAAAUUG GCCUUCA	295	А- 118672.1	UGAAGGCCAAUUUCCAGAG	378	NM_001735.2_2735- 2753_as
AD- 58269.1 им	А- 118435.3	GCAAGAUAUUUU UAUAAUA	296	А- 118673.1	UAUUAUAAAAAUAUCUUGC	379	NM_001735.2_784802_as
AD- 58275.1 им	А- 118437.3	AAUGUUUUUGUC AAGUACA	297	А- 118674.1	UGUACUUGACAAAAACAUU	380	NM_001735.2_4744- 4762_as
AD- 58280.1 им	А- 118439.3	UUAAACAACAAGU ACCUUU	298	А- 118675.1	AAAGGUACUUGUUGUUUAA	381	NM_001735.2_9821000—as
AD- 58240.1 им	А- 118441.3	UCAGAAAGUCUGU GAAGGA	299	А- 118676.1	UCCUUCACAGACUUUCUGA	382	NM—001735.2_45784596_as
AD- 58246.1 им	А- 118443.3	ACUGAAGCAUUU GAUGCAA	300	А- 118677.1	UUGCAUCAAAUGCUUCAGU	383	NM—001735.2_169187—as
AD- 58252.1 им	А- 118445.3	AGUUCUGUGUUA AAAUGUC	301	А- 118678.1	GACAUUUUAACACAGAACU	384	NM—001735.2_2591- 2 609—as

Таблица 6

Последовательности модифицированной смысловой и антисмысловой цепи dsRNA C5

ID дуплекса	Смысловая цепь	Смысловая последовательность	SEQ ID NO:	Антисмысловая	Антисмысловая последовательность	SEQ ID NO:	Виды_ название олиго Нуклеотида⁵
AD- 58143.1	A- 118423.1	cAcuAuAAuuAcuu GAuuudTsdT	385	A-118424.1	AAAUcAAGuAAUuAuA GUGdTsdT	468
AD- 58149.1	A- 118425.1	uAAcucAcuAuAAuu AcuudTsdT	386	A-118426.1	AAGuAAUuAuAGUGAG UuAdTsdT	469
AD- 58155.1	A- 118427.1	AcAAAAuAAc u cAc u AuAAdTsdT	387	A-118428.1	UuAuAGUGAGUuAUUU UGUdTsdT	470

- 111 044245

AD- 58161.1	A- 118429.1	uccucuGGAAAuuGG ccuudTsdT	388	A-118430.1	AAGGCcAAUUUCcAGAG GAdTsdT	471
AD- 58167.1	A- 118431.1	cAAAAuAAc u cAc uAu AAudTsdT	389	A-118432.1	AUuAuAGUGAGUuAUU UUGdTsdT	472
AD- 58173.1	A- 118433.1	cucuGGAAAuuGGccu ucAdTsdT	390	A-118434.1	UGAAGGCcAAUUUCcAGA GdTsdT	473
AD- 58179.1	A- 118435.1	GcAAGAuAuuuuuAu AAuAdTsdT	391	A-118436.1	uAUuAuAAAAAuAUCU UGCdTsdT	474
AD- 58185.1	A- 118437.1	AAuGuuuuuGucAAGu AcAdTsdT	392	A-118438.1	UGuACUUGAcAAAAAcA UUdTsdT	475
AD- 58144.1	A- 118439.1	uuAAAcAAcAAGuAccu uudTsdT	393	A-118440.1	AAAGGuACUUGUUGUUu AAdTsdT	476
AD- 58150.1	A- 118441.1	ucAGAAAGucuGuGAAG GAdTsdT	394	A-118442.1	UCCUUcAcAGACUUUC UGAdTsdT	477
AD- 58156.1	A- 118443.1	AcuGAAGcAuuuGAuGc AAdTsdT	395	A-118444.1	UUGcAUcAAAUGCUUcA GUdTsdT	478
AD- 58162.1	A- 118445.1	AGuucuGuGuuAAAAuG ucdTsdT	396	A-118446.1	GAcAUUUuAAcAcAGAA GUdTsdT	479
AD- 58168.1	A- 118447.1	GAuuuuGAGuGuAAAAG GAdTsdT	397	A-118448.1	UCCUUUuAcACUcAAAA UGdTsdT	480
AD- 58174.1	A- 118449.1	uGAuGAAccuuGuAAAG AAdTsdT	398	A-118450.1	UUCUUuAcAAGGUUcAU cAdTsdT	481
AD- 58180.1	A- 118451.1	cAuuGGAAcAuuuuucA uudTsdT	399	A-118452.1	AAUGAAAAAUGUUC cAA UGdTsdT	482
AD- 58186.1	A- 118453.1	ccAGAAAuucGGAGuuA uudTsdT	400	A-118454.1	AAuAACUCCGAAUUUCU GGdTsdT	483
AD- 58145.1	A- 118455.1	с c u G G GAGAuAAAAc u c AcdTsdT	401	A-118456.1	GUGAGUUUuAUCUCCcA GGdTsdT	484
AD- 58151.1	A- 118457.1	AAAuGAuGAAccuuGuA AAdTsdT	402	A-118458.1	UUuAcAAGGUUcAUcAU UUdTsdT	485
AD- 58157.1	A- 118459.1	uGcucAAGucAcAuuuGA udTsdT	403	A-118460.1	AUcAAAUGUGACUUGAGc AdTsdT	486
AD- 58163.1	A- 118461.1	GAuuGcAuAuGcuuAuAA AdTsdT	404	A-118462.1	UUuAuAAG cAuAUG cAAU GdTsdT	487
AD- 58169.1	A- 118463.1	uAuccuGAuAAAAAAuuu AdTsdT	405	A-118464.1	uAAAUUUUUuAUcAGGAu AdTsdT	488
AD- 58175.1	A- 118465.1	GAAGuuuGcAGcuuuu AuudTsdT	406	A-118466.1	AAuAAAAGCUGcAAACU UGdTsdT	489
AD- 58181.1	A- 118467.1	AGAAAuuGAucAuAuuG GAdTsdT	407	A-118468.1	UC cAAuAUGAUcAAUUU GUdTsdT	490
AD- 58187.1	A- 118469.1	c cuGAuAAAAAAuuuAG uudTsdT	408	A-118470.1	AACuAAAUUUUUuAUcA GGdTsdT	491
AD- 58146.1	A- 118471.1	GAAAAGAAAucuuAGuAA AdTsdT	409	A-118472.1	UUuACuAAGAUUUCUU UUGdTsdT	492

- 112 044245

AD- 58152.1	A- 118473.1	uuAu cAAAGuAuAAAcA uudTsdT	410	A-118474.1	AAUGUUuAuACUUUGAu AAdTsdT	493
AD- 58158.1	A- 118475.1	ccuAcAAAcuGAAuuuGG udTsdT	411	A-118476.1	ACcAAAUUcAGUUUGuA GGdTsdT	494
AD- 58164.1	A- 118477.1	GGAGcAAAcAuAuGucAu udTsdT	412	A-118478.1	AAUGAcAuAUGUUUGCU GGdTsdT	495
AD- 58170.1	A- 118479.1	AuGuAAcAAcuGuAGuuc AdTsdT	413	A-118480.1	UGAACuAcAGUUGUuAc AUdTsdT	496
AD- 58176.1	A- 118481.1	GGAAAucAuuGGAAcAuu udTsdT	414	A-118482.1	AAAUGUUC cAAUGAUUU GGdTsdT	497
AD- 58182.1	A- 118483.1	uAAGAAuuuuGAAAuuAc udTsdT	415	A-118484.1	AGuAAUUUcAAAAUUC UuAdTsdT	498
AD- 58188.1	A- 118485.1	uucuGcAAcuGAAuucGA udTsdT	416	A-118486.1	AUGGAAUUcAGUUGcA GAAdTsdT	499
AD- 58147.1	A- 118487.1	ccuuGGAAAGAGuAuuuc AdTsdT	417	A-118488.1	UGAAAuACUCUUUC cAA GGdTsdT	500
AD- 58153.1	A- 118489.1	uGAuAAAAAAuuuAGuuA cdTsdT	418	A-118490.1	GuAACuAAAUUUUUuAU cAdTsdT	501
AD- 58159.1	A- 118491.1	cuuGGAAAGAGuAuuucA AdTsdT	419	A-1184 92.1	UUGAAAuACUCUUUC cA AGdTsdT	502
AD- 58190.1	A- 118519.1	CACUAUAAUUACUUGAUU UdTdT	420	A-118520.1	AAAUCAAGUAAUUAUA GUGdTdT	503
AD- 58196.1	A- 118521.1	UAACUCACUAUAAUUAC UUdTdT	421	A-118522.1	AAGUAAUUAUAGUGAGU UAdTdT	504
AD- 58202.1	A- 118523.1	ACAAAAUAACUCACUAU AAdTdT	422	A-118524.1	UUAUAGUGAGUUAUUUU UdTdT	505
AD- 58208.1	A- 118525.1	UCCUCUGGAAAUUGGCC UUdTdT	423	A-118526.1	AAGGCCAAUUUCCAGAG GAdTdT	506
AD- 58214.1	A- 118527.1	CAAAAUAACUCACUAUA AUdTdT	424	A-118528.1	AUUAUAGUGAGUUAUU UUGdTdT	507
AD- 58220.1	A- 118529.1	CUCUGGAAAUUGGCCUU CAdTdT	425	A-118530.1	UGAAGGCCAAUUUCCAG AGdTdT	508
AD- 58226.1	A- 118531.1	GCAAGAUAUUUUUAUA AUAdTdT	426	A-118532.1	UAUUAUAAAAAUAUCUU GCdTdT	509
AD- 58231.1	A- 118533.1	AAUGUUUUUGUCAAGUA CAdTdT	427	A-118534.1	UGUACUUGACAAAAACA UUdTdT	510
AD- 58191.1	A- 118535.1	UUAAACAACAAGUAC CU UUdTdT	428	A-118536.1	AAAGGUACUUGUUGUUU AAdTdT	511
AD- 58197.1	A- 118537.1	UCAGAAAGUCUGUGAAG GAdTdT	429	A-118538.1	UCCUUCACAGACUUUCU GAdTdT	512
AD- 58203.1	A- 118539.1	ACUGAAGCAUUUGAUGC AAdTdT	430	A-118540.1	UUGCAUCAAAUGCUUCAG UdTdT	513
AD- 58209.1	A- 118541.1	AGUUCUGUGUUAAAAUG UCdTdT	431	A-118542.1	GACAUUUUAACACAGAA CUdTdT	514

- 113 044245

AD- 58233.1	A- 118565.1	C fAC fU fAU fAAU fU fAC fUfUfGAUfUfUfdTsdT	432	A-118566.1	AAAUC fAAGU fAAUU fA UfAGUGdTsdT	515
AD- 58193.1	A- 118567.1	U fAAC fU f C fAC fU fAU fAAUfUfACfUfUfdTsdT	433	A-118568.1	AAGU fAAUU fAU fAGUG AGUUfAdTsdT	516
AD- 58199.1	A- 118569.1	AC fAAAAU fAAC fU f C fA CfUfAUfAAdTsdT	434	A-118570.1	UU fAU fAGUGAGUU fAU UUUGUdTsdT	517
AD- 58205.1	A- 118571.1	UfCfCfUfCfUfGGAAAU fUfGGCfCfUfUfdTsdT	435	A-118572.1	AAGGCC fAAUUUCC fAG AGGAdTsdT	518
AD- 58211.1	A- 118573.1	C fAAAAU fAAC fU f C fAC fUfAUfAAUfdTsdT	436	A-118574.1	AUU fAU fAGUGAGUU fA UUUUGdTsdT	519
AD- 58217.1	A- 118575.1	CfUfCfUfGGAAAUfUfG GCfCfUfUfCfAdTsdT	437	A-118576.1	UGAAGGCC fAAUUUCC fA GAGdTsdT	520
AD- 58223.1	A- 118577.1	GC fAAGAU fAU fU fU fU fUfAUfAAUfAdTsdT	438	A-118578.1	U fAUU fAU fAAAAAU fA UCUUGCdTsdT	521
AD- 58229.1	A- 118579.1	AAUfGUfUfUfUfUfGU fCfAAGUfACfAdTsdT	439	A-118580.1	UGU fACUUGAC fAAAAA CfAUUdTsdT	522
AD- 58234.1	A- 118581.1	U fU fAAAC fAAC fAAGU f ACfCfUfUfUfdTsdT	440	A-118582.1	AAAGGU fACUUGUUGUUU fAAdTsdT	523
AD- 58194.1	A- 118583.1	UfCfAGAAAGUfCfUfGU fGAAGGAdTsdT	441	A-118584.1	UCCUUC fAC fAGACUUU CUGAdTsdT	524
AD- 58200.1	A- 118585.1	AC fU f GAAGC fAU fUfUf GAUfGCfAAdTsdT	442	A-118586.1	UUGC fAUC fAAAUGCUU CfAGUdTsdT	525
AD- 58206.1	A- 118587.1	AGUfUfCfUfGUfGUfUf AAAAUfGUfCfdTsdT	443	A-118588.1	GAC fAUUUU fAAC fAC fA GAACUdTsdT	526
AD- 58236.1	A- 118423.2	cAcuAuAAuuAcuuGAuu udTsdT	444	A-118644.1	AAAUcAAGuAAUuAuAG uGdTsdT	527
AD- 58242.1	A- 118425.2	uAAc u cAc uAuAAuuAc u udTsdT	445	A-118645.1	AAGuAAUuAuAGuGAGU uAdTsdT	528
AD- 58248.1	A- 118427.2	AcAAAAuAAc u cAc uAuA AdTsdT	446	A-118646.1	UuAuAGuGAGUuAuUuu GUdTsdT	529
AD- 58254.1	A- 118429.2	uccucuGGAAAuuGGccu udTsdT	447	A-118647.1	AAGGCcAAuUUCcAGAGG AdTsdT	530
AD- 58260.1	A- 118431.2	cAAAAuAAc u cAc uAuAA udTsdT	448	A-118648.1	AUuAuAGuGAGUuAuUuu GdTsdT	531
AD- 58266.1	A- 118433.2	cucuGGAAAuuGGccuu cAdTsdT	449	A-118649.1	uGAAGGCcAAuUUCcAG AGdTsdT	532
AD- 58272.1	A- 118435.2	GcAAGAuAuuuuuAuAA uAdTsdT	450	A-118650.1	uAUuAuAAAAAuAUCuuG CdTsdT	533
AD- 58277.1	A- 118437.2	AAuGuuuuuGucAAGuA cAdTsdT	451	A-118651.1	uGuACuuGAcAAAAAcAu UdTsdT	534
AD- 58237.1	A- 118439.2	uuAAAcAAcAAGuAc cu uudTsdT	452	A-118652.1	AAAGGuACuuGuuGuUuA AdTsdT	535
AD- 58243.1	A- 118441.2	ucAGAAAGucuGuGAAG GAdTsdT	453	A-118653.1	UCCuUcAcAGACuUUCuGA dTsdT	536

- 114 044245

AD- 58249.1	А- 118443.2	AcuGAAGcAuuuGAuGc AAdTsdT	454	A-118654.1	uuGcAUcAAAuGCuUcAGU dTsdT	537
AD- 58255.1	А- 118445.2	AGuucuGuGuuAAAAuG ucdTsdT	455	A-118655.1	GAcAuUUuAAcAcAGAACU dTsdT	538
AD- 58279.1	А- 118423.3	cAcuAuAAuuAcuuGAu uudTsdT	456	A-118667.1	AAAU CAAGuAAuuAuAgu g dTsdT	539
AD- 58239.1	А- 118425.3	uAAcucAcuAuAAuuAc uudTsdT	457	A-118668.1	AAGuAAuUAuAGuGAGuua dTsdT	540
AD- 58245.1	А- 118427.3	AcAAAAuAAc u cAc uAu AAdTsdT	458	A-118669.1	UuAuAGuGAGuuAuuuugu dTsdT	541
AD- 58251.1	А- 118429.3	uccucuGGAAAuuGGcc uudTsdT	459	A-118670.1	AAGGCCAAuUuCCAGAgg dTsdT	542
AD- 58257.1	А- 118431.3	cAAAAuAAc u cAc uAuA AudTsdT	460	A-118671.1	AuUAuAGuGAGuuAuuuug dTsdT	543
AD- 58263.1	А- 118433.3	cucuGGAAAuuGGccuu cAdTsdT	461	A-118672.1	UGAAGGCCAAuuuCCAgag dTsdT	544
AD- 58269.1	А- 118435.3	GcAAGAuAuuuuuAuAA uAdTsdT	462	A-118673.1	UAuUAuAAAAAuAu C u u g c d TsdT	545
AD- 58275.1	А- 118437.3	AAuGuuuuuGucAAGuA cAdTsdT	463	A-118674.1	UGuACuUGACAAAAACauu dTsdT	546
AD- 58280.1	А- 118439.3	uuAAAcAAcAAGuAc cu uudTsdT	464	A-118675.1	AAAGGuACuUGuuGuuuaa dTsdT	547
AD- 58240.1	А- 118441.3	ucAGAAAGucuGuGAAG GAdTsdT	465	A-118676.1	UCCuUCACAGACuuuCuga dTsdT	548
AD- 58246.1	А- 118443.3	AcuGAAGcAuuuGAuGc AAdTsdT	466	A-118677.1	UuGCAUCAAAuGCuuCagu dTsdT	549
AD- 58252.1	А- 118445.3	AGuucuGuGuuAAAAuG ucdTsdT	467	A-118678.1	GACAuUuUAACACAGAa cud TsdT	550

⁵ Название видов олигонуклеотида и положение в нуклеотидной последовательности GenBank записи, на которую нацелена антисмысловая цепь, соответствующая ему, показаны в табл. 5.

- 115 044245

Таблица 7

Тест разовой дозы С5 в клетках НерЗВ с GalNAC-коньюгированными иРНК

ID дуплекса	10 нМ AVG	0,1 нм AVG	10 нМ STDEV	0, 1 нМ STDEV
AD-58093.1	15, 62	21, 60	7,48	6, 52
AD-58099.1	9, 07	14,70	1,18	4, 65
AD-58105.1	36,71	60,23	5, 07	19, 83
AD-58111.1	11,83	22,78	3,51	12,75
AD-58117.1	12,43	33,46	2,00	23,56
AD-58123.1	8,05	15, 18	2,89	7,94
AD-58129.1	10,77	40, 06	1,30	19, 66
AD-58088.1	6, 55	16,40	1,24	4,58
AD-58094.1	19, 59	40, 68	7, 64	12,30
AD-58100.1	10, 92	20, 12	0,74	8,38
AD-58106.1	10, 97	37,23	2,49	19, 95
AD-58112.1	13,24	29, 32	2,90	14,08
AD-58118.1	6, 63	15, 23	0,54	5, 72
AD-58124.1	7,17	13, 00	1,44	6,48
AD-58130.1	10,38	17,92	2,36	6, 92
AD-58089.1	8,81	30, 67	2,91	10,53
AD-58095.1	8,72	14, 66	1,04	3,37
AD-58101.1	8,17	19,36	1,30	5, 69
AD-58107.1	4,84	18,10	1, 66	7,21
AD-58113.1	8,78	14, 62	1,77	7,89
AD-58119.1	8,90	15, 01	0, 91	7,35
AD-58125.1	11, 13	17,04	2, 61	9, 03
AD-58131.1	13,50	40, 14	1,08	12,07
AD-58090.1	7,90	21,57	2,95	6, 61
AD-58096.1	8,02	16, 56	1,54	6, 68
AD-58102.1	12,40	27,93	1,83	11,78
AD-58108.1	12,02	15, 07	2,88	5, 74
AD-58114.1	11,86	25, 05	1,48	9,46
AD-58120.1	7, 65	10,57	0,58	3,56
AD-58126.1	8,45	15, 39	2,08	7,42
AD-58132.1	8,50	19,26	2,52	9, 38
AD-58091.1	8, 68	18,05	2,95	6, 62
AD-58097.1	9, 31	23, 02	0, 67	10, 10
AD-58103.1	8,53	17,23	2,90	7,27
AD-1955	57,41	81,16	10,76	5,29
Имитация	78, 61	75, 97	5,70	2,76
Необработанные	100	100	6, 13	5, 98

- 116 044245

Таблица 8

Тест трансфекции разовой дозы С5 в первичных гепатоцитах мыши с GalNAC-коньюгированными иРНК

ID дуплекса	10 нМ AVG	0, 1 нм AVG	10 нМ STDEV	0,1 нМ STDEV
AD-58093.1	1,53	1, 65	0, 17	0,25
AD-58099.1	1, 65	1,50	0, 61	0,22
AD-58105.1	11,20	46, 95	0, 08	3, 89
AD-58111.1	2,49	2,13	0,26	0,20
AD-58117.1	3, 57	31, 91	0, 93	0, 62
AD-58123.1	4,29	2,97	0,11	2,22
AD-58129.1	1, 19	8,53	0,23	0, 72
AD-58088.1	0, 84	1,34	0, 68	0, 07
AD-58094.1	И, 34	66, 82	0, 17	3, 01
AD-58100.1	2,78	1,51	0,43	0, 33
AD-58106.1	6, 79	52, 91	4,42	6, 78
AD-58121.1	1, 94	2,15	0, 04	0, 91
AD-58133.1	1,74	3,25	0,19	1, 64
AD-58116.1	1,76	2,21	1,27	0, 78
AD-1955	87,39	91,71	5,77	4, 68
Имитация	79, 67	89, 02	1,51	3, 91
Необработанные	100	100	6, 39	13, 11

Таблица 9

Тест разовой дозы С5 в первичных гепатоцитах яванского макака с GalNAC-коньюгированными иРНК

ID дуплекса	500 нМ AVG	5 нМ AVG	500 нМ STDEV	5 нМ STDEV
AD-58093.1	63, 94	83, 09	2, 14	12, 65
AD-58099.1	61,34	85, 85	12,32	21,95
AD-58105.1	91,98	97,57	6, 09	11,48
AD-58111.1	71,27	92,28	1, 93	12,72
AD-58117.1	73,42	88,82	3,24	И, 08
AD-58123.1	75, 14	73, 06	7, 72	9,71
AD-58129.1	81, 66	90, 62	2, 13	4,77
AD-58088.1	53, 63	87,03	5, 93	19, 86
AD-58094.1	89, 62	93, 65	0, 87	14,76
AD-58100.1	79, 56	96,70	4,31	1,10
AD-58106.1	116,24	125,99	14,28	40, 65
AD-58112.1	97,19	107,81	N/A	3, 13
AD-58118.1	67,40	97,38	5,28	22, 64
AD-58124.1	58,04	96, 14	8,72	10, 64
AD-58130.1	84,19	88, 65	10,50	4,34
AD-58089.1	83, 83	83,44	1, 91	12,26
AD-58095.1	58,53	78,02	15, 07	12,45
AD-58101.1	76, 68	76, 73	3, 95	6, 35
AD-58107.1	57,37	86,78	14,71	2,99
AD-58113.1	37,79	71,10	8,27	7,76
AD-58119.1	36, 77	83,16	3, 42	9, 66
AD-58125.1	72,40	96, 53	4,46	4,96
AD-58131.1	95, 58	101,69	10, 17	2,21
AD-58090.1	56, 37	75, 00	3,21	4,97
AD-58096.1	44,33	57,99	11,46	25, 17
AD-58102.1	95,46	89, 35	0, 83	1,76

- 117 044245

AD-58108.1	41,54	56,41	8,41	0, 14
AD-58114.1	88,32	101,88	20, 02	30,29
AD-58120.1	37,34	56,41	0, 73	2,14
AD-58126.1	84,97	105,90	2,39	7,96
AD-58132.1	81,55	85, 12	12,93	8,94
AD-58091.1	78,88	84, 60	44, 66	17,40
AD-58097.1	106,06	98,16	13,74	3, 14
AD-58103.1	57,21	89,46	6, 40	5, 93
Необработанные	100	100	8,77	10,33

Таблица 10

Тест свободного поглощения разовой дозы С5 в первичных гепатоцитах мыши с GalNAC-коньюгированными иРНК

ID дуплекса	500 нМ AVG	5 нМ AVG	500 нМ STDEV	5 нМ STDEV
AD-58093.1	31, 62	64,91	7,13	8,39
AD-58099.1	9,46	29, 63	1,29	5, 66
AD-58105.1	84,77	96,41	5, 22	1, 89
AD-58111.1	17,35	50,95	1,21	3, 16
AD-58117.1	94, 95	139,52	15, 43	43,39
AD-58123.1	13, 07	44,58	2,11	3, 49
AD-58129.1	68, 87	85, 04	2, 62	4,42
AD-58088.1	17, 61	48,22	2,22	3, 40
AD-58094.1	95, 92	104,23	4,16	6, 53
AD-58100.1	34, 92	61,71	1,30	2, 15
AD-58106.1	85,26	107,53	2,30	3, 38
AD-58121.1	12, 88	43,76	1,41	1,28
AD-58133.1	20, 97	42,76	0,24	0, 11
AD-58116.1	8,35	38,04	1,35	1,40
Необработанные	100,00	100,00	3, 85	4,38

Таблица 11

Значения IC₅₀ в первичных гепатоцитах яванского макака с GalNAC-коньюгированными иРНК

ID дуплекса	1С₅₀ (нМ)	STDEV
AD-58099.1	3, 131	1, 141
AD-58111.1	12,750	5,280
AD-58123.1	0, 679	7,587
AD-58088.1	0,218	3,487
AD-58113.1	7,296	3,540
AD-58119.1	33,240	14,740
AD-58096.1	10,380	4, 199
AD-58108.1	0, 953	10,080
AD-58120.1	36,170	88,070

- 118 044245

Таблица 12

Значения 1С₅о в первичных гепатоцитах мыши с GalNAC-коньюгированными иРНК

ID дуплекса	1С₅₀ (нМ)	STDEV
AD-58099	3,777	0, 122
AD-58111	0, 622	2,421
AD-58123	0,549	1, 626
AD-58088	9, 513	2,588
AD-58121	2,169	1,176
AD-58133	3, 802	1,006
AD-58116	2,227	0, 604
AD-58644.1	4,596	0,3506
AD-58651.1	59,76	51,99
AD-58641.1	0, 82	0,2618
AD-58648.1	7,031	1,256
AD-58642.1	0,5414	0,7334
AD-58649.1	3,32	4,922
AD-58647.1	1,356	0,5215
AD-58654.1	2,09	0,8338
AD-58645.1	2,944	0,3315
AD-58652.1	5, 316	2,477
AD-58643.1	2,179	1,112
AD-58650.1	8,223	3,76
AD-58646.1	2,581	0, 8186
AD-58653.1	2,451	1,249

Тест разовой дозы С5 в клетках НерЗВ с модифицированными и немодифицированными иРНК

Таблица 13

Дуплекс	1 нМ AVG	0,01 нМ AVG	1 нМ STDEV	0,01 нМ STDEV
AD-58143.1	12,13	100,58	3,47	3, 94
AD-58149.1	10,46	64,97	0, 98	0, 00
AD-58155.1	44,88	76, 24	1,56	3,74
AD-58161.1	8,51	102,30	1,06	0,50
AD-58167.1	6, 54	76, 24	1,15	3,74
AD-58173.1	6, 85	107,44	0, 85	4,74
AD-58179.1	10, 19	78, 07	0,59	1,15
AD-58185.1	29, 46	79, 99	3, 64	0,78
AD-58144.1	16, 82	81, 95	1,09	0,40
AD-58150.1	11, 05	76, 20	2,55	0, 00
AD-58156.1	25, 92	76, 73	2,72	1,50
AD-58162.1	13, 25	71, 89	0,43	3, 87
AD-58168.1	9, 74	45, 16	0,52	1,11
AD-58174.1	4,84	70, 14	0,25	2,75
AD-58180.1	9,41	56, 77	1,91	1,95
AD-58186.1	9, 97	68, 91	1,03	0,34
AD-58145.1	14,29	103,38	1,94	2,03
AD-58151.1	10, 16	81, 17	1,71	4,77
AD-58157.1	4,72	63, 19	1,05	0, 00

- 119044245

AD-58163.1	4, 95	40, 13	1, 65	0,59
AD-58169.1	17,02	83, 10	1,88	2,04
AD-58175.1	8,30	62,54	0,28	0,31
AD-58181.1	21,89	55,26	4,22	3,52
AD-58187.1	61,96	71,12	2, 61	2,79
AD-58146.1	14,25	95, 23	2, 64	6, 53
AD-58152.1	11,22	70, 09	0, 80	7,88
AD-58158.1	7, 96	98,86	0,76	4,36
AD-58164.1	11, 60	43, 83	2,06	3,43
AD-58170.1	12,28	39, 59	0, 96	1,36
AD-58176.1	6, 89	38,77	1,04	1,33
AD-58182.1	18, 65	55,78	0, 96	0,55
AD-58188.1	5, 40	69, 39	1,07	0,34
AD-58147.1	8,22	106,66	0,77	2, 61
AD-58153.1	68,10	104,17	4,44	18,29
AD-58159.1	8,76	81,41	1,54	2,79
AD-58190.1	21,94	77,26	2,23	0,76
AD-58196.1	15, 97	72,43	1,07	5, 32
AD-58202.1	11,99	93, 83	5, 34	2,76
AD-58208.1	18, 63	52,07	12,88	2,55
AD-58214.1	6, 85	94,15	0,51	2,31
AD-58220.1	11,50	78,34	3, 85	0,77
AD-58226.1	5, 77	57,75	1,71	1,13
AD-58231.1	7,23	75, 67	1,07	0,74
AD-58191.1	35,40	66, 17	5, 50	4,21
AD-58197.1	12,05	67,49	1,70	0,33
AD-58203.1	15,16	66, 80	1,46	1,31
AD-58209.1	7,58	71,23	3,58	6,28
AD-58233.1	27,01	86, 02	0,86	0,42
AD-58193.1	15,37	99, 85	1,44	0, 00
AD-58199.1	21,52	78,39	6, 02	16,40
AD-58205.1	24,13	78,88	5,46	0,77

- 120 044245

AD-58211.1	16,38	32,37	2, 61	0,48
AD-58217.1	12,23	70,16	0,29	3,44
AD-58223.1	8,51	72,85	3, 01	1,79
AD-58229.1	5, 50	75, 93	1,96	0,37
AD-58234.1	46,86	101,94	15, 59	0, 00
AD-58194.1	14,49	107,05	2,47	4,20
AD-58200.1	16,21	61,04	0, 96	1,20
AD-58206.1	13,25	37,73	2,82	2,03
AD-58236.1	8,29	119,17	1,16	2,92
AD-58242.1	12,05	102,69	0,44	4,03
AD-58248.1	62,78	83,41	15, 22	3,27
AD-58254.1	11,18	100,54	1,59	0, 00
AD-58260.1	8,42	71,84	1, 10	0,35
AD-58266.1	14,05	92,21	1,91	2,26
AD-58272.1	22, 63	81, 11	1, 62	1,59
AD-58277.1	70,51	75, 67	4,80	0,74
AD-58237.1	28,10	98,56	1,96	5,79
AD-58243.1	14,16	86, 05	1,11	2,95
AD-58249.1	77, 08	96, 45	15, 14	0, 95
AD-58255.1	12,27	47,89	2,58	0, 00
AD-58279.1	25,78	94,13	5, 52	0,46
AD-58239.1	22,98	83,45	0,28	4,91
AD-58245.1	89, 60	90, 93	15, 24	0,45
AD-58251.1	28,39	86, 32	7,29	0, 00
AD-58257.1	48,97	64,53	9, 10	1,90
AD-58263.1	9, 14	83,39	1,27	1, 63
AD-58269.1	83,84	75, 94	15, 90	1,12
AD-58275.1	10,29	86, 32	0,73	0, 85
AD-58280.1	72,77	110,04	7,44	3,24
AD-58240.1	65,42	75, 69	3, 82	2,23
AD-58246.1	59, 19	65, 88	28,95	0, 65
AD-58252.1	15,35	97,26	1,14	7 , 62
Имитация	76,53	66, 57	14,26	4,72
AD-1955	72,30	82,72	19, 54	49, 99
Необработанные	100,00	100,00	21, 68	26,78

- 121 044245

Таблица 14

Тест разовой дозы С5 в первичных гепатоцитах мыши с модифицированными и ^модифицированными иРНК

			1 нМ	0, 1 нМ
ID дуплекса	1 нМ AVG	0,1 нм AVG
			STDEV	STDEV
AD-58143.1	4,51	81,77	3, 13	8,75
AD-58149.1	4, 65	73,16	3, 14	20, 17
AD-58155.1	65, 56	79, 74	4, 66	9,36
AD-58161.1	16, 82	81,11	6, 22	7,43
AD-58167.1	4,72	77,12	1,17	14,25
AD-58173.1	5, 57	76, 00	3, 14	13,52
AD-58179.1	14,55	77,88	1,44	18,40
AD-58185.1	15, 69	72,59	8, 67	7,81
AD-58144.1	8,70	91,49	0, 90	7,08
AD-58150.1	12,51	84,01	1, 64	8,20
AD-58156.1	18,23	97,32	1,47	19, 50
AD-58162.1	7,72	78,89	5, 19	13, 80
AD-58190.1	11,86	92,80	2,82	4,41
AD-58196.1	7,27	82,71	1,39	31,81
AD-58202.1	10, 67	87,11	1, 04	35,79
AD-58208.1	32,21	74,39	8, 60	27,45
AD-58214.1	4,24	67, 63	0,45	17,85
AD-58220.1	13, 64	96, 14	4,56	14,36
AD-58226.1	3, 83	63,44	1,30	11,94
AD-58231.1	5, 95	82,24	2,80	17,36
AD-58191.1	14,50	99, 50	5,48	5, 53
AD-58197.1	16, 12	93, 09	0, 81	3,21
AD-58203.1	12,52	104,63	5, 98	6, 02

- 122 044245

AD-58209.1	8,79	59, 35	3, 05	13, 07
AD-58233.1	9, 50	64,26	5, 69	8,70
AD-58193.1	8,88	89, 60	3,36	3, 08
AD-58199.1	13,56	87,14	2,18	6, 44
AD-58205.1	46, 84	89, 13	4,48	17,16
AD-58211.1	13, 10	111,62	1, 10	21,54
AD-58217.1	29,79	117,49	11,85	20,41
AD-58223.1	20,53	105,44	1,94	2,98
AD-58229.1	13,76	98,15	1, 05	9, 03
AD-58234.1	12,33	71,34	0,72	4,17
AD-58194.1	14,02	90, 60	1,39	15, 64
AD-58200.1	5, 25	90, 95	1,37	31,70
AD-58206.1	8, 19	109,47	3, 99	21,75
AD-58236.1	2,07	70, 19	0, 80	20,59
AD-58242.1	4,76	53,26	1,59	11,56
AD-58248.1	62,42	78,23	5, 47	25, 85
AD-58254.1	16, 47	70,22	2,92	21,74
AD-58260.1	2,84	75, 65	0,38	11,59
AD-58266.1	40,70	89, 88	16, 05	11,57
AD-58272.1	21,42	59, 44	13,29	10, 98
AD-58277.1	71,72	121,44	16,35	21,16
AD-58237.1	11,85	112,68	9, 22	12,88
AD-58243.1	10,46	90, 64	3,42	4,33
AD-58249.1	71,47	113,30	4,30	3, 84
AD-58255.1	6,86	78,55	2,22	28,37
AD-58279.1	7,15	74,96	2,84	4,72
AD-58239.1	13, 64	106, 45	1,87	8,25
AD-58245.1	68, 67	112,08	21,89	7,73
AD-58251.1	47,01	133,20	4, 69	7,14
AD-58257.1	30, 68	87,51	2,87	32,84
AD-58263.1	7,22	83,23	2,55	37,50
AD-58269.1	78,90	106, 06	5, 07	3, 04
AD-58275.1	8,92	95, 77	1,91	7,14
AD-58280.1	16, 67	78,47	4,15	6, 06
AD-58240.1	71,03	138,54	5, 32	10, 87
AD-58246.1	71,87	89, 02	4,95	8, 63
AD-58252.1	4,04	56, 10	1,23	12,02
Имитация	66, 84	82,81	2,75	17,19
AD-1955	87,44	102,07	3, 64	4,08
Необработанные	100,00	100,00	15,25	18,37

- 123 044245

Таблица 15

Значения IC₅₀ в клетках НерЗВ с модифицированными и немодифицированными иРНК

ID дуплекса	1С₅₀ (пМ)	STDEV
AD-58143.1	36, 35	12,26
AD-58149.1	5, 735	6, 196
AD-58161.1	78,12	26, 64
AD-58167.1	31,03	18, 14
AD-58173.1	29, 12	16, 53
AD-58236.1	52,73	32,02
AD-58242.1	8,859	4,321
AD-58260.1	7,706	5, 094
AD-58263.1	96, 64	47, 61

Таблица 16

Значения IC50 в первичных гепатоцитах мыши с модифицированными и немодифицированными иРНК

ID дуплекса	1С₅₀ (пМ)	STDEV
AD-58260.1	1, 015	0,9676
AD-58149.1	1,309	1,749
AD-58167.1	1, 991	2,477
AD-58242.1	0,5866	1,8
AD-58236.1	0,4517	0,06392
AD-58143.1	0,8876	0,1613
AD-58279.1	3, 116	0,7368
AD-58252.1	7, 153	1, 021
AD-58173.1	7, 144	19, 88
AD-58263.1	3,224	5, 478

Пример 3. Скрининг in vivo.

