EA052811B1 - Антитела против ил-27 и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к антителам против ИЛ-27 и их антигенсвязывающим частям. Данное изобретение также относится к способам лечения или облегчения одного или большего числа симптомов заболевания, такого как онкологическое заболевание, путем введения указанных антител или их антигенсвязывающих частей. Данное изобретение также относится к способам обнаружения ИЛ-27, например, у субъекта или в образце.

Description

Содержимое представленного в электронном виде перечня последовательностей в текстовом файле ASCII (с названием 4416_009PC02_Seqlisting_ST25.txt; размер: 156863 байта; дата создания: 25 сентября 2020 года), поданном вместе с данной заявкой, включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данное изобретение испрашивает приоритет относительно предварительной заявки на патент США №62/906008, поданной 25 сентября 2019 года, и предварительной заявки на патент США №63/081705, поданной 22 сентября 2020 года, содержимое которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Область техники изобретения

Данное изобретение в целом относится к композициям и способам модулирования передачи сигналов, связанных с ИЛ-27. Более конкретно, данное изобретение относится к иммуногенным композициям (например, антителам, фрагментам антител и т.п.), которые связываются с ИЛ-27 и модулируют передачу сигналов по каскаду от ИЛ-27.

Уровень техники изобретения

В последние годы появляется все больше доказательств того, что иммунная система действует как значимый барьер, предотвращающий образование и прогрессирование опухолей. Принцип, согласно которому в организме пациентов с онкологическими заболеваниями существуют природные Т-клетки с противоопухолевым потенциалом или активностью, положил начало разработке иммунотерапевтических подходов в онкологии. Иммунные клетки, такие как Т-клетки, макрофаги и естественные клеткикиллеры, могут проявлять противоопухолевую активность и эффективно контролировать возникновение и рост злокачественных опухолей. Опухолеспецифические или ассоциированные с опухолью антигены могут индуцировать иммунные клетки к распознаванию и уничтожению злокачественных новообразований (Chen & Mellman, (2013) Immunity 39 (1): 1 - 10). Несмотря на наличие опухолеспецифического иммунного ответа, злокачественные опухоли часто избегают или ускользают от иммунной атаки с помощью различных иммуномодулирующих механизмов, что приводит к неспособности контролировать возникновение и прогрессирование опухоли (Motz & Coukos, (2013) Immunity 39 (1): 61 - 730). Действительно, новым отличительным признаком рака является использование таких иммуномодулирующих механизмов и выведение из строя противоопухолевого иммунного ответа, что приводит к уклонению опухоли от иммунологического уничтожения (Hanahan and Weinberg (2011) Cell 144 (5): 646 - 674).

ИЛ-27 представляет собой гетеродимерный цитокин, состоящий из двух субъединиц (EBI3 и ИЛ27p28). ИЛ-27 структурно связан как с семействами цитокинов ИЛ-12, так и с ИЛ-6. ИЛ-27 связывается и опосредует передачу сигналов через гетеродимерный рецептор, состоящий из цепей ИЛ-27Рα (WSX1) и gp130, которые опосредуют передачу сигналов преимущественно через STAT1 и STAT3. В первых публикациях ИЛ-27 характеризовался как иммуностимулирующий цитокин, который поддерживает пролиферацию CD4+ Т-клеток, дифференцировку Т-хелперов (Th)1 и выработку ИФН-γ, часто действуя совместно с ИЛ-12. Последующие исследования показали, что ИЛ-27 проявляет сложные иммуномодулирующие функции, что приводит либо к провоспалительным, либо к противовоспалительным эффектам в зависимости от биологического контекста и используемых экспериментальных моделей. ИЛ-27 может управлять экспрессией различных иммунорегуляторных молекул в раковых клетках человека, что может способствовать локальному нарушению иммунного ответа in vivo (Fabbi et al. (2017) Mediators Inflamm 3958069; опубликовано в сети Интернет 1 февраля 2017 г., doi:10.1155/2017/3958069; и содержащийся в указанной публикации список литературы).

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении и поддерживающей терапии для пациентов с онкологическими заболеваниями, по -прежнему существует постоянная потребность в новых и эффективных способах лечения и поддерживающей терапии при онкологических заболеваниях.

Краткое описание сущности изобретения

В данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие части, которые являются антагонистами ИЛ-27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из следующих аминокислот: (i) аминокислот с 37 по 56 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28); (ii) аминокислот с 142 по 164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28); или (iii) как (i), так и (ii). В некоторых аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 или Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ27p28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Asp146, Arg149 и (или) Phe153 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения эпитоп дополнительно содержит His150 и (или) Leu156 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения эпитоп дополнительно содержит Gln37,

- 1 052811

Leu38, Glu42, Leu142 и (или) Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения эпитоп дополнительно содержит Glu46, Val49, Ser50 и (или) Leu162 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения эпитоп дополнительно содержит одну или большее число аминокислот Leu53, Lys56, Asp143, Arg145, Leu147, Arg152, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161 или Pro163 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (HH-27p28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, состоящим или по существу состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (HH-27p28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, состоящим или по существу состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (HH-27p28).

В других аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (HH-27p28), не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из: (i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 18 и 19, соответственно; (ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 39, 40 и 41, соответственно; (iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 53, 54 и 55, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответственно; (iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 75, 76 и 77, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 83, 84 и 85, соответственно; (v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 97, 98 и 99, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 105, 106 и 107, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 119, 120 и 121, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно.

В других аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (HH-27p28), не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из: (i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно; (ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 42, 43 и 44, соответственно; (iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 56, 57 и 58, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно; (iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 78, 79 и 80, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 86, 87 и 88, соответственно; (v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 108, 109 и 110, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 122, 123 и 124, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения CDR1 тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающая часть не состоят из N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C (SEQ ID NO: 144) и (или) CDR2 тяжелой цепи не состоит из N-ISSS[S/G][S/A]YI-C (SEQ ID NO: 146). В некоторых аспектах данного изобретения CDR1 тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающая часть не состоят из NFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]MN-C (SEQ ID NO: 148) и (или) CDR2 тяжелой цепи не состоит из N[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C (SEQ ID NO: 149).

В других аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37,

- 2 052811

Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28) не содержат: (i) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 147), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 121; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно; или (ii) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 150), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из NXISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 151), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 124; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В других аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28) не содержат: CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-IXXXXXXX-C (SEQ ID NO: 152), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, состоящую из N-AR[X]_n=₆_₁₅DX-C (SEQ ID NO: 153); и CDR1 легкой цепи, состоящую из N-QS[X]_n=₁.₃SS[X]_n=₀.₄Y-C (SEQ ID NO: 154), CDR2 легкой цепи, состоящую из N-XXS-C (SEQ ID NO: 155), и последовательность CDR3 легкой цепи, состоящую из N-QQXXXXP[X]_n=0-1T-C (SEQ ID NO: 156), соответственно.

В данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие части, которые проявляют по меньшей мере одно или большее число из следующих свойств: (i) связываются с ИЛ-27 человека с равновесной константой диссоциации (KD), равной 15 нМ или меньше; (ii) блокируют связывание ИЛ-27 с рецептором ИЛ-27; (iii) ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке; (iv) ингибируют или снижают опосредованное ИЛ-27 ингибирование экспрессии CD161 в клетке; (v) ингибируют или снижают опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке; и (vi) индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с ИЛ-27 человека с равновесной константой диссоциации (KD), равной 15 нМ или меньше.

В других аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке иммунной системы или в раковой клетке.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке иммунной системы.

В других аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке иммунной системы или в раковой клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 в раковой клетке.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть индуцируют или усиливают опосредованную PD1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число цитокинов представляют собой ИФН-гамма (ИФН-γ), ИЛ-17, ФНО-альфа (ФНО-α) или ИЛ-6. В некоторых аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть выбраны из группы, состоящей из антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE. В других аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть представляют собой антитело IgG1 или антитело IgG4. В некоторых аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть содержат домен Fc, содержащий по меньшей мере одну мутацию. Также в данном документе представлены фармацевтические композиции, содержащие любое из описанных выделенных антител или их антигенсвязывающих частей и фармацевтически приемлемый носитель. Также представлены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, тяжелую цепь или как легкую, так и тяжелую цепи указанного выделенного антитела, или его антигенсвязывающую часть. В данном документе представлен вектор экспрессии, содержащий указанную нуклеиновую кислоту. Также представлена клетка, трансформированная указанным вектором экспрессии.

- 3 052811

В данном изобретении также представлены способы получения антитела, которое специфически связывает ИЛ-27 человека, или его антигенсвязывающей части, включающие в себя культивирование клетки, трансформированной указанным вектором экспрессии, в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного антитела или его антигенсвязывающей части. В некоторых аспектах данного изобретения указанный способ дополнительно включает в себя получение антитела или его антигенсвязывающей части.

В данном документе представлен способ ингибирования или снижения фосфорилирования STAT1 и (или) STAT3 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с указанным антителом или его антигенсвязывающей частью, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке.

Также представлен способ ингибирования или снижения ингибирования экспрессии CD161 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с указанным антителом или его антигенсвязывающей частью, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке.

Также представлен способ ингибирования или снижения экспрессии PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с указанным антителом или его антигенсвязывающей частью, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке.

Также представлен способ индукции или усиления секреции одного или большего числа цитокинов из клетки, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с указанным антителом или его антигенсвязывающей частью, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки.

Также представлен способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающего фрагмента указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе.

Также представлен способ лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающего фрагмента указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе.

В данном документе представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта. Указанный способ включает в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающей части указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке, тем самым стимулируя иммунный ответ или осуществляя лечение онкологического заболевания.

Также представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта. Указанный способ включает в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающей части указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке, тем самым стимулируя иммунный ответ или осуществляя лечение онкологического заболевания.

Также представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта. Указанный способ включает в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающей части указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 на клетке, тем самым стимулируя иммунный ответ или осуществляя лечение онкологического заболевания.

Также представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта. Указанный способ включает в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающей части указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки, тем самым стимулируя иммунный ответ или осуществляя лечение онкологического заболевания.

В некоторых аспектах данного изобретения онкологическое заболевание, которое лечат указанным способом, выбрано из рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого), саркомы, рака яичка, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака молочной железы (например, трижды негативного рака

- 4 052811 молочной железы), меланомы, онкологического заболевания головы и шеи (например, плоскоклеточного рака головы и шеи), колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака эндометрия, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака головного мозга, лимфомы (например, диффузной В-крупноклеточной лимфомы - ДВКЛ, англ. DL-BCL), лейкоза (например, острого миелобластного лейкоза - ОМЛ, англ. AML) или рака почки (например, почечноклеточной карциномы, например, светлоклеточной почечно -клеточной карциномы).

В данном документе представлен способ усиления одной или большего числа функций антитела против PD-1 (например, усиление опосредованной PD-1 секреции цитокинов; усиление опосредованной антителом против PD-1 секреции ФНО-α; усиление опосредованной антителом против PD-1 секреции ИЛ-6 из клетки, подвергшейся воздействию антителами против PD-1). Указанный способ включает в себя воздействие на клетку представленным в данном документе антителом или его антигенсвязывающей частью одновременно с воздействием антителом против PD-1 или последовательно с ним, тем самым усиливая указанные одну или большее число функций антител против PD1.

Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против PD-1, представленное в данном документе антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель.

Также представлен набор, содержащий антитело против PD-1 и представленное в данном документе антитело или его антигенсвязывающую часть, для одновременного или последовательного введения, и инструкции по его применению.

В данном документе описаны все из представленных в данном документе способов стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания, при этом выделенное антитело, представленное в данном документе, или его антигенсвязывающую часть вводят в комбинации с одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов или процедур. Указанные второй терапевтический агент или процедура выбраны из группы, состоящей из: химиотерапии, нацеленной противораковой терапии, онколитического препарата, цитотоксического агента, иммунной терапии, цитокина, хирургической процедуры, лучевой процедуры, активатора костимулирующей молекулы, ингибитора ингибиторной молекулы, вакцины или клеточной иммунотерапии, или их комбинации. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист PD-1, ингибитор PD-L1, ингибитор TIM-3, ингибитор LAG-3, ингибитор TIGIT, ингибитор CD112R, ингибитор TAM, агонист STING, агонист 41BB, ингибитор тирозинкиназы, агент, нацеленный на аденозиновую ось (например, антагонист CD39, антагонист CD73, антагонист A2AR или антагонист A2BR, или двойной антагонист A2AR/A2BR), антагонист CCR8, антагонист CTLA4, ингибитор VEG-F, или их комбинацию. В других аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 выбран из группы, состоящей из: PDR001, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MEDI0680, REGN2810, TSR-042, PF-06801591 и AMP-224. В некоторых аспектах данного изобретения указанный ингибитор PDL1 выбран из группы, состоящей из: FAZ053, атезолизумаба, авелумаба, дурвалумаба и BMS-936559. В других аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов выбраны из группы, состоящей из: сунитиниба (SUTENT®), кабозантиниба (CABOMETYX®), акситиниба (INLYTA®), ленватиниба (LENVIMA®), эверолимуса (AFINITOR®), бевацизумаба (AVASTIN®), эпакадостата, NKTR-214 (агонист смещенной активности к CD-122), тивозаниба (FOTIVDA®), абексиностата, ипилимумаба (YERVOY®), тремелимумаба, пазопаниба (VOTRIENT®), сорафениба (NEXAVAR®), темсиролимуса (TORISEL®), рамуцирумаба (CYRAMZA®), нирапариба, саволитиниба, вороланиба (X-82), регорафениба (STIVARGO®), донафениба (мультикиназный ингибитор), камрелизумаба (SHR-1210), пексастимогена девацирепвека (JX-594), рамуцирумаба (Cyramza®), апатиниба (YN968D1), инкапсулированного доксорубицина (THERMODOX®), тивантиниба (ARQ197), ADI-PEG 20, биниметиниба, апатиниба мезилата, нинтеданиба, лирилумаба, ниволумаба (OPDIVO®), пембролизумаба (KEYTRUDA®), атезолизумаба (TECENTRIQ®), авелумаба (BAVENCIO®), дурвалумаба (IMFIMZI®), цемиплимаба-rwlc (LIBTAYO®), тислелизумаба и спартализумаба. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор TIM-3, необязательно при этом указанный ингибитор TIM-3 представляет собой MGB453 или TSR-022. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор LAG-3, необязательно при этом указанный ингибитор LAG-3 выбран из группы, состоящей из LAG525, BMS-986016 и TSR-033. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор TIGIT. В других аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор CD112R. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор TAM (Axl, Mer, Tyro). В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов

- 5 052811 представляют собой агонист 4-1ВВ. В других аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор тирозинкиназы (ИТК, англ. TKI). В некоторых аспектах данного изобретения ИТК выбран из иматиниба, дазатиниба, нилотиниба, бозутиниба или понатиниба. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных агентов представляют собой агент, нацеленный на аденозиновую ось. В некоторых аспектах данного изобретения указанный агент, нацеленный на аденозиновую ось, выбран из антагониста CD39, антагониста CD73, антагониста A2AR, антагониста A2BR или двойного антагониста A2AR/A2BR. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист CD39. Примеры антагонистов CD39 включают в себя те, которые описаны в патенте США № US2019/0284295 (Surface Oncology, Inc.), который включен в данный документ посредством ссылки. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист CD73. Примеры антагонистов CD73 включают в себя низкомолекулярные ингибиторы CD73, такие как AB421 (Arcus), антитело против CD73 или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с CD73, например, MEDI9447 (Medimmune), BMS986179 (Bristol Meyers Squibb), или такие, как описано в патенте США № US2018/0009899 (Corvus), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист A2AR, антагонист A2BR или двойной антагонист A2AR/A2BR. Примеры антагонистов A2AR, A2BR и двойных антагонистов A2AR/A2BR включают в себя преладенант/SCH 420814 (Merck/Schering, регистрационный номер CAS: 377727-87-2), который описан в работе Hodgson et al. (2009) J Pharmacol Exp Ther 330 (1): 294 - 303, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; ST-4206 (Leadiant Biosciences), который описан в патенте США № 9133197, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; KW-6356 (Kyowa Hakko Kogyo), тозаденант/SYN-115 (Acorda), истрадефиллин/KW-6002 (Kyowa Hakko Kogyo, регистрационный номер CAS: 155270-99-8), который описан в работе LeWitt et al. (2008) Ann Neurol 63 (3): 295 - 302, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; теофиллин (регистрационный номер CAS: 58-55-9), NIR178 (Novartis); AB928 (Arcus Biosciences), GBV2034 (Globavir), випаденант (Redox/Juno), AZD4635/HTL-1071 (AstraZeneca/Heptares), который описан в патентном документе WO 2011/095625 и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; CPI-444/V81444 (Corvus/Genentech), который описан в патентном документе WO 2009/156737 и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; PBF509 (Palobiofarma/Novartis), который описан в патенте США № US 8796284 и в патентном документе WO 2017/025918, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; антагонисты A2AR, описанные в патентах США № US 8114845, № US 9029393, № US 20170015758 или № US 20160129108, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; и ATL-444, MSX-3, SCH-58261, SCH-412,348, SCH-442,416, VER-6623, VER-6947, VER-7835, CGS-15943 или ZM-241,385. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист CCR8. В некоторых аспектах данного изобретения антагонист CCR8 выбран из малой молекулы и антитела. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист CTLA4. В некоторых аспектах данного изобретения антагонист CTLA4 выбран из группы, состоящей из следующего: Yervoy® (ипилимумаб или антитело 10D1, описанные в патентной публикации PCT WO 01/14424), тремелимумаб (ранее - тицилимумаб, CP-675,206), моноклональное антитело или антитело против CTLA-4, описанное в любой из следующих публикаций: WO 98/42752; WO 00/37504; патент США № 6207156; Hurwitz et al. (1998) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17): 10067 10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (145): антитело № 2505 (антитело CP-675206); и Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58: 5301 - 5304. Также можно применять любое из антител против CTLA-4, описанных в патентном документе WO 2013/173223. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор VEG-F. В некоторых аспектах данного изобретения ингибитор VEG-F выбран из кабозантиниба, паопаниба, бевацизумаба, сунитиниба, акситиниба, ленвантиниба, сорафениба, регорафениба, понатиниба, кабозантиниба, вандетаниба, рамуцирумаба или бевацизумаба.

В данном документе представлено применение антитела, представленного в данном документе, или антигенсвязывающей части указанного антитела, или фармацевтической композиции, представленной в данном документе, для стимуляции иммунного ответа у субъекта или для лечения онкологического заболевания у субъекта, необязательно - для применения в комбинации с одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов или процедур.

Также представлен набор, содержащий антитело, представленное в данном документе, или антигенсвязывающую часть указанного антитела, или фармацевтическую композицию, представленную в данном документе, и инструкции по применению для стимуляции иммунного ответа у субъекта или для

- 6 052811 лечения онкологического заболевания у субъекта, необязательно - с инструкциями по применению в комбинации с одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов или процедур.

Также представлен набор, содержащий антитело, представленное в данном документе, или антигенсвязывающую часть указанного антитела, и инструкции по применению для выявления ИЛ-27 в образце, взятом у субъекта, необязательно - с инструкциями по применению для выявления ИЛ-27ассоциированного онкологического заболевания у субъекта.

Определения

Термины, употребляемые в формуле данного изобретения и в описании данного изобретения, определяются так, как изложено ниже, если не указано иное.

Следует отметить, что при употреблении в контексте описания данного приложенной формуле данного изобретения единственное число включает в множественное число, если из контекста явным образом не следует иное.

При употреблении в контексте данного документа термин около будет специалистам в данной области техники и будет варьировать в некоторой степени изобретения и в себя ссылку на понятен рядовым в зависимости от контекста, в котором он употребляется. В случаях употребления указанного термина, не понятных для рядовых специалистов в данной области техники в контексте, в котором он употребляется, термин около будет означать до плюс-минус 10% от конкретного значения.

При употреблении в контексте данного документа термин агонист относится к любой молекуле, которая частично или полностью способствует, индуцирует, увеличивает и (или) активирует биологическую активность нативного полипептида, описанного в данном документе. Подходящие молекулы-агонисты, в частности, включают в себя антитела-агонисты или фрагменты таких антител, фрагменты или варианты аминокислотной последовательности нативных полипептидов, пептидов или белков. В некоторых аспектах данного изобретения активация в присутствии агониста имеет дозозависимый характер. В некоторых аспектах данного изобретения измеряемый сигнал (например, показатель биологической активности) по меньшей мере на около 5%, по меньшей мере на около 10%, по меньшей меньшей меньшей меньшей меньшей меньшей мере мере мере мере мере мере на на на на на на около около около около около около

15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%, по по по по по по меньшей меньшей меньшей меньшей меньшей мере мере мере мере мере на на на на на около около около около около

20%, 35%, 50%, 65%, 80%, по по по по по меньшей меньшей меньшей меньшей меньшей мере мере мере мере мере на на на на на около около около около около

25%, 40%, 55%, 70%, 85%, по по по по по меньшей мере на около 95% или по меньшей мере на около 100% превышает сигнал, измеренный в образце отрицательного контроля при сопоставимых условиях. Также в данном документе представлены способы идентификации агонистов, пригодных для применения в способах согласно данному изобретению. Например, такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, анализы связывания, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА, англ. ELISA), системы FORTE BIO® и радиоиммуноанализ (РИА, англ. RIA). Такие анализы определяют способность агониста связывать полипептид, представляющий интерес (например, рецептор или лиганд), и, следовательно, указывают на способность такого агониста стимулировать, повышать или активировать активность указанного полипептида. Эффективность агониста также можно определить с помощью функциональных анализов, таких как анализы на предмет способности агониста активировать или стимулировать функцию данного полипептида. Например, функциональный анализ может включать в себя приведение полипептида в контакт с молекулой - потенциальным агонистом и измерение обнаруживаемого изменения одной или большего числа биологических активностей, обычно ассоциированных с указанным полипептидом. Активность агониста обычно определяют по его значению EC₅₀ (концентрация, необходимая для активации 50% ответа агониста). Чем ниже значение EC₅₀, тем выше активность агониста и тем ниже концентрация, необходимая для активации максимального биологического ответа.

При употреблении в контексте данного документа термин аланиновое сканирование относится к методике, используемой для определения вклада конкретного остатка дикого типа в стабильность или функцию (функции) (например, аффинность связывания) данного белка или полипептида. Указанная методика включает в себя замену в полипептиде остатка дикого типа на остаток аланина с последующей оценкой стабильности или функции (функций) (например, аффинности связывания) аланин -замещенного производного или мутантного полипептида и сравнением с полипептидом дикого типа. Методики замены остатка дикого типа в полипептиде на аланин известны в данной области техники.

Термин облегчение относится к любому терапевтически благоприятному результату лечения болезненного состояния, например, онкологического заболевания, включая профилактику, уменьшение тяжести или замедление прогрессирования, ремиссию или излечение указанного болезненного состояния.

При употреблении в контексте данного документа термин аминокислота относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметиков аминокислот, которые функционируют подобно встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой те аминокислоты, которые кодируются

- 7 052811 генетическим кодом, а также аминокислоты, которые в последствии модифицированы, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Термин аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют базовую химическую структуру, идентичную таковой у встречающейся в природе аминокислоты, т.е. углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминную группу и R-группу, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же базовую химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Термин миметики аминокислот обозначает химические соединения, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но функционируют подобно встречающейся в природе аминокислоте.

Аминокислоты могут обозначаться в данном документе либо с помощью общепринятых трехбуквенных кодов, либо с помощью однобуквенных кодов, рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогичным образом, нуклеотиды могут обозначаться с помощью общепринятых однобуквенных кодов.

При употреблении в контексте данного документа термин аминокислотная замена относится к замене по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка в заданной аминокислотной последовательности (аминокислотной последовательности исходного полипептида) другим, отличным от него замещающим аминокислотным остатком. Термин аминокислотная вставка относится к включению по меньшей мере одной дополнительной аминокислоты в заданную аминокислотную последовательность. Хотя вставка обычно будет состоять из вставки одного или двух аминокислотных остатков, также могут быть сделаны более крупные пептидные вставки, например, вставка от около трех до около пяти или даже до около десяти, пятнадцати или двадцати аминокислотных остатков. Встроенный остаток может быть встречающимся в природе или не встречающимся в природе, как описано выше. Термин аминокислотная делеция относится к удалению по меньшей мере одного аминокислотного остатка из заданной аминокислотной последовательности.

При употреблении в контексте данного документа термин количество или уровень используется в самом широком смысле и относится к количеству, концентрации или содержанию соединения (например, метаболита, малой молекулы, белка, мРНК, маркера). Когда речь идет о метаболите или малой молекуле (например, лекарственном средстве), термины количество, уровень и концентрация обычно используются взаимозаменяемо и обычно относятся к поддающемуся обнаружению количеству в биологическом образце. Термины повышенные уровни или увеличенные уровни относятся к увеличению количества, концентрации или содержания соединения в образце по сравнению с контрольным образцом, например, у индивидуума или индивидуумов, не страдающих данным заболеванием или нарушением (например, онкологическим заболеванием), или по сравнению с внутренним контролем. В некоторых аспектах данного изобретения повышенный уровень соединения (например, лекарственного средства) в образце относится к увеличению количества указанного соединения на около 5%, на около 10%, на около 15%, на около 20%, на около 25%, на около 30%, на около 35%, на около 40%, на около 45%, на около 50%, на около 55%, на около 60%, на около 65%, на около 70%, на около 75%, на около 80%, на около 85%, на около 90%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98%, на около 99% или на около 100% по сравнению с количеством указанного соединения в контрольном образце, как определено с помощью методик, известных в данной области техники (например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ). Термин сниженный уровень относится к уменьшению количества, концентрации или содержания соединения (например, лекарственного средства) у индивидуума по сравнению с контролем, например, у индивидуума или индивидуумов, не страдающих данным заболеванием или нарушением (например, онкологическим заболеванием), или по сравнению с внутренним контролем. В некоторых аспектах данного изобретения сниженный уровень представляет собой малое или не поддающееся обнаружению количество, концентрацию или содержание. В некоторых аспектах данного изобретения сниженный уровень соединения (например, лекарственного средства) в образце относится к снижению количества указанного соединения на около 5%, на около 10%, на около 15%, на около 20%, на около 25%, на около 30%, на около 35%, на около 40%, на около 45%, на около 50%, на около 55%, на около 60%, на около 65%, на около 70%, на около 75%, на около 80%, на около 85%, на около 90%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98%, на около 99% или на около 100% по сравнению с количеством указанного соединения в контрольном образце, как определено с помощью методик, известных в данной области техники (например, с помощью ВЭЖХ).

Когда речь идет о белке, мРНК или маркере, таких как описанные в данном документе, термины уровень экспрессии или экспрессионный уровень в целом употребляются взаимозаменяемо и обычно относятся к поддающемуся выявлению количеству белка, мРНК или маркера в биологическом образце. В некоторых аспектах данного изобретения поддающееся выявлению количество или поддающийся выявлению уровень белка, мРНК или маркера связаны с вероятностью реакции на агент, такой как описанные в данном документе. Термин экспрессия обычно относится к процессу, посредством которого информация, содержащаяся в гене, преобразуется в структуры (например, белковый маркер,

- 8 052811 такой как PD-L1), присутствующие и действующие в указанной клетке. Следовательно, при употреблении в контексте данного документа термин экспрессия может относиться к транскрипции в полинуклеотид, трансляции в полипептид или даже к модификациям полинуклеотида и (или) полипептида (например, посттрансляционная модификация полипептида). Фрагменты транскрибируемого полинуклеотида, транслируемого полипептида или модификации полинуклеотида и (или) полипептида (например, посттрансляционная модификация полипептида) также должны рассматриваться как экспрессированные, независимо от того, происходят ли они из транскрипта, полученного путем альтернативного сплайсинга, или из деградированного транскрипта, или вследствие посттрансляционного процессинга полипептида, например, путем протеолиза. Термин экспрессированные гены включает в себя те гены, которые транскрибируются в полинуклеотид в виде мРНК и затем транслируются в полипептид, а также те гены, которые транскрибируются в РНК, но не транслируются в полипептид (например, транспортные и рибосомные РНК). Термины повышенная экспрессия, повышенные уровни экспрессии или повышенные уровни относятся к повышенной экспрессии или повышенным уровням соединения в образце по сравнению с контрольным образцом, например, у индивидуума или индивидуумов, не страдающих данным заболеванием или нарушением (например, онкологическим заболеванием), или по сравнению с внутренним контролем. В некоторых аспектах данного изобретения повышенная экспрессия соединения (например, белкового маркера, такого как PD-L1) в образце относится к увеличению количества указанного соединения на около 5%, на около 10%, на около 15%, на около 20%, на около 25%, на около 30%, на около 35%, на около 40%, на около

45%, на около 50%, на около 55%, на около 60%, на около 65%, на около 70%, на около 75%, на около

80%, на около 85%, на около 90%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98%, на около

99% или на около 100% по сравнению с количеством указанного соединения в контрольном образце, как определено с помощью методик, известных в данной области техники (например, с помощью клеточной сортировки с активацией флуоресценции - FACS). Термины сниженная экспрессия, сниженные уровни экспрессии или сниженные уровни относятся к сниженной экспрессии или сниженным уровням соединения (например, белкового маркера) у индивидуума по сравнению с контролем, например, у индивидуума или индивидуумов, не страдающих данным заболеванием или нарушением (например, онкологическим заболеванием), или по сравнению с внутренним контролем. В некоторых аспектах данного изобретения сниженная экспрессия представляет собой небольшую экспрессию или ее отсутствие. В некоторых аспектах данного изобретения сниженная экспрессия соединения (например, белкового маркера) в образце относится к снижению количества указанного соединения на около 5%, на около 10%, на около 15%, на около 20%, на около 25%, на около 30%, на около 35%, на около 40%, на около 45%, на около 50%, на около 55%, на около 60%, на около 65%, на около 70%, на около 75%, на около 80%, на около 85%, на около 90%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98%, на около 99% или на около 100% по сравнению с количеством указанного соединения в контрольном образце, как определено с помощью методик, известных в данной области техники (например, с помощью FACS).

При употреблении в контексте данного документа термин ангиогенез или неоваскуляризация относится к процессу, посредством которого новые кровеносные сосуды развиваются из ранее существовавших сосудов (Varner et al. (1999) Angiogen. 3: 53 - 60; Mousa et al. (2000) Angiogen. Stim. Inhib. 35: 42 - 44; Kim et al. (2000) Amer. J. Path. 156: 1345 - 1362; Kim et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 33920 - 33928; Kumar et al. (2000) Angiogenesis: From Molecular to Integrative Pharm. 169 - 180).

Эндотелиальные клетки из ранее существовавших кровеносных сосудов или из циркулирующих эндотелиальных стволовых клеток (Takahashi et al. (1995) Nat. Med. 5: 434 - 438; Isner et al. (1999) J. Clin. Invest. 103: 1231 - 1236) активируются, чтобы мигрировать, пролиферировать и дифференцироваться в структуры с просветами, формируя новые кровеносные сосуды, в ответ на фактор роста или гормональные сигналы, или в условиях гипоксии или ишемии. Во время ишемии, например, возникающей при онкологическом заболевании, потребность в увеличении оксигенации и доставки питательных веществ, по всей видимости, вызывает секрецию ангиогенных факторов пораженной тканью; эти факторы стимулируют образование новых кровеносных сосудов. Несколько дополнительных терминов связаны с ангиогенезом.

При употреблении в контексте данного документа термин антагонист относится к ингибитору целевой молекулы и может употребляться в данном документе как синоним термина ингибитор. При употреблении в контексте данного документа термин антагонист относится к любой молекуле, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного полипептида, описанного в данном документе. Подходящие молекулы-антагонисты, в частности, включают в себя антитела-антагонисты или фрагменты таких антител, фрагменты или варианты аминокислотной последовательности нативных полипептидов, пептидов или белков. В некоторых аспектах данного изобретения ингибирование в присутствии антагониста имеет дозозависимый характер. В некоторых аспектах данного изобретения измеряемый сигнал (например, показатель биологической активности) по меньшей мере на около 5%, по меньшей мере на около 10%, по меньшей мере на около 15%, по меньшей мере на около 20%, по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по

- 9 052811 меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 40%, меньшей мере на около 55%, меньшей мере на около 70%, меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 45%, по по меньшей мере на около 60%, по по меньшей мере на около 75%, по по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95% или по меньшей мере на около 100% ниже сигнала, измеренного в образце отрицательного контроля при сопоставимых условиях. Также в данном документе представлены способы идентификации антагонистов, пригодных для применения в способах согласно данному изобретению. Например, указанные способы включают в себя, но не ограничиваются ими, анализы связывания, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), системы ForteBio®, радиоиммуноанализ (РИА), анализ Meso Scale Discovery (например, электрохемилюминесцентный анализ Meso Scale Discovery (MSD-ECL) и анализ Luminex® на основе микрогранул. Такие анализы определяют способность антагониста связывать полипептид, представляющий интерес (например, рецептор или лиганд), и, следовательно, указывают на способность такого антагониста ингибировать, нейтрализовать или блокировать активность указанного полипептида. Эффективность антагониста также можно определить с помощью функциональных анализов, таких как способность антагониста ингибировать функцию данного полипептида или агониста. Например, функциональный анализ может включать в себя приведение полипептида в контакт с молекулой - потенциальным антагонистом и измерение обнаруживаемого изменения одной или большего числа биологических активностей, обычно ассоциированных с указанным полипептидом. Активность антагониста обычно определяют по его значению IC50 (концентрация, необходимая для ингибирования 50% ответа агониста). Чем ниже значение IC₅₀, тем выше активность антагониста и тем ниже концентрация, необходимая для ингибирования максимального биологического ответа.

При употреблении в контексте данного документа фраза антитело, которое проявляет антагонизм в отношении ИЛ-27 человека, или его антигенсвязывающая часть относится к антителу, которое проявляет антагонизм в отношении по меньшей мере одной известной в данной области техники активности ИЛ-27 человека (например, в отношении биологической активности ИЛ-27 и (или) пути (путей) ниже по каскаду, опосредованного (-ых) передачей сигнала от ИЛ-27 или другой функцией, опосредованной ИЛ-27), например, в связи со снижением (или уменьшением) активности ИЛ-27 человека, составляющей по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше. Дополнительные примеры биологической активности ИЛ-27 и (или) пути (путей) ниже по каскаду, опосредованного (-ых) передачей сигнала от ИЛ-27 или другой функцией, опосредованной ИЛ27, описаны более подробно ниже и в других частях данного документа.

При употреблении в контексте данного документа термин антагонистическое антитело против ИЛ27 (взаимозаменяемо обозначаемый как антитело против ИЛ-27) относится к антителу, которое специфически связывается с ИЛ-27 и ингибирует биологическую активность ИЛ-27 и (или) путь (пути) ниже по каскаду, опосредованный (-е) передачей сигнала от ИЛ-27 или другой функцией, опосредованной ИЛ-27. Антагонистическое антитело против ИЛ-27 включает в себя антитела, которые блокируют, проявляют антагонизм, подавляют, ингибируют или снижают биологическую активность ИЛ-27 (например, связывание лиганда, ферментативную активность), включая пути ниже по каскаду, опосредованные передачей сигналов или функцией ИЛ-27, например, связывание рецептора и (или) инициацию клеточного ответа на ИЛ-27 или его метаболиты. В некоторых аспектах данного изобретения антагонистическое антитело против ИЛ-27, представленное в данном документе, связывается с ИЛ-27 человека и предотвращает, блокирует или ингибирует связывание ИЛ-27 человека со свойственным ему или нормальным рецептором (например, рецептором ИЛ-27), или с одной или большим числом субъединиц рецептора (например, gp130 и (или) ИЛ-27Рα (также известным как WSX1/TCCR)). В некоторых аспектах данного изобретения указанное антагонистическое антитело против ИЛ-27 предотвращает, блокирует или ингибирует связывание ИЛ-27 человека с gp130. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антагонистическое антитело против ИЛ-27 предотвращает, блокирует или ингибирует связывание ИЛ-27 человека с ИЛ-27Рα. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антагонистическое антитело против ИЛ-27 предотвращает, блокирует или ингибирует димеризацию мономеров ИЛ-27. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело против ИЛ-27 не связывается специфически с мономером EBI3. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело против ИЛ-27 специфически связывается с мономером ИЛ-27р28. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанное антитело против ИЛ-27 специфически связывается с несмежным эпитопом, содержащим P28, но не связывается с мономером EBI3. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело против ИЛ-27 ингибирует или снижает фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело против ИЛ-27 ингибирует или снижает ингибирование экспрессии CD161 в клетке (например, ослабляет или устраняет опосредованное ИЛ-27 ингибирование экспрессии CD161 в клетке). В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело против ИЛ -27 ингибирует или снижает экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело против ИЛ-27 индуцирует или усиливает опосредованную PD-1 секрецию одного или большего

- 10 052811 числа цитокинов из клетки. В некоторых аспектах данного изобретения антагонистическое антитело против ИЛ-27 связывается с ИЛ-27 человека и стимулирует или усиливает противоопухолевый ответ. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антагонистическое антитело против ИЛ-27 связывается с ИЛ-27 человека с аффинностью, равной 15 нМ или меньше. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антагонистическое антитело против ИЛ-27 связывается с ИЛ-27 человека и содержит константную область тяжелой цепи IgG1 дикого типа или мутанта, или константную область тяжелой цепи IgG4 дикого типа или мутанта. Примеры антагонистических антител против ИЛ-27 приведены в данном документе.

При употреблении в контексте данного документа термин антитело относится к целому антителу, содержащему два полипептида легкой цепи и два полипептида тяжелой цепи. Целые антитела включают в себя различные изотипы антител, включительно с антителами IgM, IgG, IgA, IgD и IgE. Термин антитело включает в себя поликлональное антитело, моноклональное антитело, химеризированное или химерное антитело, гуманизированное антитело, приматизированное антитело, деиммунизированное антитело и полностью человеческое антитело. Антитело может быть получено из или произведено от любого из множества видов, например, млекопитающих, таких как человек, высшие приматы, отличные от человека (например, орангутанги, бабуины или шимпанзе), лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, собаки, кошки, кролики, морские свинки, песчанки, хомяки, крысы и мыши. Антитело может представлять собой рекомбинантное антитело. При употреблении в контексте данного документа термины фрагмент антитела, антигенсвязывающий фрагмент или аналогичные термины относятся к фрагменту антитела, который сохраняет способность связываться с целевым антигеном (например, ИЛ27) и ингибировать активность указанного целевого антигена. Такие фрагменты включают в себя, например, одноцепочечное антитело, одноцепочечный фрагмент Fv (оцFv), фрагмент Fd, фрагмент Fab, фрагмент Fab' или фрагмент F(ab')₂. Фрагмент оцFv представляет собой единую полипептидную цепь, которая включает в себя вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепей антитела, из которого получен указанный оцFv. Кроме того, интратела, миниантитела, триантела и диатела также включены в определение антитела и подходят для применения в способах, описанных в данном документе. См., например, работы Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248 (1): 47 - 66; Hudson and Kortt, (1999) J. Immunol. Methods 231 (1): 177 - 189; Poljak, (1994) Structure 2 (12): 1121 - 1123; Rondon and Marasco, (1997) Annu. Rev. Microbiol. 51: 257 - 283, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

При употреблении в контексте данного документа термин фрагмент антитела также включает в себя, например, однодоменные антитела, такие как верблюжьи однодоменные антитела. См ., например, работы Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26: 230 - 235; Nuttall et al. (2000) Curr. Pharm. Biotech. 1: 253 - 263; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 25 - 38; патентные публикации РСТ № WO 94/04678 и WO 94/25591; и патент США № 6005079, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых аспектах данного изобретения представлены однодоменные антитела, содержащие два домена VH, с модификациями, в результате которых образуются однодоменные антитела.

В некоторых аспектах данного изобретения антигенсвязывающий фрагмент включает в себя вариабельную область полипептида тяжелой цепи и вариабельную область полипептида легкой цепи. В некоторых аспектах данного изобретения антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, содержит CDR полипептида легкой цепи и полипептида тяжелой цепи антитела.

Термин антигенпрезентирующая клетка или АПК означает клетку, которая выставляет на своей поверхности чужеродный антиген в комплексе с ГКГ. Т-клетки распознают этот комплекс с помощью Тклеточного рецептора (ТКР). Примеры АПК включают в себя, но не ограничиваются ими, B-клетки, дендритные клетки (ДК), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), моноциты (такие как THP-1), B-лимфобластоидные клетки (такие как C1R.A2, 1518 B-LCL) и дендритные клетки (ДК), происходящие из моноцитов. Некоторые АПК интернализуют антигены либо посредством фагоцитоза, либо путем рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Термин презентация антигена относится к процессу, посредством которого АПК захватывают антигены и делают возможным их распознавание Т-клетками, например, в качестве компонента конъюгата ГКГ-I и (или) ГКГ-II.

При употреблении в контексте данного документа термин апоптоз относится к процессу запрограммированной гибели клеток, происходящему в многоклеточных организмах (например, в организме человека). Строго регулируемые биохимические и молекулярные события, которые приводят к апоптозу, могут приводить к наблюдаемым и характерным морфологическим изменениям клетки, включая вздутие мембраны, уменьшение объема клетки, конденсацию и фрагментацию хромосомной ДНК и распад мРНК. Распространенный способ идентификации клеток, включая Т-клетки, подвергающихся апоптозу, представляет собой воздействие на клетки конъюгированного с флуорофором белка (аннексин V). Аннексин V широко применяется для обнаружения апоптотических клеток по его способности связываться с фосфатидилсерином на внешнем слое плазматической мембраны, что является ранним индикатором того, что клетка подвергается процессу апоптоза.

- 11 052811

При употреблении в контексте данного документа термин В-клетка (альтернативно - Влимфоцит) относится к типу лейкоцитов подтипа лимфоцитов. В-клетки функционируют в компоненте гуморального иммунитета адаптивной иммунной системы, секретируя антитела. В-клетки также презентуют антиген и секретируют цитокины. В-клетки, в отличие от двух других классов лимфоцитов, Т-клеток и естественных клеток-киллеров, экспрессируют рецепторы В-клеток (ВКР) на своей клеточной мембране. ВКР позволяют В-клетке связываться со специфическим антигеном, против которого она инициирует образование антител.

При употреблении в контексте данного документа термин связывается с иммобилизованным ИЛ27 относится к способности антитела согласно данному изобретению связываться с ИЛ-27, например, экспрессированным на поверхности клетки или прикрепленным к твердой подложке.

При употреблении в контексте данного документа термин биспецифическое антитело или бифункциональное антитело означает искусственное гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелой/легкой цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получить с помощью различных способов, включая слияние гибридом или соединение фрагментов Fab'. См., например, работы Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315 - 321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148: 1547 - 1553.

Традиционно рекомбинантное продуцирование биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар легкая цепь/тяжелая цепь иммуноглобулина, при этом указанные две пары легкая цепь/тяжелая цепь имеют разную специфичность (Milstein and Cuello, (1983) Nature 305: 537 - 539). Вариабельные домены антител с желаемой специфичностью связывания (участки антитела, соединяющиеся с антигеном) могут быть слиты с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние вариабельной области тяжелой цепи предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, областей CH2 и CH3. Для получения дополнительной информации об иллюстративных известных в данное время способов получения биспецифических антител см., например, работу Suresh et al. (1986) Methods Enzymol. 121: 210; патентную публикацию № WO 96/27011; работы Brennan et al. (1985) Science 229: 81; Shalaby et al., J. Exp. Med. (1992) 175: 217 - 225; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148 (5): 1547 - 1553; Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448; Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368; и Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60. Биспецифические антитела включают в себя перекрестно-сшитые или гетероконъюгатные антитела. Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с применением любых подходящих способов перекрестного сшивания. Подходящие перекрестно-сшивающие агенты хорошо известны в данной области техники и представлены в патенте США № 4676980 вместе с рядом методик перекрестного сшивания.

В литературе описаны также различные методики получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Например, биспецифические антитела были получены с использованием лейциновых застежек. См., например, Kostelny et al. (1992) J Immunol 148 (5): 1547 - 1553. Пептиды лейциновой застежки из белков Fos и Jun могут быть связаны с частями Fab' двух разных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител могут быть восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окислены с образованием гетеродимеров антител. Данный способ можно также применять для получения гомодимеров антител. Технология диатела, описанная в работе Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444 - 6448, обеспечивает альтернативный механизм для получения биспецифических фрагментов антител. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) посредством линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить соединение между двумя доменами на одной цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены соединяться с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, тем самым образуя два антигенсвязывающих участка. Также сообщалось о другой стратегии получения фрагментов биспецифических антител с использованием одноцепочечных димеров Fv (оцFv). См., например, работу Gruber et al. (1994) J Immunol 152: 5368. В качестве альтернативы, антитела могут представлять собой линейные антитела, как описано, например, в работе Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8 (10): 1057 - 1062. Кратко, эти антитела составляют пару тандемных сегментов Fd (VH - CH1 - VH CH1), которые образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

Антитела с более чем двумя валентностями (например, триспецифические антитела) рассматриваются и описаны, например, в работе Tutt et al. (1991) J Immunol 147: 60.

Данное изобретение также охватывает вариантные формы мультиспецифических антител, такие как молекулы иммуноглобулина с двойным вариабельным доменом (ДВД-Ig, англ. DVD-Ig), описанные в работе Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25 (11): 1290 - 1297. Молекулы ДВД-Ig сконструированы таким образом, что два разных вариабельных домена легкой цепи (VL) из двух разных родительских антител связаны в тандеме напрямую или через короткий линкер с помощью методик рекомбинантной ДНК, за которыми следует константный домен легкой цепи. Аналогичным образом, тяжелая цепь содержит два различных вариабельных домена тяжелой цепи (VH), соединенных в тандем, за которыми следуют

- 12 052811 константный домен CH1 и область Fc. Способы получения молекул ДВД-Ig из двух родительских антител дополнительно описаны, например, в публикациях PCT № WO 08/024188 и WO 07/024715. В некоторых аспектах данного изобретения биспецифическое антитело представляет собой иммуноглобулин Fab-в-тандеме, в котором вариабельная область легкой цепи со второй специфичностью слита с вариабельной областью тяжелой цепи целого антитела. Такие антитела описаны, например, в публикации международной патентной заявки № WO 2015/103072.

При употреблении в контексте данного документа термин раковый антиген относится к: (i) опухолеспецифическим антигенам; (ii) ассоциированным с опухолью антигенам; (iii) клеткам, которые экспрессируют опухолеспецифические антигены; (iv) клеткам, которые экспрессируют ассоциированные с опухолью антигены; (v) эмбриональные антигены на опухолях; (vi) аутологичные опухолевые клетки; (vii) опухолеспецифические мембранные антигены; (viii) ассоциированные с опухолью мембранные антигены; (ix) рецепторы факторов роста; (x) лиганды факторов роста; и (xi) любой другой тип антигена, антигенпрезентирующей клетки или материала, ассоциированного с онкологическим заболевнаием.

При употреблении в контексте данного документа термин иммунный ответ в отношении рака относится к иммунному ответу, индуцированному присутствием опухолей, раковых клеток или раковых антигенов. В некоторых аспектах данного изобретения указанный ответ включает в себя пролиферацию лимфоцитов, специфичных в отношении ракового антигена. В определенных аспектах данного изобретения указанный ответ включает в себя экспрессию и активацию антител и рецепторов Т -клеток, а также образование и высвобождение лимфокинов, хемокинов и цитокинов. И врожденная, и приобретенная иммунные системы взаимодействуют, чтобы инициировать антигенные ответы против опухолей, раковых клеток или раковых антигенов. В некоторых аспектах данного изобретения иммунный ответ в отношении рака представляет собой Т -клеточный ответ.

