EA049385B1

EA049385B1 - Пептиды bnip3 для лечения реперфузионного повреждения

Info

Publication number: EA049385B1
Application number: EA202192970
Authority: EA
Inventors: Тинуш Рассаф; Ульрике Хендген-Котта
Original assignee: Бимио Гмбх
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2025-03-20

Abstract

Изобретение относится к пептидам, способным ингибировать индивидуальную активность, и взаимодействию между путями, BNIP3, ВАХ и митохондрий. Пептиды могут быть использованы в способах лечения заболевания или состояния у субъекта, у которого желательно предотвратить повреждение клеток и гибель клеток.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к лечению реперфузионного повреждения. В частности изобретение относится к пептидам из BNIP3, которые предотвращают повреждение и гибель клеток путем снижения активности BNIP3 и BAX в митохондриях.

Предпосылки создания изобретения

Окклюзия сосуда вызывает прекращение поступления крови к части ткани, что приводит, в частности, к недостаточному поступлению кислорода, снижению доступности питательных веществ и недостаточному удалению метаболических отходов, разрушающих клетки, с последующей их гибелью. При том, что острую окклюзию невозможно предсказать или избежать, восстановление проходимости сосуда вполне осуществимо и имеет большое значение для результата лечения пациентов¹. Рекомендованным методом лечения является своевременная реперфузия, однако быстрое восстановление кровоснабжения, и особенно снабжения O2, приводит к повреждению тканей, от которого в настоящее время не существует лечения. Ранняя фаза реперфузии характеризуется высоким уровнем кислорода, приводящим к гипероксическим условиям, резким повышением содержания активных форм кислорода и повышением уровня кальция без ацидоза. Патология реперфузионного повреждения может возникать в сердце, мозге, печени и почках и связана с серьезными клиническими проявлениями, включая гибернацию миокарда, острую сердечную недостаточность, церебральную дисфункцию, желудочно-кишечную дисфункцию, почечную дисфункцию, синдром системного воспалительного ответа и синдром полиорганной недостаточности. Вследствие этого, реперфузионное повреждение является критическим медицинским состоянием, которое представляет собой важную терапевтическую проблему. Инфаркт миокарда (ИМ) является внезапным, непредсказуемым во времени событием, при котором реперфузия необходима для выживания, но определяет до 50% конечного размера зоны инфаркта². Это же относится и к трансплантированным органам. ИМ является наиболее распространенной причиной сердечной недостаточности, поэтому терапевтические вмешательства, направленные на уменьшение реперфузионного повреждения, дают возможность спасти жизнеспособный миокард, ограничить размер зоны ИМ, сохранить функцию сердца и повлиять на частоту развития сердечной недостаточности³. В прогрессировании инфаркта, вызванном реперфузией, существенную роль играют две формы гибели клеток - некроз и апоптоз. В начальной зоне инфаркта можно наблюдать преобладание некротической гибели кардиомиоцитов. Некроз вызывает последующие реакции тканей, такие как воспаление, ремоделирование матрикса, а затем фиброз⁴. Апоптоз имеет место в зоне инфаркта и периинфарктной зоне и является основным компонентом раннего постинфарктного ремоделирования⁵.

Повреждение сердца также является жизненно важной проблемой для больных раком. Благодаря достижениям в области скрининга и стратегий лечения, за последние три десятилетия популяция людей, перенесших рак, неуклонно растет. Общая 5-летняя выживаемость улучшилась до 50-70% при десятилетнем наблюдении. В результате растет распространенность побочных эффектов противораковой терапии, в частности, сердечно-сосудистой токсичности. Обычная химиотерапия (например, применение антрациклинов) является широко используемым методом лечения многих видов рака, который, по общему признанию, способствует бессимптомному и симптоматическому снижению фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ), кардиомиопатии и сердечной недостаточности (СН). Связанная с раком кардиомиопатия характеризуется дозозависимым снижением систолической функции ЛЖ, опосредованным активными формами кислорода (АФК), которое, как правило, необратимо. В настоящее время не существует ни подходов для предотвращения, ни методов лечения, позволяющих эффективно снижать побочные кардиотоксические эффекты (например, снижение функции сердца, кардиомиопатию и так далее) у пациентов, получающих химиотерапию антрациклином или другие виды противораковой терапии. Несколько исследований были направлены на удовлетворение этой медицинской потребности, но привели лишь к частичным результатам/пользе. Исследование CECCY не показало преимущества карведилола у пациентов с раком молочной железы, однако была продемонстрирована защита за счет снижения уровня тропонина⁶. В исследовании PRADA была проведена оценка кандесартана и метопролола, и было выявлено значительное преимущество кандесартана для предотвращения кардиомиопатии, несмотря на то что исследование не имело достаточной мощности в соответствии с современным определением кардиотоксичности⁷. Основным оцениваемым результатом в исследовании MANTICORE было изменение диаметра левого желудочка. Ни бета-блокатор, ни ингибитор АПФ не оказывали существенного влияния на этот показатель, но в значительной степени предотвращали сердечную недостаточность в качестве вторичного оцениваемого результата⁸. В целом, несмотря на то что существующая литература свидетельствует о потенциальной пользе лечения сердечной недостаточности, на сегодняшний день ни в одном исследовании не была проведена углубленная оценка пользы современного лечения сердечной недостаточности, рекомендованного в современных руководствах, для предотвращения кардиотоксичности у онкологических пациентов.

Митохондрии играют центральную роль в некротической и апоптотической сигнализации⁹. К ней относятся нарушение транспорта электронов, окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ, фрагментация ДНК, повреждение белков и липидов, а также чрезмерное образование АФК.

- 1 049385

Определяющим событием некроза в митохондриях является открытие поры во внутренней митохондриальной мембране (ВММ), так называемой митохондриальной поры переходной проницаемости (мППП). Это ведет к энергетическому коллапсу и быстрому обмену растворителей, с притоком осмолитов в митохондрии. Последующее набухание матрикса приводит к разрыву наружной митохондриальной мембраны, набуханию клеток и их разрушению¹⁰. Предполагается, что некротические стимулы, такие как Ca²⁺, вызывают открытие мППП, и могут быть потенцированы АФК¹⁰. Несмотря на обширные исследования, компоненты мППП остаются неизвестными, при этом исследования на трансгенных животных исключили несколько предполагаемых компонентов, в том числе транслоказу адениновых нуклеотидов¹¹, потенциал-зависимый анионный канал¹², митохондриальный переносчик фосфата¹³ (SLC25A3) и циклофилин D¹⁴. Совсем недавно было высказано предположение, что ссубъединица АТФ-синтетазы формирует пору во внутренней мембране^15,16. Сообщалось, что предотвращение открытия мППП с помощью фармакологических ингибиторов, таких как циклоспорин А, уменьшает размер зоны инфаркта в доклинических моделях И/Р повреждения^17,18. В более крупных клинических испытаниях его эффект был нейтральным¹⁹. Пептид, направленный на митохондрии, эламипретид (ранее называемый бендавия или MTP-131), а также лекарственное средство, направленное на митохондрии, TRO40303, как показали исследования на животных, уменьшают размер зоны инфаркта за счет уменьшения продуцирования митохондриальных АФК при введении в начале реперфузии^20-22. Однако в исследованиях STEMI эламипретид²⁰, а также TRO40303, оба введенные внутривенно до ПЧКВ, не смогли уменьшить размер зоны инфаркта у пациентов²³. Примечательно, что у пациентов, получавших TRO40303, было зарегистрировано больше нежелательных явлений, чем в группе плацебо, что ограничивает клиническое применение данного терапевтического подхода. Столь же бесполезными оказались ингибиторы Na⁺/H⁺ обмена²⁴, антиоксиданты, такие как супероксиддисмутаза²⁵, и различные антитела против нейтрофилов^26,27.

Апоптотическая гибель клеток, происходящая в инфарктной и периинфарктной области, инициируется пермеабилизацией наружной митохондриальной мембраны (НММ), что приводит к высвобождению проапоптотических белков, таких как цитохром c, фактор, индуцирующий апоптоз, SMAC/DIABLO (второй митохондриальный активатор каспаз/непосредственно связывающий IAP белок с низкой PI) и эндонуклеаза G, из межмембранного пространства в цитозоль, что приводит к запуску каскадов клеточной гибели за счет действия каспаз и фрагментации ДНК^28-30.

Вызывающие гибель белки семейства BCL-2 BNIP3 (взаимодействующий с BCL-2 и аденовирусным 19-кДа белком E1B белок 3) и BAX (BCL-2-ассоциированный белок X) вызывают пермеабилизацию НММ и становятся медиаторами и последующими эффекторами митохондриального апоптоза в результате транслокации в НММ и образования гетеродимеров^31-35. Кроме того, BNIP3 и BAX регулируют искажения ВММ, тем самым выступая в качестве важнейших активаторов некроза^5,36.

Настоящее изобретение удовлетворяет потребность в оптимальном уменьшении как острого повреждения в центральной зоне инфаркта, так и последующей гибели клеток в непосредственно прилегающих областях, за счет предложения ингибитора активности взаимодействия BNIP3 и BAX, который прерывает взаимодействие внутри и между путей BNIP3, BAX и митохондрий, в качестве отдельных компонентов или компонентов тройного комплекса, для лечения реперфузионного повреждения сердца, мозга, печени и почек, а также других состояний, при которых искажение митохондрий приводит к повреждению и гибели клеток, таких как, например, сердечная недостаточность, трансплантация органов, остановка сердца или последствия хирургического и фармакологического вмешательства, а также повреждение сердца, вызванное инсультом, раком и противораковой терапией.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к пептидам, которые связываются с BNIP3 и BAX в виде мономеров, а также с их гомо- и гетероолигомерами, и обладают широким спектром активности за счет обходного препятствования активности отдельных компонентов и активности олигомеров. Их эффективность не ограничивается каким-либо органом или биологическим видом, что подтверждается защитой тканей сердца и мозга, а также кардиомиоцитов желудочка человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, от реперфузионного повреждения. У свиней также заметно уменьшился размер зоны инфаркта миокарда.

Пептиды получены из N-концевой части BNIP3, и доказано, что наиболее активным является 8аминокислотный фрагмент, состоящий из аминокислот 13-20 в BNIP3. Было крайне удивительно, что такой короткий пептид был способен ингибировать активность BNIP3 и BAX, блокировать образование гомо- и гетероолигомеров из этих белков и индуцировать конформационные изменения в этих гомо- и гетероолигомерах в клетке. Определенные мутации в пептидной последовательности даже повысили его эффективность.

Ввиду этих результатов, в первом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему (i) сигнал клеточного поглощения; и

- 2 049385 (ii) фрагмент BNIP3, содержащий аминокислоты положений 13-20 в BNIP3 или полученную из них аминокислотную последовательность.

Пептид, как правило, имеет длину 50, в частности, 40 или менее аминокислот.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид по первому аспекту, и ее применению для лечения связанных с реперфузией и/или связанных с митохондриями заболеваний, а также вызванной противораковой терапией кардиотоксичности, и для предотвращения таковых.

В третьем аспекте изобретение относится к способу предотвращения повреждения клеток или гибели клеток, включающему создание контакта клеток с пептидом по первому аспекту.

В четвертом аспекте изобретение также относится к способу скрининга на соединение, подходящее для предотвращения связанных с реперфузионным повреждением и/или митохондриями заболеваний и/или вызванной противораковой терапией кардиотоксичности, включающему (i) получение одного или более соединений-кандидатов;

(ii) определение способности соединений-кандидатов препятствовать связыванию BNIP3 и BAX;

(iii) выбор тех соединений-кандидатов, которые препятствуют связыванию BNIP3 и BAX.