Выбирали подгруппу семи GalNAC-коньюгированных иРНК для дальнейшего исследования in vivo.

Мышам линии C57BL/6 (количество=3 на группу) подкожно инъецировали 10 мг/кг GalNAcконъюгированных дуплексов или равным объемом 1х физиологического раствора, забуференного фосфатом Дульбекко (DPBS) (Life Technologies, номер по каталогу 14040133). Сорок восемь часов спустя мышей умерщвляли и иссекали печень и мгновенно замораживали в жидком азоте. Печень измельчали в 2000 Geno/Grinder (SPEX, SamplePrep, Metuchen, Нью-Джерси). Применяли приблизительно 10 мг порошка печени на образец для выделения РНК. Образцы сначала гомогенизировали в TissueLyserII (Qiagen Inc., Валенсия, Калифорния), а затем экстрагировали РНК с пнабора RNeasy 96 Universal Tissue Kit (Qiagen Inc., номер по каталогу 74881) в соответствии с протоколом производителя с использованием вакуум/отжим технологии. Концентрацию РНК измеряли NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Уилмингтон, Делавэр) и доводили до 100 нг мкл. кДНК и RT-PCR проводили, как описано выше.

Результаты теста разовой дозы показаны на фиг. 2. Табл. 17 показывает результаты теста разовой дозы in vivo с указанными GalNAC-конъюгированными модифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества mRNA по отношению к обработанным DPBS мышам. В столбце Эксперименты перечислен ряд экспериментов, из которых было рассчитано среднее значение. Стандартное отклонение вычисляли у всех мышей в группе во всех анализируемых экспериментах.

- 124 044245

Таблица 17

Тест разовой дозы С5 in vivo

ID дуплекса	Эксперименты	AVG	STDEV
AD-58088.2	2	82, 66	13,54
AD-58644.1	1	37,79	9, 63
AD-58651.1	1	75, 33	5,21
AD-58099.2	2	71,94	15, 45
AD-58641.1	1	20,09	4,09
AD-58648.1	1	48,43	9, 07
AD-58111.2	3	67,17	13, 60
AD-58642.1	2	21,78	5, 32
AD-58649.1	1	45, 30	14, 02
AD-58116.2	2	70,16	10, 32
AD-58647.1	1	26, 77	4,14
AD-58654.1	1	50, 06	27, 85
AD-58121.2	2	52,56	13, 00
AD-58645.1	1	24, 60	1,29
AD-58652.1	1	52, 67	3, 87
AD-58123.2	2	65, 70	9, 60
AD-58643.1	1	23,21	2,41
AD-58 650.1	1	46, 75	14,10
AD-58133.2	3	51,98	13, 45
AD-58646.1	2	28, 67	5, 34
AD-58 653.1	1	43, 02	10, 61
PBS	3	100,00	9, 03

Две наиболее эффективных GalNa- конъюгированных иРНК далее модифицировали с включением дополнительных фосфотиоатных связей (табл. 18) и эффективность этих дуплексов определяли in vivo, как описано выше. Результаты теста разовой дозы показаны на фиг. 3 и демонстрируют, что средства, представляющие собой иРНК, с дополнительными фосфотиоатными связями являются более эффективными, чем те средства, представляющие собой иРНК, которые не имеют или содержат меньшее количество фосфотиоатных связей.

Таблица 18

GalNAC-конъюгированные иРНК С5, модифицированные фосфотиоатными связями

ID дуплекса	Смысловая нить	Смысловая последовательность	SEQ ID NO:	Антисмысловая	Антисмысловая последовательность	SEQ ID NO:	Перекрестная Реактивность
AD- 58642.1	A- 119324.1	GfsasCfaAfaAfuAfAf CfuCfaCfuAfuAfaUfL 96	551	A-119325.1	asUfsuAfuAfgUfg AfguuAfuUfuUfgU fcsasa	555	HumRheMusRat
AD- 58111.2	A- 118316.1	GfaCfaAfaAfuAfAfCf uCfaCfuAfuAfaUfL96	552	A-118317.1	aUfuAfuAfgUfgAf guuAfuUfuUfgUfc sAf sa	556	HumRheMusRat
AD- 58646.1	A- 119332.1	CfsasGfaUfcAfaAfCf Af cAfaUfuUfcAfgUfL 96	553	A-119333.1	asCfsuGfaAfaUfu GfuguUfuGfaUfcU fgscsa	557	MusRat
AD- 58133.2	A- 118386.1	CfaGfaUfcAfaAfCfAf cAfaUfuUfcAfgUfL96	554	A-118387.1	aCfuGfaAfaUfuGf uguUfuGfaUfcUfg sCf sa	558	MusRat

С учетом влияния дополнительных фосфотиоатных связей на способности сайленсинга у средств, представляющих собой иРНК, описанных выше, эффективность дополнительных дуплексов GalNACконъюгированной РНК, содержащей фосфотиоатные связи (табл. 19), определяли in vivo, как описано выше. Результаты этого теста разовой дозы показаны на фиг. 4.

Продолжительность сайленсинга AD-58642 in vivo определяли путем введения разовой дозы 2,5 мг/кг, 10 мг/кг или 25 мг/кг крысам и определения количества белка С5 (фиг. 5В), присутствующего

- 125 044245 на 7-й день, и активность белка С5 (фиг. 5А), присутствующего на дни 4 и 7. Как показано на фиг. 5, присутствует 50% уменьшение активности белка С5 по 4-й день при дозе 25 мг/кг и больше, чем на 70% снижение активности белка С5 в день 7.

Количество белка С5 определяли с помощью вестерн-блоттинга всей сыворотки. Активность белка С5 определяли в реакции гемолиза. Вкратце, фиксированное разведение С5 человека, обедненное сывороткой человека, смешивали с сывороткой мыши и инкубировали с антитело-покрытыми эритроцитами барана в течение 1 ч. Измеряли поглощение гемоглобина и рассчитывали % гемолиза по сравнению с эталонной кривой (полученной с применением серии разведений сыворотки мыши).

Эффективность AD-58642 in vivo также анализировали у мышей после однократного подкожного введения 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг AD-58642. На 5-й день анализировали мРНК С5 в образцах печени с применением qPCR, активность С5 анализировали по гемолизу и количество белка С5 определяли с помощью анализа вестерн-блот всей сыворотки.

Как показано на фиг. 6А и 6В, хотя имеется только незначительное улучшение (т.е. приблизительно 5%) в эффективности AD-58642 ингибировать мРНК С5 при дозе 25 мг/кг по сравнению с 10 мг/кг, в среднем наблюдается 85% сайленсинг при дозе 25 мг/кг. Кроме того, наблюдается эффект доза-ответ при значениях IC₅₀ приблизительно 2,5 мг/кг.

На фиг. 7А и 7В, и 8 продемонстрировано, что AD-58642 является эффективным для уменьшения количества белка С5 (фиг. 8) и активности белка С5 (7А и 7В).

Продолжительность сайленсинга AD-58641 in vivo определяли путем введения разовой дозы 0,625 мг/кг, 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5,0 мг/кг или 10 мг/кг AD-58641 мышам линии С57В1/6 (количество=3) и определения количества белка С5, присутствующего в этих животных в дни 5 и 9 с помощью анализа ELISA. Вкратце, собирали сыворотку в день 0, предварительно отобранная, и на 5-й день и 9-й день определяли количественно уровни белков С5 с помощью ELISA. Уровни белка С5 были нормализованы до уровня в день 0 в предварительно отобранной сыворотке. Как показано на фиг. 9, результаты демонстрируют, что существует дозозависимый эффект и длительный нокдаун белка С5 в сыворотке (разовая доза ED₅₀ составляла 0,6 мг/кг).

Также испытывали соединение AD-58641 на эффективность применения протокола введения нескольких доз на мышах линии C57BL/6. Мышам подкожно вводили соединение AD-58641 в дозе 0,625 мг/кг, 1,25 мг/кг или в дозе 2,5 мг/кг в дни 0, 1, 2, и 3. Сыворотку собирали в дни 0 и 8, как показано на фиг. 10, и анализировали на уровень белка С5 с помощью ELISA. Уровни С5 были нормализованы до уровня в день 0 в предварительно отобранной сыворотке. На фиг. 10 показано, что применение нескольких доз AD-58641 приводит к сайленсингу белка С5 при всех тестируемых дозах на уровне больше чем 90% сайленсинга белка С5 при дозе 2,5 мг/кг.

Соединение AD-58641 дополнительно испытывали на эффективность и оценивали кумулятивный эффект соединения на крысах с применением протокола повторного введения. Крысам линии Sprague Dawley дикого типа производили подкожную инъекцию соединения AD-58641 в дозе 2,5 мг/кг/доза или 5,0 мг/кг/доза дважды в неделю в течение 3 недель (q2w х3). Сыворотку собирали на день 0, 4, 7, 11, 14, 18, 25 и 32. Гемолитическую активность сыворотки измеряли с примененим реакции гемолиза, в котором 1:150 разбавление сыворотки крыс инкубировали с сенсибилизированными клетками крови барана и крысы в GVB++-буфере в течение 1 ч и оценивали количественно высвобождение гемоглобина путем измерения оптической плотности при 415 нм (см. фиг. 11А). Количество С5 белка, присутствующего в образцах, также определяли с помощью ELISA (фиг. 11В). Полученные результаты демонстрируют дозозависимый эффект и длительное снижение гемолитической активности, достижение приблизительно 90% ингибирования гемолитической активности.

- 126 044245

Таблица 19

Дополнительные GalNAC-конъюгированные иРНК С5, модифицированные фосфотиоатными связями

ID дуплекса	Смысловая нить	Смысловая последовательность	SEQ ID NO:	Антисмысловая	Антисмысловая последовательность	SEQ ID NO:	Начальное положение	Перекрестная Реактивность	PS#
AD- 58088.2	А- 118324.1	AfuUfuAfaAfc AfAfCfaAfgUf aCfcUfuUfL96	559	A- 118325.1	aAfaGfgUfaCfuU fguuGfuUfuAfaA fusCfsu	580	984	HumRheMus	2
AD- 58644.1	А- 119328.1	AfsusUfuAfaA fcAfAfCfaAfg UfaCfcUfuUfL 96	560	A- 119329.1	asAfsaGfgUfaCf uUfguuGfuUfuAf aAfuscsu	581	984	HumRheMus	6
		AfsusUfuAfaA			asAfsaGfsgUfsa
AD- 58651.1	А- 119328.2	fcAfAfCfaAfg UfaCfcUfuUfL	561	A- 119339.1	CfsuUfsguuGfsu UfsuAfsaAfsusc	582	984	HumRheMus	14
		96			su
AD- 58099.2	А- 118312.1	U f gAf cAf aAf a UfAfAfcUfcAf cUfaUfaAfL96	562	A- 118313.1	uUfaUfaGfuGfaG fuuaUfuUfuGfuC fasAfsu	583	1513	HumRheMusRat	2
AD- 58641.1	А- 119322.1	UfsgsAfcAfaA faUfAfAfcUfc AfcUfaUfaAfL 96	563	A- 119323.1	usUfsaUfaGfuGf aGfuuaUfuUfuGf uCfasasu	584	1513	HumRheMusRat	6
		UfsgsAfcAfaA			usUfsaUfsaGfsu
AD- 58648.1	А- 119322.2	faUfAfAfcUfc AfcUfaUfaAfL	564	A- 119336.1	GfsaGfsuuaUfsu UfsuGfsuCfsasa	585	1513	HumRheMusRat	14
		96			su
AD- 58111.2	А- 118316.1	GfaCfaAfaAfu AfAfCfuCfaCf uAfuAfaUfL96	565	A- 118317.1	aUfuAfuAfgUfgA fguuAfuUfuUfgU fcsAfsa	586	1514	HumRheMusRat	2
AD- 58642.1	А- 119324.1	GfsasCfaAfaA fuAfAfCfuCfa CfuAfuAfaUfL 96	566	A- 119325.1	asUfsuAfuAfgUf gAfguuAfuUfuUf gUfcsasa	587	1514	HumRheMusRat	6
		GfsasCfaAfaA			asUfsuAfsuAfsg
AD- 58649.1	А- 119324.2	fuAfAfCfuCfa CfuAfuAfaUfL	567	A- 119337.1	UfsgAfsguuAf su UfsuUfsgUfscsa	588	1514	HumRheMusRat	14
		96			sa
AD- 58116.2	А- 118396.1	GfuUfcCfgGfa UfAfUfuUfgAf aCfuUfuUfL96	568	A- 118397.1	aAfaAfgUfuCfaA fauaUfcCfgGfaA fcsCfsg	589	4502	MusRat	2

- 127 044245

AD- 58647.1	А- 119334.1	GfsusUfcCfgG faUfAfUfuUfg AfaCfuUfuUfL 96	569	A- 119335.1	asAfsaAfgUfuCf aAfauaUfcCfgGf aAfcscsg	590	4502	MusRat	6
AD- 58654.1	А- 119334.2	GfsusUfcCfgG faUfAfUfuUfg AfaCfuUfuUfL 96	570	A- 119342.1	asAfsaAfsgUfsu CfsaAfsauaUfsc CfsgGfsaAfscsc sg	591	4502	MusRat	14
AD- 58121.2	А- 118382.1	UfgCfaGfaUfc AfAfAfcAfcAf aUfuUfcAfL96	571	A- 118383.1	uGfaAfaUfuGfuG fuuuGfaUfcUfgC fasGfsa	592	4945	MusRat	2
AD- 58645.1	А- 119330.1	UfsgsCfaGfaU fcAfAfAfcAfc AfaUfuUfcAfL 96	572	A- 119331.1	usGfsaAfaUfuGf uGfuuuGfaUfcUf gCfasgsa	593	4945	MusRat	6
AD- 58652.1	А- 119330.2	UfsgsCfaGfaU fcAfAfAfcAfc AfaUfuUfcAfL 96	573	A- 119340.1	usGfsaAfsaUfsu GfsuGfsuuuGfsa UfscUfsgCfsasg sa	594	4945	MusRat	14
AD- 58123.2	А- 118320.1	AfaGfcAfaGfa UfAfUfuUfuUf aUfaAfuAfL96	574	A- 118321.1	uAfuUfaUfaAfaA fauaUfcUfuGfcU fusUfsu	595	786	HumRheMus	2
AD- 58643.1	А- 119326.1	AfsasGfcAfaG faUfAfUfuUfu UfaUfaAfuAfL 96	575	A- 119327.1	usAfsuUfaUfaAf aAfauaUfcUfuGf cUfususu	596	786	HumRheMus	6
AD- 58650.1	А- 119326.2	AfsasGfcAfaG faUfAfUfuUfu UfaUfaAfuAfL 96	576	A- 119338.1	usAfsuUfsaUfsa Af s aAf s auaUf s c UfsuGfscUfsusu su	597	786	HumRheMus	14
AD- 58133.2	А- 118386.1	CfaGfaUfcAfa AfCfAfcAfaUf uUfcAfgUfL96	577	A- 118387.1	aCfuGfaAfaUfuG fuguUfuGfaUfcU fgsCfsa	598	4947	MusRat	2
AD- 58646.1	А- 119332.1	CfsasGfaUfcA faAfCfAfcAfa UfuUfcAfgUfL 96	578	A- 119333.1	asCfsuGfaAfaUf uGfuguUfuGfaUf cUfgscsa	599	4947	MusRat	6
AD- 58653.1	А- 119332.2	CfsasGfaUfcA faAfCfAfcAfa UfuUfcAfgUfL 96	579	A- 119341.1	asCfsuGfsaAfsa Uf suGfsuguUfsu GfsaUfscUfsgsc sa	600	4947	MusRat	14

Пример 4. Конструирование, синтез и скрининг дополнительных siRNA in vitro конструирование siRNA.

Дуплексы С5 длиной 19 нуклеотидов как для смысловой, так и антисмысловой цепи конструировали с применением последовательности мРНК С5 человека, представленной в GenBank, № NM_001735.2. Первоначально определили пятьсот шестьдесят девять дуплексов, не содержащих повторы длиннее, чем 7 нуклеотидов, охватывая по существу весь 5480-нуклеотидный транскрипт. Все 569 дуплексов затем оценивали на предсказанную эффективность в соответствии с линейной моделью, которая оценивает пары нуклеотидов в каждом положении дуплекса, а доза и клеточная линия применяют для скрининга. Дуплексы также сопоставляли со всеми транскриптами в коллекции RefSeq человека, используя собственный алгоритм полного перебора, и считали наименьшие значения несовпадений (на цепь) к транскриптам, отличным от С5. Дуплексы синтезировали и подвергали скринингу, а затем выбирали из 569, в соответствии со следующей схемой: Начиная с 5'-конца транскрипта, дуплекс выбирали внутри окна каждые 10±2 нуклеотидов, которые:

1) имели самую высокую предсказанную эффективность,

2) имели по меньшей мере одно несовпадение в обеих цепях ко всем транскриптам, отличным от SERPINC1,

- 128 044245

3) еще не были синтезированы и не подвергались скринингу как часть других наборов дуплексов.

Если в данном окне не был идентифицирован дуплекс, который удовлетворял всем критериям, то окно пропускали.

Подробный список из 569 последовательностей смысловой и антисмысловой цепи С5 показан в табл. 20.

Эффективность in vitro дуплексов, содержащих смысловую и антисмысловую последовательности, приведенные в табл. 20, определяли с помощью следующих способов.

Клеточная культура и трансфекции.

Клетки HepG2 (ATCC, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до слияния при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в минимальной поддерживающей среде Игла (АТСС), дополненной 10% FBS, стрептомицином и глутамином (АТСС), перед отделением от чашки Петри путем обработки трипсином. Трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл каждого из 164 дуплекса siRNA в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Смесь затем инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. 80 мкл полных питательных сред без антибиотика, содержащих ~2,5х10⁴ клеток HepG2, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты выполняли при значении 20 нМ и включали наивные клетки и клетки, трансфицированные AD-1955, люцифераза-нацеленная siRNA в качестве отрицательного контроля.

Выделение общей РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, номер по каталогу 610-12).

Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем смешивали в течение 5 мин при 700об/мин на качалке с платформой (скорость смешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и смешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и смешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и смешивали в течение 1 мин. Гранулы опять фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл буфера элюирования В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулам давали возможность высохнуть в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 мин при 70°C. Гранулы фиксировали на магните в течение 5 мин. Удаляли 40 мкл супернатанта, содержащего выделенную РНК, и добавляли в другой 96-луночный планшет.

Синтез кДНК с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813).

Мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н₂О на реакцию добавляли в 10 мкл общей РНК. кДНК получали с использованием термоциклера Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, Калифирния) посредством следующих стадий: 25°C 10 мин, 37°C 120 мин, 85°C 5 с, хранение при 4°C.

PCR в режиме реального времени.

мкл кДНК добавляли к смеси мастер-микса, содержащей 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH человека (Applied Biosystems, номер по каталогу 4326317Е), 0,5 мкл зонда TaqMan для SERPINC1 человека (Applied Biosystems, номер по каталогу Hs00892758_m1) и 5 мкл зонда мастер-микс Lightcycler 480 (Roche, номер по каталогу 04887301001) в каждую лунку 384-луночного планшета (Roche, номер по каталогу 04887301001). PCR в режиме реального времени проводили в приборе LC480 Real Time PCR (Roche).

Для вычисления относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с применением AACt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 20 нМ AD-1955.

- 129 044245

Таблица 20

Дополнительные последовательности немодифицированной и антисмысловой цепи С5

Название олигонуклеотида	Положение в NM_001735.2	Смысловая последовательность	SEQ ID NO:	Антисмысловая последовательность	SEQ ID NO:
NM_001735.2_321_s	3-21	UAUCCGUGGUUUCCUGCUA	601	UAGCAGGAAACCACGGAUA	1170
NM_001735.2_10- 2 8_s	10-28	GGUUUCCUGCUACCUCCAA	602	UUGGAGGUAGCAGGAAACC	1171
NM-001735.2_22- 4 0_s	22-40	CCUCCAACCAUGGGCCUUU	603	AAAGGCCCAUGGUUGGAGG	1172
NM_001735.2_3351_s	33-51	GGGCCUUUUGGGAAUACUU	604	AAGUAUUCCCAAAAGGCCC	1173
NM_001735.2_4361_s	43-61	GGAAUACUUUGUUUUUUAA	605	UUAAAAAACAAAGUAUUC C	1174
NM_001735.2_4967_s	49-67	CUUUGUUUUUUAAUCUUCC	606	GGAAGAUUAAAAAACAAAG	1175
NM_001735.2_6381_s	63-81	CUUCCUGGGGAAAACCUGG	607	CCAGGUUUUCCCCAGGAAG	1176
NM_001735.2_71- 8 9_s	71-89	GGAAAACCUGGGGACAGGA	608	UCCUGUCCC CAGGUUUUC C	1177
NM_001735.2_8199_s	81-99	GGGACAGGAGCAAACAUAU	609	AUAUGUUUGCUCCUGUCCC	1178
NM_001735.2_91- 10 9_s	91-109	CAAACAUAUGUCAUUUCAG	610	CUGAAAUGACAUAUGUUUG	1179
NM_001735.2_102- 12 0_s	102-120	CAUUUCAGCACCAAAAAUA	611	UAUUUUUGGUGCUGAAAUG	1180
NM_001735.2_109127_s	109-127	GCAC CAAAAAUAUUC C GUG	612	CACGGAAUAUUUUUGGUGC	1181
NM_001735.2_123141_s	123-141	CCGUGUUGGAGCAUCUGAA	613	UUCAGAUGCUCCAACACGG	1182
NM_001735.2_130- 14 8_s	130-148	GGAGCAUCUGAAAAUAUUG	614	CAAUAUUUUCAGAUGCUCC	1183
NM_001735.2_139157_s	139157	GAAAAUAUUGUGAUUCAAG	615	CUUGAAUCACAAUAUUUUC	1184
NM_001735.2_150168_s	150-168	GAUUCAAGUUUAUGGAUAC	616	GUAUC CAUAAACUUGAAUC	1185
NM_001735.2_163181_s	163-181	GGAUACACUGAAGCAUUUG	617	CAAAUGCUUCAGUGUAUCC	1186
NM_001735.2_172190_s	172-190	GAAGCAUUUGAUGCAACAA	618	UUGUUGCAUCAAAUGCUUC	1187
NM_001735.2_183- 2 01_s	183-201	UGCAACAAUCUCUAUUAAA	619	UUUAAUAGAGAUUGUUGCA	1188
NM_001735.2_189207_s	189-207	AAUCUCUAUUAAAAGUUAU	620	AUAACUUUUAAUAGAGAUU	1189
NM_001735.2_201219_s	201-219	AAGUUAUC CUGAUAAAAAA	621	UUUUUUAUCAGGAUAACUU	1190

- 130 044245

NM_001735.2_209227_s	209-227	CUGAUAAAAAAUUUAGUUA	622	UAACUAAAUUUUUUAUCAG	1191
NM_001735.2_221- 2 3 9_s	221-239	UUAGUUACUCCUCAGGCCA	623	UGGCCUGAGGAGUAACUAA	1192
NM_001735.2_230- 2 4 8_s	230-248	CCUCAGGCCAUGUUCAUUU	624	AAAUGAACAUGGCCUGAGG	1193
NM_001735.2_242- 2 60_s	242-260	UUCAUUUAUC CUCAGAGAA	625	UUCUCUGAGGAUAAAUGAA	1194
NM_001735.2_252- 2 7 0_s	252-270	CUCAGAGAAUAAAUUC CAA	626	UUGGAAUUUAUUCUCUGAG	1195
NM_001735.2_259- 2 7 7_s	259-277	AAUAAAUUC CAAAACUCUG	627	CAGAGUUUUGGAAUUUAUU	1196
NM_001735.2_273291_s	273-291	CUCUGCAAUCUUAACAAUA	628	UAUUGUUAAGAUUGCAGAG	1197
NM_001735.2_282- 3 0 0_s	282-300	CUUAACAAUACAAC CAAAA	629	UUUUGGUUGUAUUGUUAAG	1198
NM_001735.2_292310_s	292-310	CAAC CAAAACAAUUGC CUG	630	CAGGCAAUUGUUUUGGUUG	1199
NM_001735.2_301319_s	301-319	CAAUUGCCUGGAGGACAAA	631	UUUGUCCUCCAGGCAAUUG	1200
NM_001735.2_313331_s	313-331	GGACAAAAC C CAGUUUCUU	632	AAGAAACUGGGUUUUGUCC	1201
NM_001735.2_322- 34 0_s	322-340	CCAGUUUCUUAUGUGUAUU	633	AAUACACAUAAGAAACUGG	1202
NM_001735.2_332350_s	332-350	AUGUGUAUUUGGAAGUUGU	634	ACAACUUC CAAAUACACAU	1203
NM_001735.2_342- 3 60_s	342-360	GGAAGUUGUAUCAAAGCAU	635	AUGCUUUGAUACAACUUCC	1204
NM_001735.2_349367_s	349-367	GUAUCAAAGCAUUUUUCAA	636	UUGAAAAAUGCUUUGAUAC	1205
NM_001735.2_361- 37 9_s	361-379	UUUUCAAAAUCAAAAAGAA	637	UUCUUUUUGAUUUUGAAAA	1206
NM_001735.2_371- 3 8 9_s	371-389	CAAAAAGAAUGCCAAUAAC	638	GUUAUUGGCAUUCUUUUUG	1207
NM_001735.2_381- 3 99_s	381-399	GC CAAUAAC CUAUGACAAU	639	AUUGUCAUAGGUUAUUGGC	1208
NM_001735.2_389407_s	389-407	CCUAUGACAAUGGAUUUCU	640	AGAAAUCCAUUGUCAUAGG	1209
NM_001735.2_399417_s	399-417	UGGAUUUCUCUUCAUUCAU	641	AUGAAUGAAGAGAAAUC CA	1210
NM_001735.2_411- 42 9_s	411-429	CAUUCAUACAGACAAAC CU	642	AGGUUUGUCUGUAUGAAUG	1211
NM_001735.2_419437_s	419-437	CAGACAAAC CUGUUUAUAC	643	GUAUAAACAGGUUUGUCUG	1212
NM_001735.2_430- 4 4 8_s	430-448	GUUUAUACUC CAGAC CAGU	644	ACUGGUCUGGAGUAUAAAC	1213
NM_001735.2_441- 4 59_s	441-459	AGAC CAGUCAGUAAAAGUU	645	AACUUUUACUGACUGGUCU	1214