Термин карцинома признан в данной области техники и относится к злокачественным новообразованиям эпителиальных или эндокринных тканей, включая карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно -кишечного тракта, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Антитела против ИЛ-27, описанные в данном документе, могут быть использованы для лечения пациентов, которые имеют, у которых подозревается наличие или которые могут иметь высокий риск развития любого типа онкологического заболевания, включая карциному почки или меланому, или любого вирусного заболевания. Типичные карциномы включают в себя карциномы, образующиеся из ткани шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, толстой кишки и яичника. Данный термин также включает в себя карциносаркомы, которые включают в себя злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Термин аденокарцинома относится к карциноме, происходящей из железистой ткани или в которой опухолевые клетки образуют узнаваемые железистые структуры.

При употреблении в контексте данного документа термин CD112R относится к одному из белков, подобных рецептору полиовируса, и представляет собой коингибирующий рецептор для Т -клеток человека. CD112R представляет собой ингибиторный рецептор, преимущественно экспрессируемый Т клетками и NK-клетками, и конкурирует с активирующим рецептором CD226 за связывание с CD112. Взаимодействие CD112 с CD112R имеет более высокую аффинность, чем с CD226, и, таким образом, эффективно регулирует опосредованную CD226 активацию клеток. Антагонисты, направленные против CD112R, которые блокируют взаимодействие с CD112, ограничивают ингибиторную передачу сигналов непосредственно ниже по каскаду от CD112R, одновременно способствуя большей активации иммунных клеток за счет увеличения взаимодействия CD226 с CD112. При употреблении в контексте данного документа термин ингибитор CD112R относится к агенту, который разрушает, блокирует или ингибирует биологическую функцию или активность CD112R.

При употреблении в контексте данного документа термин CD137 (альтернативно - 4-1BB) относится к члену суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО). 4-1BB представляет собой костимулирующую молекулу иммунной контрольной точки, прежде всего для активированных Т клеток. Перекрестное сшивание CD137 усиливает пролиферацию Т-клеток, секрецию ИЛ-2, выживаемость и цитолитическую активность. При употреблении в контексте данного документа термин агонист 4-1ВВ относится к агенту, который стимулирует, индуцирует или усиливает одну или большее число функций 4-1ВВ. Иллюстративный агонист 4-1BB представляет собой утомилумаб (PF-05082566) полностью человеческое моноклональное антитело IgG2, которое нацелено на указанный 4-1BB для стимуляции Т-клеток.

При употреблении в контексте данного документа термин CD161 (альтернативно известный как член 1 подсемейства В-рецепторов, подобных лектину клеток-киллеров (KLRB1); NK1.1 или NKR-P1A) относится к члену суперсемейства лектинов С-типа. CD161 представляет собой маркер Т-клеток, и экспрессия CD161 связана с инфильтрацией Т-клеток в микроокружение опухоли при ряде различных типов онкологических заболеваний. CD161 дополнительно описан в работе Fergusson et al. (2014) Cell Reports 9 (3): 1075 - 1088, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

- 13 052811

При употреблении в контексте данного документа термин ИЛ-27 или интерлейкин 27 относится к цитокину ИЛ-27. ИЛ-27 является цитокином, родственным семейству цитокинов ИЛ-6/ИЛ-12, и представляет собой гетеродимерный цитокин, который содержит первую субъединицу, известную как ген 3, индуцированный вирусом Эпштейна-Барр (EBI3; также известный как субъединица β ИЛ-27 и ИЛ27B), и вторую субъединицу, известную как ИЛ-27р28 (также известную как ИЛ-30, субъединица α ИЛ27 и ИЛ-27А). ИЛ-27 преимущественно синтезируется активированными антигенпрезентирующими клетками, включая моноциты, эндотелиальные клетки и дендритные клетки (Jankowski et al. (2010) Arch Immunol. Ther. Exp. 58: 417 - 425, Diakowski et al. (2013) Adv. Clin. Exp. Med. (2013) 22 (5): 683 - 691). Несмотря на то, что ИЛ-27 может оказывать провоспалительное действие, многие исследования предполагают важную роль ИЛ-27 в качестве иммунодепрессанта (работы Shimizu et al. (2006) J. Immunol. 176: 7317 - 7324, Hisada et al. (2004) Cancer Res. 64: 1152 - 1156, Diakowski (2013), см. выше). Хотя первоначально он был описан как фактор, способствующий инициации ответов Th1, позже было обнаружено, что ИЛ-27 опосредует главную супрессивную функцию Т-клеток, ограничивая ответы Th1, ингибируя дифференцировку клеток Th2 и Th17 и регулируя развитие Tr1 и других регуляторных популяций Т-клеток (Dietrich et al. (2014) J. Immunol. 192: 5382 - 5389). В дополнение к своей роли иммунорегулятора ИЛ-27 также регулирует ангиогенез, гемопоэз и остеокальцитогенез (см. указанную выше публикацию).

ИЛ-27 передает сигналы через гетеродимерный рецептор цитокинов I типа (рецептор ИЛ-27 или ИЛ-27Р), который содержит первую субъединицу, известную как WSX1 (также известную как субъединица α рецептора ИЛ-27, ИЛ-27РА, Т-клеточный цитокиновый рецептор типа 1 (TCCR) и рецептор-подобный цитокин 1 (CRL1)) и вторую субъединицу, известную как gp130 (также известную как трансдуктор сигнала интерлейкина-6 (IL6ST), субъединица β рецептора интерлейкина-6 (ИЛ-6РБ) и рецептор онкостатина М). gp130 также представляет собой субъединицу рецептора цитокинов семейства ИЛ-6 (Liu et al. (2008) Scan. J. Immunol. 68:22-299, Diakowski (2013), см. выше). Передача сигналов от ИЛ-27 через ИЛ-27Р активирует несколько сигнальных каскадов, включая пути JAK-STAT и p38 MAPK.

Также считается, что субъединица EBI3 обладает биологическими функциями, независимыми от p28 или гетеродимера ИЛ-27. Например, субъединица EBI3 также взаимодействует с p35 с образованием гетеродимерного цитокина ИЛ-35 (Yoshida et al. (2015) Annu. Rev Immunol. 33: 417 - 443) и было показано, что она селективно сверхэкспрессируется в определенных типах клеток без соответствующего повышения p28 или ИЛ-27 (Larousserie et al. (2005) Am. J. Pathol. 166 (4): 1217 - 1228).

Аминокислотная последовательность иллюстративного белка EBI3 человека представлена в SEQ ID NO: 1 (референсная последовательность NCBI: NP_005746.2;

Nmtpqlllalvlwascppcsgrkgppaaltlprvqcrasrypiavdcswtlppapnstspvsfiatyrlgmaarghswpclqqtptstsctitdvqlfsmapyvlnvtav hpwgssssfvpfitehiikpdppegvrlsplaerqlqvqweppgswpfpeifslkywirykrqgaarfhrvgpieatsfilravrpraryyvqvaaqdltdygelsd wslpatatmslgk-C). Аминокислотная последовательность иллюстративного белка р28 человека представлена в SEQ ID NO: 2 (референсная последовательность NCBI: NP 663634.2; Nmgqtagdlgwrlsllllplllvqagvwgfprppgrpqlslqelrreftvslhlarkllsevrgqahrfaeshlpgvnlyllplgeqlpdvsltfqawrrlsdperlcfisttlq pihallgglgtqgrwtamermqlwarnrldlrdlqrhlrfqvlaagfnlpeeeeeeeeeeeeerkgllpgalgsalqgpaqvswpqllstyrllhslelvlsravre 1111s kaghsvwplgfptlspqp-C).

Аминокислотная последовательность иллюстративного белка WSX1 человека представлена в SEQ ID NO: 3 (референсная последовательность NCBI: NP_004834.1;

Nmrggrgapfwlwplpklallpllwvlfqrtrpqgsagplqcygvgplgdlncsweplgdlgapselhlqsqkyrsnktqtvavaagrswvaipreqltmsdkllvw gtkagqplwppvfvnletqmkpnaprlgpdvdfseddpleatvhwapptwpshkvlicqfhyrrcqeaawtllepelktipltpveiqdlelatgykvygrcrme keedlwgewspilsfqtppsapkdvwvsgnlcgtpggeeplllwkapgpcvqvsykvwfwvggrelspegitcccslipsgaewarvsavnatswepltnlslv cldsasaprsvavssiagstellvtwqpgpgeplehvvdwardgdpleklnwvrlppgnlsallpgnftvgvpyritvtavsasglasassvwgfreelaplvgptlw rlqdappgtpaiawgevprhqlrghlthytlcaqsgtspsvcmnvsgntqsvtlpdlpwgpcelwvtastiagqgppgpilrlhlpdntlrwkvlpgilflwglfllgc glslatsgrcyhlrhkvlprwvwekvpdpansssgqphmeqvpeaqplgdlpileveemepppvmessqpaqatapldsgyekhilptpeelgllgpprpqvla -C).

Аминокислотная последовательность иллюстративного белка gp130 человека представлена в SEQ ID NO: 4 (референсная последовательность NCBI: NP_002175.2;

- 14 052811

Nmltlqtwlvqalfiflttestgelldpcgyispespvvqlhsnftavcvlkekcmdyfhvnanyivwktnhftipkeqytiinrtassvtftdiaslniqltcniltfgqleq nvygitiisglppekpknlscivnegkkmrcewdggrethletnftlksewathkfadckakrdtptsctvdystvyfvnievwveaenalgkvtsdhinfdpvyk vkpnpphnlsvinseelssilkltwtnpsiksviilkyniqyrtkdastwsqippedtastrssftvqdlkpfteyvfrircmkedgkgywsdwseeasgityedrpsk apsfwykidpshtqgyrtvqlvwktlppfeangkildyevtltrwkshlqnytvnatkltvnltndrylatltvmlvgksdaavltipacdfqathpvmdlkafpkdn mlwvewttpresvkkyilewcvlsdkapcitdwqqedgtvhrtylrgnlaeskcylitvtpvyadgpgspesikaylkqappskgptvrtkkvgkneavlewdql pvdvqngfmiytifyrtiignetavnvdsshteytlssltsdtlymvrmaaytdeggkdgpeftfttpkfaqgeieaiwpvclafllttllgvlfcfiikrdlikkhiwpn vpdpskshiaqwsphtpprhnfnskdqmysdgnftdvsvveieandkkpfpedlksldlfkkekmteghssgiggsscmsssrpsisssdenessqntsstvqys tvvhsgyrhqvpsvqvfsrsestqplldseerpedlqlvdhvdggdgilprqqyfkqncsqhesspdishferskqvssvneedfvrlkqqisdhisqscgsgqmk mfqevsaadafgpgtegqverfetvgmeaatdegmpksylpqtvrqggympq-C).

При употреблении в контексте данного документа термин конкурировать, когда он используется в контексте антигенсвязывающих белков (например, иммуноглобулинов, антител или их антигенсвязывающих фрагментов), которые конкурируют за связывание с одним и тем же эпитопом, относится к взаимодействию между антигенсвязывающими белки, как определено с помощью анализа (например, анализ конкурентного связывания; анализ перекрестного блокирования), при этом тестируемый антигенсвязывающий белок (например, тестируемое антитело) ингибирует (например, снижает или блокирует) специфическое связывание референсного антигенсвязывающего белка (например, референсного антитела) с общим антигеном (например, ИЛ-27 или его фрагментом).

Полипептид, или аминокислотная последовательность, полученный (-ая) из обозначенного белка или полипептида относится к происхождению полипептида. Предпочтительно полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из конкретной последовательности, имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична этой последовательности или ее части, при этом указанная часть состоит по меньшей мере из 10-20 аминокислот, предпочтительно меньшей мере из 20-30 аминокислот, более предпочтительно - по меньшей мере из 30-50 аминокислот, или которая иным образом идентифицируется специалистом в данной области техники как происходящая из указанной последовательности. Полипептиды, полученные из другого пептида, могут иметь одну или большее число мутаций по отношению к исходному полипептиду, например, один или большее число аминокислотных остатков, которые были заменены другим аминокислотным остатком, или которые имеют одну или большее число вставок или делеций аминокислотных остатков.

Полипептид может содержать аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе. Такие варианты обязательно меньше чем на 100% идентичны или сходны с последовательностью исходной молекулы. В некоторых аспектах данного изобретения указанный вариант будет иметь аминокислотную последовательность, которая на от около 75% до меньше чем 100% идентична или сходна с аминокислотной последовательностью исходного полипептида, более предпочтительно - на от около 80% до меньше чем 100%, более предпочтительно - на от около 85% до меньше чем 100%, более предпочтительно - на от около 90% до меньше чем 100% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) и наиболее предпочтительно - на от около 95% до меньше чем 100%, идентична или сходна с аминокислотной последовательностью исходного полипептида, например, по всей протяженности указанной вариантной молекулы.

В некоторых аспектах данного изобретения антитела согласно данному изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью. Нуклеотидные последовательности согласно данному изобретению могут быть использованы для ряда применений, включая: клонирование, генную терапию, экспрессию и очистку белков, введение мутаций, ДНК-вакцинацию хозяина, нуждающегося в этом, создание антител, например, для пассивной иммунизации, ПЦР, генерация праймеров и зондов, и т.п.

Специалисту в данной области техники также будет понятно, что антитела, подходящие для применения в представленных в данном документе способах, могут быть изменены таким образом, что их последовательность будет отличаться от встречающихся в природе или нативных последовательностей, из которых они были получены, с сохранением при этом желательной активности, свойственной указанным нативным последовательностям. Например, могут быть сделаны нуклеотидные или аминокислотные замены, приводящие к консервативным заменам или изменениям в заменимых аминокислотных остатках. Мутации можно ввести с помощью стандартных методик, известных в данной области техники, например, сайт-специфического мутагенеза и опосредованного полимеразной цепной реакцией (ПЦР) мутагенеза.

Антитела, подходящие для применения в представленных в данном документе способах, могут содержать консервативные аминокислотные замены в одном или большем числе аминокислотных остатков, например, в незаменимых или заменимых аминокислотных остатках. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных

- 15 052811 остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, заменимый аминокислотный остаток в связывающем полипептиде предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом аспекте последовательность аминокислот может быть консервативно заменена структурно подобной последовательностью, которая отличается по порядку и (или) составу аминокислот - членов семейства боковых цепей. В качестве альтернативы, в некоторых аспектах данного изобретения мутации могут быть введены случайным образом по всей продолжительности или части кодирующей последовательности, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть включены в связывающие полипептиды согласно данному изобретению и подвергнуты скринингу на их способность связываться с желаемой целевой молекулой.

При употреблении в контексте данного документа термин перекрестная презентация антигена относится к презентации экзогенных белковых антигенов Т-клеткам через молекулы ГКГ класса I и класса II на АПК.

При употреблении в контексте данного документа термин перекрестно реагирует относится к способности антитела согласно данному изобретению связываться с ИЛ-27 другого вида. Например, антитело согласно данному изобретению, которое связывает ИЛ -27 человека, может также связывать ИЛ-27 других видов. При употреблении в контексте данного документа перекрестную реактивность измеряют путем обнаружения специфической реактивности с очищенным антигеном в анализах связывания (например, поверхностный плазмонный резонанс - ППР, англ. SPR; ТИФА) или по связыванию или иному функциональному взаимодействию с клетками, физиологически экспрессирующими ИЛ-27. Способы определения перекрестной реактивности включают в себя стандартные анализы связывания, как описано в данном документе, например, с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (ППР) Biacore™ с использованием анализатор Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, г. Уппсала, Швеция), или с помощью методик проточной цитометрии.

При употреблении в контексте данного документа термин ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) относится к иммунному ответу, индуцированному цитотоксическими Т-клетками. Ответы ЦТЛ опосредованы главным образом CD8+ Т-клетками.

При употреблении в контексте данного документа термин дендритная клетка или ДК относится к типу антигенпрезентирующих клеток, которые представляют собой лейкоциты, происходящие из костного мозга (КМ), и представляют собой наиболее активный тип антигенпрезентирующих клеток. ДК захватывают и процессируют антигены, превращая белки в пептиды, которые затем презентуются на молекулах главного комплекса гистосовместимости (ГКГ, англ. MHC), распознаваемых Т-клетками. ДК являются гетерогенной популяцией, например, миелоидные и плазмацитоидные ДК; хотя все ДК способны поглощать антиген, процессировать и презентировать его наивным Т -клеткам, подтипы ДК имеют разные маркеры и различаются по местонахождению, путям миграции, подробной иммунологической функции и зависимости от инфекций или воспалительных стимулов при их образовании. Во время развития адаптивного иммунного ответа фенотип и функция ДК играют роль в инициации толерантности, памяти и дифференцировки поляризованных Т-хелперов 1 (Th1), Th2 и Th17.

При употреблении в контексте данного документа термин активация дендритных клеток относится к переходу дендритных клеток от незрелых к зрелым; активированные дендритные клетки включают в себя зрелые дендритные клетки и дендритные клетки в процессе перехода, при этом экспрессия CD80 и CD86, которые индуцируют костимулирующие сигналы, повышается активирующими стимулами. Зрелые дендритные клетки человека представляют собой клетки, положительные в отношении экспрессии CD40, CD80, CD86 и HLA-класса II (например, HLA-DR). Незрелую дендритную клетку можно отличить от зрелой дендритной клетки, например, на основании маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD80 и CD86. Незрелая дендритная клетка является слабо положительной, а предпочтительно - отрицательной в отношении указанных маркеров, в то время как зрелая дендритная клетка является положительной. Специалисты в данной области техники рутинно проводят разделение зрелых дендритных клеток, и соответствующие маркеры, описанные выше, и способы измерения их экспрессии также хорошо известны специалистам в данной области техники.

При употреблении в контексте данного документа термин EC₅₀ относится к такой концентрации антитела или его антигенсвязывающей части, которая индуцирует ответ либо в анализе in vitro, либо в анализе in vivo, составляющий 50% от максимального ответа, т.е. находящийся посередине между максимальным ответом и базовым уровнем.

При употреблении в контексте данного документа термин эффективная доза или эффективная дозировка определяется как количество, достаточное для достижения или по меньшей мере частичного достижения желаемого эффекта. Термин терапевтически эффективная доза определяется как

- 16 052811 количество, достаточное для излечения или по меньшей мере частичного прерывания заболевания и его осложнений у пациента, который уже страдает от данного заболевания. Количества, эффективные для такого применения, зависят от тяжести заболевания, подлежащего лечению, и общего состояния собственной иммунной системы пациента.

При употреблении в контексте данного документа термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к участку на антигене, с которым специфически связываются иммуноглобулин или антитело. Термин картирование эпитопов относится к процессу или способу идентификации сайта связывания, или эпитопа, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента на его целевом белковом антигене. В данном документе представлены способы и методики картирования эпитопов. Эпитопы могут быть образованы как смежными аминокислотами, так и не смежными аминокислотами, расположенными рядом в результате сворачивания белка в третичную структуру. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные в результате сворачивания в третичную структуру, обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Как правило, эпитоп включает в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, с какими эпитопами связывается данное антитело (т.е. картирование эпитопов), хорошо известны в данной области техники и включают в себя, например, иммуноблоттинг и анализы иммунопреципитации, в которых перекрывающиеся или смежные пептиды из ИЛ-27 тестируют на предмет их реактивности с данным антителом против ИЛ-27. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают в себя способы, известные в данной области техники, и способы, описанные в данном документе, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерномагнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

Данное изобретение также охватывает антитела, которые связываются с эпитопом на ИЛ-27, который содержит весь или часть эпитопа, распознаваемого конкретными антителами, описанными в данном документе (например, тот же самый или перекрывающийся участок, или участок, находящийся в пределах такого участка или охватывающий его).

Данное изобретение также охватывает антитела, которые связывают один и тот же эпитоп, и (или) антитела, которые конкурируют с описанными в данном документе антителами за связывание с ИЛ -27 человека. Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп или конкурируют за связывание, могут быть идентифицированы с использованием рутинных методик. Такие методики включают в себя, например, иммуноанализ, который показывает способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном, т.е. анализ конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяют в анализе, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референсного антитела с общим антигеном, таким как ИЛ-27. Известны многочисленные типы анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), сэндвич-конкурентный анализ (см. работу Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); твердофазный прямой биотин-авидиновый ИФА (см. работу Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); твердофазный анализ с прямым мечением, твердофазный сэндвич-анализ с прямым мечением (см. работу Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазный РИА прямым мечением с использованием метки I-125 (см. работу Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988)); твердофазный прямой биотин-авидиновый ИФА (см. работу Cheung et al., Virology 176: 546 (1990)); и РИА с прямым мечением. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)). Как правило, такие способы анализа включают в себя применение очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих любой из них, немеченого исследуемого иммуноглобулина и меченого референсного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование оценивают путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Как правило, исследуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Как правило, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое референсного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, на 55-60%, на 60-65%, на 65-70%, на 70-75% или больше.

Другие методики включают в себя, например, способы картирования эпитопов, такие как рентгеноструктурный анализ кристаллов комплексов антиген - антитело, обеспечивающие атомарное разрешение эпитопа, и масс-спектрометрию в сочетании с водородно-дейтериевым (H/D) обменом, которая изучает конформацию и динамику взаимодействия антиген - антитело. Другие способы исследуют связывание антитела с фрагментами антигена или мутантными вариациями антигена, при этом потеря связывания из-за модификации аминокислотного остатка в последовательности данного антигена часто считается признаком наличия эпитопного компонента. Кроме того, можно применять вычислительные комбинаторные способы для картирования эпитопов. Эти способы основаны на способности представляющего интерес антитела аффинно изолировать специфические короткие пептиды из комбинаторных библиотек фаговых дисплеев. Затем такие пептиды рассматриваются как основа для определения эпитопа, соответствующего антителу, использованному для скрининга указанной

- 17 052811 библиотеки пептидов. Для картирования эпитопов также были разработаны вычислительные алгоритмы, которые, как было показано, картируют конформационные прерывистые эпитопы.

При употреблении в контексте данного документа термин Fc-опосредованные эффекторные функции или эффекторные функции Fc относится к биологическим активностям антитела, отличной от основной функции и назначения данного антитела. Например, эффекторные функции терапевтического агонистического антитела представляют собой биологические активности, отличные от активации целевого белка или пути. Примеры эффекторных функций антитела включают в себя связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; снижение уровня экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора); отсутствие активации тромбоцитов, экспрессирующих рецептор Fc; и активацию В-клеток. Многие эффекторные функции начинаются со связывания Fc с рецептором Fcy. В некоторых аспектах данного изобретения антитело, нацеленное на опухолевый антиген, обладает эффекторной функцией, например, активностью АЗКЦ. В некоторых аспектах данного изобретения нацеленное на опухолевый антиген антитело, представленное в данном документе, содержит вариантную константную область, обладающую повышенной эффекторной функцией (например, повышенной способностью опосредовать АЗКЦ) по сравнению с немодифицированной формой константной области.

При употреблении в контексте данного документа термин рецептор Fc относится к полипептиду, обнаруживаемому на поверхности эффекторных клеток иммунной системы, который связывается с областью Fc антитела. В некоторых аспектах данного изобретения рецептор Fc представляет собой рецептор Fcy. Существуют три подкласса рецепторов Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FycRIII (CD16). Все четыре изотипа IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) связывают и активируют рецепторы Fc - FcyRI, FcyRIIA и FcyRIIIA. FcyRIIB представляет собой ингибиторный рецептор, поэтому связывание антител с этим рецептором не активирует комплемент и клеточные ответы. FcyRI представляет собой высокоаффинный рецептор, который связывается с IgG в мономерной форме, тогда как FcyRIIA и FcyRIIIA представляет собой низкоаффинные рецепторы, которые связывают IgG только в мультимерной форме и имеют несколько более низкую аффинность. Связывание антитела с рецептором Fc и (или) с C1q регулируется специфическими остатками или доменами в областях Fc. Связывание также зависит от остатков, расположенных в шарнирной области и в части СН2 антитела. В некоторых аспектах данного изобретения агонистическая и (или) терапевтическая активности представленных в данном документе антител зависят от связывания области Fc с рецептором Fc (например, с FcyR). В некоторых аспектах данного изобретения агонистическая и (или) терапевтическая активности представленных в данном документе антител усиливаются от связывания области Fc с рецептором Fc (например, с FcyR).

Список определенных последовательностей рецептора Fc, применяемых в данном изобретении, представлен в табл. 13 ниже.

При употреблении в контексте данного документа термин профиль гликозилирования определяется как характер расположения и состава углеводных единиц, которые ковалентно присоединены к белку, более конкретно - к белку иммуноглобулина. Профиль гликозилирования гетерологичного антитела может быть охарактеризован как по существу сходный с профилем гликозилирования, который встречается в природе у антител, продуцируемых видами трансгенных животных, отличных от человека, когда рядовой специалист в данной области техники распознает профиль гликозилирования гетерологичного антитела как являющийся более сходным с указанным профилем гликозилирования у видов трансгенных животных, отличных от человека, чем у видов, от которых получены гены СН указанного трансгена.

При употреблении в контексте данного документа термин антитело человека включает в себя антитела, имеющие вариабельные и константные области (при их наличии), происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека согласно данному изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro, или с помощью соматической мутации in vivo) (см., например, работы Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856 - 859); Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - 101; Lonberg & Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65 - 93, and Harding & Lonberg, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536 - 546). Тем не менее, при употреблении в контексте данного документа термин антитело человека не включает в себя антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевых линий других видов млекопитающих, таких как мыши, были вставлены в каркасные последовательности человека (т.е. гуманизированные антитела).

При употреблении в контексте данного документа термин гетерологичное антитело определяется в отношении трансгенного, отличного от человека организма, продуцирующего такое антитело. Данный термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующие тем, которые обнаруживаются в организме,

- 18 052811 не являющемся трансгенным животным, отличным от человека, и, как правило, из вида, отличного от вида трансгенного животного, отличного от человека.

Термины индуцирование иммунного ответа и усиление иммунного ответа употребляются взаимозаменяемо и относятся к стимуляции иммунного ответа (т.е. либо пассивного, либо адаптивного) на конкретный антиген. Термин индуцировать, употребляемый в отношении индуцирования КЗЦ или АЗКЦ, относится к стимуляции конкретных механизмов прямого уничтожения клеток.

При употреблении в контексте данного документа термин иммуногенная гибель клеток (также известный как иммуногенный апоптоз) относится к способу гибели клеток, связанному с активацией одного или большего числа сигнальных путей, которые индуцируют предсмертную экспрессию и испускание молекулярных фрагментов, ассоциированных с повреждением (МФАП, англ. DAMP) (например, аденозинтрифосфат, АТФ) из опухолевой клетки, что приводит к повышению иммуногенности указанной опухолевой клетки и гибели указанной опухолевой клетки иммуногенным образом (например, путем фагоцитоза). При употреблении в контексте данного документа термин агент, индуцирующий иммуногенную гибель клеток относится к химическому, биологическому или фармакологическому агенту, который индуцирует процесс, путь или способ иммуногенной гибели клеток.

При употреблении в контексте данного документа термины ингибирует, снижает или блокирует (например, в отношении ингибирования или снижения фосфорилирования STAT1 и (или) STAT3 в клетке, опосредованного ИЛ-27 человека) употребляются взаимозаменяемо и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование ИЛ-27 снижает или изменяет нормальный уровень или тип активности, которая осуществлялась бы при отсутствии ингибирования или блокирования. Ингибирование и блокирование также включают в себя любое измеримое снижение аффинности связывания ИЛ -27 при его контакте с антителом против ИЛ-27 по сравнению с ИЛ-27, не находящимся в контакте с антителом против ИЛ-27, например, связывание ИЛ-27 ингибируется по меньшей мере на около 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

При употреблении в контексте данного документа термины ингибирует ангиогенез, уменьшает ангиогенез и снижает ангиогенез относятся к снижению уровня ангиогенеза в ткани до величины, которая составляет по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или меньше, чем количество в соответствующей контрольной ткани, и наиболее предпочтительно находится на том же уровне, который наблюдается в контрольной ткани.

При употреблении в контексте данного документа термин ингибирует рост (например, в отношении клеток) предназначен для включения в себя любого измеримого снижения роста клетки, например, ингибирование роста клетки по меньшей мере на около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%.

При употреблении в контексте данного документа термин нуждающийся в профилактике, нуждающийся в лечении или нуждающийся в этом относится к тому, кто по мнению соответствующего медицинского сотрудника (например, врача, медсестры или практикующей медсестры - в случае людей; ветеринара - в случае млекопитающих, отличных от человека), получит надлежащую пользу от данного лечения (например, лечения композицией, содержащей антитело против ИЛ-27).

Термин in vivo относится к процессам, происходящим в живом организме.

При употреблении в контексте данного документа термин выделенное антитело предназначен для обозначения антитела, которое по существу не содержит другие антитела, имеющие другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с ИЛ -27 человека, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от ИЛ-27). Тем не менее, выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, может иметь перекрестную реактивность с другими белками ИЛ-27 из разных видов. Тем не менее, указанное антитело продолжает демонстрировать специфическое связывание с ИЛ-27 человека в анализе специфического связывания, как описано в данном документе. В дополнение к этому, выделенное антитело, как правило, по существу не содержит другого клеточного материала и (или) химических веществ. В некоторых аспектах данного изобретения комбинация выделенных антител, обладающих различной специфичностью в отношении ИЛ-27, объединена в четко определенную композицию.

При употреблении в контексте данного документа термин молекула выделенной нуклеиновой кислоты относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например,V_H, VL, CDR3), которые связываются с ИЛ-27, и предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие указанное антитело или его часть, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или части антител, которые связывают антигены, отличные от ИЛ-27, при этом другие последовательности могут естественным образом фланкировать нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. Например, последовательность, выбранная из набора последовательностей, представленного в табл. 12,

- 19 052811 соответствует нуклеотидным последовательностям, содержащим вариабельные области тяжелой цепи (V_H) и легкой цепи (V_L) моноклональных антител против ИЛ-27, описанных в данном документе.

При употреблении в контексте данного документа термин изотип относится к классу антител (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи. В некоторых аспектах данного изобретения моноклональное антитело человека согласно данному изобретению относится к изотипу IgG1. В некоторых аспектах данного изобретения моноклональное антитело человека согласно данному изобретению относится к изотипу IgG2. В некоторых аспектах данного изобретения моноклональное антитело человека согласно данному изобретению относится к изотипу IgG3. В некоторых аспектах данного изобретения моноклональное антитело человека согласно данному изобретению относится к изотипу IgG4. Как очевидно квалифицированному специалисту в данной области техники, идентификация изотипов антител (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1 IgA2, IgD и IgE) является рутинной в данной области техники и, как правило, включает в себя комбинацию выравнивания последовательностей с известными антителами, опубликованными последовательностями вариантов по Fc и консервативными последовательностями.

При употреблении в контексте данного документа термин переключение изотипа относится к явлению, посредством которого класс или изотип антитела изменяется с одного класса Ig на один из других классов Ig.

При употреблении в контексте данного документа термин KD или K_D относится к равновесной константе диссоциации в реакции связывания между антителом и антигеном. Значение K_D представляет собой числовое отображение отношения константы скорости диссоциации антитела (kd) к константе скорости ассоциации антитела (k_a). Величина K_D обратно пропорциональна аффинности связывания антитела с антигеном. Чем меньше значение K_D, тем выше аффинность антитела к его антигену. Аффинность представляет собой силу связывания отдельной молекулы с ее лигандом и обычно измеряется и отображается с помощью равновесной константы диссоциации (KD), которая используется для оценки и ранжирования силы бимолекулярных взаимодействий.

При употреблении в контексте данного документа термин kd или kd (в качестве альтернативы koff или k_off) предназначен для обозначения константы скорости диссоциации антитела из комплекса антитело - антиген. Значение kd представляет собой числовое отображение доли комплексов, которые распадаются или диссоциируют в секунду, и выражается в единицах с^-1.

При употреблении в контексте данного документа термин ka или k_a (в качестве альтернативы kon или k_on) предназначен для обозначения константы скорости ассоциации антитела с антигеном. Значение ka представляет собой числовое отображение числа комплексов антитело - антиген, образующихся за секунду в 1-молярном (1М) растворе антитела и антигена, и выражается в единицах М 1с^-1.

При употреблении в контексте данного документа термин лейкоцит относится к типу белых клеток крови, участвующих в защите организма от инфекционных организмов и чужеродных веществ. Лейкоциты образуются в костном мозге. Существует 5 основных типов лейкоцитов, подразделяющиеся на 2 основные группы: полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) и мононуклеарные лейкоциты (моноциты и лимфоциты).

При употреблении в контексте данного документа термин лимфоциты относится к типу белых клеток крови, или лейкоцитов, которые участвуют в иммунной защите организма. Существует два основных типа лимфоцитов: В-клетки и Т-клетки.

При употреблении в контексте данного документа термины связанный, слитый или слияние используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединению вместе двух или большего числа элементов, компонентов или доменов любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. Способы химической конъюгации (например, с использованием гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих агентов) известны в данной области техники.

При употреблении в контексте данного документа термин местное введение или местная доставка относится к доставке, не зависящей от транспортировки композиции или терапевтического агента к предназначенной целевой ткани или целевой области через сосудистую систему. Например, композицию можно доставлять с помощью инъекции или имплантации композиции или агента, либо путем инъекции или имплантации устройства, содержащего композицию или агент. После местного введения вблизи целевой ткани или целевой области композиция, агент, или один или большее число их компонентов могут диффундировать к предназначенной целевой ткани или целевой области.

При употреблении в контексте данного документа термин молекулы ГКГ относится к двум типам молекул: ГКГ класса I и ГКГ класса II. Молекулы ГКГ класса I презентуют антиген определенным CD8+ T-клеткам, а молекулы ГКГ класса II презентуют антиген определенным CD4+ T-клеткам. Антигены, доставляемые к АПК экзогенно, проходят процессинг главным образом для ассоциации с ГКГ класса II. Напротив, антигены, доставляемые к АПК эндогенно, проходят процессинг главным образом для ассоциации с ГКГ класса I.

При употреблении в контексте данного документа термин моноклональное антитело относится к антителу, которое проявляет единственную специфичность связывания и аффинность к конкретному

- 20 052811 эпитопу. Соответственно, термин моноклональное антитело человека относится к антителу, которое проявляет единственную специфичность связывания и которое имеет вариабельные и необязательные константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. В некоторых аспектах данного изобретения моноклональные антитела человека продуцируются гибридомой, которая включает в себя В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например, трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, слитые с иммортализованной клеткой.

При употреблении в контексте данного документа термин моноцит относится к типу лейкоцитов и может дифференцироваться в макрофаги и дендритные клетки для осуществления иммунного ответа.

При употреблении в контексте данного документа термин естественные клетки-киллеры (NK) относится к типу цитотоксических лимфоцитов. Это крупные, как правило зернистые, не-Т-, не-Влимфоциты, убивающие определенные опухолевые клетки и играющие важную роль во врожденном иммунитете к вирусам и другим внутриклеточным патогенам, а также в антителозависимой клеточно опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ).

При употреблении в контексте данного документа термин встречающийся в природе применительно к объекту относится к тому факту, что данный объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательности, присутствующие в организме (включая вирусы), которые могут быть выделены из источника в природе и которые не были преднамеренно изменены человеком в лаборатории, встречаются в природе.

При употреблении в контексте данного документа термин непереключаемый изотип относится к изотипическому классу тяжелой цепи, которая продуцируется, когда не происходит переключения изотипа; ген СН, кодирующий непереключаемый изотип, обычно представляет собой первый ген СН, расположенный непосредственно в направлении к 3' функционально реаранжированного гена VDJ. Переключение изотипа классифицируется как классическое или неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит в результате событий рекомбинации, в которых участвует по меньшей мере один участок последовательности переключения в данном трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, путем гомологичной рекомбинации между σ_μ человека и Σ_μ человека (δ-ассоциированная делеция). Могут происходить альтернативные неклассические механизмы переключения, такие как межтрансгенная и (или) межхромосомная рекомбинация, среди прочего, и вызывать переключение изотипа.

При употреблении в контексте данного документа термин нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам либо в одно -, либо в двухцепочечной форме.

Если не указаны специальные ограничения, данный термин включает в себя нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают связывающими свойствами, сходными со свойствам референсной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются способом, сходным с таковым для встречающихся в природе нуклеотидов. Если не указано иное, подразумевается, что конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также включает в себя ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности так же, как и явно указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов можно получить путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или большего числа выбранных (или всех) кодонов замещено смешанным основанием и (или) остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081, 1991; Ohtsuka et al., Biol. Chem. 260: 2605 - 2608, 1985; и Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91 - 98, 1994). Для аргинина и лейцина модификации второго основания также могут быть консервативными. Термин нуклеиновая кислота употребляется в данном документе взаимозаменяемо в отношении гена, кДНК и мРНК, кодируемых геном.

Используемые в данном изобретении полинуклеотиды могут состоять из любых полирибонуклеотидов или полидезоксирибонуклеотидов, которые могут представлять собой немодифицированные РНК или ДНК, или модифицированные РНК или ДНК. Например, полинуклеотиды могут состоять из одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, ДНК, представляющей собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков, одноцепочечной и двухцепочечной РНК, а также РНК, представляющей собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что более типично, двухцепочечными, или смесью одноцепочечных и двухцепочечных областей. Кроме того, полинуклеотид может состоять из трехцепочечных участков, содержащих РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотид может также содержать одно или большее число модифицированных оснований, или каркасы ДНК или РНК, модифицированные для стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают в себя, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК могут быть внесены различные модификации; таким образом, полинуклеотид включает в себя химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.

- 21 052811

Нуклеиновая кислота является функционально связанной, когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию указанной последовательности. Что касается последовательностей, регулирующих транскрипцию, термин функционально связанные означает, что связываемые последовательности ДНК являются смежными и, если необходимо для соединения двух областей, кодирующих белок, являются смежными и находятся в рамке считывания. Для последовательностей переключателей термин функционально связанные указывает на то, что указанные последовательности способны осуществлять рекомбинацию переключателей.

При употреблении в контексте данного документа парентеральное введение, вводят парентерально и другие грамматически эквивалентные фразы относятся к способам введения, не являющимися энтеральным и местным введением, обычно выполняемым путем инъекции и включающим в себя, без ограничений, внутривенные, интраназальные, внутриглазные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрикапсулярные, внутриглазничные, внутрисердечные, внутрикожные, внутрибрюшинные, транстрахеальные, подкожные, субкутикулярные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные, интрацеребральные, внутричерепные, интракаротидные или внутригрудинные инъекции и инфузии.

При употреблении в контексте данного документа термин пациент включает в себя людей и других субъектов-млекопитающих, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение.

При употреблении в контексте данного документа термин антагонист PD-1 относится к любому химическому соединению или биологической молекуле, которые ингибируют сигнальный путь PD-1 или иным образом ингибируют функцию PD-1 в клетке (например, клетке иммунной системы). В некоторых аспектах данного изобретения антагонист PD-1 блокирует связывание PD-L1 с PD-1 и (или) PD-L2 с PD1. В некоторых аспектах данного изобретения антагонист PD-1 специфически связывает PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения антагонист PD-1 специфически связывает PD-L1.

Термин процент идентичности, при употреблении в контексте двух или большего числа последовательностей нуклеиновых кислот или последовательностей полипептидов, относится к двум или большему числу последовательностей или подпоследовательностей, которые имеют определенный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как измерено с применением одного из алгоритмов сравнения последовательностей, описанных ниже (например, BLASTP и BLASTN или других алгоритмов, доступных специалистам в данной области техники), или при визуальной оценке. В зависимости от применения процент идентичности может существовать в области сравниваемой последовательности, например, в функциональном домене, или, в качестве альтернативы, может существовать по всей длине двух сравниваемых последовательностей. Для сравнения последовательностей, как правило, одну последовательность рассматривают как референсную последовательность, с которой сравнивают исследуемые последовательности. В случае применения алгоритма для сравнения последовательностей исследуемую и референсную последовательности вносят в компьютер, при необходимости обозначают координаты подпоследовательностей, и устанавливают параметры программы - алгоритма для сравнения последовательностей. Алгоритм для сравнения последовательностей затем рассчитывает процент идентичности для исследуемой последовательности (-ей) относительно референсной последовательности на основе указанных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии согласно Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания согласно Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью способа поиска подобия согласно Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., г. Мадисон, штат Висконсин, США) или с помощью визуальной оценки (см. в общих чертах Ausubel et al., ниже).

Одним из примеров алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в работе Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализов по алгоритму BLAST общедоступно на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации США (англ. National Center for Biotechnology Information).

При употреблении в контексте данного документа термин фармацевтически приемлемый в общем используется для обозначения таких соединений, материалов, композиций и (или) лекарственных составов, которые с медицинской точки зрения являются подходящими для применения в контакте с тканями, органами и (или) физиологическими жидкостями человека и животных, без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, пропорционально разумному соотношению польза/риск.

- 22 052811

При употреблении в контексте данного документа термин фармацевтически приемлемый носитель обозначает и включает в себя всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия оболочкой, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т. п., являющиеся физиологически совместимыми. Композиция может включать в себя фармацевтически приемлемую соль, например, соль присоединения кислоты или соль присоединения основания (см., например, работу Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66: 1 - 19).

При употреблении в контексте данного документа термины полипептид, пептид и белок применяются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Данные термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или большее число аминокислотных остатков являются искусственными химическими миметиками соответствующих встречающихся в природе аминокислот, так же как и к встречающимся в природе аминокислотным полимерам и к не встречающимся в природе аминокислотным полимерам.

При употреблении в контексте данного документа термин профилактика, при использовании в отношении патологического состояния, относится к введению композиции, которая снижает частоту или отсрочивает появление симптомов данного патологического состояния у субъекта по сравнению с субъектом, который не получает данную композицию.

При употреблении в контексте данного документа термин очищенный или выделенный, при использовании в отношении любого из описанных в данном документе белков (антител или фрагментов), относится к полипептиду, который был отделен или очищен от компонентов (например, белков или других встречающихся в природе биологических или органических молекул), которые естественным образом сопровождают его, например, от других белков, липидов и нуклеиновых кислот в прокариотах, экспрессирующих указанные белки. Как правило, полипептид является очищенным, когда он составляет по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% или 99%) по массе от общего белка в образце.

При употреблении в контексте данного документа термин белок 1 запрограммированной гибели клеток, или PD-1, относится к полипептиду белка 1 запрограммированной гибели клеток иммуноингибиторному рецептору, принадлежащему к семейству CD28 и кодируемому геном PDCD1 у человека. Альтернативные названия или синонимы для PD-1 включают в себя следующие: PDCD1, PD1, CD279 и SLEB2. PD-1 экспрессируется преимущественно на предварительно активированных Т-клетках, В-клетках и миелоидных клетках in vivo и связывается с двумя лигандами - PD-L1 и PD-L2. При употреблении в контексте данного документа термин PD-1 включает в себя PD-1 человека (4PD-1), варианты, изоформы и видовые гомологи 4PD-1, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с 4PD-1. Полную последовательность 4PD-1 можно найти под регистрационным номером GenBank AAC51773.

При употреблении в контексте данного документа термин лиганд 1 запрограммированной смерти, или PD-L1, представляет собой один из двух гликопротеиновых лигандов клеточной поверхности для PD-1 (другим является PD-L2), который подавляет активацию Т-клеток и секрецию цитокинов при связывании с PD-1. Альтернативные названия и синонимы для PD-L1 включают в себя следующие: PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 и B7-H. При употреблении в контексте данного документа термин PD-L1 включает в себя PD-L1 человека (4PD-L1), варианты, изоформы и видовые гомологи 4PD-L1, а также аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с 4PD-L1. Полную последовательность 4PD-L1 можно найти под регистрационным номером GenBank Q9NZQ7.

PD-1 известен как иммуноингибиторный белок, который негативно регулирует сигналы ТКР (Ishida, Y. et al. (1992) EMBO J. 11: 3887 - 3895; Blank, C. et al. (Epub 2006 Dec. 29) Immunol. Immunother. 56 (5): 739 - 745). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 может действовать как иммунная контрольная точка, что может приводить к снижению опосредованной Т-клеточным рецептором пролиферации (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81: 281 - 7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54: 307 - 314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094 - 100). Иммунную супрессию можно обратить путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1 или с PD-L2; данный эффект является аддитивным, если также блокируется взаимодействие PD-1 с PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99: 12293 - 7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170: 1257 - 66).

Для некоторых видов онкологических заболеваний выживаемость и пролиферация опухоли поддерживаются опосредованной опухолью модуляцией иммунных контрольных точек. Такая модуляция может привести к нарушению противораковых функций иммунной системы. Например, недавние исследования показали, что экспрессия лигандов рецепторов иммунных контрольных точек, таких как PD-L1 или PD-L2, опухолевыми клетками может подавлять активность иммунной системы в микроокружении опухоли и способствовать защите рака от иммунной системы, в частности, путем супрессии Т-клеток. PD-L1 обильно экспрессируется различными видами рака человека (Dong et al. (2002) Nat Med 8: 787 - 789). PD-1 - рецептор для PD-L1 - экспрессируется на лимфоцитах (например, на активированных Т-клетках) и в норме участвует в снижении реактивности иммунной системы и обеспечении аутотолерантности, в частности, путем супрессии Т-клеток. Тем не менее, когда рецепторы PD-1, экспрессированные на Т-клетках, связываются со свойственными им лигандами PD-L1 на

- 23 052811 опухолевых клетках, возникающая в результате супрессия Т-клеток способствует нарушению иммунного ответа против данной опухоли (например, снижению уровня инфильтрирующих опухоль лимфоцитов или стойкому уклонению раковых клеток от иммунного ответа).

В больших наборах образцов, например, рака яичника, рака почки, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака печени и меланомы, было показано, что экспрессия PD-L1 коррелирует с неблагоприятным прогнозом и снижает общую выживаемость независимо от последующего лечения (см., например, работы Dong et al. (2002) Nat Med 8 (8): 793 - 800; Yang et al. (2008) Invest Ophthalmol Vis Sci 49 (6): 2518 - 2525; Ghebeh et al. (2006) Neoplasia 8: 190 - 198; Hamanishi et al. (2007) Proc Nat Acad Sci USA 104: 3360 - 3365; Thompson et al. (2006) Clin Genitourin Cancer 5: 206 - 211; Nomi et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947 - 2953; Inman et al. (2007) Cancer 109: 1499 - 1505; Shimauchi et al. (2007) Int J Cancer 121: 2585 - 2590; Gao et al. (2009) Clin Cancer Res 15: 971 - 979; Nakanishi et al. (2007) Cancer Immunol Immunother 56: 1173 -1182; Hino et al. (2010) Cancer 116 (7): 1757 - 1766). Точно так же было обнаружено, что экспрессия PD-1 на опухолевых лимфоцитах обозначает Т-клетки с нарушенной функцией при раке молочной железы (Kitano et al. (2017) ESMO Open 2 (2): e000150) и меланоме (Kleffel et al. (2015) Cell 162 (6): 1242 - 1256). Были разработаны антагонисты PD-1, которые, например, влияют на функцию сигнальной оси PD-1/PD-L1/PD-L2 и (или) нарушают взаимодействие между PD-1 с PD-L1, и (или) с PDL2, и которые представляют собой новый класс противоопухолевых ингибиторов, функционирующих посредством модуляции взаимодействия клеток иммунной системы и опухолевых клеток.