Другие цели, признаки, преимущества и аспекты настоящего изобретения станут понятны специалистам в данной области из следующего далее описания и прилагаемой формулы изобретения. Однако следует понимать, что следующее далее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, представляющие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приведены лишь в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в рамках сущности и объема раскрытого изобретения станут очевидными для специалистов в данной области после прочтения настоящего документа.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Делеция BNIP3 у мышей приводит к уменьшению размера зоны инфаркта миокарда in vivo. A Схематическое изображение in vivo модели ишемии/реперфузии. B Схематическое изображение секции сердца, показывающее не ишемическую зону (удаленная), ишемическую зону (зона риска, ЗР), область инфаркта (белая, погруженная в ЗР). C Размеры зоны инфаркта после 24 ч реперфузии у мышей дикого типа, BNIP3-дефицитных (Bnip3^-/-) и Bnip3^-/- мышей, получавших указанные дозы TAT-BNIP3 (n=3-7 мышей). ЗР - зона риска; инф - инфаркт. Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Статистический анализ представляет собой двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони.

Фиг. 2. BNIP3 является посредником активности BAX при реперфузионном повреждении миокарда. Мышам проводили реперфузию в течение указанных периодов времени in vivo после окклюзии сосуда. Наблюдали возрастающий митохондриальный уровень BNIP3 (A) и митохондриальную концентрацию BAX (B) в зоне риска в начале эксперимента и после 10 мин реперфузии (n=5-7 мышей). C Вестерн-блот анализ показал, что BNIP3 иммунопреципитируется совместно с BAX в начале эксперимента и после 10 и 30 мин реперфузии. D Количественное определение митохондриального уровня BAX в зоне риска у BNIP3-дефицитных (Bnip3^-/-) мышей в начале эксперимента и после 10 мин реперфузии, не получавших и получавших BNIP3 (n=3 мыши). Транслокация BAX зависит от присутствия BNIP3. Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Статистический анализ представляет собой двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони.

Фиг. 3. Сайты взаимодействия, вторичная структура и in silico стыковка. A Схема эксперимента (JPT, Berlin, Germany, Berlin). B Изображение тепловой карты при инкубации BNIP3 с пептидной библиотекой BAX, показывающее спирали α5, α6 и α7+α8 в качестве участков взаимодействия. Цветовая кодировка варьируется от белого (0 или низкая интенсивность) до светло-серого (средняя интенсивность) и темно-серого (высокая интенсивность) цвета. C Модель трехмерной структуры BNIP3, полученная путем гомологичного моделирования с использованием Modeller 9.15. D Спектроскопический анализ методом кругового дихроизма (КД) BNIP3. E, F Рисованные изображения взаимодействий BAX/BNIP3 с указанием сайтов связывания, полученных на основании in silico экспериментов по стыковке с использованием HADDOCK. G Структура последовательности TAT. H Структура BNIP3-20A. I Структура BNIP320C. J Репрезентативные изображения трансмурального распределения TAT-BNIP3-20A (зеленый цвет) после 10 мин реперфузии in vivo. Масштабная линейка, 1 мм. K Вестерн-блот анализ TAT-BNIP3-20A, иммунопреципированного совместно с BNIP3, через 5 мин реперфузии после окклюзии сосуда in vivo.

Фиг. 4. TAT-BNIP3-20A уменьшает реперфузионное повреждение миокарда in vivo. A Схематическое изображение in vivo модели инфаркта миокарда. Мышам проводили реперфузию в течение указанных периодов времени после окклюзии сосуда in vivo. Пептид вводили в левый желудочек за 5 мин до реперфузии. B Размеры зоны инфаркта после 24 ч реперфузии у мышей дикого типа, получавших растворитель, контрольный пептид TAT-BNIP3-20C и TAT-BNIP3-20A (n=7-10 мышей). TAT-BNIP3-20A значительно уменьшает размер зоны инфаркта. BNIP3-20C и растворитель не эффективны для уменьшения зоны инфаркта. TAT-BNIP3-20A ингибирует взаимодействие BNIP3 с митохондриями после 10 мин реперфузии (C) и активность каспазы-3 после 4 ч реперфузии (D), в отличие от контрольного пептида

- 3 049385

TAT-BNIP3-20C (n=6 мышей). Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Статистический анализ представляет собой двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони.

Фиг. 5. A Схематическое изображение in vitro реоксигенации (исследование проведено на человеческих кардиомиоцитах желудочка, полученных из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (человеческие КМ). Человеческие КМ подвергали воздействию нормоксии и 2-ч реоксигенации после гипоксии, и воздействовали на них TAT-BNIP3-20A и контрольным пептидом BNIP3-20C. B TAT-BNIP3-20A заметно ингибирует взаимодействие BNIP3 с митохондриями. C Репрезентативные изображения апоптотических, некротических и здоровых человеческих КМ. Масштабная линейка, 1 мм (слева), 200 мкм (справа). TAT-BNIP3-20A эффективно предотвращает гибель человеческих КМ при реоксигенации. D Репрезентативные изображения деполяризованных митохондрий, здоровых митохондрий, ядра. TAT-BNIP3-20A уменьшает потерю потенциала внутренней митохондриальной мембраны, индуцируемую реоксигенацией. Масштабная линейка, 400 мкм (слева), 100 мкм (справа). Контрольный пептид TAT-BNIP3-20C был неэффективен для ингибирования взаимодействия BNIP3 с митохондриями, потери потенциала внутренней митохондриальной мембраны и гибели клеток. Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Статистический анализ представляет собой двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони.

Фиг. 6. A Структура последовательности BNIP3-8B. B Структура последовательности BNIP3-8C. C Результаты спектроскопического анализа методом кругового дихроизма (КД) BNIP3-8B.

Фиг. 7. A Поглощение флуоресцентно меченого TAT-BNIP3-8B в различных органах через 5 мин реперфузии после окклюзии сосуда. TAT-BNIP3-8B вводили за 5 мин до начала реперфузии. B Выживание выделенных взрослых кардиомиоцитов, обработанных TAT-BNIP3-8B и контрольным пептидом TAT-BNIP3-8C через 24 ч.

Фиг. 8. Фармакокинетика TAT-BNIP3-8B. Флуоресцентно-меченый BNIP3-8B инкубировали в человеческой сыворотке (А), плазме (В) и цельной крови (C) при 37°C в течение указанных периодов времени и анализировали методом вестерн-блоттинга. Обработку протеазой K использовали в качестве контроля.

Фиг. 9. TAT-BNIP3-20A уменьшает размер зоны инфаркта in vivo. A Схематическое изображение in vivo модели инфаркта миокарда. Мышам проводили 5-мин и 24-ч реперфузию после окклюзии сосуда, соответственно. Пептид вводили в левый желудочек за 5 мин до начала реперфузии. B Вестерн-блот анализ TAT-BNIP3-8B, иммунопреципитированного совместно с BNIP3 и BAX, через 5 мин после реперфузии. C Иммуноблот цитозольных BNIP3 и BAX в зоне риска после синего окрашивания обычного ПААГ в начале эксперимента и после 10 мин реперфузии. Мышам вводили растворитель (NaCl) и TAT-BNIP38B. Ложно прооперированные мыши служили в качестве контроля. D, E Размеры зоны инфаркта после 24 ч реперфузии у мышей дикого типа, получавших растворитель, TAT-e-Gal, контрольный пептид TATBNIP3-8C и указанные дозы TAT-BNIP3-8B (n=7-10 мышей). TAT-BNIP3-8B значительно уменьшает размер зоны инфаркта дозозависимым образом. Растворитель, TAT-e-Gal и TAT-BNIP3-8C были неэффективны для уменьшения зоны инфаркта.

Фиг. 10. BNIP3-8B уменьшает реперфузионное повреждение миокарда in vivo. Мышам проводили реперфузию в течение указанных периодов времени после окклюзии сосуда in vivo. Пептид вводили в левый желудочек за 5 мин до начала реперфузии. TAT-BNIP3-8B ингибирует взаимодействие BNIP3 (A) и BAX (B) с митохондриями после 10 мин реперфузии, набухание митохондрий после 10 мин реперфузии (C), активацию BAX после 30 мин реперфузии (D), высвобождение цитохрома c после 30 мин реперфузии (E) и активность каспазы-3 после 4 ч реперфузии (F), в отличие от контрольного пептида TAT-BNIP3-8C (n=5-12 мышей). Ложно прооперированные мыши служили в качестве контроля (n=5-8 мышей). Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Статистический анализ представляет собой двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони.

Фиг. 11. A Схема дизайна in vitro исследования реоксигенации с человеческими кардиомиоцитами желудочка, полученными из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (человеческие КМ). Человеческие КМ подвергали воздействию нормоксии и 2 ч реоксигенации после гипоксии, и воздействовали на них TAT-BNIP3-8B и контрольным пептидом TAT-BNIP3-8C. B TATBNIP3-8B эффективно ингибирует гибель человеческих КМ при реоксигенации. Репрезентативные изображения апоптотических, некротических и здоровых человеческих КМ. C TAT-BNIP3-8B уменьшает потерю потенциала внутренней митохондриальной мембраны, индуцируемое реоксигенацией. Репрезентативные изображения деполяризованных митохондрий, здоровый митохондрий, ядра. Масштабная линейка, 200 мкм. Контрольный пептид BNIP3-8C был неэффективен для ингибирования гибели клеток и потери потенциала внутренней митохондриальной мембраны. Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Статистический анализ представляет собой двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони.

Фиг. 12. TAT-BNIP3-8B уменьшает размеры зоны инфаркта головного мозга через 24 ч реперфузии после временной окклюзии средней мозговой артерии, в сравнении с воздействием растворителя. TAT

- 4 049385

BNIP3-8B и растворитель вводили срезу после реперфузии. Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Использовали непарный t-критерий Стьюдента, и статистическую значимость устанавливали на уровне P<0,05.

Фиг. 13. TAT-BNIP3-8B уменьшает размеры зоны инфаркта через 4 ч реперфузии после окклюзии левой коронарной артерии, в сравнении с воздействием растворителя, у свиньи. TAT-BNIP3-8B и растворитель вводили за 5 мин до реперфузии. Данные представляют собой средние значения ± s.e.m. Использовали непарный t-критерий Стьюдента, и статистическую значимость устанавливали на уровне P<0,05.

Фиг. 14. TAT-BNIP3-8B защищает от индуцированного доксорубицином повреждения митохондрий за счет предотвращения набухания митохондрий. Клетки HL-1 обрабатывали 5 мкМ раствором доксорубицина без, или с, TAT-BNIP3-8B, и набухание митохондрий определяли по оптической плотности, где набухшие митохондрии имеют более низкое значение OD₅₄₀. Необработанные клетки использовали в качестве контроля.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к способам, соединениям и композициям для лечения заболевания или состояния у субъекта, у которого желательно ингибировать индивидуальную активность, и взаимодействие между путями, взаимодействующего с BCL-2 и аденовирусным 19-кДа белком E1B белка 3 (BNIP3), BCL-2-ассоциированного белка X (BAX) и митохондрий для предотвращения повреждения клеток и гибели клеток.

В одном аспекте изобретение относится к пептиду, ингибирующему трехсторонний комплекс BNIP3, BAX и митохондрий, который активирует каскады повреждения клеток и гибели клеток. Пептид по изобретению содержит сигнал клеточного поглощения и фрагмент BNIP3, содержащий аминокислоты положений 13-20 в BNIP3 или полученную из них аминокислотную последовательность, и, как правило, имеет длину 50, в частности 40 или менее аминокислот.

