EA048142B1 - Моноклональные антитела к gprc5d и варианты их применения - Google Patents

Моноклональные антитела к gprc5d и варианты их применения Download PDF

Info

Publication number
EA048142B1
EA048142B1 EA202391920 EA048142B1 EA 048142 B1 EA048142 B1 EA 048142B1 EA 202391920 EA202391920 EA 202391920 EA 048142 B1 EA048142 B1 EA 048142B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ser
gly
thr
leu
tyr
Prior art date
Application number
EA202391920
Other languages
English (en)
Inventor
Жуньшэн Ли
Вэньтао Хуан
Original Assignee
Ланова Медисинз Дивелопмент Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ланова Медисинз Дивелопмент Ко., Лтд. filed Critical Ланова Медисинз Дивелопмент Ко., Лтд.
Publication of EA048142B1 publication Critical patent/EA048142B1/ru

Links

Abstract

Представлены антитела или их фрагменты, характеризующиеся специфичностью связывания в отношении белка GPRC5D человека. Антитела или их фрагменты способны нацеливаться на раковые клетки, экспрессирующие GPRC5D, и таким образом могут применяться для лечения рака, в частности гематологического рака.

Description

Предпосылки изобретения
Представитель D группы 5 семейства C рецепторов, сопряженных с G-белком (GPRC5D), является представителем семейства рецепторов, сопряженных с G-белком. GPRC5D представляет собой трансмембранный белок. Сверхэкспрессия GPRC5D наблюдалась у пациентов с множественной миеломой. В частности, его высокая экспрессия характеризовалась значимой корреляцией с неблагоприятным исходом заболевания и лечения.
Учитывая его специфическую высокую экспрессию на клетках злокачественных новообразований, было высказано предположение, что антитела, специфичные к GPRC5D, могут быть полезны для лечения злокачественного новообразования, например, с помощью биспецифического антитела, перенаправляющего T-клетки, или посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).
Сущность изобретения
Антитела к GPRC5D, включая их гуманизированные производные, которые обладают высокой аффинностью к белку GPRC5D человека, раскрыты в данном документе. Антитела или их фрагменты способны нацеливаться на раковые клетки, экспрессирующие GPRC5D, и таким образом могут применяться для лечения рака, в частности гематологического рака.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания в отношении белка, представляющего собой представителя D группы 5 семейства С рецепторов, сопряженных с G-белком человека (GPRC5D), при этом антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющие комплементарность области CDRL1, CDRL2 и CDRL3. В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают: (a) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 2934; (b) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 42-47; (c) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54-59; или (d) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 68-73.
В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 29-34. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 7 и 35-37, и VL предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 8 и 38-41. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35, и VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 42-47. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 9 и 48-50, и VL предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 10 и 51-53. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48, и VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51.
В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54-59. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 61-64, и VL предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 16 и 65-67. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61, и VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63, и VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65.
В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 68-73. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 1 и 74-79, и VL предусматривает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 2 и 80-86. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 76, и VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77, и VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент являются ADCC-компетентными.
Также в некоторых вариантах осуществления представлено, что антитело или его фрагмент допол
- 1 048142 нительно содержат цитотоксическое лекарственное средство, конъюгированное с антителом или его фрагментом.
Также представлено биспецифическое антитело, содержащее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению и второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий специфичностью к второму белку-мишени. В некоторых вариантах осуществления второй белок-мишень выбран из группы, состоящей из CD3, CD16, CD19, CD28, CD64 и 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления второй белок-мишень представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления второй белок-мишень представляет собой 4-1BB.
Также предложен способ лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение пациенту антитела или его фрагмента по настоящему изобретению. Также предложен способ лечения рака у пациента, нуждающегося в этом, включающий: (a) обработку T-клетки, естественной клеткикиллера (NK) или макрофага in vitro антителом или его фрагментом по настоящему изобретению, и (b) введение обработанной клетки пациенту.
В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематологический рак, такой как Bклеточный рак, при котором экспрессируется GPRC5D (например, множественная миелома).
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано связывание антител мыши, собранных из супернатанта гибридомы, с GPRC5D, экспрессированным на клетках CHO-K1.
На фиг. 2 показано связывание химерных антител с GPRC5D, экспрессированным на клетках CHOK1.
На фиг. 3 показано, что связывание антител индуцировало эндоцитоз.
На фиг. 4 показано, что антитела были ADCC-компетентными.
На фиг. 5-8 показаны результаты тестирования аффинности гуманизированных антител, происходящих из 6G10D9, 58F9G10, 34D3H1 и 37B9C4 соответственно.
На фиг. 9 подтверждается связывание выбранных гуманизированных антител с GPRC5D, экспрессированным на клетках CHO-K1.
На фиг. 10 подтверждается связывание выбранных гуманизированных антител с GPRC5D, экспрессированным на клетках NCI-H929.
На фиг. 11 показана ADCC-эффективность протестированных гуманизированных антител.
На фиг. 12 показана активность индукции интернализации у протестированных гуманизированных антител.
На фиг. 13 показаны показатели активности в отношении уничтожения клеток у тестируемых конъюгатов антитело-лекарственное средство.
На фиг. 14 показаны показатели активности тестируемого антитела в отношении подавления опухоли.
Подробное описание
Определения.
Следует отметить, что термин объект в формах единственного числа относится к одному или нескольким из этих объектов; например, антитело означает одно или несколько антител. В связи с этим формы единственного числа, выражения один или несколько и по меньшей мере один можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.
Используемый в данном документе термин полипептид предназначен для охвата полипептида в единственном числе, а также полипептидов во множественном числе и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно соединенных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не привязан к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение полипептид, и термин полипептид может использоваться вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с ними. Термин полипептид также предназначен для обозначения продуктов постэкспрессионных модификаций полипептида, включая, помимо прочего, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может происходить из природного биологического источника или быть получен с помощью рекомбинантной технологии, но необязательно получен путем трансляции определенной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе путем химического синтеза.
Гомология, или идентичность, или сходство относится к сходству последовательностей между двумя пептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Гомологию можно определить путем сравнения положения в каждой последовательности, которая может быть выровнена для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято одним и тем же основанием или аминокислотой, то молекулы гомологичны в этом положении. Степень гомологии между последовательностями является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, общих для после
- 2 048142 довательностей. Неродственная или негомологическая последовательность характеризуется менее чем 40% идентичностью, хотя предпочтительно менее чем 25% идентичностью, с одной из последовательностей по настоящему изобретению.
Полинуклеотид или полинуклеотидная область (или полипептид или полипептидная область) характеризуются определенным процентом (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%) идентичности последовательности с другой последовательностью, что означает, что при выравнивании этот процент оснований (или аминокислот) являются одинаковыми при сравнении двух последовательностей.
Термин эквивалентная нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность, характеризующуюся определенной степенью гомологии или идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью нуклеиновой кислоты или ее комплемента. Подразумевается, что гомолог двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, которая характеризуется определенной степенью гомологии с ним или с его комплементом. В одном аспекте гомологи нуклеиновых кислот способны гибридизоваться с нуклеиновой кислотой или ее комплементом. Аналогично, эквивалентный полипептид относится к полипептиду, характеризующемуся определенной степенью гомологии или идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного полипептида. В некоторых аспектах идентичность последовательности составляет по меньшей мере около 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% или 99%. В некоторых аспектах эквивалентный полипептид или полинуклеотид характеризуется наличием одного, двух, трех, четырех или пяти добавлений, делеций, замен и их комбинаций по сравнению с эталонным полипептидом или полинуклеотидом. В некоторых аспектах эквивалентная последовательность сохраняет активность (например, эпитопсвязывающую) или структуру (например, солевой мостик) эталонной последовательности.
Используемые в данном документе термины антитело или антигенсвязывающий полипептид относятся к полипептиду или полипептидному комплексу, которые специфически распознают антиген и связываются с ним. Антитело может представлять собой целое антитело и любой его антигенсвязывающий фрагмент или одиночную цепь. Таким образом, термин антитело включает любую молекулу, содержащую белок или пептид, который содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, обладающую биологической активностью, состоящей в связывании с антигеном. Их примеры включают без ограничения определяющую комплементарность область (CDR) тяжелой или легкой цепи или ее лиганд-связывающую часть, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, константную область тяжелой или легкой цепи, каркасную область (FR) или любую ее часть или по меньшей мере одну часть связывающего белка.
Термины фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент, используемые в данном документе, представляют собой часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин фрагмент антитела включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин фрагмент антитела также включает любой синтетический или генно-инженерный белок, который действует как антитело, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса.
Одноцепочечный вариабельный фрагмент или scFv относится к слитому белку, состоящему из вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей иммуноглобулинов. В некоторых аспектах области соединены коротким линкерным пептидом, состоящим из от десяти до приблизительно 25 аминокислот. Линкер может быть обогащен глицином для обеспечения гибкости, а также серином или треонином для обеспечения растворимости, и может либо соединять N-конец VH с C-концом VL, либо наоборот. Этот белок сохраняет специфичность оригинального иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и введение линкера. scFv-молекулы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5892019.
Термин антитело охватывает различные широкие классы полипептидов, которые можно различить биохимически. Специалистам в данной области техники понятно, что тяжелые цепи подразделяются н классы гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) с некоторыми подклассами между ними (например, γ1-γ4). Именно природа этой цепи определяет то, к какому классу относится антитело - IgG, IgM, IgA, IgG или IgE соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 и т. д., хорошо охарактеризованы и, как известно, определяют функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов легко различимы для специалиста в данной области техники в свете настоящего изобретения, и соответственно они все входят в объем настоящего изобретения. Все классы иммуноглобулинов, безусловно, входят в объем настоящего изобретения, однако последующее обсуждение будет в целом направлено на класс IgG молекул иммуноглобулина. Что касается IgG, стандартная молекула иммуноглобулина содержит два идентичных полипептида легкой цепи с молекулярной массой примерно 23000 Дальтон и два идентичных полипептида тяжелой цепи с молекулярной массой 53000-70000. Четыре цепи обычно соединены дисульфидными связями в конфигурации Y, в которой легкие цепи прилегают к тяжелым цепям, начиная с устья Y и далее вдоль вариабельной области.
- 3 048142
Антитела, их антигенсвязывающие полипептиды, варианты или производные согласно настоящему изобретению включают без ограничения поликлональные, моноклональные, полиспецифические, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, Fv с дисульфидной связью (sdFv), фрагменты, содержащие либо домен VK, либо домен VH, фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии Fab, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-И-антитела к LIGHT-антителам, раскрытые в данном документе). Молекулы иммуноглобулина или антитела по настоящему изобретению могут относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекул иммуноглобулина.
Легкие цепи относятся либо к классу каппа, либо к классу лямбда (κ, λ). Тяжелая цепь каждого класса может быть связана либо с легкой каппа-цепью, либо с легкой лямбда-цепью. Как правило, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, а хвостовые части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, если иммуноглобулины генерируются либо гибридомами, либо B-клетками, либо генно-инженерными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности расположены от N-конца на раздвоенных концах Y-образной конфигурации до C-конца в нижней части каждой цепи.
Как легкая, так и тяжелая цепи разделены на области, обладающие структурной и функциональной гомологией. Термины константный и вариабельный применяют в функциональном значении. В этом отношении следует понимать, что вариабельные домены как легкой (VK), так и тяжелой (VH) частей цепи определяют распознавание антигена и специфичность. Наоборот, константные домены легкой цепи (CK) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) определяют важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание с рецептором Fc, связывание комплемента и т. п. По соглашению нумерация доменов константной области увеличивается по мере их удаления от антигенсвязывающего сайта или амино-конца антитела. N-концевая часть представляет собой вариабельную область, а C-концевая часть представляет собой константную область; домены CH3 и CK фактически содержат карбокси-конец тяжелой и легкой цепи соответственно.
Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать эпитопы на антигенах и специфически связывать их. То есть домен VK и домен VH или подмножество определяющих комплементарность областей (CDR) антитела объединяются с образованием вариабельной области, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Эта четвертичная структура антитела образует сайт связывания антигена, присутствующий на конце каждого плеча Y. Более конкретно, сайт связывания антигена определяется тремя CDR на каждой из цепей VH и VK (т. е. CDR-H1, CDR- H2, CDRH3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3). В некоторых случаях, например, определенные молекулы иммуноглобулина происходят из видов верблюдовых или сконструированы на основе иммуноглобулинов верблюдовых, при этом полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей без легких цепей. См., например, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).
Во встречающихся в природе антителах шесть определяющих комплементарность областей или CDR, присутствующих в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие, несмежные последовательности аминокислот, которые позиционируются конкретным образом с образованием антигенсвязывающего домена при приобретении антителом своей трехмерной конфигурации в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемые каркасными областями, демонстрируют меньшую межмолекулярную изменчивость. Каркасные области в значительной степени принимают конформацию β-слоя, a CDR образуют петли, которые соединяют структуру β-слоя, а в некоторых случаях составляют ее часть. Таким образом, функцией каркасных областей является образование остова, который обеспечивает позиционирование CDR в правильной ориентации с помощью нековалентных взаимодействий между цепями. Антиген-связывающий домен, образованный позиционированными CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу иммунореактивного антигена. Эта комплементарная поверхность содействует нековалентному связыванию антитела с его когнатным эпитопом. Аминокислоты, содержащие CDR и каркасные области, соответственно, могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области техники для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, поскольку они были точно определены (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).
В случае, если существует два или более определения термина, применяемого и/или принятого в данной области техники, определение термина, используемое в данном документе, подразумевает включение всех таких значений, если явно не указано обратное. Конкретным примером является использование термина определяющая комплементарность область (CDR) для описания несмежных сайтов связывания антигена, находящихся в вариабельной области как тяжелой, так и легкой цепи полипептидов. Эта конкретная область была описана Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983), и Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), которые вклю
- 4 048142 чены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Определения CDR по Kabat и Chothia предусматривают перекрывание подмножеств аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, подразумевается, что применение одного из двух определений для обозначения CDR антитела или его вариантов находится в пределах объема термина, как определяется и применяется в данном документе. Соответствующие аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, как определено в каждой из цитированных выше ссылок, представлены в таблице ниже в качестве сравнения. Точное число остатков, охватываемых конкретным CDR, будет варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области техники могут обычным образом определить, какие остатки составляют конкретный CDR, с учетом аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.
Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
Kabat и соавторы также определили систему нумерации последовательностей вариабельного домена, которую можно применять к любому антителу. Специалист в данной области техники может однозначно применить эту систему нумерации по Kabat к любой последовательности вариабельного домена, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные, помимо самой последовательности. Используемый в данном документе термин нумерация по Kabat относится к системе нумерации, установленной Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1983).