- 131 044245

NM_001735.2_450468_s	450-468	AGUAAAAGUUAGAGUUUAU	646	AUAAACUCUAACUUUUACU	1215
NM_001735.2_460- 4 7 8_s	460-478	AGAGUUUAUUC GUUGAAUG	647	CAUUCAACGAAUAAACUCU	1216
NM_001735.2_470- 4 8 8_s	470-488	CGUUGAAUGACGACUUGAA	648	UUCAAGUC GUCAUUCAAC G	1217
NM_001735.2_483501_s	483-501	CUUGAAGCCAGCCAAAAGA	649	UCUUUUGGCUGGCUUCAAG	1218
NM_001735.2_490508_s	490-508	C CAGC CAAAAGAGAAACUG	650	CAGUUUCUCUUUUGGCUGG	1219
NM_001735.2_503521_s	503-521	AAACUGUCUUAACUUUCAU	651	AUGAAAGUUAAGACAGUUU	1220
NM_001735.2_513531_s	513-531	AACUUUCAUAGAUCCUGAA	652	UUCAGGAUCUAUGAAAGUU	1221
NM_001735.2_519537_s	519-537	CAUAGAUCCUGAAGGAUCA	653	UGAUCCUUCAGGAUCUAUG	1222
NM_001735.2_529547_s	529-547	GAAGGAUCAGAAGUUGACA	654	UGUCAACUUCUGAUCCUUC	1223
NM_001735.2_543561_s	543-561	UGACAUGGUAGAAGAAAUU	655	AAUUUCUUCUACCAUGUCA	1224
NM_001735.2_553571_s	553-571	GAAGAAAUUGAUCAUAUUG	656	CAAUAUGAUCAAUUUCUUC	1225
NM_001735.2_562- 58 0_s	562-580	GAUCAUAUUGGAAUUAUCU	657	AGAUAAUUC CAAUAUGAUC	1226
NM_001735.2_571- 58 9_s	571-589	GGAAUUAUCUCUUUUCCUG	658	CAGGAAAAGAGAUAAUUCC	1227
NM_001735.2_579597_s	579-597	CUCUUUUCCUGACUUCAAG	659	CUUGAAGUCAGGAAAAGAG	1228
NM_001735.2_590608_s	590-608	ACUUCAAGAUUCCGUCUAA	660	UUAGACGGAAUCUUGAAGU	1229
NM_001735.2_601619_s	601-619	С C GUCUAAUC CUAGAUAUG	661	CAUAUCUAGGAUUAGACGG	1230
NM_001735.2_610628_s	610-628	CCUAGAUAUGGUAUGUGGA	662	UC CACAUAC CAUAUCUAGG	1231
NM_001735.2_623641_s	623-641	UGUGGACGAUCAAGGCUAA	663	UUAGCCUUGAUCGUCCACA	1232
NM_001735.2_629647_s	629-647	CGAUCAAGGCUAAAUAUAA	664	UUAUAUUUAGC CUUGAUC G	1233
NM_001735.2_642- 6 60_s	642-660	AUAUAAAGAGGACUUUUCA	665	UGAAAAGUC CUCUUUAUAU	1234
NM_001735.2_649667_s	649-667	GAGGACUUUUCAACAACUG	666	CAGUUGUUGAAAAGUCCUC	1235
NM_001735.2_662- 68 0_s	662-680	CAACUGGAACCGCAUAUUU	667	AAAUAUGCGGUUCCAGUUG	1236
NM_001735.2_672690_s	672-690	CGCAUAUUUUGAAGUUAAA	668	UUUAACUUCAAAAUAUGCG	1237
NM_001735.2_683- 7 01_s	683-701	AAGUUAAAGAAUAUGUCUU	669	AAGACAUAUUCUUUAACUU	1238

- 132044245

NM_001735.2_691- 7 0 9_s	691-709	GAAUAUGUCUUGCCACAUU	670	AAUGUGGCAAGACAUAUUC	1239
NM_001735.2_703721_s	703-721	CCACAUUUUUCUGUCUCAA	671	UUGAGACAGAAAAAUGUGG	1240
NM_001735.2_713- 7 31_s	713-731	CUGUCUCAAUCGAGCCAGA	672	UCUGGCUCGAUUGAGACAG	1241
NM_001735.2_719737_s	719-737	C AAUC GAG С C AGAAUAUAA	673	UUAUAUUCUGGCUCGAUUG	1242
NM_001735.2_730- 7 4 8_s	730-748	GAAUAUAAUUUCAUUGGUU	674	AAC CAAUGAAAUUAUAUUC	1243
NM_001735.2_742- 7 60_s	742-760	AUUGGUUACAAGAACUUUA	675	UAAAGUUCUUGUAACCAAU	1244
NM_001735.2_752- 7 7 0_s	752-770	AGAACUUUAAGAAUUUUGA	676	UCAAAAUUCUUAAAGUUCU	1245
NM_001735.2_762- 7 8 0_s	762-780	GAAUUUUGAAAUUACUAUA	677	UAUAGUAAUUUCAAAAUUC	1246
NM_001735.2_769- 7 8 7_s	769-787	GAAAUUACUAUAAAAGCAA	678	UUGCUUUUAUAGUAAUUUC	1247
NM_001735.2_781- 7 99_s	781-799	AAAGCAAGAUAUUUUUAUA	679	UAUAAAAAUAUCUUGCUUU	1248
NM_001735.2_789807_s	789-807	AUAUUUUUAUAAUAAAGUA	680	UACUUUAUUAUAAAAAUAU	1249
NM_001735.2_803821_s	803-821	AAGUAGUCACUGAGGCUGA	681	UCAGCCUCAGUGACUACUU	1250
NM_001735.2_810828_s	810-828	CACUGAGGCUGACGUUUAU	682	AUAAACGUCAGCCUCAGUG	1251
NM_001735.2_822- 8 4 0_s	822-840	CGUUUAUAUCACAUUUGGA	683	UC CAAAUGUGAUAUAAAC G	1252
NM_001735.2_831- 8 4 9_s	831-849	CACAUUUGGAAUAAGAGAA	684	UUCUCUUAUUCCAAAUGUG	1253
NM_001735.2_840858_s	840-858	AAUAAGAGAAGACUUAAAA	685	UUUUAAGUCUUCUCUUAUU	1254
NM_001735.2_852- 8 7 0_s	852-870	CUUAAAAGAUGAUCAAAAA	686	UUUUUGAUCAUCUUUUAAG	1255
NM_001735.2_859- 8 7 7_s	859-877	GAUGAUCAAAAAGAAAUGA	687	UCAUUUCUUUUUGAUCAUC	1256
NM_001735.2_872- 8 90_s	872-890	AAAUGAUGCAAACAGCAAU	688	AUUGCUGUUUGCAUCAUUU	1257
NM_001735.2_883901_s	883-901	ACAGCAAUGCAAAACACAA	689	UUGUGUUUUGCAUUGCUGU	1258
NM_001735.2_893911_s	893-911	AAAACACAAUGUUGAUAAA	690	UUUAUCAACAUUGUGUUUU	1259
NM_001735.2_899917_s	899-917	CAAUGUUGAUAAAUGGAAU	691	AUUC CAUUUAUCAACAUUG	1260
NM_001735.2_913931_s	913-931	GGAAUUGCUCAAGUCACAU	692	AUGUGACUUGAGCAAUUCC	1261
NM_001735.2_919937_s	919-937	GCUCAAGUCACAUUUGAUU	693	AAUCAAAUGUGACUUGAGC	1262

- 133 044245

NM_001735.2_930948_s	930-948	AUUUGAUUCUGAAACAGCA	694	UGCUGUUUCAGAAUCAAAU	1263
NM_001735.2_939957_s	939-957	UGAAACAGCAGUCAAAGAA	695	UUCUUUGACUGCUGUUUCA	1264
NM_001735.2_951- 9 69_s	951-969	CAAAGAACUGUCAUACUAC	696	GUAGUAUGACAGUUCUUUG	1265
NM_001735.2_962- 98 0_s	962-980	CAUACUACAGUUUAGAAGA	697	UCUUCUAAACUGUAGUAUG	1266
NM_001735.2_969987_s	969-987	CAGUUUAGAAGAUUUAAAC	698	GUUUAAAUCUUCUAAACUG	1267
NM_001735.2_9831001_s	983-1001	UAAACAACAAGUAC CUUUA	699	UAAAGGUACUUGUUGUUUA	1268
NM_001735.2_9901008_s	990-1008	CAAGUACCUUUAUAUUGCU	700	AGCAAUAUAAAGGUACUUG	1269
NM_001735.2_10021020_s	1002-1020	UAUUGCUGUAACAGUCAUA	701	UAUGACUGUUACAGCAAUA	1270
NM_001735.2_10111029_s	1011-1029	AACAGUCAUAGAGUCUACA	702	UGUAGACUCUAUGACUGUU	1271
NM_001735.2_10201038_s	1020-1038	AGAGUCUACAGGUGGAUUU	703	AAAUCCACCUGUAGACUCU	1272
NM_001735.2_10331051_s	1033-1051	GGAUUUUCUGAAGAGGCAG	704	CUGCCUCUUCAGAAAAUCC	1273
NM_001735.2_10421060—s	1042-1060	GAAGAGGCAGAAAUACCUG	705	CAGGUAUUUCUGCCUCUUC	1274
NM—001735.2_10501068—s	1050-1068	AGAAAUACCUGGCAUCAAA	706	UUUGAUGCCAGGUAUUUCU	1275
NM—001735.2_10611079—s	1061-1079	GCAUCAAAUAUGUCCUCUC	707	GAGAGGACAUAUUUGAUGC	1276
NM—001735.2_10711089—s	1071-1089	UGUCCUCUCUCCCUACAAA	708	UUUGUAGGGAGAGAGGACA	1277
NM—001735.2_10921110—s	1092-1110	GAAUUUGGUUGCUACUCCU	709	AGGAGUAGCAACCAAAUUC	1278
NM—001735.2_11021120—s	1102-1120	GCUACUCCUCUUUUCCUGA	710	UCAGGAAAAGAGGAGUAGC	1279
NM—001735.2_11091127—s	1109-1127	CUCUUUUCCUGAAGCCUGG	711	CCAGGCUUCAGGAAAAGAG	1280
NM—001735.2_11231141—s	1123-1141	CCUGGGAUUCCAUAUCCCA	712	UGGGAUAUGGAAUCCCAGG	1281
NM—001735.2_11331151—s	1133-1151	CAUAUCCCAUCAAGGUGCA	713	UGCACCUUGAUGGGAUAUG	1282
NM—001735.2_11391157—s	1139-1157	CCAUCAAGGUGCAGGUUAA	714	UUAACCUGCACCUUGAUGG	1283
NM—001735.2_11501168—s	1150-1168	CAGGUUAAAGAUUCGCUUG	715	CAAGCGAAUCUUUAACCUG	1284
NM—001735.2_11611179—s	1161-1179	UUCGCUUGACCAGUUGGUA	716	UACCAACUGGUCAAGCGAA	1285
NM—001735.2_11701188—s	1170-1188	CCAGUUGGUAGGAGGAGUC	717	GACUCCUCCUACCAACUGG	1286

- 134044245

NM_001735.2_11801198_s	1180-1198	GGAGGAGUCCCAGUAACAC	718	GUGUUACUGGGACUCCUCC	1287
NM_001735.2_11901208_s	1190-1208	CAGUAACACUGAAUGCACA	719	UGUGCAUUCAGUGUUACUG	1288
NM_001735.2_12001218—s	1200-1218	GAAUGCACAAACAAUUGAU	720	AUCAAUUGUUUGUGCAUUC	1289
NM—001735.2_12091227—s	1209-1227	AACAAUUGAUGUAAAC GAA	721	UUGGUUUACAUCAAUUGUU	1290
NM—001735.2_12201238—s	1220-1238	UAAAC CAAGAGACAUCUGA	722	UCAGAUGUCUCUUGGUUUA	1291
NM—001735.2_12321250—s	1232-1250	CAUCUGACUUGGAUCCAAG	723	CUUGGAUCCAAGUCAGAUG	1292
NM—001735.2_12431261—s	1243-1261	GAUCCAAGCAAAAGUGUAA	724	UUACACUUUUGCUUGGAUC	1293
NM—001735.2_12511269—s	1251-1269	CAAAAGUGUAACACGUGUU	725	AACAC GUGUUACACUUUUG	1294
NM—001735.2_12601278—s	1260-1278	AACACGUGUUGAUGAUGGA	726	UCCAUCAUCAACACGUGUU	1295
NM—001735.2_12721290—s	1272-1290	UGAUGGAGUAGCUUCCUUU	727	AAAGGAAGCUACUCCAUCA	1296
NM—001735.2_12791297—s	1279-1297	GUAGCUUCCUUUGUGCUUA	728	UAAGCACAAAGGAAGCUAC	1297
NM—001735.2_12931311—s	1293-1311	GCUUAAUCUCCCAUCUGGA	729	UCCAGAUGGGAGAUUAAGC	1298
NM—001735.2_13031321—s	1303-1321	CCAUCUGGAGUGACGGUGC	730	GCACCGUCACUCCAGAUGG	1299
NM—001735.2_13131331—s	1313-1331	UGACGGUGCUGGAGUUUAA	731	UUAAACUC CAGCACCGUCA	1300
NM—001735.2_13201338—s	1320-1338	GCUGGAGUUUAAUGUCAAA	732	UUUGACAUUAAACUCCAGC	1301
NM—001735.2_13321350—s	1332-1350	UGUCAAAACUGAUGCUCCA	733	UGGAGCAUCAGUUUUGACA	1302
NM—001735.2_13421360—s	1342-1360	GAUGCUCCAGAUCUUCCAG	734	CUGGAAGAUCUGGAGCAUC	1303
NM—001735.2_13491367—s	1349-1367	CAGAUCUUC CAGAAGAAAA	735	UUUUCUUCUGGAAGAUCUG	1304
NM—001735.2_13621380—s	1362-1380	AGAAAAUCAGGCCAGGGAA	736	UUCCCUGGCCUGAUUUUCU	1305
NM—001735.2_13711389—s	1371-1389	GGCCAGGGAAGGUUACCGA	737	UCGGUAACCUUCCCUGGCC	1306
NM—001735.2_13821400—s	1382-1400	GUUACCGAGCAAUAGCAUA	738	UAUGCUAUUGCUCGGUAAC	1307
NM—001735.2_13931411—s	1393-1411	AUAGCAUACUCAUCUCUCA	739	UGAGAGAUGAGUAUGCUAU	1308
NM—001735.2_13991417—s	1399-1471	UACUCAUCUCUCAGCCAAA	740	UUUGGCUGAGAGAUGAGUA	1309
NM—001735.2_14121430—s	1412-1430	GC CAAAGUUAC CUUUAUAU	741	AUAUAAAGGUAACUUUGGC	1310

- 135 044245

NM_001735.2_14221440_s	1422-1440	CCUUUAUAUUGAUUGGACU	742	AGUCCAAUCAAUAUAAAGG	1311
NM_001735.2_14321450_s	1432-1450	GAUUGGACUGAUAACCAUA	743	UAUGGUUAUCAGUCCAAUC	1312
NM_001735.2_14391457_s	1439-1457	CUGAUAACCAUAAGGCUUU	744	AAAGCCUUAUGGUUAUCAG	1313
NM_001735.2_14511469_s	1451-1469	AGGCUUUGCUAGUGGGAGA	745	UCUCCCACUAGCAAAGCCU	1314
NM_001735.2_14621480_s	1462-1480	GUGGGAGAACAUCUGAAUA	746	UAUUCAGAUGUUCUCCCAC	1315
NM_001735.2_14711489_s	1471-1489	CAUCUGAAUAUUAUUGUUA	747	UAACAAUAAUAUUCAGAUG	1316
NM_001735.2_14791497_s	1479-1497	UAUUAUUGUUAC С С С CAAA	748	UUUGGGGGUAACAAUAAUA	1317
NM_001735.2_14921510_s	1492-1510	С С CAAAAG С С CAUAUAUUG	749	CAAUAUAUGGGCUUUUGGG	1318
NM_001735.2_14931511_s	1493-1511	С CAAAAG С С CAUAUAUUGA	750	UCAAUAUAUGGGCUUUUGG	1319
NM_001735.2_14941512_s	1494-1512	CAAAAG С С CAUAUAUUGAC	751	GUCAAUAUAUGGGCUUUUG	1320
NM_001735.2_14951513_s	1495-1513	AAAAG С С CAUAUAUUGACA	752	UGUCAAUAUAUGGGCUUUU	1321
NM_001735.2_14961514_s	1496-1514	AAAG С С CAUAUAUUGACAA	753	UUGUCAAUAUAUGGGCUUU	1322
NM_001735.2_14971515_s	1497-1515	AAG С С CAUAUAUUGACAAA	754	UUUGUCAAUAUAUGGGCUU	1323
NM_001735.2_14981516_s	1498-1516	AG С С CAUAUAUUGACAAAA	755	UUUUGUCAAUAUAUGGGCU	1324
NM_001735.2_14991517_s	1499-1517	G С С CAUAUAUUGACAAAAU	756	AUUUUGUCAAUAUAUGGGC	1325
NM_001735.2_15001518_s	1500-1518	С C CAUAUAUUGACAAAAUA	757	UAUUUUGUCAAUAUAUGGG	1326
NM_001735.2_15011519_s	1501-1519	C CAUAUAUUGACAAAAUAA	758	UUAUUUUGUCAAUAUAUGG	1327
NM_001735.2_15021520_s	1502-1520	CAUAUAUUGACAAAAUAAC	759	GUUAUUUUGUCAAUAUAUG	1328
NM_001735.2_15031521_s	1503-1521	AUAUAUUGACAAAAUAACU	760	AGUUAUUUUGUCAAUAUAU	1329
NM_001735.2_15041522_s	1504-1522	UAUAUUGACAAAAUAACUC	761	GAGUUAUUUUGUCAAUAUA	1330
NM_001735.2_15051523_s	1505-1523	AUAUUGACAAAAUAACUCA	762	UGAGUUAUUUUGUCAAUAU	1331
NM_001735.2_15061524_s	1506-1524	UAUUGACAAAAUAACUCAC	763	GUGAGUUAUUUUGUCAAUA	1332
NM_001735.2_15071525_s	1507-1525	AUUGACAAAAUAACUCACU	764	AGUGAGUUAUUUUGUCAAU	1333
NM_001735.2_15081526_s	1508-1526	UUGACAAAAUAACUCACUA	765	UAGUGAGUUAUUUUGUCAA	1334

- 136044245

NM_001735.2_15091527_s	1509-1527	UGACAAAAUAACUCACUAU	766	AUAGUGAGUUAUUUUGUCA	1335
NM_001735.2_15101528_s	1510-1528	GACAAAAUAACUCACUAUA	767	UAUAGUGAGUUAUUUUGUC	1336
NM_001735.2_15131531—s	1513-1531	AAAAUAACUCACUAUAAUU	768	AAUUAUAGUGAGUUAUUUU	1337
NM—001735.2_15141532—s	1514-1532	AAAUAACUCACUAUAAUUA	769	UAAUUAUAGUGAGUUAUUU	1338
NM—001735.2_15151533—s	1515-1533	AAUAACUCACUAUAAUUAC	770	GUAAUUAUAGUGAGUUAUU	1339
NM—001735.2_15161534—s	1516-1534	AUAACUCACUAUAAUUACU	771	AGUAAUUAUAGUGAGUUAU	1340
NM—001735.2_15181536—s	1518-1536	AACUCACUAUAAUUACUUG	772	CAAGUAAUUAUAGUGAGUU	1341
NM—001735.2_15191537—s	1519-1537	ACUCACUAUAAUUACUUGA	773	UCAAGUAAUUAUAGUGAGU	1342
NM—001735.2_15201538—s	1520-1538	CUCACUAUAAUUACUUGAU	774	AUCAAGUAAUUAUAGUGAG	1343
NM—001735.2_15211539—s	1521-1539	UCACUAUAAUUACUUGAUU	775	AAUCAAGUAAUUAUAGUGA	1344
NM—001735.2_15231541—s	1523-1541	ACUAUAAUUACUUGAUUUU	776	AAAAUCAAGUAAUUAUAGU	1345
NM—001735.2_15241542—s	1524-1542	CUAUAAUUACUUGAUUUUA	777	UAAAAUCAAGUAAUUAUAG	1346
NM—001735.2_15251543—s	1525-1543	UAUAAUUACUUGAUUUUAU	778	AUAAAAUCAAGUAAUUAUA	1347
NM—001735.2_15261544—s	1526-1544	AUAAUUACUUGAUUUUAUC	779	GAUAAAAUCAAGUAAUUAU	1348
NM—001735.2_15271545—s	1527-1545	UAAUUACUUGAUUUUAUC C	780	GGAUAAAAUCAAGUAAUUA	1349
NM—001735.2_15281546—s	1528-1546	AAUUACUUGAUUUUAUC CA	781	UGGAUAAAAUCAAGUAAUU	1350
NM—001735.2_15291547—s	1529-1547	AUUACUUGAUUUUAUCCAA	782	UUGGAUAAAAUCAAGUAAU	1351
NM—001735.2_15401558—s	1540-1558	UUAUCCAAGGGCAAAAUUA	783	UAAUUUUGCCCUUGGAUAA	1352
NM—001735.2_15501568—s	1550-1568	GCAAAAUUAUCCACUUUGG	784	CCAAAGUGGAUAAUUUUGC	1353
NM—001735.2_15611579—s	1561-1579	CACUUUGGCACGAGGGAGA	785	UCUCCCUCGUGCCAAAGUG	1354
NM—001735.2_15711589—s	1571-1589	CGAGGGAGAAAUUUUCAGA	786	UCUGAAAAUUUCUCCCUCG	1355
NM—001735.2_15811599—s	1581-1599	AUUUUCAGAUGCAUCUUAU	787	AUAAGAUGCAUCUGAAAAU	1356
NM—001735.2_15911609—s	1591-1609	GCAUCUUAUCAAAGUAUAA	788	UUAUACUUUGAUAAGAUGC	1357
NM—001735.2_16001618—s	1600-1618	CAAAGUAUAAACAUUC GAG	789	CUGGAAUGUUUAUACUUUG	1358

- 137044245

ΝΜ_001735.2_16121630_s	1612-1630	AUUC CAGUAACACAGAACA	790	UGUUCUGUGUUACUGGAAU	1359
NM_001735.2_16221640_s	1622-1640	CACAGAACAUGGUUCCUUC	791	GAAGGAACCAUGUUCUGUG	1360
NM_001735.2_16321650_s	1632-1560	GGUUCCUUCAUCCCGACUU	792	AAGUCGGGAUGAAGGAACC	1361
NM_001735.2_16431661_s	1643-1661	CCCGACUUCUGGUCUAUUA	793	UAAUAGACCAGAAGUCGGG	1362
NM_001735.2_16531671_s	1653-1671	GGUCUAUUACAUCGUCACA	794	UGUGAC GAUGUAAUAGAC C	1363
NM_001735.2_16631681_s	1663-1681	AUCGUCACAGGAGAACAGA	795	UCUGUUCUCCUGUGACGAU	1364
NM_001735.2_16701688_s	1670-1688	CAGGAGAACAGACAGCAGA	796	UCUGCUGUCUGUUCUCCUG	1365
NM_001735.2_16821700_s	1682-1700	CAGCAGAAUUAGUGUCUGA	797	UCAGACACUAAUUCUGCUG	1366
NM_001735.2_16931711_s	1693-1711	GUGUCUGAUUCAGUCUGGU	798	ACCAGACUGAAUCAGACAC	1367
NM_001735.2_17031721_s	1703-1721	CAGUCUGGUUAAAUAUUGA	799	UCAAUAUUUAAC CAGACUG	1368
NM_001735.2_17101728_s	1710-1728	GUUAAAUAUUGAAGAAAAA	800	UUUUUCUUCAAUAUUUAAC	1369
NM_001735.2_17221740_s	1722-1740	AGAAAAAUGUGGCAACCAG	801	CUGGUUGCCACAUUUUUCU	1370
NM_001735.2_17331751_s	1733-1751	GCAACCAGCUCCAGGUUCA	802	UGAACCUGGAGCUGGUUGC	1371
NM_001735.2_17401758_s	1740-1758	GCUCCAGGUUCAUCUGUCU	803	AGACAGAUGAACCUGGAGC	1372
NM_001735.2_17511769_s	1751-1769	AUCUGUCUCCUGAUGCAGA	804	UCUGCAUCAGGAGACAGAU	1373
NM_001735.2_17621780_s	1762-1780	GAUGCAGAUGCAUAUUCUC	805	GAGAAUAUGCAUCUGCAUC	1374
NM_001735.2_17711789_s	1771-1789	GCAUAUUCUCCAGGCCAAA	806	UUUGGCCUGGAGAAUAUGC	1375
NM_001735.2_17821800_s	1782-1800	AGGCCAAACUGUGUCUCUU	807	AAGAGACACAGUUUGGCCU	1376
NM_001735.2_17921810_s	1792-1810	GUGUCUCUUAAUAUGGCAA	808	UUGCCAUAUUAAGAGACAC	1377
NM_001735.2_17991817_s	1799-1817	UUAAUAUGGCAACUGGAAU	809	AUUC CAGUUGC CAUAUUAA	1378
NM_001735.2_18091827_s	1809-1827	AACUGGAAUGGAUUCCUGG	810	C CAGGAAUC CAUUC CAGUU	1379
NM_001735.2_18211839_s	1821-1839	UUCCUGGGUGGCAUUAGCA	811	UGCUAAUGCCACCCAGGAA	1380
NM_001735.2_18301848_s	1830-1848	GGCAUUAGCAGCAGUGGAC	812	GUCCACUGCUGCUAAUGCC	1381
NM_001735.2_18421860_s	1842-1860	AGUGGACAGUGCUGUGUAU	813	AUACACAGCACUGUCCACU	1382

- 138044245

NM_001735.2_18521870_s	1852-1870	GCUGUGUAUGGAGUCCAAA	814	UUUGGACUCCAUACACAGC	1383
NM_001735.2_18631881_s	1863-1881	AGUCCAAAGAGGAGCCAAA	815	UUUGGCUCCUCUUUGGACU	1384
NM_001735.2_18701888_s	1870-1888	AGAGGAGCCAAAAAGCCCU	816	AGGGCUUUUUGGCUCCUCU	1385
NM_001735.2_18831901_s	1883-1901	AGCCCUUGGAAAGAGUAUU	817	AAUACUCUUUCCAAGGGCU	1386
NM_001735.2_18931911_s	1893-1911	AAGAGUAUUUCAAUUCUUA	818	UAAGAAUUGAAAUACUCUU	1387
NM_001735.2_19001918_s	1900-1918	UUUCAAUUCUUAGAGAAGA	819	UCUUCUCUAAGAAUUGAAA	1388
NM_001735.2_19121930_s	1912-1930	GAGAAGAGUGAUCUGGGCU	820	AGCCCAGAUCACUCUUCUC	1389
NM_001735.2_19201938_s	1920-1938	UGAUCUGGGCUGUGGGGCA	821	UGCCCCACAGCCCAGAUCA	1390
NM_001735.2_19331951_s	1933-1951	GGGGCAGGUGGUGGCCUCA	822	UGAGGCCACCACCUGCCCC	1391
NM_001735.2_19431961_s	1943-1961	GUGGCCUCAACAAUGCCAA	823	UUGGCAUUGUUGAGGCCAC	1392
NM_001735.2_19501968_s	1950-1968	CAACAAUGCCAAUGUGUUC	824	GAACACAUUGGCAUUGUUG	1393
NM_001735.2_19591977_s	1959-1977	CAAUGUGUUCCACCUAGCU	825	AGCUAGGUGGAACACAUUG	1394
NM_001735.2_19691987_s	1969-1987	CACCUAGCUGGACUUACCU	826	AGGUAAGUCCAGCUAGGUG	1395
NM_001735.2_19791997_s	1979-1997	GACUUACCUUCCUCACUAA	827	UUAGUGAGGAAGGUAAGUC	1396
NM_001735.2_19912009_s	1991-2009	UCACUAAUGCAAAUGCAGA	828	UCUGCAUUUGCAUUAGUGA	1397
NM_001735.2_2001- 2019_s	2001-2019	AAAUGCAGAUGACUCСCAA	829	UUGGGAGUCAUCUGCAUUU	1398
NM_001735.2_20132031_s	2013-2013	CUC C CAAGAAAAUGAUGAA	830	UUCAUCAUUUUCUUGGGAG	1399
NM_001735.2_20322050_s	2032-2050	CCUUGUAAAGAAAUUCUCA	831	UGAGAAUUUCUUUACAAGG	1400
NM_001735.2_20432061_s	2043-2061	AAUUCUCAGGCCAAGAAGA	832	UCUUCUUGGCCUGAGAAUU	1401
NM_001735.2_20532071_s	2053-2071	CCAAGAAGAACGCUGCAAA	833	UUUGCAGCGUUCUUCUUGG	1402
NM_001735.2_20632081_s	2063-2081	CGCUGCAAAAGAAGAUAGA	834	UCUAUCUUCUUUUGCAGCG	1403
NM_001735.2_20702088_s	2070-2088	AAAGAAGAUAGAAGAAAUA	835	UAUUUCUUCUAUCUUCUUU	1404
NM_001735.2_20822100_s	2082-2100	AGAAAUAGCUGCUAAAUAU	836	AUAUUUAGCAGCUAUUUCU	1405
NM_001735.2_2089- 2107_s	2089-2107	GCUGCUAAAUAUAAACAUU	837	AAUGUUUAUAUUUAGCAGC	1406

- 139044245

NM_001735.2_2103- 2121_s	2103-2121	ACAUUCAGUAGUGAAGAAA	838	UUUCUUCACUACUGAAUGU	1407
NM_001735.2_21102128_s	2110-2128	GUAGUGAAGAAAUGUUGUU	839	AACAACAUUUCUUCACUAC	1408
NM_001735.2_21192137_s	2119-2137	AAAUGUUGUUACGAUGGAG	840	CUC CAUC GUAACAACAUUU	1409
NM_001735.2_21302148_s	2130-2148	CGAUGGAGCCUGCGUUAAU	841	AUUAACGCAGGCUCCAUCG	1410
NM_001735.2_21422160_s	2142-2160	C GUUAAUAAUGAUGAAAC C	842	GGUUUCAUCAUUAUUAACG	1411
NM_001735.2_21502168_s	2150-2168	AUGAUGAAACCUGUGAGCA	843	UGCUCACAGGUUUCAUCAU	1412
NM_001735.2_21602178_s	2160-2178	CUGUGAGCAGCGAGCUGCA	844	UGCAGCUCGCUGCUCACAG	1413
NM_001735.2_21702188_s	2170-2188	CGAGCUGCACGGAUUAGUU	845	AACUAAUCCGUGCAGCUCG	1414
NM_001735.2_2180- 2198_s	2180-2198	GGAUUAGUUUAGGGCCAAG	846	CUUGGCCCUAAACUAAUCC	1415
NM_001735.2_21912209_s	2191-2209	GGGCCAAGAUGCAUCAAAG	847	CUUUGAUGCAUCUUGGCCC	1416
NM_001735.2_22022220_s	2202-2220	CAUCAAAGCUUUCACUGAA	848	UUCAGUGAAAGCUUUGAUG	1417
NM_001735.2_22092227_s	2209-2227	GCUUUCACUGAAUGUUGUG	849	CACAACAUUCAGUGAAAGC	1418
NM_001735.2_22192237_s	2219-2237	AAUGUUGUGUCGUCGCAAG	850	CUUGC GAC GACACAACAUU	1419
NM_001735.2_22292247_s	2229-2247	CGUCGCAAGCCAGCUCCGU	851	ACGGAGCUGGCUUGCGACG	1420
NM_001735.2_2241- 2259_s	2241-2259	GCUCCGUGCUAAUAUCUCU	852	AGAGAUAUUAGCACGGAGC	1421
NM_001735.2_22492267_s	2249-2267	CUAAUAUCUCUCAUAAAGA	853	UCUUUAUGAGAGAUAUUAG	1422
NM_001735.2_22632281_s	2263-2281	AAAGACAUGCAAUUGGGAA	854	UUCCCAAUUGCAUGUCUUU	1423
NM_001735.2_22722290_s	2272-2290	CAAUUGGGAAGGCUACACA	855	UGUGUAGCCUUCCCAAUUG	1424
NM_001735.2_2283- 2301_s	2283-2301	GCUACACAUGAAGACCCUG	856	CAGGGUCUUCAUGUGUAGC	1425
NM_001735.2_22892307_s	2289-2307	CAUGAAGACCCUGUUACGA	857	UGGUAACAGGGUCUUCAUG	1426
NM_001735.2_2303- 2321_s	2303-2321	UACCAGUAAGCAAGCCAGA	858	UCUGGCUUGCUUACUGGUA	1427
NM_001735.2_23112329_s	2311-2329	AGCAAGCCAGAAAUUCGGA	859	UCCGAAUUUCUGGCUUGCU	1428
NM_001735.2_23192337_s	2319-2337	AGAAAUUCGGAGUUAUUUU	860	AAAAUAACUCCGAAUUUCU	1429
NM_001735.2_23292347_s	2329-2347	AGUUAUUUUCCAGAAAGCU	861	AGCUUUCUGGAAAAUAACU	1430