Фрагмент BNIP3.

Фрагмент BNIP3 в пептиде по настоящему изобретению, в частности, способен связываться с BAX и/или BNIP3. Главным образом, фрагмент BNIP3 способен связываться с BNIP3-связывающей областью BAX, такой как область аминокислот 108-164 в BAX. Фрагмент BNIP3, в частности, способен препятствовать, или ингибировать взаимодействие BNIP3 и BAX.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 имеет длину 20 или менее аминокислот. В частности, его длина составляет 15 или менее аминокислот, или даже 10 или менее аминокислот. В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 имеет длину 8 аминокислот.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 имеет аминокислотную последовательность белка BNIP3. Используемый в настоящем документе термин BNIP3, в частности, относится к мышиному взаимодействующему с BCL-2 и аденовирусным 19-кДа белком E1B белку 3, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Таким образом, фрагмент BNIP3 может иметь аминокислотную последовательность, идентичную непрерывному фрагменту аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, который содержит аминокислотную последовательность положений 13-20. Например, фрагмент BNIP3 может иметь аминокислотную последовательность положений 1-20 в SEQ ID NO: 1. В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из положений 4-20 в SEQ ID NO: 1, положений 11-20 в SEQ ID NO: 1, положений 12-20 в SEQ ID NO: 1 и положений 13-20 в SEQ ID NO: 1. В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 состоит из аминокислотной последовательности положений 13-20 в SEQ ID NO: 1. В этих вариантах осуществления фрагмент BNIP3, в частности, не содержит никакие дополнительные аминокислотные остатки. Аминокислотная последовательность положений 13-20 мышиного BNIP3 идентична аминокислотной последовательности положений 73-80 человеческого BNIP3 (SEQ ID NO: 2). В качестве альтернативы аминокислотным последовательностям мышиного BNIP3, описанным в настоящем документе, можно также использовать соответствующие аминокислотные последовательности человеческого BNIP3.

В следующих вариантах осуществления фрагмент BNIP3 имеет аминокислотную последовательность, полученную из BNIP3. Целевая аминокислотная последовательность получена из, или соответствует, эталонной аминокислотной последовательности, если целевая аминокислотная последовательность имеет гомологию или идентичность по всей ее длине с соответствующим фрагментом эталонной аминокислотной последовательности, составляющую по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. В конкретных вариантах осуществления целевая аминокислотная последовательность, которая получена из, или соответствует, эталонной аминокислотной последовательности, является на 100% гомологичной, или, в частности, на 100% идентичной, по всей ее длине с соответствующим фрагментом эталонной аминокислотной последовательности. Гомологию или идентичность аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности по изобретению предпочтительно определяют по всей длине эталонной последовательности или по всей

- 5 049385 длине соответствующего фрагмента эталонной последовательности, который соответствует последовательности, гомологию или идентичность которой определяют. Фрагмент BNIP3, в частности, может быть получен из одного из фрагментов BNIP3, описанных выше. Например, фрагмент BNIP3 может иметь аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична, в частности, по меньшей мере на 70% идентична, аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из положений 1-20 в SEQ ID NO: 1, положений 4-20 в SEQ ID NO: 1, положений 1120 в SEQ ID NO: 1, положений 12-20 в SEQ ID NO: 1 и положений 13-20 в SEQ ID NO: 1. В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична положениям 13-20 в SEQ ID NO: 1.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 содержит аминокислоты положений 13-20 в BNIP3, необязательно, имея 1, 2 или 3 аминокислотные замены в сравнении с положениями 13-20 в BNIP3. BNIP3, в частности, имеет аминокислотную последовательность SEQ DI NO: 1. В этих вариантах осуществления 1, 2 или 3 аминокислотные замены предпочтительно находятся в одном или более из положений, соответствующих положениям 13, 15, 17, 18, 19 и 20 в BNIP3, в частности, положениям 15, 17 и 19 в BNIP3. В частности, аминокислотные замены выбраны из группы, состоящей из (i) замены глутаминовой кислоты в положении 15 в BNIP3 на фенилаланин, изолейцин, лейцин, валин, тирозин, цистеин, гистидин, аргинин или треонин, (ii) замены гистидина в положении 17 в BNIP3 на валин, и (iii) замены серина в положении 19 в BNIP3 на тирозин, цистеин, фенилаланин или гистидин.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 содержит аминокислоты положений 13-20 в BNIP3, имея 1 или 2 аминокислотные замены в сравнении с положениями 13-20 в BNIP3, где аминокислотные замены выбраны из группы, состоящей из (i) замены глутаминовой кислоты в положении 15 в BNIP3 на гистидин, изолейцин, лейцин, валин или тирозин, и (ii) замены серина в положении 19 в BNIP3 на тирозин, цистеин или фенилаланин.

В конкретных вариантах осуществления серин в положении 19 в BNIP3 заменен на тирозин, цистеин или фенилаланин, в частности, на фенилаланин.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 содержит, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-17. В специальных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или 8, в частности, 8.

Фрагмент BNIP3 может, необязательно, содержать дополнительные аминокислотные остатки из BNIP3. В частности, весь фрагмент BNIP3 получен из непрерывной аминокислотной последовательности BNIP3. В частности, весь фрагмент BNIP3 получен из аминокислот положений 1-20 в BNIP3, или их части, включающей по меньшей мере положения 13-20 в BNIP3. Фрагмент BNIP3 может иметь аминокислотную последовательность, идентичную соответствующему фрагменту BNIP3, или может иметь 1-8 аминокислотных замен, в частности, 1-6 аминокислотных замен. Фрагмент BNIP3 может, например, содержать аминокислоты положений 12-20 в BNIP3, необязательно, имея 1, 2, 3 или 4 аминокислотные замены в сравнении с положениями 12-20 в BNIP3, или он может содержать аминокислоты положений 4-20 в BNIP3, необязательно, имея 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных замен в сравнении с положениями 4-20 в BNIP3, или он может содержать аминокислоты положений 1-20 в BNIP3, необязательно, имея 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных замен в сравнении с положениями 1-20 в BNIP3. В частности, 1, 2 или 3 из этих аминокислотных замен находятся в положениях 13-20, и остальные аминокислотные замены находятся в положениях 1-12. В этих вариантах осуществления аминокислотные замены предпочтительно находятся в одном или более из положений, соответствующих положениям 4, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19 и 20 в BNIP3, в частности, положениям 4, 11, 12, 15, 17 и 19 в BNIP3.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-30 и 70-75.

Замененный аминокислотный остаток, в частности, заменен на другой природный аминокислотный остаток. Используемый в настоящем документе термин замена также охватывает использование химически дериватизированного остатка вместо не дериватизированного остатка, при условии, что такой полипептид проявляет необходимую активность. Используемый в настоящем документе термин производное относится к пептиду, в котором один или более остатков химически дериватизированы в результате реакции функциональной боковой группы. Такие дериватизированные молекулы включают, например, молекулы, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы, с получением гидрохлоридов амина, п-толуолсульфонильных групп, карбобензокси-групп, третбутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы, с образованием солей, метиловых и этиловых сложных эфиров или других видов сложных эфиров или гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы, с образованием O-ацильных или O-алкильных производных. Имидазольный азот гистидина может быть дериватизирован, с образованием N-им-бензилгистидина. В

- 6 049385 качестве производных также включены пептиды, которые содержат одно или более производных природных аминокислот из двадцати стандартных аминокислот. Например: 4-гидроксипролином может быть заменен пролин; 5-гидроксилизином может быть заменен лизин; 3-метилгистидином может быть заменен гистидин; гомосерином может быть заменен серин и орнитином может быть заменен лизин.

В некоторых вариантах осуществления термин замена охватывает связь двух или более замененных аминокислотных остатков. В частности, два или более аминокислотных остатков могут быть заменены сшиваемыми молекулами, и/или связанными, и каждый, необязательно, имеет дополнительную α-углеродную замену, выбранную из необязательно замещенного гетеро-низшего алкила, в частности, необязательно замещенного гетеро-метила, этила, пропила и бутила. Кроме того, два замененных аминокислотных остатка могут быть заменены остатками гомоцистеина, связанными дисульфидным мостом, с образованием кольца и хвостового циклического пептида. Альтернативно, два или более замененных аминокислотных остатков могут быть заменены линкером. Подходящие в этом отношении линкеры включают, например, -(CH₂)_nONHCOX(CH₂)_m-, где X представляет собой CH2, NH или O, и m и n представляют собой целые числа от 1 до 4, с образованием лактама пептида; -CH2OCH2CHCHCH2OCH2-, с образованием эфира пептида, или -(CH₂)nCHCH(CH₂)m-, с образованием сшитого пептида.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент BNIP3 имеет по меньшей мере одну из замен E15Y, S19F и S19Y относительно последовательности BNIP3.

Сигнал клеточного поглощения.

Сигнал клеточного поглощения в пептиде по изобретению способен, в частности, опосредовать поглощение пептида клеткой-мишенью. В частности, сигнал клеточного поглощения способен опосредовать поглощение клеткой млекопитающего, в частности, клеткой человека.

В конкретных вариантах осуществления сигнал клеточного поглощения представляет собой пептид. В частности, сигнал клеточного поглощения представляет собой проникающий в клетку пептид или белковый домен трансдукции. Он может иметь длину 5-30 аминокислот, в частности, 8-20 аминокислот или 10-16 аминокислот.

Сигнал клеточного поглощения может, например, представлять собой гидрофильный пептид или амфифильный пептид. Примеры сигналов клеточного поглощения включают белковый домен трансдукции белка TAT ВИЧ (в частности, аминокислотные остатки 48-59), пенетратин, PTD антеннапедии, SynB1, SynB3, PTD-4, PTD-5, FHV Coat-(35-49), BMV Gag-(7-25), HTLV-II Rex-(4-16), DTat, R9-Tat, транспортан, MAP, SBP, FBP, MPG, MPG^(ANLS), Pep-1, Pep-2, полиаргинины и полилизины. В конкретных вариантах осуществления сигнал клеточного поглощения представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31-50.

Сигнал клеточного поглощения может состоять из природных аминокислотных остатков и может, необязательно, представлять собой пептидное производное, содержащее химически дериватизированный аминокислотный остаток, описанный в настоящем документе. Кроме того, он может представлять собой пептидомиметик или содержать D-ретро-инверсную последовательность. В конкретных вариантах осуществления сигнал клеточного поглощения содержит D-ретро-инверсную последовательность проникающего в клетку пептида, как описано в настоящем документе.

Пептид.

Пептид по изобретению содержит сигнал клеточного поглощения и фрагмент BNIP3. Используемый в настоящем документе термин содержит, помимо его прямого значения также включает, и конкретно подразумевает, термины состоит в основном из и состоит из. Таким образом, термин содержит относится к вариантам осуществления, в которых объект, который содержит конкретные перечисленные элементы, не содержит дополнительные элементы, а также к вариантам осуществления, в которых объект, который содержит конкретные перечисленные элементы, может содержать и/или действительно содержит дополнительные элементы. Аналогично, термин имеет следует понимать как термин содержит, также включающий, и конкретно подразумевающий, термины состоит в основном из и состоит из. Термин состоит в основном из, где это возможно, относится, в частности, к вариантам осуществления, в которых объект содержит 20% или менее, в частности, 15% или менее, 10% или менее, или, в частности, 5% или менее, других элементов в дополнение к конкретным перечисленным элементам, из которых в основном состоит объект.