В дополнение к таблице выше, система присвоения номеров по Kabat описывает области CDR следующим образом: CDR-H1 начинается с примерно аминокислоты 31 (т. е. примерно через 9 остатков после первого остатка цистеина), содержит примерно 5-7 аминокислот и заканчивается на следующем остатке триптофана. CDR-H2 начинается с пятнадцатого остатка от конца CDR-H1, содержит примерно 16-19 аминокислот и заканчивается на следующем остатке аргинина или лизина. CDR-H3 начинается с примерно тридцать третьего аминокислотного остатка от конца CDR-H2; содержит 3-25 аминокислот и заканчивается на последовательности W-G-X-G, где X представляет собой любую аминокислоту. CDRL1 начинается с примерно остатка 24 (т. е. после остатка цистеина); содержит примерно 10-17 остатков и заканчивается на следующем остатке триптофана. CDR-L2 начинается с примерно шестнадцатого остатка от конца CDR-L1 и содержит примерно 7 остатков. CDR-L3 начинается с примерно тридцать третьего остатка после конца CDR-L2 (т.е. после остатка цистеина); содержит примерно 7-11 остатков и заканчивается последовательностью F или W-G-X-G, где X представляет собой любую аминокислоту.
Описанные в данном документе антитела могут происходить от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела представляют собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или курицы. В другом варианте осуществления вариабельная область может происходить от хрящевых рыб (например, от акул).
Используемый в данном документе термин константная область тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий константную область тяжелой цепи, содержит по меньшей мере один из следующих доменов: домен CH1, шарнирный домен (например, верхнюю, среднюю и/или нижнюю шарнирную область), домен CH2, домен CH3 или их вариант или фрагмент. Например, антигенсвязывающий полипептид для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную цепь, содержащую домен CH1; полипептидную цепь, содержащую домен CH1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен CH2; полипептидную цепь, содержащую домен CH1 и домен CH3; полипептидную цепь, содержащую домен CH1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен CH3, или полипептидную цепь, содержащую домен CH1, по меньшей мере часть шарнирного домена, домен CH2 и домен CH3. В другом варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит полипептидную цепь, содержащую домен CH3. Дополнительно, в антителе для применения по настоящему изобретению может отсутствовать по меньшей мере часть домена CH2 (например, весь домен CH2 или его часть). Как указано выше, специалисту в данной области техники будет понятно, что константная область тяжелой цепи может быть модифицирована таким образом, что она будет отличаться по аминокислотной последовательности от встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина.
Константная область тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, может происходить из различных молекул иммуноглобулина. Например, константная область тяжелой цепи полипептида может содержать домен CH1, происходящий из молекулы IgG1, и шарнирную область, происходящую из молекулы IgG3. В другом примере константная область тяжелой цепи может содержать шарнирную об
- 5 048142 ласть, происходящую частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере часть тяжелой цепи может содержать химерный шарнир, происходящий частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.
Используемый в данном документе термин константная область легкой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из легкой цепи антитела. Предпочтительно константная область легкой цепи содержит по меньшей мере один константный домен каппа или константный домен лямбда.
Пара легкая цепь-тяжелая цепь относится к набору легкой цепи и тяжелой цепи, которые могут образовывать димер за счет дисульфидной связи между доменом CL легкой цепи и доменом CH1 тяжелой цепи.
Как указывалось ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей иммуноглобулинов различных классов хорошо известны. Используемый в данном документе термин домен VH предусматривает амино-концевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, и термин домен CH1 включает первый (наиболее близкий к амино-концу) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен CH1 примыкает к домену VH и является амино-концевым по отношению к шарнирной области тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина.
Используемый в данном документе термин домен CH2 предусматривает часть молекулы тяжелой цепи, которая простирается, например, от приблизительно остатка 244 до остатка 360 антитела при использовании общепринятых схем нумерации (остатки от 244 до 360, система нумерации по Kabat; и остатки 231-340, система нумерации EU; см. Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983). Домен CH2 уникален тем, что он не образует тесную пару с другим доменом. Наоборот, две N-сцепленные разветвленные углеводные цепи размещены между двумя доменами CH2 интактной нативной молекулы IgG. Также получено убедительное документальное подтверждение, что домен CH3 продолжается от домена CH2 до C-конца молекулы IgG и содержит приблизительно 108 остатков.
Используемый в данном документе термин шарнирная область предусматривает часть тяжелой цепи молекулы, которая присоединяет домен CH1 к домену CH2. Эта шарнирная область содержит примерно 25 остатков и является гибкой, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающим областям двигаться независимо. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
Используемый в данном документе термин дисульфидная связь предусматривает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG области CH1 и CK связаны дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 при использовании системы нумерации по Kabat (положение 226 или 229, система нумерации EU).
Используемый в данном документе термин химерное антитело будет означать любое антитело, в котором иммунореактивная область или сайт получены или происходят из первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с настоящим изобретением) получена из второго вида. В определенных вариантах осуществления область или сайт связывания мишени будут происходить из источника, отличного от человека (например, от мыши или примата), а константная область является человеческой.
Как используется в данном документе, процент гуманизации рассчитывается путем определения количества различий аминокислот каркаса (т. е. различий, не относящихся к CDR) между гуманизированным доменом и доменом зародышевой линии, вычитания этого числа из общего количества аминокислот, а затем деления его на общее количество аминокислот и умножения на 100.
Под специфически связывается или обладает специфичностью к обычно подразумевается, что антитело связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание предусматривает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с этим определением говорят, что антитело специфически связывается с эпитопом, если оно связывается с этим эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена лучше, чем если бы оно связывалось со случайным, не родственным ему эпитопом. Термин специфичность используется в данном документе для определения относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно считать, что антитело A характеризуется более высокой специфичностью в отношении данного эпитопа, чем антитело B, или можно сказать, что антитело A связывается с эпитопом C с более высокой специфичностью, чем та, которой оно характеризуется в отношении родственного эпитопа D.
Используемые в данном документе термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к мерам профилактики или предупреждения, целью которых является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как прогрессирование рака. Благоприятные или требуемые клинические результаты включают без ограничения уменьшение выраженности симптомов, уменьшение степени тяжести заболевания, стабили
- 6 048142 зированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или ослабление болезненного состояния и ремиссию (либо частичную, либо полную), независимо от того, поддается они обнаружению или нет. Лечение также может означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии лечения. К нуждающимся в лечении относят тех, у кого уже есть состояние или нарушение, а также тех, кто предрасположен к состоянию или нарушению, или тех, у кого нужно предупредить развитие состояния или нарушения.
Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим подразумевается любой субъект, в частности субъект-млекопитающее, для которого требуется постановка диагноза, прогнозирование или терапия. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных и зоопарковых, спортивных животных или домашних питомцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и так далее.
Используемые в данном документе выражения, такие как пациенту, нуждающемуся в лечении или субъекту, нуждающемуся в лечении, включают субъектов, таких как субъекты-млекопитающие, у которых введение антитела или композиции по настоящему изобретению может обеспечить благоприятный эффект, например, для обнаружения, для диагностической процедуры и/или для лечения.
Антитела к GPRC5D.
При использовании гибридомной технологии в прилагаемых экспериментальных примерах показано, что был получен ряд антител мыши. Секвенировали четырнадцать антител мыши и получили гуманизированные антитела. Эти гуманизированные антитела проявляли мощную GPRCSD-связывающую активность и были способны индуцировать опосредованный рецептором эндоцитоз. Тестирование in vivo показало, что эти антитела активно индуцируют ADCC и подавляют развитие опухоли.
Четыре антитела мыши, 34D3H1, 37B9C4, 58F9G10 и 6G10D9, прошли процесс гуманизации. Некоторые гуманизированные антитела, включая 6-H3L3, 6-H4L3 (оба происходят из 6G10D9), 58-H1L1, 58H3L1 (оба происходят из 58F9G10), 34-H1L1 (происходит из 34D3H1) и 37-H1L1 (происходит из 37B9C4), дополнительно показали перспективность продолжения клинической разработки.
Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения представлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания в отношении белка, представляющего собой представителя D группы 5 семейства C рецепторов, сопряженных с G-белком человека (GPRC5D). Антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющие комплементарность области CDRL1, CDRL2 и CDRL3.
В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают (a) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 29-34; (b) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 42-47; (c) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54-59 или SEQ ID NO: 54, 60 и 56-59; или (d) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 68-73.
В одном варианте осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 29-34. Примеры последовательностей для VH включают последовательности под SEQ ID NO: 7 и 35-37 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью любой из последовательностей под SEQ ID NO: 7 и 35-37. Примеры последовательностей для VL включают последовательности под SEQ ID NO: 8 и 38-41 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью любой из последовательностей под SEQ ID NO: 8 и 38-41.
В одном варианте осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 35. В одном варианте осуществления VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 38.
Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом на FAPa, что и любое из этих антител. Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с любым из этих антител за связывание с FAPa, например, антитело, содержащее VH, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35, и VL, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38.
В одном варианте осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 42-47. Примеры последовательностей для VH включают последовательности под SEQ ID NO: 9 и 48-50, или последовательность,
- 7 048142 на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную любой из последовательностей под SEQ ID NO: 9 и 4850. Примеры последовательностей для VL включают последовательности под SEQ ID NO: 10 и 51-53 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью любой из последовательностей под SEQ ID NO: 10 и 51-53.
В одном варианте осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 48. В одном варианте осуществления VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 51.
Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом на FAPa, что и любое из этих антител. Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с любым из этих антител за связывание с FAPa, например, антитело, содержащее VH, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48, и VL, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51.
В одном варианте осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54-59. Примеры последовательностей для VH включают последовательности под SEQ ID NO: 61-64, или последовательность, на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную любой из последовательностей под SEQ ID NO: 61-64. Примеры последовательностей для VL включают последовательности под SEQ ID NO: 16 и 65-67, или последовательность, на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную любой из последовательностей под SEQ ID NO: 16 и 65-67.
В одном варианте осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 61. В одном варианте осуществления VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 65.
Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом на FAPa, что и любое из этих антител. Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с любым из этих антител за связывание с FAPa, например, антитело, содержащее VH, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61, и VL, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65.
В одном варианте осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 63. В одном варианте осуществления VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 65.
Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом на FAPa, что и любое из этих антител. Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с любым из этих антител за связывание с FAPa, например, антитело, содержащее VH, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63, и VL, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65.
В одном варианте осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54, 60, и 56-59. Примеры последовательностей для VH включают последовательность под SEQ ID NO: 15 или последовательность, на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную последовательности под SEQ ID NO: 15. Примеры последовательностей для VL включают последовательности под SEQ ID NO: 16 и 65-67, или последовательность, на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную любой из последовательностей под SEQ ID NO: 16 и 65-67.
В одном варианте осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 68-73. Примеры последовательностей для VH включают последовательности под SEQ ID NO: 1 и 74-79, или последовательность, на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную любой из последовательностей под SEQ ID NO: 1 и 7479. Примеры последовательностей для VL включают последовательности под SEQ ID NO: 2 и 80-86, или последовательность, на по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичную любой из последовательностей под SEQ ID NO: 2 и 80-86.
- 8 048142
В одном варианте осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 76 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 76. В одном варианте осуществления VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 82.
Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом на FAPa, что и любое из этих антител. Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с любым из этих антител за связывание с FAPa, например, антитело, содержащее VH, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 76, и VL, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82.
В одном варианте осуществления VH предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 77. В одном варианте осуществления VL предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90 или 95% идентичностью последовательности в отношении последовательности под SEQ ID NO: 82.
Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом на FAPa, что и любое из этих антител. Также в некоторых вариантах осуществления представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с любым из этих антител за связывание с FAPa, например, антитело, содержащее VH, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77, и VL, которая предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент являются ADCCкомпетентными. Способы и материалы, подходящие для получения ADCC-компетентного антитела, известны из уровня техники, такие как с использованием соответствующих Fc-фрагментов или путем уменьшения/удаления фукозилирования.
В некоторых вариантах осуществления CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно предусматривают: (a) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 29-34; (b) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 42-47; (c) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54-59 или SEQ ID NO: 54, 60 и 56-59 или (d) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 68-73, где каждая из приведенных последовательностей CDR содержит одну, две или три консервативные аминокислотные замены.
Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену аминокислотного остатка аминокислотным остатком, содержащим аналогичную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, несущественный аминокислотный остаток в полипептиде иммуноглобулина предпочтительно заменяется другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом варианте осуществления нить аминокислот может быть заменена структурно сходной нитью, которая отличается порядком и/или составом представителей семейства боковых цепей.
Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен представлены в таблице ниже, где показатель сходства 0 или выше указывает на то, что замена этих двух аминокислот друг другом является консервативной.
- 9 048142
Таблица A
Матрица сходства аминокислот
С G Р S А т D Е N Q н К R V М I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
м -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
К -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
Н -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
Е -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
Т -2 0 0 1 1 3
А -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
Р -3 -1 6
G -3 5
С 12
Таблица B Консервативные замены аминокислот
Для аминокислоты Замена на
Аланин D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys
Аргинин D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn
Аспарагин D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gin, D-Gln
Аспарагиновая кислота D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Цистеин D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser
Глутамин D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Глутаминовая кислота D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Глицин Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala
Изолейцин D-Ile, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Лейцин Vai, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, He
Лизин D-Lys, Arg, D-Arg, Om, D-Orn
Метионин D-Met, S-Me-Cys, He, D-Ile, Leu, D-Leu, Vai, D-Val
Фенилаланин D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp
Пролин D-Pro
Серин D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys
Треонин D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Vai, D-Val
Тирозин D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp
Валин D-Val, Leu, D-Leu, He, D-Не, Met, D-Met
Специалисту в данной области техники также будет понятно, что описанные в данном документе антитела могут быть модифицированы таким образом, что они будут отличаться по аминокислотной последовательности от встречающегося в природе связывающего полипептида, из которого они были получены. Например, полипептидная или аминокислотная последовательность, происходящая из указанного белка, может быть сходной, например характеризоваться определенной процентной идентичностью исходной последовательности, например, она может быть на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% иден
- 10 048142 тичной исходной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления антитела к CCR8 представляют собой модифицированные mAb, содержащие модифицированную константную область тяжелой цепи, такую как афукозилированная тяжелая цепь, которая с более высокой аффинностью связывается с активирующим рецептором Fcy, который опосредует усиление ADCC, по сравнению с немодифицированным mAb. В некоторых вариантах осуществления антитела к CCR8 содержат тяжелую цепь, которая происходит из варианта IgG1 человека, которая содержит одну L234Y, L235Q, G236W, S239D/M, F243L, H268D, D270E, R292P, S298A, Y300L, V305I, K326D, A330L/M, I332E, K334A/E, P396L или их комбинацию, что обеспечивает усиление функции ADCC (вся нумерация EU).