- 140044245

NM_001735.2_23392357_s	2339-2357	CAGAAAGCUGGUUGUGGGA	862	UC C GAGAAC CAGCUUUCUG	1431
NM_001735.2_23522370_s	2352-2370	GUGGGAAGUUCAUCUUGUU	863	AACAAGAUGAACUUC С CAC	1432
NM_001735.2_2361- 2379_s	2361-2379	UCAUCUUGUUCCCAGAAGA	864	UCUUCUGGGAACAAGAUGA	1433
NM_001735.2_23722390_s	2372-2390	CCAGAAGAAAACAGUUGCA	865	UGCAACUGUUUUCUUCUGG	1434
NM_001735.2_2383- 2401_s	2383-2401	CAGUUGCAGUUUGCCCUAC	866	GUAGGGCAAACUGCAACUG	1435
NM_001735.2_23892407_s	2389-2407	CAGUUUGCCCUACCUGAUU	867	AAUCAGGUAGGGCAAACUG	1436
NM_001735.2_2401- 2419_s	2401-2419	CCUGAUUCUCUAACCACCU	868	AGGUGGUUAGAGAAUCAGG	1437
NM_001735.2_2413- 2431_s	2413-2431	ACCACCUGGGAAAUUCAAG	869	CUUGAAUUUCCCAGGUGGU	1438
NM_001735.2_24222440_s	2422-2440	GAAAUUCAAGGCGUUGGCA	870	UGCCAACGCCUUGAAUUUC	1439
NM_001735.2_2433- 2451_s	2433-2451	CGUUGGCAUUUCAAACACU	871	AGUGUUUGAAAUGC CAAC G	1440
NM_001735.2_24392457_s	2439-2457	CAUUUCAAACACUGGUAUA	872	UAUAC CAGUGUUUGAAAUG	1441
NM_001735.2_2453- 2471_s	2453-2471	GUAUAUGUGUUGCUGAUAC	873	GUAUCAGCAACACAUAUAC	1442
NM_001735.2_24632481_s	2463-2481	UGCUGAUACUGUCAAGGCA	874	UGCCUUGACAGUAUCAGCA	1443
NM_001735.2_24712489_s	2471-2489	CUGUCAAGGCAAAGGUGUU	875	AACAC CUUUGC CUUGACAG	1444
NM_001735.2_2483- 2501_s	2483-2501	AGGUGUUCAAAGAUGUCUU	876	AAGACAUCUUUGAACACCU	1445
NM_001735.2_24902508_s	2490-2508	CAAAGAUGUCUUCCUGGAA	877	UUCCAGGAAGACAUCUUUG	1446
NM_001735.2_24992517_s	2499-2517	CUUCCUGGAAAUGAAUAUA	878	UAUAUUCAUUUCCAGGAAG	1447
NM_001735.2_25112529_s	2511-2529	GAAUAUAC CAUAUUCUGUU	879	AACAGAAUAUGGUAUAUUC	1448
NM_001735.2_25202538_s	2520-2538	AUAUUCUGUUGUACGAGGA	880	UC CUC GUACAACAGAAUAU	1449
NM_001735.2_2533- 2551_s	2533-2551	C GAG GAGAACAGAUC CAAU	881	AUUGGAUCUGUUCUCCUCG	1450
NM_001735.2_25392557_s	2539-2557	GAACAGAUC CAAUUGAAAG	882	CUUUCAAUUGGAUCUGUUC	1451
NM_001735.2_2553- 2571_s	2553-2571	GAAAGGAACUGUUUACAAC	883	GUUGUAAACAGUUCCUUUC	1452
NM_001735.2_25602578_s	2560-2578	ACUGUUUACAACUAUAGGA	884	UC CUAUAGUUGUAAACAGU	1453
NM_001735.2_25692587_s	2569-2587	AACUAUAGGACUUCUGGGA	885	UCCCAGAAGUCCUAUAGUU	1454

- 141 044245

NM_001735.2_2583- 2601_s	2583-2601	UGGGAUGCAGUUCUGUGUU	886	AACACAGAACUGCAUCCCA	1455
NM_001735.2_25922610_s	2592-2610	GUUCUGUGUUAAAAUGUCU	887	AGACAUUUUAACACAGAAC	1456
NM_001735.2_26002618_s	2600-2618	UUAAAAUGUCUGCUGUGGA	888	UCCACAGCAGACAUUUUAA	1457
NM_001735.2_26122630_s	2612-2630	CUGUGGAGGGAAUCUGCAC	889	GUGCAGAUUC C CUC CACAG	1458
NM_001735.2_26202638_s	2620-2638	GGAAUCUGCACUUCGGAAA	890	UUUC C GAAGUGCAGAUUC C	1459
NM_001735.2_26332651_s	2633-2651	CGGAAAGCCCAGUCAUUGA	891	UCAAUGACUGGGCUUUCCG	1460
NM_001735.2_26412659_s	2641-2659	CCAGUCAUUGAUCAUCAGG	892	CCUGAUGAUCAAUGACUGG	1461
NM_001735.2_26532671_s	2653-2671	CAUCAGGGCACAAAGUCCU	893	AGGACUUUGUGCCCUGAUG	1462
NM_001735.2_26592677_s	2659-2677	GGCACAAAGUCCUCCAAAU	894	AUUUGGAGGACUUUGUGCC	1463
NM_001735.2_26732691_s	2673-2691	CAAAUGUGUGCGCCAGAAA	895	UUUCUGGCGCACACAUUUG	1464
NM_001735.2_26822700_s	2682-2700	GCGCCAGAAAGUAGAGGGC	896	GCCCUCUACUUUCUGGCGC	1465
NM_001735.2_26912709_s	2691-2709	AGUAGAGGGCUCCUCCAGU	897	ACUGGAGGAGCCCUCUACU	1466
NM_001735.2_27022720_s	2702-2720	C CUC CAGUCACUUGGUGAC	898	GUCACCAAGUGACUGGAGG	1467
NM_001735.2_27092727_s	2709-2727	UCACUUGGUGACAUUCACU	899	AGUGAAUGUCACCAAGUGA	1468
NM_001735.2_27202738_s	2720-2738	CAUUCACUGUGCUUCCUCU	900	AGAGGAAGCACAGUGAAUG	1469
NM_001735.2_27392757_s	2739-2757	GGAAAUUGGCCUUCACAAC	901	GUUGUGAAGGCCAAUUUCC	1470
NM_001735.2_27492767_s	2749-2767	CUUCACAACAUCAAUUUUU	902	AAAAAUUGAUGUUGUGAAG	1471
NM_001735.2_2761- 2779_s	2761-2779	AAUUUUUCACUGGAGACUU	903	AAGUCUCCAGUGAAAAAUU	1472
NM_001735.2_27702788_s	2770-2788	CUGGAGACUUGGUUUGGAA	904	UUC CAAAC CAAGUCUC CAG	1473
NM_001735.2_27802798_s	2780-2798	GGUUUGGAAAAGAAAUCUU	905	AAGAUUUCUUUUC CAAAC C	1474
NM_001735.2_27932811_s	2793-2811	AAUCUUAGUAAAAACAUUA	906	UAAUGUUUUUACUAAGAUU	1475
NM_001735.2_28022820_s	2802-2820	AAAAACAUUACGAGUGGUG	907	CACCACUCGUAAUGUUUUU	1476
NM_001735.2_28132831_s	2813-2831	GAGUGGUGCCAGAAGGUGU	908	ACACCUUCUGGCACCACUC	1477
NM_001735.2_28232841_s	2823-2841	AGAAGGUGUCAAAAGGGAA	909	UUC C CUUUUGACAC CUUCU	1478

- 142044245

NM_001735.2_28292847_s	2829-2847	UGUCAAAAGGGAAAGCUAU	910	AUAGCUUUCCCUUUUGACA	1479
NM_001735.2_28432861_s	2843-2861	GCUAUUCUGGUGUUACUUU	911	AAAGUAACACCAGAAUAGC	1480
NM_001735.2_28522870_s	2852-2870	GUGUUACUUUGGAUCCUAG	912	CUAGGAUCCAAAGUAACAC	1481
NM_001735.2_28622880_s	2862-2880	GGAUCCUAGGGGUAUUUAU	913	AUAAAUAC С C CUAGGAUC C	1482
NM_001735.2_28722890_s	2872-2890	GGUAUUUAUGGUACCAUUA	914	UAAUGGUAC CAUAAAUAC C	1483
NM_001735.2_2882- 2900_s	2882-2900	GUAC CAUUAG CAGAC GAAA	915	UUUCGUCUGCUAAUGGUAC	1484
NM_001735.2_2892- 2910_s	2892-2910	CAGAC GAAAGGAGUUC C CA	916	UGGGAACUCCUUUCGUCUG	1485
NM_001735.2_29002918_s	2900-2918	AGGAGUUCCCAUACAGGAU	917	AUCCUGUAUGGGAACUCCU	1486
NM_001735.2_29092927_s	2909-2927	CAUACAG GAUAC C CUUAGA	918	UCUAAGGGUAUCCUGUAUG	1487
NM_001735.2_29222940_s	2922-2940	CUUAGAUUUGGUCССCAAA	919	UUUGGGGACCAAAUCUAAG	1488
NM_001735.2_2933- 2951_s	2933-2951	UC С C CAAAACAGAAAUCAA	920	UUGAUUUCUGUUUUGGGGA	1489
NM_001735.2_2941- 2959_s	2941-2959	ACAGAAAUCAAAAGGAUUU	921	AAAUCCUUUUGAUUUCUGU	1490
NM_001735.2_2951- 2969_s	2951-2969	AAAGGAUUUUGAGUGUAAA	922	UUUACACUCAAAAUC CUUU	1491
NM_001735.2_29622980_s	2962-2980	AGUGUAAAAGGACUGCUUG	923	CAAGCAGUCCUUUUACACU	1492
NM_001735.2_29692987_s	2969-2987	AAGGACUGCUUGUAGGUGA	924	UCAC CUACAAGCAGUC CUU	1493
NM_001735.2_2980- 2998_s	2980-2998	GUAGGUGAGAUCUUGUCUG	925	CAGACAAGAUCUCACCUAC	1494
NM_001735.2_29893007_s	2989-3007	AUCUUGUCUGCAGUUCUAA	926	UUAGAACUGCAGACAAGAU	1495
NM_001735.2_3001- 3019_s	3001-3019	GUUCUAAGUCAGGAAGGCA	927	UGCCUUCCUGACUUAGAAC	1496
NM_001735.2_30133031_s	3013-3031	GAAGGCAUCAAUAUCCUAA	928	UUAGGAUAUUGAUGCCUUC	1497
NM_001735.2_30203038_s	3020-3038	UCAAUAUC CUAAC С CAC CU	929	AGGUGGGUUAGGAUAUUGA	1498
NM_001735.2_30333051_s	3033-3051	CCACCUCCCCAAAGGGAGU	930	ACUCCCUUUGGGGAGGUGG	1499
NM_001735.2_30393057_s	3039-3057	CCCCAAAGGGAGUGCAGAG	931	CUCUGCACUCCCUUUGGGG	1500
NM_001735.2_30503068_s	3050-3068	GUGCAGAGGCGGAGCUGAU	932	AUCAGCUCCGCCUCUGCAC	1501
NM_001735.2_30603078_s	3060-3078	GGAGCUGAUGAGCGUUGUC	933	GACAACGCUCAUCAGCUCC	1502

- 143 044245

NM_001735.2_30723090—s	3072-3090	CGUUGUCCCAGUAUUCUAU	934	AUAGAAUACUGGGACAACG	1503
NM_001735.2_30793097—s	3079-3097	CCAGUAUUCUAUGUUUUUC	935	GAAAAACAUAGAAUACUGG	1504
NM—001735.2_30913109—s	3091-3109	GUUUUUCACUACCUGGAAA	936	UUUCCAGGUAGUGAAAAAC	1505
NM-001735.2_31023120—s	3102-3120	CCUGGAAACAGGAAAUCAU	937	AUGAUUUCCUGUUUCCAGG	1506
NM_001735.2_31223140—s	3122-3140	GGAACAUUUUUCAUUCUGA	938	UCAGAAUGAAAAAUGUUC C	1507
NM_001735.2_31333151—s	3133-3151	CAUUCUGAC C CAUUAAUUG	939	CAAUUAAUGGGUCAGAAUG	1508
NM_001735.2_31423160—s	3142-3160	CCAUUAAUUGAAAAGCAGA	940	UCUGCUUUUCAAUUAAUGG	1509
NM_001735.2_31533171—s	3153-3171	AAAGCAGAAACUGAAGAAA	941	UUUCUUCAGUUUCUGCUUU	1510
NM_001735.2_31613179—s	3161-3179	AACUGAAGAAAAAAUUAAA	942	UUUAAUUUUUUCUUCAGUU	1511
NM_001735.2_31693187—s	3169-3187	AAAAAAUUAAAAGAAGGGA	943	UCCCUUCUUUUAAUUUUUU	1512
NM_001735.2_31833201—s	3183-3201	AGGGAUGUUGAGCAUUAUG	944	CAUAAUGCUCAACAUCCCU	1513
NM_001735.2_31923210—s	3192-3210	GAGCAUUAUGUCCUACAGA	945	UCUGUAGGACAUAAUGCUC	1514
NM_001735.2_32003218—s	3200-3218	UGUCCUACAGAAAUGCUGA	946	UCAGCAUUUCUGUAGGACA	1515
NM_001735.2_32113229—s	3211-3229	AAUGCUGACUACUCUUACA	947	UGUAAGAGUAGUCAGCAUU	1516
NM_001735.2_32203238—s	3220-3238	UACUCUUACAGUGUGUGGA	948	UCCACACACUGUAAGAGUA	1517
NM_001735.2_32293247—s	3229-3247	AGUGUGUGGAAGGGUGGAA	949	UUC САС C CUUC CACACACU	1518
NM_001735.2_32403258—s	3240-3258	GGGUGGAAGUGCUAGCACU	950	AGUGCUAGCACUUCCACCC	1519
NM_001735.2_32503268—s	3250-3268	GCUAGCACUUGGUUAACAG	951	CUGUUAACCAAGUGCUAGC	1520
NM_001735.2_32603278—s	3260-3278	GGUUAACAGCUUUUGCUUU	952	AAAGCAAAAGCUGUUAACC	1521
NM_001735.2_32733291—s	3273-3291	UGCUUUAAGAGUACUUGGA	953	UCCAAGUACUCUUAAAGCA	1522
NM_001735.2_32833301—s	3283-3301	GUACUUGGACAAGUAAAUA	954	UAUUUACUUGUC CAAGUAC	1523
NM_001735.2_32923310—s	3292-3317	CAAGUAAAUAAAUAC GUAG	955	CUAC GUAUUUAUUUACUUG	1524
NM_001735.2_32993317—s	3299-3317	AUAAAUACGUAGAGCAGAA	956	UUCUGCUCUACGUAUUUAU	1525
NM_001735.2_33103328—s	3310-3328	GAGCAGAACCAAAAUUCAA	957	UUGAAUUUUGGUUCUGCUC	1526

- 144044245

NM_001735.2_33223340_s	3322-3340	AAUUCAAUUUGUAAUUCUU	958	AAGAAUUACAAAUUGAAUU	1527
NM_001735.2_33323350_s	3332-3350	GUAAUUCUUUAUUGUGGCU	959	AGCCACAAUAAAGAAUUAC	1528
NM_001735.2_33423360—s	3342-3360	AUUGUGGCUAGUUGAGAAU	960	AUUCUCAACUAGCCACAAU	1529
NM—001735.2_33493367—s	3349-3367	CUAGUUGAGAAUUAUCAAU	961	AUUGAUAAUUCUCAACUAG	1530
NM—001735.2_33603378—s	3360-3378	UUAUCAAUUAGAUAAUGGA	962	UC CAUUAUCUAAUUGAUAA	1531
NM—001735.2_33733391—s	3373-3391	AAUGGAUCUUUCAAGGAAA	963	UUUCCUUGAAAGAUCCAUU	1532
NM—001735.2_33803398—s	3380-3398	CUUUCAAGGAAAAUUCACA	964	UGUGAAUUUUCCUUGAAAG	1533
NM—001735.2_33913409—s	3391-3409	AAUUCACAGUAUCAAC CAA	965	UUGGUUGAUACUGUGAAUU	1534
NM—001735.2_33993417—s	3399-3417	GUAUCAAC CAAUAAAAUUA	966	UAAUUUUAUUGGUUGAUAC	1535
NM—001735.2_34113429—s	3411-3429	AAAAUUACAGGGUACCUUG	967	CAAGGUAC C CUGUAAUUUU	1536
NM—001735.2_34193437—s	3419-3437	AGGGUACCUUGCCUGUUGA	968	UCAACAGGCAAGGUACCCU	1537
NM—001735.2_34333451—s	3433-3451	GUUGAAGC С C GAGAGAACA	969	UGUUCUCUCGGGCUUCAAC	1538
NM—001735.2_34413459—s	3441-3559	С C GAGAGAACAG CUUAUAU	970	AUAUAAGCUGUUCUCUCGG	1539
NM—001735.2_34523470—s	3452-3470	GCUUAUAUCUUACAGCCUU	971	AAGGCUGUAAGAUAUAAGC	1540
NM—001735.2_34603478—s	3460-3478	CUUACAGCCUUUACUGUGA	972	UCACAGUAAAGGCUGUAAG	1541
NM—001735.2_34823500—s	3482-3500	GAAUUAGAAAGGCUUUCGA	973	UCGAAAGCCUUUCUAAUUC	1542
NM—001735.2_34923510—s	3492-3510	GGCUUUCGAUAUAUGCCCC	974	GGGGCAUAUAUCGAAAGCC	1543
NM—001735.2_34993517—s	3499-3517	GAUAUAUGCCCCCUGGUGA	975	UCACCAGGGGGCAUAUAUC	1544
NM—001735.2_35133531—s	3513-3531	GGUGAAAAUCGACACAGCU	976	AGCUGUGUC GAUUUUCAC C	1545
NM—001735.2_35223540—s	3522-3540	CGACACAGCUCUAAUUAAA	977	UUUAAUUAGAGCUGUGUCG	1546
NM—001735.2_35293547—s	3529-3547	GCUCUAAUUAAAGCUGACA	978	UGUCAGCUUUAAUUAGAGC	1547
NM—001735.2_35423560—s	3542-3560	CUGACAACUUUCUGCUUGA	979	UCAAGCAGAAAGUUGUCAG	1548
NM—001735.2_35493567—s	3549-3567	CUUUCUGCUUGAAAAUACA	980	UGUAUUUUCAAGCAGAAAG	1549
NM—001735.2_35603578—s	3560-3578	AAAAUACACUGCCAGCCCA	981	UGGGCUGGCAGUGUAUUUU	1550

- 145 044245

NM_001735.2_3573- 3591_s	3573-3591	AGCCCAGAGCACCUUUACA	982	UGUAAAGGUGCUCUGGGCU	1551
NM_001735.2_35813599_s	3581-3599	GCACCUUUACAUUGGCCAU	983	AUGGCCAAUGUAAAGGUGC	1552
NM_001735.2_35893607_s	3589-3607	ACAUUGGCCAUUUCUGCGU	984	ACGCAGAAAUGGCCAAUGU	1553
NM_001735.2_36023620_s	3602-3620	CUGCGUAUGCUCUUUCCCU	985	AGGGAAAGAGCAUACGCAG	1554
NM_001735.2_3613- 3631_s	3613-3631	CUUUCCCUGGGAGAUAAAA	986	UUUUAUCUCCCAGGGAAAG	1555
NM_001735.2_3623- 3641_s	3623-3641	GAGAUAAAACUCAC C GAGA	987	UGUGGGUGAGUUUUAUCUC	1556
NM_001735.2_3631- 3649_s	3631-3649	ACUCAC C CACAGUUUC GUU	988	AACGAAACUGUGGGUGAGU	1557
NM_001735.2_36403658_s	3640-3658	CAGUUUC GUUCAAUUGUUU	989	AAACAAUUGAACGAAACUG	1558
NM_001735.2_36503668_s	3650-3668	CAAUUGUUUCAGCUUUGAA	990	UUCAAAGCUGAAACAAUUG	1559
NM_001735.2_36623680_s	3662-3680	CUUUGAAGAGAGAAGCUUU	991	AAAGCUUCUCUCUUCAAAG	1560
NM_001735.2_36693687_s	3669-3687	GAGAGAAGCUUUGGUUAAA	992	UUUAACCAAAGCUUCUCUC	1561
NM_001735.2_36823700_s	3682-3700	GUUAAAG GUAAUC СAC С CA	993	UGGGUGGAUUACCUUUAAC	1562
NM_001735.2_36913709_s	3691-3709	AAUC САС C CAUUUAUC GUU	994	AACGAUAAAUGGGUGGAUU	1563
NM_001735.2_36993717_s	3699-3717	CAUUUAUCGUUUUUGGAAA	995	UUUC CAAAAACGAUAAAUG	1564
NM_001735.2_37103728_s	3710-3728	UUUGGAAAGACAAUCUUCA	996	UGAAGAUUGUCUUUCCAAA	1565
NM_001735.2_3721- 3739_s	3721-3739	AAUCUUCAGCAUAAAGACA	997	UGUCUUUAUGCUGAAGAUU	1566
NM_001735.2_37303748_s	3730-3748	CAUAAAGACAGCUCUGUAC	998	GUACAGAGCUGUCUUUAUG	1567
NM_001735.2_37413759_s	3741-3759	CUCUGUACCUAACACUGGU	999	ACCAGUGUUAGGUACAGAG	1568
NM_001735.2_37523770_s	3752-3770	ACACUGGUACGGCACGUAU	1000	AUACGUGCCGUACCAGUGU	1569
NM_001735.2_37623780_s	3762-3780	GGCACGUAUGGUAGAAACA	1001	UGUUUCUACCAUACGUGCC	1570
NM_001735.2_37713789_s	3771-3789	GGUAGAAACAACUGCCUAU	1002	AUAGGCAGUUGUUUCUACC	1571
NM_001735.2_37793797_s	3779-3797	CAACUGCCUAUGCUUUACU	1003	AGUAAAGCAUAGGCAGUUG	1572
NM_001735.2_37913809_s	3791-3809	CUUUACUCACCAGUCUGAA	1004	UUCAGACUGGUGAGUAAAG	1573
NM_001735.2_38033821_s	3803-3821	GUCUGAACUUGAAAGAUAU	1005	AUAUCUUUCAAGUUCAGAC	1574

- 146044245

NM_001735.2_38093827_s	3809-3827	ACUUGAAAGAUAUAAAUUA	1006	UAAUUUAUAUCUUUCAAGU	1575
NM_001735.2_38193837—s	3819-3837	UAUAAAUUAUGUUAAC С CA	1007	UGGGUUAACAUAAUUUAUA	1576
NM—001735.2_38293847—s	3829-3847	GUUAAC C CAGUCAUCAAAU	1008	AUUUGAUGACUGGGUUAAC	1577
NM—001735.2_38393857—s	3839-3857	UCAUCAAAUGGCUAUCAGA	1009	UCUGAUAGCCAUUUGAUGA	1578
NM—001735.2_38513869—s	3851-3869	UAUCAGAAGAGCAGAGGUA	1010	UACCUCUGCUCUUCUGAUA	1579
NM—001735.2_38633881—s	3863-3881	AGAGGUAUGGAGGUGGCUU	1011	AAGCCACCUCCAUACCUCU	1580
NM—001735.2_38723890—s	3872-3890	GAGGUGGCUUUUAUUCAAC	1012	GUUGAAUAAAAGC CAC CUC	1581
NM—001735.2_38833901—s	3883-3901	UAUUCAAG C GAG GAGACAA	1013	UUGUGUCCUGGGUUGAAUA	1582
NM—001735.2_38933911—s	3893-3911	AGGACACAAUCAAUGCCAU	1014	AUGGCAUUGAUUGUGUCCU	1583
NM—001735.2_38993917—s	3899-3917	CAAUCAAUGCCAUUGAGGG	1015	CCCUCAAUGGCAUUGAUUG	1584
NM—001735.2_39093927—s	3909-3927	CAUUGAGGGCCUGACGGAA	1016	UUCCGUCAGGCCCUCAAUG	1585
NM—001735.2_39223940—s	3922-3940	ACGGAAUAUUCACUCCUGG	1017	C CAGGAGUGAAUAUUC C GU	1586
NM—001735.2_39303948—s	3930-3948	UUCACUCCUGGUUAAACAA	1018	UUGUUUAACCAGGAGUGAA	1587
NM—001735.2_39393957—s	3939-3957	GGUUAAACAACUCCGCUUG	1019	CAAGCGGAGUUGUUUAACC	1588
NM—001735.2_39513969—s	3951-3969	CCGCUUGAGUAUGGACAUC	1020	GAUGUCCAUACUCAAGCGG	1589
NM—001735.2_39633981—s	3963-3981	GGACAUCGAUGUUUCUUAC	1021	GUAAGAAACAUCGAUGUCC	1590
NM—001735.2_39693987—s	3969-3987	CGAUGUUUCUUACAAGCAU	1022	AUGCUUGUAAGAAACAUCG	1591
NM—001735.2_39813999—s	3981-3999	CAAGCAUAAAGGUGCCUUA	1023	UAAGGCACCUUUAUGCUUG	1592
NM—001735.2_39924010—s	3992-4010	GUGCCUUACAUAAUUAUAA	1024	UUAUAAUUAUGUAAGGCAC	1593
NM—001735.2_39994017—s	3999-4017	ACAUAAUUAUAAAAUGACA	1025	UGUCAUUUUAUAAUUAUGU	1594
NM—001735.2_40094027—s	4009-4027	AAAAUGACAGACAAGAAUU	1026	AAUUCUUGUCUGUCAUUUU	1595
NM—001735.2_40204038—s	4020-4038	CAAGAAUUUCCUUGGGAGG	1027	CCUCCCAAGGAAAUUCUUG	1596
NM—001735.2_40294047—s	4029-4047	CCUUGGGAGGCCAGUAGAG	1028	CUCUACUGGCCUCCCAAGG	1597
NM—001735.2_40414059—s	4041-4059	AGUAGAGGUGCUUCUCAAU	1029	AUUGAGAAGCACCUCUACU	1598

- 147044245

NM_001735.2_40514069—s	4051-4069	CUUCUCAAUGAUGACCUCA	1030	UGAGGUCAUCAUUGAGAAG	1599
NM—001735.2_40624080—s	4062-4080	UGACCUCAUUGUCAGUACA	1031	UGUACUGACAAUGAGGUCA	1600
NM—001735.2_40724090—s	4072-4090	GUCAGUACAGGAUUUGGCA	1032	UGCCAAAUCCUGUACUGAC	1601
NM—001735.2_40804098—s	4080-4098	AGGAUUUGGCAGUGGCUUG	1033	CAAGCCACUGCCAAAUCCU	1602
NM—001735.2_40924110—s	4092-4110	UGGCUUGGCUACAGUACAU	1034	AUGUACUGUAGCCAAGCCA	1603
NM—001735.2_40994117—s	4099-4117	GCUACAGUACAUGUAACAA	1035	UUGUUACAUGUACUGUAGC	1604
NM—001735.2_41134131—s	4113-4131	AACAACUGUAGUUCACAAA	1036	UUUGUGAACUACAGUUGUU	1605
NM—001735.2_41204138—s	4120-4138	GUAGUUCACAAAAC CAGUA	1037	UACUGGUUUUGUGAACUAC	1606
NM—001735.2_41304148—s	4130-4148	AAACCAGUACCUCUGAGGA	1038	UCCUCAGAGGUACUGGUUU	1607
NM—001735.2_41434161—s	4143-4161	UGAGGAAGUUUGCAGCUUU	1039	AAAGCUGCAAACUUCCUCA	1608
NM—001735.2_41534171—s	4153-4171	UGCAGCUUUUAUUUGAAAA	1040	UUUUCAAAUAAAAGCUGCA	1609
NM—001735.2_41634181—s	4163-4181	AUUUGAAAAUC GAUACUCA	1041	UGAGUAUC GAUUUUCAAAU	1610
NM—001735.2_41734191—s	4173-4191	CGAUACUCAGGAUAUUGAA	1042	UUCAAUAUC CUGAGUAUC G	1611
NM—001735.2_41824200—s	4182-4200	GGAUAUUGAAGCAUCCCAC	1043	GUGGGAUGCUUCAAUAUCC	1612
NM—001735.2_41894207—s	4189-4207	GAAGCAUC C CACUACAGAG	1044	CUCUGUAGUGGGAUGCUUC	1613
NM—001735.2_41994217—s	4199-4217	ACUACAGAGGCUACGGAAA	1045	UUUCCGUAGCCUCUGUAGU	1614
NM—001735.2_42124230—s	4212-4230	CGGAAACUCUGAUUACAAA	1046	UUUGUAAUCAGAGUUUCCG	1615
NM—001735.2_42214239—s	4221-4239	UGAUUACAAACGCAUAGUA	1047	UACUAUGCGUUUGUAAUCA	1616
NM—001735.2_42324250—s	4232-4250	GCAUAGUAGCAUGUGCCAG	1048	CUGGCACAUGCUACUAUGC	1617
NM—001735.2_42404258_s	4240-4258	GCAUGUGCCAGCUACAAGC	1049	GCUUGUAGCUGGCACAUGC	1618
NM—001735.2_42514269_s	4251-4269	CUACAAGCCCAGCAGGGAA	1050	UUCCCUGCUGGGCUUGUAG	1619
NM—001735.2_42604278_s	4260-4278	CAGCAGGGAAGAAUCAUCA	1051	UGAUGAUUCUUCCCUGCUG	1620
NM—001735.2_42704288_s	4270-4288	GAAUCAUCAUCUGGAUCCU	1052	AGGAUCCAGAUGAUGAUUC	1621
NM—001735.2_42834301—s	4283-4301	GAUCCUCUCAUGCGGUGAU	1053	AUCACCGCAUGAGAGGAUC	1622

- 148044245

NM_001735.2_42894307_s	4289-4307	CUCAUGCGGUGAUGGACAU	1054	AUGUCCAUCACCGCAUGAG	1623
NM_001735.2_42994317_s	4299-4317	GAUGGACAUCUCCUUGCCU	1055	AGGCAAGGAGAUGUCCAUC	1624
NM_001735.2_43114329_s	4311-4329	CUUGCCUACUGGAAUCAGU	1056	ACUGAUUCCAGUAGGCAAG	1625
NM_001735.2_43224340_s	4322-4340	GAAUCAGUGCAAAUGAAGA	1057	UCUUCAUUUGCACUGAUUC	1626
NM_001735.2_43324350_s	4332-4350	AAAUGAAGAAGACUUAAAA	1058	UUUUAAGUCUUCUUCAUUU	1627
NM_001735.2_43394357_s	4339-4357	GAAGACUUAAAAGC C CUUG	1059	CAAGGGCUUUUAAGUCUUC	1628
NM_001735.2_4353- 4371_s	4353-4371	CCUUGUGGAAGGGGUGGAU	1060	AUG САС С C CUUC CACAAGG	1629
NM_001735.2_43604378_s	4360-4378	GAAGGGGUGGAUCAACUAU	1061	AUAGUUGAUCCACCCCUUC	1630
NM_001735.2_43704388_s	4370-4388	AUCAACUAUUCACUGAUUA	1062	UAAUCAGUGAAUAGUUGAU	1631
NM_001735.2_43804398_s	4380-4398	CACUGAUUAC CAAAUCAAA	1063	UUUGAUUUGGUAAUCAGUG	1632
NM_001735.2_4393- 4411_s	4393-4411	AUCAAAGAUGGACAUGUUA	1064	UAACAUGUCCAUCUUUGAU	1633
NM_001735.2_44024420_s	4402-4420	GGACAUGUUAUUCUGCAAC	1065	GUUGCAGAAUAACAUGUCC	1634
NM_001735.2_4413- 4431_s	4413-4431	UCUGCAACUGAAUUCGAUU	1066	AAUCGAAUUCAGUUGCAGA	1635
NM_001735.2_44224440_s	4422-4440	GAAUUCGAUUCCCUCCAGU	1067	ACUGGAGGGAAUCGAAUUC	1636
NM_001735.2_44324450_s	4432-4450	С C CUC CAGUGAUUUC CUUU	1068	AAAGGAAAUCACUGGAGGG	1637
NM_001735.2_4441- 4459_s	4441-4459	GAUUUCCUUUGUGUACGAU	1069	AUCGUACACAAAGGAAAUC	1638
NM_001735.2_4453- 4471_s	4453-4471	GUAC GAUUC C GGAUAUUUG	1070	CAAAUAUC C GGAAUC GUAC	1639
NM_001735.2_44624480_s	4462-4480	CGGAUAUUUGAACUCUUUG	1071	CAAAGAGUUCAAAUAUC C G	1640
NM_001735.2_4473- 4491_s	4473-4491	ACUCUUUGAAGUUGGGUUU	1072	AAAC C CAACUUCAAAGAGU	1641
NM_001735.2_44824500_s	4482-4500	AGUUGGGUUUCUCAGUCCU	1073	AGGACUGAGAAACCCAACU	1642
NM_001735.2_44904508_s	4490-4508	UUCUCAGUCCUGCCACUUU	1074	AAAGUGGCAGGACUGAGAA	1643
NM_001735.2_45034521_s	4503-4521	CACUUUCACAGUGUACGAA	1075	UUCGUACACUGUGAAAGUG	1644
NM_001735.2_45094527_s	4509-4527	CACAGUGUAC GAAUAC CAC	1076	GUGGUAUUCGUACACUGUG	1645
NM_001735.2_4523- 4541_s	4523-4541	AC C AC AGAC C AGAUAAAC A	1077	UGUUUAUCUGGUCUGUGGU	1646