В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению состоит из сигнала клеточного поглощения и фрагмента BNIP3.

В следующих вариантах осуществления пептид по изобретению содержит сигнал клеточного поглощения, фрагмент BNIP3 и линкер между сигналом клеточного поглощения и фрагментом BNIP3. В частности, пептид по изобретению состоит из сигнала клеточного поглощения, фрагмента BNIP3 и линкера между сигналом клеточного поглощения и фрагментом BNIP3. Линкер может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислот, или химический линкер. Линкер, в частности, имеет небольшой размер. Например, он представляет собой пептидный линкер, имеющий 10 или менее аминокислот, например, 8 или менее, 6 или менее, или 5 или менее аминокислот. Химический линкер, например, имеет молекулярную массу 1500 Да или менее, например, 1000 Да или менее, 750 Да или

- 7 049385 менее, или 500 Да или менее. В вариантах осуществления, в которых сигнал клеточного поглощения представляет собой пептидный фрагмент, линкер предпочтительно представляет собой пептидный линкер.

В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению имеет длину 40 или менее аминокислот. В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению имеет длину 35 или менее аминокислот, в частности, 30 или менее аминокислот. Пептид по изобретению может, например, иметь длину 25 или менее аминокислот, например, примерно 20 аминокислот. Более короткие пептиды являются особенно предпочтительными, поскольку они просты в производстве, формулировании и обращении. Таким образом, пептид по изобретению предпочтительно имеет длину 35 или менее аминокислот, в частности, 25 или менее аминокислот. Это особенно относится к вариантам осуществления, в которых сигнал клеточного поглощения представляет собой пептидный фрагмент. В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению имеет молекулярную массу 10000 Да или менее, в частности, 5000 Да или менее, 4000 Да или менее, или 3000 Да или менее.

В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 51-67.

Как правило, пептид по изобретению состоит из природных L-аминокислот. В конкретных вариантах осуществления пептид может также содержать искусственные аминокислоты. Например, пептид может содержать одну или более D-аминокислот, E-β-гомоаминокислот и/или N-метилированных аминокислот; или он может состоять из них. В конкретных вариантах осуществления сигнал клеточного поглощения и/или фрагмент BNIP3 представляют собой D-ретро-инверсную последовательность, в частности, D-ретро-инверсную последовательность аминокислотной последовательности, описанной в настоящем документе. Например, пептид имеет D-ретро-инверсную последовательность QPRRRQRRKKRG-NSFHLEVWSGQLNEEGSQSM (SEQ ID NO: 68) или QPRRRQRRKKRG-NSFHLEVW (SEQ ID NO: 69).

В конкретных вариантах осуществления пептид является ацетилированным, ацилированным, формилированным, амидированным, фосфорилированным, сульфатированным, нитрозированным, гликозилированным, сумоилированным, гидроксилированным, алкилированным и/или изомеризованным. Например, пептид может содержать N-концевую ацетильную, формильную, миристоильную, пальмитоильную, карбоксильную или 2-фурозильную группу, и/или C-концевую гидроксильную, амидную, сложноэфирную или тиоэфирную группу. Кроме того, пептид может быть циклизованным.

В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению представляет собой пептидомиметик любых пептидов, описанных в настоящем документе. Используемый в настоящем документе термин пептидомиметик относится к структурам, которые служат заменителями пептидов при взаимодействиях между молекулами. Пептидомиметики включают синтетические структуры, которые могут содержать, или не содержать, аминокислоты и/или пептидные связи, но сохраняют структурные и функциональные признаки пептида BNIP3. Пептидомиметики также включают молекулы, в которых пептиды заключены в более крупных молекулах с другими функциональными элементами, пептоидами, олигопептоидами, а также пептидные библиотеки, содержащие пептиды расчетной длины, представляющие все возможные последовательности аминокислот, соответствующие пептиду по изобретению. Все эти пептиды, а также молекулы, в значительной степени гомологичные, комплементарные или иным образом функционально или структурно эквивалентные этим пептидам, могут быть использованы для целей настоящего изобретения.

В конкретных вариантах осуществления пептид по изобретению находится в композиции, дополнительно содержащей наночастицы. В частности, пептид находится внутри наночастицы. Наночастицы могут представлять собой любые наночастицы, подходящие для инкапсуляции пептида. Иллюстративные наночастицы включают липосомы, наноэмульсии, твердо-жидкие наночастицы, наноструктурированные липидные носители, полимерные наночастицы и дендримеры. В конкретных вариантах осуществления наночастица содержит направляющие молекулы на ее внешней поверхности, такие как пептиды, лиганды или антитела, позволяющие направлять пептид по изобретению в нужные клетки или ткани.

В конкретных вариантах осуществления наночастицы делают возможным поглощение пептида по изобретению клетками-мишенями. В этих вариантах осуществления наночастица может выполнять роль сигнала клеточного поглощения и, в частности, представлять собой, или заменять, сигнал клеточного поглощения. Таким образом, настоящее изобретение также относится к наночастице, содержащей фрагмент BNIP3, описанный в настоящем документе.

Варианты терапевтического применения пептида.

Изобретение относится к способам, соединениям и композициям для лечения заболевания или состояния у субъекта, у которого желательно ингибировать индивидуальную активность, и взаимодействие между путями, BNIP3, BAX и митохондрий, включающим введение субъекту соединения в количестве, эффективном для лечения заболевания или состояния у субъекта.

- 8 049385

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим пептид по изобретению. В частности, фармацевтические композиции содержат пептид по изобретению в форме стандартной вводимой дозы. Изобретение также относится к способам ингибирования повреждения клеток и гибели клеток, включающим введение человеку, который нуждается в этом, эффективного количества пептида по изобретению. Настоящее изобретение также относится к применению пептида по изобретению или фармацевтической композиции, содержащей его, в медицине, в частности, для лечения связанных с реперфузией и/или связанных с митохондриями заболеваний, а также вызванной противораковой терапией кардиотоксичности, и для предотвращения таковых, соответственно.

Изобретение включает все сочетания перечисленных конкретных вариантов осуществления, как если бы каждое сочетание было перечислено в отдельности.

Изобретение также относится к способу ингибирования BNIP3 у субъекта, включающему создание контакта BNIP3 с одним или более из любых пептидов, или фармацевтических композиций, раскрытых в настоящем документе, в количестве, эффективном для ингибирования BNIP3. Предпочтительно, BNIP3 находится в организме субъекта, и один или более пептидов, или композиций, вводят субъекту.

Изобретение также относится к способу ингибирования BAX у субъекта, включающему создание контакта BAX с одним или более из любых пептидов, или фармацевтических композиций, раскрытых в настоящем документе, в количестве, эффективном для ингибирования BAX. Предпочтительно, BAX находится в организме субъекта, и один или более пептидов, или композиций, вводят субъекту.

Изобретение также относится к способу ингибирования активности димера и/или олигомера BNIP3/BAX у субъекта, включающему создание контакта димеров и/или олигомеров BNIP3/BAX с одним или более из любых пептидов, или фармацевтических композиций, раскрытых в настоящем документе, в количестве, эффективном для ингибирования активности димера/олигомера BNIP3/BAX. Предпочтительно, BNIP3 и BAX находятся в организме субъекта, и один или более пептидов, или композиций, вводят субъекту.

Изобретение также относится к способу лечения связанных с реперфузией и/или связанных с митохондриями заболеваний у субъекта, включающему введение пептида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту в терапевтически эффективном количестве.

Изобретение также относится к способу лечения или предотвращения повреждения тканей вследствие индуцируемого митохондриями апоптоза или некроза у субъекта, включающему введение пептида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту в терапевтически эффективном количестве. Пептид можно вводить субъекту до, в процессе и/или после наступления гибели или повреждения клеток.

Субъект, которому вводят пептид или фармацевтическую композицию и который получает лечение, может иметь, например, заболевание или состояние, выбранное из группы, состоящей из гипоксических и/или ишемических клеток; ишемии сердца, головного мозга, печени, почки, кишечника, конечностей, окклюзии сосудов конечностей; реперфузионного повреждения сердца, головного мозга, печени, почки, кишечника, конечностей; инфаркта и реперфузионного повреждения миокарда; вызванной химиотерапией, радиотерапией, таргетированной терапией и иммунотерапией кардиотоксичности; атеросклероза; сердечной недостаточности; трансплантации сердца, печени, почки; аневризмы; хронического заболевания легких; ишемической болезни сердца; гипертензии; легочной гипертензии; эмболии; тромбоза; кардиомиопатии; инсульта; нейродегенеративного заболевания или нарушения; иммуннологического заболевания; почечной гипоксии; гепатита; заболевания печени; заболевания почек; мозжечковой дегенерации; отторжения трансплантированного органа, а также заболевания или нарушения, включающего гибель клеток и/или повреждение тканей. В конкретных вариантах осуществления субъект имеет связанное с ишемией, реперфузией и/или митохондриями заболевание, особенно после окклюзии сосуда, в частности, инфаркт миокарда, ишемический инсульт, острое повреждение почек, травму, остановку кровообращения и ишемию при трансплантации органов. В следующих вариантах осуществления субъект страдает от вызванной противораковой терапией кардиотоксичности, например, кардиотоксичности, вызванной химиотерапией, радиотерапией, иммунотерапией и/или таргетированной терапией. Или субъект может подвергаться любому виду противораковой терапии, и лечение может применяться для профилактики кардиотоксичности. Химиотерапия, в частности, представляет собой химиотерапию антрациклином, например, химиотерапию доксорубицином. В конкретном варианте осуществления субъект страдает от кардиотоксичности, вызванной химиотерапией антрациклином, например, химиотерапией доксорубицином.

Связанное с реперфузией заболевание обычно может представлять собой заболевание, включающее реперфузионное повреждение. Реперфузионное повреждение представляет собой повреждение тканей, вызванное, например, при восстановлении кровоснабжения в тканях после периода ишемии, при котором восстановление кровообращения приводит к воспалению и окислительному повреждению в результате индукции окислительного стресса, а не восстановления нормальной функции. Изобретение, таким образом, относится к способу лечения реперфузионного повреждения у субъекта, включающему

- 9 049385 введение пептида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту в терапевтически эффективном количестве.

Изобретение также относится к способу лечения острого инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения миокарда или сердечной недостаточности у субъекта, включающему введение субъекту одного или более из пептидов, или фармацевтических композиций, раскрытых в настоящем документе, в количестве, эффективном для лечения острого инфаркта миокарда, реперфузионного повреждения миокарда или сердечной недостаточности у субъекта, который нуждается в этом. Предпочтительно, один или более пептидов, или фармацевтических композиций, вводят в количестве, эффективном для ингибирования активности BNIP3, BAX или димеров/олигомеров BNIP3/BAX, соответственно, у субъекта.

В конкретных вариантах осуществления лечение включает облегчение и/или предотвращение связанного с реперфузией и митохондриями повреждения. В следующих вариантах осуществления лечение включает облегчение и/или предотвращение вызванной противораковой терапией кардиотоксичности.

Субъектом может являться, например, млекопитающее, и предпочтительно является человек.