При употреблении в контексте данного документа термин реаранжированный относится к конфигурации локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, при которой сегмент V расположен непосредственно смежно с сегментом D-J или J в конформации, кодирующей по существу полный домен VH или VL, соответственно. Реаранжированный локус гена иммуноглобулина можно идентифицировать путем сравнения с ДНК зародышевой линии; реаранжированный локус будет иметь по меньшей мере один перестроенный гептамерный/нонамерный элемент гомологии.

При употреблении в контексте данного документа термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) относится к клетке, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной указанной клетки, но и клеток, происходящих из нее. Поскольку некоторые модификации могут произойти в последующих поколениях вследствие мутаций или воздействия окружающей среды, такое потомство не может, по сути, быть идентичным родительской клетке, но тем не менее включено в термин клеткахозяин при употреблении в контексте данного документа.

При употреблении в контексте данного документа термин рекомбинантное антитело человека включает в себя все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, например: (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулина человека, или полученная из них гибридома; (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии данного антитела, например, из трансфектомы; (c) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека; и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают в себя сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области, в которых используются определенные последовательности иммуноглобулинов зародышевой линии человека, кодируемые генами указанной зародышевой линии, но включающие в себя последующие реаранжировки и мутации, которые происходят, например, во время созревания антитела. Как известно в данной области техники (см., например, работу Lonberg (2005) Nature Biotech. 23 (9): 1117 - 1125), вариабельная область содержит антигенсвязывающий домен, который кодируется различными генами, которые реаранжируются с образованием антитела, специфичного к чужеродному антигену. В дополнение к реаранжировке, вариабельная область может быть дополнительно модифицирована путем множественных замен отдельных аминокислот (называемых соматической мутацией или гипермутацией) для повышения аффинности антитела к чужеродному антигену. Константная область изменится при дальнейшем ответе на антиген (т.е. при переключении изотипа). Следовательно, реаранжированные и соматически мутированные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в ответ на антиген, могут не иметь идентичности последовательности с исходными молекулами нуклеиновой кислоты, а вместо этого будут по существу идентичными или подобными (т.е. будут по меньшей мере на 80% идентичны).

При употреблении в контексте данного документа термин референсное антитело (используемый взаимозаменяемо с термином референсное АТ), или референсный антигенсвязывающий белок, относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются со специфическим эпитопом на ИЛ-27 и используется для установления взаимосвязи между ним и одним или большим числом различных антител, при этом указанная взаимосвязь представляет собой связывание указанного референсного антитела и указанных одного или большего числа других антител с одним и тем же эпитопом на ИЛ-27. При употреблении в контексте данного документа данный термин означает антитело

- 24 052811 против ИЛ-27, которое можно использовать в тесте или анализе, например, таких, как описанные в данном документе (например, анализ конкурентного связывания), в качестве конкурирующей молекулы, при этом указанный анализ пригоден для обнаружения, идентификации или разработки одного или большего числа различных антител, которые связываются с одним и тем же эпитопом.

При употреблении в контексте данного документа термины специфическое связывание, избирательное связывание, избирательно связывает и специфически связывает относятся к связыванию антитела с эпитопом на заранее определенном антигене. Как правило, связывание антитела характеризуется константой равновесной диссоциации (K_D), равной меньше чем около 10^-6 М, например, равной меньше чем около 10^-7, 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 М или даже меньше, при ее определении с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на анализаторе BIACORE 2000 с использованием рекомбинантного ИЛ-27 человека в качестве аналита и указанного антитела в качестве лиганда, который связывается с предопределенным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, бычьим сывороточным альбумином (БСА), казеином), отличным от указанного предопределенного антигена или близкородственного антигена. В определенных аспектах данного изобретения антитело, которое специфически связывается с ИЛ-27, характеризуется константой равновесной диссоциации (KD) для данного связывания, равной меньше чем около 100 нМ (10^-7 M), необязательно - равной меньше чем около 50 нМ (5*10^-8 M), необязательно - равной меньше чем около 15 нМ (1,5^10^-8 M), необязательно равной меньше чем около 10 нМ (10^-8 M), необязательно - равной меньше чем около 5 нМ (5*10^-9 M), необязательно - равной меньше чем около 1 нМ (10^-9 M), необязательно - равной меньше чем около 0,1 нМ (10^-10 M), необязательно - равной меньше чем около 0,01 нМ (10^-11 M) или даже меньше, при ее определении с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на анализаторе BIACORE 2000 с использованием рекомбинантного ИЛ-27 человека в качестве аналита и указанного антитела в качестве лиганда, при этом связывание с предопределенным антигеном происходит с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает аффинность связывания указанного антигена с неспецифическим антигеном (например, с БСА, с казеином), отличным от указанного предопределенного антигена или близкородственного антигена. Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное в отношении антигена, употребляются в данном документе взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.

При употреблении в контексте данного документа термин фосфорилирование STAT1 относится к фосфорилированию полипептида - трансдуктора сигналов и активатора транскрипции 1 (STAT1), фактора транскрипции, кодируемого геном STAT1 у человека. Молекулы STAT фосфорилируются рецептор-ассоциированными киназами, которые вызывают активацию и димеризацию путем образования гомодимеров или гетеродимеров, которые транслоцируются в ядро, чтобы функционировать в качестве факторов транскрипции. STAT1 может быть активирован (т.е. фосфорилирован) в ответ на передачу сигналов посредством нескольких лигандов, включая ИЛ-27. Передача сигналов ИЛ-27 посредством ИЛ-27Р приводит к фосфорилированию STAT1 (pSTAT1). STAT1 играет ключевую роль в экспрессии генов, участвующих в выживании клетки, жизнеспособности или ответе на патогены. Способы определения фосфорилирования STAT1 как результата передачи сигнала ИЛ-27 включают в себя, но не ограничиваются им, проточный цитометрический анализ клеток, меченных антителами, которые специфически распознают фосфорилированный STAT1 (см., например, работу Tochizawa et al. (2006) J Immunol Methods 313 (1 - 2): 29 - 37).

При употреблении в контексте данного документа термин фосфорилирование STAT3 относится к фосфорилированию полипептида - трансдуктора сигналов и активатора транскрипции 3 (STAT3), фактора транскрипции, кодируемого геном STAT3 у человека. STAT3 опосредует экспрессию множества генов в ответ на клеточные стимулы и, таким образом, играет ключевую роль во многих клеточных процессах, таких как рост клеток и апоптоз. Способы определения фосфорилирования STAT3 как результата передачи сигнала ИЛ-27 включают в себя, но не ограничиваются им, анализ клеток или клеточных экстрактов, меченных антителами, которые специфически распознают фосфорилированный STAT3 (см., например, работу Fursov et al. (2011) Assay Drug Dev Technol 9 (4): 420 - 429).

При употреблении в контексте данного документа термин последовательность переключения относится к тем последовательностям ДНК, которые ответственны за рекомбинацию переключения. Последовательность переключателя-донора, как правило, область переключения μ, будет находиться в направлении к 5' (т.е. выше по направлению кодирующей цепи) от области конструкции, подлежащей удалению во время рекомбинации переключения. Область переключателя-акцептора будет находиться между удаляемой областью конструкции и замещающей константной областью (например, γ, ε и т.д.). Поскольку нет конкретного сайта, где всегда происходит рекомбинация, окончательная последовательность гена обычно не может быть предсказана на основании конструкции.

При употреблении в контексте данного документа термин субъект включает в себя любого человека или животное, отличное от человека. Например, способы и композиции согласно данному изобретению можно применять для лечения субъекта с иммунным нарушением. Термин животное отличное от человека включает в себя всех позвоночных животных, например, млекопитающих и не

- 25 052811 млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.

Для нуклеиновых кислот термин существенная гомология обозначает, что две нуклеиновые кислоты или их указанные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными, с соответствующими вставками или делециями нуклеотидов, по меньшей мере в около 80% нуклеотидов, как правило - по меньшей мере в от около 90% до около 95%, и более предпочтительно - по меньшей мере в от около 98% до около 99,5% нуклеотидов. В качестве альтернативы, существенная гомология существует, когда сегменты будут гибридизироваться в условиях селективной гибридизации с цепью, комплементарной данной цепи.

Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для данных последовательностей (т.е., % гомологии=число идентичных положений*100), принимая во внимание число гэпов и длину каждого гэпа, который должен быть введен для оптимального выравнивания двух данных последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть достигнуто с использованием математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах, представленных ниже.

Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью программы GAP в программном пакете GCG (доступен по адресу: http://www.gcg.com), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и штрафа за открытие гэпа, который равен 40, 50, 60, 70 или 80, и штрафа за длину гэпа, который равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательности также можно определить с помощью алгоритма Э. Мейерса и У. Миллера (E. Meyers, W. Miller, CABIOS, 4: 11 - 17 (1989)), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за длину гэпа, который равен 12, и штрафа за открытие гэпа, который равен 4. В дополнение к этому, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Нидлмана - Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (48): 444 - 453 (1970)), который включен в программу GAP в программном пакете GCG (доступен по адресу: http://www.gcg.com), с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы PAM250, штрафа за открытие гэпа, который равен 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, штрафа за длину гэпа, который равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков согласно данному изобретению могут быть дополнительно использованы в качестве запрашиваемой последовательности для выполнения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск можно выполнять с помощью программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) согласно Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 10. Для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, описанным в данном документе, можно выполнять поиск нуклеотидных последовательностей с помощью BLAST в программе NBLAST, вес=100, длина слова=12. Для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков, описанным в данном документе, можно выполнять поиск белков с помощью BLAST в программе XBLAST, вес=50, длина слова=3. Для получения выравниваний с гэпами для целей сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в работе Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389 - 3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или по существу чистой, если она очищена от других клеточных компонентов или других загрязняющих соединений, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик, включая обработку щелочью / додецилсульфатом натрия (ДСН), разделение в CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методики, хорошо известные в данной области техники. См. работу F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

Композиции нуклеиновых кислот согласно данному изобретению, хотя часто и имеют нативную последовательность (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), могут быть мутированы либо из кДНК, либо из геномной ДНК, либо из их смесей, в соответствии со стандартными методиками, для получения генных последовательностей. Для кодирующих последовательностей такие мутации могут затрагивать аминокислотную последовательность, если таковое является желательным. В частности, предусмотрены последовательности ДНК, по существу гомологичные или происходящие из нативных последовательностей V, D, J, константных последовательностей, последовательностейпереключателей и других подобных последовательностей, описанных в данном документе (при этом происходящая из означает, что данная последовательность идентична другой последовательности или модифицирована из нее).

При употреблении в контексте данного документа термин STING (альтернативно - TMEM173) относится к стимулятору генов интерферона - белку, который действует и как прямой сенсор

- 26 052811 цитозольной ДНК, и как адаптерный белок. У человека STING кодируется геном TMEM173. STING играет важную роль во врожденном иммунитете. STING индуцирует продукцию интерферона типа I, когда клетки инфицированы внутриклеточными патогенами, такими как вирусы, микобактерии и внутриклеточные паразиты. Интерферон типа I, опосредованный STING, защищает инфицированные клетки и близлежащие клетки от локальной инфекции, связываясь с той же клеткой, которая его секретирует, и с близлежащими клетками.

Иллюстративная аминокислотная последовательность для STING представлена в базе данных NCBI Genbank под регистрационным номером NP_001288667.

Термин Т-клетка относится к типу лейкоцитов, которые можно отличить от других лейкоцитов по наличию Т-клеточного рецептора на их клеточной поверхности. Существует несколько субпопуляций Тклеток, в том числе, но не ограничиваясь ими, Т-клетки-хелперы (также известные как TH клетки или CD4+ T клетки) и их подтипы, в том числе T_H1, T_H2, T_H3, T_H17, T_H9 и T_FH клетки, цитотоксические Тклетки (также известные как T_C клетки, CD8+ T-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, Т-клеткикиллеры, Т-киллеры), Т-клетки памяти и их подтипы, включая центральные Т-клетки памяти (клетки T_CM), эффекторные Т-клетки памяти (клетки T_EM и T_EMRA) и резидентные Т-клетки памяти (клетки T_RM), регуляторные Т-клетки (также известные как T reg-клетки или супрессорные Т-клетки) и их подтипы, в том числе CD4+ FOXP3+ Treg-клетки, CD4+FOXP3^- Treg-клетки, Tr1-клетки, Th3-клетки и T_reg17-клетки, Тклетки - естественные киллеры (также известные как NKT-клетки), инвариантные Т-клетки, ассоциированные со слизистой оболочкой (ТАСО, англ. MAIT), и гамма-дельта Т-клетки (γδ Т-клетки), в том числе Vγ9/Vδ2 Т-клетки. Любые одна или большее число из вышеупомянутых или не упомянутых Т-клеток могут быть целевым типом клеток для способа применения согласно данному изобретению.

При употреблении в контексте данного документа термин ответ, опосредованный Т-клетками относится к любому ответу, опосредованному Т-клетками, включая, но не ограничиваясь ими, эффекторные Т-клетки (например, CD8⁺ клетки) и Т-хелперы (например, CD4⁺ клетки). Ответы, опосредованные Т-клетками, включают в себя, например, Т-клеточную цитотоксичность и пролиферацию Т-клеток.

При употреблении в контексте данного документа термины терапевтически эффективное количество, или терапевтически эффективная доза, или аналогичные термины, используемые в данном документе, предназначены для обозначения количества агента (например, антитела против ИЛ27 или его антигенсвязывающего фрагмента), которое вызовет желаемый биологический или медицинский ответ (например, улучшение одного или большего числа симптомов онкологического заболевания).

При употреблении в контексте данного документа термин рецептор ТАМ относится к протеинтирозинкиназам рецептора ТАМ (TYRO3, AXL и MER). Рецепторы ТАМ участвуют в регуляции гомеостаза иммунной системы. При онкологическом заболевании рецепторы ТАМ выполняют двойную регуляторную роль, контролируя инициацию и прогрессирование развития опухоли и, в то же время, связанные с ней противоопухолевые реакции различных клеток иммунной системы. Дальнейшее описание рецепторов ТАМ можно найти в работе Paolino and Penninger (2016), Cancers 8 (97):

doi:10.3390/cancers8100097). При употреблении в контексте данного документа термин ингибитор рецептора ТАМ или ингибитор ТАМ относится к агенту, который ингибирует, блокирует или снижает функцию, или активность, рецептора ТАМ.

При употреблении в контексте данного документа термин TIGIT, или Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM, относится к любому нативному TIGIT из любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. TIGIT также известен в данной области техники как DKFZp667A205, FLJ39873, белок 9, содержащий V-набор и домен иммуноглобулина, белок 3, содержащий V-набор и трансмембранный домен, VSIG9, VSTM3 и WUCAM. Данный термин также охватывает собой встречающиеся в природе варианты TIGIT, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотную последовательность иллюстративного TIGIT человека можно найти в UniProt под регистрационным номером Q495A1.

Термины лечить, лечит и лечение, употребляемые в контексте данного документа, относятся к терапевтическим или профилактическим мерам, описанным в данном документе. Способы лечения включают в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела человека согласно данному изобретению, например, субъекту, нуждающемуся в усиленном иммунном ответе против определенного антигена, или субъекту, у которого в конечном итоге может появиться такое нарушение, чтобы предотвратить, вылечить, отсрочить, уменьшить тяжесть или облегчить один или большее число симптомов указанного нарушения или рецидивирующего нарушения, или чтобы продлить выживание субъекта сверх того периода, который ожидается при отсутствии такого лечения.

При употреблении в контексте данного документа термин микроокружение опухоли (МОО, англ. TME; в качестве альтернативы - микроокружение рака) относится к клеточному окружению или среде, в которой существует опухоль или новообразование, включая окружающие кровеносные сосуды, а также нераковые клетки, включая, но не ограничиваясь ими, клетки иммунной системы, фибробласты,

- 27 052811 воспалительные клетки костного мозга и лимфоциты. МОО включает в себя также сигнальные молекулы и внеклеточный матрикс. Опухоль и окружающее ее микроокружение тесно связаны и постоянно взаимодействуют. Опухоли могут влиять на микроокружение, высвобождая внеклеточные сигналы, способствуя ангиогенезу опухоли и индуцируя периферическую иммунную толерантность, в то время как клетки иммунной системы в микроокружении могут влиять на рост и развитие опухолевых клеток.

При употреблении в контексте данного документа термин нереаранжированная или конфигурация зародышевой линии относится к такой конфигурации, в которой сегмент V не рекомбинирован таким образом, чтобы располагаться непосредственно смежно с сегментом D или J.

При употреблении в контексте данного документа термин вектор предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с ней соединенную. Один из типов вектора представляет собой плазмиду - термин, который обозначает кольцевую двуцепочечную петлю ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, при этом дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки хозяина при введении в указанную клетку хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе называются рекомбинантными векторами экспрессии (или просто векторами экспрессии). Как правило, векторы экспрессии, используемые в методиках рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид. В описании данного изобретения плазмида и вектор могут быть взаимозаменяемы, поскольку плазмида является наиболее часто применяемой формой вектора. Тем не менее предусматривается, что данное изобретение включает в себя такие другие формы векторов экспрессии, как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Если не определено иное, все технические и научные термины, употребляемые в данном документе, имеют значение, обычно понимаемое рядовым специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы на практике или при тестировании данного изобретения. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие документы, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой таблицу, в которой представлены данные об аффинности антител против ИЛ-27, которые способны связываться с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). Измерения аффинности проводились с использованием методов ForteBio и Meso Scale Discovery.

Фиг. 2A представляет собой график, показывающий ингибирование опосредованного ИЛ-27 фосфорилирования STAT1 в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) человека с помощью антител против ИЛ-27, как указано, согласно результатам измерений с помощью проточной цитометрии. Фиг. 2B представляет собой график, показывающий ингибирование опосредованного ИЛ -27 фосфорилирования STAT1 в клетках U937 с помощью антител против ИЛ-27, как указано, согласно результатам измерений с помощью проточной цитометрии. Фиг. 2C представляет собой график, показывающий ингибирование опосредованного ИЛ-27 фосфорилирования STAT1 в клетках HUT-78 с помощью антител против ИЛ-27, как указано, согласно результатам измерений с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий, что антитело против ИЛ-27 согласно данному изобретению (Ab1 против ИЛ-27) ингибирует опосредованный ИЛ-27 pSTAT1 в Т-клетках цельной крови человека.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий изменение опосредованного ИЛ-27 ингибирования экспрессии CD161 в Т-клетках в указанном диапазоне концентраций антител против ИЛ 27. Экспрессию CD161 определяли с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 5A представляет собой график, показывающий степень усиления антителами против ИЛ-27 PD-1-опосредованной секреции ФНО-α в МКПК человека, согласно результатам измерений с помощью ТИФА. Фиг. 5B представляет собой график, показывающий степень усиления антителами против ИЛ-27 PD-1-опосредованной секреции ИЛ-6 в МКПК человека, согласно результатам измерений с помощью ТИФА. На фиг. 5C - 5D показано, что ИЛ-27 ингибирует выработку цитокинов (ИЛ-17А, фиг. 5C; и ИФН-γ, фиг. 5D) после блокады PD-1 и восстанавливается в комбинации с Ab1 против ИЛ-27 (сокращения: контр.=контроль, н/з=незначительно, МКПК=мононуклеарные клетки периферической крови, рчИЛ-27=рекомбинантный человеческий ИЛ-27). На фиг. 5E - 5H обобщенно представлена

- 28 052811 наблюдаемая индукция цитокинов ФНО-α (фиг. 5E), ИФН-γ (фиг. 5F), ИЛ-6 (фиг. 5G) и ИЛ-17А (фиг. 5H) в активированных культурах МКПК от нескольких отдельных доноров, включая контрольную группу здоровых людей и пациентов с почечно-клеточной карциномой (ПКК), гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) и раком яичника, когда такие клетки приводили в контакт с антителом Ab1 против ИЛ-27, антителом αPD-1 или комбинацией антитела Ab1 против ИЛ-27 и антитела αPD-1.

Фиг. 6A представляет собой график, показывающий ингибирование опосредованной ИЛ-27 экспрессии PD-L1 при обработке моноцитов человека антителом против ИЛ-27, согласно результатам измерений с помощью проточной цитометрии. Фиг. 6B представляет собой график, показывающий ингибирование опосредованной ИЛ-27 экспрессии TIM3 при обработке моноцитов человека антителом против ИЛ-27, согласно результатам измерений с помощью проточной цитометрии. Фиг. 6C представляет собой график, показывающий ингибирование опосредованной ИЛ-27 экспрессии PD-L1 при обработке покоящихся Т-клеток человека антителом против ИЛ-27, согласно результатам измерений с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 7A представляет собой точечную диаграмму, показывающую количество поверхностных метастатических узелков B16F10 в легких (легочные узелки) от мышей с опухолями B16F10, получавших лечение антителом против ИЛ27 (Ab1 против ИЛ-27), контрольным изотипическим антителом, антителом αWSX-1 или комбинацией антитела αPD-1 и антитела αCTLA-4, как указано, согласно результатам измерений с помощью визуального подсчета узелков в легких, выделенных из мышей. На фиг. 7B представлен график, показывающий динамику роста биолюминесцентных опухолей B16-Luc у мышей, получавших антитело против ИЛ-27 (Ab1 против ИЛ-27) или контрольное изотипическое антитело, согласно результатам измерений с помощью анализа биолюминесцентной визуализации. На фиг. 7C - 7F показана серия изображений фиксированных срезов легочной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, выделенных из мышей с опухолями B16F10, обработанных антителом против ИЛ-27 (Ab1 против ИЛ-27) (фиг. 7D), контрольным изотипическим антителом (фиг. 7C), антителом αWSX-1 (фиг. 7E) или комбинацией антитела αPD-1 и антитела αCTLA-4 (фиг. 7F), как указано. Фиг. 7G представляет собой точечный график, показывающий общую площадь опухоли в процентах от общей площади фиксированной ткани рассеченного легкого с раком B16F10, окрашенной гематоксилином и эозином, выделенной из мышей с опухолью B16F10, обработанных антителом против ИЛ-27 (Ab1 против ИЛ-27), контрольным изотипическим антителом, антителом αWSX-1 или комбинацией антитела αPD-1 и антитела αCTLA-4, как указано, согласно результатам измерений с помощью компьютеризованного анализа изображений. Сходное снижение числа поверхностных метастазов в легких и общей площади опухоли наблюдалось при блокаде, опосредованной антителами против ИЛ-27РА (WSX-1), и при применении комбинированной терапии антителом против PD-1 и антителом против CTLA-4.

На фиг. 8A представлена диаграмма рассеяния данных, полученных с помощью микроматричного анализа, для генов, экспрессия которых изменилась в >1,0 log2 раз (черные точки) в спленоцитах, выделенных из мышей со сверхэкспрессией ИЛ-27 после их обработки миникольцами ИЛ-27. По оси x показано log2-кратное изменение экспрессии генов (обработка миникольцами ИЛ-27 по сравнению с контролем). По оси y показано p-значение согласно t-критерию, показывающее вероятность кратного изменения для каждого гена. На фиг. 8В представлен график, показывающий уровень экспрессии выбранных иммуномодулирующих генов, как указано, в спленоцитах, как на фиг. 8А. На фиг. 8C - 8F показано, что эктопическая экспрессия ИЛ -27 человека индуцирует экспрессию ингибиторного рецептора (анализ с помощью проточной цитометрии) на Т-клетках мышей in vivo, и что антитело Ab1 против ИЛ-27 снижает экспрессию ингибиторного рецептора на Т -клетках in vivo после обработки миникольцами ИЛ-27. Самкам мышей Balb/c возрастом 6 недель вводили пустой вектор (контроль) или миникольцо чИЛ-27 (фиг. 8C и 8D). МКПК и (фиг. 8E и 8F) общие спленоциты собирали через 5 суток после трансфекции, клетки окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Экспрессию указанных маркеров анализировали на CD4+ T-клетках (фиг. 8C и 8E) и CD8+ T-клетках (фиг. 8D и 8F). Анализ проводили с помощью программного обеспечения FlowJo. На фиг. 8G показано, что антитело Ab1 против ИЛ-27 ингибирует обнаружение ИЛ-27 человека, полученного из миникольца, в плазме крови мышей.

Фиг. 9 представляет собой ленточную диаграмму кристаллической структуры комплекса ИЛ-27 антитело Ab1 против ИЛ-27, определенную с использованием программного обеспечения Phaser для молекулярного замещения (McCoy et al. (2007) J. Appl. Cyrst. 40: 658 - 74) и Molrep (Vagin et al. (1997) J. Appl. Cyrst. 30: 1022 - 25). Тяжелая цепь, легкая цепь, p28 и EBI-3 окрашены в желтый, красный, серый и зеленый цвета, соответственно. На фиг. 9 показано, что антитело Ab1 против ИЛ-27 связано с молекулой p28 ИЛ-27.

Фиг. 10A - 10B представляют собой графики, показывающие аффинность связывания гетеродимера ИЛ-27 человека с WSX-1 (фиг. 10A) и gp130 (фиг. 10B) в присутствии (темно-серая линия) или в отсутствие (светло-серая линия) антитела Ab1 против ИЛ-27, согласно результатам измерений с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

- 29 052811

Фиг. 11 представляет собой ленточную диаграмму р28, показывающую остатки, по которым антитело Ab1 против ИЛ-27 связывается с р28. ЛЦ=легкая цепь антитела Ab1 против ИЛ-27; ТЦ=тяжелая цепь антитела Ab1 против ИЛ-27.

Фиг. 12 представляет собой ленточную диаграмму структурного выравнивания ИЛ-27 / Fab антитела Ab1 против ИЛ-27 с ИЛ-23/ИЛ-23Р (PDB ID: 5MZV). Наложение комплексов с использованием р28 и р19 выравнивали в 3-мерном пространстве.

Фиг. 13 представляет собой ленточную диаграмму структурного выравнивания ИЛ-27/Fab антитела Ab1 против ИЛ-27 с ИЛ-6/ИЛ-6Pa/gp130. Наложение комплексов с использованием р28 и ИЛ-6 выравнивали в 3-мерном пространстве.

Фиг. 14A - 14B представляют собой ленточные диаграммы поверхности связывания p28 и EBI3, а на фиг. 14В показано увеличение фиг. 14А, чтобы проиллюстрировать расположение взаимодействий по типу солевых мостиков и ароматических/гидрофобных взаимодействий между p28 и EBI3.

Фиг. 15A - 15B представляют собой изображения выравнивания последовательностей p28 (фиг. 15A) и EBI3 (фиг. 15B) у нескольких видов животных. Стрелки указывают на консервативные аминокислоты, образующие соляные мостики, и консервативные гидрофобные аминокислоты, как указано.

Фиг. 16А представляет собой ленточную диаграмму, иллюстрирующую структурное выравнивание гетеродимера ИЛ-27 с ИЛ-6/ИЛ-6Ра. Фиг. 16B - 16C представляют собой выравнивания последовательностей ИЛ-27 и ИЛ-6/ИЛ-6Ра. Стрелки указывают на консервативные аминокислоты, образующие соляные мостики, и консервативные гидрофобные аминокислоты. Фиг. 16D представляет собой ленточную диаграмму, иллюстрирующую несколько взаимодействий p28 с EBI3, которые сохраняются с помощью ИЛ-6Ра.

Фиг. 17 представляет собой таблицу, в которой представлены данные об аффинности связывания ИЛ-27 человека и gp130, WSX-1 и антитела против p28.

Фиг. 18A представляет собой выравнивание аминокислотных последовательностей p28 мыши и человека. Фиг. 18B представляет собой ленточную диаграмму, сфокусированную на остатке 162 (Leu в последовательности человека и Cys в последовательности мыши).

На фиг. 19А показан электростатический поверхностный потенциал ИЛ-27 человека. На фиг. 19B показана первичная структура ИЛ-27 человека, в которой показаны спирали αA, αB, αC, αD и неразрешенная петля CD с последовательностью поли-Glu.

Фиг. 20A представляет собой графическое представление, иллюстрирующее дифференциальную экспрессию EBI3, ИЛ-27р28 и ИЛ-27РА в опухоли ПКК (1) и в нормальной почечной ткани (2). Фиг. 20B - 20D представляют собой кривые Каплана - Мейера (процент выживаемости без летального исхода в сутках) для пациентов с ПКК, стратифицированных по высокой (1) или низкой (2) экспрессии EBI3 (фиг. 20B), ИЛ-27р28 (фиг. 20C) и ИЛ-27РА (фиг. 20D). Данные были получены с использованием Атласа ракового генома (АРГ, англ. TCGA), как описано ранее (см., например, работы Li et al., Cancer Research. 2017; 77 (21): e108 - e110; Li et al., Genome Biology 2016; 17 (1): 174).

На фиг. 21A - 21B показаны профили индуцированной ИЛ-27 экспрессии генов в активированных CD4+ T-клетках человека. Фиг. 21A представляет собой график рассеяния кратного изменения CD4+ Tклеток, обработанных ИЛ-27, по сравнению с необработанным контролем для двух отдельных доноров. На фиг. 21B показан 31 главный ген в профиле ИЛ-27 в CD4+ T-клетках. Пятнадцать из указанных 31 гена (отмечены звездочкой) были связаны с плохим исходом. Данные были получены с использованием АРГ.

Фиг. 22A - 22B представляют собой графическое отображение коэффициентов риска для всего генома, связанных с экспрессией профильных генов ИЛ-27 в образцах опухолей ПКК (фиг. 22A) и рака молочной железы (РМЖ, англ. BRCA) (фиг. 22B). Данные были получены с использованием АРГ.

Фиг. 23А представляет собой графическое отображение уровней EBI3 в плазме крови у пациентов с ПКК по сравнению с сывороткой крови здорового донора и сывороткой крови беременной женщины (положительный контроль), измеренных с использованием пары антител, специфичных в отношении EBI3. На фиг. 23B показаны уровни EBI3 в отдельной когорте пациентов с ПКК, сгруппированных по стадии развития опухоли. На фиг. 23C показана общая выживаемость, а на фиг. 23D показана выживаемость без признаков заболевания у пациентов с ПКК, со стратификацией по уровням EBI3 в сыворотке крови.

Фиг. 24A - 24B представляют собой графическое отображение влияния антитела Ab1 против ИЛ-27 на рост опухоли и метастазы в легкие в ортотопической модели карциномы почки (модель Renca). На фиг. 24А и фиг. 24В показаны чистая масса первичной опухоли (почки) и число метастазов в легких у контрольных мышей и мышей Renca, получавших антитела Ab1 против ИЛ-27. (*P < 0,05; непарный tтест).

На фиг. 25A - 25B показано влияние антитела Ab1 против ИЛ-27 в качестве единственного агента на средний поток фотонов от ортотопической опухоли Hepa1-6 с течением времени по сравнению с изотипическим контролем (фиг. 25B) в модели ортотопической опухоли Hepa1-6-luc (фиг. 25A). Планки погрешностей (усы) отображают стандартную ошибку.

- 30 052811

На фиг. 26A - 26F показано дозозависимое ингибирование роста ортотопической опухоли Hepa1-6 после серийного введения антитела Ab1 против ИЛ-27 (фиг. 26A). На фиг. 26B показана средняя биолюминесцентная визуализация (БЛВ, англ. BLI, фотоны/секунду) через 5, 8, 13 и 16 суток после имплантации для контроля и антитела Ab1 против ИЛ-27 (в дозах 5 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг). На фиг. 26C - 26F показана средняя БЛВ (фотоны/секунду) через 5, 8, 13 и 16 суток после имплантации у отдельных животных для контроля (фиг. 26C) и антитела Ab1 против ИЛ-27 в группах доз 5 мг/кг (фиг. 26D), 25 мг/кг (фиг. 26E) и 50 мг/кг (фиг. 26F).

На фиг. 27A - 27C показана модуляция экспрессии генов в печени Hepa1-6 после введения антитела Ab1 против ИЛ-27 (фиг. 27A и фиг. 27B). Фиг. 27C представляет собой график рассеяния данных для генов, модулируемых введением антитела Ab1 против ИЛ-27. В табл. 11A-11B ниже представлены списки генов, экспрессия которых была повышена и понижена, представленных на фиг. 27B.

Фиг. 28A - 28E представляют собой графические отображения, иллюстрирующие экспрессию различных компонентов гена ИЛ-27 (фиг. 28A); CD274, TIGIT, LAG3, HAVCR2 и PDCD1 (фиг. 28B); ТФР-альфа и ТФР-бета-1(фиг. 28C); АФП (фиг. 28D); и TNFRSF10B, TNFRSF1A и PDGFA (фиг. 28E) после введения антитела Ab1 против ИЛ-27.

Фиг. 29A - 29B представляют собой графические отображения относительной экспрессии различных маркерных генов макрофагов и NK-транскриптов в микроокружении опухоли (МОО) после введения антитела Ab1 против ИЛ-27.

Фиг. 30 представляет собой графическое отображение экспрессии NK-ассоциированных рецепторов после введения либо антитела Ab1 против ИЛ-27, либо изотипического контроля.

На фиг. 31 показана относительная экспрессия различных маркеров клеточной поверхности после введения антитела Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с изотипическим контролем IgG. Соотношения были получены путем нормализации уровня транскриптов целевого маркера к уровню транскриптов гена PTPRC. Направленность выражается как разница между соотношением, полученным для антитела Ab1 против ИЛ-27, и соотношением, полученным для IgG.

Фиг. 32A - 32D представляют собой столбчатые диаграммы, отображающие экспрессию ИЛ-17А (фиг. 32A), ИФН-γ (ИФН-гамма) (фиг. 32B), ФНО-α (ФНО-альфа) (фиг. 32C) и ИЛ-10 (фиг. 32D) в культивируемых МКПК, стимулированных антителом против CD3 (0,25 мкг/мл) в течение 3 суток в присутствии или в отсутствие ИЛ-27 (100 нг/мл).

Фиг. 33A - 33D представляют собой графики рассеяния, отображающие экспрессию ИЛ-17А (фиг. 33A), ИФН-γ (ИФН-гамма) (фиг. 33B), ФНО-α (ФНО-альфа) (фиг. 33C) и ИЛ-10 (фиг. 33D) в культивируемых МКПК, стимулированных антителом против CD3 (0,25 мкг/мл) в течение 4 суток в присутствии или в отсутствие антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл).

Фиг. 34 представляет собой график рассеяния, отображающий log2-кратное изменение экспрессии генов после ингибирования ИЛ-27 по сравнению с контролем (ось x) в сравнении со значимостью (pзначение) изменений экспрессии генов после обработки антителом Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с контролем (ось Y).

Фиг. 35 представляет собой график рассеяния, отображающий экспрессию TNFSF15 в активированных МКПК после культивирования с антителом Ab1 против ИЛ-27 или с изотипическим контролем (IgG).

Фиг. 36A - 36B представляют собой столбчатые диаграммы, отображающие уровни экспрессии TNFSF15 в активированных (фиг. 36A) и покоящихся (фиг. 36B) МКПК, культивированных в присутствии двух разных партий антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл) или с изотипическим контролем.

Фиг. 37 представляет собой столбчатую диаграмму, отображающую кратность изменений уровней транскрипта TNFSF15 после ингибирования ИЛ-27 антителом Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с изотипическим контролем в различных типах клеток, как указано.

Фиг. 38 представляет собой столбчатую диаграмму, отображающую кратность изменений уровней транскрипта TNFSF15 после обработки антителом Ab1 против ИЛ-27, антителом против CD39 и двумя антителами против CD112R, как указано.

Фиг. 39A-39B представляют собой столбчатые диаграммы, отображающие уровни экспрессии транскрипта TNFSF15 (фиг. 39A) и секретируемого белка TNFSF15 (фиг. 39B) после блокирования ИЛ27 антителом Ab1 против ИЛ-27 в активированных МКПК с замедленной кинетикой.

Подробное описание сущности изобретения

В данном изобретении представлены, по меньшей мере частично, молекулы антител, которые связываются со специфическим эпитопом ИЛ-27р28 человека с высокой аффинностью и специфичностью. При употреблении в контексте данного документа термины ИЛ-27 и ИЛ27 взаимозаменяемо относятся к гетеродимерному цитокину ИЛ-27, который состоит из двух различных субъединиц, кодируемых двумя разными генами: индуцированным вирусом Эпштейна-Барр геном 3 (EBI3) и ИЛ-27р28. ИЛ-27 обладает как провоспалительными, так и противовоспалительными свойствами с разнообразным действием на гемопоэтические и негематопоэтические клетки.

Соответственно, в одном из аспектов данного изобретения представлены выделенное антитело, которое специфически связывается с ИЛ-27 человека и оказывает антагонистическое действие, или

- 31 052811 антигенсвязывающая часть указанного антитела, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть специфически связываются с представленными в данном документе эпитопами и проявляют по меньшей мере одно или большее число из следующих свойств:

(i) связываются с ИЛ-27 человека с равновесной константой диссоциации (K_D), равной 15 нМ или меньше;

(ii) блокируют связывание ИЛ-27 с рецептором ИЛ-27;

(iii) ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке;

(iv) ингибируют или снижают опосредованное ИЛ-27 ингибирование экспрессии CD161 в клетке;

(v) ингибируют или снижают опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке;

(vi) индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки; и (vii) комбинация (i)-(vi).

Дополнительные аспекты данного изобретения включают в себя молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы антител, векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы получения указанных молекул антител. Также представлены иммуноконъюгаты, мульти- или биспецифические молекулы и фармацевтические композиции, содержащие указанные молекулы антител. Молекулы антител против ИЛ-27, представленные в данном документе, можно применять для лечения, профилактики и (или) диагностики раковых или злокачественных заболеваний, например, солидных и жидких опухолей (например, лейкоза, например, лимфомы, например, ОМЛ), рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого), рака поджелудочной железы, рака молочной железы (например, тройного негативного рака молочной железы), меланомы, рака яичка, саркомы, онкологических заболеваний головы и шеи (например, плоскоклеточного рака головы и шеи), рака печени (например, гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК, англ. HCC)), колоректального рака, рака яичника, рака головного мозга (например, мультиформной глиобластомы) или рака почки (например, почечно -клеточной карциномы, например, светлоклеточной почечно -клеточной карциномы).

Антитела против ИЛ-27 и их антигенсвязывающие фрагменты.

Данное изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим частям, которые специфически связываются с ИЛ-27р28 и проявляют антагонизм в отношении ИЛ-27, в частности - в отношении ИЛ-27 человека.

Данное изобретение направлено на выделенное антитело, которое проявляет антагонизм в отношении ИЛ-27 человека, или на антигенсвязывающую часть указанного антитела, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из следующих аминокислот: (i) аминокислот с 37 по 56 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28); (ii) аминокислот с 142 по 164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28); или (iii) как (i), так и (ii). В некоторых аспектах данного изобретения выделенное антитело согласно данному изобретению, проявляющее антагонизм в отношении ИЛ -27 человека, или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из следующих аминокислот: Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 или Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Asp146, Arg149 и (или) Phe153 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Asp146, Arg149 и Phe153 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения указанный эпитоп содержит Asp146, Arg149, His150 и Phe153 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения указанный эпитоп содержит Asp146, Arg149, Phe153 и Leu156 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения указанный эпитоп содержит Asp146, Arg149, His150, Phe153 и Leu156 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения указанный эпитоп содержит Gln37, Leu38, Glu42, Asp146, Arg149, His150, Phe153 и Leu156 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Gln37, Leu38, Glu42, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ27p28). В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или

- 32 052811 антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28). В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, состоящим или по существу состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), и по меньшей мере один остаток, выбранный из группы, состоящей из: Leu53, Lys56, Asp143, Leu147, Arg152, Ala157, Gly159, Phe160 или Asn161 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ -27p28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), и по меньшей мере один остаток, выбранный из группы, состоящей из: Leu53, Lys56, Asp143, Arg145, Leu147, Arg152, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161 или Pro163 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, состоящим или по существу состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело согласно данному изобретению или антигенсвязывающая часть указанного антитела специфически связываются с эпитопом, состоящим или по существу состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), и проявляет антагонизм в отношении ИЛ-27 человека, или антигенсвязывающая часть указанного антитела, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть проявляют по меньшей мере одно или большее число из следующих свойств: (i) связываются с ИЛ-27 человека с равновесной константой диссоциации (K_D), равной 15 нМ или меньше; (ii) блокируют связывание ИЛ-27 с рецептором ИЛ-27; (iii) ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке; (iv) ингибируют или снижают опосредованное ИЛ-27 ингибирование экспрессии CD161 в клетке; (v) ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке; (vi) индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки; и (vii) комбинация (i)(vi).

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28 человека) с равновесной константой диссоциации (K_D), равной 15 нМ или меньше.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с рекомбинантным ИЛ-27р28 человека или с ИЛ-27р28 мыши.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения указанная клетка представляет собой клетку иммунной системы. В некоторых аспектах данного изобретения указанная клетка представляет собой раковую клетку.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке (например, ослабляют или устраняют ингибирование экспрессии CD161 в клетке). В некоторых аспектах данного изобретения указанная клетка представляет собой клетку иммунной системы.

- 33 052811

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке. В некоторых аспектах данного изобретения экспрессия PD-L1 ингибируется или снижается. В некоторых аспектах данного изобретения экспрессия TIM-3 ингибируется или снижается. В некоторых аспектах данного изобретения снижается как экспрессия PD-L1, так и экспрессия TIM-3. В некоторых аспектах данного изобретения указанная клетка представляет собой клетку иммунной системы. В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитела представляют собой моноклональные антитела.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число цитокинов представляют собой ФНО-α. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число цитокинов представляют собой ИЛ-6. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число цитокинов представляют собой ФНО -α и ИЛ-6. В некоторых аспектах данного изобретения указанная клетка представляет собой клетку иммунной системы.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть выбраны из группы, состоящей из антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело представляет собой антитело IgG1 или антитело IgG4. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1 дикого типа. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG4 дикого типа. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело содержит домен Fc, содержащий по меньшей мере одну мутацию. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело содержит мутантную константную область тяжелой цепи IgG1. В некоторых аспектах данного изобретения указанное антитело содержит мутантную константную область тяжелой цепи IgG4. В некоторых аспектах данного изобретения указанная мутантная константная область тяжелой цепи IgG4 содержит любую из замен S228P, L235E, L235A или их комбинацию, в соответствии с системой нумерации ЕС.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются по существу с тем же эпитопом на ИЛ-27, что и антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с любым из указанных выше аспектов.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются по меньшей мере с одним из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), связываемых антителом или его антигенсвязывающей частью в соответствии с любым из указанных выше аспектов.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, при этом мутация в эпитопе (Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28)), связываемом указанными антителом или его антигенсвязывающей частью, ингибирует, снижает или блокирует связывание как с указанными антителом или его антигенсвязывающей частью, так и с антителом или его антигенсвязывающей частью в соответствии с любым из указанных выше аспектов.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR1 легкой цепи состоит из NXXXXXXLFSSNXKXYXX-C. В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR3 легкой цепи состоит из N-XXXASAXXX-C. В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR2 тяжелой цепи состоит из N-XXSSSXSYXYXXXXXXX-C. В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR3 тяжелой цепи состоит из N-XXXXGRTSYTATXHNXXXX-C, где X представляет собой любые аминокислоты.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR1 легкой цепи состоит из NXXXXXXLFSSNXKXYXX-C и указанная CDR3 легкой цепи состоит из N-XXXASAXXX-C. В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть

- 34 052811 содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR2 тяжелой цепи состоит из NXXSSSXSYXYXXXXXXX-C и указанная CDR3 тяжелой цепи состоит из NXXXXGRTSYTATXHNXXXX-C, где X представляет собой любые аминокислоты.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, при этом указанная CDR1 легкой цепи состоит из NXXXXXXLFSSNXKXYXX-C, указанная CDR3 легкой цепи состоит из N-XXXASAXXX-C, указанная CDR2 тяжелой цепи состоит из N-XXSSSXSYXYXXXXXXX-C и указанная CDR3 тяжелой цепи состоит из N-XXXXGRTSYTATXHNXXXX-C, где X представляет собой любые аминокислоты.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

(i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно;

(ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 39, 40 и 41, соответственно;

(iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 53, 54 и 55, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответственно;

(iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 75, 76 и 77, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 83, 84 и 85, соответственно;

(v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 97, 98 и 99, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 105, 106 и 107, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 119, 120 и 121, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

(i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно;

(ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 39, 40 и 41, соответственно;

(iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 53, 54 и 55, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответственно;

(iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 75, 76 и 77, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 83, 84 и 85, соответственно;

(v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 97, 98 и 99, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 105, 106 и 107, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 119, 120 и 121, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146,

- 35 052811

Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

(i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно;

(ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 39, 40 и 41, соответственно;

(iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 53, 54 и 55, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответственно;

(iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 75, 76 и 77, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 83, 84 и 85, соответственно;

(v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 97, 98 и 99, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 105, 106 и 107, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 119, 120 и 121, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

(i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно;

(ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 42, 43 и 44, соответственно;

(iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 56, 57 и 58, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно;

(iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 78, 79 и 80, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 86, 88 и 89, соответственно;

(v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 108, 109 и 110, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 122, 123 и 124, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

(i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно;

(ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 42, 43 и 44, соответственно;

(iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 56, 57 и 58, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно;

- 36 052811 (iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 78, 79 и 80, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 86, 88 и 89, соответственно;

(v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 108, 109 и 110, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 122, 123 и 124, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

(i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно;

(ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 42, 43 и 44, соответственно;

(iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 56, 57 и 58, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно;

(iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 78, 79 и 80, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 86, 88 и 89, соответственно;

(v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 108, 109 и 110, соответственно; или (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 122, 123 и 124, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, и при этом указанная CDR1 тяжелой цепи не состоит из N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C (SEQ ID NO: 144) и (или) указанная CDR2 тяжелой цепи не состоит из N-ISSS[S/G][S/A]YI-C (SEQ ID NO: 146).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, и при этом указанная CDR1 тяжелой цепи не состоит из N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C (SEQ ID NO: 144) и (или) указанная CDR2 тяжелой цепи не состоит из N-ISSS[S/G][S/A]YI-C (SEQ ID NO: 146).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, и при этом указанная CDR1 тяжелой цепи не состоит из N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C (SEQ ID NO: 144) и (или) указанная CDR2 тяжелой цепи не состоит из N-ISSS[S/G][S/A]YI-C (SEQ ID NO: 146).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или

- 37 052811 большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, и при этом указанная CDR1 тяжелой цепи не состоит из N-FTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]MN-C (SEQ ID NO: 148) и (или) указанная CDR2 тяжелой цепи не содержит N-[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C (SEQ ID NO: 149).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, и при этом указанная CDR1 тяжелой цепи не состоит из N-FTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]MN-C (SEQ ID NO: 148) и (или) указанная CDR2 тяжелой цепи не содержит N-[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C (SEQ ID NO: 149).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, и при этом указанная CDR1 тяжелой цепи не состоит из N-FTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]MN-C (SEQ ID NO: 148) и (или) указанная CDR2 тяжелой цепи не содержит N-[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C (SEQ ID NO: 149).