- 149044245

NM_001735.2_45314549_s	4531-4549	C CAGAUAAACAGUGUACCA	1078	UGGUACACUGUUUAUCUGG	1647
NM_001735.2_45404558_s	4540-4558	CAGUGUAC CAUGUUUUAUA	1079	UAUAAAACAUGGUACACUG	1648
NM_001735.2_4551- 4569_s	4551-4569	GUUUUAUAGCACUUCCAAU	1080	AUUGGAAGUGCUAUAAAAC	1649
NM_001735.2_45624580_s	4562-4580	CUUC CAAUAUCAAAAUUCA	1081	UGAAUUUUGAUAUUGGAAG	1650
NM_001735.2_45704588_s	4570-4588	AUCAAAAUUCAGAAAGUCU	1082	AGACUUUCUGAAUUUUGAU	1651
NM_001735.2_4581- 4599_s	4581-4599	GAAAGUCUGUGAAGGAGCC	1083	GGCUCCUUCACAGACUUUC	1652
NM_001735.2_45914609_s	4591-4609	GAAGGAGCCGCGUGCAAGU	1084	ACUUGCACGCGGCUCCUUC	1653
NM_001735.2_46014619_s	4601-4619	CGUGCAAGUGUGUAGAAGC	1085	GCUUCUACACACUUGCACG	1654
NM_001735.2_46124630_s	4612-4630	GUAGAAGCUGAUUGUGGGC	1086	GCCCACAAUCAGCUUCUAC	1655
NM_001735.2_46194637_s	4619-4637	CUGAUUGUGGGCAAAUGCA	1087	UGCAUUUGCCCACAAUCAG	1656
NM_001735.2_46294647_s	4629-4647	GCAAAUGCAGGAAGAAUUG	1088	CAAUUCUUCCUGCAUUUGC	1657
NM_001735.2_46394657_s	4639-4657	GAAGAAUUGGAUCUGACAA	1089	UUGUCAGAUCCAAUUCUUC	1658
NM_001735.2_46514669_s	4651-4669	CUGACAAUCUCUGCAGAGA	1090	UCUCUGCAGAGAUUGUCAG	1659
NM_001735.2_46634681_s	4663-4681	GCAGAGACAAGAAAACAAA	1091	UUUGUUUUCUUGUCUCUGC	1660
NM_001735.2_46704688_s	4670-4688	CAAGAAAACAAACAGCAUG	1092	CAUGCUGUUUGUUUUCUUG	1661
NM_001735.2_46814699_s	4681-4699	ACAGCAUGUAAACCAGAGA	1093	UCUCUGGUUUACAUGCUGU	1662
NM_001735.2_46934711_s	4693-4711	CCAGAGAUUGCAUAUGCUU	1094	AAGCAUAUGCAAUCUCUGG	1663
NM_001735.2_47024720_s	4702-4720	GCAUAUGCUUAUAAAGUUA	1095	UAACUUUAUAAGCAUAUGC	1664
NM_001735.2_47104728_s	4710-4728	UUAUAAAGUUAGCAUCACA	1096	UGUGAUGCUAACUUUAUAA	1665
NM_001735.2_47224740_s	4722-4740	CAUCACAUCCAUCACUGUA	1097	UACAGUGAUGGAUGUGAUG	1666
NM_001735.2_4733- 4751_s	4733-4751	UCACUGUAGAAAAUGUUUU	1098	AAAACAUUUUCUACAGUGA	1667
NM_001735.2_47404758_s	4740-4758	AGAAAAUGUUUUUGUCAAG	1099	CUUGACAAAAACAUUUUCU	1668
NM_001735.2_47504768_s	4750-4768	UUUGUCAAGUACAAGGCAA	1100	UUGCCUUGUACUUGACAAA	1669
NM_001735.2_47634781_s	4763-4781	AGGCAACCCUUCUGGAUAU	1101	AUAUCCAGAAGGGUUGCCU	1670

- 150044245

ΝΜ_001735.2_47704788_s	4770-4788	CCUUCUGGAUAUCUACAAA	1102	UUUGUAGAUAUCCAGAAGG	1671
NM_001735.2_47794797_s	4779-4797	UAUCUACAAAACUGGGGAA	1103	UUC С C CAGUUUUGUAGAUA	1672
NM_001735.2_47904808_s	4790-4808	CUGGGGAAGCUGUUGCUGA	1104	UCAGCAACAGCUUCCCCAG	1673
NM_001735.2_47994817_s	4799-4817	CUGUUGCUGAGAAAGACUC	1105	GAGUCUUUCUCAGCAACAG	1674
NM_001735.2_48134831_s	4813-4831	GACUCUGAGAUUACCUUCA	1106	UGAAGGUAAUCUCAGAGUC	1675
NM_001735.2_48194837_s	4819-4837	GAGAUUAC CUUCAUUAAAA	1107	UUUUAAUGAAGGUAAUCUC	1676
NM_001735.2_48314849_s	4831-4849	AUUAAAAAGGUAACCUGUA	1108	UACAGGUUACCUUUUUAAU	1677
NM_001735.2_48414859_s	4841-4859	UAACCUGUACUAACGCUGA	1109	UCAGCGUUAGUACAGGUUA	1678
NM_001735.2_48504868_s	4850-4868	CUAACGCUGAGCUGGUAAA	1110	UUUACCAGCUCAGCGUUAG	1679
NM_001735.2_48634881_s	4863-4881	GGUAAAAGGAAGACAGUAC	1111	GUACUGUCUUCCUUUUACC	1680
NM_001735.2_48714889_s	4871-4889	GAAGACAGUACUUAAUUAU	1112	AUAAUUAAGUACUGUCUUC	1681
NM_001735.2_4881- 4899_s	4881-4899	CUUAAUUAUGGGUAAAGAA	1113	UUCUUUAC C CAUAAUUAAG	1682
NM_001735.2_4893- 4911_s	4893-4911	UAAAGAAGC C CUC CAGAUA	1114	UAUCUGGAGGGCUUCUUUA	1683
NM_001735.2_49024920_s	4902-4920	C CUC CAGAUAAAAUACAAU	1115	AUUGUAUUUUAUCUGGAGG	1684
NM_001735.2_49124930_s	4912-4930	AAAUACAAUUUCAGUUUCA	1116	UGAAACUGAAAUUGUAUUU	1685
NM_001735.2_4923- 4941_s	4923-4941	CAGUUUCAGGUACAUCUAC	1117	GUAGAUGUACCUGAAACUG	1686
NM_001735.2_4931- 4949_s	4931-4949	GGUACAUCUAC C CUUUAGA	1118	UCUAAAGGGUAGAUGUACC	1687
NM_001735.2_49424960_s	4942-4960	CCUUUAGAUUCCUUGACCU	1119	AGGUCAAGGAAUCUAAAGG	1688
NM_001735.2_49524970_s	4952-4970	CCUUGACCUGGAUUGAAUA	1120	UAUUCAAUCCAGGUCAAGG	1689
NM_001735.2_4961- 4979_s	4961-4979	GGAUUGAAUACUGGCCUAG	1121	CUAGGCCAGUAUUCAAUCC	1690
NM_001735.2_49714989_s	4971-4989	CUGGCCUAGAGACACAACA	1122	UGUUGUGUCUCUAGGCCAG	1691
NM_001735.2_49794997_s	4979-4997	GAGACACAACAUGUUCAUC	1123	GAUGAACAUGUUGUGUCUC	1692
NM_001735.2_49915009_s	4991-5009	GUUCAUCGUGUCAAGCAUU	1124	AAUGCUUGACACGAUGAAC	1693
NM_001735.2_50005018_s	5000-5018	GUCAAGCAUUUUUAGCUAA	1125	UUAGCUAAAAAUGCUUGAC	1694

- 151 044245

NM_001735.2_50135031_s	5013-5031	AGCUAAUUUAGAUGAAUUU	1126	AAAUUCAUCUAAAUUAGCU	1695
NM_001735.2_50225040_s	5022-5040	AGAUGAAUUUGC C GAAGAU	1127	AUCUUCGGCAAAUUCAUCU	1696
NM_001735.2_50335051_s	5033-5051	С C GAAGAUAUCUUUUUAAA	1128	UUUAAAAAGAUAUCUUCGG	1697
NM_001735.2_50435061_s	5043-5061	CUUUUUAAAUGGAUGCUAA	1129	UUAGCAUCCAUUUAAAAAG	1698
NM_001735.2_50535071_s	5053-5071	GGAUGCUAAAAUUCCUGAA	1130	UUCAGGAAUUUUAGCAUCC	1699
NM_001735.2_50595077_s	5059-5077	UAAAAUUC CUGAAGUUCAG	1131	CUGAACUUCAGGAAUUUUA	1700
NM_001735.2_50715089_s	5071-5089	AGUUCAGCUGCAUACAGUU	1132	AACUGUAUGCAGCUGAACU	1701
NM_001735.2_50805098_s	5080-5098	GCAUACAGUUUGCACUUAU	1133	AUAAGUGCAAACUGUAUGC	1702
NM_001735.2_50935111_s	5093-5111	ACUUAUGGACUCCUGUUGU	1134	ACAACAGGAGUCCAUAAGU	1703
NM_001735.2_5099- 5117_s	5099-5117	GGACUCCUGUUGUUGAAGU	1135	ACUUCAACAACAGGAGUCC	1704
NM_001735.2_51095127_s	5109-5127	UGUUGAAGUUC GUUUUUUU	1136	AAAAAAAC GAACUUCAACA	1705
NM_001735.2_51225140_s	5122-5140	UUUUUUGUUUUCUUCUUUU	1137	AAAAGAAGAAAACAAAAAA	1706
NM_001735.2_51325150_s	5132-5150	UCUUCUUUUUUUAAACAUU	1138	AAUGUUUAAAAAAAGAAGA	1707
NM_001735.2_51395157_s	5139-5157	UUUUUAAACAUUCAUAGCU	1139	AGCUAUGAAUGUUUAAAAA	1708
NM_001735.2_51525170_s	5152-5170	AUAGCUGGUCUUAUUUGUA	1140	UACAAAUAAGACCAGCUAU	1709
NM_001735.2_51595177_s	5159-5177	GUCUUAUUUGUAAAGCUCA	1141	UGAGCUUUACAAAUAAGAC	1710
NM_001735.2_51705188_s	5170-5188	AAAGCUCACUUUACUUAGA	1142	UCUAAGUAAAGUGAGCUUU	1711
NM_001735.2_51825200_s	5182-5200	ACUUAGAAUUAGUGGCACU	1143	AGUGCCACUAAUUCUAAGU	1712
NM_001735.2_51925210_s	5192-5210	AGUGGCACUUGCUUUUAUU	1144	AAUAAAAGCAAGUGCCACU	1713
NM_001735.2_52025220_s	5202-5220	GCUUUUAUUAGAGAAUGAU	1145	AUCAUUCUCUAAUAAAAGC	1714
NM_001735.2_52125230_s	5212-5230	GAGAAUGAUUUCAAAUGCU	1146	AGCAUUUGAAAUCAUUCUC	1715
NM_001735.2_52205238_s	5220-5238	UUUCAAAUGCUGUAACUUU	1147	AAAGUUACAGCAUUUGAAA	1716
NM_001735.2_5231- 5249_s	5231-5249	GUAACUUUCUGAAAUAACA	1148	UGUUAUUUCAGAAAGUUAC	1717
NM_001735.2_5241- 5259_s	5241-5259	GAAAUAACAUGGCCUUGGA	1149	UCCAAGGCCAUGUUAUUUC	1718

- 152044245

NM_001735.2_5253- 5271_s	5253-5271	CCUUGGAGGGCAUGAAGAC	1150	GUCUUCAUGCCCUCCAAGG	1719
NM_001735.2_52595277_s	5259-5277	AGGGCAUGAAGACAGAUAC	1151	GUAUCUGUCUUCAUGCCCU	1720
NM_001735.2_5273- 5291_s	5273-5291	GAUACUC CUC CAAGGUUAU	1152	AUAACCUUGGAGGAGUAUC	1721
NM_001735.2_52795297_s	5279-5297	CCUCCAAGGUUAUUGGACA	1153	UGUCCAAUAACCUUGGAGG	1722
NM_001735.2_5293- 5311_s	5293-5311	GGACACCGGAAACAAUAAA	1154	UUUAUUGUUUCCGGUGUCC	1723
NM_001735.2_5301- 5319_s	5301-5319	GAAACAAUAAAUUGGAACA	1155	UGUUCCAAUUUAUUGUUUC	1724
NM_001735.2_53115329_s	5311-5329	AUUGGAACACCUCCUCAAA	1156	UUUGAGGAGGUGUUCCAAU	1725
NM_001735.2_53225340_s	5322-5340	UCCUCAAACCUACCACUCA	1157	UGAGUGGUAGGUUUGAGGA	1726
NM_001735.2_5331- 5349_s	5331-5349	CUACCACUCAGGAAUGUUU	1158	AAACAUUCCUGAGUGGUAG	1727
NM_001735.2_5343- 5361_s	5343-5361	AAUGUUUGCUGGGGCCGAA	1159	UUCGGCCCCAGCAAACAUU	1728
NM_001735.2_53495367_s	5349-5367	UGCUGGGGCCGAAAGAACA	1160	UGUUCUUUCGGCCCCAGCA	1729
NM_001735.2_53605378_s	5360-5378	AAAGAACAGUCCAUUGAAA	1161	UUUCAAUGGACUGUUCUUU	1730
NM_001735.2_53715389_s	5371-5389	CAUUGAAAGGGAGUAUUAC	1162	GUAAUACUCCCUUUCAAUG	1731
NM_001735.2_53805398_s	5380-5398	GGAGUAUUACAAAAACAUG	1163	CAUGUUUUUGUAAUACUCC	1732
NM_001735.2_53915409_s	5391-5409	AAAACAUGGCCUUUGCUUG	1164	CAAGCAAAGGCCAUGUUUU	1733
NM_001735.2_53995417_s	5399-5417	GCCUUUGCUUGAAAGAAAA	1165	UUUUCUUUCAAGCAAAGGC	1734
NM_001735.2_54095427_s	5409-5427	GAAAGAAAAUACCAAGGAA	1166	UUCCUUGGUAUUUUCUUUC	1735
NM_001735.2_54205438_s	5420-5438	CCAAGGAACAGGAAACUGA	1167	UCAGUUUCCUGUUCCUUGG	1736
NM_001735.2_5433- 5451_s	5433-5451	AACUGAUCAUUAAAGCCUG	1168	CAGGCUUUAAUGAUCAGUU	1737
NM_001735.2_5441- 5459_s	5441-5459	AUUAAAGCCUGAGUUUGCU	1169	AGCAAACUCAGGCUUUAAU	1738

Пример 5. Сайленсинг С5 in vivo.

Группы из трех самок яванского макака обрабатывали C5-siRNA AD-58641 подкожно в лопаточную и среднюю часть спины в дозе 2,5 мг/кг или 5 мг/кг, или носителем в качестве контроля. Два круга схемы применения осуществляли в восемь доз в каждом круге, каждый третий день. С5 в сыворотке собирали и оценивали с помощью анализа ELISA, специфическом для обнаружения С5 (Abeam) в указанные моменты времени (фиг. 13). Уровни С5 приводили к среднему из трех образцов до введения препарата. Образцы, собранные до введения препарата и на день 23 (через 24 ч после последней введенной дозы в первом круге лечения) подвергали биохимическому анализу сыворотки, гематологическому анализу и анализу на свертываемость.

Анализ уровня белка С5 в сыворотке по сравнению с уровнем белка С5 в сыворотке до лечения показал, что схема лечения с дозой 5 мг/кг AD-58641 привела к уменьшению уровня белка С5 в сыворотке до 98% (фиг. 12). Средние уровни С5 в сыворотке были снижены на 97% в нижней точке, что указывает, что большинство циркулирующего С5 происходит из печени. Наблюдали дозозависимый эффект и длительный нокдаун уровня белка С5 в сыворотке при подкожном введении AD-58641. Никаких изменений в параметрах гематологии, биохимии сыворотки или коагуляции не было определено через 24 ч после первого круга схемы применения.

Гемолитическую активность сыворотки также анализировали с применением анализа сенсибилизированных эритроцитов барана для измерения активности классического пути. Процентную долю гемоли- 153 044245 за рассчитывали по отношению максимального гемолиза к фоновому гемолизу в контрольных образцах.

Средний индекс гемолиза +/- SEM для трех животных рассчитывали и анализировали (фиг. 13). Гемолиз снизился до 94% в схеме лечения с дозой 5 мг/кг со средним значением ингибирования 92% в нижней точке. Снижение гемолиза поддерживалось в течение более чем двух недель после последней дозы.

Пример 6. Скрининг дополнительных siRNA in vitro.

Последовательности смысловой и антисмысловой цепей, представленные в табл. 20, модифицировали на 3'-конце короткой последовательностью дезокси-тимин нуклеотидов (dT) (табл. 21). Эффективность in vitro дуплексов, содержащих смысловую и антисмысловую последовательности, приведенные в табл. 21, определяли с помощью следующих способов.

Клеточная культура и трансфекции.

Клетки Hep3B (АТСС, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до слияния при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в ЕМЕМ (АТСС), дополненной 10% FBS (АТСС), перед отделением от чашки Петри путем обработки трипсином. Трансфекцию выполняли путем добавления 5 мкл Opti-MEM плюс 0,1 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу13778-150) к 5 мкл дуплексов siRNA на лунку в 384-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. 40 мкл полных питательных сред, содержащих ~5х10³ клеток Hep3B, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 нМ.

Выделение РНК проводили с применением полуавтоматического анализатора Biotek EL 405 washer. Вкратце, клетки лизировали в 75 мкл лизирующего/связывающего буфера, содержащего 2 мкл Dynabeads, затем смешивали в течение 10 мин при установке 7 электромагнитного шейкера (Union Scientific). Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 90 мкл промывочного буфера А, затем 90 мкл промывочного буфера В. Гранулы дважды промывали 100 мкл элюирующего буфера, который затем отсасывали и получали кДНК непосредственно на РНК, связанных с гранулами, в 384-луночном планшете.

Мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл H2O на реакцию добавляли непосредственно к РНК, связанных с гранулами, в 384-луночных планшетах, применяемых для выделения РНК. Затем планшеты встряхивали на электромагнитном шейкере в течение 10 мин и затем помещали в инкубатор при 37°C в течение 2 ч. После этой инкубации планшеты помещали на шейкер в инкубаторе при 80°C в течение 7 мин для инактивации фермента и элюирования РНК/кДНК из гранул.

PCR в режиме реального времени.

мкл кДНК добавляли к смеси мастер-микса, содержащей 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH (Applied Biosystems, номер по каталогу 4326317Е), 0,5 мкл зонда TaqMan для С5 (Applied Biosystems, номер по каталогу Hs00156197_M1) и 0,5 мкл зонда мастер-микс Lightcycler 480 (Roche, номер по каталогу 04887301001) в каждую лунку 384-луночного планшета (Roche, номер по каталогу 04887301001). PCR в режиме реального времени проводили в системе Roche LC480 Real Time PCR (Roche). Каждый дуплекс исследовали в по меньшей мере двух независимых трансфекциях и каждую трансфекцию оценивали в двух параллельных испытаниях.

Для вычисления относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с применением AACt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками.

Табл. 22 показывает результаты теста разовой дозы в клетках Hep3B, трансфицированных указанными dT-модифицированными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося количества транскрипта по отношению к необработанным клеткам.

- 154 044245

Таблица 21 dT-модифицированные иРНК С5

ID дуплекса	Смысловая последовательность	SEQ ID NO:	Положение в NM_001735.2	Антисмысловая последовательность	SEQ ID NO:
AD-61779.2	UAUCCGUGGUUUCCUGCUAdTdT	1739	3-21	UAGCAGGAAACCACGGAUAdTdT	2306
AD-61785.2	GGUUUCCUGCUACCUCCAAdTdT	1740	10-28	UUGGAGGUAGCAGGAAACCdTdT	2307
AD-61791.2	CCUCCAACCAUGGGCCUUUdTdT	1741	22-40	AAAGGCCCAUGGUUGGAGGdTdT	2308
AD-61797.2	GGGCCUUUUGGGAAUACUUdTdT	1742	33-51	AAGUAUUCCCAAAAGGCCCdTdT	2309
AD-61803.2	GGAAUACUUUGUUUUUUAAdTdT	1743	43-61	UUAAAAAACAAAGUAUUCCdTdT	2310
AD-61809.2	CUUUGUUUUUUAAUCUUCCdTdT	1744	49-67	GGAAGAUUAAAAAACAAAGdT dT	2311
AD-61815.2	CUUCCUGGGGAAAACCUGGdTdT	1745	63-81	CCAGGUUUUCCCCAGGAAGdTdT	2312
AD-61821.2	GGAAAACCUGGGGACAGGAdTdT	1746	71-89	UCCUGUCCCCAGGUUUUCCdTdT	2313
AD-61780.2	GGGACAGGAGCAAACAUAUdTdT	1747	81-99	AUAUGUUUGCUCCUGUCCCdTdT	2314
AD-61786.2	CAAACAUAUGUCAUUUCAGdTdT	1748	91-109	CUGAAAUGACAUAUGUUUGdTdT	2315
AD-61792.2	CAUUUCAGCACCAAAAAUAdTdT	1749	102-120	UAUUUUUGGUGCUGAAAUGdTdT	2316
AD-61798.2	GCACCAAAAAUAUUCCGUGdTdT	1750	109-127	CACGGAAUAUUUUUGGUGCdTdT	2317
AD-61804.2	CCGUGUUGGAGCAUCUGAAdTdT	1751	123-141	UUCAGAUGCUCCAACACGGdTdT	2318
AD-61810.2	GGAGCAUCUGAAAAUAUUGdTdT	1752	130-148	CAAUAUUUUCAGAUGCUCCdTdT	2319
AD-61816.2	GAAAAUAUUGUGAUUCAAGdT dT	1753	139-157	CUUGAAUCACAAUAUUUUCdTdT	2320
AD-61822.2	GAUUCAAGUUUAUGGAUACdTdT	1754	150-168	GUAUCCAUAAACUUGAAUCdTdT	2321
AD-61781.2	GGAUACACUGAAGCAUUUGdTdT	1755	163-181	CAAAUGCUUCAGUGUAUCCdTdT	2322
AD-61787.2	GAAGCAUUUGAUGCAACAAdTdT	1756	172-190	UUGUUGCAUCAAAUGCUUCdTdT	2323
AD-61793.2	UGCAACAAUCUCUAUUAAAdTdT	1757	183-201	UUUAAUAGAGAUUGUUGCAdT dT	2324
AD-61799.2	^UCUCUAUUAAAAGUUAUdT dT	1758	189-207	AUAACUUUUAAUAGAGAUUdT dT	2325
AD-61805.2	^GUUAUCCUGAUAAAAAAdTdT	1759	201-219	UUUUUUAUCAGGAUAACUUdT dT	2326
AD-61811.2	CUGAUAAAAAAUUUAGUUAdT dT	1760	209-227	UAACUAAAUUUUUUAUCAGdT dT	2327
AD-61817.2	UUAGUUACUCCUCAGGCCAdTdT	1761	221-239	UGGCCUGAGGAGUAACUAAdTdT	2328
AD-61823.2	CCUCAGGCCAUGUUCAUUUdTdT	1762	230-248	AAAUGAACAUGGCCUGAGGdTdT	2329
AD-61782.2	UUCAUUUAUCCUCAGAGAAdTdT	1763	242-260	UUCUCUGAGGAUAAAUGAAdTdT	2330
AD-61788.2	CUCAGAGAAUAAAUUCCAAdTdT	1764	252-270	UUGGAAUUUAUUCUCUGAGdTdT	2331
AD-61794.2	4AUAAAUUCCAAAACUCUGdTdT	1765	259-277	CAGAGUUUUGGAAUUUAUUdT dT	2332
AD-61800.2	CUCUGCAAUCUUAACAAUAdTdT	1766	273-291	UAUUGUUAAGAUUGCAGAGdTdT	2333
AD-61806.2	CUUAACAAUACAACCAAAAdTdT	1767	282-300	UUUUGGUUGUAUUGUUAAGdTdT	2334
AD-61812.2	CAACCAAAACAAUUGCCUGdTdT	1768	292-310	CAGGCAAUUGUUUUGGUUGdTdT	2335
AD-61818.2	CAAUUGCCUGGAGGACAAAdTdT	1769	301-319	UUUGUCCUCCAGGCAAUUGdTdT	2336
AD-61824.2	GGACAAAACCCAGUUUCUUdTdT	1770	313-331	AAGAAACUGGGUUUUGUCCdTdT	2337
AD-61783.2	CCAGUUUCUUAUGUGUAUUdTdT	1771	322-340	AAUACACAUAAGAAACUGGdTdT	2338
AD-61789.2	AJGUGUAUUUGGAAGUUGUdTdT	1772	332-350	ACAACUUCCAAAUACACAUdTdT	2339
AD-61795.2	GGAAGUUGUAUCAAAGCAUdTdT	1773	342-360	AUGCUUUGAUACAACUUCCdTdT	2340
AD-61801.2	GUAUCAAAGCAUUUUUCAAdTdT	1774	349-367	UUGAAAAAUGCUUUGAUACdTdT	2341
AD-61807.2	DUUUCAAAAUCAAAAAGAAdT dT	1775	361-379	UUCUUUUUGAUUUUGAAAAdTdT	2342
AD-61813.2	CAAAAAGAAUGCCAAUAACdTdT	1776	371-389	GUUAUUGGCAUUCUUUUUGdTdT	2343
AD-61819.2	GCCAAUAACCUAUGACAAUdTdT	1777	381-399	AUUGUCAUAGGUUAUUGGCdTdT	2344
AD-61825.2	CCUAUGACAAUGGAUUUCUdTdT	1778	389-407	AGAAAUCCAUUGUCAUAGGdTdT	2345

- 155044245

AD-61784.2	UGGAUUUCUCUUCAUUCAUdTdT	1779	399-417	AUGAAUGAAGAGAAAUCCAdTdT	2346
AD-61790.2	CAUUCAUACAGACAAACCUdTdT	1780	411-429	AGGUUUGUCUGUAUGAAUGdTdT	2347
AD-61796.2	CAGACAAACCUGUUUAUACdTdT	1781	419-437	GUAUAAACAGGUUUGUCUGdTdT	2348
AD-61802.2	GUUUAUACUCCAGACCAGUdTdT	1782	430-448	ACUGGUCUGGAGUAUAAACdTdT	2349
AD-61808.2	AGACCAGUCAGUAAAAGUUdTdT	1783	441-459	AACUUUUACUGACUGGUCUdTdT	2350
AD-61814.2	AGUAAAAGUUAGAGUUUAUdT dT	1784	450-468	AUAAACUCUAACUUUUACUdTdT	2351
AD-61820.2	ASAGUUUAUUCGUUGAAUGdTdT	1785	460-478	CAUUCAACGAAUAAACUCUdTdT	2352
AD-61826.2	CGUUGAAUGACGACUUGAAdTdT	1786	470-488	UUCAAGUCGUCAUUCAACGdTdT	2353
AD-61832.2	CUUGAAGCCAGCCAAAAGAdTdT	1787	483-501	UCUUUUGGCUGGCUUCAAGdTdT	2354
AD-61838.2	CCAGCCAAAAGAGAAACUGdTdT	1788	490-508	CAGUUUCUCUUUUGGCUGGdTdT	2355
AD-61844.2	4AACUGUCUUhACUUUCAUdTdT	1789	503-521	AUGAAAGUUAAGACAGUUUdT dT	2356
AD-61850.2	4ACUUUCAUAGAUCCUGAAdTdT	1790	513-531	UUCAGGAUCUAUGAAAGUUdTdT	2357
AD-61856.2	CAUAGAUCCUGAAGGAUCAdTdT	1791	519-537	UGAUCCUUCAGGAUCUAUGdTdT	2358
AD-61862.2	GAAGGAUCAGAAGUUGACAdTdT	1792	529-547	UGUCAACUUCUGAUCCUUCdTdT	2359
AD-61868.2	UGACAUGGUAGAAGAAAUUdTdT	1793	543-561	AAUUUCUUCUACCAUGUCAdTdT	2360
AD-61827.2	GAAGAAAUUGAUCAUAUUGdT dT	1794	553-571	CAAUAUGAUCAAUUUCUUCdTdT	2361
AD-61833.2	GAUCAUAUUGGAAUUAUCUdT dT	1795	562-580	AGAUAAUUCCAAUAUGAUCdTdT	2362
AD-61839.2	GGAAUUAUCUCUUUUCCUGdTdT	1796	571-589	CAGGAAAAGAGAUAAUUCCdTdT	2363
AD-61845.2	CUCUUUUCCUGACUUCAAGdTdT	1797	579-597	CUUGAAGUCAGGAAAAGAGdTdT	2364
AD-61851.2	ACUUCAAGAUUCCGUCUAAdTdT	1798	590-608	UUAGACGGAAUCUUGAAGUdTdT	2365
AD-61857.2	CCGUCUAAUCCUAGAUAUGdTdT	1799	601-619	CAUAUCUAGGAUUAGACGGdTdT	2366
AD-61863.2	CCUAGAUAUGGUAUGUGGAdTdT	1800	610-628	UCCACAUACCAUAUCUAGGdTdT	2367
AD-61869.2	UGUGGACGAUCAAGGCUAAdTdT	1801	623-641	UUAGCCUUGAUCGUCCACAdTdT	2368
AD-61828.2	CGAUCAAGGCUAAAUAUAAdTdT	1802	629-647	UUAUAUUUAGCCUUGAUCGdTdT	2369
AD-61834.2	AJAUAAAGAGGACUUUUCAdT dT	1803	642-660	UGAAAAGUCCUCUUUAUAUdTdT	2370
AD-61840.2	GAGGACUUUUCAACAACUGdTdT	1804	649-667	CAGUUGUUGAAAAGUCCUCdTdT	2371
AD-61846.2	CAACUGGAACCGCAUAUUUdTdT	1805	662-680	AAAUAUGCGGUUCCAGUUGdTdT	2372
AD-61852.2	CGCAUAUUUUGAAGUUAAAdTdT	1806	672-690	UUUAACUUCAAAAUAUGCGdTdT	2373
AD-61858.2	AASUUAAAGAAUAUGUCUUdTdT	1807	683-701	AAGACAUAUUCUUUAACUUdT dT	2374
AD-61864.2	GAAUAUGUCUUGCCACAUUdTdT	1808	691-709	AAUGUGGCAAGACAUAUUCdTdT	2375
AD-61870.2	CCACAUUUUUCUGUCUCAAdTdT	1809	703-721	UUGAGACAGAAAAAUGUGGdTdT	2376
AD-61829.2	CUGUCUCAAUCGAGCCAGAdTdT	1810	713-731	UCUGGCUCGAUUGAGACAGdTdT	2377
AD-61835.2	CAAUCGAGCCAGAAUAUAAdTdT	1811	719-737	UUAUAUUCUGGCUCGAUUGdTdT	2378
AD-61841.2	GAAUAUAAUUUCAUUGGUUdT dT	1812	730-748	AACCAAUGAAAUUAUAUUCdTdT	2379
AD-61847.2	AJUGGUUACAAGAACUUUAdTdT	1813	742-760	UAAAGUUCUUGUAACCAAUdTdT	2380
AD-61853.2	AGAACUUUAAGAAUUUUGAdT dT	1814	752-770	UCAAAAUUCUUAAAGUUCUdTdT	2381
AD-61859.2	GAAUUUUGAAAUUACUAUAdT dT	1815	762-780	UAUAGUAAUUUCAAAAUUCdTdT	2382
AD-61865.2	GAAAUUACUAUAAAAGCAAdT dT	1816	769-787	UUGCUUUUAUAGUAAUUUCdTdT	2383
AD-61871.2	/WkGCAAGAUAUUUUUAUAdT dT	1817	781-799	UAUAAAAAUAUCUUGCUUUdT dT	2384
AD-61830.2	AJAUUUUUAUAAUAAAGUAdT dT	1818	789-807	UACUUUAUUAUAAAAAUAUdT dT	2385
AD-61836.2	?\AGUAGUCACUGAGGCUGAdTdT	1819	803-821	UCAGCCUCAGUGACUACUUdTdT	2386
AD-61842.2	CACUGAGGCUGACGUUUAUdTdT	1820	810-828	AUAAACGUCAGCCUCAGUGdTdT	2387
AD-61848.2	CGUUUAUAUCACAUUUGGAdTdT	1821	822-840	UCCAAAUGUGAUAUAAACGdTdT	2388
AD-61854.2	CACAUUUGGAAUAAGAGAAdT dT	1822	831-849	UUCUCUUAUUCCAAAUGUGdTdT	2389