Используемый в настоящем документе термин лечение, или лечить, заболевания или нарушения означает ослабление или облегчение, или устранение, признака или симптома заболевания или нарушения, которое подвергают лечению. Когда пептиды или композицию вводят субъекту до, или в момент начала, заболевания или нарушения, пептиды или композиция могут предотвращать или уменьшать степень тяжести заболевания или нарушения. Например, введение пептидов или композиции субъекту может предотвращать или уменьшать степень тяжести вызванной противораковой терапией кардиотоксичности, например, вызванной химио-, радио-, таргетированной или иммунотерапией кардиотоксичности. В этих вариантах осуществления пептид по изобретению можно вводить до, в процессе и/или после противораковой терапии. Введение пептидов может включать превентивное и/или терапевтическое введение.

Пептиды и композиции по настоящему изобретению можно вводить субъектам с использованием путей введения, известных в данной области. Введение может быть системным или локализованным в конкретном участке. Пути введения включают, но без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутрисердечную, интратекальную или подкожную инъекцию, пероральное или ректальное введение, а также инъекцию в определенный участок тела.

В конкретных вариантах осуществления пептид или фармацевтическую композицию по изобретению вводят субъекту в процессе или после возникновения нарушения кровоснабжения, ишемии или окклюзии сосуда, в частности, до реперфузии ткани, поврежденной вследствие окклюзии сосуда. В конкретных вариантах осуществления пептид или фармацевтическую композицию вводят в пределах 6 часов до реперфузии, в частности, в пределах 4 ч, в пределах 2 ч или в пределах 1 ч до реперфузии. В конкретных вариантах осуществления пептид или фармацевтическую композицию вводят в пределах 45 мин, в частности, в пределах 30 мин до реперфузии.

Все сочетания различных элементов, описанных в настоящем документе, входят в объем изобретения, если в настоящем документе нет иных указаний, или если это не противоречит контексту.

Способ может включать экспрессию в клетке эффективного количества пептида по изобретению, при этом апоптоз, некроз, или их сочетание, изменяются в клетке в сравнении с контрольной клеткой. Экспрессия может включать, например, введение полинуклеотида, кодирующего пептид, в клетку. Клетка может находиться ex vivo или in vivo, и может представлять собой клетку сердца. Апоптоз, некроз, или их сочетание, могут уменьшаться в клетке.

Настоящее изобретение относится к способу, включающему введение субъекту, который нуждается в этом, эффективного количества композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению, когда апоптоз, некроз, или их сочетание, увеличены у субъекта. Введение может включать доставку полинуклеотида в ткань сердца, ткань мозга, ткань печени и ткань почки. Субъект может иметь признаки, или риск развития, заболевания, выбранного из острого инфаркта, гипоксии, ишемии, инсульта или сосудистого заболевания. Способ может приводить к уменьшению признаков заболевания.

Используемый в настоящем документе термин полинуклеотид означает полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, и охватывает как двухцепочечные, так и одноцепочечные РНК и ДНК. Полинуклеотид может быть получен непосредственно из природного источника, или может быть получен при помощи рекомбинантных, ферментативных или химических методов. Полинуклеотид топологически может быть линейным или кольцевым. Полинуклеотид может представлять собой, например, часть вектора, такого как экспрессионный или клонирующий вектор, или фрагмент. Полинуклеотид может включать нуклеотидные последовательности, имеющие разные функции, включая, например, кодирующие области и не кодирующие области, такие как регуляторные области.

Используемый в настоящем документе термин ген означает нуклеотидную последовательность, кодирующую мРНК. Ген имеет на его 5'-конце сайт инициации транскрипции, и терминатор транскрипции на его 3'-конце. Используемый в настоящем документе термин целевой ген означает

- 10 049385 конкретный ген, экспрессию которого ингибирует полинуклеотид, описанный в настоящем документе. Используемый в настоящем документе термин целевая мРНК означает мРНК, закодированную целевым геном. Если нет иных указаний, целевой ген может приводить ко множеству мРНК, отличающихся использованием различных комбинаций экзонов. Такие родственные мРНК называют сплайс-вариантами или вариантами транскрипта гена.

В настоящем документе термины кодирующая область и кодирующая последовательность используются взаимозаменяемо и означают нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид и, будучи помещенной под контроль соответствующих регуляторных последовательностей, экспрессирует закодированный полипептид. Границы кодирующей области обычно определяются кодоном инициации трансляции на ее 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на ее 3'-конце. Регуляторная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая регулирует экспрессию кодирующей последовательности, с которой она функционально связана. Неограничивающие примеры регуляторных последовательностей включают промоторы, энхансеры, сайты инициации транскрипции, сайты начала трансляции, сайты остановки трансляции и терминаторы транскрипции. Термин функционально связанные относится к соединению компонентов таким образом, что они находятся в отношениях, позволяющих им функционировать по своему назначению. Регуляторная последовательность функционально связана с кодирующей областью, когда они связаны таким образом, что экспрессия кодирующей области достигается в условиях, определяемых регуляторной последовательностью.

Полинуклеотид, который включает кодирующую область, может содержать гетерологичные нуклеотиды, фланкирующие с одной, или с обеих сторон кодирующую область. Используемый в настоящем документе термин гетерологичные нуклеотиды означает нуклеотиды, обычно не фланкирующие кодирующую область, которая присутствует в клетке дикого типа. Например, кодирующая область, имеющаяся у микроорганизма дикого типа и кодирующая полипептид, фланкирована гомологичными последовательностями, и любую другую нуклеотидную последовательность, фланкирующую кодирующую область, считают гетерологичной. Примеры гетерологичных нуклеотидов включают, но без ограничения, регуляторные последовательности. Как правило, гетерологичные нуклеотиды присутствуют в полинуклеотиде по настоящему изобретению в результате использования стандартных генетических и/или рекомбинантных методов, хорошо известных специалисту в данной области. Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть включен в соответствующий вектор. Присутствие гетерологичных нуклеотидов, фланкирующих с одной, или с обеих сторон полинуклеотид, описанный в настоящем документе, является следствием манипуляций человека.

Используемые в настоящем документе термины комплемент и комплементарные относятся к способности двух одноцепочечных полинуклеотидов спариваться основаниями друг с другом, где аденин на одной цепи полинуклеотида будет образовывать пары оснований с тимином или урацилом на цепи второго полинуклеотида, и цитозин на одной цепи полинуклеотида будет образовывать пары оснований с гуанином на цепи второго полинуклеотида. Два полинуклеотида являются комплементарными друг другу, когда нуклеотидная последовательность в одном полинуклеотиде может образовывать пары оснований с нуклеотидной последовательностью во втором полинуклеотиде. Например, 5'-ATGC и 5'-GCAT являются комплементарными. Используемый в настоящем документе термин существенный комплемент, и его аналоги, относятся к полинуклеотиду, который способен избирательно гибридизироваться с конкретным полинуклеотидом в строгих условиях гибридизации. Гибридизация в строгих условиях может иметь место при определенных значениях pH, концентрации соли и температуры. Значение pH может варьироваться от 6 до 9, предпочтительно от 6,8 до 8,5. Концентрация соли может варьироваться от 0,15 M натрия до 0,9 M натрия, и могут быть использованы другие катионы при условии, что ионная сила эквивалентна таковой для натрия. Температура реакции гибридизации может варьироваться от 30°C до 80°C, предпочтительно от 45°C до 70°C. Кроме того, и другие соединения могут быть добавлены в реакционную смесь для гибридизации с целью стимуляции конкретной гибридизации при более низких температурах, например, соответствующих, или примерно соответствующих, комнатной температуре. В число соединений, предусмотренных для снижения требований к температуре, входит формамид. Таким образом, полинуклеотид, как правило, является существенно комплементарным второму полинуклеотиду, если между полинуклеотидом и вторым полинуклеотидом происходит гибридизация. Используемый в настоящем документе термин специфическая гибридизация означает гибридизацию между двумя полинуклеотидами в строгих условиях гибридизации.

Полинуклеотид, который включает кодирующую область, может содержать гетерологичные нуклеотиды, фланкирующие с одной, или с обеих сторон кодирующую область. Используемый в настоящем документе термин гетерологичные нуклеотиды означает нуклеотиды, обычно не фланкирующие кодирующую область, которая присутствует в клетке дикого типа. Например, кодирующая область, имеющаяся у микроорганизма дикого типа и кодирующая полипептид, фланкирована гомологичными последовательностями, и любую другую нуклеотидную

- 11 049385 последовательность, фланкирующую кодирующую область, считают гетерологичной. Примеры гетерологичных нуклеотидов включают, но без ограничения, регуляторные последовательности. Как правило, гетерологичные нуклеотиды присутствуют в полинуклеотиде по настоящему изобретению в результате использования стандартных генетических и/или рекомбинантных методов, хорошо известных специалисту в данной области. Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть включен в соответствующий вектор. Присутствие гетерологичных нуклеотидов, фланкирующих с одной, или с обеих сторон полинуклеотид, описанный в настоящем документе, является следствием манипуляций человека.

Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения повреждения клеток или гибели клеток, включающему создание контакта клеток с пептидом по изобретению. Способ можно применять in vitro или in vivo и, в частности, применяют ex vivo.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на соединение, подходящее для предотвращения связанных с реперфузионным повреждением и/или митохондриями заболеваний и/или вызванной противораковой терапией кардиотоксичности, включающему (i) получение одного или более соединений-кандидатов;

Соединения-кандидаты могут представлять собой любые подходящие соединения, в частности, включая пептиды и низкомолекулярные соединения.

Примеры

Пример 1. BNIP3 представляет собой терапевтическую мишень при И/Р повреждении.

Сочетание некротической и апоптотической гибели кардиомиоцитов является отличительной чертой ранней стадии реперфузионного повреждения. Митохондрии играют важную роль в обоих процессах. Член BNIP3 подгруппы BH-only семейства BCL2 является потенциальным активатором митохондриальных каскадов некротической и апоптотической клеточной гибели в культуре клеток и изолированных сердцах крысы^31,32,36-38. Ранее была установлена связь BNIP3 с ремоделированием левого желудочка после острого инфаркта миокарда и сердечной недостаточностью с сохраненной фракцией выброса^33,39,40. Для изучения участия BNIP3 в И/Р повреждении, а также того, является ли BNIP3 перспективной мишенью для терапевтического вмешательства, мышам дикого типа и BNIP3дефицитным мышам проводили 24-ч реперфузию после окклюзии левой передней нисходящей коронарной артерии в клинически значимой in vivo модели^41-44 (фиг. 1A). Для отграничения пораженной зоны от непораженной зоны в аорту и коронарные артерии вводили синий краситель Эванса. Для установления границ нежизнеспособного миокарда, инфарктного участка в зоне риска, срезы сердца окрашивали трифенилтетразолия хлоридом (фиг. 1B). В соответствии с результатами предыдущего исследования на изолированных сердцах крыс с использованием хорошо известного доминантнонегативного ингибитора BNIP3³¹, генетическая абляция BNIP3 приводила к значительному уменьшению размера зоны инфаркта на 46% в сравнении с мышами дикого типа (фиг. 1C). Соответственно, восстановление BNIP3 у BNIP3-дефицитных мышей приводило к зоне инфаркта, сравнимой по размерам с таковой у мышей дикого типа, дозозависимым образом и исключало возможные побочные эффекты генетической делеции BNIP3 (фиг. 1C). Эти результаты указывают на то, что BNIP3 играет важную роль в развитии инфаркта in vivo.

Пример 2. BNIP3 является посредником BAX-индуцированной гибели клеток при И/Р повреждении.