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат:

(i) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 147), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 121; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно; или (ii) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 150), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-XISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 151), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 124; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат:

(i) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 147), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 121; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно; или (ii) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 150), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-XISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 151), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 124; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат:

(i) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 147), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 121; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно; или

- 38 052811 (ii) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 150), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-XISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 151), и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 124; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-IXXXXXXX-C (SEQ ID NO: 152), CDR3 тяжелой цепи, состоящую из N-AR[X]_n=₆_₁₅DX-C (SEQ ID NO: 153); и CDR1 легкой цепи, состоящую из NQS[X]_n=₁_₃SS[X]_n=₀_₄Y-C (SEQ ID NO: 154), CDR2 легкой цепи, состоящую из N-XXS-C (SEQ ID NO: 155), CDR3 легкой цепи, состоящую из N-QQXXXXP[X]_n=_0-1T-C (SEQ ID NO: 156), соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu142, Asp146, Arg149, His150, Phe153, Leu156, Leu162 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-IXXXXXXX-C (SEQ ID NO: 152), CDR3 тяжелой цепи, состоящую из N-AR[X]_n=₆_₁₅DX-C (SEQ ID NO: 153); и CDR1 легкой цепи, состоящую из N-QS[X]_n=1. ₃SS[X]_n=₀_₄Y-C (SEQ ID NO: 154), CDR2 легкой цепи, состоящую из N-XXS-C (SEQ ID NO: 155), CDR3 легкой цепи, состоящую из N-QQXXXXP[X]_n=0-1T-C (SEQ ID NO: 156), соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим или состоящим из Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR1 тяжелой цепи, состоящую из N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 145), CDR2 тяжелой цепи, состоящую из N-IXXXXXXX-C (SEQ ID NO: 152), CDR3 тяжелой цепи, состоящую из N-AR[X]_n=₆_₁₅DX-C (SEQ ID NO: 153); и CDR1 легкой цепи, состоящую из N-QS[X]_n=1. ₃SS[X]_n=₀_₄Y-C (SEQ ID NO: 154), CDR2 легкой цепи, состоящую из N-XXS-C (SEQ ID NO: 155), CDR3 легкой цепи, состоящую из N-QQXXXXP[X]_n=0-1T-C (SEQ ID NO: 156), соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены к выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ27p28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 37, 59, 81, 103 и 125; и при этом указанная вариабельная область легкой цепи не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 45, 67, 89, 111 и 133.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи и указанная вариабельная область легкой цепи не представляют собой аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO: 15 и 65, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 37 и 45, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 59 и 67, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 81 и 89, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 103 и 111, соответственно; и (vi) SEQ ID NO: 125 и 133, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152,

- 39 052811

Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи не содержит аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 37, 59, 81, 103 и 125; и при этом указанная вариабельная область легкой цепи не содержит аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 45, 67, 89, 111 и 133.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ-27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи и указанная вариабельная область легкой цепи не содержат аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO: 15 и 65, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 37 и 45, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 59 и 67, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 81 и 89, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 103 и 111, соответственно; и (vi) SEQ ID NO: 125 и 133, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь и легкую цепь, при этом указанная тяжелая цепь не содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 47, 69, 91, 113 и 135; и при этом указанная легкая цепь не содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 42, 71, 93 и 115.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую и легкую цепи, при этом указанная тяжелая цепь не содержит аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 47, 69, 91, 113 и 135; и при этом указанная легкая цепь не содержит аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 42, 71, 93 и 115.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь и легкую цепь, при этом указанная тяжелая цепь не содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 51, 73, 95, 117 и 139; и при этом указанная легкая цепь не содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 71, 49, 71, 93, 115 и 137.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ-27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую и

- 40 052811 легкую цепи, при этом указанная тяжелая цепь не содержит аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 51, 73, 95, 117 и 139; и при этом указанная легкая цепь не содержит аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 71, 49, 71, 93, 115 и 137.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ-27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь и легкую цепь, и при этом указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь не содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO: 25 и 27, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 47 и 49, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 69 и 71, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 91 и 93, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 113 и 115, соответственно; и (vi) SEQ ID NO: 135 и 137, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ-27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь и легкую цепь, и при этом указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь не содержат аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO: 25 и 27, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 47 и 49, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 69 и 71, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 91 и 93, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 113 и 115, соответственно; и (vi) SEQ ID NO: 135 и 137, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь и легкую цепь, и при этом указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь не содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO: 29 и 27, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 51 и 49, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 73 и 72, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 95 и 93, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 117 и 115, соответственно; и (vi) SEQ ID NO: 139 и 137, соответственно.

В некоторых аспектах данного изобретения представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые проявляют антагонизм в отношении ИЛ -27 и специфически связываются с эпитопом, содержащим одну или большее число из аминокислот Gln37, Leu38, Glu42, Glu46, Val49, Ser50, Leu53, Lys56, Leu142, Asp143, Arg145, Asp146, Leu147, Arg149, His150, Arg152, Phe153, Leu156, Ala157, Gly159, Phe160, Asn161, Leu162, Pro163 и Glu164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь и легкую цепь, и при этом указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь не содержат аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из:

(i) SEQ ID NO: 29 и 27, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 51 и 49, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 73 и 72, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 95 и 93, соответственно;

- 41 052811 (v) SEQ ID NO: 117 и 115, соответственно; и (vi) SEQ ID NO: 139 и 137, соответственно.

Способы получения антител против ИЛ-27 и их антигенсвязывающих фрагментов.

В данном изобретении также представлены способы получения любых описанных в данном документе антител против ИЛ-27 или антигенсвязывающих фрагментов указанных антител. В некоторых аспектах данного изобретения способы получения антитела, представленного в данном документе, могут включать в себя иммунизацию субъекта (например, млекопитающего, отличного от человека) подходящим иммуногеном. Подходящие иммуногены для получения любого из антител, описанных в данном документе, представлены в данном документе. Например, для создания антитела, которое связывается с ИЛ-27р28, специалист в данной области техники может иммунизировать подходящего субъекта (например, млекопитающее, отличное от человека, такое как крыса, мышь, песчанка, хомяк, собака, кошка, свинья, коза, лошадь или нечеловекообразный примат) интерлейкином ИЛ -27. В некоторых аспектах данного изобретения в качестве иммуногена используют полноразмерный мономерный полипептид ИЛ-27р28 человека, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Подходящий субъект (например, млекопитающее, отличное от человека) может быть иммунизирован соответствующим антигеном вместе с последующими бустерными иммунизациями такое количество раз, которого достаточно для того, чтобы вызвать выработку антитела у данного млекопитающего. Иммуноген можно вводить субъекту (например, млекопитающему, отличному от человека) вместе с адъювантом. Адъюванты, применимые для получения антитела у субъекта, включают в себя, но не ограничиваются ими, белковые адъюванты; бактериальные адъюванты, например, цельные бактерии (БЦЖ, Corynebacterium parvum или Salmonella minnesota) и бактериальные компоненты, включая скелет клеточной стенки, димиколат трегалозы, монофосфориллипид A, экстрагируемый метанолом остаток (ЭМО, англ. MER) туберкулезной палочки, полный или неполный адъювант Фрейнда; вирусные адъюванты; химические адъюванты, например, гидроксид алюминия, йодоацетат и холестерилгемисукцинат. Другие адъюванты, которые можно применять в способах индукции иммунного ответа, включают в себя, например, холерный токсин и белки парапоксвируса. См. также работу Bieg et al. (1999) Autoimmunity 31 (1): 15 - 24. См. также, например, работы Lodmell et al. (2000) Vaccine 18: 1059 - 1066; Johnson et al. (1999) J Med Chem 42: 4640 - 4649; Baldridge et al. (1999) Methods 19: 103 - 107; и Gupta et al. (1995) Vaccine 13 (14): 1263 - 1276.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные способы включают в себя получение клеточной линии гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, которое связывается с иммуногеном. Например, подходящее млекопитающее, такое как лабораторная мышь, иммунизируют полипептидом ИЛ-27, как описано выше. Клетки иммунизированного млекопитающего, продуцирующие антитела (например, В-клетки селезенки), можно выделять через двое - четверо суток после по меньшей мере одной бустерной иммунизации иммуногеном, а затем кратковременно выращивать в культуре перед слиянием с клетками подходящей клеточной линии миеломы. Слияние клеток можно осуществлять в присутствии промотора слияния, такого как, например, вирус коровьей оспы или полиэтиленгликоль. Гибридные клетки, полученные при слиянии, клонируют и отбирают клеточные клоны, секретирующие желаемые антитела. Например, клетки селезенки мыши Balb/c, иммунизированной подходящим иммуногеном, могут быть слиты с клетками клеточной линии миеломы PAI или с клетками клеточной линии миеломы Sp2/0-Ag 14. После слияния число клеток увеличивают в подходящей культуральной среде, которую дополняют средой для селекции, например, гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой средой (ГАТ-средой), через равные промежутки времени, чтобы предотвратить чрезмерный рост нормальных клеток миеломы по сравнению с желаемыми клетками гибридомы. Полученные гибридные клетки затем подвергают скринингу на предмет секреции желаемых антител, например, антитела, которое связывается с ИЛ-27 человека, и в некоторых аспектах данного изобретения специалист в данной области техники может идентифицировать антитело против ИЛ-27 из неиммунологической направленной библиотеки, как описано, например, в патенте США № 6300064 (выданном на имя Knappik et al.; Morphosys AG) и в работе Schoonbroodt et al. (2005) Nucleic Acids Res 33 (9): e81.

В некоторых аспектах данного изобретения способы, описанные в данном документе, могут включать в себя или использоваться в сочетании, например, с технологиями фагового дисплея, бактериального дисплея, дрожжевого поверхностного дисплея, эукариотического вирусного дисплея, дисплея на клетках млекопитающих и бесклеточными методиками скрининга антител (например, рибосомного дисплея) (см., например, работы Etz et al. (2001) J Bacteriol 183: 6924 - 6935; Cornelis (2000) Curr Opin Biotechnol 11: 450 - 454; Klemm et al. (2000) Microbiology 146: 3025 - 3032; Kieke et al. (1997) Protein Eng 10: 1303 - 1310; Yeung et al. (2002) Biotechnol Prog 18: 212 - 220; Boder et al. (2000) Methods Enzymology 328: 430 - 444; Grabherr et al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4: 185 - 192; Michael et al. (1995) Gene Ther 2: 660 - 668; Pereboev et al. (2001) J Virol 75: 7107 - 7113; Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231: 119 - 135; и Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol 18: 1287 - 1292).

Способы идентификации антител с использованием различных способов фагового дисплея известны в данном уровне техники. В способах фагового дисплея функциональные домены антитела

- 42 052811 отображаются на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Такой фаг можно использовать для отображения антигенсвязывающих доменов антител, таких как Fab, Fv или фрагменты Fv антител, стабилизированных дисульфидной связью, экспрессированных из репертуарной или комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных). Фаги, применяемые в таких способах, обычно представляют собой нитевидные фаги, такие как fd и M13. Антигенсвязывающие домены экспрессируются в виде белка, рекомбинантно слитого с любым из белков оболочки фага pIII, pVIII или pIX. См., например, работу Shi et al. (2010) JMB 397: 385 - 396. Примеры способов фагового дисплея, которые можно применять для получения описанных в данном документе иммуноглобулинов или их фрагментов, включают в себя способы, представленные в работах Brinkman et al. (1995) J Immunol Methods 182: 41 - 50; Ames et al. (1995) J Immunol Methods 184: 177 - 186; Kettleborough et al. (1994) Eur J Immunol 24: 952 - 958; Persic et al. (1997) Gene 187: 9 - 18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57: 191 - 280; и в международных патентных PCTпубликациях № WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982 и WO 95/20401. Подходящие способы также представлены, например, в патентах США № 5698426; № 5223409; № 5403484; № 5580717; № 5427908; № 5750753; № 5821047; № 5571698; № 5427908; № 5516637; № 5780225; № 5658727; № 5733743 № и № 5969108.

В некоторых аспектах данного изобретения библиотеки антител фагового дисплея могут быть созданы с использованием мРНК, собранной из В-клеток иммунизированных млекопитающих. Например, образец клеток селезенки, содержащий В -клетки, может быть выделен из мышей, иммунизированных полипептидом ИЛ-27, как описано выше. мРНК можно выделить из клеток и перевести в кДНК с использованием стандартных методик молекулярной биологии. См., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (1988), как указано выше; Benny K. C. Lo (2004), как указано выше; и Borrebaek (1995), как указано выше. кДНК, кодирующую вариабельные области полипептидов тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулинов, используют для создания библиотеки фагового дисплея. Способы создания такой библиотеки описаны, например, в работах Merz et al. (1995) J Neurosci Methods 62 (1 - 2): 213 - 9; Di Niro et al. (2005) Biochem J 388 (Pt 3): 889 - 894; и Engberg et al. (1995) Methods Mol Biol 51: 355 - 376.

В некоторых аспектах данного изобретения можно применять комбинацию селекции и скрининга для идентификации представляющего интерес антитела, например, из популяции гибридомных антител или библиотеки антител фагового дисплея. Подходящие способы известны в данной области техники и описаны, например, в работах Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15: 62 - 70; Brinkman et al. (1995), как указано выше; Ames et al. (1995), как указано выше; Kettleborough et al. (1994), как указано выше; Persic et al. (1997), как указано выше; и Burton et al. (1994), как указано выше. Например, множество фагмидных векторов, каждый из которых кодирует слитый белок из белка оболочки бактериофага (например, pIII, pVIII или pIX фага M13) и другую антигенсвязывающую область, получают с использованием стандартных методик молекулярной биологии, а затем вводят в популяцию бактерий (например, E. coli). Экспрессия бактериофага в бактериях может, в некоторых аспектах данного изобретения, потребовать использования вспомогательного фага. В некоторых аспектах данного изобретения вспомогательный фаг не требуется (см., например, Chasteen et al. (2006) Nucleic Acids Res 34 (21): e145). Фаг, продуцируемый бактериями, выделяют и затем приводят в контакт, например, с целевым антигеном, связанным с твердой подложкой (иммобилизированным). Фаг также можно приводить в контакт с антигеном в растворе, после чего полученный комплекс связывают с твердой подложкой.

Субпопуляцию антител, выделенных с помощью скрининга с использованием вышеуказанных способов, можно охарактеризовать по их специфичности и аффинности связывания с конкретным антигеном (например, с ИЛ-27р28 человека) с использованием любого иммунологического или биохимического способа, известного в данной области техники. Например, специфическое связывание антитела с ИЛ-27р28 можно определить, например, с помощью иммунологических или биохимических методов, таких как, но не ограничиваясь ими, анализ ТИФА, анализ ППР, анализ иммунопреципитации, аффинная хроматография и равновесный диализ, как описано выше. Иммуноанализы, которые можно применять для анализа иммуноспецифического связывания и перекрестной реактивности антител, включают в себя, но не ограничиваются ими, конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием таких методов, как вестерн-блоттинг, РИА, ТИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), сэндвич-иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с белком А. Такие анализы являются рутинными и хорошо известны в данной области техники.

В аспектах данного изобретения, в которых выбранные аминокислотные последовательности CDR представляют собой короткие последовательности (например, длиной меньше чем 10 -15 аминокислот), нуклеиновые кислоты, кодирующие CDR, могут быть синтезированы химически, как описано, например, в работе Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51 (1): 129 - 130 и в патенте США №

- 43 052811

6995259. Для данной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей акцепторное антитело, область последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующая CDR, может быть заменена химически синтезированными нуклеиновыми кислотами с помощью стандартных методик молекулярной биологии. 5'- и 3'-концы химически синтезированных нуклеиновых кислот могут быть синтезированы так, чтобы они содержали сайты рестрикционных ферментов с липкими концами для использования при клонировании нуклеиновых кислот в нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область донорного антитела.

В некоторых аспектах данного изобретения антитела против ИЛ-27, описанные в данном документе, содержат измененную константную область тяжелой цепи, которая обладает сниженной эффекторной функцией (или не обладает эффекторной функцией) по сравнению с соответствующей неизмененной константной областью. Эффекторные функции, связанные с константной областью антитела против ИЛ-27, можно модулировать путем изменения свойств константной области или области Fc. Измененные эффекторные функции включают в себя, например, модулирование одной или большего числа из следующих функций: антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ), комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ), апоптоз, связывание с одним или большим числом Fcрецепторов и провоспалительные реакции. Модуляция обозначает повышение, снижение или устранение активности эффекторной функции, проявляемой рассматриваемым антителом, содержащим измененную константную область, по сравнению с активностью неизмененной формы константной области. В конкретных аспектах данного изобретения модуляция включает в себя ситуации, в которых активность отключена или полностью отсутствует.

В одном аспекте данного изобретения антитела против ИЛ-27, описанные в данном документе, содержат константную область тяжелой цепи IgG4. В одном аспекте данного изобретения указанная константная область тяжелой цепи IgG4 представляет собой константную область тяжелой цепи IgG4 дикого типа. В другом аспекте данного изобретения указанная константная область IgG4 содержит мутацию, например, одну или обе из S228P и L235E или L235A, например, в соответствии с системой нумерации ЕС (Kabat, EA, et al., см. выше). В одном аспекте данного изобретения антитела против ИЛ27, описанные в данном документе, содержат константную область IgG1. В одном аспекте данного изобретения указанная константная область тяжелой цепи IgG1 представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 дикого типа. В другом аспекте данного изобретения указанная константная область тяжелой цепи IgG1 содержит мутацию.

Измененная константная область с измененной аффинностью связывания с FcR и (или) активностью АЗКЦ, и (или) измененной активность КЗЦ представляет собой полипептид, который имеет либо повышенную, либо пониженную активность связывания с FcR и (или) активностью АЗКЦ, и (или) активностью КЗЦ по сравнению с неизмененной формой константной области. Измененная константная область, проявляющая повышенное связывание с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с большей аффинностью, чем неизмененный полипептид. Измененная константная область, которая проявляет сниженное связывание с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более низкой аффинностью, чем неизмененная форма константной области. Такие варианты, которые проявляют сниженное связывание с FcR, могут проявлять незначительное связывание с FcR или вообще не проявлять заметного связывания с FcR, например, проявляют от 0% до 50% (например, меньше чем 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%) связывания с FcR по сравнению с уровнем связывания с FcR нативной последовательности константной области иммуноглобулина или области Fc. Подобным образом измененная константная область, которая проявляет модулированную активность АЗКЦ и (или) КЗЦ, может проявлять либо повышенную, либо сниженную активность АЗКЦ и (или) КЗЦ по сравнению с неизмененной константной областью. Например, в некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27, содержащее измененную константную область, может проявлять от около 0% до около 50% (например, меньше чем 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%) активности АЗКЦ и (или) КЗЦ по сравнению с неизмененной формой константной области. Антитело против ИЛ -27, описанное в данном документе, содержащее измененную константную область, проявляющую сниженную АЗКЦ и (или) КЗЦ, может проявлять сниженную активность АЗКЦ и (или) КЗЦ, или не проявлять их вообще.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27, описанное в данном документе, проявляет сниженную эффекторную функцию или не проявляет ее вообще. В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 содержит гибридную константную область или ее часть, такую как гибридная константная область G2/G4 (см., например, работы Burton et al. (1992) Adv Immun 51: 1 - 18; Canfield et al. (1991) J Exp Med 173: 1483 - 1491; и Mueller et al. (1997) Mol Immunol 34 (6): 441 452).

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 может содержать измененную константную область, проявляющую повышенную или сниженную комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ). Модуляция активности КЗЦ может быть достигнута путем введения одной или

- 44 052811 большего числа аминокислотных замен, вставок или делеций в участок Fc данного антитела. См., например, патент США № 6194551. В качестве альтернативы или дополнения в область Fc может (могут) быть введен (-ы) остаток (-ки) цистеина, тем самым обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь улучшенную или сниженную способность к интернализации и (или) повышенную или сниженную активность комплемент-опосредованного уничтожения клеток. См., например, работы Caron et al. (1992) J Exp Med 176: 1191 - 1195 и Shopes (1992) Immunol 148: 2918 - 2922; международные патентные публикации PCT № WO 99/51642 и WO 94/29351; работу Duncan and Winter (1988) Nature 322: 738 - 40; и патенты США № 5648260 и № 5624821.

Экспрессия и очистка рекомбинантных антител.

Описанные в данном документе антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью множества методик, известных в области молекулярной биологии и химии белков. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая один или оба полипептида тяжелой и легкой цепей антитела, может быть встроена в вектор экспрессии, который содержит регуляторные последовательности транскрипции и трансляции, которые включают в себя, например, промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала транскрипции и остановки транскрипции, последовательности начала трансляции и остановки трансляции, сигналы терминатора транскрипции, сигналы полиаденилирования и энхансерные или активирующие последовательности. Регуляторные последовательности включают в себя промотор и последовательности начала и остановки транскрипции. В дополнение к этому вектор экспрессии может включать в себя больше чем одну систему репликации, так что его можно поддерживать в двух разных организмах, например, в клетках млекопитающих или насекомых для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации.

Доступно несколько возможных векторных систем для экспрессии клонированных полипептидов тяжелой и легкой цепей из нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих. Один из классов векторов основан на интеграции желаемых последовательностей генов в геном клетки-хозяина. Клетки со стабильно интегрированной ДНК могут быть отобраны путем одновременного введения генов устойчивости к лекарственному препарату, таких как E.coli gpt (Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072) или Tn5 neo (Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1: 327). Селектируемый маркерный ген может быть либо непосредственно связан с последовательностями ДНК, которые должны быть экспрессированы, либо введен в ту же клетку путем котрансфекции (Wigler et al. (1979) Cell 16: 77). Во втором классе векторов используются элементы ДНК, которые придают способность к автономной репликации внехромосомной плазмиде. Такие векторы могут быть получены из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79: 7147), цитомегаловирус, вирус полиомы (Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 1292) или вирус SV40 (Lusky and Botchan (1981) Nature 293: 79).

Векторы экспрессии можно вводить в клетки способом, подходящим для последующей экспрессии нуклеиновой кислоты. Способ введения во многом диктуется целевым типом клеток, что обсуждается ниже. Иллюстративные способы включают в себя осаждение с помощью CaPO₄, слияние липосом, катионные липосомы, электропорацию, вирусную инфекцию, трансфекцию, опосредованную декстраном, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов и прямую микроинъекцию.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии антител или их антигенсвязывающих фрагментов включают в себя клетки дрожжей, бактерий, насекомых, растений и млекопитающих. Особый интерес представляют бактерии, такие как E.coli, грибы, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, клетки насекомых, такие как SF9, клеточные линии млекопитающих (например, клеточные линии человека), а также первичные клеточные линии.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело или его фрагмент могут быть экспрессированы и очищены из организмов трансгенных животных (например, трансгенных млекопитающих). Например, антитело может быть получено в организме трансгенного млекопитающего (например, грызуна) и выделено из молока, как описано, например, в работах Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13 (6): 625 - 629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9 (2): 155 - 159; и Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231 (1 - 2): 147 - 157.

Антитела и их фрагменты могут быть получены из клеток путем культивирования клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела или их фрагменты, в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения экспрессии указанных белков. Такие условия для экспрессии белка будут варьировать в зависимости от выбора вектора экспрессии и клетки-хозяина, и специалист в данной области техники легко определит их с помощью рутинных экспериментов. Например, антитела, экспрессированные в E.coli, могут быть получены путем рефолдинга из телец включения (см., например, работу Hou et al. (1998) Cytokine 10: 319 - 30). Системы бактериальной экспрессии и способы их применения хорошо известны в данной области техники (см. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning - A Laboratory Manual - 3^rd Ed.,

- 45 052811

Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Выбор кодонов, подходящих векторов экспрессии и подходящих клеток-хозяев будет варьировать в зависимости от ряда факторов и при необходимости может быть легко оптимизирован. Антитело (или его фрагмент), описанные в данном документе, могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих или в других системах экспрессии, включая, но не ограничиваясь ими, дрожжи, бакуловирусы и системы экспрессии in vitro (см., например, работу Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18: 213 - 220).

После экспрессии антитела и их фрагменты можно выделять. Антитело или его фрагмент могут быть выделены или очищены различными способами, известными специалистам в данной области техники, в зависимости от того, какие другие компоненты присутствуют в данном образце. Стандартные методы очистки включают в себя электрофоретические, молекулярные, иммунологические и хроматографические методики, включая ионообменную, гидрофобную, аффинную хроматографии и обращенно-фазовую ВЭЖХ. Например, антитело может быть очищено с помощью стандартной колонки против антител (например, колонки с белком А или с белком G). Также можно применять методики ультрафильтрации и диафильтрации в сочетании с концентрированием белка. См., например, Scopes (1994) Protein Purification, 3^rd edition, Springer-Verlag, New York City, New York. Степень очистки обязательно будет зависеть от желаемого применения. В некоторых случаях нет необходимости в очистке экспрессированного антитела или его фрагментов.

Способы определения выхода или чистоты очищенного антитела или его фрагмента известны в данной области техники и включают в себя, например, анализ по Брэдфорду, УФ-спектроскопию, биуретовый анализ белка, анализ белка по Лоури, анализ белка с амидовым черным красителем, жидкостную хроматографию высокого давления (ВЭЖХ), масс-спектрометрию (МС) и методы гельэлектрофореза (например, с использованием белкового красителя, такого как кумасси синий, или коллоидного серебра).

Модификация антител или их антигенсвязывающих фрагментов.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно модифицировать после их экспрессии и очистки. Модификации могут быть ковалентными или нековалентными модификациями. Такие модификации могут быть введены в антитела или их фрагменты, например, путем приведения целевых аминокислотных остатков данного полипептида в реакцию с органическим дериватизирующим агентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Подходящие сайты для модификации могут быть выбраны с использованием любого из множества критериев, включая, например, структурный анализ или анализ аминокислотной последовательности антител или их фрагментов.

В некоторых аспектах данного изобретения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть конъюгированы с гетерологичным фрагментом. Такой гетерологичный фрагмент может представлять собой, например, гетерологичный полипептид, терапевтический агент (например, токсин или лекарственный препарат) или обнаруживаемую метку, такую как, но не ограничиваясь ими, радиоактивная метка, ферментативная метка, флуоресцентная метка, метка тяжелого металла, люминесцентная метка или аффинная метка, такая как биотин или стрептавидин. Подходящие гетерологичные полипептиды включают в себя, например, антигенную метку (FLAG (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 141)), полигистидин (6-His; HHHHHH (SEQ ID NO: 142), гемагглютинин (HA; YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 143)), глутатион-S-трансферазу (GST) или мальтозосвязывающий белок (МСБ, англ.

MBP)), для применения при очистке антител или их фрагментов. Гетерологичные полипептиды также включают в себя полипептиды (например, ферменты), которые можно применять в качестве диагностических или обнаруживаемых маркеров, например, люциферазу, флуоресцентный белок (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP)) или хлорамфениколацетилтрансферазу (ХАТ, англ. CAT). Подходящие радиоактивные метки включают в себя, например, ³²P, ³³P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S и ³H. Подходящие флуоресцентные метки включают в себя, но не ограничиваются ими, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), зеленый флуоресцентный белок (GFP), DyLight™ 488, фикоэритрин (PE), йодид пропидия (PI), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, аллофикоцианин и Cy7. Люминесцентные метки включают в себя, например, любой из множества люминесцентных хелатов лантанидов (например, европия или тербия). Например, подходящие хелаты европия включают в себя хелат европия и диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПК, англ. DTPA) или тетраазациклододекан-1,4,7,10тетрауксусной кислоты (ТЦТК, англ. DOTA). Ферментативные метки включают в себя, например, щелочную фосфатазу, ХАТ, люциферазу и пероксидазу хрена.

Два белка (например, антитело и гетерологичный фрагмент) могут быть сшиты с помощью любого из ряда известных химических перекрестно-сшивающих агентов. Примерами таких перекрестносшивающих агентов являются те, которые связывают два аминокислотных остатка посредством связи, включающей затрудненную дисульфидную связь. В таких связях дисульфидная связь в сшивающем звене защищена (за счет пространственно-блокирующих групп по обе стороны от данной дисульфидной связи) от восстановления под действием, например, восстановленного глутатиона или фермента дисульфидредуктазы. Один подходящий реагент - 4-сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α(2пиридилдитио)толуол (СМПТ, англ. SMPT) - образует такую связь между двумя белками, используя

- 46 052811 концевой лизин на одном из белков и концевой цистеин на другом. Также можно использовать гетеробифункциональные реагенты, которые перекрестно сшиваются с помощью различных групп связывания на каждом белке. Другие пригодные перекрестно-сшивающие агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, реагенты, которые связывают две аминогруппы (например, К-5-азидо-2нитробензоилоксисукцинимид), две сульфгидрильные группы (например, 1,4-бис-малеимидобутан), аминогруппу и сульфгидрильную группу (например, м-малеимидобензоил-Жгидроксисукцинимидный сложный эфир), аминогруппу и карбоксильную группу (например, 4-[п-азидосалициламидо]бутиламин), и аминогруппу и гуанидиниевую группу, которые присутствуют в боковой цепи аргинина (например, моногидрат п-азидофенилглиоксаля).

В некоторых аспектах данного изобретения радиоактивная метка может быть непосредственно конъюгирована с аминокислотным остовом антитела. В качестве альтернативы радиоактивная метка может быть включена как часть более крупной молекулы (например, ¹²⁵I в мета-[¹²⁵I]йодофенил-Nгидроксисукцинимид ([¹²⁵1]мИФНГС, англ. ([¹²⁵I]mIPNHS) который связывается со свободными аминогруппами с образованием мета-йодофенильных (мИФ, англ. mIP) производных соответствующих белков (см., например, Rogers et al. (1997) J NuclMed 38: 1221 - 1229) или в виде хелата (например, с ТЦТК или ДТПК), который, в свою очередь, связан с белковым остовом. Способы конъюгации радиоактивных меток или более крупных молекул/хелатов, содержащих их, с антителами, описанными в данном документе, или с их антигенсвязывающими фрагментами, известны в данной области техники. Такие способы включают в себя инкубацию белков с радиоактивной меткой в определенных условиях (например, pH, концентрация соли, и (или) температура), которые облегчают связывание радиоактивной метки или хелата с данным белком (см., например, патент США № 6001329).

Способы конъюгации флуоресцентной метки (иногда называемой флуорофор) с белком (например, антителом) известны в области химии белков. Например, флуорофоры могут быть конъюгированы со свободными аминогруппами (например, лизинов) или сульфгидрильными группами (например, цистеинов) белков с использованием групп сукцинимидилового (НГС, англ. NHS) сложного эфира или тетрафторфенилового (ТФФ, англ. TFP) сложного эфира, присоединенных к флуорофорам. В некоторых аспектах данного изобретения флуорофоры могут быть конъюгированы с гетеробифункциональным перекрестно-сшивающим фрагментом, таким как сульфосукцинимидил-4-(Nмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-СМЦК, англ. sulfo-SMCC). Подходящие способы конъюгации включают в себя инкубацию белка антитела или его фрагмента с флуорофором в условиях, облегчающих связывание данного флуорофора с данным белком. См., например, Welch and Redvanly (2003) Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications, John Wiley and Sons (ISBN 0471495603).

В некоторых аспектах данного изобретения антитела или их фрагменты можно модифицировать, например, фрагментом, улучшающим стабилизацию и (или) удержание антител в циркуляции, например, в крови, сыворотке крови или других тканях. Например, антитело или его фрагмент можно ПЭГилировать, как описано, например, в работах Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10 (6): 973 - 8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54: 477 - 485; и Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459 - 476; или ГЭКилировать (с помощью гидроксиэтилового крахмала - ГЭК, англ. HES) (Fresenius Kabi, Germany; см., например, работу Pavisic et al. (2010) Int J Pharm 387 (1 - 2): 110 - 119). Стабилизирующий фрагмент может улучшить стабильность или удержание антитела (или его фрагмента) по меньшей мере в 1,5 раза (например, по меньшей мере в 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 или большее число раз).

В некоторых аспектах данного изобретения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, могут быть гликозилированы. В некоторых аспектах данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, могут быть подвергнуты ферментативной или химической обработке, или получены из клетки, так что указанные антитело или его фрагмент имеют низкую степень гликозилирования или не гликозилированы вообще. Способы получения антител с низкой степенью гликозилирования известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 6933368; и в работах Wright et al. (1991) EMBO J 10 (10): 2717 - 2723; и Co et al. (1993) Mol Immunol 30: 1361.

Фармацевтические композиции и составы.

В некоторых аспектах данного изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против ИЛ-27 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителями, носителем, солюбилизатором, эмульгатором, консервантом и (или) адъювантом.

В определенных аспектах данного изобретения приемлемые материалы для лекарственных составов предпочтительно являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. В некоторых аспектах данного изобретения материал (-ы) для лекарственных составов предназначен (-ы) для п/к и (или) в/в введения. В определенных аспектах данного изобретения фармацевтическая композиция может содержать материалы для лекарственных составов для модифицирования, поддержания или сохранения, например, уровня рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения,

- 47 052811 адсорбции или проницаемости указанной композиции. В определенных аспектах данного изобретения подходящие материалы включают в себя, но не ограничиваются ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин, пролин или лизин); противомикробные агенты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты); объемообразующие агенты (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, англ. EDTA)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бетациклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды; и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, ароматизаторы и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); полипептиды с низкой молекулярной массой; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерол, тилоксапол); агенты, повышающие стабильность (такие как сахароза или сорбит); агенты, повышающие тоничность (такие как галогениды щелочных металлов, предпочтительно -хлорид натрия или калия, маннит, сорбит); носители; разбавители; эксципиенты и (или) фармацевтические адъюванты. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). В некоторых аспектах данного изобретения лекарственный состав содержит ФСБ; 20 мМ ацетата натрия, pH 5,2, 50 мМ NaCl; и (или) 10 мМ ацетата натрия, pH 5,2, 9% сахарозы. В определенных аспектах данного изобретения оптимальная фармацевтическая композиция определяется специалистом в данной области техники в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формы доставки и необходимой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, как указано выше. В определенных аспектах данного изобретения такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и (или) скорость выведения in vivo указанного антитела против ИЛ-27.

В определенных аспектах данного изобретения основная несущая среда или носитель в фармацевтической композиции могут быть по своей природе как водными, так и неводными. Например, в определенных аспектах данного изобретения пригодная несущая среда или носитель могут представлять собой воду для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственную спинномозговую жидкость, возможно, дополненные другими материалами, часто применяемыми в композициях для парентерального введения. В определенных аспектах данного изобретения физиологический раствор включает в себя изотонический фосфатно -солевой буфер. В определенных аспектах данного изобретения дополнительными иллюстративными носителями являются нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. В определенных аспектах данного изобретения фармацевтические композиции содержат Трис-буфер с pH около 7,0-8,5 или ацетатный буфер с pH около 4,0-5,5, и могут дополнительно содержать сорбит или его подходящий заменитель. В определенных аспектах данного изобретения композиции, содержащие антитело против ИЛ-27, могут быть подготовлены для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей необходимую степень чистоты, с оптимальными агентами для лекарственного состава (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, как указано выше) в форме лиофилизированной массы или водного раствора. Кроме того, в определенных аспектах данного изобретения композицию, содержащую антитело против ИЛ-27, можно составить в виде лиофилизата, используя соответствующие эксципиенты, такие как сахароза.

В определенных аспектах данного изобретения фармацевтические композиции могут быть выбраны для парентеральной доставки. В определенных аспектах данного изобретения композиции могут быть выбраны для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, пероральной доставки.

Приготовление таких фармацевтически приемлемых композиций находится в пределах компетентности специалиста в данной области техники.

В определенных аспектах данного изобретения компоненты лекарственного состава предпочтительно находятся в концентрациях, которые являются приемлемыми с учетом конкретного места введения. В определенных аспектах данного изобретения применяют буферы для поддержания в композиции физиологического уровня рН или немного более низкого уровня рН, как правило, в пределах диапазона рН от около 5 до около 8.

В определенных аспектах данного изобретения, если предусмотрено парентеральное введение, терапевтические композиции могут находиться в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, содержащего антитело против ИЛ-27 и фармацевтически приемлемый носитель. В определенных аспектах данного изобретения носитель для парентеральной инъекции представляет собой

- 48 052811 стерильную дистиллированную воду, в которую добавлено антитело против ИЛ-27, в виде стерильного изотонического раствора с надлежащим консервантом. В определенных аспектах данного изобретения препарат может включать в себя готовый лекарственный состав необходимой молекулы с агентом, таким как инъекционные микросферы, биоразлагаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут обеспечивать контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который может доставляться посредством депонированной инъекции. В определенных аспектах данного изобретения также можно использовать гиалуроновую кислоту, действие которой состоит в обеспечении продления периода нахождения в циркуляции. В определенных аспектах данного изобретения можно использовать имплантируемые устройства доставки лекарственного препарата для введения необходимой молекулы.

В определенных аспектах данного изобретения фармацевтическая композиция составлена для ингаляции. В определенных аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 может быть составлено в виде сухого порошка для ингаляции. В определенных аспектах данного изобретения раствор для ингаляции, содержащий антитело против ИЛ-27, может быть составлен с пропеллентом для аэрозольной доставки. В определенных аспектах данного изобретения растворы могут быть распыляемыми. Ингаляционное введение дополнительно описано в международном патентном документе № PCT/US94/001875, который описывает ингаляционное введение химически модифицированных белков.

В определенных аспектах данного изобретения предполагается, что лекарственные составы можно вводить перорально. В определенных аспектах данного изобретения антитело против ИЛ -27, которое вводят таким образом, можно составить с или без носителей, обычно применяемых при составлении твердых дозированных лекарственных форм, таких как таблетки или капсулы. В определенных аспектах данного изобретения капсула может быть разработана так, чтобы высвобождение активной части лекарственного состава происходило в точке желудочно-кишечного тракта, в которой биодоступность максимальна, а пресистемная деградация минимальна. В определенных аспектах данного изобретения может быть добавлен по меньшей мере один дополнительный агент для облегчения абсорбции антитела против ИЛ-27. В определенных аспектах данного изобретения можно также применять разбавители, ароматизаторы, тугоплавкие воски, растительные масла, смазывающие агенты, суспендирующие агенты, агенты для улучшения распадаемости таблеток и связующие агенты.

В определенных аспектах данного изобретения фармацевтическая композиция может включать в себя эффективное количество антитела против ИЛ-27 в смеси с нетоксичными эксципиентами, которые подходят для изготовления таблеток. В определенных аспектах данного изобретения путем растворения таблеток в стерильной воде или в другом подходящем носителе можно получить растворы в форме единичной дозы. В определенных аспектах данного изобретения подходящие эксципиенты включают в себя, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия или бикарбонат, лактоза или фосфат кальция; или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Дополнительные фармацевтические композиции будут очевидны для специалистов в данной области техники, включая лекарственные составы на основе антитела против ИЛ-27, характеризующиеся пролонгированной или контролируемой доставкой. В определенных аспектах данного изобретения специалистам в данной области техники также известны методики составления различных других средств замедленной или контролируемой доставки, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые микрогранулы и депонированные инъекции. См., например, заявку РСТ № PCT/US93/00829, в которой описано контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. В определенных аспектах данного изобретения препараты с замедленным высвобождением могут содержать полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Матрицы, обеспечивающие замедленное высвобождение, могут включать в себя полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и Европейская патентная заявка № EP 058481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Е-глутамата (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547 - 556 (1983)), поли(2гидроксиэтилметакрилат) (Eanger et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167 - 277 (1981); и Eanger, Chem. Tech., 12: 98 - 105 (1982)), этиленвинилацетат (Eanger et al., см. выше) или поли-П(-)-3-гидроксимасляную кислоту (EP 133988). В определенных аспектах данного изобретения композиции с замедленным высвобождением могут также включать в себя липосомы, которые можно приготовить любым из нескольких способов, известных в данной области техники. См., например, работу Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 - 3692 (1985); европейские патентные заявки № EP 036676; № EP 088046 и № EP 143949.

Фармацевтическая композиция для применения при введении in vivo является, как правило, стерильной. В определенных аспектах данного изобретения этого можно достичь путем фильтрации через стерильные фильтровальные мембраны. В определенных аспектах данного изобретения, если композиция является лиофилизированной, стерилизацию с применением данного способа можно проводить до или после лиофилизации и восстановления. В определенных аспектах данного изобретения

- 49 052811 композиции для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе. В определенных аспектах данного изобретения парентеральные композиции в общем случае помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, в пакет для внутривенного раствора или во флакон, имеющий пробку, прокалываемую гиподермической иглой для инъекций.

В определенных аспектах данного изобретения после приготовления фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, или в виде дегидрированного или лиофилизированного порошка. В определенных аспектах данного изобретения такие лекарственные составы можно хранить в готовой для применения форме или в форме (например, лиофилизированной), которую восстанавливают перед введением.

В определенных аспектах данного изобретения также представлены наборы для получения единичной дозы для введения. В определенных аспектах данного изобретения указанный набор содержит первый контейнер, содержащий сухой белок, и второй контейнер, содержащий водный препарат. В определенных аспектах данного изобретения представлены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).

В определенных аспектах данного изобретения эффективное количество терапевтически применяемой фармацевтической композиции, содержащей антитело против ИЛ-27, будет зависеть, к примеру, от обстоятельств и целей лечения. Специалисту в данной области техники понятно, что, таким образом, подходящие для лечения дозировочные уровни в соответствии с определенными аспектами данного изобретения будут варьировать в зависимости, частично, от доставляемой молекулы, показаний, по которым применяется антитело против ИЛ-27, пути введения, а также размеров (массы тела, площади поверхности тела или размеров органов) и (или) состояния (возраста и общего состояния здоровья) данного пациента. В определенных аспектах данного изобретения лечащий врач может титровать дозу и изменять путь введения, чтобы получить оптимальный терапевтический эффект.

В определенных аспектах данного изобретения частота введения дозы будет учитывать фармакокинетические параметры антитела против ИЛ-27 в используемом лекарственном составе. В определенных аспектах данного изобретения лечащий врач будет вводить композицию до тех пор, пока будет достигнута доза, которая приведет к требуемому эффекту. Таким образом, в определенных аспектах данного изобретения композицию можно вводить в виде одной дозы или в виде двух или большего числа доз (которые могут содержать или не содержать одно и то же количество необходимой молекулы) с течением времени, или в виде непрерывной инфузии через имплантируемое устройство или катетер. Дальнейшее улучшение применения соответствующей дозы проводится рутинным образом рядовыми специалистами в данной области техники и находится в пределах задач, выполняемых ими рутинным образом. В определенных аспектах данного изобретения соответствующие дозы можно установить на основании соответствующих данных о зависимости между дозой и эффектом.

В определенных аспектах данного изобретения путь введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например, пероральное введение, введение посредством внутривенной, внутрибрюшинной, интрацеребральной (интрапаренхиматозной), интрацереб ровентрикулярной, внутримышечной, подкожной, внутриглазной, внутриартериальной, интрапортальной или внутриочаговой инъекциями; при помощи систем для замедленного высвобождения или имплантируемых устройств. В определенных аспектах данного изобретения композиции можно вводить путем болюсной инъекции или непрерывно путем инфузии, или при помощи имплантируемого устройства. В определенных аспектах данного изобретения отдельные элементы комбинированной терапии могут вводиться разными путями.

В определенных аспектах данного изобретения композицию можно вводить местно путем имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, в который абсорбирована или инкапсулирована необходимая молекула. В определенных аспектах данного изобретения, если применяется имплантируемое устройство, указанное устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, а доставку необходимой молекулы можно осуществлять посредством диффузии, болюса с отложенным высвобождением или непрерывного введения. В определенных аспектах данного изобретения может быть желательным применять фармацевтическую композицию, содержащую антитело против ИЛ-27, путем ex vivo. В таких случаях клетки, ткани и (или) органы, которые были удалены из организма пациента, обрабатывают фармацевтической композицией, содержащей антитело против ИЛ-27, после чего данные клетки, ткани и (или) органы имплантируют обратно в организм данного пациента.

В определенных аспектах данного изобретения антитело против ИЛ -27 может быть доставлено путем имплантации определенных клеток, которые были генетически сконструированы с помощью таких способов, как описанные в данном документе, для экспрессии и секреции полипептидов. В определенных аспектах данного изобретения такие клетки могут быть клетками животного или человека и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В определенных аспектах данного изобретения клетки могут быть иммортализованными. В определенных аспектах данного изобретения, чтобы снизить вероятность иммунологического ответа, клетки можно инкапсулировать, чтобы избежать

- 50 052811 инфильтрации окружающих тканей. В определенных аспектах данного изобретения инкапсулирующие материалы обычно представляют собой биосовместимые, полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые позволяют высвобождать белковый (-е) продукт (-ы), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими вредными для них факторами из окружающих тканей.

Варианты применения.

Описанные в данном документе композиции можно использовать в ряде диагностических и терапевтических применений. Например, обнаруживаемые меченые антигенсвязывающие молекулы можно применять в анализах для обнаружения присутствия или количества целевых антигенов в образце (например, в биологическом образце). Композиции можно применять в анализах in vitro для изучения ингибирования функции целевого антигена. В некоторых аспектах данного изобретения, например, в которых композиции связываются с белком комплемента и ингибируют его, указанные композиции можно применять в качестве положительных контролей в анализах, разработанных для выявления дополнительных новых соединений, которые ингибируют активность комплемента или иным образом применимы для лечения нарушения, связанного с системой комплемента. Например, композицию, ингибирующую ИЛ-27, можно применять в качестве положительного контроля в анализе для выявления дополнительных соединений (например, низкомолекулярных соединений, аптамеров или антител), которые снижают или устраняют выработку ИЛ-27. Указанные композиции также можно применять в терапевтических способах, что подробно описано ниже.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ обнаружения ИЛ-27 в биологическом образце или в организме субъекта, включающий в себя: (i) приведение указанного образца или указанного организма субъекта (и, необязательно, референсного образца или субъекта) в контакт с любым антителом, описанным в данном документе, в условиях, которые обеспечивают взаимодействие молекулы антитела и ИЛ-27, и (ii) обнаружение образования комплекса между молекулой антитела и образцом или организмом субъекта (и, необязательно, референсным образцом или субъектом).

Наборы.

Набор может включать в себя антитело против ИЛ-27, как описано в данном документе, и инструкции по применению. Наборы могут включать в себя, в подходящем контейнере, антитело против ИЛ-27, один или большее число контролей и различные буферы, реагенты, ферменты и другие стандартные ингредиенты, хорошо известные в данной области техники. В некоторых аспектах данного изобретения представлен набор, содержащий антитело против ИЛ -27 или его антигенсвязывающую часть, как описано в данном документе, и инструкции по применению для стимуляции иммунного ответа у субъекта или для лечения онкологического заболевания у субъекта, необязательно - с инструкциями по применению в сочетании с одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов или процедур, как описано в данном документе.

Контейнер может включать в себя по меньшей мере один флакон, лунку, пробирку, колбу, бутыль, шприц или другой вид контейнера, в которые антитело против ИЛ -27 может быть помещено, а в некоторых случаях - подходящим образом аликвотировано. В случаях, когда предоставлен дополнительный компонент, набор содержит один или большее число дополнительных контейнеров, в которые может быть помещен данный компонент. Указанные наборы также могут включать в себя средства для содержания контейнеров с антителом против ИЛ-27 или любым другим реактивом плотно упакованными для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать в себя пластиковые контейнеры, изготовленные впрыскиванием или литьем с раздувом, в которых находятся желаемые флаконы. Контейнеры и (или) наборы могут включать в себя маркировку с инструкциями по применению и (или) предупреждениями.

Способы применения.