- 156044245

AD-61860.2	4AUAAGAGAAGACUUAAAAdT dT	1823	840-858	UUUUAAGUCUUCUCUUAUUdTdT	2390
AD-61866.2	GUUAAAAGAUGAUCAAAAAdT dT	1824	852-870	UUUUUGAUCAUCUUUUAAGdTdT	2391
AD-61872.2	GAUGAUCAAAAAGAAAUGAdT dT	1825	859-877	UCAUUUCUUUUUGAUCAUCdTdT	2392
AD-61831.2	4AAUGAUGCAAACAGCAAUdTdT	1826	872-890	AUUGCUGUUUGCAUCAUUUdTdT	2393
AD-61837.2	AGAGCAAUGCAAAACACAAdT dT	1827	883-901	UUGUGUUUUGCAUUGCUGUdTdT	2394
AD-61843.2	/WkACACAAUGUUGAUAAAdT dT	1828	893-911	UUUAUCAACAUUGUGUUUUdTdT	2395
AD-61849.2	CAAUGUUGAUAAAUGGAAUdTdT	1829	899-917	AUUCCAUUUAUCAACAUUGdTdT	2396
AD-61855.2	GGAAUUGCUCAAGUCACAUdTdT	1830	913-931	AUGUGACUUGAGCAAUUCCdTdT	2397
AD-61861.2	GCUCAAGUCACAUUUGAUUdTdT	1831	919-937	AAUCAAAUGUGACUUGAGCdTdT	2398
AD-61867.2	AJUUGAUUCUGAAACAGCAdTdT	1832	930-948	UGCUGUUUCAGAAUCAAAUdTdT	2399
AD-620 62.1	UGAAACAGCAGUCAAAGAAdTdT	1833	939-957	UUCUUUGACUGCUGUUUCAdTdT	2400
AD-62068.1	GAAAGAACUGUCAUACUACdTdT	1834	951-969	GUAGUAUGACAGUUCUUUGdTdT	2401
AD-62074.1	GAUACUACAGUUUAGAAGAdT dT	1835	962-980	UCUUCUAAACUGUAGUAUGdTdT	2402
AD-6208 0.1	GAGUUUAGAAGAUUUAAACdTdT	1836	969-987	GUUUAAAUCUUCUAAACUGdTdT	2403
AD-620 86.1	UAAACAACAAGUACCUUUAdTdT	1837	983-1001	UAAAGGUACUUGUUGUUUAdTdT	2404
AD-62092.1	GAAGUACCUUUAUAUUGCUdTdT	1838	990-1008	AGCAAUAUAAAGGUACUUGdTdT	2405
AD-62098.1	UAUUGCUGUAACAGUCAUAdTdT	1839	1002-1020	UAUGACUGUUACAGCAAUAdT dT	2406
AD-62104.1	4ACAGUCAUAGAGUCUACAdTdT	1840	1011-1029	UGUAGACUCUAUGACUGUUdTdT	2407
AD-62063.1	AGAGUCUACAGGUGGAUUUdTdT	1841	1020-1038	AAAUCCACCUGUAGACUCUdTdT	2408
AD-62069.1	GGAUUUUCUGAAGAGGCAGdTdT	1842	1033-1051	CUGCCUCUUCAGAAAAUCCdTdT	2409
AD-62075.1	GAAGAGGCAGAAAUACCUGdTdT	1843	1042-1060	CAGGUAUUUCUGCCUCUUCdTdT	2410
AD-62081.1	AGAAAUACCUGGCAUCAAAdTdT	1844	1050-1068	UUUGAUGCCAGGUAUUUCUdTdT	2411
AD-62087.1	GCAUCAAAUAUGUCCUCUCdTdT	1845	1061-1079	GAGAGGACAUAUUUGAUGCdTdT	2412
AD-62093.1	UGUCCUCUCUCCCUACAAAdTdT	1846	1071-1089	UUUGUAGGGAGAGAGGACAdTdT	2413
AD-62099.1	GAAUUUGGUUGCUACUCCUdTdT	1847	1092-1110	AGGAGUAGCAACCAAAUUCdTdT	2414
AD-62105.1	GCUACUCCUCUUUUCCUGAdTdT	1848	1102-1120	UCAGGAAAAGAGGAGUAGCdTdT	2415
AD-62064.1	GUCUUUUCCUGAAGCCUGGdTdT	1849	1109-1127	CCAGGCUUCAGGAAAAGAGdTdT	2416
AD-62070.1	GCUGGGAUUCCAUAUCCCAdTdT	1850	1123-1141	UGGGAUAUGGAAUCCCAGGdTdT	2417
AD-62076.1	GAUAUCCCAUCAAGGUGCAdTdT	1851	1133-1151	UGCACCUUGAUGGGAUAUGdTdT	2418
AD-62082.1	GCAUCAAGGUGCAGGUUAAdTdT	1852	1139-1157	UUAACCUGCACCUUGAUGGdTdT	2419
AD-62088.1	GAGGUUAAAGAUUCGCUUGdTdT	1853	1150-1168	CAAGCGAAUCUUUAACCUGdTdT	2420
AD-62094.1	UUCGCUUGACCAGUUGGUAdTdT	1854	1161-1179	UACCAACUGGUCAAGCGAAdTdT	2421
AD-62100.1	GCAGUUGGUAGGAGGAGUCdTdT	1855	1170-1188	GACUCCUCCUACCAACUGGdTdT	2422
AD-62106.1	GGAGGAGUCCCAGUAACACdTdT	1856	1180-1198	GUGUUACUGGGACUCCUCCdTdT	2423
AD-62065.1	GAGUAACACUGAAUGCACAdTdT	1857	1190-1208	UGUGCAUUCAGUGUUACUGdTdT	2424
AD-62071.1	GAAUGCACAAACAAUUGAUdTdT	1858	1200-1218	AUCAAUUGUUUGUGCAUUCdTdT	2425
AD-62077.1	4ACAAUUGAUGUAAACCAAdTdT	1859	1209-1227	UUGGUUUACAUCAAUUGUUdTdT	2426
AD-62083.1	UAAACCAAGAGACAUCUGAdTdT	1860	1220-1238	UCAGAUGUCUCUUGGUUUAdTdT	2427
AD-62089.1	GAUCUGACUUGGAUCCAAGdTdT	1861	1232-1250	CUUGGAUCCAAGUCAGAUGdTdT	2428
AD-62095.1	GAUCCAAGCAAAAGUGUAAdTdT	1862	1243-1261	UUACACUUUUGCUUGGAUCdTdT	2429
AD-62101.1	GAAAAGUGUAACACGUGUUdTdT	1863	1251-1269	AACACGUGUUACACUUUUGdTdT	2430
AD-62107.1	4ACACGUGUUGAUGAUGGAdTdT	1864	1260-1278	UCCAUCAUCAACACGUGUUdTdT	2431
AD-620 66.1	DGAUGGAGUAGCUUCCUUUdTdT	1865	1272-1290	AAAGGAAGCUACUCCAUCAdTdT	2432
AD-62072.1	GUAGCUUCCUUUGUGCUUAdTdT	1866	1279-1297	UAAGCACAAAGGAAGCUACdTdT	2433

- 157044245

AD-62078 .1	GCUUAAUCUCCCAUCUGGAdTdT	1867	1293-1311	UCCAGAUGGGAGAUUAAGCdTdT	2434
AD-62084.1	GCAUCUGGAGUGACGGUGCdTdT	1868	1303-1321	GCACCGUCACUCCAGAUGGdTdT	2435
AD-62090.1	UGACGGUGCUGGAGUUUAAdTdT	1869	1313-1331	UUAAACUCCAGCACCGUCAdTdT	2436
AD-62096.1	GCUGGAGUUUAAUGUCAAAdTdT	1870	1320-1338	UUUGACAUUAAACUCCAGCdTdT	2437
AD-62102.1	UGUCAAAACUGAUGCUCCAdTdT	1871	1332-1350	UGGAGCAUCAGUUUUGACAdTdT	2438
AD-62108.1	GAUGCUCCAGAUCUUCCAGdTdT	1872	1342-1360	CUGGAAGAUCUGGAGCAUCdTdT	2439
AD-62067.1	CAGAUCUUCCAGAAGAAAAdTdT	1873	1349-1367	UUUUCUUCUGGAAGAUCUGdTdT	2440
AD-62073.1	AGAAAAUCAGGCCAGGGAAdTdT	1874	1362-1380	UUCCCUGGCCUGAUUUUCUdTdT	2441
AD-62079.1	GGCCAGGGAAGGUUACCGAdTdT	1875	1371-1389	UCGGUAACCUUCCCUGGCCdTdT	2442
AD-62085.1	GUUACCGAGCAAUAGCAUAdTdT	1876	1382-1400	UAUGCUAUUGCUCGGUAACdTdT	2443
AD-62091.1	AJAGCAUACUCAUCUCUCAdTdT	1877	1393-1411	UGAGAGAUGAGUAUGCUAUdT dT	2444
AD-62097.1	UACUCAUCUCUCAGCCAAAdTdT	1878	1399-1417	UUUGGCUGAGAGAUGAGUAdTdT	2445
AD-62103.1	GCCAAAGUUACCUUUAUAUdTdT	1879	1412-1430	AUAUAAAGGUAACUUUGGCdTdT	2446
AD-62109.1	GCUUUAUAUUGAUUGGACUdTdT	1880	1422-1440	AGUCCAAUCAAUAUAAAGGdTdT	2447
AD-62115.1	GAUUGGACUGAUAACCAUAdTdT	1881	1432-1450	UAUGGUUAUCAGUCCAAUCdTdT	2448
AD-62121.1	GUGAUAACCAUAAGGCUUUdTdT	1882	1439-1457	AAAGCCUUAUGGUUAUCAGdTdT	2449
AD-62127.1	AGGCUUUGCUAGUGGGAGAdTdT	1883	1451-1469	UCUCCCACUAGCAAAGCCUdTdT	2450
AD-62133.1	GUGGGAGAACAUCUGAAUAdTdT	1884	1462-1480	UAUUCAGAUGUUCUCCCACdTdT	2451
AD-62139.1	CAUCUGAAUAUUAUUGUUAdT dT	1885	1471-1489	UAACAAUAAUAUUCAGAUGdT dT	2452
AD-62145.1	UAUUAUUGUUACСССCAAAdTdT	1886	1479-1497	UUUGGGGGUAACAAUAAUAdTdT	2453
AD-62151.1	CCCAAAAGCCCAUAUAUUGdTdT	1887	1492-1510	CAAUAUAUGGGCUUUUGGGdTdT	2454
AD-62110.1	CCAAAAGCCCAUAUAUUGAdTdT	1888	1493-1511	UCAAUAUAUGGGCUUUUGGdTdT	2455
AD-62116.1	GAAAAGCCCAUAUAUUGACdTdT	1889	1494-1512	GUCAAUAUAUGGGCUUUUGdTdT	2456
AD-62122.1	4AAAGCCCAUAUAUUGACAdTdT	1890	1495-1513	UGUCAAUAUAUGGGCUUUUdTdT	2457
AD-62128.1	4AAGCCCAUAUAUUGACAAdTdT	1891	1496-1514	UUGUCAAUAUAUGGGCUUUdTdT	2458
AD-62134.1	4AGCCCAUAUAUUGACAAAdTdT	1892	1497-1515	UUUGUCAAUAUAUGGGCUUdTdT	2459
AD-6214 0.1	AGCCCAUAUAUUGACAAAAdTdT	1893	1498-1516	UUUUGUCAAUAUAUGGGCUdTdT	2460
AD-62146.1	GCCCAUAUAUUGACAAAAUdTdT	1894	1499-1517	AUUUUGUCAAUAUAUGGGCdTdT	2461
AD-62152.1	CCCAUAUAUUGACAAAAUAdTdT	1895	1500-1518	UAUUUUGUCAAUAUAUGGGdTdT	2462
AD-62111.1	CCAUAUAUUGACAAAAUAAdTdT	1896	1501-1519	UUAUUUUGUCAAUAUAUGGdTdT	2463
AD-62117.1	GAUAUAUUGACAAAAUAACdTdT	1897	1502-1520	GUUAUUUUGUCAAUAUAUGdT dT	2464
AD-62123.1	AJAUAUUGACAAAAUAACUdT dT	1898	1503-1521	AGUUAUUUUGUCAAUAUAUdT dT	2465
AD-62129.1	UAUAUUGACAAAAUAACUCdTdT	1899	1504-1522	GAGUUAUUUUGUCAAUAUAdT dT	2466
AD-62135.1	AJAUUGACAAAAUAACUCAdT dT	1900	1505-1523	UGAGUUAUUUUGUCAAUAUdT dT	2467
AD-62141.1	UAUUGACAAAAUAACUCACdTdT	1901	1506-1524	GUGAGUUAUUUUGUCAAUAdT dT	2468
AD-62147.1	AJUGACAAAAUAACUCACUdT dT	1902	1507-1525	AGUGAGUUAUUUUGUCAAUdTdT	2469
AD-62153.1	UUGACAAAAUAACUCACUAdT dT	1903	1508-1526	UAGUGAGUUAUUUUGUCAAdTdT	2470
AD-62112.1	UGACAAAAUAACUCACUAUdT dT	1904	1509-1527	AUAGUGAGUUAUUUUGUCAdT dT	2471
AD-62118.1	GACAAAAUAACUCACUAUAdT dT	1905	1510-1528	UAUAGUGAGUUAUUUUGUCdTdT	2472
AD-62124.1	ikAAAUAACUCACUAUAAUUdT dT	1906	1513-1531	AAUUAUAGUGAGUUAUUUUdT dT	2473
AD-62130.1	AA№AACUCACUAUAAUUAdT dT	1907	1514-1532	UAAUUAUAGUGAGUUAUUUdT dT	2474
AD-62136.1	4AUAACUCACUAUAAUUACdTdT	1908	1515-1533	GUAAUUAUAGUGAGUUAUUdT dT	2475
AD-62142.1	AUAACUCACUAUAAUUACUdT dT	1909	1516-1534	AGUAAUUAUAGUGAGUUAUdT dT	2476
AD-62148.1	AACUCACUAUAAUUACUUGdTdT	1910	1518-1536	CAAGUAAUUAUAGUGAGUUdT dT	2477

- 158044245

AD-62154.1	AGUCACUAUAAUUACUUGAdT dT	1911	1519-1537	UCAAGUAAUUAUAGUGAGUdT dT	2478
AD-62113.1	CUCACUAUAAUUACUUGAUdT dT	1912	1520-1538	AUCAAGUAAUUAUAGUGAGdT dT	2479
AD-62119.1	UCACUAUAAUUACUUGAUUdT dT	1913	1521-1539	AAUCAAGUAAUUAUAGUGAdT dT	2480
AD-62125.1	AGUAUAAUUACUUGAUUUUdT dT	1914	1523-1541	AAAAUCAAGUAAUUAUAGUdT dT	2481
AD-62131.1	CUAUAAUUACUUGAUUUUAdT dT	1915	1524-1542	UAAAAUCAAGUAAUUAUAGdT dT	2482
AD-62137.1	UAUAAUUACUUGAUUUUAUdT dT	1916	1525-1543	AUAAAAUCAAGUAAUUAUAdT dT	2483
AD-62143.1	AJAAUUACUUGAUUUUAUCdTdT	1917	1526-1544	GAUAAAAUCAAGUAAUUAUdT dT	2484
AD-62149.1	UAAUUACUUGAUUUUAUCCdTdT	1918	1527-1545	GGAUAAAAUCAAGUAAUUAdTdT	2485
AD-62155.1	4AUUACUUGAUUUUAUCCAdTdT	1919	1528-1546	UGGAUAAAAUCAAGUAAUUdT dT	2486
AD-62114.1	AJUACUUGAUUUUAUCCAAdTdT	1920	1529-1547	UUGGAUAAAAUCAAGUAAUdT dT	2487
AD-62120.1	UUAUCCAAGGGCAAAAUUAdTdT	1921	1540-1558	UAAUUUUGCCCUUGGAUAAdTdT	2488
AD-62126.1	GCAAAAUUAUCCACUUUGGdTdT	1922	1550-1568	CCAAAGUGGAUAAUUUUGCdTdT	2489
AD-62132.1	CACUUUGGCACGAGGGAGAdTdT	1923	1561-1579	UCUCCCUCGUGCCAAAGUGdTdT	2490
AD-62138.1	GGAGGGAGAAAUUUUCAGAdTdT	1924	1571-1589	UCUGAAAAUUUCUCCCUCGdTdT	2491
AD-62144.1	AJUUUCAGAUGCAUCUUAUdTdT	1925	1581-1599	AUAAGAUGCAUCUGAAAAUdT dT	2492
AD-62150.1	GCAUCUUAUCAAAGUAUAAdT dT	1926	1591-1609	UUAUACUUUGAUAAGAUGCdTdT	2493
AD-62156.1	CAAAGUAUAAACAUUCCAGdTdT	1927	1600-1618	CUGGAAUGUUUAUACUUUGdTdT	2494
AD-62162.1	AJUCCAGUAACACAGAACAdTdT	1928	1612-1630	UGUUCUGUGUUACUGGAAUdTdT	2495
AD-62168.1	CACAGAACAUGGUUCCUUCdTdT	1929	1622-1640	GAAGGAACCAUGUUCUGUGdTdT	2496
AD-62174.1	GGUUCCUUCAUCCCGACUUdTdT	1930	1632-1650	AAGUCGGGAUGAAGGAACCdTdT	2497
AD-62180.1	CCCGACUUCUGGUCUAUUAdTdT	1931	1643-1661	UAAUAGACCAGAAGUCGGGdTdT	2498
AD-62186.1	GGUCUAUUACAUCGUCACAdTdT	1932	1653-1671	UGUGACGAUGUAAUAGACCdTdT	2499
AD-62192.1	AJCGUCACAGGAGAACAGAdTdT	1933	1663-1681	UCUGUUCUCCUGUGACGAUdTdT	2500
AD-62198.1	CAGGAGAACAGACAGCAGAdTdT	1934	1670-1688	UCUGCUGUCUGUUCUCCUGdTdT	2501
AD-62157.1	CAGCAGAAUUAGUGUCUGAdTdT	1935	1682-1700	UCAGACACUAAUUCUGCUGdTdT	2502
AD-62163.1	GUGUCUGAUUCAGUCUGGUdTdT	1936	1693-1711	ACCAGACUGAAUCAGACACdTdT	2503
AD-62169.1	CAGUCUGGUUAAAUAUUGAdTdT	1937	1703-1721	UCAAUAUUUAACCAGACUGdTdT	2504
AD-62175.1	GUUAAAUAUUGAAGAAAAAdT dT	1938	1710-1728	UUUUUCUUCAAUAUUUAACdTdT	2505
AD-62181.1	/IGAAAAAUGUGGCAACCAGdTdT	1939	1722-1740	CUGGUUGCCACAUUUUUCUdTdT	2506
AD-62187.1	GCAACCAGCUCCAGGUUCAdTdT	1940	1733-1751	UGAACCUGGAGCUGGUUGCdTdT	2507
AD-62193.1	GCUCCAGGUUCAUCUGUCUdTdT	1941	1740-1758	AGACAGAUGAACCUGGAGCdTdT	2508
AD-62199.1	AJCUGUCUCCUGAUGCAGAdTdT	1942	1751-1769	UCUGCAUCAGGAGACAGAUdTdT	2509
AD-62158.1	GAUGCAGAUGCAUAUUCUCdTdT	1943	1762-1780	GAGAAUAUGCAUCUGCAUCdTdT	2510
AD-62164.1	GCAUAUUCUCCAGGCCAAAdTdT	1944	1771-1789	UUUGGCCUGGAGAAUAUGCdTdT	2511
AD-62170.1	AGGCCAAACUGUGUCUCUUdTdT	1945	1782-1800	AAGAGACACAGUUUGGCCUdTdT	2512
AD-62176.1	GUGUCUCUUAAUAUGGCAAdTdT	1946	1792-1810	UUGCCAUAUUAAGAGACACdTdT	2513
AD-62182.1	UUAAUAUGGCAACUGGAAUdTdT	1947	1799-1817	AUUCCAGUUGCCAUAUUAAdTdT	2514
AD-62188.1	4ACUGGAAUGGAUUCCUGGdTdT	1948	1809-1827	CCAGGAAUCCAUUCCAGUUdTdT	2515
AD-62194.1	UUCCUGGGUGGCAUUAGCAdTdT	1949	1821-1839	UGCUAAUGCCACCCAGGAAdTdT	2516
AD-62200.1	GGCAUUAGCAGCAGUGGACdTdT	1950	1830-1848	GUCCACUGCUGCUAAUGCCdTdT	2517
AD-62159.1	AGUGGACAGUGCUGUGUAUdTdT	1951	1842-1860	AUACACAGCACUGUCCACUdTdT	2518
AD-62165.1	GCUGUGUAUGGAGUCCAAAdTdT	1952	1852-1870	UUUGGACUCCAUACACAGCdTdT	2519
AD-62171.1	AOUCCAAAGAGGAGCCAAAdTdT	1953	1863-1881	UUUGGCUCCUCUUUGGACUdTdT	2520
AD-62177.1	AGAGGAGCCAAAAAGCCCUdTdT	1954	1870-1888	AGGGCUUUUUGGCUCCUCUdTdT	2521

- 159044245

AD-62183.1	AGCCCUUGGAAAGAGUAUUdTdT	1955	1883-1901	AAUACUCUUUCCAAGGGCUdTdT	2522
AD-62189.1	4AGAGUAUUUCAAUUCUUAdTdT	1956	1893-1911	UAAGAAUUGAAAUACUCUUdTdT	2523
AD-62195.1	UUUCAAUUCUUAGAGAAGAdT dT	1957	1900-1918	UCUUCUCUAAGAAUUGAAAdTdT	2524
AD-62201.1	GAGAAGAGUGAUCUGGGCUdTdT	1958	1912-1930	AGCCCAGAUCACUCUUCUCdTdT	2525
AD-62160.1	UGAUCUGGGCUGUGGGGCAdTdT	1959	1920-1938	UGCCCCACAGCCCAGAUCAdTdT	2526
AD-62166.1	GGGGCAGGUGGUGGCCUCAdTdT	1960	1933-1951	UGAGGCCACCACCUGCCCCdTdT	2527
AD-62172.1	GUGGCCUCAACAAUGCCAAdTdT	1961	1943-1961	UUGGCAUUGUUGAGGCCACdTdT	2528
AD-62178.1	CAACAAUGCCAAUGUGUUCdTdT	1962	1950-1968	GAACACAUUGGCAUUGUUGdTdT	2529
AD-62184.1	GAAUGUGUUCCACCUAGCUdTdT	1963	1959-1977	AGCUAGGUGGAACACAUUGdTdT	2530
AD-62190.1	GACCUAGCUGGACUUACCUdTdT	1964	1969-1987	AGGUAAGUCCAGCUAGGUGdTdT	2531
AD-62196.1	GACUUACCUUCCUCACUAAdTdT	1965	1979-1997	UUAGUGAGGAAGGUAAGUCdTdT	2532
AD-62202.1	UCACUAAUGCAAAUGCAGAdTdT	1966	1991-2009	UCUGCAUUUGCAUUAGUGAdTdT	2533
AD-62161.1	4AAUGCAGAUGACUCCCAAdTdT	1967	2001-2019	UUGGGAGUCAUCUGCAUUUdTdT	2534
AD-62167.1	GUCCCAAGAAAAUGAUGAAdTdT	1968	2013-2031	UUCAUCAUUUUCUUGGGAGdTdT	2535
AD-62173.1	GCUUGUAAAGAAAUUCUCAdTdT	1969	2032-2050	UGAGAAUUUCUUUACAAGGdTdT	2536
AD-62179.1	4AUUCUCAGGCCAAGAAGAdTdT	1970	2043-2061	UCUUCUUGGCCUGAGAAUUdTdT	2537
AD-62185.1	GCAAGAAGAACGCUGCAAAdTdT	1971	2053-2071	UUUGCAGCGUUCUUCUUGGdTdT	2538
AD-62191.1	GGCUGCAAAAGAAGAUAGAdTdT	1972	2063-2081	UCUAUCUUCUUUUGCAGCGdTdT	2539
AD-62197.1	AAYGAAGAUAGAAGAAAUAdT dT	1973	2070-2088	UAUUUCUUCUAUCUUCUUUdTdT	2540
AD-62203.1	AGAAAUAGCUGCUAAAUAUdTdT	1974	2082-2100	AUAUUUAGCAGCUAUUUCUdTdT	2541
AD-62209.1	GCUGCUAAAUAUAAACAUUdTdT	1975	2089-2107	AAUGUUUAUAUUUAGCAGCdTdT	2542
AD-62215.1	ACAUUCAGUAGUGAAGAAAdT dT	1976	2103-2121	UUUCUUCACUACUGAAUGUdTdT	2543
AD-62221.1	GUAGUGAAGAAAUGUUGUUdTdT	1977	2110-2128	AACAACAUUUCUUCACUACdTdT	2544
AD-62227.1	4AAUGUUGUUACGAUGGAGdTdT	1978	2119-2137	CUCCAUCGUAACAACAUUUdTdT	2545
AD-62233.1	GGAUGGAGCCUGCGUUAAUdTdT	1979	2130-2148	AUUAACGCAGGCUCCAUCGdTdT	2546
AD-62239.1	GGUUAAUAAUGAUGAAACCdTdT	1980	2142-2160	GGUUUCAUCAUUAUUAACGdTdT	2547
AD-62245.1	AUGAUGAAACCUGUGAGCAdTdT	1981	2150-2168	UGCUCACAGGUUUCAUCAUdTdT	2548
AD-62204.1	GUGUGAGCAGCGAGCUGCAdTdT	1982	2160-2178	UGCAGCUCGCUGCUCACAGdTdT	2549
AD-62210.1	CGAGCUGCACGGAUUAGUUdTdT	1983	2170-2188	AACUAAUCCGUGCAGCUCGdTdT	2550
AD-62216.1	GGAUUAGUUUAGGGCCAAGdTdT	1984	2180-2198	CUUGGCCCUAAACUAAUCCdTdT	2551
AD-62222.1	GGGCCAAGAUGCAUCAAAGdTdT	1985	2191-2209	CUUUGAUGCAUCUUGGCCCdTdT	2552
AD-62228.1	GAUCAAAGCUUUCACUGAAdTdT	1986	2202-2220	UUCAGUGAAAGCUUUGAUGdTdT	2553
AD-62234.1	GCUUUCACUGAAUGUUGUGdTdT	1987	2209-2227	CACAACAUUCAGUGAAAGCdTdT	2554
AD-62240.1	4AUGUUGUGUCGUCGCAAGdTdT	1988	2219-2237	CUUGCGACGACACAACAUUdTdT	2555
AD-62246.1	GGUCGCAAGCCAGCUCCGUdTdT	1989	2229-2247	ACGGAGCUGGCUUGCGACGdTdT	2556
AD-62205.1	GCUCCGUGCUAAUAUCUCUdTdT	1990	2241-2259	AGAGAUAUUAGCACGGAGCdTdT	2557
AD-62211.1	GUAAUAUCUCUCAUAAAGAdT dT	1991	2249-2267	UCUUUAUGAGAGAUAUUAGdT dT	2558
AD-62217.1	4AAGACAUGCAAUUGGGAAdTdT	1992	2263-2281	UUCCCAAUUGCAUGUCUUUdTdT	2559
AD-62223.1	GAAUUGGGAAGGCUACACAdTdT	1993	2272-2290	UGUGUAGCCUUCCCAAUUGdTdT	2560
AD-62229.1	GCUACACAUGAAGACCCUGdTdT	1994	2283-2301	CAGGGUCUUCAUGUGUAGCdTdT	2561
AD-62235.1	CAUGAAGACCCUGUUACCAdTdT	1995	2289-2307	UGGUAACAGGGUCUUCAUGdTdT	2562
AD-62241.1	UACCAGUAAGCAAGCCAGAdTdT	1996	2303-2321	UCUGGCUUGCUUACUGGUAdTdT	2563
AD-62247.1	AGCAAGCCAGAAAUUCGGAdTdT	1997	2311-2329	UCCGAAUUUCUGGCUUGCUdTdT	2564
AD-62206.1	AGAAAUUCGGAGUUAUUUUdTdT	1998	2319-2337	AAAAUAACUCCGAAUUUCUdTdT	2565

- 160044245

AD-62212.1	hGUUAUUUUCCAGAAAGCUdTdT	1999	2329-2347	AGCUUUCUGGAAAAUAACUdTdT	2566
AD-62218.1	GAGAAAGCUGGUUGUGGGAdTdT	2000	2339-2357	UCCCACAACCAGCUUUCUGdTdT	2567
AD-62224.1	GUGGGAAGUUCAUCUUGUUdTdT	2001	2352-2370	AACAAGAUGAACUUCCCACdTdT	2568
AD-62230.1	UCAUCUUGUUCCCAGAAGAdTdT	2002	2361-2379	UCUUCUGGGAACAAGAUGAdTdT	2569
AD-62236.1	GCAGAAGAAAACAGUUGCAdTdT	2003	2372-2390	UGCAACUGUUUUCUUCUGGdTdT	2570
AD-62242.1	GAGUUGCAGUUUGCCCUACdTdT	2004	2383-2401	GUAGGGCAAACUGCAACUGdTdT	2571
AD-62248.1	CAGUUUGCCCUACCUGAUUdTdT	2005	2389-2407	AAUCAGGUAGGGCAAACUGdTdT	2572
AD-62207.1	CCUGAUUCUCUAACCACCUdTdT	2006	2401-2419	AGGUGGUUAGAGAAUCAGGdTdT	2573
AD-62213.1	hCCACCUGGGAAAUUCAAGdTdT	2007	2413-2431	CUUGAAUUUCCCAGGUGGUdTdT	2574
AD-62219.1	GAAAUUCAAGGCGUUGGCAdTdT	2008	2422-2440	UGCCAACGCCUUGAAUUUCdTdT	2575
AD-62225.1	GGUUGGCAUUUCAAACACUdTdT	2009	2433-2451	AGUGUUUGAAAUGCCAACGdTdT	2576
AD-62231.1	GAUUUCAAACACUGGUAUAdTdT	2010	2439-2457	UAUACCAGUGUUUGAAAUGdTdT	2577
AD-62237.1	GUAUAUGUGUUGCUGAUACdTdT	2011	2453-2471	GUAUCAGCAACACAUAUACdTdT	2578
AD-62243.1	UGCUGAUACUGUCAAGGCAdTdT	2012	2463-2481	UGCCUUGACAGUAUCAGCAdTdT	2579
AD-62249.1	GUGUCAAGGCAAAGGUGUUdTdT	2013	2471-2489	AACACCUUUGCCUUGACAGdTdT	2580
AD-62208.1	hGGUGUUCAAAGAUGUCUUdTdT	2014	2483-2501	AAGACAUCUUUGAACACCUdTdT	2581
AD-62214.1	GAAAGAUGUCUUCCUGGAAdTdT	2015	2490-2508	UUCCAGGAAGACAUCUUUGdTdT	2582
AD-62220.1	GUUCCUGGAAAUGAAUAUAdTdT	2016	2499-2517	UAUAUUCAUUUCCAGGAAGdTdT	2583
AD-62226.1	GAAUAUACCAUAUUCUGUUdTdT	2017	2511-2529	AACAGAAUAUGGUAUAUUCdTdT	2584
AD-62232.1	AJAUUCUGUUGUACGAGGAdTdT	2018	2520-2538	UCCUCGUACAACAGAAUAUdTdT	2585
AD-62238.1	CGAGGAGAACAGAUCCAAUdTdT	2019	2533-2551	AUUGGAUCUGUUCUCCUCGdTdT	2586
AD-62244.1	GAACAGAUCCAAUUGAAAGdTdT	2020	2539-2557	CUUUCAAUUGGAUCUGUUCdTdT	2587
AD-61874.1	GAAAGGAACUGUUUACAACdTdT	2021	2553-2571	GUUGUAAACAGUUCCUUUCdTdT	2588
AD-61880.1	hCUGUUUACAACUAUAGGAdTdT	2022	2560-2578	UCCUAUAGUUGUAAACAGUdTdT	2589
AD-6188 6.1	hACUAUAGGACUUCUGGGAdTdT	2023	2569-2587	UCCCAGAAGUCCUAUAGUUdTdT	2590
AD-61892.1	UGGGAUGCAGUUCUGUGUUdTdT	2024	2583-2601	AACACAGAACUGCAUCCCAdTdT	2591
AD-61898.1	GUUCUGUGUUAAAAUGUCUdTdT	2025	2592-2610	AGACAUUUUAACACAGAACdTdT	2592
AD-61904.1	UUAAAAUGUCUGCUGUGGAdTdT	2026	2600-2618	UCCACAGCAGACAUUUUAAdTdT	2593
AD-61910.1	CUGUGGAGGGAAUCUGCACdTdT	2027	2612-2630	GUGCAGAUUCCCUCCACAGdTdT	2594
AD-61916.1	GGAAUCUGCACUUCGGAAAdTdT	2028	2620-2638	UUUCCGAAGUGCAGAUUCCdTdT	2595
AD-61875.1	GGGAAAGCCCAGUCAUUGAdTdT	2029	2633-2651	UCAAUGACUGGGCUUUCCGdTdT	2596
AD-61881.1	GCAGUCAUUGAUCAUCAGGdTdT	2030	2641-2659	CCUGAUGAUCAAUGACUGGdTdT	2597
AD-61887.1	GAUCAGGGCACAAAGUCCUdTdT	2031	2653-2671	AGGACUUUGUGCCCUGAUGdTdT	2598
AD-61893.1	GGCACAAAGUCCUCCAAAUdTdT	2032	2659-2677	AUUUGGAGGACUUUGUGCCdTdT	2599
AD-61899.1	GAAAUGUGUGCGCCAGAAAdTdT	2033	2673-2691	UUUCUGGCGCACACAUUUGdTdT	2600
AD-61905.1	GCGCCAGAAAGUAGAGGGCdTdT	2034	2682-2700	GCCCUCUACUUUCUGGCGCdTdT	2601
AD-61911.1	hGUAGAGGGCUCCUCCAGUdTdT	2035	2691-2709	ACUGGAGGAGCCCUCUACUdTdT	2602
AD-61917.1	GCUCCAGUCACUUGGUGACdTdT	2036	2702-2720	GUCACCAAGUGACUGGAGGdTdT	2603
AD-61876.1	UCACUUGGUGACAUUCACUdTdT	2037	2709-2727	AGUGAAUGUCACCAAGUGAdTdT	2604
AD-61882.1	GAUUCACUGUGCUUCCUCUdTdT	2038	2720-2738	AGAGGAAGCACAGUGAAUGdTdT	2605
AD-61888.1	GGAAAUUGGCCUUCACAACdTdT	2039	2739-2757	GUUGUGAAGGCCAAUUUCCdTdT	2606
AD-61894.1	GUUCACAACAUCAAUUUUUdTdT	2040	2749-2767	AAAAAUUGAUGUUGUGAAGdTdT	2607
AD-61900.1	hAUUUUUCACUGGAGACUUdTdT	2041	2761-2779	AAGUCUCCAGUGAAAAAUUdTdT	2608
AD-61906.1	CUGGAGACUUGGUUUGGAAdTdT	2042	2770-2788	UUCCAAACCAAGUCUCCAGdTdT	2609