Вызывающий гибель член BAX семейства BCL-2, по-видимому, находится на пересечении митохондриально-зависимого некроза и апоптоза в качестве эффекторного белка⁵. Критическим этапом для этого является транслокация BAX из цитозоля в митохондрии^37,45,46. Недавно авторы изобретения продемонстрировали фундаментальное взаимодействие BAX с BNIP3, происходящее в НММ кардиомиоцитов in vivo³⁵. Для определения того, происходит ли транслокация BAX в митохондрии, как наиболее значимый этап в гибели клеток, при И/Р и зависит ли она от BNIP3, сначала были исследованы изменения в митохондриальной концентрации BAX и BNIP3. Через 10 мин реперфузии после окклюзии сосуда уровень BAX в НММ заметно возрастает, наряду с увеличением митохондриальной концентрации BNIP3 (фиг. 2A и B). Совместная иммунопреципитация показала, что BNIP3 и BAX образуют гетеродимеры в НММ (фиг. 2C). Используя BNIP3-дефицитных мышей, авторы изобретения затем исследовали, является ли BNIP3 действующим ранее медиатором BAX для этой транслокации во время реперфузионного повреждения. В ранней фазе реперфузии при генетической абляции BNIP3 отсутствовало увеличение митохондриальной концентрации BAX, что свидетельствует о прямом действии BNIP3 (фиг. 2D). Для проверки того, что этот эффект действительно достигается за счет BNIP3, авторы изобретения вводили BNIP3 в сердца BNIP3-дефицитных мышей за 5 мин до начала процедуры по созданию инфаркта миокарда. Добавление BNIP3 восстанавливало транслокацию BAX в сердцах BNIP3-дефицитных мышей в ранней фазе реперфузии и исключало возможные побочные эффекты генетической делеции BNIP3 (фиг. 2D).

- 12 049385

Пример 3. Идентификация критической последовательности BNIP3, необходимой для ингибирования BNIP3 при И/Р повреждении.

Поскольку взаимодействие BNIP3 с BAX было признано важной активностью при реперфузионном повреждении in vivo на основании результатов совместной иммунопреципитации, авторы изобретения идентифицировали спирали α5, α6, α7 и α8 в BAX в качестве потенциальных сайтов связывания путем оценки пептидного микрочипа с библиотекой из 13 синтезированных пептидов BAX (фиг. 3A и B). Для данного исследования авторы изобретения предсказали 3D-структуру BNIP3 in silico методом гомологичного моделирования с использованием Modeller 9.15⁴⁷ (фиг. 3C). Созданная модель была скорректирована в соответствии с энергетическим минимумом при помощи NAMD 2.9 и силового поля CHARMM36. Модель BNIP3 включает 9 α-спиралей различной длины, составляющих 64%, за которыми следуют статистические клубки, составляющие 19%, и неопознанные структуры, составляющие 17%, что было подтверждено методом спектроскопии кругового дихроизма (фиг. 3D). Результаты вычислительного моделирования стыковки указывали на спирали α5, α6, α7 и α8 BAX и последовательность MSQSGEENLQGSWVELHFSN BNIP3 (аминокислоты 1-20; SEQ ID NO: 20) как на сайты взаимодействия (фиг. 3E), при этом первые 10 аминокислот сами по себе не связывались с BAX (фиг. 3F). Авторы изобретения предположили, что аминокислоты 1-20 в BNIP3 могут быть достаточными для противодействия активности BNIP3, и они спроектировали проникающий в клетку пептид, пептид TAT-BNIP3-20A, состоящий из белкового домена трансдукции TAT ВИЧ-1 (PTD, GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 31), Фиг. 3G)^48,49, связанного ковалентной связью с 20 аминокислотами, происходящими из аминокислот 1-20 в BNIP3 (фиг. 3H). Аминокислоты 42-61 из BNIP3 были использованы для получения контрольного пептида TAT-BNIP3-20C (фиг. 3I). К пептидным фрагментам присоединяли на N-конце ацетильную группу, и на C-конце амидную группу. Введение мышам дикого типа TAT-BNIP3-20A показало, что пептид поглощается миокардом (фиг. 3J) и взаимодействует там с эндогенным BNIP3.

Для изучения того, обладает ли TAT-BNIP3-20A, введенный за 5 мин до реперфузии - момент времени, важный для клинической практики, способностью препятствовать активности BNIP3 и уменьшать реперфузионное повреждение in vivo, авторы изобретения использовали конкретную мышиную модель инфаркта миокарда (фиг. 4A). Введение TAT-BNIP3-20A, но не растворителя и не TAT-BNIP3-20C, приводило к уменьшению размера зоны инфаркта на 37% (фиг. 4B). Это являлось результатом предотвращения пептидным фрагментом TAT-BNIP3-20A транслокации BNIP3 в митохондрии (фиг. 4C), приводя к существенному ингибированию активности каспазы-3, являющейся ключевым событием при И/Р после искажения митохондриальной мембраны (фиг. 4D).

Пример 4. Пептидный фрагмент TAT-BNIP3-20A ингибирует апоптотическую и некротическую гибель человеческих кардиомиоцитов.

Для удовлетворения необходимости в перенесении полученных результатов в другую систему, были проведены эксперименты по реоксигенации в желудочковых кардиомиоцитах человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (человеческие КМ) (фиг. 5A). Человеческие КМ подвергали 2-ч реоксигенации после гипоксии. Примечательно, что даже в человеческих КМ TAT-BNIP3-20A проявляет свои защитные свойства. BNIP3-20A способен предотвращать транслокацию человеческого BNIP3 в митохондрии (фиг. 5B), приводя к значительной защите митохондрий, о чем свидетельствовал низкий уровень деполяризации внутренней митохондриальной мембраны (фиг. 5C) и меньшее количество апоптотических и некротических клеток (фиг. 5D).

Пример 5. Идентификация и дизайн пептидного ингибитора активности BNIP3/BAX.

N-концевые укорочения пептидной последовательности BNIP3-20A, с последующей заменой отдельных остатков, показали, что пептид, содержащий аминокислоты 13-20 в сочетании с заменой Ser на Phe в положении 19, отличался значительно более сильным связыванием BNIP3 в анализе с пептидными микрочипами (смотри Таблицу 1).

Таблица 1

Укороченные фрагменты BNIP3-20A, проявляющие максимальную активность связывания с BNIP3

Последовательность (SEQ ID NO)	Интенсивность флуоресценции
MSQSGEENLQGSWVELHFSN (21)	1040,33
SGEENLQGSWVELHFSN (25)	2656,33
SWVELHFSN (29)	4889,33
WVELHFSN (7)	14410,00

На основании этих результатов авторы изобретения спроектировали пептид BNIP3-8B, состоящий из PTD, связанного ковалентной связью с 8 аминокислотами из аминокислот 13-20 в BNIP3, с заменой Ser-19 на Phe-19 (WVELHFFN (SEQ ID NO: 8); фиг. 6A). Для демонстрации необходимости остатка фенилаланина в пептидной последовательности авторы изобретения заменяли Phe-18 на Ala-18, а также His-17 на Ala-17, с получением пептида BNIP3-8C (фиг. 6B). Спектр кругового дихроизма BNIP3-8B показал, что пептид имеет конформацию статистического клубка (фиг. 6C).

- 13 049385

Кроме того, проводили исследования взаимодействия BNIP3/BNIP3 с пептидом BNIP3-20A, в котором отдельные остатки последовательности 1-20 BNIP3 дикого типа были заменены 18 нейтральными аминокислотами. Пептиды BNIP3 с конкретными аминокислотными заменами продемонстрировали повышенную способность к связыванию с BNIP3 (иллюстративные данные приведены в табл. 2).

Таблица 2

Пептиды BNIP3-20A с заменами, демонстрирующие максимальную способность связывания с BNIP3

Последовательность (SEQ ID NO)	Аминокислотная замена	Интенсивность флуоресценции
MSQSGEENLQGSWVELHFSN (21)	-	1040,33
MSQSGEENLQGSWVELCFSN (70)	H17 -> C	6787,00
MSQSGEENLQGCWVELHFSN (71)	S12 -> C	7038,00
MSQSGEENLQGSWVCLHFSN (72)	E15 -> C	7149,00
MSQSGEENLQGSWVELYFSN (73)	H17 -> Y	7988,00
MSQSGYENLQGSWVELHFSN (74)	E6 -> Y	13122,50
MSQSGEENLQYSWVELHFSN (75)	G11 -> Y	10230,33
MSQSGEENLQGSWVELHFFN (22)	S19 -> F	15000,00

Пример 6. In vitro и in vivo эффекты поглощения пептидного фрагмента TAT-BNIP3-8B, токсичность и стабильность.

Сначала авторы изобретения оценивали распределение и присутствие BNIP3-8B при внутрисердечном введении в момент наступления желаемого эффекта in vivo. Затем они оценивали фармакокинетический профиль TAT-BNIP3-8B в сыворотке, плазме и цельной крови человека и оценивали токсичность в выделенных взрослых кардиомиоцитах. TAT-BNIP3-8B поглощается сердцем, селезенкой и печенью, и присутствует в плазме крови (фиг. 7A). Таким образом, TAT-BNIP3-8B присутствует в сердце через 10 мин после начала реперфузии, в момент времени, когда происходит каскад гибели клеток за счет тройного комплекса ВМРЗ-ВАХ-митохондрии; кардиомиоциты не проявляли признаков явной токсичности (фиг. 7B), и период полураспада TAT-BNIP3-8B в сыворотке, плазме и цельной крови человека позволяет проявлять его ингибирующий потенциал in vivo (фиг. 8A-C). Инкубация TAT-BNIP3-8B с протеазой K служила в качестве контроля.

Пример 7. Механизм действия пептида TAT-BNIP3-8B.

Была выдвинута гипотеза, что TAT-BNIP3-8B связывается с мономерами и гомодимерами BNIP3 и BAX, а также с гетеродимерами и гетероолигомерами BNIP3/BAX, нарушая их активность. Для оценки механизма взаимодействия TAT-BNIP3-8B были проведены анализы наложения и моделирование стыковки для BNIP3/TAT-BNIP3-8B, а также BAX/TAT-BNIP3-8B. В обоих случаях результаты свидетельствовали о том, что TAT-BNIP3-8B связывается с BNIP3 и с BAX (данные не представлены).

Примечательно, что в модели инфаркта миокарда (фиг. 9A) через 5 мин после начала реперфузии эндогенные мономеры, гомо- и гетеродимеры BNIP3 и BAX были совместно иммунопреципитированы с флуоресцентно меченым TAT-BNIP3-8B (фиг. 9B). Кроме того, реперфузия способствовала олигомеризации BNIP3 и BAX, о чем свидетельствовало крупномасштабное образование олигомеров, состоящих из BNIP3 и 3 BAX (фиг. 9C). Эксперименты методами SDS-ПААГ и совместной иммунопреципитации выявили гетеро-взаимодействие BNIP3/BAX в олигомерных комплексах более высокого порядка, и эта олигомеризация была сильно подавлена воздействием TAT-BNIP3-8B (Фигура 9C).

Пример 8. TAT-BNIP3-8B уменьшает размер зоны инфаркта.

Затем авторы изобретения изучали эффективность и влияние введения TAT-BNIP3-8B за 5 мин до начала реперфузии в соответствующей модели инфаркта миокарда (фиг. 9A). Примечательно, что TATBNIP3-8B уменьшает размер зоны инфаркта дозозависимым образом на величину вплоть до 40% в сравнении с введением растворителя и TAT-e-Gal (фиг. 9D и E). Введение TAT-BNIP3-8C не оказывает заметного влияния на размер зоны инфаркта в сравнении с TAT-BNIP-8B, это указывает на важность остатка фенилаланина (фиг. 9D).