Композиции согласно данному изобретению имеют многочисленные способы применения in vitro и in vivo, включая обнаружение и (или) количественное определение ИЛ-27 и (или) антагонизм функции ИЛ-27.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ ингибирования или снижения фосфорилирования STAT1 и (или) STAT3 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью, представленными в данном документе, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ ингибирования или снижения ингибирования экспрессии CD161 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью, представленными в данном документе, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ ингибирования или снижения экспрессии PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью, представленными в данном документе, при

- 51 052811 этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ индукции или усиления секреции одного или большего числа цитокинов из клетки, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью, представленными в данном документе, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающей части, которые специфически связываются с ИЛ-27 и оказывают на него антагонистическое действие, которые представлены в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающей части, которые специфически связываются с ИЛ-27 и оказывают на него антагонистическое действие, которые представлены в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые представлены в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и (или) STAT3 в клетке, тем самым обеспечивая стимуляцию иммунного ответа или лечение онкологического заболевания.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые представлены в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке, тем самым обеспечивая стимуляцию иммунного ответа или лечение онкологического заболевания.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые представлены в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция ингибируют или снижают экспрессию PD-L1 и (или) TIM-3 в клетке, тем самым обеспечивая стимуляцию иммунного ответа или лечение онкологического заболевания.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ стимуляции иммунного ответа или лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые представлены в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его антигенсвязывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанные антитело, его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки, тем самым обеспечивая стимуляцию иммунного ответа или лечение онкологического заболевания.

В некоторых аспектах данного изобретения онкологическое заболевание выбрано из рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого), саркомы, рака яичка, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака молочной железы (например, трижды негативного рака молочной железы), меланомы, онкологического заболевания головы и шеи (например, плоскоклеточного рака головы и шеи), колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака эндометрия, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака головного мозга, лимфомы (например, ДВКЛ), лейкоза (например, ОМЛ) или рака почки (например, почечно-клеточной карциномы, например, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы).

Вышеописанные композиции полезны, среди прочего, в способах лечения или профилактики различных видов онкологических заболеваний у субъекта. Указанные композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку, с помощью множества способов, которые зависят, частично, от

- 52 052811 пути введения. Путь введения может представлять собой, например, внутривенную (в/в) инъекцию или инфузию, подкожную (п/к) инъекцию, внутрибрюшинную (в/бр) инъекцию, внутримышечную (в/м) инъекцию или интратекальную (и/т) инъекцию. Инъекция может представлять собой болюсную инъекцию или непрерывную инфузию.

Введение можно осуществлять, например, путем местной инфузии, инъекции, или с помощью имплантата. Имплантат может быть из пористого, непористого или желеобразного материала, включая мембраны, такие как силиконовые мембраны, или волокна. Имплантат может быть сконфигурирован для пролонгированного или периодического высвобождения указанной композиции в организм субъекта. См., например, публикацию заявки на патент США № 20080241223; патенты США № 5501856; № 4863457; и № 3710795; европейские патентные публикации ЕР 488401; и EP 430539; описание каждой (каждого) из них включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Композиция может быть доставлена в организм субъекта с помощью имплантируемого устройства на основе, например, диффузионных, эрозионных или конвективных систем, например, осмотических насосов, биоразлагаемых имплантатов, электродиффузионных систем, электроосмосных систем, насосов парового давления, электролитических насосов, шипучих насосов, пьезоэлектрических насосов, систем на основе эрозии или электромеханических систем.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающий фрагмент терапевтическим образом доставляют в организм субъекта путем местного введения.

Подходящая доза композиции описанного в данном документе антитела или его фрагмента, которая может лечить или предотвращать онкологическое заболевание у субъекта, может зависеть от множества факторов, включая, например, возраст, пол и массу тела субъекта, подвергаемого лечению, и конкретный применяемый ингибитор. Например, для лечения субъекта с онкологическим заболеванием может потребоваться доза целого антитела против ИЛ-27, которая отличается от дозы ИЛ-27-связывающего Fab'-фрагмента антитела, необходимой для лечения того же субъекта. Другие факторы, влияющие на дозу, вводимую субъекту, включают в себя, например, тип или тяжесть онкологического заболевания. Например, субъекту с метастатической меланомой может потребоваться введение дозы антитела против ИЛ-27, которая отличается от дозы указанного антитела для субъекта с глиобластомой. Другие факторы могут включать в себя, например, другие медицинские нарушения, одновременно или ранее имеющиеся у данного субъекта, общее состояние здоровья данного субъекта, генетическую предрасположенность данного субъекта, диету, время введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных препаратов и любые другие дополнительные терапевтические средства, которые вводят данному субъекту. Кроме того, следует понимать, что конкретную дозу и схему лечения любого конкретного субъекта также можно корректировать на основе суждения медицинского работника (например, лечащего врача или медсестры), который осуществляет лечение данного субъекта. Подходящие дозы описаны в данном документе.

Фармацевтическая композиция может включать в себя терапевтически эффективное количество антитела против ИЛ-27 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе. Такие эффективные количества может определить специалист в данной области техники, частично на основании эффекта введенного антитела или комбинаторного эффекта данного антитела и одного или большего числа дополнительных активных агентов, если применяется больше чем один агент. Терапевтически эффективное количество описанного в данном документе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия болезни, возраст, пол и масса тела индивидуума, а также способность указанного антитела (а также одного или большего числа дополнительных активных агентов) вызывать желаемый ответ у данного индивидуума, например, снижение роста опухоли. Например, терапевтически эффективное количество антитела против ИЛ-27 может ингибировать (уменьшать тяжесть или устранять возникновение) и (или) предотвращать конкретное нарушение и (или) любой из симптомов конкретного нарушения, известный в данной области техники или описанный в данном документе. Терапевтически эффективное количество также является таким, при использовании которого терапевтически благоприятные эффекты превосходят любые токсические или пагубные эффекты указанной композиции.

Подходящие для человека дозы любого из антител или их фрагментов, описанных в данном документе, могут быть дополнительно оценены, например, в исследованиях фазы I повышения дозы. См., например, работы van Gurp et al. (2008) Am J Transplantation 8 (8): 1711 - 1718; Hanouska et al. (2007) Clin Cancer Res 13 (2, part 1): 523 - 531; и Hetherington et al. (2006) Antimicrobial 5 Agents and Chemotherapy 0 (10): 3499 - 3500.

В некоторых аспектах данного изобретения композиция содержит любое из антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, и одно или большее число (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10 или 11, или больше) дополнительных терапевтических агентов, так что указанная композиция в целом является терапевтически эффективной. Например, композиция может содержать антитело против ИЛ-27, описанное в данном документе, и алкилирующий агент, при этом указанные антитело и агент находятся в такой концентрации, которая при

- 53 052811 их сочетании является терапевтически эффективной для лечения или профилактики онкологического заболевания (например, меланомы) у субъекта.

Токсичность и терапевтическую эффективность таких композиций можно определить с помощью известных фармацевтических процедур на культурах клеток или на экспериментальных животных (например, на животных моделях любого из описанных в данном документе видов онкологического заболевания). Такие процедуры могут быть использованы, например, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Дозовое соотношение между токсичным и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено в виде соотношения LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительно, чтобы антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладали высоким терапевтическим индексом. Несмотря на то, что можно использовать композиции, которые проявляют токсические побочные эффекты, следует позаботиться о разработке системы доставки, которая нацеливает такие соединения на участок пораженной ткани и сводит к минимуму потенциальное повреждение нормальных клеток и, таким образом, уменьшает побочные эффекты.

Результаты, полученные в исследованиях культур клеток и лабораторных животных, можно применять для определения диапазона доз для применения у человека. Доза таких антител или их антигенсвязывающих фрагментов находится, как правило, в пределах диапазона циркулирующих концентраций указанных антител или их фрагментов - концентраций, которые включают в себя ED₅₀ с небольшой токсичностью или вовсе без токсичности. Доза может меняться в этом диапазоне в зависимости от используемой дозовой формы и используемого пути введения. Для описанного в данном документе антитела против ИЛ-27 терапевтически эффективную дозу можно первоначально оценить на основании анализов с использованием культур клеток. Дозу можно разработать на животных моделях для достижения диапазона концентраций, циркулирующих в плазме крови, который включает в себя IC₅₀ (т.е. такую концентрацию активного ингредиента, которая позволяет достичь полумаксимального ингибирования симптомов), определенную в клеточной культуре. Эту информацию можно применять для более точного определения доз, пригодных для человека. Концентрацию в плазме крови можно измерить, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В некоторых аспектах данного изобретения, например, когда желательно местное введение (например, в глаз или в сустав), можно использовать клеточную культуру или моделирование на животных для определения дозы, необходимой для достижения терапевтически эффективной концентрации в локальном участке.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные способы можно осуществлять в сочетании с другими видами лечения онкологического заболевания. Например, композиция может быть введена субъекту одновременно, до или после облучения, хирургического вмешательства, нацеленной или цитотоксической химиотерапии, химиолучевой терапии, гормональной терапии, иммунотерапии, генной терапии, терапии трансплантацией клеток, прецизионной медицины, терапии с редактированием генома или другой фармакотерапии.

Как описано выше, композиции, описанные в данном документе (например, композиции антитела против ИЛ-27), могут применяться для лечения ряда онкологических заболеваний, включая следующие, но не ограничиваясь ими: саркома Капоши, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, мантийноклеточная лимфома, первичная лимфома центральной нервной системы, лимфома Беркитта и В-клеточная лимфома маргинальной зоны, истинная полицитемия, лимфома, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, солидные опухоли, саркомы и карциномы, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хрондросаркома, остеогенная саркома, остеосаркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, саркома толстой кишки, колоректальная карцинома, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно клеточная карцинома, гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, опухоль яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, немелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, менангиома, меланома, нейробластома, ретинобластома, карцинома носоглотки, карцинома пищевода, базальноклеточная карцинома, рак желчевыводящих путей, рак мочевого пузыря, рак костей, рак головного мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рак шейки матки, хориокарцинома, колоректальный рак, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, рак эндометрия, рак пищевода, рак глаза, рак органов головы и шеи, рак желудка, внутриэпителиальное

- 54 052811 новообразование, рак почки, рак гортани, рак печени, рак легкого (мелкоклеточный, крупноклеточный), меланома, нейробластома; рак полости рта (например, рак губы, языка, рта и глотки), рак яичника, рак поджелудочной железы, ретинобластома, рабдомиосаркома, рак прямой кишки; рак дыхательной системы, саркома, рак кожи, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак матки и рак мочевыделительной системы.

Комбинированная терапия.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающую часть, представленные в данном документе, можно комбинировать с одним или большим числом дополнительных терапевтических средств или способов лечения, например, с другим терапевтическим средством или способом лечения онкологического заболевания. Например, антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающую часть можно вводить субъекту (например, пациенту-человеку) в комбинации с одним или большим числом дополнительных терапевтических средств, при этом такая комбинация обеспечивает терапевтическую пользу для субъекта, который имеет или подвергается риску развития онкологического заболевания.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27, или его антигенсвязывающую часть, и одно или большее число дополнительных терапевтических средств вводят в одно и то же время (например, одновременно). В других аспектах данного изобретения антитело против ИЛ -27, или его антигенсвязывающую часть, вводят первыми по времени, а одно или большее число дополнительных терапевтических средств вводят вторыми по времени (например, последовательно). В некоторых аспектах данного изобретения одно или большее число дополнительных терапевтических средств вводят первыми по времени, а антитело против ИЛ-27 вводят вторым по времени.

Антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, могут заменить или дополнить ранее или одновременно проводимую терапию. Например, при лечении антителом против ИЛ-27 или его антигенсвязывающим фрагментом введение одного или большего числа дополнительных терапевтических средств может быть прекращено или уменьшено, например, их вводят в более низких дозах. В некоторых аспектах данного изобретения введение предшествующего терапевтического средства может сохраняться. В некоторых аспектах данного изобретения введение предшествующего терапевтического средства будет продолжаться до тех пор, пока уровень антитела против ИЛ-27 достигнет уровня, достаточного для обеспечения терапевтического эффекта.

В некоторых аспектах данного изобретения в данном изобретении представлен способ лечения онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающей части, которые специфически связываются с ИЛ-27 и оказывают на ИЛ-27 антагонистическое действие, в соответствии с данным изобретением, в комбинации с одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов или процедур, при этом указанные второй терапевтический агент или процедура выбраны из группы, состоящей из: химиотерапии, нацеленной противораковой терапии, онколитического препарата, цитотоксического агента, иммунной терапии, цитокина, хирургической процедуры, лучевой процедуры, активатора костимулирующей молекулы, ингибитора ингибиторной молекулы, вакцины или клеточной иммунотерапии, или их комбинации.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист PD-1, ингибитор TIM-3, ингибитор LAG-3, ингибитор TIGIT, ингибитор CD112R, ингибитор TAM, агонист STING, агонист 4-1BB или их комбинацию. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист CD39, антагонист CD73, антагонист CCR8 или их комбинацию. В некоторых аспектах данного изобретения антитело против CD73 представляет собой любое антитело против CD73, представленное, например, в патентной публикации США 2019/0031766 A1, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых аспектах данного изобретения антитело против CD39 представляет собой любое антитело против CD39, представленное, например, в международной патентной публикации № WO 2019/178269 A2, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 выбран из группы, состоящей из: PDR001, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MEDI0680, REGN2810, TSR-042, PF-06801591 и AMP-224. В определенных аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор PD-L1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный ингибитор PD-L1 выбран из группы, состоящей из: FAZ053, атезолизумаба, авелумаба, дурвалумаба и BMS-936559. В некоторых аспектах данного изобретения представлен способ усиления одной или большего числа функций антитела против PD-1 (например, усиление опосредованной PD-1 секреции цитокинов; усиление опосредованной антителом против PD-1 секреции ФНО-α; усиление опосредованной антителом против PD-1 секреции ИЛ-6 из клетки, подвергшейся воздействию антител против PD-1), способ, включающий в себя воздействие на клетку антителом или

- 55 052811 его антигенсвязывающей частью, представленными в данном документе, одновременно с или последовательно с антителом против PD-1, тем самым обеспечивая усиление одной или большего числа функций указанного антитела против PD-1.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой сунитиниб (Sutent®), кабозантиниб (CABOMETYX®), акситиниб (INLYTA®), ленватиниб (LENVIMA®), эверолимус (AFINITOR®), бевацизумаб (AVASTIN®), эпакадостат, NKTR-214 (агонист смещенной активности к CD-122), тивозаниб (FOTIVDA®), абексиностат, ипилимумаб (YERVOY®), тремелимумаб, пазопаниб (VOTRIENT®), сорафениб (NEXAVAR®), темсиролимус (TORISEL®), рамуцирумаб (CYRAMZA®), нирапариб, саволитиниб, вороланиб (X-82), регорафениб (STIVARGO®), донафениб (мультикиназный ингибитор), камрелизумаб (SHR-1210), пексастимоген девацирепвек (JX-594), рамуцирумаб (CYRAMZA®), апатиниб (YN968D1), инкапсулированный доксорубицин (THERMODOX®), тивантиниб (ARQ197), ADI-PEG 20, биниметиниб, апатиниба мезилат, нинтеданиб, лирилумаб, ниволумаб (OPDIVO®), пембролизумаб (KEYTRUDA®), атезолизумаб (TECENTRIQ®), авелумаб (BAVENCIO®), дурвалумаб (IMFIMZI®), цемиплимаб-rwlc (LIBTAYO®), тислелизумаб и спартализумаб.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор TIM-3, необязательно при этом указанный ингибитор TIM-3 представляет собой MGB453 или TSR-022.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор LAG-3, необязательно при этом указанный ингибитор LAG-3 выбран из группы, состоящей из LAG525, BMS-986016 и TSR-033.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор TIGIT. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор CD112R. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор TAM (Axl, Mer, Tyro). В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой агонист STING. В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой агонист 4-1BB.

В некоторых аспектах данного изобретения указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой ингибитор тирозинкиназы, агент, нацеленный на аденозиновую ось (например, антагонист CD39, антагонист CD73, антагонист A2AR или антагонист A2BR, или двойной антагонист A2AR/A2BR), антагонист CCR8, антагонист CTLA4, ингибитор VEG-F, или их комбинацию.

Комбинация с химиотерапевтическими агентами.

Химиотерапевтические агенты, пригодные для комбинации и (или) совместному введению с композициями согласно данному изобретению, включают в себя, например: таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и их аналоги или гомологи. Другие агенты включают в себя, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин С, цисдихлордиамин платины (II) (ДДП, англ. DDP), прокарбазин, альтретамин, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, недаплатин, сатраплатин или тетранитрат триплатина), антрациклин (например, даунорубицин (ранее - дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномцин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМЦ, англ. АМС)), антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин) и темозоломид.

Комбинация с антагонистами PD-1/PD-L1.

В некоторых аспектах данного изобретения антитела против ИЛ-27 или их антигенсвязывающие части, представленные в данном документе, комбинируют (например, вводят в комбинации) с одним или большим числом антагонистов PD-1, которые специфически связываются с PD-1 или PD-L1 человека и ингибируют биологическую активность PD-1/PD-L1 и (или) путь (пути) ниже по каскаду от них, и (или) клеточные процессы, опосредованные сигнальным (-и) путем (путями) PD-1/PD-L1 человека, или другие функции, опосредованные PD-1/PD-L1 человека.

Соответственно, в данном документе представлены антагонисты PD-1, которые прямо или аллостерически блокируют, проявляют антагонизм, подавляют, ингибируют или снижают биологическую активность PD-1/PD-L1, включая сигнальные пути и (или) клеточные процессы, опосредованные сигнальным (-и) путем (путями) PD-1/PD-L1, такие как связывание рецептора и (или) инициация клеточного ответа на PD-1/PD-L1. Также в данном документе представлены антагонисты PD- 56 052811

1, которые снижают количество или уровень PD-1 человека или PD-L1 человека, продуцируемых клеткой или субъектом.

В некоторых аспектах данного изобретения представлен антагонист PD-1, который связывает PD-1 человека и предотвращает, ингибирует или снижает связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 связывается с мРНК, кодирующей PD-1 или PD-L1, и предотвращает трансляцию. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 связывается с мРНК, кодирующей PD-1 или PD-L1, и вызывает их деградацию и (или) метаболизм.

В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 ингибирует передачу сигналов PD-1 или функцию PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 блокирует связывание PD-1 с PD-L1, с PD-L2 или как с PD-L1, так и с PD-L2. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 блокирует связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 блокирует связывание PD-1 с PD-L2. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 блокирует связывание PD-1 с PDL1 и (или) с PD-L2. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 специфически связывает PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 специфически связывает PD-L1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 специфически связывает PD-L2.

В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 ингибирует связывание PD1 со свойственным ему лигандом. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1, PD-1 с PD-L2 или PD-1 как с PD-L1, так и с PD-L2. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 не ингибирует связывание PD-1 со свойственным ему лигандом.

В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой выделенное антитело (мАТ) или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с PD-1 или с PD-L1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с PD-1 человека. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с PD-L1 человека. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PD-L1 человека и ингибируют связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с PD-1 человека и ингибируют связывание PD-L1 с PD-1.

Несколько антагонистов иммунных контрольных точек, которые ингибируют или нарушают взаимодействие между PD-1 и одним или обоими его лигандами, PD-L1 и PD-L2, находятся в стадии клинической разработки или в данное время доступны клиницистам для лечения онкологических заболеваний.

Примеры антител против PD-1 человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые могут содержать антагонист PD-1 в любой из композиций, способов и вариантов применения, представленных в данном документе, включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: KEYTRUDA® (пембролизумаб, MK-3475, h409A11, см. патентные документы US 8952136, US 8354509, US 8900587 и EP 2170959, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; Merck), OPDIVO® (ниволумаб, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538; см. патентные документы US 7595048, US 8728474, US 9073994, US 9067999, EP 1537878, US 8008449, US 8779105 и EP 2161336, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; Bristol Myers Squibb), MEDI0680 (AMP-514), BGB-A317 и BGB-108 (BeiGene), 244C8 и 388D4 (см. патентный документ WO 2016106159, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; Enumeral Biomedical), PDR001 (Novartis) и REGN2810 (Regeneron). Соответственно, в некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой пембролизумаб. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой ниволумаб.

Примеры антител против PD-L1 человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые могут содержать антагонист PD-1 в любой из композиций, способов и вариантов применения, представленных в данном документе, включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: BAVENCIO® (авелумаб, MSB0010718C, см. патентный документ WO 2013/79174, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; Merck/Pfizer), IMFINZI® (дурвалумаб, MEDI4736), TECENTRIQ® (атезолизумаб, MPDL3280A, RG7446; см. патентный документ WO 2010/077634, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; Roche), MDX-1105 (BMS936559, 12A4; см. патентные документы US 7943743 и WO 2013/173223, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; Medarex/BMS), и FAZ053 (Novartis). Соответственно, в некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой авелумаб. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет

- 57 052811 собой дурвалумаб. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой иммуноадгезин, который специфически связывается с PD-1 человека или с PD-L1 человека, например, слитый белок, содержащий внеклеточную или PD-1-связывающую часть PD-L1 или PD-L2, слитую с константной областью, такой как область Fc молекулы иммуноглобулина. Примеры молекул иммуноадгезии, которые специфически связываются с PD-1, описаны в патентных документах WO 2010/027827 и WO 2011/06634, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1 представляет собой AMP-224 (также известный как B7-DCIg), который представляет собой слитый белок PD-L2 - FC, который специфически связывается с PD-1 человека.

Рядовому специалисту будет понятно, что любой антагонист PD-1, который связывается с PD-1 или с PD-L1 и нарушает сигнальный путь PD-1/PD-L1, подходит для композиций, способов и вариантов применения, представленных в данном документе.

В некоторых аспектах данного изобретения указанный антагонист PD-1/PD-L1 представляет собой малую молекулу, нуклеиновую кислоту, пептид, миметик пептида, белок, углевод, производное углевода или гликополимер. Иллюстративные малые молекулы - ингибиторы PD-1 описаны в работе Zhan et al. (2016) Drug Discov Today 21 (6):1027 - 1036.

Комбинации с ингибиторами TIM-3.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающая часть, представленные в данном документе, комбинируют (например, вводят в комбинации) с ингибитором TIM-3. Ингибитор TIM-3 может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид. В некоторых аспектах данного изобретения ингибитор TIM-3 выбран из MGB453 (Novartis), TSR-022 (Tesaro) или LY3321367 (Eli Lilly). В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающую часть вводят в комбинации с MGB453. В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающую часть вводят в комбинации с TSR-022.

Комбинации с ингибиторами LAG-3.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ -27 или его антигенсвязывающая часть, представленные в данном документе, комбинируют (например, вводят в комбинации) с ингибитором LAG-3. Ингибитор LAG-3 может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид. В некоторых аспектах данного изобретения ингибитор LAG-3 выбран из LAG525 (Novartis), BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb), TSR-033 (Tesaro), MK-4280 (Merck & Co) или REGN3767 (Regeneron).

Другие комбинации.

В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающую часть, представленные в данном документе, комбинируют (например, вводят в комбинации) с ингибитором TIGIT, ингибитором киназы (например, ингибитором тирозинкиназы (ИТК, англ. TKI)), ингибитором CD112R, ингибитором рецептора ТАМ, агонистом STING и (или) агонистом 4-1ВВ, или с их комбинацией. В некоторых аспектах данного изобретения антитело против ИЛ -27 или его антигенсвязывающую часть, представленные в данном документе, комбинируют (например, вводят в комбинации) с ингибитором тирозинкиназы, агентом, нацеленным на аденозиновую ось (например, антагонистом CD39, антагонистом CD73 или антагонистом A2AR, A2BR или двойным антагонистом A2AR/A2BR), антагонистом CCR8, антагонистом CTLA4, ингибитором VEG-F, или с их комбинацией.

Способы обнаружения.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело против ИЛ -27 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, можно применять в способах обнаружения и (или) количественного определения ИЛ-27 человека в биологическом образце. Соответственно, антитело против ИЛ-27 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в данном документе, пригодны для диагностики, прогнозирования и (или) определения прогрессирования заболевания (например, онкологического заболевания) у пациента.

Наблюдение за субъектом (например, пациентом-человеком) на предмет улучшения онкологического заболевания, как определено в данном документе, означает оценку данного субъекта на предмет изменения параметра заболевания, например, снижения роста опухоли. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанную оценку проводят в течение по меньшей мере одного (1) часа, например, в течение по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 24 или 48 ч, или в течение по меньшей мере 1 суток, 2 суток, 4 суток, 10 суток, 13 суток, 20 суток или больше, или в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель, 4 недель, 10 недель, 13 недель, 20 недель или больше после введения. Указанную оценку субъекта можно проводить в один или большее число из следующих периодов: до начала лечения; во время лечения; или после введения одного или большего числа элементов лечения. Оценка может включать в себя оценку потребности в дальнейшем лечении, например, оценку необходимости изменения дозы, частоты введения или продолжительности лечения. Оценка также может включать

- 58 052811 оценку необходимости добавления или исключения выбранного терапевтического воздействия, например, добавления или исключения любого из способов лечения онкологического заболевания, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения представлен способ обнаружения ИЛ27 в образце, взятом у субъекта, при этом указанный способ включает в себя: (а) приведение образца, взятого у субъекта, в контакт с детектирующим антителом в условиях, позволяющих указанному детектирующему антителу образовать комплекс детектирующее антитело - ИЛ-27, если ИЛ-27 присутствует в указанном образце, при этом указанное детектирующее антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе; и (b) обнаружение присутствия указанного комплекса, если таковой имеется, полученного на этапе (а).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения представлен способ обнаружения у субъекта онкологического заболевания, ассоциированного с ИЛ-27, при этом указанный способ включает в себя следующие этапы: (а) приведение образца, взятого у субъекта с подозрением на онкологическое заболевание, ассоциированное с ИЛ-27, в контакт с детектирующим антителом в условиях, позволяющих указанному детектирующему антителу образовать комплекс детектирующее антитело - ИЛ-27, если ИЛ27 присутствует в указанном образце, при этом указанное детектирующее антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, представленные в данном документе; и (b) обнаружение присутствия указанного комплекса, если таковой имеется, полученного на этапе (а). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения детектирующее антитело конъюгировано с детектируемой меткой. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный способ дополнительно включает в себя приведение указанного образца в контакт с захватывающим антителом для получения комплекса, содержащего ИЛ-27 и захватывающее антитело, если ИЛ-27 присутствует в указанном образце, при этом указанное захватывающее антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, представленные в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанное захватывающее антитело иммобилизировано на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный образец приводят в контакт с указанным захватывающим антителом до приведения в контакт с указанным детектирующим антителом. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный образец представляет собой образец биологической жидкости организма. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный образец биологической жидкости организма представляет собой кровь, сыворотку крови, плазму крови, лизаты клеток или лизаты тканей.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения онкологическое заболевание выбрано из почечно-клеточной карциномы (ПКК), гепатоцеллюлярной карциномы, рака легкого, гастроэзофагеального рака, рака яичника, рака эндометрия, меланомы, лейкоза и лимфомы. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения онкологическое заболевание представляет собой почечно-клеточную карциному (ПКК). В других вариантах осуществления данного изобретения онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения онкологическое заболевание выбрано из лейкоза и лимфомы. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения онкологическое заболевание представляет собой острый миелоидный лейкоз (ОМЛ).

Примеры

В то время как данное изобретение было описано со ссылками на его конкретные аспекты, специалистам в данной области техники следует понимать, что могут быть выполнены различные изменения и эквиваленты могут быть заменены без отхода от истинной сути и объема данного изобретения. В дополнение к этому, могут быть произведены многочисленные модификации для того, чтобы адаптировать конкретную ситуацию, материал, композицию, процесс, технологические стадии или стадию к задаче, сути и объему данного изобретения. Все такие модификации включены в объем данного изобретения.

Пример 1. Получение антител против ИЛ-27 в дрожжах, которые специфически связывают субъединицы P28 ИЛ-27 человека.

Антитела против ИЛ-27, представляющие несколько эпитопных групп, были отобраны из восьми библиотек наивных человеческих антител синтетических дрожжей с использованием способов, описанных ниже.

Материалы и методы.

Восемь библиотек наивных человеческих антител в синтетических дрожжах, каждую численностью в ~10⁹, размножали так, как описано ранее (см., например, работу Xu et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26 (10): 663 - 670; патентные документы WO 2009036379; WO 2010105256; и WO 2012009568, каждая (каждый) из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Для первых двух раундов отбора применяли методику сортировки с магнитными микрогранулами с использованием системы Miltenyi MACS, как описано ранее (см., например, работу Siegel et al. (2004) J Immunol Methods 286 (1 - 2): 141 - 153, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

- 59 052811

Кратко, дрожжевые клетки (~10¹⁰ клеток на библиотеку) инкубировали с 3 мл биотинилированного антигена (рекомбинантный ИЛ-27 человека; R & D Systems) концентрацией 100 нМ в течение 30 мин при температуре 30°C в промывочном буфере (фосфатно-солевом буфере) (ФСБ)/0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА)). После однократной промывки с помощью 40 мл ледяного промывочного буфера клеточный осадок ресуспендировали в 20 мл промывочного буфера, к дрожжам добавляли стрептавидиновые микрогранулы (500 мкл) и инкубировали в течение 15 мин при температуре 4°С. Затем клетки дрожжей осаждали, ресуспендировали в 20 мл промывочного буфера и загружали в колонку Miltenyi LS. После загрузки 20 мл колонку промывали 3 раза по 3 мл промывочного буфера. Затем колонку удаляли из магнитного поля, клетки дрожжей элюировали с помощью 5 мл питательной среды и выращивали в течение ночи. Следующие раунды отбора проводили с помощью метода проточной цитометрии. Около 2*10⁷ клеток дрожжей осаждали, трижды промывали промывочным буфером и инкубировали при температуре 30°C либо с уменьшающимися концентрациями биотинилированного антигена (от 100 до 1 нМ) в равновесных условиях, либо с 30 нМ биотинилированных антигенов разных видов для получения видовой перекрестной реактивность, либо с реагентом снижения полиспецифичности (РСП, англ. PSR) для удаления неспецифических антител из отбора. Для РСП-истощения указанные библиотеки инкубировали с разведением 1:10 биотинилированного реагента РСП.

Затем клетки дрожжей дважды промывали промывочным буфером и окрашивали с помощью LCFITC (в разведении 1:100) и с помощью вторичных реагентов - либо SA-633 (в разведении 1:500), либо EAPE (в разведении 1:50) в течение 15 мин при температуре 4°С. После двукратной промывки промывочным буфером осадки клеток ресуспендировали в 0,3 мл промывочного буфера и переносили в сортировочные пробирки с фильтром. Сортировку проводили с использованием сортера FACS ARIA (BD Biosciences) с гейтированием для отбора антител с желаемыми характеристиками. Раунды отбора повторяли до тех пор, пока была получена популяция со всеми желаемыми характеристиками. После последнего раунда сортировки клетки дрожжей высевали и отбирали отдельные колонии для их характеризации.

Дифференциация легких цепей.

Протокол дифференциации легких цепей применяли на этапе первичного обнаружения для дальнейшего выявления и улучшения антител.

Протокол пакетной дифференциации легких цепей: плазмиды тяжелых цепей из исходного продукта наивной селекции экстрагировали из дрожжей методом smash and grab, размножали и затем очищали от E.coli и трансформировали в библиотеку легких цепей с разнообразием 5*106. Отбор проводили с помощью одного раунда MACS и четырех раундов FACS с использованием тех же условий, что и при наивном обнаружении.

Оптимизация антител.

Оптимизацию антител проводили путем внесения разнообразия в вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, как описано ниже.

Отбор CDRH1 и CDRH2: CDRH3 одного антитела рекомбинировали в предварительно созданную библиотеку с вариантами CDRH1 и CDRH2 с разнообразием 1*108 и проводили отбор с помощью одного цикла MACS и четырех раундов FACS, как описано для наивного обнаружения. В различных раундах FACS библиотеки проверяли на связывание с РСП, видовую перекрестную реактивность и давление аффинности путем титрования или предварительного комплексообразования родительских Fab, и выполняли сортировку для получения популяции с желаемыми характеристиками.

Получение и очистка антител.

Клоны дрожжей размножали до насыщения и затем индуцировали в течение 48 ч при температуре 30°C при встряхивании. После индукции клетки дрожжей осаждали, а надосадочные жидкости собирали для очистки. IgG очищали с использованием колонки с белком A и элюировали уксусной кислотой, рН=2,0. Фрагменты Fab получали путем расщепления папаином и очищали пропусканием через KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences).

Измерения KD по технологии ForteBio.

Измерения аффинности по технологии ForteBio выполняли на анализаторе Octet RED384, в общем так, как было описано ранее (см., например, работу Estep et al., High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs 5 (2), 270 - 278 (2013), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Кратко, измерения аффинности по технологии ForteBio выполняли путем загрузки IgG в режиме реального времени на сенсоры AHQ. Датчики уравновешивали в автономном режиме в буфере для анализа в течение 30 мин, а затем контролировали в режиме реального времени в течение 60 с для установления базового уровня. Сенсоры с загруженными IgG подвергали воздействию антигена в концентрации 100 нМ в течение 3 мин, а затем переносили в буфер для анализа на 3 мин для измерения скорости диссоциации. Всю кинетику анализировали с использованием модели связывания 1:1. В качестве антигена использовали рекомбинантный белок ИЛ-27 человека (R & D Systems, № по каталогу: 2526-IL). Результаты измерения аффинности антител против ИЛ-27 представлены на фиг. 1.

- 60 052811

Эпитоп-специфическая сортировка/блокирование лигандов по технологии ForteBio.

Эпитоп-специфическую сортировку/блокирование лигандов выполняли с помощью анализа перекрестной блокировки стандартного формата сэндвич. Контрольный IgG против мишени наносили на сенсоры AHQ, а незанятые сайты связывания Fc на сенсоре блокировали не представляющим интерес антителом IgG1 человека. Далее сенсоры подвергали воздействию целевого антигена в концентрации 100 нМ, а затем второго - воздействию антитела или лиганда против мишени. Дополнительное связывание вторым антителом или лигандом после ассоциации с антигеном указывает на незанятый эпитоп (неконкурирующий), в то время как отсутствие связывания указывает на блокирование эпитопа (блокирование конкурентом или лигандом).

Кинетический анализ по технологии MSD-РТР.

Измерения равновесной аффинности проводили так, как было описано ранее (Estep et al., 2013). Равновесное титрование в растворе (РТР, англ. SET) проводили в ФСБ + 0,1% БСА без иммуноглобулина IgG (БСАБИ, англ. PBSF) с постоянной концентрацией антигена в 10 - 100 пМ и инкубировали с 3-5-кратными серийными разведениями антител, начиная с 5 - 100 нМ (экспериментальные условия зависели от образца). Антителами (20 нМ в ФСБ) покрывали лунки стандартных планшетов MSD-ECL для связывания в течение ночи при температуре 4°C или при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем планшеты блокировали в течение 30 мин при встряхивании при 700 об/мин с последующими тремя промывками промывочным буфером (БСАБИ) + 0,05% Твин 20). Образцы для РТР наносили на планшеты и инкубировали в течение 150 с при встряхивании при 700 об/мин с последующей однократной промывкой. Антиген, захваченный на планшете, выявляли с помощью 250 нг/мл меченного сульфометкой стрептавидина в БСАБИ путем инкубации на планшете в течение 3 мин. Планшеты трижды промывали промывочным буфером, а затем считывали на анализаторе MSD Sector Imager 2400 с использованием буфера Read Buffer T однократной концентрации с поверхностно-активным веществом. Процент свободного антигена наносили на график как функцию оттитрованного антитела в программе Prism и встраивали в квадратичную модель для получения KD. Для повышения пропускной способности во всех экспериментах по технологии MSD-РТР, включая подготовку проб для РТР, использовались роботы для работы с жидкостями.

Пример 2. Связывание антител против ИЛ-27 с рекомбинантным ИЛ-27 человека.

Способность антител против ИЛ-27, описанных в примере 1, связываться с рекомбинантным ИЛ-27 человека оценивали с помощью ТИФА. Кратко, планшеты Nunc MaxiSorp ELISA (Affymetrix, № по каталогу: 44-2404-21) покрывали рекомбинантным ИЛ-27 человека (R & D Systems, № по каталогу: 2526IL/CF) в концентрации 100 мкл/лунку (0,5 мкг/мл разводили в ФСБ), запечатывали и инкубировали в течение ночи при температуре 4°C. Планшеты промывали 3 раза промывочным буфером (ФСБ + 0,01% Твин), по 100 мкл/лунку. Затем планшеты блокировали с помощью блокирующего буфера (ФСБ + 0,1% БСА + 0,01% Твин), по 200 мкл/лунку, в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) при встряхивании. Блокирующий буфер декантировали и добавляли по 100 мкл на лунку разбавленного контроля и антител против ИЛ-27, как указано. Для каждого антитела выполняли 10-точечное серийное разведение путем разбавления антител 1 : 10, начиная с максимальной концентрации в 1 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 1-2 ч при КТ при встряхивании. Планшеты промывали 3 раза промывочным буфером, по 100 мкл/лунку. Добавляли по 100 мкл/лунку вторичного антитела против IgG человека (SouthernBiotech; № по каталогу: 2014-05) (1:5000 разводили в блокирующей буфере). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при КТ. После 1-часовой инкубации планшеты промывали 3 раза промывочным буфером, по 100 мкл/лунку. Для проявления планшетов добавляли раствор тетраметилбензидина (ТМБ, англ. TMB; Life Technologies, № по каталогу: 00-2023) в буфере, по 100 мкл/лунку. Наблюдали развитие синей окраски в лунках стандартной кривой и, как только наибольшая концентрация разведенных контрольных антител достигала темно-синего цвета (5-10 мин), добавляли стоп-раствор (Thermo Fisher, № по каталогу: SS04), по 50 мкл/лунку (окраска менялась на желтую). Проявленные планшеты считывали при 450 нм (минус значение, считанное при 570 нм, для коррекции длины волны) в течение 30 мин после остановки реакции.

Например, исследования биохимической аффинности и специфичности показали, что антитело Ab1 против ИЛ-27 связывается с субъединицей p28 (но не с субъединицей EBI3) гетеродимерного цитокина ИЛ-27. Антитело Ab1 против ИЛ-27 связывалось с рекомбинантным ИЛ-27 человека, нечеловекообразных приматов и грызунов, и степень связывания различалась между видами. Специфичность связывания антитела Ab1 против ИЛ-27 подтвердили тестированием против панели из ~ 4500 молекул клеточной поверхности и растворимых молекул, а нецелевое связывание не наблюдалось. Также подтвердили специфичность связывания ИЛ-27 с его рецептором ИЛ-27РА (WSX-1); никакой другой рецептор клеточной поверхности не связывался с ИЛ-27 человека. Способность антитела Ab1 против ИЛ-27 блокировать взаимодействие между ИЛ-27 человека и ИЛ-27РА (WSX-1) подтвердили с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

Связывание описанных в данном документе антител оценивали в нескольких модельных системах. Поскольку ИЛ-27 человека биологически активен при применении на клетках мыши, применяли системную сверхэкспрессию ИЛ-27 человека у мышей с использованием миникольца ДНК для анализа

- 61 052811 эффектов, опосредованных ИЛ-27 in vivo, с помощью полногеномного мультиплексного анализа, проточной цитометрии и анализа сывороточных цитокинов. Результаты исследования многих из маркеров, которые модулировал ИЛ-27 in vivo, согласовываются с результатами анализов на клетках человека. Антитело Ab3 против ИЛ-27 также оценивали на модели диссеминированной опухоли B16. В данных условиях воздействие антителом Ab3 против ИЛ-27 показало результаты, соответствующие фенотипам, наблюдаемым у мышей с дефицитом различных компонентов лиганда ИЛ-27 (ИЛ-27р28, EBI3) или рецептора (ИЛ-27РА).

В совокупности данные исследования демонстрируют, что антитело Ab1 против ИЛ-27 (и родственное ему антитело Ab3 против ИЛ-27) могут фенокопировать дефицит ИЛ 27 у мышей, связываться с ИЛ-27 специфически и с высокой аффинностью, и могут ингибировать его иммуносупрессивные эффекты, как в отдельности, так и в комбинации с блокаторами PD-L1.

Пример 3. Антитела против ИЛ27 ингибируют фосфорилирование STAT1 in vitro.

Передача сигналов ИЛ-27 через рецептор ИЛ-27 (ИЛ-27Р) приводит к фосфорилированию полипептида STAT1 - трансдуктора сигналов и активатора транскрипции 1 (pSTAT1). Антитела против ИЛ-27, описанные в примере 1, исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованное ИЛ-27 фосфорилирование STAT1 в цельной крови человека, в МКПК человека, в миелоидных клетках U937 (клеточная линия гистиоцитарной лимфомы) и в клетках Т-клеточной лимфомы HUT-78 с помощью проточной цитометрии.

Антитела против ИЛ-27 исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованное ИЛ27 фосфорилирование STAT1 в цельной крови человека. Кратко, в данном анализе использовали цельную кровь человека с антикоагулянтом ЭДТА, хранившуюся при комнатной температуре. По 45 мкл крови распределяли в каждую лунку планшета с глубокими круглодонными лунками (Phenix, № по каталогу: 850356) и нагревали в течение 30 мин при температуре 37°C на нагревателе для планшетов (EchoTherm IC20) или в инкубаторе при температуре 37°C. Антитела против ИЛ-27 разводили до 10кратной максимальной концентрации в ФСБ, не содержащем эндотоксина (Teknova, № по каталогу: P0300) в полипропиленовом планшете с лунками с V-образным дном (Corning, № по каталогу: 3363). Антитела против ИЛ-27 серийно разбавляли до желаемой концентрации ФСБ, не содержащем эндотоксина. В лунки для нестимулированного и стимулированного контролей добавляли только ФСБ. По 5 мкл каждого разведения добавляли в лунку с 45 мкл крови и перемешивали встряхиванием на планшетном шейкере в течение 15 с при 1000 об/мин (Eppendorf Mix Mate). Планшет инкубировали в течение 60 мин при температуре 37°С на нагревателе для планшетов или в инкубаторе при температуре 37°С.

Флакон 10 мкг рекомбинантного ИЛ-27 человека (R & D Systems, № по каталогу: 2526-IL) восстанавливали до 100 мкг/мл путем добавления 100 мкл ФСБ + 0,1% БСА (изготовлено из 10% БСА, Sigma, № по каталогу: A1595). Рабочий раствор рекомбинантного чИЛ-27 (рчИЛ-27) готовили путем разведения до 200 нг/мл в ФСБ, не содержащем эндотоксина. После 60-минутной инкубации в каждую лунку со стимулированной кровью добавляли по 5 мкл рчИЛ-27 в концентрации 200 нг/мл. В нестимулированные контрольные лунки добавляли по 5 мкл ФСБ. Планшет встряхивали на шейкере в течение 15 с при 1000 об/мин. Планшет инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С.

После 30-минутной инкубации клетки фиксировали. Реактив Lyse/Fix (BD, № по каталогу: 558049) разбавляли 1:5 в стерильной воде (Hyclone, № по каталогу: SH3052902) и нагревали до температуры 37°С на водяной бане. По 500 мкл реактива Lyse/Fix добавляли в каждую лунку планшета с глубокими лунками и планшет встряхивали на шейкере для планшетов в течение 15 с при 1000 об/мин. Планшет инкубировали в течение 15 мин при температуре 37°С.

После 15-минутной инкубации планшет центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре (центрифуга Eppendorf 5810R) и удаляли надосадочную жидкость путем вытряхивания. В каждую лунку добавляли по 1 мл ФСБ, не содержащего эндотоксин, и планшет встряхивали на шейкере для планшетов в течение 15 с при 1000 об/мин. Планшет центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре (центрифуга Eppendorf 5810R) и удаляли надосадочную жидкость путем вытряхивания. Осадки клеток оставались в планшете.

Осадки клеток ресуспендировали в 50 мкл 1:200 реактива CD14-Pacific Blue (Biolegend, № по каталогу: 325616) в буфере для FACS (ФСБ, Gibco, № по каталогу: 14190-144/2% ФБС, Sigma, № по каталогу: F8317/1 мМ ЭДТА, Fisher, № по каталогу: BP2482) и переносили в 96-луночный планшет с Uобразным дном (Costar, № по каталогу: 3799). Планшет запечатывали с помощью пленки для планшетов (VWR, № по каталогу: 89134-432) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте.

После 30-минутной инкубации в каждую лунку добавляли по 150 мкл буфера для FACS и планшет центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл реактива Perm III (хранили при -20°C) (BD, № по каталогу: 558050) пипетированием, и планшет запечатывали с помощью пленки для планшетов и крышки. Планшет инкубировали в течение ночи при температуре -20°С или 15 мин при температуре 4°С.

После инкубации добавляли по 150 мкл ФСБ и планшет центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли из планшета путем

- 62 052811 вытряхивания и содержимое планшета ресуспендировали в 50 мкл смеси для окрашивания, приготовленной так, как описано в табл. 6 ниже.

Таблица 6

№ по каталогу BD	Антитело	Цвет	Разведение
561807	CD3	FITC	1:10
562069	Y701 pSTATl	РЕ	1:100
562071	Y705 pSTAT3	АРС	1:20

Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После инкубации в течение 1 ч добавляли100 мкл буфера для FACS и планшет центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли из планшета путем вытряхивания и содержимое планшета ресуспендировали в 100 мкл буфера для FACS для анализа с помощью проточной цитометрии.

Антитела против ИЛ-27, описанные в примере 1, исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованное ИЛ-27 фосфорилирование STAT1 в объединенных образцах МКПК человека с помощью проточной цитометрии. Кратко, замороженные криопробирки с МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) человека, полученными из лейкоцитарных пленок, извлекали из хранилища с жидким азотом и быстро оттаивали на водяной бане при температуре 37°С. Содержимое каждой криопробирки удаляли пипеткой P1000 и переносили в коническую пробирку Falcon объемом 15 мл. 2-3 мл полной среды RPMI-1640 (Gibco, № по каталогу: 61870-036) медленно добавляли к размороженным клеткам и ресуспендировали их осторожным взбалтыванием или встряхиванием. Конические пробирки заполняли до 10 мл полной средой RPMI-1640 и переворачивали пробирки для перемешивания их содержимого. Конические пробирки центрифугировали при 1400 об/мин при комнатной температуре в течение 8 мин.

Клетки МКПК ресуспендировали при плотности 4 миллиона клеток на мл в теплой бессывороточной среде RPMI-1640 и высевали при плотности 200000 клеток на лунку (в 50 мкл) в 96луночный планшет с круглодонными лунками (Costar, № по каталогу: 3799). Антитела против ИЛ-27 разводили в бессывороточной среде RPMI-1640 в первом ряду 96-луночного полипропиленового планшета до максимальной концентрации 40 мкг/мл (конечная концентрация будет составлять 10 мкг/мл). Выполняли серийные разведения до требуемых концентраций (1:2, 1:3, и т.д.) в оставшихся лунках первых 10 рядов планшета. По пятьдесят микролитров (мкл) исходного раствора антител (4*) добавляли в лунки первых 10 рядов планшета с клетками МКПК в планшете с круглодонными лунками. В ряды 11 и 12 добавляли по 50 мкл бессывороточной культуральной среды RPMI-1640. Затем планшет инкубировали при температуре 37°С в течение 2 ч.

После 2-часовой инкубации по 100 мкл рекомбинантного ИЛ-27 человека (R & D Systems, № по каталогу: 2526-IL), разбавленного до концентрации 50 нг/мл в бессывороточной культуральной среде RPMI-1640, добавляли в каждую лунку (за исключением контрольных лунок, которые содержали только бессывороточную среду или только антитело) до конечной концентрации 25 нг/мл. По 100 мкл бессывороточной культуральной среды RPMI-1640 добавляли в контрольные лунки или лунки с одним антителом. Планшет инкубировали в течение 20 мин при температуре 37°C.