В определенных вариантах осуществления антитело содержит аминокислотную последовательность или одну или несколько частиц, которые обычно не ассоциированы с антителом. Примеры модификаций более подробно описаны ниже. Например, антитело по настоящему изобретению может содержать гибкую линкерную последовательность или может быть модифицировано для добавления функциональной частицы (например, PEG, лекарственного средства, токсина или метки).
Антитела, их варианты или производные по настоящему изобретению включают производные, которые модифицированы, т. е. путем ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу, так что ковалентное присоединение не препятствует связыванию антитела с эпитопом. Например без ограничения антитела могут быть модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пэгилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т. д. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена с помощью известных методик, включая без ограничения специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т. д. Кроме того, антитела могут содержать одну или несколько неклассических аминокислот.
Конъюгаты антитело-лекарственное средство.
GPRC5D сверхэкспрессируется на определенных злокачественных гематологических клетках, таких как клетки множественной миеломы. Таким образом, антитела и фрагменты по настоящему изобретению могут использоваться для нацеливания на эти злокачественные клетки для их подавления, инактивации или разрушения. В одном примере антитело или его фрагмент конъюгированы со средством, которое помогает подавлять, инактивировать или разрушать злокачественную клетку. В данном документе показано, что антитела способны индуцировать эндоцитоз, опосредованный GPRC5D.
В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты могут быть конъюгированы с терапевтическими средствами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими средствами или PEG. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное средство может представлять собой короткую интерферирующую РНК (siRNA) или природный модулятор, такой как агонист стимулятора генов интерферона (STING) или агонист TLR7/8.
В одном варианте осуществления антитела или фрагменты по настоящему изобретению ковалентно присоединены к частице лекарственного средства. Частица лекарственного средства может представлять собой группу, реагирующую с точкой конъюгации на антителе, или может быть модифицирована для включения таковой. Например, частица лекарственного средства может быть присоединена путем алкилирования (например, по эпсилон-аминогруппе остатков лизина или N-концу антител), восстановительного аминирования окисленного углевода, переэтерификации между гидроксильными и карбоксильными группами, амидированием по аминогруппам или карбоксильным группам и конъюгации с тиолами.
В некоторых вариантах осуществления число частиц лекарственного средства, р, конъюгированных на молекулу антитела, находится в диапазоне в среднем от 1 до 8; от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления р находится в диапазоне в среднем от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления р в среднем составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В некоторых вариантах осуществления р находится в диапазоне в среднем от приблизительно 1 до приблизительно 20, от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 2 до приблизительно 10, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 1 до приблизительно 8, от приблизительно 1 до приблизительно 7, от приблизительно 1 до приблизительно 6, от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 1 до приблизительно 4, от приблизительно 1 до приблизительно 3 или от приблизительно 1 до приблизительно 2. В некоторых вариантах осуществления р находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 8, от приблизительно 2 до приблизительно 7, от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 4 или от приблизительно 2 до приблизительно 3.
Например, если химическая активация белка приводит к образованию свободных тиольных групп, белок может быть конъюгирован с сульфгидрильным реагирующим средством. В одном аспекте средство представляет собой средство, который существенно специфичен в отношении свободных тиольных групп. Такие средства включают, например, малеимид, галогенацетамиды (например, с йодом, бромом или хлором), сложные эфиры галогенов (например, йода, брома или хлора), галогенметилкетоны (напри
- 11 048142 мер, с йодом, бромом или хлором), бензилгалогениды (например, йодид, бромид или хлорид), винилсульфон и пиридилтио.
Лекарство может быть связано с антителом или фрагментом с помощью линкера. Подходящие линкеры включают, например, расщепляемые и нерасщепляемые линкеры. Расщепляемый линкер обычно подвержен расщеплению во внутриклеточных условиях. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, такой как лизосомальная протеаза или эндосомальная протеаза. В примерах вариантов осуществления линкер может представлять собой дипептидный линкер, такой как валин-цитруллиновый (val-cit), фенилаланин-лизиновый (phe-lys) линкер или малеимидокапроно-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбониловый (mc-Val-Cit-PABA) линкер. Другой линкер представляет собой сульфосукцинимидил-4-[Ы-малеимидометил]циклогексан-1карбоксилат (smcc). Конъюгация сульфо-smcc происходит посредством малеимидной группы, которая реагирует с сульфгидрилами (тиолами, -SH), тогда как ее сложный эфир сульфо-NHS является реактивным в отношении первичных аминов (таких, как находящиеся в лизине и N-конце белка или пептида). Еще одним линкером является малеимидокапроил (mc). Другие подходящие линкеры включают линкеры, гидролизуемые при определенном pH или диапазоне pH, такие как гидразоновый линкер. Дополнительные подходящие расщепляемые линкеры включают дисульфидные линкеры. Линкер может быть ковалентно связан с антителом до такой степени, что антитело должно подвергаться внутриклеточной деградации для высвобождения лекарственного средства, например, линкер mc и т.п.
Линкер может содержать группу для связывания с антителом. Например, линкер может содержать амино-, гидроксильную, карбоксильную или сульфгидрильную реакционноспособную группу (например, малеимид, галогенацетамиды (например, с йодом, бромом или хлором), галоидэфиры (например, с йодом, бромом или хлором), галогенметилкетоны (например, с йодом, бромом или хлором), бензилгалогениды (например, йодид, бромид или хлорид), винилсульфон и пиридилтио).
В некоторых вариантах осуществления частица лекарственного средства представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство, иммунодепрессант, радиоизотоп, токсин или т. п. Конъюгат можно использовать для подавления размножения опухолевой клетки или раковой клетки, вызывая апоптоз в опухолевой или раковой клетке или для лечения рака у пациента. Соответственно, конъюгат можно использовать в различных условиях для лечения форм рака у животных. Конъюгат можно использовать для доставки лекарственного средства к опухолевой или раковой клетке. Не ограничиваясь какой-либо теорией, в некоторых вариантах осуществления конъюгат связывается или ассоциируется с раковой клеткой, экспрессирующей GPRC5D, и конъюгат и/или лекарственное средство могут проникать внутрь опухолевой или раковой клетки посредством опосредованного рецептором эндоцитоза.
Оказавшись внутри клетки, одна или несколько специфических пептидных последовательностей в конъюгате (например, в линкере) гидролитически расщепляются одной или несколькими протеазами, ассоциированными с опухолевыми клетками или с раковыми клетками, что приводит к высвобождению лекарственного средства. Затем высвобожденное лекарственное средство может свободно мигрировать внутри клетки и индуцировать цитотоксическую, цитостатическую или другие виды активности. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство отщепляется от антитела вне опухолевой или раковой клетки, и впоследствии лекарственное средство проникает в клетку или действует на клеточной поверхности.
Примеры частиц лекарственного средства или вариантов нагрузки выбраны из группы, состоящей из DM1 (майтанзин, Н2'-деацетил-Н2'-(3-меркапто-1-оксопропил)- или Н2'-деацетил-Н2'-(3-меркапто-1оксопропил)майтанзин), mc-MMAD (б-малеимидокапроил-монометилауристатин-D или Н-метил-Ьвалил-N-[(1S,2R)-2-метокси-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-[[(1S)-2-фенил-1-(2тиазолил)этил]амино]пропил]-1-пирролидинил] -1-[(1S)-1 -метилпропил] -4-оксобутил] -Н-метил-(9С1)-Ьвалинамид), mc-MMAF (малеимидокапроил-монометилауристатин F или Н-[6-(2,5-дигидро-2,5-диоксо1H-пиррол-1-ил)-1-оксогексил]-N-метил-L-валил-L-валил-(3R,4S,5S)-3-метокси-5-метил-4(метиламино)гептαноил-(αR,βR,2β)-β-метокси-α-метил-2-пирролидинпропаноил-L-фенилаланин) и mcVal-Cit-PABA-MMAE (б-малеимидокапроил^акСЦ-(р-аминобензилоксикарбонил)монометилауристатин E или Н-|||4-||Н-|6-(2.5-дигидро-2.5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)-1-оксогексил|-квалил-N5-(аминокарбонил)-L-орнитил]амино]фенил]метокси]карбонил]-N-метил-L-валил-N-[(1S,2R)-4[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-гидрокси-1-метил-2-фенилэтил]αмино]-1-метокси-2-метил-3-оксоnропил]1 -пирролидинил] -2-метокси- 1-|(1S)-1 -метилпропил] -4-оксобутил] -Н-метил-Ь-валинамид). DM1 является производным ингибитора тубулина майтанзина, тогда как MMAD, MMAE и MMAF являются производными ауристатина. В некоторых вариантах осуществления частица лекарственного средства выбрана из группы, состоящей из mc-MMAF и mc-Val-Cit-PABA-MMAE В некоторых вариантах осуществления частица лекарственного средства представляет собой майтанзиноид или ауристатин.
Антитела или фрагменты могут быть конъюгированы или слиты с терапевтическим средством, которое может предусматривать обнаруживаемые метки, такие как радиоактивные метки, иммуномодулятором, гормоном, ферментом, олигонуклеотидом, фотоактивным терапевтическим или диагностическим средством, цитотоксическим средством, которое может представлять собой лекарственное средство или токсин, средством, усиливающим воздействие ультразвука, нерадиоактивной метки, их комбинацией и
- 12 048142 другими подобными средствами, известными в данной области техники.
Антитела могут быть помечены обнаруживаемой меткой путем связывания их с хемилюминесцентным соединением. Присутствие антигенсвязывающего полипептида с хемилюминесцентной меткой затем определяют путем обнаружения люминесценции, возникающей в ходе химической реакции. Примерами особенно применимых соединений для хемилюминесцентного мечения являются люминол, изолюминол, сложный ароматический эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир оксалата.
Антитела также могут быть помечены обнаруживаемой меткой с использованием испускающих флуоресценцию металлов, таких как 152Eu или других из ряда лантанидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких металлохелатирующих групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) или этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Методики конъюгирования различных частиц с антителом хорошо известны, см., например, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al, Antibodies For Drug Delivery в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), и Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)).
Бифункциональные молекулы и комбинированная терапия.
GPRC5D сверхэкспрессируется на определенных злокачественных гематологических клетках, таких как клетки множественной миеломы. Таким образом, антитела и фрагменты по настоящему изобретению могут использоваться для нацеливания на эти злокачественные клетки для их подавления, инактивации или разрушения. В некоторых вариантах осуществления представлена бифункциональная или биспецифическая молекула/антитело, которая нацеливается как на белок GPRC5D, так и на иммунную клетку.
В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Tклетки, B-клетки, моноцита, макрофага, нейтрофила, дендритной клетки, фагоцита, естественной клеткикиллера, эозинофила, базофила и мастоцита. Молекулы на иммунной клетке, на которые может осуществляться нацеливание, включают, например, CD3, CD16, CD19, CD28, CD64 и 4-1BB (также известный как CD137). Другие примеры включают PD-1, CTLA-4, LAG-3 (также известный как CD223), CD28, CD122, TIM3, OX-40 или OX40L, CD40 или CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM или BTLA (также известный как CD272), иммуноглобулиноподобные рецепторы клеток-киллеров (KIR) и CD47. Конкретные примеры биспецифичности включают без ограничения GPRC5D/CD3.
Также представлены различные форматы биспецифических антител. В некоторых вариантах осуществления каждый из фрагмента, специфического в отношении PD-L1, и второго фрагмента независимо выбран из Fab-фрагмента, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или однодоменного антитела. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело дополнительно содержит Fcфрагмент.
Полинуклеотиды, кодирующие антитела, и способы получения антител.
В настоящем изобретении также представлены выделенные полинуклеотиды или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела, их варианты или производные по настоящему изобретению. Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут кодировать полные вариабельные области тяжелой и легкой цепей антигенсвязывающих полипептидов, их вариантов или производных на одной и той же молекуле полинуклеотида или на отдельных молекулах полинуклеотида. Кроме того, полинуклеотиды по настоящему изобретению могут кодировать части вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антигенсвязывающих полипептидов, их вариантов или производных на одной и той же молекуле полинуклеотида или на отдельных молекулах полинуклеотида.
Способы создания антител хорошо известны в данной области техники и описаны в данном документе. В определенных вариантах осуществления как вариабельная, так и константная области антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению являются полностью человеческими. Полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием методик, описанных в данной области техники и описанных в данном документе. Например, полностью человеческие антитела к конкретному антигену можно получить путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано с обеспечением получения таких антител в ответ на антигенную стимуляцию, но эндогенные локусы которого были дезактивированы. Примеры методик, которые можно использовать для получения таких антител, описаны в патентах США 6150584, 6458592, 6420140, которые включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Способы лечения.
Как описано в данном документе, антитела, варианты или производные по настоящему изобретению можно использовать в определенных способах лечения и диагностики.
Настоящее изобретение дополнительно направлено на варианты терапии на основе антител, кото
- 13 048142 рые предусматривают введение антител по настоящему изобретению пациенту, такому как животное, млекопитающее и человек, для лечения одного или нескольких нарушений или состояний, описанных в данном документе. Терапевтические соединения по настоящему изобретению включают без ограничения антитела по настоящему изобретению (включая их варианты и производные, как описано в данном документе) и нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды, кодирующие антитела по настоящему изобретению (включая их варианты и производные, как описано в данном документе).
Антитела по настоящему изобретению также можно использовать для лечения или подавления рака. Как представлено выше, GPRC5D может сверхэкспрессироваться в раковых клетках, в частности, в клетках множественной миеломы. Было показано, что ингибирование GPRC5D является применимым для лечения форм рака.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления представлены способы лечения рака у пациента, нуждающегося в этом. В одном варианте осуществления способ включает введение пациенту эффективного количества антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из раковых клеток у пациента сверхэкспрессирует GPRC5D. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент является ADCC-компетентными. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент дополнительно содержит цитотоксическое средство. В некоторых вариантах осуществления антитело является биспецифическим, при этом оно дополнительно нацеливается на иммунную клетку, такую как цитотоксическая T-клетка.