Пример 9. TAT-BNIP3-8B уменьшает митохондриальное искажение и каскад гибели клеток.

Митохондриальное повреждение может происходить в результате искажения внутренней митохондриальной мембраны (ВММ) и НММ. Критическим митохондриальным событием при некрозе является раннее открытие митохондриальной поры переходной проницаемости (мППП) в ВММ⁵⁰, что со временем вызывает исчезновение разности электрических потенциалов через ВММ, с последующим набуханием митохондрий и разрушением клеток. Ключевым митохондриальным событием в апоптозе является активация BAX, вызывающая экспонирование его трансмембранного домена и пермеабилизацию МОМ, что приводит к высвобождению апоптогена, например, цитохрома c, и последующей активации каспазы⁵¹. TAT-BNIP3-8B, инъецированный в левый желудочек за 5 мин до реперфузии в конкретной in vivo модели И/Р, предотвращает транслокацию BNIP3 и BAX в митохондрии, что приводит к ингибированию действующих далее механизмов клеточной гибели, включая набухание митохондрий, активацию BAX, высвобождение цитохрома c и активность каспазы-3.

- 14 049385

Пример 10. TAT-BNIP3-8B ингибирует апоптотическую и некротическую гибель кардиомиоцитов.

Было проверено, может ли TAT-BNIP3-8B ингибировать гибель клеток в случае человеческих КМ. Человеческие КМ подвергали 2-ч реоксигенации после гипоксии (фиг. 11A). BNIP3-8B значительно ингибирует некротическую и апоптотическую гибель клеток (фиг. 11B), а также потерю потенциала внутренней митохондриальной мембраны (фиг. 11C).

Пример 11. TAT-BNIP3-8B уменьшает размер зоны церебрального инфаркта.

Поскольку предполагается, что BNIP3 играет критическую роль в церебральной ишемии³⁸, авторы изобретения также оценивали эффекты пептида BNIP3-8B на клинический исход в мышиной модели фокальной церебральной реперфузии. Они подвергали мышей 24-ч реперфузии после 30-мин временной окклюзии средней мозговой артерии (вОСМА). Введение BNIP3-8B сразу после вОСМА приводило к значительному уменьшению размера зоны инфаркта на 52% (фиг. 12).

Пример 12. TAT-BNIP3-8B уменьшает размер зоны инфаркта у свиней.

Затем авторы изобретения изучали эффективность и влияние введения TAT-BNIP3-8B за 5 мин до начала реперфузии в свиной модели инфаркта миокарда. Свиней подвергали 60-минутной окклюзии левой передней нисходящей коронарной артерии, с последующей 4-ч реперфузией. Примечательно, что TAT-BNIP3-8B существенно уменьшает размер зоны инфаркта на 56% в сравнении с растворителем (фиг. 13).

Пример 13. TAT-BNIP3-8B защищает от индуцированного доксорубицином митохондриального повреждения.

Авторы изобретения оценивали эффекты пептида BNIP3-8B на индуцированное доксорубицином митохондриальное повреждение в клетках HL-1. Для отслеживания набухания митохондрий клетки HL-1 обрабатывали 5 мкМ раствором доксорубицина, воспроизводя пиковую концентрацию в плазме крови, достигаемую при стандартной инфузии у пациентов. Набухание митохондрий измеряли по оптической плотности при 540 нм, где увеличение митохондриального объема вследствие набухания приводит к уменьшению оптической плотности. TAT-BNIP3-8B, вводимый одновременно с доксорубицином, предотвращает набухание митохондрий, о чем свидетельствует увеличение показателей OD₅₄₀ (фиг. 14). Эти данные указывают на то, что TAT-BNIP3-8B может защищать митохондрии от повреждений, опосредованных химиотерапевтическими средствами, такими как антрациклины.

Пример 14. Методы.

Химические реактивы были получены от Sigma Aldrich. Антитела против BNIP3, тубулина, цитохрома c и BAX были получены от Abcam, и активированный BAX от Enzo.

Животные. Использовали самцов мышей примерно одного возраста (12 ± 3 недель) со средней массой тела 30 г. Мышей C57BL/6 дикого типа получали от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) и содержали в течение одной недели в местном помещении для животных для акклиматизации.

Мышей C57BL/6J-TgH (Bnip3^-/-) получали от профессора Gerald W. Dorn, Центр молекулярных сердечно-сосудистых исследований и кафедра педиатрии, Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо, США. Мыши были получены путем замены экзонов 2 и 3 кассетой устойчивости к неомицину³³. Мышей разводили и содержали в местном помещении для животных университетской клиники Эссена. Все эксперименты были одобрены местным этическим комитетом в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. (Директива 2010/63/EU).

In vivo модель инфаркта миокарда на мышах. Мышей дикого типа и Bnip3-дефицитных (Bnip3^-/-) мышей анестезировали внутривенной инъекцией кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), и интубировали. Параметры механической вентиляции были установлены на дыхательный объем от 2,1 до 2,5 мл и частоту дыхания 140 вдохов в минуту с помощью мышиного мини-вентилятора. Глубокую анестезию поддерживали путем добавления 2 об.% изофлурана к вентиляционному газу. Грудную клетку вскрывали путем боковой торакотомии (1-см левосторонний разрез между 3-м и 4-м ребрами). На левую коронарную артерию (ЛКА) накладывали проленовую нить 6-0, и поверх артерии помещали кусок мягкой силиконовой трубки. Коронарную окклюзию осуществляли путем затягивания и завязывания нити. После 30 мин окклюзии силиконовую трубку удаляли, а шов оставляли на месте. В случае более продолжительного времени реперфузии грудную клетку закрывали с помощью пролена 4-0. 2, 6 и 9 нмоль (в 50 мкл 0,9% хлорида натрия) BNIP3 вводили инъекцией в полость левого желудочка за 5 мин до окклюзии сосуда. Пептиды с 20 аминокислотами (2 нмоль/50 мкл) и пептиды с 8 аминокислотами (8 нмоль/50 мкл) в NaCl вводили за 5 мин до реперфузии. Инъекция хлорида натрия (50 мкл) служила в качестве контрольного воздействия.

In vivo модель инфаркта миокарда на свиньях. После индукции анестезии делали небольшой разрез над бедренной артерией и веной; сосуды изолировали. В артерии создавали небольшое отверстие и вводили канюлю. Кроме того, в бедренную вену или другую соответствующую вену устанавливали канюлю для экстренного введения препарата в случае необходимости. Перед введением гепарина собирали образец крови, который использовали для определения исходного активированного времени свертывания (ACT), которое регистрировали. Затем, по указанию хирурга, вводили гепарин (от 250 до 350 МЕ/кг) по мере необходимости для достижения и поддержания ACT, превышающего в два раза

- 15 049385 уровень исходного ACT. После введения первого болюса гепарина ACT вновь регистрировали, и в дальнейшем контролировали по меньшей мере каждые 60 мин до завершения операции.

Соответствующий направляющий катетер вводили в отверстие левой передней нисходящей артерии (ЛИНА) под визуальным флуороскопическим контролем. Для всех процедур использовали неионный контраст. Баллонный катетер вводили, продвигая его через направляющий катетер к левой передней нисходящей (ЛИНА) коронарной артерии. Баллон продвигали в коронарные артерии через направляющий катетер в подходящее место над 1-й диагональной ветвью ЛИНА. Затем баллон надували до давления, достаточного для обеспечения полной окклюзии артерии. Окклюзию артерии подтверждали методом флуороскопии. После подтверждения окклюзии баллон оставляли раздутым в артерии на 60 мин. Частоту применения поддерживающих лекарственных препаратов и дефибрилляции регистрировали в протоколе исследования. Пептид и растворитель, соответственно, вводили путем в/в инъекции за 5 мин до реперфузии. По окончании периода окклюзии сосуда баллон сдували, и создавали возможность для реперфузии ишемической области. Полное сдувание баллона проверяли методом флуороскопии. В конце процедуры все катетеры удаляли, артерию и вену перевязывали, и разрез закрывали стандартным образом. Через 4 часа после реперфузии животных умерщвляли.

Измерение зоны инфаркта. Для анализа размера зоны инфаркта мышей умерщвляли через 24 ч реперфузии; сердца вырезали и перфузировали PBS в течение 5 мин. После перфузии ЛКА повторно перевязывали в том же месте, как было указано ранее. Синий краситель Эванса (1 мл 1% раствора) вводили в аорту и коронарные артерии для отграничения ишемической ЗР от не ишемической зоны. Ткань заворачивали в прозрачную пищевую пленку и хранили в течение часа в морозильной камере при температуре -20°C. Затем сердце последовательно разрезали перпендикулярно длинной оси на 1-мм срезы, и каждый срез взвешивали. Срезы инкубировали в 1% TTC в течение 5 мин при 37°C для установления границ жизнеспособного и нежизнеспособного миокарда в зоне риска. Зону инфаркта, ЗР и не ишемический левый желудочек оценивал с помощью компьютерной планиметрии наблюдатель, незнакомый с категорией образца. Размер зоны инфаркта миокарда выражали в процентах от ЗР.

Иммуноблоттинг. Ткань и человеческие КМ лизировали в RIPS буфере (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1% NP-40 с ингибиторами протеаз и фосфатаз, pH 7,4). Выделенные митохондрии лизировали в лизирующем буфере Mito (200 мМ сахароза, 10 мМ HEPES, 1 мМ ЭГТА, 1% Triton-X100 с ингибиторами протеаз и фосфатаз, pH 7,4). Лизаты осветляли центрифугированием (20000 x g, 15 мин, 4°C). Концентрации белка в супернатанте определяли с использованием совместимого с детергентом белкового анализа (Bio-Rad). Образцы разбавляли в 4x LDS буфере для образцов с 10x восстанавливающим средством (Invitrogen) и готовили для SDS-ПААГ путем нагревания при 95°C в течение 5 мин. Эквивалентные количества белка разделяли в 4-12% бис-трис гелях (Invitrogen), переносили на нитроцеллюлозу и проводили иммуноблоттинг с первичными антителами. Используемыми вторичными антителами были конъюгированные с пероксидазой хрена антитела козы против мышиных или против кроличьих IgG (Invitrogen). Результаты иммуноблоттинга обнаруживали методом ЭХЛ (Thermo Scientific), и изображения получали на Imager 600 (Amersham).

Исследования взаимодействий. Для исследований белок-пептидных взаимодействий были синтезированы пептидные библиотеки и иммобилизованы на микрочипах. Рекомбинантный BNIP3 использовали в концентрации 1 мкг/мл. Пептиды синтезировали и иммобилизовали для: (i) исследования взаимодействия BNIP3/BAX; (ii) исследования взаимодействия BNIP3/BNIP3, в которых были выполнены C-, N- или C/N-концевые укорочения последовательности дикого типа BNIP3 1-20; и (iii) исследования взаимодействия BNIP3/BNIP3, в которых отдельные остатки последовательности BNIP3 120 дикого типа были заменены на 18 нейтральных аминокислот.