- 161 044245

AD-61912.1	GGUUUGGAAAAGAAAUCUUdTdT	2043	2780-2798	AAGAUUUCUUUUCCAAACCdTdT	2610
AD-61918.1	4AUCUUAGUAAAAACAUUAdT dT	2044	2793-2811	UAAUGUUUUUACUAAGAUUdT dT	2611
AD-61877.1	4AAAACAUUACGAGUGGUGdTdT	2045	2802-2820	CACCACUCGUAAUGUUUUUdTdT	2612
AD-61883.1	GAGUGGUGCCAGAAGGUGUdTdT	2046	2813-2831	ACACCUUCUGGCACCACUCdTdT	2613
AD-61889.1	AGAAGGUGUCAAAAGGGAAdT dT	2047	2823-2841	UUC C CUUUUGACAC CUUCUdT dT	2614
AD-61895.1	UGUCAAAAGGGAAAGCUAUdTdT	2048	2829-2847	AUAGCUUUCCCUUUUGACAdTdT	2615
AD-61901.1	GCUAUUCUGGUGUUACUUUdTdT	2049	2843-2861	AAAGUAACACCAGAAUAGCdTdT	2616
AD-61907.1	GUGUUACUUUGGAUCCUAGdTdT	2050	2852-2870	CUAGGAUCCAAAGUAACACdTdT	2617
AD-61913.1	GGAUCCUAGGGGUAUUUAUdTdT	2051	2862-2880	AUAAAUACCCCUAGGAUCCdTdT	2618
AD-61919.1	GGUAUUUAUGGUACCAUUAdTdT	2052	2872-2890	UAAUGGUACCAUAAAUACCdTdT	2619
AD-61878.1	GUACCAUUAGCAGACGAAAdTdT	2053	2882-2900	UUUCGUCUGCUAAUGGUACdTdT	2620
AD-61884.1	GAGACGAAAGGAGUUCCCAdTdT	2054	2892-2910	UGGGAACUCCUUUCGUCUGdTdT	2621
AD-61890.1	AGGAGUUCCCAUACAGGAUdTdT	2055	2900-2918	AUCCUGUAUGGGAACUCCUdTdT	2622
AD-61896.1	GAUACAGGAUACCCUUAGAdTdT	2056	2909-2927	UCUAAGGGUAUCCUGUAUGdTdT	2623
AD-61902.1	GUUAGAUUUGGUCCCCAAAdTdT	2057	2922-2940	UUUGGGGACCAAAUCUAAGdTdT	2624
AD-61908.1	DCСССAAAACAGAAAUCAAdTdT	2058	2933-2951	UUGAUUUCUGUUUUGGGGAdTdT	2625
AD-61914.1	ACAGAAAUCAAAAGGAUUUdT dT	2059	2941-2959	AAAUCCUUUUGAUUUCUGUdTdT	2626
AD-61920.1	4AAGGAUUUUGAGUGUAAAdTdT	2060	2951-2969	UUUACACUCAAAAUCCUUUdTdT	2627
AD-61879.1	AGUGUAAAAGGACUGCUUGdTdT	2061	2962-2980	CAAGCAGUCCUUUUACACUdTdT	2628
AD-61885.1	4AGGACUGCUUGUAGGUGAdTdT	2062	2969-2987	UCACCUACAAGCAGUCCUUdTdT	2629
AD-61891.1	GUAGGUGAGAUCUUGUCUGdTdT	2063	2980-2998	CAGACAAGAUCUCACCUACdTdT	2630
AD-61897.1	AJCUUGUCUGCAGUUCUAAdTdT	2064	2989-3007	UUAGAACUGCAGACAAGAUdTdT	2631
AD-61903.1	GUUCUAAGUCAGGAAGGCAdTdT	2065	3001-3019	UGCCUUCCUGACUUAGAACdTdT	2632
AD-61909.1	GAAGGCAUCAAUAUCCUAAdTdT	2066	3013-3031	UUAGGAUAUUGAUGCCUUCdTdT	2633
AD-61915.1	UCAAUAUCCUAACСCACCUdTdT	2067	3020-3038	AGGUGGGUUAGGAUAUUGAdTdT	2634
AD-61921.1	GCACCUCCCCAAAGGGAGUdTdT	2068	3033-3051	ACUCCCUUUGGGGAGGUGGdTdT	2635
AD-61927.1	GCCCAAAGGGAGUGCAGAGdTdT	2069	3039-3057	CUCUGCACUCCCUUUGGGGdTdT	2636
AD-61933.1	GUGCAGAGGCGGAGCUGAUdTdT	2070	3050-3068	AUCAGCUCCGCCUCUGCACdTdT	2637
AD-61939.1	GGAGCUGAUGAGCGUUGUCdTdT	2071	3060-3078	GACAACGCUCAUCAGCUCCdTdT	2638
AD-61945.1	CGUUGUCCCAGUAUUCUAUdTdT	2072	3072-3090	AUAGAAUACUGGGACAACGdTdT	2639
AD-61951.1	GCAGUAUUCUAUGUUUUUCdTdT	2073	3079-3097	GAAAAACAUAGAAUACUGGdT dT	2640
AD-61957.1	GUUUUUCACUACCUGGAAAdTdT	2074	3091-3109	UUUCCAGGUAGUGAAAAACdTdT	2641
AD-61963.1	GCUGGAAACAGGAAAUCAUdTdT	2075	3102-3120	AUGAUUUCCUGUUUCCAGGdTdT	2642
AD-61922.1	GGAACAUUUUUCAUUCUGAdTdT	2076	3122-3140	UCAGAAUGAAAAAUGUUCCdTdT	2643
AD-61928.1	GAUUCUGACCCAUUAAUUGdTdT	2077	3133-3151	CAAUUAAUGGGUCAGAAUGdTdT	2644
AD-61934.1	GCAUUAAUUGAAAAGCAGAdTdT	2078	3142-3160	UCUGCUUUUCAAUUAAUGGdTdT	2645
AD-61940.1	ZkAAGCAGAAACUGAAGAAAdTdT	2079	3153-3171	UUUCUUCAGUUUCUGCUUUdTdT	2646
AD-61946.1	ikACUGAAGAAAAAAUUAAAdT dT	2080	3161-3179	UUUAAUUUUUUCUUCAGUUdTdT	2647
AD-61952.1	ZkAAAAAUUAAAAGAAGGGAdT dT	2081	3169-3187	UCCCUUCUUUUAAUUUUUUdTdT	2648
AD-61958.1	AGGGAUGUUGAGCAUUAUGdTdT	2082	3183-3201	CAUAAUGCUCAACAUCCCUdTdT	2649
AD-61964.1	GAGCAUUAUGUCCUACAGAdTdT	2083	3192-3210	UCUGUAGGACAUAAUGCUCdTdT	2650
AD-61923.1	UGUCCUACAGAAAUGCUGAdTdT	2084	3200-3218	UCAGCAUUUCUGUAGGACAdTdT	2651
AD-61929.1	/UWGCUGACUACUCUUACAdTdT	2085	3211-3229	UGUAAGAGUAGUCAGCAUUdTdT	2652
AD-61935.1	DACUCUUACAGUGUGUGGAdTdT	2086	3220-3238	UCCACACACUGUAAGAGUAdTdT	2653

- 162044245

AD-61941 .1	AGUGUGUGGAAGGGUGGAAdTdT	2087	3229-3247	UUC САС C CUUC CACACACUdT dT	2654
AD-61947.1	GGGUGGAAGUGCUAGCACUdTdT	2088	3240-3258	AGUGCUAGCACUUCCACCCdTdT	2655
AD-61953.1	GCUAGCACUUGGUUAACAGdTdT	2089	3250-3268	CUGUUAACCAAGUGCUAGCdTdT	2656
AD-61959.1	GGUUAACAGCUUUUGCUUUdTdT	2090	3260-3278	AAAGCAAAAGCUGUUAACCdTdT	2657
AD-61965.1	UGCUUUAAGAGUACUUGGAdTdT	2091	3273-3291	UCCAAGUACUCUUAAAGCAdTdT	2658
AD-61924.1	GUACUUGGACAAGUAAAUAdT dT	2092	3283-3301	UAUUUACUUGUCCAAGUACdTdT	2659
AD-61930.1	CAAGUAAAUAAAUACGUAGdTdT	2093	3292-3310	CUACGUAUUUAUUUACUUGdTdT	2660
AD-61936.1	AJAAAUACGUAGAGCAGAAdTdT	2094	3299-3317	UUCUGCUCUACGUAUUUAUdTdT	2661
AD-61942.1	GAGCAGAACCAAAAUUCAAdTdT	2095	3310-3328	UUGAAUUUUGGUUCUGCUCdTdT	2662
AD-61948.1	hAUUCAAUUUGUAAUUCUUdTdT	2096	3322-3340	AAGAAUUACAAAUUGAAUUdT dT	2663
AD-61954.1	GUAAUUCUUUAUUGUGGCUdTdT	2097	3332-3350	AGCCACAAUAAAGAAUUACdTdT	2664
AD-61960.1	AJUGUGGCUAGUUGAGAAUdTdT	2098	3342-3360	AUUCUCAACUAGCCACAAUdTdT	2665
AD-61966.1	CUAGUUGAGAAUUAUCAAUdT dT	2099	3349-3367	AUUGAUAAUUCUCAACUAGdTdT	2666
AD-61925.1	UUAUCAAUUAGAUAAUGGAdT dT	2100	3360-3378	UCCAUUAUCUAAUUGAUAAdTdT	2667
AD-61931.1	hAUGGAUCUUUCAAGGAAAdTdT	2101	3373-3391	UUUCCUUGAAAGAUCCAUUdTdT	2668
AD-61937.1	CUUUCAAGGAAAAUUCACAdTdT	2102	3380-3398	UGUGAAUUUUCCUUGAAAGdTdT	2669
AD-61943.1	hAUUCACAGUAUCAACCAAdTdT	2103	3391-3409	UUGGUUGAUACUGUGAAUUdTdT	2670
AD-61949.1	GUAUCAACCAAUAAAAUUAdTdT	2104	3399-3417	UAAUUUUAUUGGUUGAUACdTdT	2671
AD-61955.1	AAAAJUACAGGGUACCUUGdTdT	2105	3411-3429	CAAGGUACCCUGUAAUUUUdTdT	2672
AD-61961.1	AGGGUACCUUGCCUGUUGAdTdT	2106	3419-3437	UCAACAGGCAAGGUACCCUdTdT	2673
AD-61967.1	GUUGAAGCCCGAGAGAACAdTdT	2107	3433-3451	UGUUCUCUCGGGCUUCAACdTdT	2674
AD-61926.1	CCGAGAGAACAGCUUAUAUdTdT	2108	3441-3459	AUAUAAGCUGUUCUCUCGGdTdT	2675
AD-61932.1	GCUUAUAUCUUACAGCCUUdTdT	2109	3452-3470	AAGGCUGUAAGAUAUAAGCdTdT	2676
AD-61938.1	CUUACAGCCUUUACUGUGAdTdT	2110	3460-3478	UCACAGUAAAGGCUGUAAGdTdT	2677
AD-61944.1	GAAUUAGAAAGGCUUUCGAdTdT	2111	3482-3500	UCGAAAGCCUUUCUAAUUCdTdT	2678
AD-61950.1	GGCUUUCGAUAUAUGCCCCdTdT	2112	3492-3510	GGGGCAUAUAUCGAAAGCCdTdT	2679
AD-61956.1	GAUAUAUGCCCCCUGGUGAdTdT	2113	3499-3517	UCACCAGGGGGCAUAUAUCdTdT	2680
AD-61962.1	GGUGAAAAUCGACACAGCUdTdT	2114	3513-3531	AGCUGUGUCGAUUUUCACCdTdT	2681
AD-61968.1	CGACACAGCUCUAAUUAAAdTdT	2115	3522-3540	UUUAAUUAGAGCUGUGUCGdTdT	2682
AD-61974.1	GCUCUAAUUAAAGCUGACAdTdT	2116	3529-3547	UGUCAGCUUUAAUUAGAGCdTdT	2683
AD-61980.1	CUGACAACUUUCUGCUUGAdTdT	2117	3542-3560	UCAAGCAGAAAGUUGUCAGdTdT	2684
AD-61986.1	CUUUCUGCUUGAAAAUACAdTdT	2118	3549-3567	UGUAUUUUCAAGCAGAAAGdTdT	2685
AD-61992.1	hAAAUACACUGCCAGCCCAdTdT	2119	3560-3578	UGGGCUGGCAGUGUAUUUUdTdT	2686
AD-61998.1	AGCCCAGAGCACCUUUACAdTdT	2120	3573-3591	UGUAAAGGUGCUCUGGGCUdTdT	2687
AD-62004.1	GCACCUUUACAUUGGCCAUdTdT	2121	3581-3599	AUGGCCAAUGUAAAGGUGCdTdT	2688
AD-62010.1	ACAUUGGCCAUUUCUGCGUdTdT	2122	3589-3607	ACGCAGAAAUGGCCAAUGUdTdT	2689
AD-61969.1	CUGCGUAUGCUCUUUCCCUdTdT	2123	3602-3620	AGGGAAAGAGCAUACGCAGdTdT	2690
AD-61975.1	CUUUCCCUGGGAGAUAAAAdTdT	2124	3613-3631	UUUUAUCUCCCAGGGAAAGdTdT	2691
AD-61981.1	GAGAUAAAACUCACCCACAdTdT	2125	3623-3641	UGUGGGUGAGUUUUAUCUCdTdT	2692
AD-61987.1	ACUCAC C CACAGUUUC GUUdT dT	2126	3631-3649	AACGAAACUGUGGGUGAGUdTdT	2693
AD-61993.1	CAGUUUCGUUCAAUUGUUUdTdT	2127	3640-3658	AAACAAUUGAACGAAACUGdTdT	2694
AD-61999.1	CAAUUGUUUCAGCUUUGAAdTdT	2128	3650-3668	UUCAAAGCUGAAACAAUUGdTdT	2695
AD-62005.1	CUUUGAAGAGAGAAGCUUUdTdT	2129	3662-3680	AAAGCUUCUCUCUUCAAAGdTdT	2696
AD-62011 . 1	GAGAGAAGCUUUGGUUAAAdTdT	2130	3669-3687	UUUAACCAAAGCUUCUCUCdTdT	2697

-163044245

AD-61970 .1	GUUAAAGGUAAUCCACCCAdTdT	2131	3682-3700	UGGGUGGAUUACCUUUAACdTdT	2698
AD-61976.1	4AUCСАСCCAUUUAUCGUUdTdT	2132	3691-3709	AACGAUAAAUGGGUGGAUUdTdT	2699
AD-61982.1	GAUUUAUCGUUUUUGGAAAdTdT	2133	3699-3717	UUUCCAAAAACGAUAAAUGdTdT	2700
AD-61988.1	UUUGGAAAGACAAUCUUCAdTdT	2134	3710-3728	UGAAGAUUGUCUUUCCAAAdTdT	2701
AD-61994.1	4AUCUUCAGCAUAAAGACAdTdT	2135	3721-3739	UGUCUUUAUGCUGAAGAUUdTdT	2702
AD-62006.1	GUCUGUACCUAACACUGGUdTdT	2136	3741-3759	ACCAGUGUUAGGUACAGAGdTdT	2703
AD-62012.1	^CACUGGUACGGCACGUAUdTdT	2137	3752-3770	AUACGUGCCGUACCAGUGUdTdT	2704
AD-61971.1	GGCACGUAUGGUAGAAACAdTdT	2138	3762-3780	UGUUUCUACCAUACGUGCCdTdT	2705
AD-61977.1	GGUAGAAACAACUGCCUAUdTdT	2139	3771-3789	AUAGGCAGUUGUUUCUACCdTdT	2706
AD-61983.1	GAACUGCCUAUGCUUUACUdTdT	2140	3779-3797	AGUAAAGCAUAGGCAGUUGdTdT	2707
AD-61989.1	GUUUACUCACCAGUCUGAAdTdT	2141	3791-3809	UUCAGACUGGUGAGUAAAGdTdT	2708
AD-61995.1	GUCUGAACUUGAAAGAUAUdTdT	2142	3803-3821	AUAUCUUUCAAGUUCAGACdTdT	2709
AD-62001.1	AGUUGAAAGAUAUAAAUUAdT dT	2143	3809-3827	UAAUUUAUAUCUUUCAAGUdT dT	2710
AD-62007.1	UAUAAAUUAUGUUAACCCAdTdT	2144	3819-3837	UGGGUUAACAUAAUUUAUAdT dT	2711
AD-62013.1	GUUAACCCAGUCAUCAAAUdTdT	2145	3829-3847	AUUUGAUGACUGGGUUAACdTdT	2712
AD-61972.1	UCAUCAAAUGGCUAUCAGAdTdT	2146	3839-3857	UCUGAUAGCCAUUUGAUGAdTdT	2713
AD-61978.1	UAUCAGAAGAGCAGAGGUAdT dT	2147	3851-3869	UACCUCUGCUCUUCUGAUAdTdT	2714
AD-61984.1	AGAGGUAUGGAGGUGGCUUdTdT	2148	3863-3881	AAGCCACCUCCAUACCUCUdTdT	2715
AD-61990.1	GAGGUGGCUUUUAUUCAACdTdT	2149	3872-3890	GUUGAAUAAAAGCCACCUCdTdT	2716
AD-61996.1	UAUUCAACCCAGGACACAAdTdT	2150	3883-3901	UUGUGUCCUGGGUUGAAUAdTdT	2717
AD-62002.1	AOGACACAAUCAAUGCCAUdTdT	2151	3893-3911	AUGGCAUUGAUUGUGUCCUdTdT	2718
AD-62008.1	CAAUCAAUGCCAUUGAGGGdTdT	2152	3899-3917	CCCUCAAUGGCAUUGAUUGdTdT	2719
AD-62014.1	GAUUGAGGGCCUGACGGAAdTdT	2153	3909-3927	UUCCGUCAGGCCCUCAAUGdTdT	2720
AD-61973.1	ACGGAAUAUUCACUCCUGGdTdT	2154	3922-3940	CCAGGAGUGAAUAUUCCGUdTdT	2721
AD-61979.1	UUCACUCCUGGUUAAACAAdTdT	2155	3930-3948	UUGUUUAACCAGGAGUGAAdTdT	2722
AD-61985.1	GGUUAAACAACUCCGCUUGdTdT	2156	3939-3957	CAAGCGGAGUUGUUUAACCdTdT	2723
AD-61991.1	GCGCUUGAGUAUGGACAUCdTdT	2157	3951-3969	GAUGUCCAUACUCAAGCGGdTdT	2724
AD-61997.1	GGACAUCGAUGUUUCUUACdTdT	2158	3963-3981	GUAAGAAACAUCGAUGUCCdTdT	2725
AD-62003.1	CGAUGUUUCUUACAAGCAUdTdT	2159	3969-3987	AUGCUUGUAAGAAACAUCGdTdT	2726
AD-62009.1	CAAGCAUAAAGGUGCCUUAdTdT	2160	3981-3999	UAAGGCACCUUUAUGCUUGdTdT	2727
AD-62056.1	GUGCCUUACAUAAUUAUAAdTdT	2161	3992-4010	UUAUAAUUAUGUAAGGCACdTdT	2728
AD-62015.1	AGAUAAUUAUAAAAUGACAdT dT	2162	3999-4017	UGUCAUUUUAUAAUUAUGUdT dT	2729
AD-62021.1	4AAAUGACAGACAAGAAUUdTdT	2163	4009-4027	AAUUCUUGUCUGUCAUUUUdTdT	2730
AD-62027.1	GAAGAAUUUCCUUGGGAGGdTdT	2164	4020-4038	CCUCCCAAGGAAAUUCUUGdTdT	2731
AD-62033.1	GCUUGGGAGGCCAGUAGAGdTdT	2165	4029-4047	CUCUACUGGCCUCCCAAGGdTdT	2732
AD-62039.1	AGUAGAGGUGCUUCUCAAUdTdT	2166	4041-4059	AUUGAGAAGCACCUCUACUdTdT	2733
AD-62045.1	GUUCUCAAUGAUGACCUCAdTdT	2167	4051-4069	UGAGGUCAUCAUUGAGAAGdTdT	2734
AD-62051.1	UGACCUCAUUGUCAGUACAdTdT	2168	4062-4080	UGUACUGACAAUGAGGUCAdTdT	2735
AD-62057.1	GUCAGUACAGGAUUUGGCAdTdT	2169	4072-4090	UGCCAAAUCCUGUACUGACdTdT	2736
AD-62016.1	AGGAUUUGGCAGUGGCUUGdTdT	2170	4080-4098	CAAGCCACUGCCAAAUCCUdTdT	2737
AD-62022.1	UGGCUUGGCUACAGUACAUdTdT	2171	4092-4110	AUGUACUGUAGCCAAGCCAdTdT	2738
AD-62028.1	GCUACAGUACAUGUAACAAdTdT	2172	4099-4117	UUGUUACAUGUACUGUAGCdTdT	2739
AD-62034.1	?\ACAACUGUAGUUCACAAAdTdT	2173	4113-4131	UUUGUGAACUACAGUUGUUdTdT	2740
AD-62040.1	GUAGUUCACAAAACCAGUAdTdT	2174	4120-4138	UACUGGUUUUGUGAACUACdTdT	2741

- 164044245

AD-62046.1	4AACCAGUACCUCUGAGGAdTdT	2175	4130-4148	UCCUCAGAGGUACUGGUUUdTdT	2742
AD-62052.1	UGAGGAAGUUUGCAGCUUUdTdT	2176	4143-4161	AAAGCUGCAAACUUCCUCAdTdT	2743
AD-62058.1	UGCAGCUUUUAUUUGAAAAdTdT	2177	4153-4171	UUUUCAAAUAAAAGCUGCAdTdT	2744
AD-62017.1	AJUUGAAAAUCGAUACUCAdTdT	2178	4163-4181	UGAGUAUCGAUUUUCAAAUdTdT	2745
AD-62023.1	CGAUACUCAGGAUAUUGAAdTdT	2179	4173-4191	UUCAAUAUCCUGAGUAUCGdTdT	2746
AD-62029.1	GGAUAUUGAAGCAUCCCACdTdT	2180	4182-4200	GUGGGAUGCUUCAAUAUCCdTdT	2747
AD-62035.1	GAAGCAUCCCACUACAGAGdTdT	2181	4189-4207	CUCUGUAGUGGGAUGCUUCdTdT	2748
AD-62041.1	AGUACAGAGGCUACGGAAAdTdT	2182	4199-4217	UUUCCGUAGCCUCUGUAGUdTdT	2749
AD-62047.1	CGGAAACUCUGAUUACAAAdTdT	2183	4212-4230	UUUGUAAUCAGAGUUUCCGdTdT	2750
AD-62053.1	UGAUUACAAACGCAUAGUAdTdT	2184	4221-4239	UACUAUGCGUUUGUAAUCAdTdT	2751
AD-62059.1	GCAUAGUAGCAUGUGCCAGdTdT	2185	4232-4250	CUGGCACAUGCUACUAUGCdTdT	2752
AD-62018.1	GCAUGUGCCAGCUACAAGCdTdT	2186	4240-4258	GCUUGUAGCUGGCACAUGCdTdT	2753
AD-62024.1	CUACAAGCCCAGCAGGGAAdTdT	2187	4251-4269	UUCCCUGCUGGGCUUGUAGdTdT	2754
AD-62030.1	CAGCAGGGAAGAAUCAUCAdTdT	2188	4260-4278	UGAUGAUUCUUCCCUGCUGdTdT	2755
AD-62036.1	GAAUCAUCAUCUGGAUCCUdTdT	2189	4270-4288	AGGAUCCAGAUGAUGAUUCdTdT	2756
AD-62042.1	GAUCCUCUCAUGCGGUGAUdTdT	2190	4283-4301	AUCACCGCAUGAGAGGAUCdTdT	2757
AD-62048.1	CUCAUGCGGUGAUGGACAUdTdT	2191	4289-4307	AUGUCCAUCACCGCAUGAGdTdT	2758
AD-62054.1	GAUGGACAUCUCCUUGCCUdTdT	2192	4299-4317	AGGCAAGGAGAUGUCCAUCdTdT	2759
AD-62060.1	CUUGCCUACUGGAAUCAGUdTdT	2193	4311-4329	ACUGAUUCCAGUAGGCAAGdTdT	2760
AD-62019.1	GAAUCAGUGCAAAUGAAGAdTdT	2194	4322-4340	UCUUCAUUUGCACUGAUUCdTdT	2761
AD-62025.1	?\AAUGAAGAAGACUUAAAAdT dT	2195	4332-4350	UUUUAAGUCUUCUUCAUUUdTdT	2762
AD-62031.1	GAAGACUUAAAAGCCCUUGdTdT	2196	4339-4357	CAAGGGCUUUUAAGUCUUCdTdT	2763
AD-62037.1	CCUUGUGGAAGGGGUGGAUdTdT	2197	4353-4371	AUCCACCCCUUCCACAAGGdTdT	2764
AD-62043.1	GAAGGGGUGGAUCAACUAUdTdT	2198	4360-4378	AUAGUUGAUCCACCCCUUCdTdT	2765
AD-62049.1	AJCAACUAUUCACUGAUUAdT dT	2199	4370-4388	UAAUCAGUGAAUAGUUGAUdT dT	2766
AD-62055.1	CACUGAUUACCAAAUCAAAdTdT	2200	4380-4398	UUUGAUUUGGUAAUCAGUGdTdT	2767
AD-62061.1	AJCAAAGAUGGACAUGUUAdT dT	2201	4393-4411	UAACAUGUCCAUCUUUGAUdTdT	2768
AD-62020.1	GGACAUGUUAUUCUGCAACdTdT	2202	4402-4420	GUUGCAGAAUAACAUGUCCdTdT	2769
AD-62026.1	UCUGCAACUGAAUUCGAUUdTdT	2203	4413-4431	AAUCGAAUUCAGUUGCAGAdTdT	2770
AD-62032.1	GAAUUCGAUUCCCUCCAGUdTdT	2204	4422-4440	ACUGGAGGGAAUCGAAUUCdTdT	2771
AD-62038.1	CCCUCCAGUGAUUUCCUUUdTdT	2205	4432-4450	AAAGGAAAUCACUGGAGGGdTdT	2772
AD-62044.1	GAUUUCCUUUGUGUACGAUdTdT	2206	4441-4459	AUCGUACACAAAGGAAAUCdTdT	2773
AD-62050.1	GUACGAUUCCGGAUAUUUGdTdT	2207	4453-4471	CAAAUAUCCGGAAUCGUACdTdT	2774
AD-62320.1	CGGAUAUUUGAACUCUUUGdTdT	2208	4462-4480	CAAAGAGUUCAAAUAUCCGdTdT	2775
AD-62326.1	ACUCUUUGAAGUUGGGUUUdTdT	2209	4473-4491	AAACCCAACUUCAAAGAGUdTdT	2776
AD-62332.1	AGUUGGGUUUCUCAGUCCUdTdT	2210	4482-4500	AGGACUGAGAAACCCAACUdTdT	2777
AD-62338.1	UUCUCAGUCCUGCCACUUUdTdT	2211	4490-4508	AAAGUGGCAGGACUGAGAAdTdT	2778
AD-62344.1	CACUUUCACAGUGUACGAAdTdT	2212	4503-4521	UUCGUACACUGUGAAAGUGdTdT	2779
AD-62350.1	CACAGUGUACGAAUACCACdTdT	2213	4509-4527	GUGGUAUUCGUACACUGUGdTdT	2780
AD-62356.1	ACCACAGACCAGAUAAACAdTdT	2214	4523-4541	UGUUUAUCUGGUCUGUGGUdTdT	2781
AD-62362.1	CCAGAUAAACAGUGUACCAdTdT	2215	4531-4549	UGGUACACUGUUUAUCUGGdTdT	2782
AD-62321.1	CAGUGUACCAUGUUUUAUAdTdT	2216	4540-4558	UAUAAAACAUGGUACACUGdT dT	2783
AD-62327.1	GUUUUAUAGCACUUCCAAUdTdT	2217	4551-4569	AUUGGAAGUGCUAUAAAACdTdT	2784
AD-62333.1	CUUCCAAUAUCAAAAUUCAdTdT	2218	4562-4580	UGAAUUUUGAUAUUGGAAGdTdT	2785