В настоящем изобретении также представлены варианты клеточной терапии, такие как варианты терапии на основе T-клеток (или NK-клеток, макрофагов) с химерным антигенным рецептором (CAR). Можно применять подходящую клетку, которая приводится в контакт с антителом к GPRC5D по настоящему изобретению (или, альтернативно, сконструирована с обеспечением экспрессии антитела к GPRC5D по настоящему изобретению). После такого контакта или конструирования клетка может затем быть введена пациенту с раком, нуждающемуся в лечении. У пациента с раком может иметься рак любого из описанных в данном документе типов. Клетка (например, T-клетка) может представлять собой, например, без ограничения инфильтрирующий опухоль T-лимфоцит, CD4+ T-клетку, CD8+ T-клетку, естественную клетку-киллер (NK), макрофаг или их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления клетка была выделена из организма самого пациента с раком. В некоторых вариантах осуществления клетка была предоставлена донором или из банка клеток. Если клетка выделена из организма пациента с раком, нежелательные иммунные реакции могут быть минимизированы.
Неограничивающие примеры форм рака включают гематологические формы рака, такие как множественная миелома. Другие примеры включают варианты лейкоза (включая варианты острого лейкоза (например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз (включая миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз)) и варианты хронического лейкоза (например, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз)), и варианты лимфомы (например, лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома), и множественную миелому.
Конкретная дозировка и схема лечения для любого конкретного пациента будут зависеть от множества факторов, включая конкретные используемые антитела, их варианты или производные, возраст пациента, вес тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания, а также время введения, скорость выведения, комбинацию препаратов и тяжесть конкретного заболевания, которое лечат. Оценка таких факторов лицами, осуществляющими уход, находится в рамках обычной квалификации в данной области техники. Количество также будет зависеть от конкретного пациента, подлежащего лечению, пути введения, типа состава, характеристик используемого соединения, тяжести заболевания и требуемого эффекта. Используемое количество можно определить с помощью фармакологических и фармакокинетических принципов, хорошо известных в данной области техники.
Способы введения антител, вариантов включают без ограничения внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Антигенсвязывающие полипептиды или композиции можно вводить любым удобным путем, например путем инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или слизистокожные выстилки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т. д.), и их можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Таким образом, фармацевтические композиции, содержащие антигенсвязывающие полипептиды по настоящему изобретению, можно вводить перорально, ректально, парентерально, интрацистеально, интравагинально, внутрибрюшинно, наружно (в виде порошков, мазей, капель или чрескожных пластырей), трансбуккально или в виде пероральных или назальных спреев.
Термин парентеральный, используемый в данном документе, относится к способам введения, которые включают внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрастернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию.
Введение может быть системным или местным. Кроме того, может требоваться введение антител по настоящему изобретению в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая внут
- 14 048142 рижелудочковую и подоболочечную инъекцию; при этом внутрижелудочковая инъекция может осуществляться с помощью внутрижелудочкового катетера, например, прикрепленного к резервуару, такому как резервуар Оммая. Также можно применять ингаляционное введение, например путем применения ингалятора или распылителя и состава с аэрозольным средством.
Может требоваться местное введение антигенсвязывающих полипептидов или композиций по настоящему изобретению в область, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например без ограничения местной инфузией во время операции, наружным применением, например в сочетании с перевязкой после операции, инъекцией, с помощью катетера, с помощью суппозитория или с помощью имплантата, при этом указанный имплантат изготовлен из пористого, непористого или желеобразного материала, включая мембраны, такие как мембраны или волокна из силастика. Предпочтительно при введении белка, включая антитело, по настоящему изобретению необходимо соблюдать осторожность и использовать материалы, на которых белок не абсорбируется.
Количество антител по настоящему изобретению, которое будет эффективным для лечения, подавления и предупреждения воспалительного, иммунного или злокачественного заболевания, нарушения или состояния, можно определить с помощью стандартных клинических методик. Кроме того, для определения оптимального диапазона дозировок могут использоваться анализы in vitro. Точная доза, которая будет использоваться в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности заболевания, нарушения или состояния и должна определяться в соответствии с решением лечащего врача и особенностями каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости дозаответ, полученных с помощью тест-систем in vitro или в модельных животных.
Как правило, вводимая пациенту дозировка антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению обычно составляет от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг веса тела пациента, от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг веса тела пациента или от 1 мг/кг до 10 мг/кг веса тела пациента. Как правило, антитела человека характеризуются более продолжительным временем полужизни в организме человека, чем антитела из других видов вследствие иммунного ответа на чужеродные полипептиды. Таким образом, во многих случаях возможно применение более низких дозировок антител человека и меньшая частота введения. Дополнительно, дозировка и частота введения антител по настоящему изобретению могут быть снижены за счет усиления поглощения антител и их проникновения в ткани (например, в головной мозг), обеспечиваемых модификациями, такими как, например, липидирование.
В дополнительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят в комбинации с цитокинами. Цитокины, которые можно вводить с композициями по настоящему изобретению, включают без ограничения IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, средство, специфическое в отношении CD40, CD40L, и TNF-α.
В дополнительных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению вводят в сочетании с другими терапевтическими или профилактическими схемами, такими как, например, лучевая терапия.
Способы диагностики.
Сверхэкспрессия GPRC5D наблюдается в определенных образцах опухолей, и пациенты, у которых имеются клетки со сверхэкспрессией GPRC5D, вероятно, будут восприимчивыми к лечению антителами к GPRC5D по настоящему изобретению. Соответственно, антитела по настоящему изобретению также можно использовать для диагностических и прогностических целей.
Образец, который предпочтительно предусматривает клетку, может быть получен из организма пациента, который может представлять собой пациента с раком или пациента, которому требуется постановка диагноза. Клетка представляет собой клетку опухолевой ткани или опухолевого блока, образца крови, образца мочи или любого образца из организма пациента. После необязательной предварительной обработки образца образец можно инкубировать с антителом по настоящему изобретению в условиях, позволяющих антителу взаимодействовать с белком GPRC5D, потенциально присутствующим в образце. Для обнаружения присутствия белка GPRC5D в образце можно использовать такие способы, как ELISA, используя преимущество антитела к GPRC5D.
Присутствие белка GPRC5D в образце (необязательно с указанием количества или концентрации) можно использовать для диагностики рака, в качестве индикатора того, что пациент подходит для лечения антителом, или в качестве индикатора того, что пациент ответил (или нет) на лечение рака. В случае прогностического способа обнаружение может быть выполнено один, два или больше раз на определенных стадиях после начала лечения рака для определения прогресса лечения.
Композиции.
В настоящем изобретении также представлены фармацевтические композиции. Такие композиции содержат эффективное количество антитела и приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит второе противораковое средство (например, ингибитор контрольной точки иммунного ответа).
В конкретном варианте осуществления термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регулирующим ведомством федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более
- 15 048142 конкретно у человека. Дополнительно, фармацевтически приемлемый носитель обычно представляет собой нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное средство для составления любого типа.
Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или наполнителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т. п. Вода является предпочтительным носителем, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т. п. Если это требуется, композиция может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих средств или буферизующих средств для регулирования pH, таких как ацетаты, цитраты или фосфаты.
Также предусмотрены антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т. п. Композицию также можно составлять в виде суппозитория с традиционными связывающими средствами и носителями, такими как триглицериды. Состав для перорального применения может содержать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т. д. фармацевтического качества. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martin, включенной в данный документ посредством ссылки. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество антигенсвязывающего полипептида, предпочтительно в очищенной форме, вместе с носителем в количестве, подходящем для обеспечения формы для надлежащего введения пациенту. Состав должен соответствовать способу введения. Препарат для парентерального применения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика.
В одном варианте осуществления композиция составлена в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты доставляются либо по отдельности, либо в виде смеси друг с другом в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Если композиция предназначена для введения путем инфузии, она может быть помещена в инфузионный флакон, содержащий стерильную воду фармацевтической чистоты или физиологический раствор. Если композицию вводят путем инъекции, может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, чтобы можно было смешать ингредиенты перед введением.
Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные с анионами, такие как производные соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т. д., и соли, образованные с катионами, такие как производные натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т. д.
Примеры
Пример 1. Получение моноклональных антител мыши к GPRC5D человека.
Белок GPRC5D человека использовали для иммунизации различных линий мышей и соответственно получали гибридомы. Для дальнейшего анализа было собрано более двадцати клонов гибридом.
Антитела, собранные из супернатантов гибридом, тестировали в отношении их связывания с белком GPRC5D человека, экспрессированным на клетках CHO K1. Клетки CHO-K1, стабильно экспрессирующие GPRC5D человека, собирали из колб. По 100 мкл клеток в количестве 1х 106 клеток/мл инкубировали с антителами мыши в 3-кратных серийных разведениях в течение 30 минут на льду. После двукратной промывки с помощью 200 мкл буфера FACS клетки инкубировали со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. Клетки дважды промывали с помощью 200 мкл буфера FACS, переносили в пробирку BD Falcon вместимостью 5 мл и анализировали с помощью FACS. Результаты исследования показали, что антитела мыши могут связываться с GPRC5D человека с высокой EC50 (фиг. 1). Результаты представлены в таблице ниже. Все они проявляли хорошую связывающую активность.
- 16 048142
Минимальн ое значение Максимальн ое значение LogEC 50 Угловой коэффицие нт Хилла ЕС50 Интерв ал
2D3C12 46110 835137 0,4535 1,132 2,841 789027
6G10D9 6870 1429638 0,9116 0,9535 8,159 1422768
11С1Н10 40235 859162 0,5274 1,101 3,368 818927
14С2А11С6 5573 728662 0,9934 0,8801 9,849 723089
14C2F7C6 15616 751279 0,9634 0,9615 9,193 735663
14F3H2 20428 872785 0,8744 1,146 7,489 852357
21СЗС11ВЗ 57013 1508205 0,6538 1Д 4,506 1451192
26E1D12 52742 677713 0,2246 1,303 1,677 624970
29A7H11B9D 3 71394 1385928 0,4219 1,259 2,642 1314534
29А7Н11Н4С 12 43439 1461931 0,7377 1,109 5,466 1418492
29В2С10 68634 1607305 0,6201 1,305 4,17 1538671
31Н11С10Н7 16791 961550 0,9534 1,134 8,983 944759
34D3F8B5 -16109 1407656 1,084 0,7475 12,12 1423765
34D3H1 -13314 1412131 0,8843 0,8042 7,662 1425446
34D4A10 2737 921851 1,019 0,8496 10,44 919114
36F11E9H3 13852 766682 0,8732 1,087 7,468 752830
37В9С4 10880 1758861 0,5917 0,9933 3,906 1747981
38А10Е9А11 24016 1785041 0,9472 1,099 8,854 1761025
39D2B6 7833 1774093 0,5469 0,98 3,523 1766260
40А5В2 25394 1196144 0,5108 0,9236 3,242 1170750
57G11D4A10 -22363 2089505 0,9703 0,8141 9,34 2111868
58F9G10 -14744 2052463 0,9635 0,8313 9,194 2067207
Четырнадцать гибридом были субклонированы и были определены последовательности VH/VL (см. табл. 1).
Таблица 1
Последовательность VH/VL лидерных антител мыши
Название Последовательность (CDR подчеркнуты) SEQ ID NO:
6G10D9 VH OVOLOOSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYT MHWVKORPGOGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFK DKATLTAGKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASL RSRGYFDYWGOGTTLTVS S 1
6G10D9 VL DIVMTOSOTFMSTSVGDRVRITCKASQNVGTAVV WYOQKTGOSPRLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNMOSEDLADFFCOQYSSYPYTFGGGTK LEIK 2
21СЗС11ВЗ VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFINYLIE WIKQRPGOGLEWIGMINPGSGGTNYNEKFKDKA TLTADKSSSTAYMOLSSLTSDDSAVYFCARNWDV WGQGTTLTVSS 3
21СЗС11ВЗ VL DVVMTOSPLSLPVSLGDOASVSCRSSQSLVHSTG NTYLHWYLOKPGO SPKLLIYKVSNRFSGVPDRF S 4
- 17 048142
GSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTF GGGTKLEIK
29B2C10 VH EVOLOQSGPELVKPGASMKLSCKASGYSFTGYTM HWVKQSHGENLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKG KATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCSRWG LRRAMDYWGOGTSVTVSS 5
29B2C10 VL DIVMTOSOKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGSNV AWYOQKPGOSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGNGS GTDFTLTISNVOSEDLAEYFCOQYYNSPWTFGGG TKLEIK 6
34D3H1 VH EVHLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGM SWVROTPDKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLNLQMS SLKSEDT AMYYC ARQGG DAMDYWGOGTSVTVSS 7
34D3H1 VL DIVLFOSPATLSVFPGDSVSLSCRASQSINNNLHW YOQKSHESPRLLIKYASOSISGIPSRFSGSGSGTDFT LSINSVETEDFGMYFCOQSNSRLTFGAGTKLELK 8
37B9C4 VH EVNLEESGGGL VQPGGSMKL SC VASGFTF SDYW MNWVROSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESV KGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRP LLWFRRYYAMDYWGOGTSVTVSS 9
37B9C4 VL DIQMTQTTS SLS ASLGDRITISCSASQGISNYLNWY OQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDY SLTISNLEPADIATYYCQQYSKLPFTFGSGTKLEIK 10
38A10E9A11 VH OVOLOQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYT MHWVKORPGOGLEWIGYINPSSGYTNYNQKFKD KATLTAGKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASLRS RGYFDYWGRGTTLTVSS 11
38A10E9A11 VL DIVMTOSOKFLSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVA WYQQKPGQ SPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNMOSEDLAGYFCOQYSSYPYTFGGGTK LEIK 12
- 18 048142
40A5B2 VH EVOLOQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRNIM HWVKQKPGOGLEWIGYINPYNAGSKYNEKFKG KATLTSDIS S STAYMELSSLTSEDSAVYYCAREEV YYRYGAWFAYWGHGTLVTVSA 13
40A5B2 VL DIVLTOSPASLAVSLGORATISCRASQSVSTSSYSY MHWYOQKPGOPPKLLIKYASNLESGVPARF SGSG SGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPRTFGGG TKLEIK 14
58F9G10 VH EVOLOQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFTGYYIH WVKOSHGKSLEWIGYISCYNGATSFNQKFKGKA TFTVDTSSSTAYMQFNSLTSEDSAVYYCARTELR GPWFAYWGOGTLVTVSA 15
58F9G10 VL QTVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNW YOQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTS YSLTIS SMEAED AATYYCQQWSNNPLTFGAGTKL ELK 16
2D3C12 VH OVOLOOSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFINYLIE WIKQRPGOGLEWIGMINPGSGGTNYNEKFKDKA TLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARNWDV WGQGTTLTVSS 17
2D3C12 VL DVVMTOSPLSLPVSLGDOASVSCRSSQSLVHSTG NTYLHWYLQKPGO SPKLLIYKVSNRFSGVPDRF S GSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTF GGGTKLEIK 18
14C2A11C6 VH OVHLOQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYT MHWVKORPGOGLEWIGYINPNSAYTNYNQKFK DKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARR VLLLRVLDFFDYWGOGTTLTVS S 19
14C2A11C6 VL DVOITOSPSYLAASPGETITINCRASKSINKYLTWY QEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGSDFT LTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGTGTKLELK 20
14F3H2 VH EVOLOQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTM NWVKOSHGKNLEWIGLINPYNGGIRYNQKFKGK 21
- 19 048142
ATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARWGL RRAMDYWGOGTSVTVS S
14F3H2 VL DIVMTOSOKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNV AWYQQKPGOSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGS GTDFTLTISNVOSEDLAEYFCOQYNSSPWTFGGGT KLEIK 22
26E1D12 VH EVOLOQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTM NWVKOSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKG KATLAVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCSRWG LRRAMDYWGOGTSVTVSS 23
26E1D12 VL DIVMTOSOKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGSNV AWYOQKPGOSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGS GTDFTLTISNVOSEDLAEYFCOQYNNSPWTFGGG TKLEIK 24
29А7Н11Н4С12 VH EVOLOQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTM HWVKOSHGENLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKG KATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCSRWG LRRAMDYWGOGTSVTVSS 25
29А7Н11Н4С12 VL DIVMTOSOKFMSTSIGDRVSVTCKASQNVGSNVA WYOQKPGOSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGNGSG TDFTLTISNVOSEDLAEYFCOQYYNSPWTFGGGT KLEIK 26
34D4A10 VH OVOLOOSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFISYLIE WIKQRPGOGLEWIGMINPGSGGTNYNEKFKDKA TLTADKSSSTAYMOLSSLTSDDSAVYFCARNWDV WGQGTTLTVSS 27
34D4A10 VL DVVMTOSPLSLPVSLGDOASVSCRSSQSLVHSTG NTYLHWYLQKPGO SPKLLIYKVSNRFSGVPDRF S GSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTF GGGTKLEIK 28
Пример 2. Связывание химерных антител с GPRC5D.