Микрочип. Для исследований белок-пептидного связывания рекомбинантные BNIP3 (cusabio) и BAX (MyBioSource) использовали в концентрации 10 мкг/мл, соответственно, 1 мкмоль/мл. В качестве набора для мечения использовали набор для микромасштабного мечения антител DyLight (Thermo) с меткой Dylight 650. Анализ проводили с использованием автоматизированной станции обработки микрочипов TECAN HS4800. Микрочипы инкубировали с образцами, предоставленными клиентом, разбавленными в блокирующем буфере в течение 2 ч при 30°C. Перед каждым этапом микрочипы промывали буфером для промывки. Микрочипы сканировали с использованием флуоресцентного сканера высокого разрешения. Настройки лазера и применяемое разрешение были одинаковыми для всех проведенных измерений. Полученные изображения анализировали и количественно обрабатывали с использованием программного обеспечения для распознавания пятен GenePix (Molecular Devices). Для каждого пятна извлекали среднюю интенсивность сигнала (от 0 до 65535 произвольных единиц). Для дальнейшей оценки данных определяли так называемые значения MMC2. MMC2 равен среднему значению всех трех образцов на микрочипе, за исключением случаев, когда коэффициент вариации (CV) - стандартное отклонение, деленное на среднее значение - больше 0,5. В этом случае MMC2 присваивали среднее из двух ближайших значений (MC2). Все этапы были выполнены JPT Peptide Technologies (Berlin, Germany).

Моделирование трехмерной (3D) структуры BNIP3 in silico. Предсказанную in silico 3D-структуру BNIP3 получали путем гомологичного моделирования с использованием Modeller 9.15, и созданная

- 16 049385 модель была скорректирована в соответствии с энергетическим минимумом при помощи NAMD 2.9 и силового поля CHARMM36.

Спектроскопия кругового дихроизма (КД). КД-спектры белка BNIP3 и пептида BNIP3-8B регистрировали на спектрополяриметре Jasco J-715 при 37°C, pH 7,4, 1х PBS.

Моделирование стыковки. Эксперименты проводили с использованием Autodock Vina⁵² и HADDOCK⁵³. Структуру BAX (pdb-ID: 4S0O) получали из Базы данных белков, при этом структуру BNIP3 и пептида BNIP3-8B моделировали с использованием Modeller 9.15⁴⁷. Шаблонные структуры соответствуют PDB-кодам 2k7w и 2ka1. Созданная модель была скорректирована в соответствии с энергетическим минимумом при помощи NAMD 2.9⁵⁴ и силового поля CHARMM36.

Иммунопреципитация. Иммунопреципитацию проводили с использованием связанных с белком G Dynabeads (Invitrogen). 500 мкг лизированных белков инкубировали с 2 мкг антитела в течение ночи при 4°C со встряхиванием в буфере PBS, содержащем 1 мМ DTT, 0,005% Brij 35 и ингибиторы протеазфосфатаз. На следующий день добавляли 20 мкл Dynabeads, и раствор вновь инкубировали в течение 1 ч. Осажденный иммунный комплекс промывали 2 раза, а затем ресуспендировали в буфере для элюирования, содержащем LDS буфер для образцов (1:4) и восстанавливающее средство (1:10) (Invitrogen) в PBS, и нагревали в течение 5 мин при 95°C. После удаления Dynabeads элюат анализировали методом иммуноблоттинга.

Активность каспазы-3 измеряли с использованием набора для анализа каспазы-3 от компании Abcam (№ ab39401). Сердца мышей собирали после 30-мин ишемии и 4-ч реперфузии, зону риска выделяли, лизировали в содержащемся буфере и проводили анализ в соответствии с инструкциями производителя.

Клеточная культура. Человеческие полученные из иПСК кардиомиоциты желудочка (человеческие КМ) получали от (axol) и культивировали в соответствии со спецификацией производителя.

Для моделирования окклюзии сосудов клетки инкубировали в буфере (113 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 12 мМ HEPES, 1,2 мМ MgSO4, 30 мМ таурин, 1,3 мМ CaCh, pH 7,4) в условиях 1% O2, 37°C. Реоксигенацию проводили в буфере с добавлением 5,5 мМ глюкозы в условиях 21% O₂, 37°C.

Клетки HL-1 культивировали в среде Claycomb в соответствии с протоколом производителя. Клетки обрабатывали 5 мкМ доксорубицином и 2 нМ TAT-BNIP3-8B в течение 30 мин.

Анализ с JC-1. Для анализа потенциала внутренней митохондриальной мембраны в человеческих КМ клетки окрашивали 5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин иодидом (JC-1). Клетки инкубировали с 6 мкМ JC-1 в среде при 37°C в течение 30 мин. После промывания клеток буфером PBS при 37°C их фиксировали 4% ПФА в течение 15 мин при комнатной температуре. Выполняли окрашивание DAPI, и клетки анализировали с использованием EVOS FL (Life Technologies).

Анализ набухания. Набухание митохондрий измеряли методом рассеяния света при 540 нм в микропланшетном ридере оптической плотности FLUOstar Omega (BMG Labtech) при RT. Конечный объем аналитической смеси составлял 200 мкл, она содержала митохондрии в концентрации 0,5 мг/мл в буфере, содержащем 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES, 1 мМ ЭГТА, pH 7,4.

Пептиды. Пептиды получали методом синтеза на смоле (JPT International, Berlin, Germany). К ним присоединяли на N-конце ацетильную группу, и на C-конце амид. Для доставки пептиды соединяли ковалентной связью с TAT-последовательностью GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 31). Для исследований поглощения и связывания пептиды метили флуорофором. Полный список пептидов приведен в приложении 1.

Библиография

1. Zipes, D., Libby, P., Bonow, R. & Mann, D. Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. Elsevier/Saunders 10th Edition (2015).

2. Yellon, D. M. & Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. N Engl J Med 357, 1121-1135, (2007).

3. Cahill, T. J. & Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World J Cardiol 9, 407-415, (2017).

4. Christia, P. & Frangogiannis, N. G. Targeting inflammatory pathways in myocardial infarction. Eur J Clin Invest 43, 986-995, (2013).

5. Whelan, R. S. et al. Bax regulates primary necrosis through mitochondrial dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 6566-6571, (2012).

6. Avila, M. S. et al. Carvedilol for Prevention of Chemotherapy-Related Cardiotoxicity: The CECCY Trial. J Am Coll Cardiol 71, 2281-2290, (2018).

7. Gulati, G. et al. Prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy (PRADA): a 2^2 factorial, randomized, placebo-controlled, double-blind clinical trial of candesartan and metoprolol. Eur Heart J 37, 1671-1680, (2016).

8. Pituskin, E. et al. Multidisciplinary Approach to Novel Therapies in Cardio-Oncology Research (MANTICORE 101-Breast): A Randomized Trial for the Prevention of Trastuzumab-Associated Cardiotoxicity. J Clin Oncol 35, 870-877, (2017).

9. Baines, C. P. The cardiac mitochondrion: nexus of stress. Annu Rev Physiol 72, 61-80, (2010).

- 17 049385

10. Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B. & Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol 78, 23-34, (2015).

11. Kokoszka, J. E. et al. The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore. Nature 427, 461-465, (2004).

12. Baines, C. P., Kaiser, R. A., Sheiko, T., Craigen, W. J. & Molkentin, J. D. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat Cell Biol 9, 550-555, (2007).

13. Kwong, J. Q. et al. Genetic deletion of the mitochondrial phosphate carrier desensitizes the mitochondrial permeability transition pore and causes cardiomyopathy. Cell Death Differ 21, 1209-1217, (2014).

14. Basso, E. et al. Properties of the permeability transition pore in mitochondria devoid of Cyclophilin D. J Biol Chem 280, 18558-18561, (2005).

15. Bonora, M. et al. Role of the c subunit of the FO ATP synthase in mitochondrial permeability transition. Cell Cycle 12, 674-683, (2013).

16. Giorgio, V. et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 5887-5892, (2013).

17. Argaud, L. et al. Specific inhibition of the mitochondrial permeability transition prevents lethal reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol 38, 367-374, (2005).

18. Skyschally, A., Schulz, R. & Heusch, G. Cyclosporine A at reperfusion reduces infarct size in pigs. Cardiovasc Drugs Ther 24, 85-87, (2010).

19. Cung, T. T. et al. Cyclosporine before PCI in Patients with Acute Myocardial Infarction. N Engl J Med 373, 1021-1031, (2015).

20. Gibson, C. M. et al. EMBRACE STEMI study: a Phase 2a trial to evaluate the safety, tolerability, and efficacy of intravenous MTP-131 on reperfusion injury in patients undergoing primary percutaneous coronary intervention. Eur Heart J 37, 1296-1303, (2016).

21. Szeto, H. H. First-in-class cardiolipin-protective compound as a therapeutic agent to restore mitochondrial bioenergetics. Br J Pharmacol 171, 2029-2050, (2014).

22. Schaller, S. et al. TRO40303, a new cardioprotective compound, inhibits mitochondrial permeability transition. J Pharmacol Exp Ther 333, 696-706, (2010).

23. Atar, D. et al. Effect of intravenous TRO40303 as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute ST-elevation myocardial infarction: MITOCARE study results. Eur Heart J 36, 112-119, (2015).

24. Rupprecht, H. J. et al. Cardioprotective effects of the Na(+)/H(+) exchange inhibitor cariporide in patients with acute anterior myocardial infarction undergoing direct PTCA. Circulation 101, 2902-2908, (2000).

25. Chi, L. G. et al. Effect of superoxide dismutase on myocardial infarct size in the canine heart after 6 hours of regional ischemia and reperfusion: a demonstration of myocardial salvage. Circ Res 64, 665-675, (1989).

26. Arai, M. et al. An anti-CD18 antibody limits infarct size and preserves left ventricular function in dogs with ischemia and 48-hour reperfusion. J Am Coll Cardiol 27, 1278-1285, (1996).

27. Williams, F. M., Kus, M., Tanda, K. & Williams, T. J. Effect of duration of ischaemia on reduction of myocardial infarct size by inhibition of neutrophil accumulation using an anti-CD18 monoclonal antibody. Br J Pharmacol 111, 1123-1128, (1994).

28. Wei, M. C. et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292, 727-730, (2001).

29. Ow, Y. P., Green, D. R., Hao, Z. & Mak, T. W. Cytochrome c: functions beyond respiration. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 532-542, (2008).

30. Oberst, A., Bender, C. & Green, D. R. Living with death: the evolution of the mitochondrial pathway of apoptosis in animals. Cell Death Differ 15, 1139-1146, (2008).

31. Hamacher-Brady, A. et al. Response to myocardial ischemia/reperfusion injury involves Bnip3 and autophagy. Cell Death Differ 14, 146-157, (2007).

32. Kubli, D. A., Quinsay, M. N., Huang, C., Lee, Y. & Gustafsson, A. B. Bnip3 functions as a mitochondrial sensor of oxidative stress during myocardial ischemia and reperfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol 295, H2025-2031, (2008).

33. Diwan, A. et al. Inhibition of ischemic cardiomyocyte apoptosis through targeted ablation of Bnip3 restrains postinfarction remodeling in mice. J Clin Invest 117, 2825-2833, (2007).

34. Hochhauser, E. et al. Bax ablation protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in transgenic mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284, H2351-2359, (2003).

35. Hendgen-Cotta, U. B. et al. Cytosolic BNIP3 Dimer Interacts with Mitochondrial BAX Forming Heterodimers in the Mitochondrial Outer Membrane under Basal Conditions. Int J Mol Sci 18, (2017).

36. Ray, R. et al. BNIP3 heterodimerizes with Bcl-2/Bcl-X(L) and induces cell death independent of a Bcl2 homology 3 (BH3) domain at both mitochondrial and nonmitochondrial sites. J Biol Chem 275, 1439-1448, (2000).

37. Kubli, D. A., Ycaza, J. E. & Gustafsson, A. B. Bnip3 mediates mitochondrial dysfunction and cell death through Bax and Bak. Biochem J 405, 407-415, (2007).

-