После 20-минутной инкубации непосредственно в каждую лунку добавляли по 50 мкл 4% параформальдегида (ПФА, англ. PFA; Pierce, № по каталогу: 28906) в деионизированной воде и планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 5 мин для фиксации клеток. Планшет центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Среду удаляли путем вытряхивания и планшет промывали с помощью 150 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (ФСБД, англ. DPBS). Этапы промывки повторяли еще 2 раза. В каждую лунку с помощью 12 -канальной пипетки быстро добавляли по 50 мкл ледяного 90% метанола (MeOH) (Sigma, № по каталогу: 439193), разведенного в H₂O. При добавлении MeOH особое внимание уделялось перемешиванию содержимого в каждой лунке. Планшет инкубировали при температуре 20°C в течение по меньшей мере 15 мин. По 100 мкл ФСБД добавляли в каждую лунку поверх 90% метанола и планшет центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Содержимое планшета удаляли путем вытряхивания и планшет промывали 3 раза, как описано ранее. После последней промывки в лунках планшета оставались осадки клеток.

Осажденные МКПК окрашивали реактивом pSTAT1 PE (BD Phosflow, № по каталогу: 526069) 1:100 в буфере для FACS (2% ФСБ, 2 мМ ЭДТА в ФСБД) в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте. При добавлении красителя особое внимание уделялось перемешиванию содержимого в каждой лунке с помощью 12-канальной пипеткой. После 45-минутной инкубации в каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера для FACS и планшет центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную

- 63 052811 жидкость удаляли путем вытряхивания и планшет промывали 2 раза, как описано ранее. Клетки ресуспедировали в 100 мкл буфера для FACS и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Как показано на фиг. 2А, антитела против ИЛ-27 ингибировали фосфорилирование STAT1 в объединенных образцах МКПК человека. Антитело Ab3 против ИЛ-27 ингибировало фосфорилирования STAT1 со средним показателем IC₅₀, составляющим 140,5 нг/мл (n=2), в объединенных образцах МКПК человека. Антитело Ab1 против ИЛ-27 ингибировало фосфорилирования STAT1 со средним показателем IC₅₀, составляющим 58,3 нг/мл (n=3), в объединенных образцах МКПК человека.

Антитела против ИЛ-27 дополнительно исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованное ИЛ-27 фосфорилирование STAT1 в клетках U937 - клеточной линии, которая, как известно, экспрессирует рецепторы Fc, - с помощью проточной цитометрии, по существу так, как описано для фиг. 2А. Как показано на фиг. 2B, антитела против ИЛ-27 ингибируют фосфорилирование STAT1 в клетках U-937, как указано. Антитело Ab3 против ИЛ-27 ингибировало фосфорилирования STAT1 со средним показателем IC₅₀, составляющим 81 нг/мл (n=2), в клетках U937. Антитело Ab1 против ИЛ-27 ингибировало фосфорилирования STAT1 со средним показателем IC50, составляющим 96 нг/мл (n=2), в клетках U937.

Антитела против ИЛ-27 дополнительно исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованное ИЛ-27 фосфорилирование STAT1 в линии клеток кожной Т-клеточной лимфомы HUT78, которая не экспрессирует рецепторы Fc клеточной поверхности, с помощью проточной цитометрии, по существу так, как описано для фиг . 2А. Как показано на фиг. 2C, антитела против ИЛ-27 ингибируют фосфорилирование STAT1 в клетках HUT-78. Антитело Ab3 против ИЛ-27 ингибировало фосфорилирования STAT1 с показателем IC₅₀, составляющим 80 нг/мл (n=1), в клетках HUT-78. Антитело Ab1 против ИЛ-27 ингибировало фосфорилирования STAT1 с показателем IC₅₀, составляющим 95 нг/мл (n=1), в клетках HUT-78.

В данном изобретении также оценивали ингибирование ИЛ-27 антителом Ab1 против ИЛ-27 у разных видов в анализе цельной крови. Чтобы охарактеризовать активность антитела Ab1 против ИЛ-27 у разных видов, рекомбинантный ИЛ-27 человека, яванской макаки, крысы и мыши исследовали на предмет стимуляции ими передачи сигнала pSTAT1 в Т-лимфоцитах из образцов цельной крови, полученных от указанных видов (данные не показаны).

Кратко, цельную кровь нагревали до температуры 37°C с последующей 60-минутной предварительной инкубацией с антителом Ab1 против ИЛ-27 и добавляли ИЛ-27 человека в концентрации 20 нг/мл. Образцы инкубировали еще 30 мин. Лейкоциты фиксировали, а эритроциты лизировали. После промывки фиксированные клетки пермеабилизировали и окрашивали антителом против CD3 и антителом против ФосФо-STATI (Y701). После 1-часовой инкубации образцы промывали и ресуспендировали для проточной цитометрии. Процентное ингибирование рассчитывали с использованием стимулированных и нестимулированных контрольных лунок, а значения IC₅₀ рассчитывали с помощью GraphPad Prism.

Репрезентативные данные по ингибированию передачи сигнала, вызванному антитела Ab1 против ИЛ-27, в Т-клетках человека показаны на фиг. 3. В соответствии с наблюдениями, сделанными в отношении аффинности антитела Ab1 против ИЛ-27 у разных видов, активность ингибирования передачи сигнала ИЛ-27 с помощью антитела Ab1 против ИЛ-27 была наиболее высокой у человека, далее следует активность у яванской макаки, крысы и мыши (см., например, табл. 7).

Таблица 7

Значения IC₅₀ антитела Ат1 против ИЛ-27 в Т-клетках периферической крови разных видов

Виды	Средняя ICso, нг/мл	Стандартное отклонение	Количество
Человек	78,4	35	7
Яванская макака	118,1	36,4	4
Крыса	273,2	133,5	8
Мышь	1721	Н/П	1 (пул из 10)

Сокращения: IC₅₀=полумаксимальная ингибирующая концентрация, Н/П=неприменимо.

Пример 4. Снижение опосредованного ИЛ-27 ингибирования CD161 антителами против ИЛ-27.

CD161 - лектин С-типа - представляет собой маркер Т -клеток, экспрессия которого подавляется ИЛ-27. Антитела против ИЛ-27, описанные в примере 1, исследовали на предмет их способности обращать опосредованное ИЛ-27 ингибирование CD161 в объединенных образцах МКПК человека с помощью проточной цитометрии. Кратко, замороженные криопробирки с объединенными образцами МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) человека, полученными из лейкоцитарных пленок, извлекали из хранилища с жидким азотом и быстро оттаивали на водяной бане при температуре

- 64 052811

37°С. Содержимое каждой криопробирки удаляли пипеткой P1000 и переносили в коническую пробирку Falcon объемом 15 мл. 2-3 мл полной среды RPMI-1640 (Gibco, № по каталогу: 61870-036) медленно добавляли к размороженным клеткам и ресуспендировали их осторожным взбалтыванием или встряхиванием. Конические пробирки заполняли до 10 мл полной средой RPMI-1640 и переворачивали пробирки для перемешивания их содержимого. Конические пробирки центрифугировали при 1400 об/мин при комнатной температуре в течение 8 мин.

Использования внешних лунок избегали, чтобы свести к минимуму последствия испарения в течение 5-суточного исследования. Внешние лунки заполняли ФСБД, по 200 мкл на лунку (Gibco, № по каталогу: 14190-144). Клетки МКПК ресуспендировали при плотности 2 миллиона клеток на мл в теплой полной среде RPMI-1640. Очищенное антитело человека против CD3 (Biolegend, UCTH1, № по каталогу: 300402) добавляли в концентрации 0,5 мкг/мл (что в 2 раза выше, чем конечная концентрация). По 100 мкл на лунку указанной клеточной смеси (200000 клеток на лунку) высевали в 96-луночный планшет с круглодонными лунками (Costar, № по каталогу: 3799).

Антитела против ИЛ-27 разводили в полной среде RPMI-1640 в первом ряду 96-луночного полипропиленового планшета до максимальной концентрации 40 мкг/мл (конечная концентрация будет составлять 10 мкг/мл). Серийные разведения до требуемых концентраций (1:2, 1:3 и т.д.) выполняли в оставшихся лунках первых 10 рядов планшета. По 50 мкл исходного раствора антител (4*) добавляли в первые 10 рядов планшета - в лунки с клетками МКПК планшета с круглодонными лунками. В ряды 11 и 12 добавляли по 50 мкл полной среды RPMI-1640.

После добавления антител против ИЛ-27 в каждую лунку добавляли по 50 мкл рекомбинантного ИЛ-27 человека (R&D Systems, № по каталогу: 2526-IL), разведенного до концентрации 100 нг/мл в полной среде RPMI-1640 (за исключением контрольных лунок, которые содержали бессывороточную среду или только антитело), для получения конечной концентрации 25 нг/мл. В контрольные лунки добавляли по 50 мкл полной среды RPMI-1640. Планшет инкубировали на протяжении 5 суток при температуре 37°С в инкубаторе для клеточных культур, с минимальным вмешательством.

После 5-суточной инкубации планшет вынимали из инкубатора и встряхивали на шейкере для планшетов в течение 30 с при 600 об/мин. Планшет центрифугировали при 1800 об/мин в течение 5 минут. Среду удаляли и сохраняли для дополнительных анализов, а планшет промывали с помощью 150 мкл ФСБД (Gibco, № 14190-144). Промывку повторяли еще 2 раза. Клеточный осадок окрашивали с помощью 50 мкл на лунку смеси для окрашивания, как описано в табл. 8 ниже .

Таблица 8

№ по каталогу (Biolegend)	Мишень антитела	Цвет	Разведение
300532	CD4	BV421	1:100
304204	CD45RO	FITC	1:100
339910	CD161	AF647	1:100
353410	CCR6	РЕ	1:100

Планшет встряхивали на шейкере в течение 30 с при 600 об/мин и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.

После 30-минутной инкубации планшет центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость путем вытряхивания. Планшет промывали 2 раза, как описано ранее. После последней промывки клеточный осадок фиксировали добавлением 50 мкл 4% ПФА (Pierce, № по каталогу: 28906) в деионизированной воде при комнатной температуре в течение 10 мин. В каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера для FACS и центрифугировали планшет при 1800 об/мин в течение 5 мин. Клетки ресуспедировали в 100 мкл буфера для FACS и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Как показано на фиг. 4, антитела против ИЛ-27, как указано, снижают опосредованное ИЛ-27 ингибирование CD161.

Пример 5. Усиление опосредованной PD-1 секреции ФНО-α, ИЛ-6 и других цитокинов антителами против ИЛ-27, включая дополнительную характеризацию антител против ИЛ -27 in vitro.

Антитела против ИЛ-27 исследовали на предмет их способности усиливать опосредованную PD-1 секрецию ФНО-α и ИЛ-6 в клетках МКПК человека, полученных от пациентов с онкологическими заболеваниям. Клетки МКПК человека, полученные от пациентов с онкологическими заболеваниями, культивировали по существу так, как описано в примере 4, с добавлением лунок, в которые добавляли также антитело против PD-1, как указано, в концентрации 1 мкг/мл. Надосадочные жидкости из данного исследования анализировали в отношении ФНО-α и ИЛ-6 с использованием набора для мультиплексного анализа цитокинов человека CBA Th1/Th2/Th17 Kit (BD, № по каталогу: 560484). Как показано на фиг. 5A и 5B, антитела против ИЛ-27 усиливают опосредованную PD-1 секрецию ФНО-α и ИЛ-6 в объединенных образцах клеток МКПК человека.

- 65 052811

Описанные в данном документе результаты исследований также демонстрируют цитокининдуцирующую активность антитела Ab1 против ИЛ-27 в виде монотерапии и в комбинации с антителом против PD-1 в МКПК человека. Известно, что ИЛ-27 отрицательно регулирует экспрессию ряда воспалительных цитокинов. Чтобы определить влияние блокады ИЛ-27 на продукцию цитокинов, МКПК человека, полученные от здоровых доноров, пациентов с ПКК и пациентов с раком яичника, активировали с помощью антитела против CD3 в присутствии или в отсутствие антитела Ab1 против ИЛ27 в течение нескольких суток и исследовали уровни секретируемых ими цитокинов, включая ИЛ-17, ИФН-γ (ИФН-гамма), ФНО-α (ФНО-альфа) и ИЛ-6. Кратко, МКПК, выделенные из свежей цельной крови 4 здоровых доноров, 5 пациентов с ПКК и 2 пациентов с раком яичника, активировали с помощью антитела против CD3 в концентрации 0,25 мкг/мл в отсутствие или в присутствии антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл), антитела против PD 1 (пембролизумаб, 1 мкг/мл) или обоих антител. Через 5 суток надосадочные жидкости собирали и исследовали в них уровни ФНО-α (A) или ИФН-γ (B) с помощью технологий MSD или CBA. Показанные данные представляют собой кратность изменения продукции цитокинов по сравнению со стимуляцией только антителом против CD3. Статистический анализ выполняли на основании парного t-критерия (*p < 0,005).

В указанных анализах антитело против PD-1 использовали в качестве контроля, а также исследовали комбинацию блокады PD-1 и ИЛ-27, как показано на фиг. 5С. Обработка антителом Ab1 против ИЛ-27 привела к увеличению продукции ФНО-α в 6 из 11 исследованных образцов МКПК (определялось как увеличение в > 2 раза), включая 2 из 4 здоровых доноров, 3 из 5 пациентов с ПКК и 1 из 2 пациентов с раком яичника. При исследовании у подгруппы доноров указанная активность зависела от дозы антитела Ab1 против ИЛ-27 (данные не показаны). Воздействие антителом против PD-1 (пембролизумаб) привело к повышению уровня ФНО-α у 2 из 11 исследованных доноров (1 из 5 с ПКК и 1 из 2 с раком яичника), в то время как комбинация антитела Ab1 против ИЛ-27 и антитела против PD-1 привела к повышению у 10 из 11 доноров. Повышение ФНО-α, наблюдаемое в условиях комбинированного лечения, оказалось аддитивным в 8 из 10 образцов клеток, ответивших на указанное воздействие. Аддитивный эффект продуцирования ИФН-γ наблюдался в этих культурах после обработки антителом Ab1 против ИЛ-27 и антителом против PD-1 (10 из 11 доноров); тем не менее, ответы на воздействие одним только антителом против PD-1 наблюдались чаще (10 из 11 доноров) по сравнению с воздействием антителом Ab1 против ИЛ-27 (2 из 11 доноров). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что антитела Ab1 против ИЛ-27 повышает уровни ФНО-α в активированных культурах МКПК от здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями, а комбинация воздействия антителом Ab1 против ИЛ-27 и антителом против PD-1 приводит к более высоким уровням ФНО-α и ИФН-γ по сравнению с любым из указанных воздействий отдельно.

Для дальнейшего изучения роли блокады ИЛ-27 и PD-1 использовали ту же систему активированного культивирования МКПК, чтобы определить, может ли ИЛ-27 непосредственно противодействовать эффекту повышенной продукции цитокинов, вызванной блокадой PD-1. Кратко, свежевыделенные МКПК из цельной крови человека активировали с помощью антитела против CD3 в концентрации 0,25 мкг/мл. На клетки воздействовали либо контрольным IgG1 (1 мкг/мл), антителом αPD-1 (пембролизумаб, 1 мкг/мл) отдельно, рчИЛ-27 (25 нг/мл) плюс αPD-1 или рчИЛ-27 плюс αPD-1 с антителом Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл) при температуре 37°С в течение 5 суток. Надосадочные жидкости собирали для обнаружения цитокинов по технологии CBA. В качестве примера показаны результаты определения цитокинов (ИЛ-17А и ИФН-γ) в образцах от 4 здоровых доноров как кратность изменения по сравнению с контролем. Показаны среднее значение и стандартное отклонение. Статистический анализ выполняли на основании парного t-критерия (* p < 0,05, ** p < 0,01). Похожие результаты также наблюдались для МКПК от пациентов с ПКК. Блокада PD-1 повышала как ИЛ-17, так и ИФН-γ в данных культурах, и ИЛ-27 мог полностью ингибировать указанную активность - ответ, который был обращен в присутствии антитела Ab1 против ИЛ-27, как показано на фиг. 5D. Указанные данные показывают, что ИЛ-27 может ослаблять эффекты на продукцию цитокинов, вызванные воздействием антителом против PD-1.

Таким образом, было показано, что ИЛ-27 ингибирует опосредованную антителом против PD-1 продукцию провоспалительных цитокинов в активированных МКПК человека - эффект, который блокировался антителом Ab1 против ИЛ-27. Более того, антитело Ab1 против ИЛ-27 в комбинации с блокадой PD-1 приводило к повышенной продукции цитокинов в активированных МКПК от здоровых доноров и пациентов с ПКК. Таким образом, блокада ИЛ-27 антителом Ab1 против ИЛ-27 усиливает активацию клеток иммунной системы путем изменения экспрессии иммунорегуляторных рецепторов и повышения продукции воспалительных цитокинов.

В дополнение к характеризации отдельных антител против ИЛ -27 в присутствии антитела против ИЛ-27 (в данном документе - антитела Ab1 против ИЛ-27), антитела αPD-1 или комбинации антитела против ИЛ-27 и антитела αPD-1, выполняли дальнейшую характеризацию индукции/секреции цитокинов (фиг. 5E-5H, конкретно для ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ-6 и ИЛ-17А).

Пример 6. Ингибирование опосредованной ИЛ-27 экспрессии PD-L1 и TIM3 антителами против ИЛ-27.

- 66 052811

Антитела против ИЛ-27, описанные в примере 1, исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 и TIM-3 в объединенных образцах моноцитов человека с помощью проточной цитометрии.

Свежие моноциты выделяли из лейкоцитарной пленки человека с использованием смеси для обогащения моноцитов человека ROSETTESEP ™ (Stemcell, № по каталогу: 15068).

Использования внешних лунок избегали, чтобы свести к минимуму последствия испарения в течение 5-суточного исследования. Внешние лунки заполняли ФСБД, по 200 мкл на лунку (Gibco, № по каталогу: 14190-144).

Моноциты ресуспендировали при плотности 2 миллиона клеток на мл в теплой полной среде RPMI1640. По 100 мкл на лунку указанной клеточной смеси (200000 клеток на лунку) высевали в 96-луночный планшет с круглодонными лунками (Costar, № по каталогу: 3799).

Антитела против ИЛ-27 разводили в полной среде RPMI-1640 в первом ряду 96-луночного полипропиленового планшета до максимальной концентрации 40 мкг/мл (конечная концентрация составит 10 мкг/мл). Выполняли серийные разведения до требуемых концентраций (1 : 2, 1 : 3, и т. д.) в оставшихся лунках первых 10 рядов планшета. По 50 мкл исходного раствора антител (4*) добавляли в лунки первых 10 рядов планшета с клетками МКПК в планшете с круглодонными лунками. В ряды 11 и 12 добавляли по 1250 мкл полной среды RPMI-1640.

После добавления антител против ИЛ-27 в каждую лунку добавляли по 50 мкл рекомбинантного ИЛ-27 человека (R&D Systems, № по каталогу: 2526-IL), разведенного до концентрации 80 нг/мл в полной среде RPMI-1640 (за исключением контрольных лунок, которые содержали бессывороточную среду или только антитело), для получения конечной концентрации 20 нг/мл. В контрольные лунки добавляли по 100 мкл бессывороточной среды RPMI-1640. Планшет инкубировали в течение 3 суток при температуре 37°C с минимальным вмешательством.

После 3-суточной инкубации планшет вынимали из инкубатора и встряхивали на шейкере для планшетов в течение 30 с при 600 об/мин. Планшет центрифугировали при 1800 об/мин в течение 5 минут. Среду удаляли путем вытряхивания и планшет промывали с помощью 150 мкл ФСБД (Gibco, № по каталогу: 14190-144). Промывку повторяли дважды. Клеточный осадок окрашивали с помощью 50 мкл на лунку смеси для окрашивания, как описано в табл. 9 ниже:

Таблица 9

№ по каталогу (Biolegend)	Мишень антитела	Цвет	Разведение
345006	TIM3	РЕ	1:100
301310	CDllb	АРС	1:100
329714	PD-L1	BV421	1:100

Планшет встряхивали на шейкере в течение 30 с при 600 об/мин и инкубировали в течение 30 мин температуре 4°C в темноте.

После 30-минутной инкубации планшет центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость путем вытряхивания. Планшет промывали 2 раза, как описано ранее. После последней промывки клеточный осадок фиксировали добавлением 50 мкл 4% ПФА (Pierce, № по каталогу: 28906) в деионизированной (ДИ) воде при комнатной температуре в течение 10 мин. В каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера для FACS и центрифугировали планшет при 1800 об/мин в течение 5 мин. Клетки ресуспедировали в 100 мкл буфера для FACS и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Как показано на фиг. 6A и 6B, антитела против ИЛ-27 активно ингибируют опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 и TIM3 в объединенных образцах моноцитов человека.

Антитела против ИЛ-27 дополнительно исследовали на предмет их способности ингибировать опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 в покоящихся Т-клетках (инактивированных), по существу так, как описано для фиг. 6A и 6B. Покоящиеся выделяли из лейкоцитарной пленки человека с использованием смеси для обогащения Т-клеток человека ROSETTESEP™ (Stemcell, № по каталогу: 15061).

В конечной стадии анализа клеточные осадки окрашивали с помощью 50 мкл на лунку смеси для окрашивания, как описано в табл. 10 ниже:

- 67 052811

Таблица 10

№ по каталогу (Biolegend)	Мишень антитела	Цвет	Разведение
345006	TIM3	РЕ	1:100
555349	CD4	АРС	1:100
329714	PD-L1	BV421	1:100
555366	CD8	FITC	1:100

Планшет встряхивали на шейкере для планшетов в течение 30 с при 600 об/мин и инкубировали в течение 30 мин температуре 4°C в темноте.

После 30-минутной инкубации планшет центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость путем вытряхивания. Планшет промывали 2 раза, как описано ранее. После последней промывки клеточный осадок фиксировали добавлением 50 мкл 4% ПФА (Pierce, № по каталогу: 28906) в ДИ-воде при комнатной температуре в течение 10 мин. В каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера для FACS и центрифугировали планшет при 1800 об/мин в течение 5 мин. Клетки ресуспедировали в 100 мкл буфера для FACS и анализировали с помощью проточной цитометрии. Как показано на фиг. 6C, антитела против ИЛ-27 активно ингибируют опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 в объединенных образцах покоящихся Т-клеток человека.

Пример 7. Эффективность антитела против ИЛ-27 in vivo в модели диссеминированной меланомы B16F10.

Модель метастазирования меланомы в легкие использовали для оценки противоопухолевой активности блокады ИЛ-27 с использованием клинического кандидатного антитела Ab1 против ИЛ-27. Известно, что рост диссеминированных метастазов B16F10 в легкие значительно снижен у мышей с дефицитом EBI3 и Il27ra (Wsx-1) (Sauer et al., J. Immunology 181: 6148 - 6157). Поскольку размер узелков в легких и кинетика роста зависят от количества перенесенных клеток B16F10 и могут развиваться вариабельно и быстро, комбинация антитела против PD-1 и антитела против CTLA-4 изучалась в качестве референсной терапевтической активности. Предварительное воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 привела к значительному снижению общей массы опухоли.

Кратко, самкам мышей C57BL/6 (п=10/группу) в возрасте от шести до восьми недель инокулировали внутривенно (в/в) либо 2,5*105 клеток B16F10, либо 1*105 клеток B16-Luc через хвостовую вену в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Животным вводили внутрибрюшинной инъекцией (в/бр) антитело Ab1 против ИЛ-27 (в дозе 1 мг) (Wuxi; лот № 2108SD170316K01X01I01) или поликлональный изотипический контроль IgG человека (в дозе 1 мг) (Bioxcell; № по каталогу: BE0092; лот № 658417D1). Антитела вводили один раз в неделю, начиная с 7-х суток до инъекции опухоли, всего вводили четыре дозы (сутки -7, 0, 7 и 14). Для визуального подсчета метастазов в легких мышей с опухолями B16F10 подвергали эвтаназии путем асфиксии в CO₂ через 18 суток после инъекции опухолевых клеток, а легкие перфузировали ФСБ посредством сердечной пункции, удаляли и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине на протяжении 24 ч. Затем фиксированные легкие переносили в 70% этанол и визуально подсчитывали поверхностные метастазы в легких. Для иммуногистохимического анализа фиксированные формалином легкие (п=5/группу) заливали в парафин, делали срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином для количественного определения общей площади опухоли в процентах от общей площади ткани в каждом срезе. Для визуализации метастазов опухоли в легких in vivo животным с опухолью B16-Luc вводили в/в через хвостовую вену по 3 мг VivoGlo D-люциферина в 200 мкл ФСБ (Promega) два раза в неделю. Через пять минут после инъекции люциферина животных анестезировали и проводили биолюминесцентную визуализацию с использованием устройства для визуализации IVIS Lumina LT Series III. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Living Image (версия 4.5.5) и данные отображали в виде измерений общего потока в фотонах в секунду (фотоны/секунду).

Как показано на фиг. 7A - 7G, воздействие на мышей с опухолями B16F10 антителом против ИЛ-27 - антителом Ab1 против ИЛ-27 приводило к значительному снижению общей опухолевой массы, измеренному на основании как общего числа поверхностных метастазов в легких (число легочных узелков, фиг. 7A), так и уменьшения площади опухоли в срезах легочной ткани с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа (фиг. 7C - 7F и фиг. 7G). Блокада p28 с помощью антитела Ab1 против ИЛ-27 привела к снижению числа легочных узелков B16 на 42% по сравнению с воздействием изотипическим контролем. Воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 значительно ингибировало (p=0,0079) рост легочных метастазов B16F10 по сравнению с воздействием изотипическим контролем (21,6 ± 8,4 по сравнению 37,6 ± 10,9 легочных узелков, соответственно). Воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 привело к уменьшению общей площади метастазов опухоли в легких на 83% по данным

- 68 052811

ИГХ (16,43 ± 1,39% в группе изотипического контроля по сравнению с 2,83 ± 1,45% в группе воздействия антителом Ab1 против ИЛ-27). Подобным образом биолюминесцентная визуализация показала, что воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 значительно (p=0,0062) задерживает рост метастазов B16-Luc в легких (фиг. 7B). Сходное снижение числа поверхностных метастазов в легких и общей площади опухоли наблюдалось при блокаде, опосредованной антителами против ИЛ-27РА (WSX1), и при применении комбинированной терапии антителом против PD-1 и антителом против CTLA-4, как показано в фиг. 7G. Указанные данные получены в 2 независимых экспериментах, в которых референсная комбинация антитела против PD-1 и антитела против CTLA-4 продемонстрировала противоопухолевую активность. Клетки B16F10 (по 2,5*105) вводили внутривенно мышам C57BL/6 (п=10/группу). Мышам внутрибрюшинно вводили 1 мг либо антитела Ab1 против ИЛ-27, либо антитела против ИЛ-27РА (WSX-1), либо изотипического контрольного антитела IgG человека (сутки -7, 0, 7, 14). Некоторым животным внутрибрюшинно вводили антитело против PD-1 и антитело против CTLA-4 (сутки 0, 4, 7 и 11). Легкие получали из животных (п=5/группу) с метастазами B16F10 в легких, на которых воздействовали так, как описано выше, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Опухолевую ткань B16F10 отличали от нормальной легочной ткани на основании окрашивания гематоксилином и эозином срезов легких обработанных животных (фиг. 7А). Площадь опухоли рассчитывали как процент от общей площади легких (фиг. 7G). Статистический анализ выполняли на основании парного t-критерия. В совокупности эти данные указывают на то, что антитело Ab1 против ИЛ-27 может фенокопировать дефицит ИЛ-27РА (WSX-1) и EBI3 в модели опухоли и проявляет активность, сходную с комбинированной блокадой PD-1 и CTLA-4.

Указанные данные демонстрируют, что воздействие антителом против ИЛ-27 (антителом Ab1 против ИЛ-27) приводит к противоопухолевым эффектам, уменьшая как рост опухоли, так и метастазирование в большей степени, чем лечение контрольным изотипическим антителом, которое не связывает ИЛ-27.

Пример 8. Определение профилей экспрессии генов в спленоцитах, полученных от мышей, гидродинамически трансфицированных миникольцами ИЛ-27 человека.

Чтобы изучить влияние ИЛ-27 на фенотип Т-клеток in vivo, миникольца ДНК, кодирующие ИЛ-27, использовали для сверхэкспрессии ИЛ-27 у мышей, а ответы Т-клеток оценивали с помощью секвенирования РНК и проточной цитометрии. Известно, что ИЛ-27 человека представляет собой перекрестно-реактивный иммуноглобулин и может индуцировать передачу сигналов pSTAT1 и PD L1 в спленоцитах мыши in vitro. Данную видовую перекрестную реактивность использовали для изучения эффектов сверхэкспрессии ИЛ-27 человека на мышах и ее ингибирования антителом Ab1 против ИЛ-27. Для этого миникольца ДНК-плазмиды, кодирующие ИЛ-27 человека (p28, связанный с EBI3 глицинсериновым линкером), вводили мышам с помощью гидродинамической трансфекции, как описано ниже, что приводило к высоким системным уровням ИЛ-27.

Гидродинамическая трансфекция миниколец ИЛ-27 человека.

Шестинедельным самкам мышей BALB/c вводили по 20 мкг либо пустого вектора, либо связанной миникольцевой ДНК ИЛ-27 человека (System Biosciences, г. Пало-Альто, штат Калифорния, США) в 2 мл 0,9% физиологического раствора через хвостовую вену в течение 5 с. После инъекции животных перемещали в пустую клетку с грелкой для восстановления в течение 5 мин. Цельную кровь собирали в пробирки с K2-EDTA для отделения плазмы через 24 часа после инъекции миникольца, и уровни ИЛ-27 в плазме подтверждали с помощью ТИФА. МКПК и общие спленоциты собирали через 5 суток после трансфекции, клетки окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Экспрессию указанных маркеров анализировали на CD4⁺ Т-клетках и на CD8⁺ Т-клетках. Анализ проводили с помощью программного обеспечения FlowJo.

Определение профилей экспрессии генов.

Спленоциты мышей получали путем механической диссоциации целых селезенок с последующим лизисом эритроцитов аммоний - хлоридно - натриевым буфером (АХН, англ. АСК). Общую РНК экстрагировали из спленоцитов с помощью набора реактивов RNEASY® Mini Kit (Qiagen, № по каталогу: 74104) и доводили до 20 нг/мкл в воде, не содержащей нуклеаз (Qiagen, № по каталогу: 19101). Определение профилей экспрессии генов проводили на чипах GENECHIP™ Mouse Gene 2.0 ST Arrays (Applied Biosystems, № по каталогу: 902118). Обработку образцов РНК, гибридизацию и сканирование чипов проводили с использованием стандартных протоколов Affymetrix GENECHIP™ в Ресурсе микрочипов и секвенирования Бостонского университета (BUMSR). Все файлы CEL нормализовали с помощью метода Robust Multi-array Average (RMA) (Irizarry et al., 2003), а данные об экспрессии генов предварительно обрабатывали путем удаления неэкспрессированных зондов и отбрасывания транскриптов с высоким межповторным коэффициентом дисперсии. Последующие анализы (средняя экспрессия, кратность изменения, t-критерий) выполняли в программе R (версия R 3.6.2).

Проточный цитометрический анализ.

Цельную кровь и селезенку получали из мышей через пять суток после инъекции миникольца. Спленоциты получали из мышей, экспрессирующих ИЛ 27, через 5 суток после трансфекции. Суспензии одиночных спленоцитов готовили путем механической диссоциации через нейлоновый клеточный

- 69 052811 фильтр с размером ячеек 40 мкм с последующим лизисом эритроцитов в буфере АХН. Цельные клетки крови окрашивали напрямую с последующим лизисом и фиксацией эритроцитов в буфере BD Phosflow Lyse/Fix в соответствии с инструкциями производителя (BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США). FcyRIII/II блокировали путем предварительной инкубации клеток с моноклональным антителом (мАт) крысы против CD16/CD32 мыши (1 мкг на миллион клеток; Biolegend, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США) в ФСБ с 2% ФБС и 2 мМ ЭДТА. Клетки окрашивали с помощью APC-, PE-, Brilliant Violet 510- и Brilliant Violet 711-конъюгированных мАт против CD4 (клон GK1.5), CD8 (53-6.7), PD-L1 (10F.9G2), TIM3 ( RMT3-23), LAG3 (C9B7W) и TIGIT (1G9) мыши (Biolegend). Связанную с клетками флуоресценцию измеряли с использованием проточного цитометра LSRFortessa X-20 (BD Biosciences), а анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, г. Ашленд, штат Орегон, США).

Статистический анализ.

Статистическую значимость определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism с использованием парного, непарного критерия Стьюдента или отношения Стьюдента, как указано. Когда использовался критерий отношения t, к нулевым значениям добавляли 0,1, чтобы сделать их ненулевыми. Значения р меньше чем 0,05 считали значимыми.

ИЛ-27 способствует экспрессии ингибиторных рецепторов Т-клетками in vivo.

Экспрессия более чем 400 генов изменилась в > Log2 раза в ответ на введение ИЛ-27, как показано на фиг. 8А. Подмножество данных генов показано в табл. 11A - 11B. Среди данных генов были те, которые кодируют иммуноингибиторные рецепторы, играющие ключевую роль в иммунном ответе. Как показано на фиг. 8B, экспрессия Ly6a (кодирует Sca-1), Lag3, Tigit и ИЛ-10 повысилась на спленоцитах в ответ на ИЛ-27. Также наблюдалась тенденция к опосредованному ИЛ-27 повышению экспрессии Ctla4 и Cd274 (кодирует PD-L1), которое представляло собой индукцию в меньше чем 1 раз (данные не показаны). Для проверки указанных данных об экспрессии использовали проточную цитометрию для оценки экспрессии белков PD-L1, LAG-3, TIGIT и TIM-3 на Т-клетках указанных мышей. Введение миниколец ИЛ-27 приводило к повышению экспрессии PD-L1, LAG-3 и TIGIT в CD4⁺ Т-клетках селезенки и периферической крови (МКПК). В CD8+ Т-клетках миникольца ИЛ-27 повышали PD-L1, LAG-3, TIGIT и TIM-3. Как показано на фиг. 8C - 8F, введение миниколец ИЛ-27 приводило к повышению PD-L1, Lag-3 и Tigit в CD4⁺ Т-клетках селезенки и периферической крови. В CD8⁺ Т-клетках миникольца ИЛ-27 повышали PD-L1, Lag-3, Tigit и Tim-3. Указанные данные свидетельствуют о том, что ИЛ-27 может играть ключевую роль в управлении экспрессией иммунорегуляторных рецепторов in vivo.

Чтобы исследовать способность антитела Ab1 блокировать ИЛ-27 человека, полученный из миникольца, in vivo, изучали как взаимодействие с целевой молекулой с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), так и экспрессию иммунорегуляторного рецептора в спленоцитах. Через пять суток после трансфекции ИЛ-27 и воздействия антителом Ab1 против ИЛ-27 (50 мг/кг) у мышей собирали плазму для анализа уровней гетеродимера ИЛ-27 и EBI3 с помощью технологии Meso Scale Discovery (MSD). В анализе гетеродимера ИЛ-27 использовали захватывающее антитело против p28, которое перекрестно блокирует антитело Ab1 против ИЛ-27, и специфичное для человека детектирующее антитело против EBI3; следовательно, если антитело Ab1 против ИЛ-27 связано с ИЛ-27, то его обнаружение будет замаскировано. В анализе EBI3 использовали как захватывающие, так и детектирующие антитела, специфичные к 2 различным эпитопам EBI3 человека, и, поскольку полученный из миникольца ИЛ-27 представляет собой связанный гетеродимер, данный анализ позволяет обнаруживать общий ИЛ-27 независимо от связывания с антителом Ab1 против ИЛ-27.

Кратко, самкам мышей Balb/c возрастом 6 недель вводили пустой вектор (контроль) или ИЛ-27 человека. На мышей воздействовали 1 мг либо антитела Ab1 против ИЛ-27, либо изотипического контрольного антитела IgG1 против DNP за 7 суток до и в день трансфекции миниколец (сутки -7 и 0). Собирали цельную кровь и анализировали плазму крови на наличие ИЛ-27 (фиг. 8G) с помощью технологии Meso Scale Discovery.На фиг. 8G показано, что воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 полностью ингибирует обнаружение ИЛ-27 в плазме с помощью MSD. Похожие данные получили при исследовании антитела Ab1 против ИЛ-27 в дозе 25 мг/кг. Указанные данные свидетельствуют о том, что антитело Ab1 против ИЛ-27 в дозе 25 мг/кг или выше может полностью насыщать ИЛ-27, полученный из миникольца, in vivo. Данное полное взаимодействие с целевой молекулой также подтвердили в функциональном анализе pSTAT1.

Для оценки способности антитела Ab1 против ИЛ-27 блокировать активность ИЛ-27 in vivo анализировали экспрессию PD L1, Tim-3, Lag-3 и Tigit в МКПК и спленоцитах мыши с помощью проточной цитометрии. Антитело Ab1 против ИЛ-27 значительным образом блокировало индуцированную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 и Lag 3 в CD4+ МКПК и экспрессию PD-L1, Tim-3, Lag-3 и TIGIT в CD8+ МКПК.

Воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 также блокировало индуцированную ИЛ-27 экспрессию PD-L1, Lag-3 и TIGIT в CD4+ спленоцитах и экспрессию PD-L1 и Lag 3 в CD8+ спленоцитах. Указанные данные свидетельствуют о том, что антитело Ab1 против ИЛ-27 может как взаимодействовать, так и блокировать активность ИЛ-27 человека in vivo.

- 70 052811

Данные результаты демонстрируют, что эктопическая экспрессия ИЛ-27 in vivo приводит к повышению Т-клетками множества ингибирующих рецепторов и некоторых других молекул с иммуномодулирующей активностью в спленоцитах. Указанные данные свидетельствуют о том, что антагонизм в отношении ИЛ-27 (например, вызванный путем лечения антителом против ИЛ-27) будет снижать экспрессию ингибиторных рецепторов на Т-клетках, тем самым усиливая иммунный ответ.

Таблица ПА

Активация генов в ответ на введение ИЛ-27

Обозначение гена	Кратность изменения	р-значенне		Оботначение гена	Кратность изменения	p- зпачепие
GM4841	3,824228667	0,012331653		SLC26A3	2,286	0,3487
LY6A	3,568709	0,000991642		DPCR1	2,285	0,0653
IIGP1	3,294783	0,000455248		GM 11844	2,279	0,1054
TUBB1	3,145617	0,002782618		CYP4A32	2,269	0,2133
МРО	3,112051333	0,026667968		MIR1928	2,267	0,0134
CTSG	2,954178333	0,018177934		GKN3	2,266	0,3840
РРВР	2,878417333	0,006623845		KRT4	2,264	0,1539
ELANE	2,845762333	0,024770656		PGC	2,262	0,2583
МТ2	2,757525667	0,004548988		HIST1H2BA	2,260	0,0390
MUCH	2,696042667	0,018195326		SPRR2A3	2,254	0,1974
F83OO16BO8RIK	2,603319667	0,011330985		IGKV12-41	2,235	0,3548
GM4951	2,583066667	0,01529863		PARD3BOS3	2,227	0,1149
APOL11В	2,565688667	0,006885943		CLCA4B	2,225	0,4177
GZMB	2,515642667	0,004012308		GM23744	2,208	0,1217
PRTN3	2,450033	0,028785527		VMN2R-PS129	2,200	0,0021
CLCA3A1	2,345778333	0,018175529		GM23241	2,194	0,1644
GM11505	2,331628667	0,023451392		MYOZ2	2,191	0,2091
ИЛ-10	2,324278	0,008857442		MIR192	2,191	0,0553
GBP 11	2,307386	0,005204674		MY111	2,188	0,1653
PF4	2,270045	0,016210658		5033403H07RIK	2,187	0,1231
IRG1	2,269440667	0,003861367		MIRLET7F-2	2,186	0,1617
CES2G	2,252403333	0,033921335		GM25009	2,185	0,1243
OASL2	2,243393	0,00470682		MUC13	2,182	0,4412
LAG3	2,203067	0,002539095		PPP1R3A	2,178	0,1968
II1ST1H2AG	2,197938	0,03499933		OLFR798	2,172	0,0036
OAS1G	2,184084667	0,007645573		SERPINA12	2,154	0,0309
MFSD2B	2,179382333	0,030664254		GM25864	2,152	0,0404
RI1AG	2,146212667	0,072130267		N-R5S155	2,151	0,0691

-71 052811

T1G1T	2,145155	0,005421349		CYP2C65	2,142	0,1438
SLC6A4	2,121439	0,009945773		GM 14750	2,141	0,0525
SHCBP1	2,092208667	0,038685767		GM23026	2,134	0,0863
BC023105	2,079652	0,002582842		HAMP2	2,125	0,2675
PKLR	2,045597333	0,053459171		GM24527	2,125	0,0777
TFR2	2,037887333	0,033394313		OLFR891	2,125	0,0731
F13A1	2,010803333	0,010612157		OLFR68	2,125	0,1746
HIST1H2AB	2,002687333	0,025241		TRAV6-2	2,123	0,1684
SERPINA3F	1,991916	0,002220854		CYP4F40	2,119	0,1848
ERMAP	1,940590333	0,042680673		TRDN	2,119	0,2396
MCPT8	1,930212667	0,018921256		CFTR	2,117	0,3208
SLC26A1	1,926420667	0,025126602		XIRP2	2,109	0,2031
PRKAR2B	1,924056667	0,016881189		CYP8B1	2,107	0,0912
BIRC5	1,914826333	0,032959509		GM23629	2,105	0,0590
FADS2	1,91223	0,013830993		GM25076	2,104	0,0980
TOP2A	1,88339	0,034852729		1700080G11RIK	2,103	0,1621
NCAPG	1,881082333	0,036612626		N-R5S96	2,100	0,0493
A730089K16RIK	1,870258667	0,061491704		GM 11027	2,097	0,3009
MNS1	1,860366	0,014834618		SLC22A29	2,089	0,2663
GP9	1,859234333	0,002956835		GSTT2	2,082	0,2372
GF11B	1,852962	0,0291761		GM23911	2,081	0,1903
NUF2	1,850953	0,032872517		OLFR724	2,079	0,0925
CHIL3	1,848470667	0,001494932		GM23277	2,078	0,0912
KIF11	1,83252	0,040535377		A4GNT	2,076	0,2431
ALOX 12	1,823174	0,006931665		MUP21	2,074	0,1149
ADGRG7	1,822065	0,017542834		GM24147	2,074	0,2669
KLF1	1,820262333	0,060689421		MYBPC1	2,067	0,1392
E2F8	1,817455333	0,069143254		CYP3A59	2,063	0,2628
ATP1B2	1,811274333	0,024016123		ACTN2	2,063	0,1471
KIF2C	1,811223333	0,061246458		MIR29A	2,062	0,0340
FADS3	1,803859667	0,050197663		TFF1	2,061	0,0803
MS4A6D	1,801871667	0,01036878		PLA2G1B	2,060	0,4477
SLC25A21	1,801518667	0,048282826		GM23021	2,060	0,1111
HIST1H1B	1,800434	0,037242995		GM22607	2,045	0,1383
CKAP2L	1,783850333	0,061646634		RPL10L	2,044	0,0692
SAMD14	1,782388333	0,02384128		ACE2	2,038	0,3505
CARI	1,770098667	0,025511071		PRAMEL3	2,038	0,1490
DEPDC1A	1,765839667	0,03875749		SULT1B1	2,032	0,2495
CEN PE	1,765095667	0,039288425		ARL14	2,026	0,0952
ASPM	1,753558	0,054145246		GM11337	2,024	0,0270
CCNB2	1,751291667	0,036336189		CNN1	2,020	0,0217

-72052811

RY К	1,749673	0,035413093		LR1T2	2,019	0,0533
MMP14	1,747348667	0,010510984		ACOT4	2,015	0,2120
BUB1	1,738322667	0,02139336		LOC100125594	2,014	0,0208
MYOID	1,734508	0,006655486		GLB1L2	2,012	0,0396
PARVB	1,733820333	0,010799396		GM25605	2,008	0,1329
GM5593	1,728317	0,008578526		GM15384	2,002	0,0255
CCNA2	1,724975667	0,026630845		GM94	1,997	0,1095
PRR11	1,724352667	0,04875805		OLFR1113	1,997	0,1277
AQP1	1,719081667	0,064562051		G630018N14RIK	1,997	0,3017
CASP3	1,709594333	0,009087444		GM23232	1,994	0,0672
K1F15	1,708689667	0,026782535		GM16378	1,994	0,0357
ASNS	1,708074333	0,037928738		GM22838	1,994	0,0875
CPOX	1,706113	0,030298001		HSD3B5	1,992	0,2019
MT1	1,699002667	0,010159345		OLFR746	1,989	0,0331
CDC6	1,694586667	0,049970924		GM24254	1,988	0,1301
GBP2B	1,694018	0,000929009		GM24232	1,986	0,2212
GBP2	1,689558667	0,004961011		PRAP1	1,986	0,3720
HMMR	1,687253333	0,063769534		ALPI	1,986	0,4192
KIF20A	1,686718333	0,020639142		MIR3964	1,983	0,0301
GSTM5	1,681807333	0,04316743		GM22787	1,983	0,0183
REEP6	1,677204667	0,056071877		GM26081	1,982	0,1771
GM12250	1,675485	0,003251181		GM22242	1,980	0,3169
GBP 10	1,673458	0,009333312		IGHV1-77	1,980	0,4742
ATP7B	1,671614	0,029798535		OLFR740	1,980	0,2191
GM22973	1,663495667	0,004472758		OLFR1201	1,979	0,0339
CASC5	1,659578	0,044333895		GM22654	1,976	0,5101
ADD2	1,659553667	0,053938067		OLFR747	1,975	0,0719
CAMP	1,659111667	0,066745225		GM22521	1,973	0,1073
CLEC5A	1,654882667	0,00665055		VMM RI 72	1,972	0,0731
MUP-PS12	6,332	0,0021		GM 13773	1,971	0,2179
GM26184	5,617	0,0850		CLEC2H	1,970	0,2041
GKN2	4,822	0,0378		OLFR714	1,967	0,0816
MYH8	3,854	0,3190		GM22284	1,965	0,1376
MIR101B	3,695	0,0111		GM26342	1,962	0,0242
GKN1	3,485	0,0451		OLFR190	1,961	0,0184
СЛН	3,473	0,1822		CCDC152	1,960	0,0375
MUC5AC	3,341	0,0628		GM26048	1,959	0,1807
2310057J18RIK	3,041	0,4100		GM24410	1,959	0,1844
PSCA	3,027	0,1219		LGALS4	1,957	0,0215
GM25623	2,948	0,0133		OLFR969	1,956	0,0946
FAM83B	2,905	0,0202		GM6222	1,956	0,0950