- 165044245

AD-62339.1	AJCAAAAUUCAGAAAGUCUdTdT	2219	4570-4588	AGACUUUCUGAAUUUUGAUdTdT	2786
AD-62345.1	GAAAGUCUGUGAAGGAGCCdTdT	2220	4581-4599	GGCUCCUUCACAGACUUUCdTdT	2787
AD-62351.1	GAAGGAGCCGCGUGCAAGUdTdT	2221	4591-4609	ACUUGCACGCGGCUCCUUCdTdT	2788
AD-62357.1	GGUGCAAGUGUGUAGAAGCdTdT	2222	4601-4619	GCUUCUACACACUUGCACGdTdT	2789
AD-62363.1	GUAGAAGCUGAUUGUGGGCdTdT	2223	4612-4630	GCCCACAAUCAGCUUCUACdTdT	2790
AD-62322.1	GUGAUUGUGGGCAAAUGCAdTdT	2224	4619-4637	UGCAUUUGCCCACAAUCAGdTdT	2791
AD-62328.1	GCAAAUGCAGGAAGAAUUGdTdT	2225	4629-4647	CAAUUCUUCCUGCAUUUGCdTdT	2792
AD-62334.1	GAAGAAUUGGAUCUGACAAdTdT	2226	4639-4657	UUGUCAGAUCCAAUUCUUCdTdT	2793
AD-62340.1	GUGACAAUCUCUGCAGAGAdTdT	2227	4651-4669	UCUCUGCAGAGAUUGUCAGdTdT	2794
AD-62346.1	GCAGAGACAAGAAAACAAAdT dT	2228	4663-4681	UUUGUUUUCUUGUCUCUGCdTdT	2795
AD-62352.1	GAAGAAAACAAACAGCAUGdTdT	2229	4670-4688	CAUGCUGUUUGUUUUCUUGdTdT	2796
AD-62358.1	ACAGCAUGUAAACCAGAGAdTdT	2230	4681-4699	UCUCUGGUUUACAUGCUGUdTdT	2797
AD-62364.1	GCAGAGAUUGCAUAUGCUUdTdT	2231	4693-4711	AAGCAUAUGCAAUCUCUGGdTdT	2798
AD-62323.1	GCAUAUGCUUAUAAAGUUAdT dT	2232	4702-4720	UAACUUUAUAAGCAUAUGCdTdT	2799
AD-62329.1	UUAUAAAGUUAGCAUCACAdT dT	2233	4710-4728	UGUGAUGCUAACUUUAUAAdTdT	2800
AD-62335.1	GAUCACAUCCAUCACUGUAdTdT	2234	4722-4740	UACAGUGAUGGAUGUGAUGdTdT	2801
AD-62341.1	UCACUGUAGAAAAUGUUUUdTdT	2235	4733-4751	AAAACAUUUUCUACAGUGAdT dT	2802
AD-62347.1	AGAAAAUGUUUUUGUCAAGdTdT	2236	4740-4758	CUUGACAAAAACAUUUUCUdTdT	2803
AD-62353.1	DUUGUCAAGUACAAGGCAAdTdT	2237	4750-4768	UUGCCUUGUACUUGACAAAdTdT	2804
AD-62359.1	AGGCAACCCUUCUGGAUAUdTdT	2238	4763-4781	AUAUCCAGAAGGGUUGCCUdTdT	2805
AD-62365.1	CCUUCUGGAUAUCUACAAAdTdT	2239	4770-4788	UUUGUAGAUAUCCAGAAGGdTdT	2806
AD-62324.1	DAUCUACAAAACUGGGGAAdTdT	2240	4779-4797	UUC С C CAGUUUUGUAGAUAdT dT	2807
AD-62330.1	GUGGGGAAGCUGUUGCUGAdTdT	2241	4790-4808	UCAGCAACAGCUUCCCCAGdTdT	2808
AD-62336.1	GUGUUGCUGAGAAAGACUCdTdT	2242	4799-4817	GAGUCUUUCUCAGCAACAGdTdT	2809
AD-62342.1	GACUCUGAGAUUACCUUCAdTdT	2243	4813-4831	UGAAGGUAAUCUCAGAGUCdTdT	2810
AD-62348.1	GAGAUUACCUUCAUUAAAAdTdT	2244	4819-4837	UUUUAAUGAAGGUAAUCUCdTdT	2811
AD-62354.1	AJUAAAAAGGUAACCUGUAdTdT	2245	4831-4849	UACAGGUUACCUUUUUAAUdTdT	2812
AD-62360.1	UAACCUGUACUAACGCUGAdTdT	2246	4841-4859	UCAGCGUUAGUACAGGUUAdTdT	2813
AD-62366.1	CUAACGCUGAGCUGGUAAAdTdT	2247	4850-4868	UUUACCAGCUCAGCGUUAGdTdT	2814
AD-62325.1	GGUAAAAGGAAGACAGUACdTdT	2248	4863-4881	GUACUGUCUUCCUUUUACCdTdT	2815
AD-62331.1	GAAGACAGUACUUAAUUAUdT dT	2249	4871-4889	AUAAUUAAGUACUGUCUUCdTdT	2816
AD-62337.1	GUUAAUUAUGGGUAAAGAAdTdT	2250	4881-4899	UUCUUUACCCAUAAUUAAGdTdT	2817
AD-62343.1	UAAAGAAGCCCUCCAGAUAdTdT	2251	4893-4911	UAUCUGGAGGGCUUCUUUAdTdT	2818
AD-62349.1	GCUCCAGAUAAAAUACAAUdTdT	2252	4902-4920	AUUGUAUUUUAUCUGGAGGdTdT	2819
AD-62355.1	4AAUACAAUUUCAGUUUCAdTdT	2253	4912-4930	UGAAACUGAAAUUGUAUUUdTdT	2820
AD-62361.1	GAGUUUCAGGUACAUCUACdTdT	2254	4923-4941	GUAGAUGUACCUGAAACUGdTdT	2821
AD-62367.1	GGUACAUCUACCCUUUAGAdTdT	2255	4931-4949	UCUAAAGGGUAGAUGUACCdTdT	2822
AD-62373.1	GCUUUAGAUUCCUUGACCUdTdT	2256	4942-4960	AGGUCAAGGAAUCUAAAGGdTdT	2823
AD-62379.1	GCUUGACCUGGAUUGAAUAdTdT	2257	4952-4970	UAUUCAAUCCAGGUCAAGGdTdT	2824
AD-62385.1	GGAUUGAAUACUGGCCUAGdTdT	2258	4961-4979	CUAGGCCAGUAUUCAAUCCdTdT	2825
AD-62391.1	CUGGCCUAGAGACACAACAdTdT	2259	4971-4989	UGUUGUGUCUCUAGGCCAGdTdT	2826
AD-62397.1	GAGACACAACAUGUUCAUCdTdT	2260	4979-4997	GAUGAACAUGUUGUGUCUCdTdT	2827
AD-62403.1	GUUCAUCGUGUCAAGCAUUdTdT	2261	4991-5009	AAUGCUUGACACGAUGAACdTdT	2828
AD-62409.1	GUCAAGCAUUUUUAGCUAAdTdT	2262	5000-5018	UUAGCUAAAAAUGCUUGACdTdT	2829

- 166 044245

AD-62368.1	A.GCUAAUUUAGAUGAAUUUdT dT	2263	5013-5031	AAAUUCAUCUAAAUUAGCUdTdT	2830
AD-62374.1	AGAUGAAUUUGCCGAAGAUdTdT	2264	5022-5040	AUCUUCGGCAAAUUCAUCUdTdT	2831
AD-62380.1	GCGAAGAUAUCUUUUUAAAdTdT	2265	5033-5051	UUUAAAAAGAUAUCUUCGGdTdT	2832
AD-62386.1	GUUUUUAAAUGGAUGCUAAdTdT	2266	5043-5061	UUAGCAUCCAUUUAAAAAGdTdT	2833
AD-62392.1	GGAUGCUAAAAUUCCUGAAdTdT	2267	5053-5071	UUCAGGAAUUUUAGCAUCCdTdT	2834
AD-62398.1	UAAAAUUCCUGAAGUUCAGdTdT	2268	5059-5077	CUGAACUUCAGGAAUUUUAdTdT	2835
AD-62404.1	AGUUCAGCUGCAUACAGUUdTdT	2269	5071-5089	AACUGUAUGCAGCUGAACUdTdT	2836
AD-62410.1	GCAUACAGUUUGCACUUAUdTdT	2270	5080-5098	AUAAGUGCAAACUGUAUGCdTdT	2837
AD-62369.1	ACUUAUGGACUCCUGUUGUdTdT	2271	5093-5111	ACAACAGGAGUCCAUAAGUdTdT	2838
AD-62375.1	GGACUCCUGUUGUUGAAGUdTdT	2272	5099-5117	ACUUCAACAACAGGAGUCCdTdT	2839
AD-62381.1	UGUUGAAGUUCGUUUUUUUdTdT	2273	5109-5127	AAAAAAACGAACUUCAACAdTdT	2840
AD-62387.1	UUUUUUGUUUUCUUCUUUUdTdT	2274	5122-5140	AAAAGAAGAAAACAAAAAAdT dT	2841
AD-62393.1	UCUUCUUUUUUUAAACAUUdTdT	2275	5132-5150	AAUGUUUAAAAAAAGAAGAdT dT	2842
AD-62399.1	UUUUUAAACAUUCAUAGCUdTdT	2276	5139-5157	AGCUAUGAAUGUUUAAAAAdT dT	2843
AD-62405.1	AJAGCUGGUCUUAUUUGUAdTdT	2277	5152-5170	UACAAAUAAGACCAGCUAUdTdT	2844
AD-62411.1	GUCUUAUUUGUAAAGCUCAdTdT	2278	5159-5177	UGAGCUUUACAAAUAAGACdTdT	2845
AD-62370.1	4AAGCUCACUUUACUUAGAdTdT	2279	5170-5188	UCUAAGUAAAGUGAGCUUUdTdT	2846
AD-62376.1	ACUUAGAAUUAGUGGCACUdTdT	2280	5182-5200	AGUGCCACUAAUUCUAAGUdTdT	2847
AD-62382.1	AGUGGCACUUGCUUUUAUUdTdT	2281	5192-5210	AAUAAAAGCAAGUGCCACUdTdT	2848
AD-62388.1	GCUUUUAUUAGAGAAUGAUdT dT	2282	5202-5220	AUCAUUCUCUAAUAAAAGCdTdT	2849
AD-62394.1	GAGAAUGAUUUCAAAUGCUdTdT	2283	5212-5230	AGCAUUUGAAAUCAUUCUCdTdT	2850
AD-62400.1	DUUCAAAUGCUGUAACUUUdTdT	2284	5220-5238	AAAGUUACAGCAUUUGAAAdTdT	2851
AD-62406.1	GUAACUUUCUGAAAUAACAdTdT	2285	5231-5249	UGUUAUUUCAGAAAGUUACdTdT	2852
AD-62412.1	GAAAUAACAUGGCCUUGGAdTdT	2286	5241-5259	UCCAAGGCCAUGUUAUUUCdTdT	2853
AD-62371.1	GCUUGGAGGGCAUGAAGACdTdT	2287	5253-5271	GUCUUCAUGCCCUCCAAGGdTdT	2854
AD-62377.1	AGGGCAUGAAGACAGAUACdTdT	2288	5259-5277	GUAUCUGUCUUCAUGCCCUdTdT	2855
AD-62383.1	GAUACUCCUCCAAGGUUAUdTdT	2289	5273-5291	AUAACCUUGGAGGAGUAUCdTdT	2856
AD-62389.1	GCUCCAAGGUUAUUGGACAdTdT	2290	5279-5297	UGUCCAAUAACCUUGGAGGdTdT	2857
AD-62395.1	GGACACCGGAAACAAUAAAdTdT	2291	5293-5311	UUUAUUGUUUCCGGUGUCCdTdT	2858
AD-62401.1	GAAACAAUAAAUUGGAACAdT dT	2292	5301-5319	UGUUCCAAUUUAUUGUUUCdTdT	2859
AD-62407.1	AJUGGAACACCUCCUCAAAdTdT	2293	5311-5329	UUUGAGGAGGUGUUCCAAUdTdT	2860
AD-62413.1	UCCUCAAACCUACCACUCAdTdT	2294	5322-5340	UGAGUGGUAGGUUUGAGGAdTdT	2861
AD-62372.1	GUACCACUCAGGAAUGUUUdTdT	2295	5331-5349	AAACAUUCCUGAGUGGUAGdTdT	2862
AD-62378.1	4AUGUUUGCUGGGGCCGAAdTdT	2296	5343-5361	UUCGGCCCCAGCAAACAUUdTdT	2863
AD-62384.1	UGCUGGGGCCGAAAGAACAdTdT	2297	5349-5367	UGUUCUUUCGGCCCCAGCAdTdT	2864
AD-62390.1	4AAGAACAGUCCAUUGAAAdTdT	2298	5360-5378	UUUCAAUGGACUGUUCUUUdTdT	2865
AD-62396.1	GAUUGAAAGGGAGUAUUACdTdT	2299	5371-5389	GUAAUACUCCCUUUCAAUGdTdT	2866
AD-62402.1	GGAGUAUUACAAAAACAUGdT dT	2300	5380-5398	CAUGUUUUUGUAAUACUCCdTdT	2867
AD-62408.1	4AAACAUGGCCUUUGCUUGdTdT	2301	5391-5409	CAAGCAAAGGCCAUGUUUUdTdT	2868
AD-62414.1	GCCUUUGCUUGAAAGAAAAdTdT	2302	5399-5417	UUUUCUUUCAAGCAAAGGCdTdT	2869
AD-62415.1	GAAAGAAAAUACCAAGGAAdTdT	2303	5409-5427	UUCCUUGGUAUUUUCUUUCdTdT	2870
AD-62416.1	GCAAGGAACAGGAAACUGAdTdT	2304	5420-5438	UCAGUUUCCUGUUCCUUGGdTdT	2871
AD-62417.1	4ACUGAUCAUUAAAGCCUGdTdT	2305	5433-5451	CAGGCUUUAAUGAUCAGUUdTdT	2872

- 167044245

Таблица 22

Тест разовой дозы С5 (10 мМ) в клетках НерЗВ с dT-модифицированными иРНК

- 168 044245

- 169 044245

- 170 044245

- 171 044245

- 172 044245

- 173 044245

- 174 044245

- 175 044245

- 176 044245

- 177 044245

- 178 044245

- 179 044245

- 180 044245

- 181 044245

- 182 044245

- 183 044245

- 184 044245

Пример 7. Скрининг дополнительных siRNA in vivo.

На основании последовательности AD-58643, синтезировали дополнительные четыре смысловых и три антисмысловых последовательности и применяли их для получения двенадцати, 21/25mer соединений (табл. 23). В общем, антисмысловые цепи этих соединений были расширены посредством dTdT и дуплексы содержали меньше фтор-модифицированных нуклеотидов.

Мышам линии C57BL/6 (количество=3 на группу) подкожно вводили 1 мг/кг таких GalNAcконъюгированных дуплексов, собирали сыворотку в день 0, предварительно отбирая, и на день 5 определяли количественно уровень белков С5 с помощью ELISA. Уровни белка С5 были нормализованы до уровня в день 0 в предварительно отобранной сыворотке.

Табл. 14 показывает результаты теста разовой дозы in vivo с указанными иРНК. Данные выражены в виде процентного отношения оставшегося белка С5 по отношению к уровням в предварительно отобранной сыворотке. Эти иРНК с улучшенной эффективностью по сравнению с исходным соединением включали AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 и AD-62651. Эти иРНК также демонстрировали подобную эффективность (IC₅₀ приблизительно 23-59 пМ).

- 185 044245

Эффективность этих иРНК испытывали на мышах линии C57BL/6 с применением протокола введения разовой дозы. Мышам вводили подкожно AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 и

AD-62651 в дозе 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг или 2,5 мг/кг. Сыворотку собирали в дни 0 и 5 и анализировали на уровень белка С5 с помощью ELISA. Уровни С5 были нормализованы до уровня в день 0 в предварительно отобранной сыворотке.

На фиг. 15 показано наличие зависимости доза-ответ со всеми тестируемыми иРНК и что разовое введение всех этих иРНК приводит к сайленсингу белка С5, аналогичному или улучшенному по сравнению с AD-58641.

Продолжительность сайленсинга AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 и AD62651 in vivo определяли путем введения разовой дозы 1,0 мг/кг мышам линии C57BL/6 и определением количество белка С5, обнаруживаемого в дни 6, 13, 20, 27 и 34 с помощью ELISA. Уровни С5 были нормализованы до уровня в день 0 в предварительно отобранной сыворотке.

Как показано на фиг. 16, каждая из испытуемых иРНК демонстрирует ту же кинетику восстановления, что и AD-62643, с тенденцией к лучшему сайленсингу, но в пределах погрешности анализа.

AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 и AD-62651 дополнительно испытывали на эффективность и оценивали кумулятивный эффект иРНК у крыс с применением протокола повторных введений. Крысам линии Sprague Dawley дикого типа производили подкожную инъекцию с каждой из иРНК в дозе 5,0 мг/кг/дозу на день 0, 4 и 7. Сыворотку собирали на день 0, 4, 7, 11, 14, 18, 25, 28 и 32. Гемолитическую активность сыворотки количественно оценивали, как описано выше.

Результаты, представленные на фиг. 17, показывают, что все из испытанных иРНК обеспечивают эффективное и продолжительное снижение гемолитической активности и аналогичное восстановление гемолиза, наблюдаемые при обработке AD-58641.

Таблица 23 Последовательности модифицированной смысловой и антисмысловой цепи GalNAc-коньюгированных dsRNA C5

ID дуплекса	ID смысловой	Смысловая (от 5' к 3')	SEQ ID NO:	AS ID	Антисмысловая (от 5' к 3')	SEQ ID NO:
AD-58643	A-119326.1	Af sasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuUfa UfaAfuAfL96	2873	A- 119327.1	usAf suU f aUf aAf aAf auaU f cUfuG f cUf ususu	2886
AD-62642	A-125167.7	asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfu Af auaL96	2874	A- 125139.1	usAfsuuaUfaAfaAfauaUfcUfuGfcuus usudTdT	2887
AD-62510	A-125167.7	asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfu Af auaL96	2875	A- 125173.2	usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcu ususudTdT	2888
AD-62643	A-125167.7	asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfu Af auaL96	2876	A- 125647.1	usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuu susudTdT	2889
AD-62644	A-125157.17	asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfu aAfuaL96	2877	A- 125139.1	usAfsuuaUfaAfaAfauaUfcUfuGfcuus usudTdT	2890
AD-62645	A-125157.17	asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfu aAfuaL96	2878	A- 125173.2	usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcu ususudTdT	2891
AD-62646	A-125157.17	asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfu aAfuaL96	2879	A- 125647.1	usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuu susudTdT	2892
AD-62647	A-125134.1	asasgcaagauaUfuuuua(Tgn)aau aL96	2880	A- 125139.1	usAfsuuaUfaAfaAfauaUfcUfuGfcuus usudTdT	2893
AD-62648	A-125134.1	asasgcaagauaUfuuuua(Tgn)aau aL96	2881	A- 125173.2	usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcu ususudTdT	2894
AD-62649	A-125134.1	asasgcaagauaUfuuuua(Tgn)aau aL96	2882	A- 125647.1	usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuu susudTdT	2895
AD-62428	A-125127.2	asasgcaagaUfaUfuuuuauaaual® 6	2883	A- 125139.1	usAfsuuaUfaAfaAfauaUfcUfuGfcuus usudTdT	2896
AD-62650	A-125127.2	asasgcaagaUfaUfuuuuauaaual9 6	2884	A- 125173.2	usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcu ususudTdT	2897
AD-62651	A-125127.2	asasgcaagaUfaUfuuuuauaaual9 6	2885	A- 125647.1	usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuu susudTdT	2898

Claims

1. Средство, представляющее собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где указанная dsRNA содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь и антисмысловая цепь, каждая независимо, имеют длину 19-25 нуклеотидов, смысловая цепь содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности 5'-AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA-3' (SEQ ID NO:62) и указанная антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности 5'-UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU-3') (SEQ ID NO:113), все нуклеотиды указанной смысловой цепи и все нуклеотиды указанной антисмысловой цепи включают нуклеотидную модификацию и по меньшей мере одна цепь конъюгируется с лигандом.

2. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.1, где по меньшей мере одна из указанных нуклеотидных модификаций выбрана из группы, состоящей из 3'-концевой дезокси-тимин (dT) нуклеотидной модификации, 2'-O-метил-нуклеотидной модификации, 2'-фтор-нуклеотидной модификации, 2'-дезоксинуклеотидной модификации, замкнутой нуклеотидной модификации, абазической нуклеотидной модификации, 2'-амино-нуклеотидной модификации, 2'-алкил-нуклеотидной модификации, морфолинонуклеотидной модификации, нуклеотидной модификации фосфорамидата, содержащего основание не природного происхождения, нуклеотида, содержащего модификацию 5'-фосфоротиоатной группы, и модификации концевого нуклеотида, связанного с холестерильным производным или группой бисдециламида додекановой кислоты.

3. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.2, где указанные модифицированные нуклеотиды содержат модификацию короткой последовательности 3'-концевых дезокси-тиминовых нуклеотидов (dT).

4. Средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-3, где по меньшей мере одна цепь содержит 3'-выступ по меньшей мере 1 нуклеотида.

5. Средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-3, где по меньшей мере одна цепь содержит 3'-выступ по меньшей мере 2 нуклеотидов.

6. Средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-5, где лиганд конъюгируется с 3'концом смысловой цепи средства, представляющего собой dsRNA.

7. Средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-6, где лиганд представляет собой производное N-ацетилгалактозамина (GalNAc).

8. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.7, где лиганд представляет собой

9. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.7, где средство, представляющее собой dsRNA, конъюгируется с лигандом, как показано на следующей схеме:

и где X представляет собой О или S.

10. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.9, где X представляет собой О.

- 187 044245

11. Средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-10, где указанное средство, представляющее собой dsRNA, дополнительно содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь.

12. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.11, где фосфоротиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится на 3'-конце одной цепи.

13. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.12, где указанная цепь является антисмысловой цепью.

14. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.12, где указанная цепь является смысловой цепью.

15. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.11, где фосфоротиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится на 5'-конце одной цепи.

16. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.15, где указанная цепь является антисмысловой цепью.

17. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.15, где указанная цепь является смысловой цепью.

18. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.11, где фосфоротиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится как на 5'-, так и на 3'-конце одной цепи.

19. Средство, представляющее собой dsRNA, по п.18, где указанная цепь является антисмысловой цепью.

20. Средство, представляющее собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где указанное средство dsRNA содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, образующие двухцепочечный участок, где смысловая цепь и антисмысловая цепь, каждая независимо, имеет длину 19-25 нуклеотидов, смысловая цепь содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности 5'-AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA-3' (SEQ ID NO:62), и указанная антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности 5'UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU-3' (SEQ ID NO:113), все нуклеотиды указанной смысловой цепи содержат модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2'-O-метил-модификации и 2'-фтор-модификации, указанная смысловая цепь содержит две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце, все нуклеотиды указанной антисмысловой цепи содержат модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2'-O-метил-модификации, 2'-фтор-модификации и модификации дезокси-тимин нуклеотида, указанная антисмысловая цепь содержит две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце и указанная смысловая цепь конъюгируется с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством одновалентного, двухвалентного или трехвалентного линкера на 3'-конце.

21. Средство dsRNA по п.20, где одно или несколько производных GalNAc присоединены посредст- вом трехвалентного разветвленного линкера.

22. Средство dsRNA по п.20 или 21, где лиганд представляет собой

- 188 044245

23. Средство dsRNA по п.22, где средство RNAi конъюгируется с лигандом, как показано на следующей схеме:

24. Средство dsRNA по любому из пп.1-23, где двухцепочечный участок составляет в длину 19-25 пар нуклеотидов.

25. Средство dsRNA по п.24, где двухцепочечный участок составляет в длину 19-23 пары нуклеотидов.

26. Средство dsRNA по п.24, где двухцепочечный участок составляет в длину 19-21 пару нуклеотидов.

27. Средство dsRNA по п.24, где двухцепочечный участок составляет в длину 21-23 пары нуклеотидов.

28. Средство dsRNA по любому из пп.1-27, где каждая цепь независимо составляет в длину 21-23 нуклеотида.

29. Средство dsRNA по любому из пп.1-28, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность 5'-AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA-3' (SEQ ID NO:62).

30. Средство dsRNA по любому из пп.1-29, где антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность 5'-UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU-3' (SEQ ID NO:113).

31. Средство dsRNA по любому из пп.1-30, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность 5'-AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA-3' (SEQ ID NO:62) и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность 5'-UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU-3' (SEQ ID NO:113).

32. Средство dsRNA по п.31, где смысловая цепь содержит 5'-asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfaua3' (SEQ ID NO:2876) и антисмысловая цепь содержит 5'-usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT-3' (SEQ ID NO:2889), где a, g, с и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) А, G, С и U; Af, Gf, Cf и Uf представляют собой 2'-фтор A, G, С и U; dT представляет собой дезокси-тимин нуклеотид и s представляет собой фосфоротиоатную связь.

- 189 044245

33. Средство dsRNA по любому из пп.1-31, где смысловая и антисмысловая цепи содержат нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из

5' - AfaGfcAfaGfaUfAfUfuUfuUfaUfaAfuAf - 3' (SEQ ID NO:122) и

5' - uAfuUfaUfaAfaAfauaUfcUfuGfcUfusUfsu - 3' (SEQ ID

NO:173) r

5' - AfsasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuUfaUfaAfuAf - 3' (SEQ ID

NO:164) и

5' - usAfsuUfaUfaAfaAfauaUfcUfuGfcUfususu - 3' (SEQ ID

NO:215)

5' - asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfaua - 3' (SEQ ID NO:2875) и

5' - usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT - 3' (SEQ ID

NO:2 8 8 8) ;

5' - asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfaua - 3' (SEQ ID NO: 2876) и

5' - usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT - 3' (SEQ ID

NO:2 8 8 9) ;

5' - asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuaAfua - 3' (SEQ ID NO:2878) и

5' - usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT - 3' (SEQ ID

NO:2891);

5' - asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuaAfua - 3' (SEQ ID NO:2879) и

5' - usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT - 3' (SEQ ID

NO:2892);

5' - asasgcaagaUfaUfuuuuauaaua - 3' (SEQ ID NO:2884) и

5' - usAfsUfuAfuAfAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT - 3' (SEQ ID

NO:2897); и

5' - asasgcaagaUfaUfuuuuauaaua - 3' (SEQ ID NO:2885) и

5' - usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT - 3' (SEQ ID

NO:2898), где a, g, с и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) А, G, С и U; Af, Gf, Cf и Uf представляют собой 2'-фтор A, G, С и U; dT представляет собой дезокси-тимин нуклеотид и s представляет собой фосфоротиоатную связь.

34. Средство dsRNA по п.33, где смысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности 5'asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfaua-3' (SEQ ID NO:2876) и антисмысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности 5'-usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT-3' (SEQ ID NO:2889), a, g, с и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) А, G, С и U; Af, Gf, Cf и Uf представляют собой 2'-фтор A, G, С и U; dT представляет собой дезокси-тимин нуклеотид и s представляет собой фосфоротиоатную связь; и

- 190 044245 лиганд конъюгируется на З'-конце смысловой цепи, как показано на следующей схеме:

35. Клетка, содержащая средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-34.

36. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена компонента комплемента С5, содержащая средство, представляющее собой dsRNA, по любому из пп.1-34.

37. Фармацевтическая композиция по п.36, где средство RNAi содержится в небуферном растворе.

38. Фармацевтическая композиция по п.37, где указанный небуферный раствор представляет собой физиологический раствор или воду.

39. Фармацевтическая композиция по п.38, где указанное средство RNAi присутствует с буферным раствором.

40. Фармацевтическая композиция по п.39, где указанный буферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию.

41. Фармацевтическая композиция по п.39, где указанный буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

42. Способ ингибирования экспрессии компонента комплемента С5 в клетке, включающий:

(а) приведение клетки в контакт со средством dsRNA по любому из пп.1-34 или фармацевтической композицией по любому из пп.36-41 и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а) в течение времени, достаточного для разрушения транскрипта мРНК гена компонента комплемента С5 с ингибированием тем самым экспрессии гена компонента комплемента С5 в клетке.

43. Способ лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, по любому из пп.1-34 или фармацевтической композиции по любому из пп.36-41 с лечением тем самым указанного субъекта.

44. Способ предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие, причем способ включает введение субъекту профилактически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, по любому из пп.1-34 или фармацевтической композиции по любому из пп.36-41 с предупреждением тем самым по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

45. Способ по п.43 или 44, где введение dsRNA субъекту приводит к уменьшению внутрисосудистого гемолиза, стабилизации уровней гемоглобина и/или снижению белка С5.

46. Способ по п.43 или 44, где нарушение представляет собой заболевание, связанное с компонентом комплемента С5.

47. Способ по п.46, где заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, выбрано из группы, состоящей из ночной пароксизмальной гемоглобинурии (PNH), атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), астмы, ревматоидного артрита (RA), синдрома антифосфолипидных антител, волчаночного нефрита, ишемически-реперфузионного повреждения, типичного или инфекционного гемолитико-уремического синдрома (tHUS), болезни плотного осадка (DDD), оптиконевромиелита (NMO), мультифокальной моторной нейропатии (MMN), рассеянного склероза (MS); дегенерации желтого пятна (например, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD)); синдрома, включающего гемолиз, повышение активности печеночных ферментов и снижение числа тромбоцитов (HELLP); пурпуры тромботической тромбоцитопенической (ТТР); спонтанной потери плода; пауци-иммунного васкулита; буллезного эпидермолиза; рецидивирующей потери плода; преэклампсии, черепно-мозговой травмы, миастении гравис, болезни холодовых агглютининов, дерматомиозита буллезного пемфигоида, связанного с Шига-подобным токсином Е. coli гемолитико-уремического синдрома, C3-нефропатии, васкулита, связанного с антителами к цитоплазме нейтрофилов; реакций отторжения трансплантата, вызванных гуморальным и сосудистым механизмами, дисфункции трансплантата, инфаркта миокарда, аллогенной трансплантации, сепсиса, заболевания коронарной артерии, дерматомиозита, болезни Грейвса, атеро-

- 191 044245 склероза, болезни Альцгеймера, сепсиса, связанного с системным воспалительным ответом, септического шока, травмы спинного мозга, гломерулонефрита, тиреоидита Хашимото, диабета I типа, псориаза, пузырчатки, аутоиммунной гемолитической анемии (AIHA), ITP, синдрома Гудпасчера, болезни Дегоса, антифосфолипидного синдрома (APS), катастрофического APS (CAPS), сердечно-сосудистых нарушений, миокардита, цереброваскулярного нарушения, периферического сосудистого нарушения, реноваскулярного нарушения, нарушения брыжеечных/кишечных сосудов, васкулита, нефрита ШенлейнаГеноха, васкулита, связанного с системной красной волчанкой, васкулита, связанного с ревматоидным артритом, васкулита, связанного с иммунными комплексами, болезни Такаясу, дилатационной кардиомиопатии, диабетической ангиопатии, болезни Кавасаки (артериита), венозной газовой эмболии (VGE) и рестеноза после установки стента, вращательной атерэктомии, перепончатой нефропатии, синдрома Гийена-Барре и чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (РТСА).

48. Способ по п.47, где заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой ночную пароксизмальную гемоглобинурию (PNH).

49. Способ по п.47, где заболевание, связанное с компонентом комплемента С5, представляет собой атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS).

50. Способ по п.43 или 44, где субъектом является человек.

51. Способ по любому из пп.43-50, дополнительно включающий введение субъекту антитела к компоненту комплемента С5 или его антигенсвязывающего фрагмента.

52. Способ по любому из пп.43-51, где средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозировке от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/кг.

53. Способ по п.52, где средство, представляющее собой dsRNA, вводят в дозировке от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг.

54. Способ по п.52, где средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту один раз в неделю.

55. Способ по п.52, где средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту два раза в неделю.

56. Способ по п.52, где средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту два раза в месяц.

57. Способ по любому из пп.43-56, где средство, представляющее собой dsRNA, вводят субъекту подкожно.

58. Способ по п.43 или 44, дополнительно включающий измерение гемоглобина и/или уровней LDH у указанного субъекта.

59. Средство, представляющее собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где dsRNA содержит смысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfiiuAfuAfaua-3' (SEQ ID NO:2876) и антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT-3' (SEQ ID NO:2889), где a, g, с и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) А, G, С и U; Af, Gf, Cf и Uf представляют собой 2'-фтор A, G, С и U; dT представляет собой дезокси-тимин нуклеотид и s представляет собой фосфоротиоатную связь.

60. Средство, представляющее собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (dsRNA), для ингибирования экспрессии компонента комплемента С5, где dsRNA содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность 5'asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfaua-3' (SEQ ID NO:2876) и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность 5'-usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT-3' (SEQ ID NO:2889), где a, g, с и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) А, G, С и U; Af, Gf, Cf и Uf представляют собой 2'-фтор A, G, С и U; dT представляет собой дезокси-тимин нуклеотид и s представляет собой фосфоротиоатную связь;

лиганд конъюгируется на 3'-конце смысловой цепи, как показано на следующей схеме:

где X представляет собой О.

- 192 044245

61. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена компонента комплемента

С5, содержащая средство, представляющее собой dsRNA, по п.60.

62. Способ лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, по п.60 или фармацевтической композиции по п.61 с лечением тем самым указанного субъекта.

63. Способ предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при котором снижение экспрессии компонента комплемента С5 окажет благоприятное воздействие, причем способ включает введение субъекту профилактически эффективного количества средства, представляющего собой dsRNA, по п.60 или фармацевтической композиции по п.61 с предупреждением тем самым по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего заболеванием, при котором снижение экспрессии С5 окажет благоприятное воздействие.

64. Способ по п.62 или 63, в котором средство dsRNA или фармацевтическая композиция предназначены для подкожного введения.