Г ены VH и VK мыши были получены синтетическим путем, а затем соответственно клонированы в векторы, содержащие константные домены гамма-1 и каппа человека. Очищенные химерные антитела получали из трансфицированных клеток CHO.
Клетки CHO-K1, стабильно экспрессирующие GPRC5D человека, собирали из колб. По 100 мкл клеток в количестве 1 х106 клеток/мл инкубировали с первичными химерными антителами в 3-кратных серийных разведениях, начиная с 300 нМ до 0,001 нМ, в течение 30 минут на льду. После двукратной промывки с помощью 200 мкл буфера FACS клетки инкубировали со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. Клетки дважды промывали с помощью 200 мкл буфера FACS, переносили в пробирку BD Falcon вместимостью 5 мл и анализировали с помощью FACS. Результаты исследования показали, что химерные антитела могут связываться с GPRC5D человека с высокой EC50 (фиг. 2).
Результаты представлены в таблице ниже.
- 20 048142
Минимальн ое значение Максимальн ое значение LogEC5 0 Угловой коэффицие нт Хилла ЕС50 Интерва л
58F9G10 -521,8 414579 0,3596 0,8258 2,289 415101
40А5В2 1487 440269 0,3436 0,8189 2,206 438781
38А9Е10А 11 3016 386984 0,2453 1,037 1,759 383968
37В9С4 2078 405062 0,249 1,045 1,774 402985
34D3H1 3448 507844 0,5214 1,012 3,322 504396
29В2С10 4326 430443 0,342 1,041 2,198 426116
21СЗС11В 3 5774 403938 0,2293 1,286 1,696 398164
6G10D9 6886 458124 0,1012 1,343 1,262 451238
Пример 3. EC50 интернализации для химерных антител к GPRC5D на клетках CHO-GPRC5D.
Красители pHAb представляют собой чувствительные к pH красители, которые характеризуются очень низкой флуоресценцией при pH > 7 и резким увеличением флуоресценции, когда pH раствора становится кислым. Красители pHAb характеризуются максимумом возбуждения (Ex) при 532 нм и максимумом излучения (Em) при 560 нм. Антитела, конъюгированные с красителем pHAb, можно использовать для мониторинга интернализации антител, опосредованной рецептором. Когда конъюгат антителокраситель pHAb связывается со своим рецептором на клеточной мембране, он проявляет минимальную флуоресценцию. Однако при интернализации, опосредованной рецептором, конъюгаты антителокраситель pHAb перемещаются к эндосомальным и лизосомальным везикулам, где pH является кислым, вызывая флуоресценцию красителя pHAb. Эта флуоресценция может быть обнаружена с использованием различных методик, включая визуализацию клеток, проточную цитометрию и флуоресцентные ридеры на основе планшетов с соответствующими фильтрами.
Стабильно трансфицированные клетки GPRC5D CHO человека собирали с помощью 0,05% трипсина/ЭДТА (Gibco, 25300-054) и высевали в 96-луночный черный планшет (Thermo Scientific, № 165305) при плотности 10000 на 90 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 20-24 ч перед обработкой антителами, мечеными с помощью pHAb.
Для интернализации к клеткам в разных количествах добавляли химерные антитела GPRC5D, конъюгированные с pHAb, и осторожно перемешивали в течение 1-2 мин на перемешивающем устройстве для планшетов, а затем инкубировали в течение ночи для обеспечения интернализации (интернализация может быть обнаружена через несколько часов). Планшеты считывали на флуоресцентном планшетридере при Ex/Em: 532 нм/560 нм на Tecan Infinite M1000 Pro. Для достижения более высокой чувствительности среду перед считыванием планшета заменяли на PBS.
Результаты, нормализованные с помощью DAR, показаны на фиг. 3. Как показано на фиг. 3, протестированные химерные антитела характеризуются сильной активностью интернализации.
Пример 4. Тестирование антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).
В ADCC Reporter Bioassay используется альтернативное считывание на более ранней стадии активации пути ADCC MOA: активация транскрипции гена посредством пути NFAT (ядерный фактор активированных T-клеток) в эффекторной клетке. Кроме того, в ADCC Reporter Bioassay используются сконструированные клетки Jurkat, стабильно экспрессирующие рецептор FcYRIIIa, вариант VI58 (высокая аффинность), и элемент ответа NFAT, управляющий экспрессией люциферазы светлячка, в качестве эффекторных клеток. Биологическую активность антител в ADCC MOA количественно определяют с помощью люциферазы, продуцируемой в результате активации пути NFAT; активность люциферазы в эффекторной клетке количественно оценивают с помощью считывания люминесценции. Сигнал высокий, а фоновый уровень анализа низкий.
Серийные разведения химерного моноклонального антитела к GPRC5D инкубировали в течение 6 часов после индукции при 37°C со сконструированными эффекторными клетками Jurkat (эффекторными клетками ADCC Bioassay) с клетками-мишенями ADCC Bioassay (GPRC5D) или без них. Активность люциферазы определяли количественно с использованием реагента Bio-Glo™ (на фиг. 4). Все протестированные антитела проявляли мощную способность индуцировать ADCC.
Пример 5. Гуманизация mAb мыши.
Гены вариабельной области антител мыши использовали для создания гуманизированных mAb. На первой стадии этого способа аминокислотные последовательности VH и VL mAb сравнивали с последовательностями в доступной базе данных последовательностей генов Ig человека, чтобы найти последовательности генов Ig зародышевой линии человека в целом с наилучшим совпадением.
Аминокислотные последовательности гуманизированного антитела представлены ниже.
- 21 048142
Г уманизированные последовательности.
A. 34D3H1.
Таблица 2A
Гуманизация 34D3H1 - VH
Название Последовательность SEQ ID NO:
34D3H1 VH EVHLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGM SWVROTPDKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLNLQMSSLKSEDTAMYYCARQGG DAMDYWGOGTSVTVSS 7
VI (пересадка CDR) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMS WVROAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGG DAMP YWGQGTL VTVS S 35
V2 (с обратным и мутациям и) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC AASGFTF S S YGMS WVRQTPGKGLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCARQGGDA MD YWGQGTL VT VS S 36
V3 (с обратным и мутациям и) EVHLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMS WVRQTPGKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLNLQMSSLRAEDTAVYYCARQGGDA MD YWGQGTL VTVS S 37
Таблица 2B
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-H1 SYGMS 29
CDR-H2 TISSGGSYTYYPDSVKG 30
CDR-H3 QGGDAMDY 31
Таблица 2C Гуманизация 34D3H1 - VL
Название Последовательность SEQID NO:
VL 34D3H1 DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSINNNLHW YOOKSHESPRLLIKYASOSISGIPSRFSGSGSGTDFT LSINSVETEDFGMYFCOOSNSRLTFGAGTKLELK 8
VI (пересадка CDR) DIQMTQ SPSSLSASVGDRVTITCRASOSINNNLHW YOOKPGKAPKLLIYYASOSISGVP SRF SGSGSGTDF TLTISSLOPEDFATYYCOOSNSRLTFGGGTKVEIK 38
V2(c обратным и мутациям и) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINNNLHW YQQKPGKAPKLLIYYASQSISGIPSRFSGSGSGTDF TLTISSVQPEDFATYFCQQSNSRLTFGGGTKVEIK 39
V3 (с обратным и мутациям и) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINNNLHWY QQKPGKSPKLLIYYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTL TISSVQPEDFATYFCQQSNSRLTFGGGTKLEIK 40
- 22 048142
V4 (с обратным и мутациям и) DIVLTQ SP S SLS V S VGDRVTLTCRASQ SINNNLHW YQQKPGKSPKLLIYYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFT LTISSVQPEDFATYFCQQSNSRLTFGGGTKLEIK 41
Таблица 2D
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-L1 RASQSINNNLH 32
CDR-L2 YASQSIS 33
CDR-L3 QQSNSRLT 34
Таблица 2E
Гуманизи рованные антитела
VL vl VL v2 VL v3 VL v4 VL
VH 34-XI
vl VH 34-H1L1 34-H1L2 34-H1L3 34-H1L4
v2 VH 34-H2L1 34-H2L2 34-H2L3 34-H2L4
v3 VH 34-H3L1 34-H3L2 34-H3L3 34-H3L4
B. 37B9C4.
Таблица 3A
Гуманизация 37B9C4 - VH
Название Последовательность SEQ ID NO:
VH 37B9C4 EVNLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQ SPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESV KGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRP LLWFRRYYAMDYWGOGTSVTVSS 9
Vl (пересадка CDR) EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWM NWVROAPGKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR PLLWFRRYYAMDYWGOGTLVTVSS 48
V2(c обратным и мутациям и) V3 (с обратным и мутациям и) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWM NWVRQSPGI<GLEWVAEIRL1<SNNYATHYAESVI< GRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPL LWFRRYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWM NWVRQSPGI<GLEWVAEIRL1<SNNYATHYAESVI< GRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPL LWFRRYYAMDYWGQGTLVTVSS 49 50
Таблица 3B
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-H1 DYWMN 42
CDR-H2 EIRLKSNNYATHYAESVKG 43
CDR-H3 PLLWFRRYYAMDY 44
- 23 048142
Таблица 3C Гуманизация 37B9C4 - VL
Название Последовательность SEQID NO:
37В9С4 DIOMTOTTSSLSASLGDRITISCSASOGISNYLNWY 10
VL OQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDY SLTISNLEPADIATYYCQQYSKLPFTFGSGTKLEIK
VI DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCSASOGISNYLNW 51
(пересадка YOOKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTD
CDR) FTLTISSLQPEDFATYYCOQYSKLPFTFGOGTKLEI К
V2 (с DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNW 52
обратным YQQKPGKTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTD
и YTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPFTFGQGTKLEI
мутациям и) К
V3 (с DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCSASQGISNYLNWY 53
обратным OQKPGKTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDY
и мутациям и) TLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPFTFGSGTKLEIK
Таблица 3D
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-L1 SASQGISNYLN 45
CDR-L2 YTSSLHS 46
CDR-L3 QQYSKLPFT 47
Таблица 3E
Гуманизированные антитела
VL vl VL v2 VL v3 VL
VH 37B9C4-XI
vl VH 37-H1L1 37-H1L2 37-H1L3
v2 VH 37-H2L1 37-H2L2 37-H2L3
v3 VH 37-H3L1 37-H3L2 37-H3L3
- 24 048142
C. 58F9G10.
Таблица 4A Гуманизация 58F9G10 - VH
Название Последовательность SEQ ID NO:
VH 58F9G10 EVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFTGYYIH WVKOSHGKSLEWIGYISCYNGATSFNQKFKGKA TFTVDTSSSTAYMQFNSLTSEDSAVYYCARTELR GPWFAYWGQGTLVTVSA 15
VI (пересадка CDR) OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVROAPGOGLEWMGYISSYNAATSFNQKFKG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARTE LRGPWF AYWGQGTL VTVS S 61
V2 (с обратным и мутациям и) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQGLEWIGYISSYNAATSFNQKFKGRV TFTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARTELRG PWF AYWGQGTL VT VS S 62
V3 (с обратным и мутациям и) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVKQAPGQGLEWIGYISSYNAATSFNQKFKGRV TFTVDTSTSTVYMEFSSLRSEDTAVYYCARTELRG PWF AYWGQGTL VTVS S 63
V4 (с обратным и мутациям и) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYIH WVKQAPGQGLEWIGYISSYNAATSFNQKFKGRAT FTVDTSTSTAYMEFSSLRSEDSAVYYCARTELRGP WF AYWGQGTL VTVS S 64
Таблица 4B
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-H1 GYYIH 54
CDR-H2 YISCYNGATSFNQKFKG YISSYNAATSFNQKFKG 60 55
CDR-H3 TELRGPWFAY 56
- 25 048142
Название Таблица 4C Гуманизация 58F9G10 - VL Последовательность SEQ ID NO:
58F9G10 VL OTVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNW YOQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTS YSLTIS SMEAED AATYYCQQWSNNPLTFGAGTKL ELK 16
VI (пересадка CDR) DIOMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWY OQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDF TLTIS SLQPEDF AT YYCQQWSNNPLTFGOGTKLEI К 65
V2 (с обратным и DTQMTQ SP S SL S AS VGDRVTITC SASS S VS YMNWY QQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDY TLTISSLQPEDFATYYCQQWSNNPLTFGQGTKLEIK 66
мутациям и)
V3 (с обратным и мутациям и) DTQLTQSPSSLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNW YQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTD YTLTISSMQPEDFATYYCQQWSNNPLTFGQGTKLE IK 67
Таблица 4D
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-L1 SASSSVSYMN 57
CDR-L2 DTSKLAS 58
CDR-L3 QQWSNNPLT 59
Таблица 4E Гуманизированные антитела
VL vl VL v2 VL V3 VL
VH 58F9G10-XI
vl VH 58-H1L1 58-H1L2 58-H1L3
v2 VH 58-H2L1 58-H2L2 58-H2L3
v3 VH 58-H3L1 58-H3L2 58-H3L3
v4 VH 58-H4L1 58-H4L2 58-H4L3
D. 6G10D9
Таблица 5A
Гуманизация 6G10D9- VH
Название Последовательность SEQ ID NO:
VH 6G10D9 OVOLOQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYT MHWVKORPGOGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFK DKATLTAGKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASL RSRGYFDYWGOGTTLTVS S 1
Vl (пересадка CDR) 0 VOLVO SGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYT MHWVROAPGOGLEWMGYINPSSGYTNYNQKFK 74
- 26 048142
DRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCSRL RSRGYFDYWGOGTLVTVSS
V2 (с обратным и мутациям и) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYTM HWVRQAPGQGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFKDR VTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLRS RGYFD YWGQGTL VT VS S 75
V3 (с обратным и мутациям и) QVQLVQSGAEVAKPGASVKVSCKASGYTFTTYTM HWVKQAPGQGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFKDR VTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLRSR GYFD YWGQGTL VT VS S 76
V4 (с обратным и мутациям и) QVQLVQSGAEVAKPGASVKMSCKASGYTFTTYT MHWVKQAPGQGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFKD RVTLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLRS RGYFD YWGQGTLLTVSS 77
V5 (с обратным и мутациям и) QVQLQQSGAEVAI<PGASVI<MSCT<ASGYTFTTYT MHWVKQRPGQGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFKD RVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLRS RGYFD YWGQGTLLTVSS 78
V6 (с обратным и мутациям и) QVQLQQSGAEVAI<PGASVI<MSCT<ASGYTFTTYT MHWVKQRPGQGLEWLGYINPSSGYTNYNQKFKD RATLTAGKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLRS RGYFD YWGQGTLLTVSS 79
Таблица 5B
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-H1 TYTMH DOI
CDR-H2 YINPS SGYTNYNQKFKD D02
CDR-H3 LRSRGYFDY D03
- 27 048142
Таблица 5C
Гуманизация 6G10D9 - VL
Название Последовательность SEQ ID NO:
6G10D9 VL DIVMTQSOTFMSTSVGDRVRITCKASQNVGTAVV WYQQKTGOSPRLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNMQSEDLADFFCOQYSSYPYTFGGGTK LEIK 2
VI (пересадка CDR) DIQLTQ SP SFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVVW YQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLOPEDFATYYCOQYSSYPYTFGOGTKLEI К 80
V2(c обратным и мутациям и) DIQLTQ SPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGTAVVW YQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPEDFATFYCQQYSSYPYTFGQGTKLEIK 81
V3 (с обратным и мутациям и) DIQMTQ SP SFL ST S VGDRVTITCK ASQNVGT AVV WYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSMQPEDFATFFCQQYSSYPYTFGQGTKLE IK 82
V4 (с обратным и мутациям и) DIVMTQ SP SFL ST S VGDRVTITCK ASQNVGT AVV WYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGT EFTLTISSMQPEDFATFFCQQYSSYPYTFGGGTKLE IK 83
Via (версия а пересадки CDR) EIVMTOSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTAVV WYQQKPGQ APRLLIYSASNRYTGIPARF SGSGSGT EFTLTISSLOSEDFAVYYCOQYSSYPYTFGOGTKL EIK 84
V2a(c обратным и мутациям и) EIVMTQSPATLSTSPGERATLSCKASQNVGTAVV WYQQKPGQSPRLLIYSASNRYTGIPDRFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVFFCQQYSSYPYTFGQGTKLE IK 85
V3a(c обратным и мутациям и) EIVMTQSPATLSTSPGERVTISCKASQNVGTAVVW YQQKPGQSPRLLIYSASNRYTGIPDRFTGSGSGTDF TLTIS SMQSEDF AVFFCQQ YS S YPYTFGGGTKLEIK 86
Таблица 5D
Последовательности CDR
CDR Последовательность SEQ ID NO:
CDR-L1 KASQNVGTAVV 71
CDR-L2 SASNRYT 72
CDR-L3 OOYSSYPYT 73
- 28 048142
Таблица 5E Гуманизированные антитела
VL vl VL v2 VL v3 VL v4 VL via VL v2a VL v3a VL
VH 6G10D9- XI
vl VH 6- H1L1 6- H1L2 6- H1L3
v2 VH 6- H2L1 6- H2L2 6- H2L3
v3 VH 6- H3L1 6- H3L2 6- H3L3
v4 VH 6- H4L1 6- H4L2 6- H4L3
v5 VH
v6 VH
Пример 6. Тестирование гуманизированных антител.
В этом примере тестировали некоторые гуманизированные антитела в отношении способности связываться с GPRC5D, экспрессируемым на клетках CHO-K1.
Из протестированных гуманизированных антител, антитела, происходящих из 6G10D9, 6-H2L1 и 6H3L3, превзошли другие (фиг. 5, табл. 6).
Таблица 6
Показатели активности гуманизированных антител из 6G10D9 в отношении связывания GPRC5D
Минимально e значение Максимально e значение LogEC5 0 Угловой коэффициен т Хилла ЕС50 Интерва л
6G10D9 -XI 6858 121725 0,2992 1,525 1,991 114867
6-H1L1 192,6 -6397 -3,102 1,198 - 1264 -6205
6-H1L2 191,9 898894 5,224 1Д9 16763 9 898702
6-H1L3 226,2 16478302 5,389 1,156 24479 0 16478076
6-H2L1 189,1 661560 5,039 1,232 10929 4 661371
6-H2L2 192,5 1271084 5,37 1,191 23436 4 1270892
6-H2L3 215,7 10592380 5,039 1,23 10927 9 10592164
6-H3L1 -205,1 74293 2,352 0,8392 225,1 74498
6-H3L2 68,94 47463 2,244 0,9532 175,3 47394
6-H3L3 3994 119304 0,9553 1,13 9,022 115310
6-H4L1 61,5 50293 1,654 0,9277 45,05 50231
6-H4L2 9,56 39449 1,976 0,911 94,63 39440
6-H4L3 2344 126413 0,9049 1,052 8,033 124069
Как показано на фиг. 6 и в табл. 7, оказалось, что все гуманизированные версии 58F9G10 обладают хорошими характеристиками.
- 29 048142
Таблица 7
Показатели активности гуманизированных антител из 58F9G10 в отношении связывания GPRC5D
Минимальн ое значение Максимальн ое значение LogEC5 0 Угловой коэффициен т Хилла ЕС50 Интерва л
58F9G10 -XI 6697 127349 0,2925 1,292 1,961 120652
58-H1L1 15047 107881 0,2519 1,342 1,786 92834
58-H1L2 5500 114432 0,2632 1,238 1,833 108932
58-H1L3 4227 105346 0,2308 1,14 1,701 101119
58-H2L1 3617 109672 0,3776 1,064 2,386 106055
58-H2L2 4837 107888 0,3448 1,091 2,212 103050
58-H2L3 1229 91713 0,2697 0,9633 1,861 90483
58-H3L1 9887 103663 -0,1918 1,382 0,643 93776
58-H3L2 5981 105458 0,3742 1,195 2,367 99476
58-H3L3 4022 97718 0,3177 1,105 2,078 93695
58-H4L1 4993 104559 0,3655 1,179 2,32 99566
58-H4L2 4600 105051 0,3407 1,143 2,191 100451
58-H4L3 6249 102650 0,2874 1,27 1,938 96401
Аналогично, как показано на фиг. 7 ив табл. 8, оказалось, что все гуманизированные версии 34D3H1 обладают хорошими характеристиками, сравнимыми с химерным антителом.
Таблица 8
Показатели активности гуманизированных антител из 34D3H1 в отношении связывания GPRC5D
Минимально е значение Максимально е значение LogEC5 0 Угловой коэффициен т Хилла ЕС50 Интерва л
34-XI 16525 192054 0,4947 1,454 3,124 175530
34- H1L1 10921 196570 0,5908 1,314 3,898 185650
34- H1L2 13856 182030 0,5836 1,436 3,834 168174
34- H1L3 10620 185840 0,5732 1,167 3,743 175220
34- H1L4 10299 188925 0,5999 1,195 3,98 178626
34- H2L1 7854 187153 0,6188 1,173 4,157 179298
34- H2L2 8736 178873 0,6254 1,118 4,221 170137
34- H2L3 7063 185842 0,5832 1,И 3,83 178779
34- H2L4 4393 192405 0,6092 1,041 4,066 188012
34- H3L1 11139 178248 0,5207 1,228 3,317 167109
34- H3L2 9036 179809 0,6464 1,146 4,43 170773
34- H3L3 9118 192976 0,6508 1,1 4,475 183858
34- H3L4 12751 192533 0,5981 1,263 3,963 179782
Также как показано на фиг. 8 и в табл. 9, оказалось, что все гуманизированные версии 37B9C4 обладают хорошими характеристиками, сравнимыми с химерным аналогом.
- 30 048142
Таблица 9
Показатели активности гуманизированных антител из 37B9C4 в отношении связывания GPRC5D
Минимальное значение Максимальное значение LogEC50 Угловой коэффициент Хилла ЕС50 Интервал
37В9С4 -XI 11711 188479 0,2364 1,502 1,723 176769
37- H1L1 9596 178413 0,3574 1,613 2,277 168817
37- H1L2 8848 181865 0,3502 1,534 2,24 173017
37- H1L3 10445 173229 0,2332 1,528 1,711 162784
37- H2L1 9184 175072 0,351 1,583 2,244 165888
37- H2L2 9383 175293 0,3455 1,656 2,216 165910
37- H2L3 8049 168032 0,3334 1,564 2,155 159982
37- H3L1 6372 179261 0,2921 1,35 1,96 172889
37- H3L2 9193 179304 0,3153 1,428 2,067 170111
37- H3L3 7780 181053 0,2846 1,305 1,926 173273
На основании приведенных выше данных, гуманизированные антитела 6-H3L3, 6-H4L3, 58-H1L1, 58-H3L1, 34-H1L1 и 37-H1L1 были отобраны для дальнейшего подтверждающего тестирования.
Пример 7. Подтверждающее тестирование отобранных гуманизированных антител.
В этом примере тестировали некоторые гуманизированные антитела (6-H3L3, 6-H4L3, 58-H1L1, 58H3L1, 34-H1L1 и 37-H1L1) в отношении их способности связываться с белком GPRC5D человека, экспрессированным на клетках CHO-K1 и NCI-H929.
Данные связывания с CHO-K1 представлены на фиг. 9 и обобщены в табл. 10 ниже.
Таблица 10
Связывание с GPRC5D на клетках CHO-K1
Минимально е значение Максимально е значение LogEC5 0 Угловой коэффициен т Хилла ЕС50 Интерва л
6-XI 523,9 104077 0,4723 1,095 2,967 103553
58-XI 52,25 107000 0,5562 0,9481 3,599 106948
6- H3L3 172 134045 1,412 0,8045 25,82 133873
6- H4L3 109,4 145833 1,421 0,7392 26,34 145724
58- H1L1 275,4 99454 0,579 0,972 3,793 99178
58- H3L1 75,37 104402 0,612 0,9135 4,093 104326
34-XI 688,6 117714 0,5776 1,054 3,781 117025
- 31 048142
37-XI 792,6 113379 0,3877 1,175 2,442 112586
34- H1L1 170,8 119038 0,781 0,8745 6,04 118867
37- H1L1 523,2 102496 0,511 1,042 3,244 101973
Таблица 11 Связывание с GPRC5D на клетках NCI-H929
6-XI 58-XI 6H3L3 6- H4L3 58H1L1 58H3L1 34-XI 34H1L1 Минимально е значение 269,4 261,4 129,8 80,05 281 275,5 181,1 199,3 Максимально е значение 13785 14738 21859 28987 13474 13934 18146 17911 LogEC5 0 0,05146 0,1596 1,465 1,606 0,1648 о,з 0,7587 0,8048 Угловой коэффициен т Хилла 1,313 1,269 0,8063 0,7142 1,319 1,297 0,9911 1,011 ЕС50 1,126 1,444 29,18 40,33 1,462 1,995 5,738 6,379 Интерва л 13515 14476 21730 28907 13193 13658 17965 17712
37-XI 337,6 13807 -0,05621 1,41 0,8786 13470
37- H1L1 341,8 13534 -0,1991 1,419 0,6323 13192
Таким образом, эти данные подтверждают, что эти отобранные гуманизированные антитела пригодны для дальнейшей клинической разработки.
Пример 8. ADCC гуманизированных антител.
В ADCC Reporter Bioassay используется альтернативное считывание на более ранней стадии активации пути ADCC MOA: активация транскрипции гена посредством пути NFAT (ядерный фактор активированных T-клеток) в эффекторной клетке. Кроме того, в ADCC Reporter Bioassay используются сконструированные клетки Jurkat, стабильно экспрессирующие рецептор FcYRIIIa, вариант V158 (высокая аффинность), и элемент ответа NFAT, управляющий экспрессией люциферазы светлячка, в качестве эффекторных клеток. Биологическую активность антител в ADCC MOA количественно определяют с помощью люциферазы, продуцируемой в результате активации пути NFAT; активность люциферазы в эффекторной клетке количественно оценивают с помощью считывания люминесценции. Сигнал высокий, а фоновый уровень анализа низкий.
Серийные разведения Ab к GPRC5D человека инкубировали в течение 6 часов после индукции при 37°C со сконструированными эффекторными клетками Jurkat (эффекторными клетками ADCC Bioassay) и с клетками-мишенями ADCC Bioassay (экспрессирующими GPRC5D). Активность люциферазы определяли количественно с использованием реагента Bio-GloTM.
Результаты представлены на фиг. 11, на которой показано, что эти гуманизированные антитела индуцировали сильную ADCC-активность в линиях клеток со сверхэкспрессией GPRC5D и линиях клеток MM (множественной миеломы) с эндогенной экспрессией.
Пример 9. Интернализация гуманизированных антител.
В этом примере тестировали гуманизированные антитела в отношении их показателей активности индукции интернационализации. В примере использовали новый гидрофильный и яркий чувствительный к pH краситель (краситель pHAb), который не флуоресцирует при нейтральном pH, но становится высоко флуоресцентным при кислом pH при интернализации. Его можно использовать для обнаружения процесса интернализации. Клетки NCI-H929 и MM. 1R эндогенно экспрессировали GPRC5D человека в качестве клеток-мишеней, для оценки интернализации антитела к GPRC5D человека in vitro добавляли детектирующее антитело, меченное красителем pHAb.