-73 052811

GM23852	2,882	0,0763		OLFR913	1,953	0,3111
SPTSSB	2,873	0,0952		4930557A04RIK	1,953	0,0645
MIRLET7F-1	2,794	0,0447		GM24750	1,950	0,2385
MUP-PS16	2,778	0,0114		GM23043	1,948	0,0490
ANXA1O	2,689	0,1047		STFA1	1,946	0,0803
LGALS2	2,685	0,1337		SUCNR1	1,942	0,1078
СШЛ1	2,672	0,4078		MYOM1	1,941	0,1753
AKP3	2,660	0,3665		KLK1B22	1,938	0,1263
SLC13A1	2,622	0,2936		GM23917	1,934	0,1949
GM766	2,621	0,4035		GM 15949	1,932	0,0450
GM24537	2,617	0,1649		OLFR709-PS1	1,930	0,0722
GM24138	2,606	0,0374		OBP1A	1,928	0,3421
SIS	2,585	0,3777		SULT2A1	1,927	0,3528
2210407C18RIK	2,584	0,0600		GM24786	1,923	0,2103
S100G	2,580	0,3877		SGK2	1,916	0,1567
GM26354	2,540	0,1097		MIRLET7C-1	1,911	0,0725
CKMT2	2,538	0,2680		VMN1R90	1,910	0,1018
GM26055	2,525	0,2157		GM23342	1,909	0,0298
GM5885	2,479	0,0305		REG3G	1,908	0,1599
AGR2	2,458	0,1845		GM24839	1,906	0,2631
VMN1R167	2,454	0,0932		N-R5S157	1,905	0,1167
GM25167	2,444	0,0264		GM25023	1,905	0,0253
ATP5C1-PS	2,437	0,0477		CES2B	1,902	0,1386
GM24470	2,434	0,1676		IGHV8-11	1,901	0,1555
MY 112	2,403	0,1632		GM25982	1,899	0,0542
MIR326	2,375	0,0059		ATP4A	1,899	0,3968
MIR122	2,375	0,0242		GM26162	1,898	0,0147
MCPT9	2,375	0,0623		PNPLA3	1,898	0,0031
PSG18	2,359	0,0115		AU015336	1,893	0,0794
MUC6	2,358	0,3108		GM24621	1,891	0,0840
VMN2R115	2,352	0,1111		CYP2C40	1,891	0,4000
GM25498	2,351	0,0086		GM25602	1,891	0,1527
2010106E10RIK	2,339	0,4607		ADGRG7	1,889	0,3205
ERBB4	2,328	0,0350		SLC30A10	1,888	0,1288
LYPD8	2,320	0,1374		GM25836	1,888	0,1934
CYP2A5	2,305	0,2330		GM25629	1,887	0,1192
BTNL5-PS	2,301	0,1684		GM24861	1,886	0,0396
GM24549	2,289	0,1138		GM21057	1,884	0,0850
GM24465	2,287	0,2356

-74052811

Таблица 11В

Подавление генов в ответ на введение ИЛ-27

Обозначение гена	Кратность изменения	р-значение		Обозначение гена	Кратность изменения	p- значение
DEFB44-PS	0,187	0,1696		1700049E17RIK2	0,380	0,0045
C1S2	0,187	0,0076		IGH-VJ558	0,382	0,4348
HIST1H1B	0,204	0,1347		PRRG4	0,382	0,1000
GM15114	0,205	0,1127		GM7391	0,383	0,0206
GM2005	0,205	0,0169		CD 109	0,384	0,0892
KHDC1C	0,211	0,0820		ТМЕМ173	0,385	0,0912
GM2005	0,224	0,0023		CDH17	0,385	0,0338
SERPINB7	0,224	0,1389		KITL	0,385	0,0287
SERP1NB11	0,225	0,0594		SKA3	0,388	0,1991
CXCL3	0,230	0,1516		PRC1	0,390	0,0796
CDH10	0,230	0,0466		МВОАТ1	0,390	0,0339
MIR1949	0,235	0,1307		ТОР2А	0,394	0,0659
SLC7A11	0,236	0,0195		1700049E17RIK2	0,395	0,0084
LUZP4	0,249	0,0952		SPEER4D	0,396	0,0119
IGHV1-81	0,252	0,5116		HIST1H3I	0,396	0,3818
PTPRTOS	0,252	0,0338		TUBA1A	0,396	0,0139
RP1	0,254	0,1538		GM22265	0,396	0,0909
GM15127	0,254	0,0500		TRBJ1-7	0,397	0,1567
CRISP 1	0,255	0,0865		KIF20B	0,398	0,0922
GM15107	0,255	0,0591		SERPINB2	0,398	0,0259
SERP1NB5	0,256	0,0402		GM 14402	0,398	0,2496
GM7665	0,256	0,0034		PLK4	0,399	0,0728
ТМЕМ252	0,259	0,0173		C330027C09R1K	0,400	0,1046
PNMA5	0,262	0,0922		GM15091	0,401	0,0763
CXCL15	0,263	0,1037		NDC80	0,401	0,0773
CLEC2G	0,265	0,0388		MYBL1	0,401	0,1659
ММР13	0,267	0,1687		KIF2C	0,401	0,0703
GM15093	0,269	0,0741		GM 12603	0,401	0,0856
VMN1R53	0,270	0,0648		CYP11A1	0,403	0,2635
GM14409	0,276	0,1558		FANCI	0,403	0,1782
GM11884	0,278	0,1682		CCNA2	0,404	0,0598
SLC16A4	0,278	0,1159		RACGAP1	0,406	0,0734
ММР12	0,280	0,0786		NCAPH	0,406	0,1125
KIF5C	0,281	0,1003		GM 16094	0,407	0,0317
APELA	0,283	0,0601		СП25П	0,407	0,3075
AFP (АФП)	0,283	0,0424		GM 15398	0,408	0,1043
1GKV1-122	0,286	0,0090		KNTC1	0,409	0,1335
A63OO95E13RIK	0,292	0,0905		BST1	0,409	0,0928
GM15109	0,297	0,0058		KIF11	0,412	0,0752

-75052811

OLFR111	0,299	0,2107		GM23576	0,412	0,2618
TNS4	0,301	0,0381		SHCBP1	0,412	0,1361
PLEKI1S1	0,301	0,0784		1GIIV1-42	0,413	0,4474
LNCENC1	0,305	0,0939		GPRC5A	0,415	0,0333
THBS1	0,309	0,0243		TNFRSF10B	0,416	0,1047
PLATR14	0,313	0,0812		IL23A	0,418	0,1414
RASSF9	0,314	0,1125		ERICH2	0,419	0,1444
ITGA2	0,319	0,0699		AN LN	0,420	0,0409
LOCI 02634388	0,320	0,0213		CASC5	0,420	0,1178
LOC102634388	0,320	0,0213		GM17689	0,421	0,2773
GM15093	0,320	0,0380		SOX4	0,422	0,0795
CEP55	0,321	0,1007		GM22069	0,422	0,0494
A630038E17R1K	0,321	0,1334		PRR11	0,423	0,0750
GM25552	0,323	0,1261		SEMA3C	0,423	0,0208
RPS26	0,327	0,1840		RETNLA	0,423	0,0429
STRA6	0,330	0,0498		FRMD7	0,424	0,0211
GM15093	0,331	0,0403		TNFRSF11B	0,425	0,0592
PSAT1	0,332	0,0926		RAD54L	0,426	0,1604
AKR1C18	0,332	0,0983		GM10488	0,426	0,0074
DEPDC1A	0,333	0,1814		PLAT	0,427	0,0647
GM10439	0,335	0,0694		GM13790	0,427	0,1161
GM24916	0,335	0,2031		DTL	0,427	0,1700
STC1	0,337	0,0829		SERPINB9B	0,429	0,1064
DPPA2	0,337	0,0887		ASNS	0,430	0,0471
E030011O05RIK	0,337	0,0486		GM15097	0,430	0,1722
GM20756	0,337	0,0218		TMED6	0,432	0,2648
GM22771	0,339	0,2897		SERPINE1	0,433	0,0345
IGKV6-32	0,340	0,4435		TPX2	0,433	0,0588
AIM2	0,340	0,0091		CENPK	0,433	0,1772
C920009B18RIK	0,341	0,0220		2810429I04RIK	0,434	0,2171
BUB1	0,349	0,0755		4930461G14RIK	0,434	0,1799
T1CRR	0,350	0,1772		111ST1H2AG	0,435	0,1874
MIS18BP1	0,353	0,0909		IER3	0,435	0,1414
MAGEA6	0,353	0,2067		CHRNB1	0,436	0,0500
CHIL3	0,354	0,0651		GM5431	0,437	0,1300
IGHV1-78	0,357	0,2850		GM13247	0,438	0,2035
STIL	0,358	0,1413		AI506816	0,438	0,0773
GM26735	0,360	0,0654		GM7942	0,438	0,0432
REG2	0,360	0,4969		CCNB1	0,440	0,0362
SPRR1A	0,361	0,0056		ZFP345	0,440	0,2490
PARPBP	0,362	0,1471		TGHV8-8	0,440	0,4507

-76052811

PADI4	0,366	0,0975		ATAD5	0,442	0,1143
GM14139	0,367	0,0423		KDELR3	0,444	0,0873
GPC3	0,368	0,2139		CDC25C	0,445	0,0353
MS4A6D	0,370	0,0176		IGKV4-72	0,445	0,1803
АТР10А	0,371	0,0977		OLFR99	0,447	0,1622
KIF23	0,371	0,0432		GM25544	0,448	0,1385
GM20757	0,371	0,2248		MIR101C	0,448	0,0818
GM2318	0,372	0,0136		HYDIN	0,448	0,1499
GM2318	0,372	0,0136		IGHV5-16	0,449	0,3210
GM2318	0,372	0,0136		NOP58	0,449	0,1379
GM2318	0,372	0,0136		CEL	0,449	0,5062
IGHV1-9	0,372	0,3585		MS4A4A	0,449	0,1126
СРВ1	0,374	0,5445		BCL2A1B	0,450	0,0035
TNFSF4	0,374	0,1420		IGKV4-59	0,450	0,4975
RNASE1	0,375	0,2935		CCL3	0,450	0,1070
Т1МР1	0,376	0,0765		GM2933	0,451	0,1650
GM6020	0,379	0,4836		FAM102B	0,451	0,1330

Таблица 12

Перечень последовательностей

SEQ ID NO	Описание	Последовательность
		Антитело Ab2-A против ИЛ-27
9	HCDR1 (IMGT)	GFTFSSYS
10	HCDR2 (IMGT)	ISSSSSYI
11	HCDR3 (IMGT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
12	HCDR1 (NT)	FTFSSYSMN
13	HCDR2 (NT)	SISSSSSYIYYADSVKG
14	HCDR3 (NT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
15	VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSS
16	ДНК VH	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGC TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA

-77 052811

		GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT СТССТСА
17	LCDR1 (IMGT)	QSVLFSSNNKNY
18	LCDR2 (IMGT)	WAS
19	LCDR3 (IMGT)	QQHASAPPT
20	LCDR1 (NT)	KSSQSVLFSSNNKNYLA
21	LCDR2 (NT)	WASTRES
22	LCDR3 (NT)	QQHASAPPT
23	VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERAT1NCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIK
24	ДНК VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAA
25	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAIINWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHN AKTKPREEQYN ST YR VVS VLTVLHQD WLNGKE YKCKV SNK ALP APIEKTTSK AKGQPR EPQ VYTLPPS RDELTKNQ VSLTCLVKGFYP SDIA V EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
26	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGC TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GT ACTA CTGCGCC AG AG ATGGTGGA AG A ACGTC CTAC ACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGA GCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGT GAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCA

-78052811

		GCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGC AACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAA ACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCC GAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTA GCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGA AGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTG CATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCT ATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAAC GGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGC CGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACC GCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAAC CAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATAT TGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAA ACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAG CAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTT AGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGA AAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA
27	Легкая цепь	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VY ACEVTHQGLS SP VTK SFNRGEC
28	ДНК легкой цепи	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCT GCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGC
		Антитело Ab2-B против ИЛ-27
29	Тяжелая цепь	EVQL VESGGGLVKPGG SLRLSC A A SGFTF S SYSMN WVRQ APGKGLE W VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST

-79052811

		SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
30	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGC TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTG CTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGA AGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCC CTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG CCTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACAC CAAAGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTT CCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCC CTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAAGTCCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGC AAAGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCT CCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCC TCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACTTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGC
		Антитело АЬЗ-А против ИЛ-27
31	HCDRl (IMGT)	GFTFRSYG
32	HCDR2 (IMGT)	ISSSSSYI
33	HCDR3 (IMGT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP

- 80 052811

34	HCDR1 (NT)	FTFRSYGMN
35	HCDR2 (NT)	SISSSSSYIYYADSVKG
36	HCDR3 (NT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
37	VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSS
38	ДНК VH	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGGAGC TATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCA
39	LCDR1 (IMGT)	QSVLFSSNNKNY
40	LCDR2 (IMGT)	WAS
41	LCDR3 (IMGT)	QQHASAPPT
42	LCDR1 (NT)	KSSQSVLFSSNNKNYLA
43	LCDR2 (NT)	WASTRES
44	LCDR3 (NT)	QQHASAPPT
45	VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIK
46	ДНК VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAA
47	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

- 81 052811

		EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
48	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGGAGC TATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGA GCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGT GAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCA GCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGC AACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAA ACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCC GAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTA GCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGA AGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTG CATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCT ATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAAC GGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGC CGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACC GCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAAC CAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATAT TGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAA ACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAG CAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTT AGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGA AAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA
49	Легкая цепь	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
50	ДНК легкой цепи	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT

- 82 052811

		CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCT GCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGC
		Антитело АЬЗ-В против ИЛ-27
51	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
52	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGGAGC TATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTG CTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGA AGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCC CTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG CCTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACAC CAAAGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTT CCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCC CTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAAGTCCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGC

- 83 052811

		AAAGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCT CCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCC TCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACTTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGC
		Антитело Ab4-A против ИЛ-27
53	HCDR1 (IMGT)	GFTFSRTG
54	HCDR2 (IMGT)	ISSSSSYI
55	HCDR3 (IMGT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
56	HCDR1 (NT)	FTFSRTGMN
57	HCDR2 (NT)	SISSSSSYIYYADSVKG
58	HCDR3 (NT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
59	VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRTGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSS
60	ДНК VH	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGG ACTGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCA
61	LCDR1 (IMGT)	QSVLFSSNNKNY
62	LCDR2 (IMGT)	WAS
63	LCDR3 (IMGT)	QQHASAPPT
64	LCDR1 (NT)	KSSQSVLFSSNNKNYLA
65	LCDR2 (NT)	WASTRES
66	LCDR3 (NT)	QQHASAPPT
67	VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIK
68	ДНК VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG

- 84 052811

		GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAA
69	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRTGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
70	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGG ACTGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGA GCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGT GAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCA GCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGC AACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAA ACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCC GAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTA GCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGA AGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTG CATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCT ATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAAC GGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGC CGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACC GCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAAC CAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATAT TGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAA ACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAG CAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTT

- 85 052811

		AGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGA AAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA
71	Легкая цепь	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
72	ДНК легкой цепи	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCT GCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGC
		Антитело АЬ4-В против ИЛ-27
73	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRTGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
74	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGG ACTGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTG

- 86 052811

		CTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGA AGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCC CTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG CCTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACAC CAAAGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTT CCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCC CTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAAGTCCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGC AAAGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCT CCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCC TCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACTTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGC
		Антитело Ab5-A против ИЛ-27
75	HCDR1 (IMGT)	GFTFSRYG
76	HCDR2 (IMGT)	ISSSSAYI
77	HCDR3 (IMGT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
78	HCDR1 (NT)	FTFSRYGMN
79	HCDR2 (NT)	SISSSSAYILYADSVKG
80	HCDR3 (NT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
81	VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSAYILYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSS
82	ДНК VH	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGG TATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTGCTTACATACTGTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCA
83	LCDR1 (IMGT)	QSVLFSSNNKNY

- 87 052811

84	LCDR2 (IMGT)	WAS
85	LCDR3 (IMGT)	QQHASAPPT
86	LCDR1 (NT)	KSSQSVLFSSNNKNYLA
87	LCDR2 (NT)	WASTRES
88	LCDR3 (NT)	QQHASAPPT
89	VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIK
90	ДНК VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAA
91	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSAYILYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
92	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGG TATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTGCTTACATACTGTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGA GCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGT GAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCA GCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGC AACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAA

- 88 052811

		ACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCC GAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTA GCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGA AGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTG CATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCT ATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAAC GGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGC CGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACC GCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAAC CAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATAT TGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAA ACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAG CAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTT AGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGA AAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA
93	Легкая цепь	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
94	ДНК легкой цепи	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCT GCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGC
		Антитело АЬ5-В против ИЛ-27
95	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSAYILYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV

- 89 052811

		HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
96	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGG TATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTGCTTACATACTGTACGCAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGT GTACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACA GCCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGT CTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTG CTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGA AGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCC CTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG CCTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACAC CAAAGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTT CCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCC CTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAAGTCCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGC AAAGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCT CCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCC TCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACTTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGC
		Антитело Ab6-A против ИЛ-27
97	HCDRl (IMGT)	GFTFASYG
98	HCDR2 (IMGT)	ISSSSSYI
99	HCDR3 (IMGT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
100	HCDRl (NT)	FTFASYGMN
101	HCDR2 (NT)	SISSSSSYIYYADSVKG
102	HCDR3 (NT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP

- 90 052811

103	VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFASYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSS
104	ДНК VH	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCGCTAGCT ATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCCATTAGTAGTTCTAGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTG TACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACAG CCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC ТССТСА
105	LCDR1 (IMGT)	QSVLFSSNNKNY
106	LCDR2 (IMGT)	WAS
107	LCDR3 (IMGT)	QQHASAPPT
108	LCDR1 (NT)	KSSQSVLFSSNNKNYLA
109	LCDR2 (NT)	WASTRES
ПО	LCDR3 (NT)	QQHASAPPT
111	VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIK
112	ДНК VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAA
113	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFASYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
114	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCGCTAGCT

- 91 052811

		ATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCCATTAGTAGTTCTAGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTG TACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACAG CCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC TCCTCAGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGA GCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGT GAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCA GCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGC AACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAA ACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCC GAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTA GCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGA AGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTG CATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCT ATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAAC GGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGC CGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACC GCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAAC CAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATAT TGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAA ACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAG CAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTT AGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGA AAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA
115	Легкая цепь	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
116	ДНК легкой цепи	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCT

- 92 052811

		GCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGC
		Антитело АЬ6-В против ИЛ-27
117	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFASYGMNWVRQAPGKGLEW VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
118	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCGCTAGCT ATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCCATTAGTAGTTCTAGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTG TACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACAG CCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC TCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAA GGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCC TGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGG CACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACC AAAGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTTC CTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCC TCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAAGTCCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGC AAAGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCT CCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCC TCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACTTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTC

- 93 052811

		CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGC
		Антитело Abl-A против ИЛ-27
119	HCDR1 (IMGT)	GFTFRSYG
120	HCDR2 (IMGT)	ISSSGSYI
121	HCDR3 (IMGT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
122	HCDR1 (NT)	FTFRSYGMN
123	HCDR2 (NT)	GISSSGSYIYYADSVKG
124	HCDR3 (NT)	ARDGGRTSYTATAHNWFDP
125	VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMNWVRQAPGKGLEW VSGISSSGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSS
126	ДНКУН	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGTAGCT ATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGGTATTAGTAGTAGTGGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTG TACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACAG CCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC TCCTCA
127	LCDR1 (IMGT)	QSVLFSSNNKNY
128	LCDR2 (IMGT)	WAS
129	LCDR3 (IMGT)	QQHASAPPT
130	LCDR1 (NT)	KSSQSVLFSSNNKNYLA
131	LCDR2 (NT)	WASTRES
132	LCDR3 (NT)	QQHASAPPT
133	VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA SAPPTFGGGTKVEIK
134	ДНК VL	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAA

- 94 052811

135	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMNWVRQAPGKGLEW VSGISSSGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
136	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGTAGCT ATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGGTATTAGTAGTAGTGGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTG TACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACAG CCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC TCCTCAGCGAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGA GCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGT GAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCA GCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGC AACACCAAAGTGGATAAAAAAGTGGAACCGAAAAGCTGCGATAAA ACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGCGCCGGAACTGCTGGGCGGCCC GAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTA GCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGA AGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTG CATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCT ATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAAC GGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGC CGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACC GCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAAC CAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATAT TGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAA ACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAG CAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTT AGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGA AAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA
137	Легкая цепь	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHA

- 95 052811

		SAPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
138	ДНК легкой цепи	GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCA GCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGG ACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCG GGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCAGCAGCACGCCAGTGCCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGG TTGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCT GCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGC
		Антитело Abi-В против ИЛ-27
139	Тяжелая цепь	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMNWVRQAPGKGLEW VSGISSSGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGGRTSYTATAHNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
140	ДНК тяжелой цепи	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGTAGCT ATGGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGGTATTAGTAGTAGTGGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTG TACTACTGCGCCAGAGATGGTGGAAGAACGTCCTACACCGCCACAG CCCACAATTGGTTCGACCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC TCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAA GGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCC TGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGG

- 96 052811

		CACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACC AAAGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTTC CTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCC TCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAAGTCCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGC AAAGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCT CCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCC TCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACTTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGC
141	FLAG	DYKDDDDK
142	6-HIS	HHHHHH
143	HA	YPYDVPDYA

Таблица 13

Последовательности Fc (=CH₂+CH₃)

Названи e	Псевдо ним	Последовательность аминокислот
IgGl человека	1.0	EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5)
IgG4 человека	4.0	ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 6)
IgG4 человека (S228P)	4.1	ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 7)

- 97 052811

IgG4 человека (S228P/ L235E)

4.2

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 8)

Пример 9. Свойства связывания антитела АЫ против ИЛ-27 и блокада рецептора ИЛ-27.

Определяли ассоциацию и диссоциацию рекомбинантного ИЛ-27 человека в диапазоне концентраций от 0 до 5,0 мкг/мл с антителом АЫ против ИЛ-27 концентрацией 1 мкг/мл. Окончательные кинетические параметры связывания представлены в табл. 14 вместе с параметрами соответствия модели связывания (R² и χ²), которые демонстрируют хорошее соответствие экспериментальных данных указанной модели.

ИЛ-27 человека продемонстрировал наиболее высокую аффинность связывания с антителом АЫ против ИЛ-27 среди всех видов, протестированных в данном исследовании (3,86 пМ). Рекомбинантные ИЛ-27 крысы и яванской макаки также проявили высокую аффинность к антителу АЫ против ИЛ-27, со значениями 80,9 пМ и 37,4 пМ, соответственно, хотя несколько более слабую, чем указанный белок человека. Рекомбинантный ИЛ-27 мыши имел наиболее низкую аффинность к антителу АЫ против ИЛ27 по сравнению с соответствующим белком человека, со значением в наномолярном диапазоне (4,43 нМ), на что указывает его более низкая скорость ассоциации и более высокая скорость диссоциации.

Таблица 14

Сводные данные о связывании ИЛ-27 с антителом АЫ против ИЛ-27 и межвидовой перекрестной реактивности

Аналит	Kd (М)	ка (1/Мс)	ка (1/с)	Полный χ2	Полный R2
ИЛ-27 человека	3,86Е-12	5Д0Е+05	1,97Е-06	0,4055	0,9991
ИЛ-27 мыши	4,43Е-09	5,50Е+04	2,44Е-04	0,6732	0,9963
ИЛ-27 крысы	8,09Е-11	2,34Е+06	1,89Е-04	0,4685	0,9945
ИЛ-27 яванской макаки	3,74Е-11	ЗД8Е+05	1Д9Е-05	1,3431	0,9979

Сокращения: ИЛ-27=интерлейкин 27, к_а=константа ассоциации, kj-копстапта диссоциации, K_D= аффинность связывания.

Примечание: значения R² > 0,95 и значения χ² < 3,0 свидетельствуют о том, что полученные данные точно соответствуют математической модели.

Пример 10. Выравнивание последовательностей CDR.

Ряд подгрупп антител против ИЛ-27 согласно данному изобретению имеет гомологию последовательностей в их областях CDR, обеспечивая разнообразие вариантов последовательностей CDR, которые, как подтверждено, сохраняют свою функциональность. В данном документе явным образом предусмотрено, что следующие консенсусные последовательности CDR полностью поддерживаются и, следовательно, входят в объем данного изобретения.

Для антитела АЫ против ИЛ-27, антитела АЬЗ против ИЛ-27, антитела АЬ4 против ИЛ-27, антитела АЬ5 против ИЛ-27, антитела АЬ6 против ИЛ-27 и антитела АЬ7 против ИЛ-27 выравнивание последовательностей CDR каждого из данных антител против ИЛ-27 выявило обширную гомологию, перемежающуюся вариабельными остатками. В частности, выравнивание CDR1 тяжелой цепи выявило следующие вариабельные остатки:

HCDR1 (IMGT).

Программа множественного выравнивания последовательностей CLUSTAL О (1.2.4)

1 GFTFRSYG	8	(SEQ ID NO: 119)
5 GFTFRSYG	8	(SEQ ID NO: 31)
4 GFTFASYG	8	(SEQ ID NO: 97)
2 GFTFSRTG	8	(SEQ ID NO: 53)
3 GFTFSRYG	8	(SEQ ID NO: 75)
6 GFTFSSYS	8	(SEQ ID NO: 9)
### *

-98052811

Таким образом, консенсусная последовательность CDR1 (IMGT) тяжелой цепи для данных гомологичных антител представляет собой последовательность N-GFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]-C (SEQ ID NO: 144) и, соответственно, более обобщенная представленная в данном документе консенсусная последовательность CDR1 (IMGT) тяжелой цепи представляет собой последовательность N-GFTFXXXXС (SEQ ID NO: 145), где X представляет собой любой аминокислотный остаток.

Выравнивание последовательностей CDR2 (IMGT) тяжелой цепи антитела АЫ против ИЛ-27, антитела АЬЗ против ИЛ-27, антитела АЬ4 против ИЛ-27, антитела АЬ5 против ИЛ-27, антитела АЬ6 против ИЛ-27 и антитела АЬ7 против ИЛ-27 выявило следующее:

HCDR2 (IMGT).

Программа множественного выравнивания последовательностей CLUSTAL О (1.2.4)

10 ISSSGSY1	8	(SEQ ID NO: 120)
11ISSSSSYI	8	(SEQ ID NO: 98)
7ISSSSSYI	8	(SEQ ID NO: 32)
9 ISSSSSYI	8	(SEQ ID NO: 54)
8 ISSSSAYI	8	(SEQ ID NO: 76)
12 ISSSSSYI	8	(SEQ ID NO: 10)

Таким образом, консенсусная последовательность CDR2 (IMGT) тяжелой цепи для данных гомологичных антител представляет собой последовательность N-ISSS[S/G][S/A]YI-C (SEQ ID NO: 146) и, соответственно, более обобщенная представленная в данном документе консенсусная последовательность CDR2 (IMGT) тяжелой цепи представляет собой последовательность N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 147), где X представляет собой любой аминокислотный остаток.

Выравнивание последовательностей CDR1 человека (NT) и CDR2 человека (NT) также выявило следующее:

HCDR1 (NT).

Программа множественного выравнивания последовательностей CLUSTAL О (1.2.4)

13 FTFRSYGMN	9	(SEQ ID NO: 34)
16FTFRSYGMN	9	(SEQ ID NO: 122)
17FTFASYGMN	9	(SEQ ID NO: 100)
14 FTFSRTGMN	9	(SEQ ID NO: 56)
15 FTFSRYGMN	9	(SEQ ID NO: 78)
18FTFSSYSMN	9	(SEQ ID NO: 12)

HCDR2 (NT).

Программа множественного выравнивания последовательностей CLUSTAL О (1.2.4)

23 GISSSGSYIYYADSVKG	17	(SEQ ID NO: 123)
19 SISSSSSYIYYADSVKG	17	(SEQ ID NO: 35)
20 SISSSSSYIYYADSVKG	17	(SEQ ID NO: 57)
22 SISSSSSYIYYADSVKG	17	(SEQ ID NO: 101)
21 SISSSSAYILYADSVKG	17	(SEQ ID NO: 79)
24 SISSSSSYIYYADSVKG	17	(SEQ ID NO: 13)

Таким образом, консенсусные последовательности CDR1 (NT) и CDR2 (NT) тяжелых цепей для данных гомологичных антител представляют собой последовательность NFTF[S/A/R][S/R][T/Y][G/S]MN-C (SEQ ID NO: 148) и последовательность N[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C (SEQ ID NO: 149), соответственно. Принимая во внимание указанные консенсусные последовательности, более обобщенные представленные в данном документе консенсусные последовательности CDR1 (NT) и CDR2 (NT) тяжелых цепей представляют собой последовательность N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 150) и последовательность NXISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 151), соответственно, где X представляет собой любой аминокислотный остаток.

-99052811

Область CDR3 тяжелой цепи (IMGT или NT) и области CDR легкой цепи CDR1 (IMGT или NT), CDR2 (IMGT или NT) и CDR3 (IMGT или NT) были полностью консервативны между антителом АЫ против ИЛ-27, антителом АЬЗ против ИЛ-27, антителом АЬ4 против ИЛ-27, антителом АЬ5 против ИЛ27, антителом АЬ6 против ИЛ-27 и антителом АЬ7 против ИЛ-27.

Пример 11. Кристаллизация и определение эпитопа комплекса ИЛ-27 - Fab антитела Abi против ИЛ-27.

Первоначальные исследования кристаллизации проводили с комплексом ИЛ-27 человека - Fab антитела Abi против ИЛ-27 при концентрации 10,1 мг/мл в 25 мМ Трис pH 7,5, около 30 мМ хлорида натрия и 5% глицерола. Предварительные условия кристаллизации определяли с помощью скрининга PACT (Newman et al. (2005) Acta Cryst. D 61: 1426).

Кристаллы получали в различных условиях, включая PACT А2 (0,1 М реактива SPG (янтарная кислота, дигидрофосфат натрия и глицин) pH 5 и 25% ПЭГ 1500). Указанные кристаллы использовали для создания нового материала засева и постановки эксперимента по микроматричному засеву (ММ3, англ. MMS) с использованием скрининга JCSG+ (D'Arcy et al. (2007) Acta Cryst. D Biol Cryst. 63: 550 54).

Наборы данных собирали при 100К на устройстве 104, Diamond Light Source, г. Дидкот, Великобритания (λ=0,9795 А) с детектором Eiger2 ХЕ 16М. Данные обрабатывали с помощью программы autoPROC (Kabash, (2010) Acta. Cryst. D. Biol. Cyrst. 66: 125 - 32; Vonrhein et al. (2011) Acta Cryst. Biol. Cryst. 67: 292 - 302) и анизотропно усечены с использованием программного обеспечения STARANISO (Tickle et al, STRANISO. Cambridge, United Kingdon: Global Phasing Ltd. (2018)), также включенного в программу Aimless (Evans et al. (2013) Acta Cryst. Biol. Cryst. 69: 1204 - 14).

Структуру определяли с применением программного обеспечения для молекулярного замещения Phaser (McCoy et al. (2007) J. Appl. Cyrst. 40: 658-74) и Molrep (Vagin et al. (1997) J. Appl. Cyrst. 30: 102225) (FIG. 9). Как показано на фиг. 9, Fab антитела Abi против ИЛ-27 связан с молекулой р28 ИЛ-27. Электронная плотность для всей области эпитоп - паратоп является четко определенной. Взаимодействия между антителом Abi против ИЛ-27 и р28 показаны в табл. 15.

Таблица 15

Карта взаимодействий антитела Abi против ИЛ-27 с р28 (< 4,0А)

ИЛ-27 (р28)	Fab антитела Abi против ИЛ-27	Расстояние (A)	Тип
Остаток	Atom	Остаток	Atom	Петля CDR
Gln37	oeI	Ser32	N	LI	3,0	11-связь
	cb	Phe31	cdl	LI	3,6	Гидрофобные
Leu38	c®	Phe31	cz	LI	4,1	Г идрофобные
Glu42	oel	Ser99	og	L3	2,7	Н-связь
Glu46	oe2	Tyr59	oh	H2	2,7	Н-связь
Val49	csl	Tyr57	cdl	H2	3,5	Гидрофобные
Ser50	o®	Tyr57	o'*	H2	2,7	Н-связь
Leul42	c62	Ser54	ca	H2	3,8	Гидрофобные
Aspl46	odU	Ser53	og	H2	3,7	Н-связь
	od2	Ser54	o6	H2	2,7	Н-связь
	od2	Ser56	og	H2	4,0	11-связь
Argl49	№	Thrl03	о	113	3,1	Н-связь
	№	Thrl06	о	H3	2,9	Н-связь
	NH2	GlylOl	о	H3	3,0	Н-связь
Hisl50	№2	Thrl08	ogI	H3	2,7	Н-связь

- 100052811

	Ndl, cel	Tyr57	ce2, cd2	H2	3,5-3,7	р-стэкинг
Phel53	cz	HisllO	Ndl	H3	3,6	Гидрофобные
	cd2	Ala 107	cb	H3	3,7	Гидрофобные
	cel	Tyr38	ce2	LI	3,8	Гидрофобные
Leul56	о	Ser33	o8	LI	2,6	Н-связь
		Tyrl05	Cdl	H3	3,9	Гидрофобные
	cdl	Ser33	cb	LI	3,9	Гидрофобные
Leul62	о	Tyrl05	oh	H3	2,8	Н-связь
Glul64	oel	Thrl03	o8	H3	2,6	Н-связь
	oe2	Lys36	Nz	LI	3,9	Ионные

Пример 12. Дополнительные исследования по картированию эпитопов.

Дальнейшие исследования по картированию эпитопов проводили с использованием кристаллической структуры комплекса ИЛ-27 - Fab антитела Ab1 против ИЛ-27. Области взаимодействия между молекулой Fab антитела Ab1 против ИЛ-27 и ИЛ-27 исследовали с помощью программ Qt-PISA и NCONT в программном пакете CCP4 (Winn, et al. (2011) Acta Cryst. D Biol. Cryst. 67: 235 - 42). Программу Coot (Emsley, et al. (2010) Acta Cryst. D Biol. Cyrst. 66: 486 - 501) применяли для анализа данных.

Остатки эпитопов определяли как аминокислоты ИЛ-27, имеющие атомы в пределах 4 А от атомов Fab, на основании оценки с использованием NCONT в CCP4. Кроме остатков, идентифицированных ранее и перечисленных в табл. 15, в данных исследованиях обнаружили дополнительные остатки эпитопов. Все взаимодействия между ИЛ-27р28 и Fab антитела Ab1 против ИЛ-27 в пределах 4 А представлены в табл. 16А ниже.

Таблица 16А

CDR	Fab антитела Abi против ИЛ-27	Остаток ИЛ-27 (p28)
LC-CDR1	Leu 30	Gin 37
	Phe 31	Gin 37, Leu 38, Phe 153, Ala 157
	Ser 32	Gin 37
	Ser 33	Gin 37, Leu 156, Gly 159, Phe 160, Asn 161
	Asn 34	Leu 156
	Lys 36	Glu 164
	Tyr38	Phe 153
LC-CDR3	Ala 98	Leu 38
	Ser 99	Leu 38, Glu 42
	Ala 100	Glu 42
HC-CDR1	Ser 31	Arg 145*
HC-CDR2	Ser 52	Asp 146, His 150

- 101 052811

	Ser 53	Leu 142, Asp 146
	Ser 54	Leu 142, Asp 143, Asp 146
	Ser 56	Leu 53, Lys 56, Asp 146
	Туг 57	Vai 49, Ser 50, Leu 53, Asp 146, Leu 147, His 150
	Туг 59	Glu 46
	Asn 74	Leu 142**
HC-CDR3	Gly 101	Arg 149
	Arg 102	Arg 149
	Thr103	Arg 149, Glu 164
	Ser 104	Arg 149, Arg 152, Phe 153, Leu 156
	Tyr 105	Phe 153, Leu 156, Leu 162, Pro 163*, Glu 164
	Thr106	Arg 149, Phe 153
	Ala 107	Arg 149, His 150, Phe 153
	Thr108	His 150
	His 110	Glu 42, Glu 46, Phe 153
	Asn 111	Arg 149

Исследования связывания и блокирования проводили с помощью ПИР как для WSX-1, так и для gpl30 для гетеродимера ИЛ-27 человека. ИЛ-27 человека связывался с WSX-1 с высокой аффинностью, и антитело АЫ против ИЛ-27 проявило способность полностью ингибировать связывание (фиг. 10А). ИЛ27 человека связывался с gpl30 с более низкой аффинностью, и антитело АЫ против ИЛ-27 не ингибировало связывание ИЛ-27 с gpl30 (фиг. 10В).

Антитело АЫ против ИЛ-27 взаимодействует со спиралями аА и аС и начальной частью последовательности поли-Glu (фиг. 11). CDR 2 и 3 тяжелой цепи имеют наиболее протяженные контакты с р28 (табл. 16В).

Таблица 16В

Контакты между ИЛ27-р28 и антителом АЫ против ИЛ-27

ИЛ27 (p28)	Fab антитела AM против ИЛ-27	Расстояние (A)	Тип
Остаток	Atom	Остаток	Atom	Петля CDR
Gln37	oel	Ser32	Oe	LI	3,0	Н-связь
	cb	Phe31	cdl	LI	3,6	Г идрофобные
Leu38	cs	Phe31	cz	LI	3,8	Г идрофобные
Glu42	oeI	Ser99	os	L3	2,8	Н-связь
Glu46	oeI	Tyr59	oh	H2	2,8	Н-связь
Val49	csl	Tyr57		H2	3,6	Г идрофобные
Ser50	og	Tyr57	oh	H2	2,7	Н-связь
Leul42	cd2	Ser54	ca	112	3,9	Г идрофобные

- 102052811

Aspl46	odl	Ser53	Os	H2	2,7	Н-связь
		Ser54	O8	H2	2,7	Н-связь
		Ser56	o8	H2	2,9	Н-связь
Argl49	№	Thrl03	о	H3	2,8	Н-связь
	№	Thrl06	0	ИЗ	2,8	11-связь
	NH2	GlylOl	0	ИЗ	3,0	Н-связь
His 150	Ne2	Thrl08	о81	ИЗ	2,8	Н-связь
	Ndl, cel	Tyr57	ceI, cdI	H2	3,5-3,6	р-стэкинг
Phel53	c7	HisllO		ИЗ	3,8	Гидрофобные
	cd2	Ala 107	cb	ИЗ	3,6	Гидрофобные
	cel	Tyr38	ce2	L1	3,7	Гидрофобные
Leul56	о	Ser33	os	L1	2,7	Н-связь
	cdl	Tyrl05	cdl	ИЗ	3,7	Гидрофобные
	cd2	Ser33	cb	L1	3,8	Гидрофобные
Leu 162	о	Tyr105	oh	ИЗ	3,1	Н-связь
Glul64	oel	Thrl03	os	из	2,7	Н-связь
	oe2	Lys36	Nz	L1	3,9	Ионные

На фиг. 12 показано наложение комплексов ИЛ-27/антитело АЫ против ИЛ-27 и ИЛ-23/ИЛ-23Р с использованием р28 и ИЛ-6 для выравнивания в трехмерном пространстве. Сайт связывания gpl30 на ИЛ-6 перекрывается с сайтом связывания антитела АЫ против ИЛ-27 на р28. Тем не менее, сайт связывания ИЛ-23Р на р 19 не перекрывается с сайтом связывания антитела АЫ против ИЛ-27 на р28.

На фиг. 13 показано наложение комплексов ИЛ-27/антитело АЫ против ИЛ-27 и ИЛ-6/ИЛ6Pa/gpl30 с использованием р28 и ИЛ-6 для выравнивания в трехмерном пространстве. В данном случае сайт связывания gpl30 на ИЛ-6 перекрывается с сайтом связывания антитела АЫ против ИЛ-27 на р28. Кроме того, ИЛ-бРа выравнивается с EBI-3.

Выравнивание последовательностей различных животных показывает, что остатки р28, которые участвуют в специфических взаимодействиях с EBI3, являются высоко консервативными, и то же самое верно для остатков EBI3, участвующих в специфических взаимодействиях с р28 (фиг. 14А - 15В). Сюда входят несколько консервативных аминокислотных остатков солевых мостиков и несколько консервативных гидрофобных аминокислотных остатков, отмеченных стрелками.

Структурное выравнивание гетеродимера ИЛ-27 с ИЛ-6/ИЛ-6РА показывает, что вторичная структура, домены и альфа-углеродный остов хорошо совпадают у обоих гетеродимеров (фиг. 16А 16D), и несколько взаимодействий р28 с EBI3 потенциально консервативны для ИЛ-6РА (фиг. 16D).

Данные об аффинности связывания для ИЛ-27 человека показывают, что р28 имел слабое связывание или не вовсе связывался ни с gpl30, ни с WSX-1 по отдельности (фиг. 17). EBI3 не связывался с gpl30 отдельно, но обладал умеренной аффинностью связывания с WSX-1. Высокоаффинное связывание с ИЛ27 человека наблюдалось только при наличии собранного гетеродимера. Аффинность EBI3 к р28 составляла 5 нМ.

Аминокислоты в р28 человека, взаимодействующие с антителом АЫ против ИЛ-27, в основном консервативны в мышиной последовательности (фиг. 18А).); однако антитело АЫ против ИЛ-27 взаимодействует как с Gln37, так и с Leul62 для р28 человека, и Gln37 отсутствует в мышиной последовательности, a Leul62 соответствует Cys в мышиной последовательности (фиг. 18В). Дополнительные дисульфидные связи в р28 мыши также могут нарушать локальный структурный эпитоп, по которому связывается ЛЦ антитела АЫ против ИЛ-27.

Также имелась неразрешенная петля CD с последовательностью поли-Glu, включающая в себя большую область положительных зарядов от остатков Arg в спирали аС (фиг. 19А - 19В).

- 103 052811

Пример 13. Нацеливание на экспрессию ИЛ-27 при почечно-клеточной карциноме.

Экспрессия ИЛ-27 повышена при почечно-клеточной карциноме (ПКК) с повышенными уровнями EBI3, ИЛ-27р28 и ИЛ-27РА в опухолевой ткани ПКК по сравнению с экспрессией каждого из них в нормальной ткани почки (фиг. 20А). Высокая экспрессия каждого из EBI3 (фиг. 20B), ИЛ-27РА (фиг. 20C) и ИЛ-27р28 (фиг. 20D) коррелирует со сниженной вероятностью выживания у субъектов-людей по сравнению с низкой экспрессией каждого из указанных транскриптов.

ИЛ-27 индуцирует воспроизводимый профиль экспрессии генов в активированных CD4+ Т-клетках человека. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от отдельных доноров активировали с помощью антитела против CD3 ± рекомбинантным ИЛ-27 человека (рчИЛ-27) в течение 3 суток. CD4+ Т-клетки сортировали с помощью FACS и экспрессию генов анализировали с помощью микрочипа. В Тклетках, активированных с помощью CD3 и рчИЛ-27, наблюдалось повышение или снижение уровней многочисленных генов, включая повышенную экспрессию PDCD1, HAVCR2, CD274, LGALS9, GBP5, LAMP3, RGS1, IL12RB2, RSAD2, IFIT3 и IFI44L, уровни которых были повышены, а экспрессия GZMA и CD200 была снижена (фиг. 21А). 31 основной ген в профиле экспрессии ИЛ-27 в CD4+ Т-клетках перечислен на фиг. 21B. Примечательно, что 15 из 31 гена были связаны с неблагоприятным исходом, а именно AIM2, ALPK1, APOL1, GBP5, IFI44, IRF1, LAMP3, LOC400696, PARP3, RGS1, SAMD9L, SOCS1, STAT1, TNFSF13B и XAF1. Двенадцать основных генов профиля экспрессии (включая STAT1, GBP5, IFI44, XAF1 и SOCS1) были связаны с неблагоприятными исходами при ПКК (фиг. 22А), но эти же гены не были связаны с неблагоприятными исходами при раке молочной железы (РМЖ) (фиг. 22B).

Кроме того, уровни EBI3 в плазме крови у пациентов с ПКК могут предсказывать исход данного заболевания. У пациентов с ПКР собирали образцы сыворотки крови во время операции по удалению почки и измеряли уровни EBI3 с помощью пары антител, специфичных в отношении EBI3. Средние уровни EBI3 были повышены в сыворотке крови пациентов с ПКК по сравнению с сывороткой крови здоровых доноров (фиг. 23А). В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови от беременных доноров. Уровни EBI3 были наиболее высокими у субъектов с ПКК стадии 4 по сравнению со стадией 2 или стадией 3 (фиг. 23B); общая выживаемость (фиг. 23C) и выживаемость без признаков заболевания (фиг. 23D) были выше у пациентов с ПКК с низкими уровнями EBI3 в сыворотке крови.

Для проверки эффективности лечения антителом Ab1 против ИЛ-27 in vivo в мышиной модели ПКК клетки Renca ортотопически имплантировали в левую почку. Через трое суток после имплантации мышам внутрибрюшинно вводили антитело Ab1 против ИЛ-27 или изотипический контроль IgG1 человека (по 50 мг/кг два раза в неделю) в течение 2 недель. Через 21 сутки ткани собирали, обе почки взвешивали для расчета чистой массы опухоли и визуально подсчитывали метастазы в легких. Несмотря на то, что средняя масса опухоли оставалась в значительной степени постоянной (фиг. 24А), метастазирование в легкие было значительно снижено у мышей, получавших антитело Ab1 против ИЛ27, по сравнению с мышами, получавшими изотипический контроль (фиг. 24В).

Указанные данные показывают, что повышенные уровни транскриптов ИЛ-27р28, EBI3 и ИЛ-27РА в опухолях пациентов с ПКК связаны с неблагоприятным прогнозом. Антитело Ab1 против ИЛ-27 демонстрирует моноактивность в ортотопической модели ПКК in vivo, а блокада ИЛ-27 с помощью антитела Ab1 против ИЛ-27 представляет собой многообещающую стратегию для пациентов с ПКК, которые имеют высокие уровни циркулирующего EBI3.

Пример 14. Нацеливание in vivo на ИЛ-27 с использованием антитела Ab1 против ИЛ-27 в мышиной модели ортотопической ГЦК Hepa1-6.

Для изучения эффективности антитела Ab1 против ИЛ-27 in vivo на модели рака печени опухолевые клетки Hepa1-6-Luc путем инъекции вводили в печень мыши, и на 5, 8, 12 и 15 сутки после имплантации животным вводили антитело Ab1 против ИЛ-27 в дозе 50 мг/кг путем в/бр инъекции (фиг. 25A). Общий поток фотонов был снижен почти до исходного уровня у мышей, получавших антитело Ab1 против ИЛ-27, по сравнению с мышами, получавшими изотипический контроль чIgG1 (фиг. 25B).

Ответ на антитело Ab1 против ИЛ-27 в данной мышиной модели был дозозависимым. Мышам вводили изотипический контроль, 5 мг/кг антитела Ab1 против ИЛ-27, 25 мг/кг антитела Ab1 против ИЛ27 или 50 мг/кг антитела Ab1 против ИЛ-27 на 5, 8, 12 и 15 сутки после имплантации (фиг. 26А). Рост опухоли был наиболее медленным, близким к базовому уровню, у мышей, получавших 25 или 50 мг/кг антитела Ab1 против ИЛ-27 (фиг. 26B - 26F).

Чтобы определить, имеют ли значение в данной модели ранее определенные доклинические изменения в экспрессии генов, индуцированные антителом Ab1 против ИЛ-27, анализировали экспрессию ряда биомаркерных генов после введения антитела Ab1 против ИЛ-27 (фиг. 27A - 27C). 200 основных генов с наибольшей репрессией показаны в табл. 17А, а 200 основных генов с наибольшей индукцией показаны в табл. 17В. Полные списки генов с повышенной и пониженной экспрессией представлены выше в табл. 11A - 11B.