Серийные разведения антител к GPRC5D человека инкубировали в течение 24 часов при 37°C. Обнаружена активность люциферазы. Результаты на фиг. 12, показывают, что эти гуманизированные анти
- 32 048142 тела обладают очень сильной активностью интернализации как в отношении линий клеток со сверхэкспрессией GPRC5D, так и в отношении линий клеток MM с эндогенной экспрессией.
Пример 10. Показатель активности уничтожения для ADC на основе GPRC5D.
В этом примере тестировали два конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) в отношении их показателей активности уничтожения клеток-мишеней. Эти ADC предусматривали 37B9C4 и 58F9G10, соответственно конъюгированные с токсичным лекарственным средством монометилауристатином E (MMAE).
Сконструированные клетки HEK293 и NCI-H929, экспрессирующие GPRC5D человека (HEK293/HGPRC5D и NCI-H929/HGPRC5D), клетки NCI-H929 и MM.1R, эндогенно экспрессирующие GPRC5D, высевали в 96-луночный планшет по 3000-4000 клеток на лунку. Клетки обрабатывали с помощью 37B9C4-MMAE и 58F9G10-MMAE в соответствующих концентрациях в течение 5 дней. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью CellTite, посеянного в 96-луночный планшет при 3000~4000 клеток на лунку с реагентом r-Glo. Активность люциферазы обнаруживали с помощью Envison. Результаты на фиг. 13 и в табл. 12, показывают, что эти гуманизированные антитела обладают очень сильной активностью уничтожения.
Таблица 12
Показатели активности уничтожения для ADC
Нек293/HGPRC5D (IC50, нМ) MM.1R (IC50, нМ) NCI-H929 (IC50, нМ) NCIH929/GPRC5D (IC50, нМ)
37В9С4- ММАЕ 0,025 0,14 0,23 0,11
58F9G10- ММАЕ 0,026 0,07 0,99 0,14
Пример 11. Показатели противоопухолевой активности in vivo.
В этом примере для тестирования показателей противоопухолевой активности антитела 37B9C4 (H1L1) использовали модель CDX на животных.
В этом исследовании использовали 6-8-недельных самок мышей NCG (Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd). Каждую мышь инокулировали подкожно в правую подмышечную (боковую) область опухолевые клетки MM.1R (2x106) в 0,1 мл PBS с матригелем (V:V=1:1) для развития опухоли. Животных случайным образом группировали, когда объем опухоли достигал примерно 60 мм3, после чего начинали лечение для исследования эффективности. 37B9C4 в дозе 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг вводили внутривенно (в/в) в день 0, день 7, день 14. Эксперимент прекращали в день 19, когда средний объем опухоли в группе среды-носителя превышал 2000 мм3. Средний объем опухоли в группе PBS, группе 37B9C4 (1 мг/кг), группе 37B9C4 (3 мг/кг) и группе 37B9C4 (10 мг/кг) составлял 2498,58 мм3, 1196,15 мм3, 0,00 мм3 (6/6 CR) и 0,00 мм3 (6/6 CR) соответственно. Размер опухоли измеряли три раза в неделю в двух измерениях с помощью штангенциркуля, а объем выражали в мм3 по формуле: V = 0,5 a x b2, где a и b - длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Точки данных представляют среднее значение группы (n=6), планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM).
Вес тела мышей, несущих опухоли MM.1R, регулярно подвергали мониторингу в качестве косвенного показателя токсичности. На фиг. 14A показана кривая роста опухоли у мышей, несущих опухоли MM.1R, после введения 37B9C4. Антитело дозозависимым образом обеспечивало подавление роста опухоли в этой модели опухоли, и полное подавление опухоли достигалось при дозе 3 мг/кг или выше.
Подробные изменения веса тела и относительное изменение веса тела мышей с опухолями MM.1R после введения показаны на фиг. 14B. В течение периода введения все группы мышей не имели значительной потери веса тела, а мыши в группе введения характеризовались хорошей переносимостью, что свидетельствует о безопасности лечения.
Объем настоящего изобретения не должен ограничиваться описанными конкретными вариантами осуществления, которые предназначены в качестве одиночных иллюстраций отдельных аспектов изобретения, и любые композиции или способы, которые функционально эквивалентны, входят в объем настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что в способах и композициях по настоящему изобретению могут быть сделаны различные модификации и вариации без отклонения от сущности или объема настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение охватывает модификации и варианты настоящего изобретения при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения, и их эквиваленты.
Все публикации и заявки на патенты, упоминаемые в данном описании, включены в данный документ посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была конкретно и отдельно указана в качестве включенной посредством ссылки.
- 33 048142
Перечень последовательностей <110> LaNova Medicines Development Co., Ltd.
<120> Моноклональные антитела к GPRC5D и варианты их применения <130> 70LG-325887-WO2 <150> PCT/CN2021/070314 <151> 2021-01-05 <160>86 <170> PatentIn версия 3.5 <210>1 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 2530
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 <210>2 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 34 048142 <223> синтетический <400>2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Thr Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
5 1015
Asp Arg Val Arg Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 2530
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 4045
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
70 7580
Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 85 9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105 <210>3 <211>113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Asn Tyr 20 2530
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 4045
Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 5560
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
- 35 048142
90 95
Ala Arg Asn Trp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser
Ser <210> 4 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His
25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln 85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Ser
Lys <210> 5 <211> 118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
5 10 15
Ala
- 36 048142
Ser Met Lys Leu Ser 20
Cys Lys Ala Ser Gly
Tyr Ser Phe Thr Gly
Thr Met His Trp Val 35
Lys Gln Ser His Gly 40
Glu Asn Leu Glu Trp 45
Gly Leu Ile Asn Pro 50
Tyr Asn Gly Gly Thr 55
Asn Tyr Asn Gln Lys 60
Lys Gly Lys Ala Thr 65
Leu Thr Val Asp Lys 70
Ser Ser Ser Thr Ala 75
Met Glu Leu Leu Ser
Leu Thr Ser Glu Asp
Ser Ala Val Tyr Tyr
Ser Arg Trp Gly Leu
100
Arg Arg Ala Met Asp
105
Tyr Trp Gly Gln Gly
110
Tyr
Ile
Phe
Tyr 80
Cys
Thr
Ser Val Thr Val Ser
115
Ser <210> 6 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 6
Asp Ile Val Met Thr 1 5
Gln Ser Gln Lys Phe 10
Met Ser Thr Ser Val
Asp Arg Val Ser Val
Thr Cys Lys Ala Ser 25
Gln Asn Val Gly Ser 30
Val Ala Trp Tyr Gln 35
Gln Lys Pro Gly Gln 40
Ser Pro Lys Ala Leu 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr 50
Arg Tyr Ser Gly Val 55
Pro Asp Arg Phe Thr 60
Asn Gly Ser Gly Thr 65
Asp Phe Thr Leu Thr 70
Ile Ser Asn Val Gln 75
Glu Asp Leu Ala Glu
Tyr Phe Cys Gln Gln
Tyr Tyr Asn Ser Pro
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Trp
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
Ile Lys
- 37 048142
100
105 <210> 7 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 7
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr
40
Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser
55
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asn
80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser 85
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met
100
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 8 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 8
Asp Ile Val Leu 1
Thr Gln Ser Pro Ala 5
Thr Leu Ser Val 10
Thr Pro Gly 15
Asp Ser Val
Ser Leu Ser Cys Arg Ala
25
Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
- 38 048142
Leu His Trp
Tyr Gln Gln
Lys Ser His 40
Glu Ser Pro
Lys Tyr Ala 50
Ser Gln Ser
Ile Ser Gly 55
Ile Pro Ser
Ser Gly Ser 65
Gly Thr Asp
Phe Thr Leu
Ser Ile Asn
Arg Leu Leu 45
Arg Phe Ser
Ser Val Glu
Glu Asp Phe Gly Met
Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu
95
Ile
Gly
Thr 80
Thr
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 <210> 9 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 9
Glu Val Asn Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp
25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser 65 70 75
Val
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile 85 90 95
Tyr Cys
Thr Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met
100 105 110
Gly
Tyr
Val
Glu
Ser 80
Tyr
Asp
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 10
- 39 048142 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala SerLeu
5 1015
Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile SerAsn
2530
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu 65 7075
Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro 85 9095
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105
Gly
Tyr
Ile
Gly
Pro 80
Phe <210>11 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 11
Gln Val Gln 1
Ser Val Lys
Thr Met His
Gly Tyr Ile
Leu Gln Gln 5
Met Ser Cys 20
Trp Val Lys
Asn Pro Ser
Ser Gly Ala
Lys Ala Ser
Gln Arg Pro 40
Ser Gly Tyr 55
Glu Leu Ala 10
Gly Tyr Thr
Gly Gln Gly
Thr Asn Tyr 60
Arg Pro Gly
Phe Thr Thr
Leu Glu Trp 45
Asn Gln Lys
Ala
Tyr
Ile
Phe
- 40 048142
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 <210>12 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln 1 5
Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 20
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
55
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
80
Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Phe Cys 85
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105 <210>13 <211>122 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 13
- 41 048142
Glu 1
Val
Gln
Leu
Gln 5
Gln
Ser
Gly
Pro
Glu 10
Leu
Val
Lys
Pro
Gly 15
Ala
Ser
Val
Lys
Met 20
Ser
Cys
Lys
Ala
Ser 25
Gly
Tyr
Thr
Phe
Thr
Arg
Asn
Ile
Met
His 35
Trp
Val
Lys
Gln
Lys 40
Pro
Gly
Gln
Gly
Leu 45
Glu
Trp
Ile
Gly
Tyr 50
Ile
Asn
Pro
Tyr
Asn 55
Ala
Gly
Ser
Lys
Tyr 60
Asn
Glu
Lys
Phe
Lys 65
Gly
Lys
Ala
Thr
Leu 70
Thr
Ser
Asp
Ile
Ser 75
Ser
Ser
Thr
Ala
Tyr 80
Met
Glu
Leu
Ser
Ser 85
Leu
Thr
Ser
Glu
Asp 90
Ser
Ala
Val
Tyr
Tyr 95
Cys
Ala
Arg
Glu
Glu
100
Val
Tyr
Tyr
Arg
Tyr 105
Gly
Ala
Trp
Phe
Ala
110
Tyr
Trp
Gly
His
Gly 115
Thr
Leu
Val
Thr
Val
120
Ser
Ala <210> 14 <211> 111 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg 20
Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr
40
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
55
Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 70
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
80
- 42 048142
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
Cys Gln His Ser Trp
Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105110 <210>15 <211>119 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>15
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala
5 1015
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 4045
Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 <210>16 <211>106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 16
Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
5 10 15
- 43 048142
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser
2025
Ser Val Ser Tyr Met
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 4045
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 5560
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 7580
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr 85 9095
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100105 <210>17 <211>113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 1 5
Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20
Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Asn Tyr 25 30
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg
40
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 45
Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly
55
Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala 65 70
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
95
Ala Arg Asn Trp Asp Val Trp Gly
100
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
105 110
- 44 048142
Ser <210> 18 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His 20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
55
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
90
Tyr Phe Cys Ser Gln
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Ser
Lys <210> 19 <211> 122 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 19
Gln Val His 1
Ser Val Lys
Thr Met His
Leu Gln Gln
Met Ser Cys 20
Trp Val Lys
Ser Gly Ala
Lys Ala Ser
Gln Arg Pro 40
Glu Leu Ala 10
Gly Tyr Thr
Gly Gln Gly
Arg Pro Gly
Phe Thr Thr
Leu Glu Trp 45
Ala
Tyr
Ile
- 45 048142
Gly
Tyr 50
Ile
Asn
Pro
Asn
Ser 55
Ala
Tyr
Thr
Asn
Tyr 60
Asn
Gln
Lys
Phe
Lys 65
Asp
Lys
Ala
Thr
Leu
Thr
Ala
Asp
Lys
Ser 75
Ser
Ser
Thr
Ala
Tyr 80
Met
Gln
Leu
Ser
Ser 85
Leu
Thr
Ser
Glu
Asp 90
Ser
Ala
Val
Tyr
Tyr 95
Cys
Ala
Arg
Arg
Val
100
Leu
Leu
Leu
Arg
Val
105
Leu
Asp
Phe
Phe
Asp 110
Tyr
Trp
Gly
Gln
Gly 115
Thr
Thr
Leu
Thr
Val
120
Ser
Ser <210> 20 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 20
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro 1 5
Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg
Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Glu Lys Pro
40
Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
55
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr 65 70
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys 85
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100105 <210>21 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 46 048142 <220>
<223> синтетический <400>21
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 4045
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 <210>22 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln 1 5
Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys 20
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
55
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60
- 47 048142
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75
Ser Asn Val Gln Ser
Glu Asp Leu Ala
Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn 85 90
Ser Ser Pro Trp
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105 <210>23 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>23
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
5 1015
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 4045
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 <210>24 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический
- 48 048142 <400> 24
Asp Ile Val Met
Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 5 10 15
Asp Arg Val
Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40
Ser Pro Lys Ala Leu Ile 45
Tyr
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70
Ile Ser Asn Val Gln Ser
80
Glu Asp Leu Ala
Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Ser Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 25 <211> 118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 1 5
Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala 20
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser
40
His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly
55
Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val 65 70
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
95
- 49 048142
Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105110
Thr
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 <210>26 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile 1 5 1015
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser
2530
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu 35 4045
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 50 5560
Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln 65 7075
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Pro
9095
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Trp
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105 <210>27 <211>113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 2025
Gly Tyr Ala Phe Ile Ser
Thr
Tyr
- 50 048142
Leu Ile Glu Trp Ile 35
Lys Gln Arg Pro Gly 40
Gln Gly Leu Glu Trp 45
Gly Met Ile Asn Pro 50
Gly Ser Gly Gly Thr 55
Asn Tyr Asn Glu Lys 60
Lys Asp Lys Ala Thr 65
Leu Thr Ala Asp Lys 70
Ser Ser Ser Thr Ala 75
Met Gln Leu Ser Ser
Leu Thr Ser Asp Asp
Ser Ala Val Tyr Phe
Ala Arg Asn Trp Asp
100
Val Trp Gly Gln Gly
105
Thr Thr Leu Thr Val
110
Ile
Phe
Tyr 80
Cys
Ser
Ser <210> 28 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>28
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 1015
Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His
2530
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln 85 9095
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Ser
Lys
- 51 048142 <210> 29 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>29
Ser Tyr Gly Met Ser <210>30 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>30
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>31 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>31
Gln Gly Gly Asp Ala Met Asp Tyr <210>32 <211>11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 32
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn Leu His
5 10 <210> 33 <211> 7
- 52 048142 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>33
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 15 <210>34 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>34
Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr 15 <210>35 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser
55
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met
100
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
105 110
- 53 048142
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 36 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser
55
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala 85
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met
100
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 37 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 37
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
Thr Phe Ser Ser Tyr
- 54 048142
Gly Met Ser Trp Val 35
Arg Gln Thr Pro Gly 40
Lys Arg Leu Glu Trp 45
Ala Thr Ile Ser Ser 50
Gly Gly Ser Tyr Thr 55
Tyr Tyr Pro Asp Ser 60
Lys Gly Arg Phe Thr 65
Ile Ser Arg Asp Asn 70
Ala Lys Asn Ser Leu 75
Leu Gln Met Ser Ser
Leu Arg Ala Glu Asp
Thr Ala Val Tyr Tyr
Ala Arg Gln Gly Gly
100
Asp Ala Met Asp Tyr
105
Trp Gly Gln Gly Thr
110
Val
Val
Asn 80
Cys
Leu
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 38 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 38
Asp Ile Gln Met Thr 1 5
Gln Ser Pro Ser Ser
Leu Ser Ala Ser Val
Asp Arg Val Thr Ile
Thr Cys Arg Ala Ser 25
Gln Ser Ile Asn Asn
Leu His Trp Tyr Gln 35
Gln Lys Pro Gly Lys 40
Ala Pro Lys Leu Leu 45
Tyr Tyr Ala Ser Gln 50
Ser Ile Ser Gly Val 55
Pro Ser Arg Phe Ser 60
Ser Gly Ser Gly Thr 65
Asp Phe Thr Leu Thr 70
Ile Ser Ser Leu Gln 75
Glu Asp Phe Ala Thr
Tyr Tyr Cys Gln Gln
Ser Asn Ser Arg Leu
Gly
Asn
Ile
Gly
Pro 80
Thr
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
- 55 048142 <210> 39 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>
<223> синтетический <400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
25
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
40
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly
55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln 85
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 <210> 40 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>
<223> синтетический <400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
25
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
40
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly
55
Leu Ser Ala Ser Val Gly 15
Gln Ser Ile Asn Asn Asn
Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45
Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Ile Ser Ser Val Gln Pro
80
Ser Asn Ser Arg Leu Thr
Leu Ser Ala Ser Val Gly
Gln Ser Ile Asn Asn Asn
Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45
Pro Ser Arg Phe Ser Gly
- 56 048142
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln 85
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 <210> 41 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>
<223> синтетический <400> 41
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser
5
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala
25
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
40
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly
55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln 85
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 <210> 42 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>
<223> синтетический <400> 42
Asp Tyr Trp Met Asn
Ile Ser Ser Val Gln Pro
80
Ser Asn Ser Arg Leu Thr 95
Leu Ser Val Ser Val Gly
Gln Ser Ile Asn Asn Asn
Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45
Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Ile Ser Ser Val Gln Pro
80
Ser Asn Ser Arg Leu Thr 95
- 57 048142 <210> 43 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>43
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
5 1015
Val Lys Gly <210>44 <211>13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>44
Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
510 <210>45 <211>11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>45
Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
510 <210>46 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 46
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
5
- 58 048142 <210> 47 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>47
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe Thr 15 <210>48 <211>124 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 2530
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 5560
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 7580
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Tyr Cys Ala Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115120
Ser <210>49 <211>124 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический
- 59 048142 <400>49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 2530
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 5560
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser 65 70 7580
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Tyr Cys Thr Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120 <210>50 <211>124 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn
55
Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
80
- 60 048142
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met
100 105 110
Tyr
Asp
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 51 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn
25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro
90 95
Gly
Tyr
Ile
Gly
Pro 80
Phe
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 52 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
Gly
- 61 048142
Asp Arg Val Thr Ile 20
Thr Cys Ser Ala Ser 25
Gln Gly Ile Ser Asn
Leu Asn Trp Tyr Gln 35
Gln Lys Pro Gly Lys 40
Thr Val Lys Leu Leu 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser 50
Leu His Ser Gly Val 55
Pro Ser Arg Phe Ser 60
Ser Gly Ser Gly Thr 65
Asp Tyr Thr Leu Thr 70
Ile Ser Ser Leu Gln 75
Glu Asp Phe Ala Thr
Tyr Tyr Cys Gln Gln
Tyr Ser Lys Leu Pro
Tyr
Ile
Gly
Pro 80
Phe
Thr Phe Gly Gln Gly
100
Thr Lys Leu Glu Ile
105
Lys <210> 53 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn 20 2530
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro
9095
Gly
Tyr
Ile
Gly
Pro 80
Phe
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105
- 62 048142 <210> 54 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>54
Gly Tyr Tyr Ile His 15 <210>55 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>55
Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe Lys
5 1015
Gly <210>56 <211>10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>56
Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr
510 <210>57 <211>10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 57
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
5 10 <210> 58
- 63 048142 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 58
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 59
Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 60 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 60
Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys 1 5 10
Phe Lys 15
Gly <210> 61 <211> 119 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
5 10
Lys Lys Pro Gly Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
Ser Phe Thr Gly Tyr 30
- 64 048142
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210>62 <211>119 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 4045
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
- 65 048142
115 <210> 63 <211> 119 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala
40
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala
55
Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Val 65 70
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
80
Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser 85
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro
100
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 64 <211> 119 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
5 10
Lys Lys Pro Gly Ala
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
Ser Phe Thr Gly Tyr 30
- 66 048142
Tyr Ile His Trp Val 35
Lys Gln Ala Pro Gly 40
Gln Gly Leu Glu Trp 45
Gly Tyr Ile Ser Ser 50
Tyr Asn Ala Ala Thr 55
Ser Phe Asn Gln Lys 60
Lys Gly Arg Ala Thr 65
Phe Thr Val Asp Thr 70
Ser Thr Ser Thr Ala 75
Met Glu Phe Ser Ser
Leu Arg Ser Glu Asp
Ser Ala Val Tyr Tyr
Ala Arg Thr Glu Leu
100
Arg Gly Pro Trp Phe
105
Ala Tyr Trp Gly Gln
110
Ile
Phe
Tyr 80
Cys
Gly
Thr Leu Val Thr Val
115
Ser Ser <210> 65 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr 20 2530
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 4045
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 5560
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 7075
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu
9095
Gly
Met
Tyr
Ser
Glu 80
Thr
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105 <210> 66
- 67 048142 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 66
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser 20
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
40
Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly
55
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 65 70
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85
Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
100
Ile Lys 105 <210> 67 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 67
Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser 20
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
40
Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly
55
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
- 68 048142
Gly 65
Ser
Gly
Thr
Asp
Tyr 70
Thr
Leu
Thr
Ile
Ser 75
Ser
Met
Gln
Pro
Asp
Phe
Ala
Thr
Tyr 85
Tyr
Cys
Gln
Gln
Trp 90
Ser
Asn
Asn
Pro
Leu
Glu 80
Thr
Phe
Gly
Gln
Gly 100
Thr
Lys
Leu
Glu
Ile
105
Lys <210> 68 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>68
Thr Tyr Thr Met His <210>69 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>69
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
5 1015
Lys
Asp <210>70 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>70
Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr <210>71 <211>11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 69 048142 <220>
<223> синтетический <400>71
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Val
510 <210>72 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>72
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr <210>73 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>73
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr 15 <210>74 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly
55
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 60
- 70 048142
Lys 65
Asp
Arg
Val
Thr
Met 70
Thr
Arg
Asp
Thr
Ser 75
Thr
Ser
Thr
Val
Tyr 80
Met
Glu
Leu
Ser
Ser 85
Leu
Arg
Ser
Glu
Asp 90
Thr
Ala
Val
Tyr
Tyr 95
Cys
Ser
Arg
Leu
Arg 100
Ser
Arg
Gly
Tyr
Phe
105
Asp
Tyr
Trp
Gly
Gln
110
Gly
Thr
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 75 <211> 118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 2530
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Arg Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210>76 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 71 048142 <220>
<223> синтетический <400>76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 2530
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210>77 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5
Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala 20
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ala
40
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly
55
Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 60
- 72 048142
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115 <210>78 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>78
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 2530
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115 <210>79 <211>118 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 73 048142 <220>
<223> синтетический <400>79
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 2530
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 5560
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115 <210>80 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 80
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 20
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
55
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
- 74 048142
Ser Gly Ser Gly Thr 65
Glu Phe Thr Leu Thr 70
Ile Ser Ser Leu Gln 75
Glu Asp Phe Ala Thr
Tyr Tyr Cys Gln Gln
Tyr Ser Ser Tyr Pro
Pro 80
Tyr
Thr Phe Gly Gln Gly
100
Thr Lys Leu Glu Ile
105
Lys <210> 81 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr 20 2530
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro
9095
Gly
Ala
Ile
Gly
Pro 80
Tyr
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105 <210>82 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val 1 5 10 15
Gly
- 75 048142
Asp Arg Val Thr Ile
Thr Cys Lys Ala Ser 25
Gln Asn Val Gly Thr
Val Val Trp Tyr Gln 35
Gln Lys Pro Gly Lys 40
Ser Pro Lys Leu Leu 45
Tyr Ser Ala Ser Asn 50
Arg Tyr Thr Gly Val 55
Pro Ser Arg Phe Ser 60
Ser Gly Ser Gly Thr 65
Glu Phe Thr Leu Thr 70
Ile Ser Ser Met Gln 75
Glu Asp Phe Ala Thr
Phe Phe Cys Gln Gln
Tyr Ser Ser Tyr Pro
Ala
Ile
Gly
Pro 80
Tyr
Thr Phe Gly Gln Gly
100
Thr Lys Leu Glu Ile
105
Lys <210> 83 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400>83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr 20 2530
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro 85 9095
Gly
Ala
Ile
Gly
Pro 80
Tyr
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100105
- 76 048142 <210> 84 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 84
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys 20
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
55
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 70
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
100
Glu Ile Lys 105 <210> 85 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический <400> 85
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5
Ala Thr Leu Ser Thr Ser Pro Gly
15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys 20
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
55
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 60
- 77 048142
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp Phe Ala Val Phe Phe Cys Gln 85
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 <210> 86 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательно <220>
<223> синтетический <400> 86
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala
5
Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala
25
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
40
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly
55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp Phe Ala Val Phe Phe Cys Gln 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105
Ile Ser Ser Leu Gln Ser
80
Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 95
Lys
Leu Ser Thr Ser Pro Gly 15
Gln Asn Val Gly Thr Ala 30
Ser Pro Arg Leu Leu Ile 45
Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60
Ile Ser Ser Met Gln Ser
80
Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 95
Lys
-

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированное(ый) с цитотоксическим лекарственным средством, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с белком, представляющим собой представителя D группы 5 семейства C рецепторов, сопряженных с G-белком человека (GPRC5D), и содержит:
    вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 (HCDR1) под SEQ ID NO: 42, аминокислотную последовательность HCDR2 под SEQ ID NO: 43 и аминокислотную последовательность HCDR3 под SEQ ID NO: 44; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 (LCDR1) под SEQ ID NO: 45, аминокислотную последовательность LCDR2 под SEQ ID NO: 46 и аминокислотную последовательность LCDR3 под SEQ ID NO: 47.
  2. 2. ADC по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, 48, 49 или 50.
  3. 3. ADC по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, 51, 52 или 53.
  4. 4. ADC по любому из пп.1-3, где вариабельная область тяжелой цепи предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, 48, 49 или 50; и вариабельная область легкой цепи предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, 51, 52 или 53.
  5. 5. ADC по любому из пп.1-4, где вариабельная область тяжелой цепи предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48 и вариабельная область легкой цепи предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51.
  6. 6. ADC по любому из пп.1-4, где цитотоксическое лекарственное средство представляет собой майтанзиноид или ауристатин.
  7. 7. ADC по п.6, где цитотоксическое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из майтанзина, №'-деацетил-Н2'-(3-меркапто-1-оксопропил)- или №'-деацетил-Н2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзина (DM1); монометилауристатина-D (MMAD); монометилауристатина-E (MMAE); и монометилауристатина-F (MMAF).
  8. 8. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированное(ый) с монометилауристатином-Е (MMAE), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с белком, представляющим собой представителя D группы 5 семейства C рецепторов, сопряженных с G-белком человека (GPRC5D), и содержит:
    вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 (HCDR1) под SEQ ID NO: 42, аминокислотную последовательность HCDR2 под SEQ ID NO: 43, и аминокислотную последовательность HCDR3 под SEQ ID NO: 44; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 (LCDR1) под SEQ ID NO: 45, аминокислотную последовательность LCDR2 под SEQ ID NO: 46, и аминокислотную последовательность LCDR3 под SEQ ID NO: 47.
  9. 9. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированное(ый) с монометилауристатином-Е (MMAE), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с белком, представляющим собой представителя D группы 5 семейства C рецепторов, сопряженных с G-белком человека (GPRC5D), и содержит:
    вариабельную область тяжелой цепи, предусматривающую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48; и вариабельную область легкой цепи, предусматривающую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51.
  10. 10. Способ лечения рака, включающий:
    введение пациенту, имеющему гематологический рак, конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), содержащего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированное(ый) с монометилауристатином-E (MMAE), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с белком, представляющим собой представителя D группы 5 семейства C рецепторов, сопряженных с G-белком человека (GPRC5D), и содержит:
    вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 (HCDR1) под SEQ ID NO: 42, аминокислотную последовательность HCDR2 под SEQ ID NO: 43, и аминокислотную последовательность HCDR3 под SEQ ID NO: 44; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность опреде
    -
EA202391920 2021-01-05 2022-01-05 Моноклональные антитела к gprc5d и варианты их применения EA048142B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2021/070314 2021-01-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA048142B1 true EA048142B1 (ru) 2024-10-29

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11873342B2 (en) Anti-CCR8 monoclonal antibodies and uses thereof
US12281162B2 (en) Chimeric antigen receptors targeting GPRC5D
WO2022206961A1 (en) Anti-cd24 monoclonal antibodies and uses thereof
WO2022148370A1 (en) Anti-gprc5d monoclonal antibodies and uses thereof
TW202330599A (zh) 抗ｃｃｒ８單株抗體及其用途
TWI883306B (zh) 抗ｇｐｒｃ５ｄ單株抗體及其用途
US20250163164A1 (en) Anti-il-13ra2 monoclonal antibodies and uses thereof
EA048142B1 (ru) Моноклональные антитела к gprc5d и варианты их применения
HK40118089A (zh) 抗il-13ra2单克隆抗体及其用途
HK40080157A (en) Anti-gprc5d monoclonal antibodies and uses thereof
HK40080157B (zh) 抗gprc5d单克隆抗体及其用途
EA049975B1 (ru) Моноклональные антитела к ccr8 и их применения
OA21300A (en) Anti-ccr8 monoclonal antibodies and uses thereof.