- 104 052811

Таблица 17А

200 генов в печени мышей Hepal-б с наибольшей репрессией после введения антитела АЫ против ИЛ-27

Ген	Кратность изменения	рзначение		Ген	Кратность изменения	рзначение
DEFB44-PS	0,18731	0,16963		GM7391	0,38252	0,02063
C1S2	0,18735	0,00760		GM7391	0,38252	0,02063
HIST1H1B	0,20429	0,13468		GM7391	0,38252	0,02063
GM15114	0,20467	0,11272		GM7391	0,38252	0,02063
G М2005	0,20501	0,01692		GM7391	0,38252	0,02063
KHDC1C	0,21082	0,08196		GM7391	0,38252	0,02063
GM2005	0,22434	0,00235		CD109	0,38422	0,08923
SERPINB7	0,22443	0,13886		ТМЕМ173	0,38467	0,09117
SERP1NB11	0,22512	0,05938		CD1117	0,38479	0,03381

- 105052811

CXCL3	0,22982	0,15165		KIEL	0,38506	0,02871
CDH10	0,23008	0,04656		SKA3	0,38794	0,19907
M1R1949	0,23543	0,13071		PRC1	0,38977	0,07960
SLC7A11	0,23650	0,01951		MBOAT1	0,39032	0,03388
LUZP4	0,24896	0,09520		TOP2A	0,39357	0,06590
IGHV1-81	0,25160	0,51163		1700049E17RIK2	0,39548	0,00842
PTPRTOS	0,25229	0,03379		SPEER4D	0,39557	0,01189
RP1	0,25355	0,15378		HTST1H3I	0,39572	0,38176
GM15127	0,25399	0,05002		TUBA 1A	0,39616	0,01385
CRISP 1	0,25472	0,08655		GM22265	0,39624	0,09085
GM15107	0,25489	0,05910		TRBJ1-7	0,39684	0,15669
SERPINB5	0,25593	0,04019		KTF20B	0,39753	0,09225
GM7665	0,25600	0,00338		SERP1NB2	0,39766	0,02587
TMEM252	0,25889	0,01729		GM14402	0,39768	0,24963
ΡΝΜΛ5	0,26178	0,09220		PLK4	0,39883	0,07277
CXCL15	0,26260	0,10373		C330027C09RIK	0,40017	0,10461
CLEC2G	0,26543	0,03883		GM15091	0,40058	0,07631
MMP13	0,26736	0,16866		NDC80	0,40091	0,07729
GM 15093	0,26907	0,07413		MYBL1	0,40096	0,16592
VMN1R53	0,27031	0,06485		K1F2C	0,40131	0,07030
GM 14409	0,27619	0,15580		GM12603	0,40134	0,08558
GM11884	0,27767	0,16819		CYP11A1	0,40271	0,26346
SLC16A4	0,27777	0,11590		FANCI	0,40316	0,17817
MMP12	0,27973	0,07864		CCNA2	0,40376	0,05984
KIF5C	0,28118	0,10032		RACGAP1	0,40619	0,07336
APELA	0,28255	0,06005		NCAPII	0,40648	0,11248
AFP (ΛΦΠ)	0,28256	0,04236		GM16094	0,40657	0,03168
IGKV1-122	0,28592	0,00900		C11251I	0,40668	0,30753
A630095E13RIK	0,29162	0,09055		GM15398	0,40844	0,10428
GM15109	0,29701	0,00582		KNTC1	0,40858	0,13345
OLFR1U	0,29889	0,21068		BST1	0,40915	0,09282
TNS4	0,30067	0,03812		K1F11	0,41151	0,07520
PLEKHS1	0,30148	0,07842		GM23576	0,41226	0,26181
LNCENC1	0,30470	0,09388		SHCBP1	0,41247	0,13607
THBS1	0,30908	0,02429		1GHV1-42	0,41274	0,44744
PLATR14	0,31317	0,08123		GPRC5A	0,41537	0,03331
RASSF9	0,31383	0,11251		TNFRSF10B	0,41617	0,10473
ITGA2	0,31895	0,06993		IL23A	0,41843	0,14139
LOC102634388	0,32002	0,02127		ER1CH2	0,41910	0,14436
LOC102634388	0,32002	0,02127		ANLN	0,41967	0,04088
GM 15093	0,32036	0,03800		CASC5	0,41996	0,11775

- 106052811

CEP55	0,32092	0,10073		GM17689	0,42053	0,27734
A630038E17RIK	0,32118	0,13340		SOX4	0,42211	0,07946
GM25552	0,32317	0,12614		GM22069	0,42215	0,04943
RPS26	0,32662	0,18403		PRR11	0,42277	0,07500
STRA6	0,33040	0,04984		SEMA3C	0,42285	0,02076
GM 15093	0,33144	0,04030		RETNLA	0,42307	0,04289
PSAT1	0,33163	0,09265		FRMD7	0,42356	0,02106
AKR1C18	0,33224	0,09827		TNFRSF11B	0,42500	0,05920
DEPDC1A	0,33251	0,18136		RAD54L	0,42591	0,16039
GM 1043 9	0,33495	0,06941		GM10488	0,42650	0,00744
GM24916	0,33509	0,20312		PLAT	0,42677	0,06470
STC1	0,33666	0,08291		GM13790	0,42685	0,11605
DPPA2	0,33711	0,08874		DTL	0,42697	0,16996
E030011O05RIK	0,33714	0,04863		SERPINB9B	0,42886	0,10643
GM20756	0,33749	0,02179		ASNS	0,42974	0,04714
GM22771	0,33862	0,28971		GM15097	0,42977	0,17217
1GKV6-32	0,33990	0,44350		TMED6	0,43183	0,26485
A1M2	0,34040	0,00912		SERP1NE1	0,43312	0,03450
C920009B18RIK	0,34064	0,02201		TPX2	0,43325	0,05879
BUB1	0,34878	0,07548		CENPK	0,43347	0,17724
TICRR	0,34960	0,17718		2810429I04RIK	0,43385	0,21706
M1S18BP1	0,35250	0,09094		4930461G14RIK	0,43432	0,17990
MAGEA6	0,35303	0,20666		HIST1H2AG	0,43516	0,18735
C1I1L3	0,35389	0,06510		1ER3	0,43524	0,14140
IGHV1-78	0,35720	0,28499		CHRNB1	0,43554	0,04999
ST1L	0,35848	0,14130		GM5431	0,43690	0,13001
GM26735	0,36001	0,06537		GM13247	0,43774	0,20349
REG 2	0,36041	0,49690		A1506816	0,43795	0,07730
SPRR1A	0,36134	0,00562		GM7942	0,43806	0,04319
PARPBP	0,36204	0,14708		CCNB1	0,44021	0,03617
PADI4	0,36592	0,09746		ZFP345	0,44040	0,24896
GM14139	0,36657	0,04225		1GI1V8-8	0,44047	0,45075
GPC3	0,36787	0,21392		ATAD5	0,44240	0,11428
MS4A6D	0,37021	0,01764		KDELR3	0,44372	0,08725
ATP10A	0,37100	0,09774		CDC25C	0,44462	0,03533
KIF23	0,37107	0,04316		IGKV4-72	0,44464	0,18026
GM20757	0,37125	0,22483		OLFR99	0,44744	0,16218
GM2318	0,37176	0,01361		GM25544	0,44759	0,13854
GM2318	0,37176	0,01361		M1R101C	0,44785	0,08179
GM2318	0,37176	0,01361		HYD1N	0,44832	0,14992
GM2318	0,37176	0,01361		1GHV5-16	0,44859	0,32098
IGHV1-9	0,37183	0,35845		NOP58	0,44866	0,13787
CPB1	0,37389	0,54454		CEL	0,44913	0,50615
TNFSF4	0,37410	0,14201		MS4A4A	0,44926	0,11256
RNASE 1	0,37521	0,29355		BCL2A1B	0,44968	0,00346
TIMP1	0,37633	0,07652		IGKV4-59	0,44969	0,49749
GM6020	0,37895	0,48362		CCL3	0,45007	0,10701
1700049E17RIK2	0,37958	0,00452		GM2933	0,45077	0,16505
IGH-VJ558	0,38192	0,43479		FAM102B	0,45149	0,13304
PRRG4	0,38250	0,10001

- 107052811

Таблица 17B

200 генов в печени мышей Hepa1-6 с наибольшей индукцией после введения антитела Ab1 против ИЛ-27

Ген	Кратность изменения	рзначение		Ген	Кратность изменения	рзначение
MUP-PS12	6,33152	0,00215		OLFR724	2,07902	0,09250
GM26184	5,61658	0,08504		GM23277	2,07764	0,09120
GKN2	4,82174	0,03776		A4GNT	2,07584	0,24306
MYH8	3,85386	0,31903		MUP21	2,07390	0,11490
MIR101B	3,69523	0,01108		GM24147	2,07383	0,26694
GKN1	3,48462	0,04511		MYBPC1	2,06732	0,13917
SLN	3,47316	0,18221		CYP3A59	2,06303	0,26277
MUC5AC	3,34061	0,06276		ACTN2	2,06253	0,14714
2310057J18RIK	3,04114	0,41002		MIR29A	2,06200	0,03405
PSCA	3,02691	0,12186		TFF1	2,06146	0,08032
GM25623	2,94838	0,01329		PLA2G1B	2,05956	0,44772
FAM83B	2,90452	0,02016		GM23021	2,05954	0,11112
GM23852	2,88192	0,07627		GM22607	2,04477	0,13834
SPTSSB	2,87259	0,09524		RPL10L	2,04430	0,06920
MIRLET7F-1	2,79416	0,04469		АСЕ2	2,03841	0,35049
MUP-PS16	2,77768	0,01138		PRAMEL3	2,03798	0,14902
ANXA10	2,68901	0,10472		SULT1B1	2,03237	0,24951
LGALS2	2,68519	0,13369		ARL14	2,02633	0,09522
CHIA1	2,67246	0,40779		GM11337	2,02394	0,02702
АКРЗ	2,66042	0,36655		CNN1	2,02048	0,02173
SLC13A1	2,62180	0,29356		LRIT2	2,01905	0,05334
GM766	2,62086	0,40345		АСОТ4	2,01479	0,21202
GM24537	2,61729	0,16494		LOC100125594	2,01433	0,02079
GM24138	2,60556	0,03739		GLB1L2	2,01156	0,03963
SIS	2,58535	0,37774		GM25605	2,00818	0,13287
2210407C18RIK	2,58374	0,06005		GM15384	2,00171	0,02548
S100G	2,58040	0,38773		GM94	1,99674	0,10946

- 108 052811

GM26354

2,54047

0,10968

OLFR1113

1,99669

0,12774

CKMT2	2,53798	0,26801		G630018N14RIK	1,99666	0,30168
GM26055	2,52487	0,21572		GM23232	1,99430	0,06721
GM5885	2,47858	0,03053		GM16378	1,99415	0,03571
AGR2	2,45816	0,18450		GM22838	1,99362	0,08752
VMN1R167	2,45428	0,09317		HSD3B5	1,99243	0,20188
GM25167	2,44373	0,02641		OLFR746	1,98892	0,03312
ATP5C1-PS	2,43743	0,04767		GM24254	1,98755	0,13006
GM24470	2,43383	0,16763		GM24232	1,98629	0,22120
MYH2	2,40309	0,16324		PRAP1	1,98616	0,37196
MIR326	2,37544	0,00590		ALPI	1,98615	0,41922
MIR122	2,37543	0,02420		MIR3964	1,98298	0,03007
MCPT9	2,37520	0,06227		GM22787	1,98276	0,01829
PSG18	2,35852	0,01151		GM26081	1,98214	0,17707
MUC6	2,35850	0,31084		GM22242	1,98012	0,31686
VMN2R115	2,35187	0,11114		IGHV1-77	1,97991	0,47423
GM25498	2,35108	0,00863		OLFR740	1,97966	0,21907
2010106E10RIK	2,33919	0,46065		OLFR1201	1,97856	0,03392
ERBB4	2,32759	0,03502		GM22654	1,97558	0,51008
LYPD8	2,31999	0,13737		OLFR747	1,97523	0,07186
CYP2A5	2,30476	0,23296		GM22521	1,97342	0,10732
BTNL5-PS	2,30131	0,16835		VMN1R172	1,97211	0,07313
GM24549	2,28941	0,11379		GM13773	1,97144	0,21792
GM24465	2,28686	0,23556		CLEC2H	1,97034	0,20412
SLC26A3	2,28613	0,34866		OLFR714	1,96697	0,08163
DPCR1	2,28459	0,06528		GM22284	1,96490	0,13765
GM 11844	2,27856	0,10541		GM26342	1,96171	0,02416
CYP4A32	2,26879	0,21331		OLFR190	1,96140	0,01845
MIR1928	2,26702	0,01338		CCDC152	1,96048	0,03753
GKN3	2,26609	0,38398		GM26048	1,95935	0,18068
KRT4	2,26351	0,15392		GM24410	1,95853	0,18441
PGC	2,26227	0,25834		LGALS4	1,95650	0,02146
HIST1H2BA	2,26012	0,03903		OLFR969	1,95620	0,09460
SPRR2A3	2,25406	0,19740		GM6222	1,95616	0,09501
IGKV12-41	2,23462	0,35478		OLFR913	1,95340	0,31106
PARD3BOS3	2,22662	0,11494		4930557A04RIK	1,95314	0,06455
CLCA4B	2,22470	0,41766		GM24750	1,95027	0,23848
GM23744	2,20755	0,12172		GM23043	1,94750	0,04897
VMN2R-PS129	2,20013	0,00212		STFA1	1,94574	0,08031
GM23241	2,19443	0,16439		SUCNR1	1,94177	0,10776
MYOZ2	2,19124	0,20907		MYOM1	1,94136	0,17534

- 109 052811

MIR192	2,19083	0,05530		KLK1B22	1,93841	0,12634
MYH1	2,18765	0,16532		GM23917	1,93358	0,19490
5033403H07RIK	2,18709	0,12308		GM15949	1,93187	0,04498
MIRLET7F-2	2,18612	0,16167		OLFR709-PS1	1,93037	0,07218
GM25009	2,18474	0,12429		OBP1A	1,92773	0,34212
MUC13	2,18238	0,44121		SULT2A1	1,92697	0,35277
PPP1R3A	2,17804	0,19680		GM24786	1,92300	0,21032
OLFR798	2,17172	0,00360		SGK2	1,91561	0,15674
SERPINA12	2,15429	0,03094		MIRLET7C-1	1,91086	0,07251
GM25864	2,15155	0,04041		VMN1R90	1,90960	0,10180
N-R5S155	2,15090	0,06906		GM23342	1,90947	0,02984
CYP2C65	2,14174	0,14376		REG3G	1,90771	0,15987
GM14750	2,14105	0,05245		GM24839	1,90586	0,26313
GM23026	2,13427	0,08632		N-R5S157	1,90509	0,11667
HAMP2	2,12517	0,26750		GM25023	1,90492	0,02529
GM24527	2,12509	0,07768		CES2B	1,90228	0,13857
OLFR891	2,12488	0,07314		IGHV8-11	1,90067	0,15551
OLFR68	2,12477	0,17461		GM25982	1,89862	0,05418
TRAV6-2	2,12335	0,16838		ATP4A	1,89851	0,39680
CYP4F40	2,11940	0,18482		GM26162	1,89809	0,01472
TRDN	2,11902	0,23956		PNPLA3	1,89778	0,00313
CFTR	2,11685	0,32080		AU015336	1,89289	0,07944
XIRP2	2,10948	0,20311		GM24621	1,89139	0,08404
CYP8B1	2,10691	0,09121		CYP2C40	1,89106	0,40000
GM23629	2,10532	0,05899		GM25602	1,89074	0,15275
GM25076	2,10385	0,09801		ADGRG7	1,88894	0,32051
1700080G11RIK	2,10309	0,16206		SLC30A10	1,88809	0,12880
N-R5S96	2,09968	0,04925		GM25836	1,88784	0,19345
GM 11027	2,09669	0,30087		GM25629	1,88723	0,11919
SLC22A29	2,08861	0,26634		GM24861	1,88583	0,03961
GSTT2	2,08187	0,23716		GM21057	1,88436	0,08496
GM23911	2,08111	0,19027

Примечательно, было обнаружено, что антитело Ab1 против ИЛ-27 подавляет несколько ключевых ингибиторных генов, включая экспрессию PD-L1, TIGIT и АФП (фиг. 28B - 28D), без существенных изменений в экспрессии EBI3, ИЛ-27 и ИЛ-27РА (фиг. 28А). Было также обнаружено, что путь ТФР-β подавляется после введения антитела Ab1 против ИЛ-27, при сниженной экспрессии TNFRSF10B, TNFRSFla и PDGFA (фиг. 28C и фиг. 28E).

Кроме того, воздействие антителом Ab1 против ИЛ-27 изменяет инфильтрацию опухолевых клеток иммунной системы. Антитело Ab1 против ИЛ-27 способствует повышению уровней транскриптов макрофагов и NK-клеток в микроокружении опухоли (МОО; фиг. 29A). В частности, антитело Ab1 против ИЛ-27 повышает CD206 и CD163 (фиг. 29B), которые являются ключевыми маркерами, ассоциированными с макрофагами; и было обнаружено, что антитело Ab1 против ИЛ-27 модулирует специфические NK-ассоциированные рецепторы (фиг. 30). Неоднородность модуляции маркера NK предполагает, что антитела Ab1 против ИЛ-27 влияет на функцию NK, а не только на инфильтрацию в опухолях HEPA1-6. В дополнение к этому, различные другие маркеры клеточной поверхности демонстрировали модулированную экспрессию после обработки антителом Ab1 против ИЛ-27 (фиг. 31).

Пример 15. TNFSF15 как биомаркер ингибирования ИЛ-27.

TNFSF15 (растворимый фактор фактора некроза опухоли 15), также известный как TL1A (ФНОподобный лиганд 1A) или VEGFI (ингибитор фактора роста эндотелия сосудов), представляет собой цитокин из семейства факторов некроза опухоли, который, как известно, играет роль в ингибировании ангиогенеза (ссылка: VEGI, a novel cytokine of the tumor necrosis factor family, is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of colon carcinomas in vivo. FASEB J.1999 Human Genome Sciences, Inc.) и может действовать как костимулятор Т-клеток, индуцируя выработку воспалительных цитокинов (см. Работы Migone et al., Immunity 16 (3): 479 - 92 (March 2002); Jin et al., Mucosal Immunology 6: 886 - 99 (December

- 110 052811

19, 2012)). Было показано, что TNFSF15 активируется после блокирования ИЛ-27 после лечения ингибитором ИЛ-27, подтверждая его полезность в качестве биомаркера при оценке эффективности ингибирования ИЛ-27 после введения терапевтического средства, предназначенного для ингибирования ИЛ-27.

ИЛ-27 ингибировал продуцирование цитокинов ИЛ-17А, ИФН-γ (или ИФН-гамма) и ФНО-α (или ФНО-альфа) в активированных МКПК. Объединенные образцы МКПК человека от 3 доноров стимулировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) на протяжении 3 суток в присутствии или в отсутствие ИЛ-27 (100 нг/мл). Надосадочные жидкости собирали и исследовали на предмет влияния ИЛ-27 на ИЛ-17А, ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-10 с помощью цитометрического анализа с микрогранулами; ИЛ-27 привел к снижению продуцирования ИЛ-17А, ИФН-γ и ФНО-α и не влиял на продуцирование ИЛ10 (фиг. 32A - 32D).

И наоборот, блокирование ИЛ-27 с помощью антитела Ab1 против ИЛ-27 в активированных МКПК привело к повышению продуцирования цитокинов. МКПК от 3-4 отдельных доноров стимулировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) в течение 4 суток в присутствии или в отсутствие антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл). Надосадочные жидкости собирали и исследовали на предмет влияния на ИЛ-17А, ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-10 с помощью цитометрического анализа с микрогранулами; антитело Ab1 против ИЛ-27 привело к повышению продуцирования ИЛ-17А, ИФН-γ и ФНО-α (фиг. 33A - 33D).

Чтобы определить другие изменения в экспрессии генов, которые можно было бы отслеживать как фармакодинамические или биомаркерные показатели активности антитела Ab1 против ИЛ-27, провели определение профилей экспрессии генов путем анализа активированных МКПК с помощью микрочипов. МКПК от трех отдельных доноров стимулировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) в присутствии или в отсутствие антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл) в течение 24 ч. Из каждого образца выделяли РНК и обрабатывали ее для определения профиля экспрессии генов с помощью микрочипов для определения эффекта ингибирования ИЛ-27. Несколько генов были дифференциально экспрессированы, что видно на графиках рассеяния, после ингибирования ИЛ -27 антителом Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с изотипическим контролем, включая гены MMP1, MMP10 и TNFSF15, как показано в табл. 18. Фиг. 34 представляет собой график рассеяния, отображающий 1og2-кратное изменение экспрессии генов после ингибирования ИЛ-27 по сравнению с контролем (ось x) в сравнении со значимостью (p-значение) изменений экспрессии генов после обработки антителом Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с контролем (ось y). Уровень транскрипта TNFSF15 значительно повысился после блокады ИЛ-27. Уровень экспрессии гена TNFSF15 воспроизводимым образом повысился после воздействия антителом Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с воздействием изотипическим контролем у всех 3 отдельных доноров, как показано на фиг. 35.

- 111 052811

Таблица 18

Профили транскрипции в МКПК in vitro после ингибирования ИЛ-27 200 генов с наибольшей индукцией, вызванной ингибированием ИЛ-27

Оботначени е гена	Кратность изменения: [антитело АЬ1 против ИЛ-27 / IgGl]	р-значение: антитело АЫ против ИЛ-27 по сравнению с IgGl
LOC1053750 02	1,645118	0,000457
OR2AG1	1,633194	0,02143
SNORD115- 10	1,61366	0,042825
M1R548AK.	1,594121	0,047753
VTRNA2-1	1,539071	0,018135
LOC1053758 37	1,528625	0,042765
MIR4540	1,506249	0,014019
TNFSF15	1,48874	0,00196
LOC1053779 50	1,474449	0,017305
LOC1053752 91	1,455875	0,037183
LOC392232	1,442977	0,034733
IFNA6	1,435639	0,032471
MIG7	1,433659	0,011024
LOC1053694 73	1,428921	0,045657
GAGE1	1,427557	0,025117
LOC1005060 98	1,426037	0,008256
LOC1053776 43	1,416114	0,011246
LOC1053704 79	1,414996	0,016319
LOCI 019273 42	1,387702	0,001705

Обозначение гена	Кратность изменения [Антитело АЫ против ИЛ-27 / IgGl]	р-значение Антитело АЫ против ИЛ-27 по сравнению с IgGl
MIR519B	0,542762	0,017631
MIR4272	0,633358	0,045813
MIR4712	0,662079	0,013235
MIR4738	0,666032	0,008113
MIR4668	0,676758	0,002044
MIR634	0,67895	0,010185
L1NCO1233	0,695199	0,03774
MIR19B2	0,706896	0,045961
LOC105378073	0,712528	0,010495
LOC105370770	0,716513	0,010176
КССАТ198	0,72041	0,040506
LOC101927552	0,721552	0,002026
MIR1302-1	0,72292	0,031298
АРОН	0,729982	0,018512
OR56A3	0,731084	0,014148
SD1M1	0,73208	0,001115
LOC101928395	0,736856	0,03984
LCE1F	0,739268	0,025556
LOC100129476	0,740716	0,005034

- 112052811

spoil	1,384138	0,019734
LOC1053741 46	1,372296	0,042536
MMP10	1,35563	0,035631
MIR513A1	1,349552	0,003188
LOC1053731 87	1,33789	0,011411
MIR302E	1,329896	0,049451
LOC1053747 15	1,328902	0,039526
CRYGC	1,326275	0,002843
NR0B1	1,322219	0,03641
LOC1053728 23	1,322197	0,008592
KRT74	1,321165	0,032883
LOC1053755 38	1,319595	0,019808
LOC1053782 20	1,319239	0,004044
SNORD116- 23	1,314349	0,035597
ROCK1P1	1,311881	0,009781
LOC1053757 34	1,310484	0,01621
MIR874	1,30894	0,00796
LOC1024672 16	1,306665	0,029327
MIR18B	1,305409	0,02179
LOC1053786 88	1,30501	0,005119
PIPSL	1,303637	0,013713
LOC1053744 84	1,302454	0,01914

C6orflO	0,741035	0,045023
DDX46	0,744975	0,031001
MIR544B	0,745497	0,000331
LOC105371152	0,745893	0,001107
HBZ	0,746633	0,032099
LINC00173	0,75377	0,046112
MIR95	0,754058	0,029894
LOC105369893	0,758578	0,042461
RNU6-58P	0,761545	0,022808
EPYC	0,763574	0,015155
WWC2-AS1	0,764054	2,67E-05
LOC105370359	0,766521	0,01068
MIR519A2	0,766808	0,045329
NSAP11	0,768519	0,020859
TDGF1	0,771131	0,010419
LOC646588	0,771593	0,022006
LOCI 01927281	0,773448	0,028332
LOC105374670	0,777386	0,028457
A2MP1	0,778456	0,001304
SLC7A11	0,779049	0,048778
PRH2	0,780025	0,029219
SNORD114-19	0,781894	0,040583

- 113 052811

LRRC46	1,299851	0,040688
SMG7-AS1	1,298713	0,039351
LOC1053787 49	1,295692	0,02812
CT55	1,295094	0,029095
MPDZ	1,288722	0,005299
H1ST1H4B	1,288471	0,02363
LOC1053792 23	1,287376	0,007854
POM121L4P	1,28655	0,006754
HIST1H2AH	1,285763	0,045671
OR6C74	1,284028	0,021357
KRT33A	1,28161	0,041615
PLCE1-AS1	1,280197	0,023448
ALX1	1,279203	0,042523
KCNN3	1,274928	0,01882
LOC1053771 24	1,274321	0,01119
BMP 15	1,272919	0,013839
RPLP0P2	1,271495	0,003828
LOC1053740 24	1,271237	0,040873
OR4C5	1,270368	0,008923
LOC1053762 34	1,269085	0,000332
LINC01591	1,268954	0,010567
LOC1019286 63	1,265242	0,003128
LOC1053758 90	1,264046	0,005132
IGHV3-16	1,2619	0,010831
TRIM55	1,260372	0,014182

LOC105373550	0,78246	0,003341
LOC101927413	0,785604	0,025946
MIR765	0,785901	0,027588
ALDH2	0,787067	0,03251
LOC105370607	0,787785	0,029023
ZNF717	0,788458	0,019536
MIR7-2	0,78937	0,024631
OR2Y1	0,791148	0,005362
FCGR1C	0,791398	0,036053
LOC102723879	0,792285	0,021851
LOC153910	0,793028	0,026202
M1R410	0,793302	0,007555
LOG 102725105	0,794407	0,019386
LOC105373461	0,798351	0,021561
LOC105373109	0,799694	0,035357
LOC105376899	0,8002	0,011314
LOC105375857	0,800606	0,049069
LOC105371883	0,802577	0,001618
M1R3121	0,804293	0,01562
KRTAP19-2	0,805488	0,007923
LOC105370057	0,805791	0,036764
LOC105375969	0,806373	0,002891
TMED3	0,807779	0,049844
LOC105371856	0,809355	0,000543
EYAI	0,809515	0,008405

- 114052811

LOC1053710 18	1,259721	0,026344
LOC1053719 76	1,256944	0,030406
LOC1001293 45	1,256654	0,011358
LOC1053758 75	1,254562	0,047657
TM4SF1	1,253654	0,008913
LOC1053752 73	1,25346	0,035173
LOC1019282 79	1,252743	0,015819
MIR4493	1,251366	0,046562
LOC1053764 25	1,249945	0,029786
LOC1053762 43	1,248505	0,004647
OR4K17	1,24847	0,035361
LINC00865	1,248322	0,007719
CAV3	1,246213	0,024171
LOC1053698 30	1,244553	0,000338
RSI	1,244259	0,009886
LOC1019292 84	1,243628	0,009664
SPATAI 7- AS1	1,243442	0,036463
C9orfl29	1,241344	0,008005
TEX 12	1,239195	0,039282
OLIG2	1,235907	0,016016
SRGAP1	1,232365	0,0168

LOC105372147	0,810403	0,018231
SNORT) 115-20	0,81087	0,01113
LOC105378424	0,812013	0,025289
LOC105379104	0,812998	0,026458
LOC105378078	0,815137	0,043079
PCAT18	0,815152	0,012051
CRYBAI	0,815488	0,008079
DOCK4-AS1	0,816945	0,003652
PFN4	0,817389	0,017892
LOC105373456	0,817412	0,047871
LOC105376207	0,817593	0,03227
RUFY4	0,817735	0,047204
PGM5P2	0,820132	0,047774
FLJ20712	0,822198	0,042585
LOC105378741	0,822688	0,023776
KIR3DL2	0,822791	0,017144
IRS4	0,824149	0,020883
RNF175	0,824277	0,040132
MIR4473	0,824601	0,01576
C21orf62-ASl	0,825875	0,029134
TPI1P3	0,826368	0,005535

- 115 052811

LOC1053743 23	1,23136	0,006316
MIR1283-1	1,230642	0,005018
GJD4	1,229305	0,016043
LOC1053747 70	1,229204	0,023076
IGFL2	1,226273	0,0209
LOC1053769 44	1,225754	0,017134
ALG1L	1,224177	0,002154
PCDHB18P	1,223959	0,009905
RIMBP2	1,223519	0,039249
OR52B4	1,22324	0,024734
ADGRL2	1,223099	0,02921
SCG5	1,222368	0,013456
LOC1053765 70	1,221999	0,007463
LOC654841	1,221214	0,016472
HAS2-AS1	1,221198	0,047307
SPATA24	1,220361	0,009933
LINC01538	1,218128	0,007969
CCDC85C	1,217577	0,040344
LOC1053705 71	1,216124	0,013425
LOC1019274 99	1,214266	0,029007
TFPI2	1,213888	0,020451
TSSK3	1,212747	0,003353
LOC1053718 18	1,21189	0,040895
NPY1R	1,211641	0,033039
LOC1053765 30	1,211121	0,008511

OR6K2	0,82656	0,027951
LOC105375971	0,827067	0,028154
LOC105377841	0,827522	0,046396
LOC105370772	0,828585	0,019601
OR5H6	0,828925	0,033792
LOC400958	0,829718	0,027201
KCNAB1-AS2	0,830199	0,046563
ANXA8L1	0,830719	0,017418
LOC102724520	0,831113	0,019589
ALS2CR11	0,831379	0,005442
LINC01052	0,831661	0,038213
MIR492	0,8348	0,041657
LOC101928119	0,835502	0,004564
SYT4	0,836312	0,025009
LOC101928421	0,836388	0,04031
CASC23	0,838526	0,026392
LOC105375855	0,838859	0,027901
LINC00366	0,839834	0,009281
DEPDC7	0,841512	0,035067
LOCI 027243 30	0,842675	0,033285
PLA2G2D	0,843078	0,032033
LINC01166	0,844555	0,044378
RPE65	0,845494	0,005261
GLIS3	0,845755	0,047774
LINC01523	0,84612	0,021712

- 116 052811

EVX1-AS	1,208195	0,026851
NPAS3	1,207602	0,019453
OR51Q1	1,206806	0,037877
LOC1019274 18	1,206024	0,018913
SSTR2	1,20578	0,043155
LOC653653	1,205761	0,036703
LOC1053722 49	1,203904	0,010203
LOC1027236 39	1,203543	0,007388
LOC1053754 76	1,203038	0,015508
FKBP7	1,201988	0,042042
HRAT56	1,201942	0,020195
MIR4778	1,201939	0,017579
LOC1053781 80	1,201664	0,020417
SCARA3	1,200146	0,008278
LOC1019302 94	1,199177	0,022741
GUCY1A2	1,197934	0,000492
MGAM2	1,197312	0,042246
TEX 14	1,197177	0,037082
OR2L13	1,19687	0,022817
IGSF10	1,195837	0,02574
SFRP2	1,194806	0,008784
GALNT16	1,194743	0,022064
TM4SF19	1,194237	0,042563
LOC1019270 55	1,194215	0,029334
XIRP2-AS1	1,194173	0,045563
KCNJ16	1,194028	0,018938

LOC105374787	0,84724	0,001573
IGLV3-32	0,84882	0,010713
LOC105373595	0,849597	0,020159
LOC728040	0,849791	0,01671
LINC00597	0,849976	0,037685
MIR3591	0,850417	0,045077
KRTAP10-3	0,851393	0,03041
ZC3H12B	0,853207	0,026583
LOC105370690	0,853241	0,001048
ZIC3	0,853712	0,039829
FGF10-AS1	0,853729	0,035366
PMS2P5	0,854195	0,048446
SUGT1P1	0,854792	0,034214
LOC105369293	0,855263	0,044491
DEFBI19	0,85586	0,008256
LOC105369488	0,856419	0,018871
NRXN1	0,856769	0,047832
LVCAT8	0,856829	0,028297
KIZ-AS1	0,857975	0,033864
LOC105378283	0,858492	0,036091
MIR1290	0,858598	0,031938
GKAP1	0,858622	0,042287
LGR5	0,858793	0,01244
NUDT10	0,85898	0,015489
DSCAM-AS1	0,85983	0,003654
LOC105376640	0,86136	0,004118

- 117 052811

LOC1053705 61	1,194006	0,046886
ASIC2	1,193784	0,020987
LOC401191	1,19219	0,013408
INCAI	1,189251	0,007965
LOC1053761 61	1,188411	0,016143
ADAMTS3	1,188383	0,048302
LOC1019282 31	1,187861	0,031467
CMYA5	1,187321	0,024627
IGSF5	1,187268	0,046046
MIR3177	1,187017	0,041887
GPC4	1,186929	0,023815
OC90	1,186462	0,046711
ST8SIA6- AS1	1,185617	0,034159
SPDYE4	1,185393	0,007728
CHODL-AS1	1,185235	0,029759
USP17L17	1,184052	0,037856
LOC1053769 75	1,182382	0,011412
LOC1019271 09	1,180499	0,008781
CLCNKB	1,179758	0,033508
NR1I2	1,179102	0,020533
CASC17	1,179066	0,018346
FAM 19 A3	1,177994	0,002009
LOC1053755 86	1,177235	0,025561
SUMO1P3	1,176228	0,027566
FLJ44874	1,175661	0,037981
NACAP1	1,175123	0,02547

LOC105377693	0,862866	0,038576
SFTA3	0,863502	0,038347
CYYR1-AS1	0,864454	0,033992
C9orf3	0,864736	0,006764
LOC105373886	0,864772	0,012476
LOC105370060	0,865766	0,0341
CTBP2	0,866251	0,009633
LOC101927328	0,86679	0,033119
ZNF449	0,866794	0,036778
ΟΓΗ	0,86879	0,02991
MAP1LC3B2	0,869085	0,00058
АСПН	0,87022	0,049977
LOC105370018	0,873226	0,033161
LOC105376347	0,87418	0,033977
OR52D1	0,874677	0,037917
SFTA1P	0,87492	0,012883
LOC105376658	0,877883	0,038524
LINC00092	0,878605	0,03258
ERVK3-2	0,878835	0,001504
LOC105379385	0,878896	0,02955
ATP8B3	0,879183	0,00631
CTRB2	0,880249	0,025135
LINC01527	0,880518	0,040258
KRTAP19-7	0,880746	0,030687
LOC105376244	0,881151	0,036515
LOC105376554	0,881259	0,022378

- 118 052811

PTPN3	1,175009	0,028207
SSX2B	1,174369	0,003748
SSX2B	1,174369	0,003748
LOXHD1	1,173847	0,008937
LINC01104	1,172936	0,038443
SERPINI1	1,172725	0,00357
LOC1019283 87	1,172215	0,007858
CDH12	1,171839	0,00615
LPIN3	1,171832	0,027473
LOC1053695 75	1,171058	0,022101
SHC3	1,170409	0,014611
AIFM3	1,170074	0,001628
LOC1053705 64	1,16947	0,031193
KCNJ14	1,169446	0,03716
LOC1027233 23	1,16941	0,005804
LOC1019296 08	1,169147	0,005278
LINC01039	1,168287	0,028847
LOC1053749 80	1,168286	0,039283
GAL	1,167357	0,013476
MIR107	1,1655	0,014498
SCGB1A1	1,165175	0,007183
LOC1019272 77	1,164914	0,022585
LMOD3	1,164303	0,013973
MIR520G	1,163434	0,033228
LINC01618	1,162641	0,049271

ZNF30	0,8823	0,024368
LINC00894	0,88431	0,020883
MIR592	0,884366	0,023417
LOH12CR2	0,886427	0,036694
ZNF846	0,887147	0,019874
LINC01202	0,887201	0,036865
CACNG4	0,8877	0,031884
LOC642648	0,888364	0,019056
LOC105370526	0,888491	0,002669
TRIM45	0,889074	0,046329
AQP11	0,889428	0,005461
ANKEF1	0,889878	0,019532
PTGDR2	0,890525	0,042594
LOC100129869	0,891023	0,036875
RBM12B-AS1	0,892387	0,00632
LOC105378081	0,894442	0,029207
MIR365A	0,895999	0,04973
LINC00581	0,896004	0,048047
LYPD8	0,896025	0,042973
OR14I1	0,896295	0,007798
FAM217A	0,89866	0,019317
TMEM254-AS1	0,898681	0,049183
LARS2-AS1	0,898922	0,014049
CCDC150	0,899017	0,002703
GLI1	0,899604	0,00209

- 119 052811

LOC1019295 28	1,16255	0,024828
LOC1053757 10	1,162468	0,036178
LOC1027247 32	1,162206	0,015044
GEM	1,161606	0,005818
HLX-AS1	1,161435	0,03007
LOC441239	1,160728	0,018365
LOC1053738 23	1,157242	0,000638
TINAG	1,157194	0,039893
MFAP2	1,155841	0,026956
TUB-AS1	1,154582	0,031326

CD163L1	0,90077	0,019563
МАР2К2	0,901533	0,028712
DIRC3	0,901772	0,047553
IQCC	0,901863	0,009081
IRX6	0,901966	0,041501
TRIM63	0,903387	0,048605
SPATA18	0,90354	0,004953
LPEQ6126	0,903553	0,030286
RIPPLY3	0,905238	0,027728
ZNF192P1	0,905716	0,021822

В последующем эксперименте объединенные образцы МКПК человека либо стимулировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) в течение 24 ч, либо оставляли без стимуляции, в присутствии двух разных лотов антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл) или изотипического контроля. Собирали РНК и определяли относительное количество (ОК) TNFSF15 с помощью количественной ПЦР, измеряя транскрипты TNFSF15 с использованием геноспецифических зондов Taqman. Полученные результаты подтвердили повышение экспрессии TNFSF15 после ингибирования ИЛ-27, и было обнаружено, что оно зависит от активации клеток иммунной системы, поскольку экспрессия TNFSF15 не повышалась после воздействия антитела Ab1 против ИЛ-27 в покоящихся МКПК, как показано на фиг. 36А - 36B.

Относительное повышение уровня транскрипта TNFSF15 дополнительно усиливалось при добавлении моноцитов в культуры МКПК. Объединенные образцы МКПК человека либо оставляли в покоящемся состоянии (покоящиеся МКПК), либо в МКПК добавляли моноциты, выделенные из МКПК, в соотношении 1:2 (покоящиеся МКПК + моноциты), либо моноциты оставляли в покоящемся состоянии (покоящиеся моноциты), либо МКПК активировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) (активированные МКПК), либо в МКПК добавляли моноциты, выделенные из МКПК, в соотношении 1 : 2, и активировали их с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) (активированные МКПК + моноциты). Клетки культивировали в течение 24 ч, затем выделяли РНК для определения уровней TNFSF15 с помощью количественной ПЦР. Значения, представленные на фиг. 37, отображают кратность изменения транскрипта TNFSF15 после ингибирования ИЛ-27 антителом Ab1 против ИЛ-27 по сравнению с изотипическим контролем.

Эффект повышения уровней транскрипта TNFSF15 был специфичен для блокады ИЛ-27 и не наблюдался с другими антителами, нацеленными на CD39 или CD112R, как показано на фиг. 38. В данном случае объединенные образцы МКПК человека дополняли макрофагами, происходящими из моноцитов, и стимулировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) в течение 24 ч в присутствии контрольного антитела IgG1, антитела против ИЛ-27 (антитела Ab1 против ИЛ-27 (1 мкг/мл), антитела IgG4 против CD39 (1 мкг/мл), антитела IgG1 против CD112R (1 мкг/мл) или антитела IgG4 против CD112R (1 мкг/мл). РНК собирали через 24 часа; транскрипт TNFSF15 измеряли в надосадочных жидкостях от клеточных культур с использованием набора для ТИФА Human TL1A/TNFSF15 DuoSet ELISA (R & D Systems).

Кроме того, как показано на фиг. 39А и фиг. 39B, также наблюдалось повышение уровня секретируемого белка TNFSF15 после блокирования ИЛ-27 антителом Ab1 против ИЛ-27 в активированных МКПК, что характеризовалось замедленной кинетикой по сравнению с транскриптом (фиг. 39A - 39B). Объединенные образцы МКПК человека дополняли макрофагами, происходящими из моноцитов, и стимулировали с помощью антитела против CD3 (0,25 мкг/мл) в присутствии контрольного IgG1 или антитела против ИЛ-27 (антитело Ab1 против ИЛ-27, 1 мкг/мл). РНК собирали в 1, 2 и 5 сутки и определяли количество транскриптов (ОК) TNFSF15 с помощью количественной ПЦР для каждой временной точки. Культуральные надосадочные жидкости собирали в разное время; белок TNFSF15 измеряли с помощью сэндвич-ТИФА.

- 120 -

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело, которое проявляет антагонизм в отношении ИЛ-27 человека, или антигенсвязывающая часть указанного антитела, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть специфически связываются с эпитопом, содержащим: (i) аминокислоты с 37 по 56 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28); (ii) аминокислоты с 142 по 164 в соответствии с SEQ ID NO: 2 (ИЛ-27р28); или (iii) как (i), так и (ii), при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть содержат CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, где указанная CDR1 легкой цепи состоит из N-XXXXXXLFSSNXKXYXX-C, указанная CDR3 легкой цепи состоит из N-XXXASAXXX-C, указанная CDR2 тяжелой цепи состоит из NXXSSSXSYXYXXXXXXX-C и указанная CDR3 тяжелой цепи состоит из NXXXXGRTSYTATXHNXXXX-C, где X представляет собой любую аминокислоту.
2. 2. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающая часть не содержат CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:

   (i) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно;

   (ii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 39, 40 и 41, соответственно;

   (iii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 53, 54 и 55, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 61, 62 и 63, соответственно;

   (iv) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 75, 76 и 77, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 83, 84 и 85, соответственно;

   (v) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 97, 98 и 99, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 105, 106 и 107, соответственно;

   (vi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 119, 120 и 121, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 127, 128 и 129, соответственно;

   (vii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 12, 13 и 14, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 20, 21 и 22, соответственно;

   (viii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 34, 35 и 36, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 42, 43 и 44, соответственно;

   (ix) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 56, 57 и 58, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 64, 65 и 66, соответственно;

   (x) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 78, 79 и 80, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 86, 87 и 88, соответственно;

   (xi) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 100, 101 и 102, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 108, 109 и 110, соответственно; и (xii) последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 122, 123 и 124, соответственно, и последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, представленных в SEQ ID NOs: 130, 131 и 132, соответственно.
3. 3. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающая часть проявляют по меньшей мере одно или большее число из следующих свойств:

   (i) связываются с ИЛ-27 человека с равновесной константой диссоциации (K_D), равной 15 нМ или меньше;

   (ii) блокируют связывание ИЛ-27 с рецептором ИЛ-27;

   (iii) ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и/или STAT3 в клетке;

   (iv) ингибируют или снижают опосредованное ИЛ-27 ингибирование экспрессии CD161 в клетке;

   (v) ингибируют или снижают опосредованную ИЛ-27 экспрессию PD-L1 и/или TIM-3 в клетке; и

   - 121 052811 (vi) индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки.
4. 4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-3, отличающиеся тем, что указанное антитело выбрано из группы, состоящей из антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE.
5. 5. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
6. 6. Способ ингибирования или снижения фосфорилирования STAT1 и/или STAT3 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-4, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают фосфорилирование STAT1 и/или STAT3 в клетке.
7. 7. Способ ингибирования или снижения ингибирования экспрессии CD161 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-4, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют или снижают ингибирование экспрессии CD161 в клетке.
8. 8. Способ ингибирования или снижения экспрессии PD-L1 и/или TIM-3 в клетке, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-4, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют экспрессию PD-L1 и/или TIM-3 в клетке.
9. 9. Способ индукции или усиления секреции одного или большего числа цитокинов из клетки, включающий в себя приведение указанной клетки в контакт с выделенным антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-4, при этом указанные антитело или его антигенсвязывающая часть индуцируют или усиливают опосредованную PD-1 секрецию одного или большего числа цитокинов из клетки.
10. 10. Способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-4, или фармацевтической композиции по п.5.
11. 11. Способ лечения ИЛ-27-ассоциированного онкологического заболевания у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-4, или фармацевтической композиции по п.5.
12. 12. Способ по п.11, где ИЛ-27-ассоциированное онкологическое заболевание выбрано из рака легкого, саркомы, рака яичка, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, меланомы, онкологического заболевания головы и шеи, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака эндометрия, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака головного мозга, лимфомы, лейкоза или рака почки.
13. 13. Способ по п.11, где ИЛ-27-ассоциированное онкологическое заболевание представляет собой немелкоклеточный рак легкого.
14. 14. Способ по п.11, где ИЛ-27-ассоциированное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному.
15. 15. Способ по п.11, где ИЛ-27-ассоциированное онкологическое заболевание представляет собой почечно-клеточную карциному.
16. 16. Способ по п.11, где ИЛ-27-ассоциированное онкологическое заболевание представляет собой рак желудка.
17. 17. Способ усиления одной или большего числа функций антитела против PD-1, включающий в себя воздействие на клетку антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп. 1-4, одновременно с или последовательно с антителом против PD-1, тем самым обеспечивая усиление одной или большего числа функций антител против PD1.
18. 18. Способ по п.17, где указанные одна или большее число функций антитела против PD-1 выбраны из группы, состоящей из: опосредованная PD-1 секреция цитокинов;

    опосредованная антителом против PD-1 секреция ФНО-α; опосредованная антителом против PD-1 секреция ИЛ-6, и их комбинаций.
19. 19. Способ по любому из пп.10-16, отличающийся тем, что указанное выделенное антитело или его антигенсвязывающую часть вводят в комбинации с одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов или процедур, при этом указанные второй терапевтический агент или процедура выбраны из группы, состоящей из: химиотерапии, нацеленной противораковой терапии, онколитического препарата, цитотоксического агента, иммунной терапии, цитокина, хирургической процедуры, лучевой процедуры, активатора костимулирующей молекулы, ингибитора ингибиторной молекулы, вакцины или клеточной иммунотерапии, или их комбинации.
20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанные один или большее число дополнительных терапевтических агентов представляют собой антагонист PD-1, ингибитор PD-L1, ингибитор TIM-3, ингибитор LAG-3, ингибитор TIGIT, ингибитор CD112R, ингибитор TAM, агонист STING, агонист 41BB или их комбинацию.

    - 122 -