ECSP088086A - METODOS DE PURIFICACION DE PROTEINAS QUE CONTIENEN REGIONES Fc - Google Patents

Abstract

En varios aspectos, el presente invento describe métodos para la separación de proteínas que contienen una región Fc de un líquido fuente compuesto por la proteína y una o más impurezas. En los métodos del invento, la proteína que contiene la región Fc (la proteína objetivo) es adsorbida en un agente enlazador del Fc y el agente enlazador del Fc es lavado con una solución búfer que contiene una sal de catión divalente para eliminar una o más impurezas. La proteína es posteriormente recuperada del agente enlazador del Fc en una solución elución. Los métodos del invento son particularmente útiles en la remoción de impurezas tales como especies variantes de intrones [intron read through] (IRT), especies con menos enlaces bisulfuro (UDB) y/o especies variantes de bajo peso molecular (LMW). Los métodos del invento también son efectivos en la remoción de impurezas tales como proteínas de células huésped (HCP) y DNA. Los métodos del presente invento incluyen uno o más pasos de separación por cromatografía y adicionalmente pueden incluir uno o más pasos de filtración. Los pasos de separación por cromatografía pueden ser continuos o descontinuos (por ejemplo, un procedimiento batch), o una combinación de ambos. En varios ejemplos en la aplicación de patente [embodiments], los métodos incluyen uno o más pasos de filtración, por ejemplo, para la remoción de virus, para concentrar y preparar una solución búfer que contenga la proteína objetivo, y para la remoción de contaminantes microbianos. En varios ejemplos en la aplicación de patente, la proteína que contiene la región Fc es un polipéptido enlazador de antígenos (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo) o una inmunoadesina (por ejemplo, una inmunoadesina receptora de TNF). En varios ejemplos en la aplicación de patente, la proteína que contiene la región Fc es una fusión de anticuerpos, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado. En un ejemplo preferente en la aplicación de patente, la proteína que contiene la región Fc es un anticuerpo humano o humanizado de tipo anti-IL-13- Alternativamente, en otros ejemplos en la aplicación de patente, la proteína que contiene la región Fc puede enlazar un antígeno tal como Aß, CD3, VEGF, EGFR, CD33, CD20, HER-2, TNFa, CD25, RSV, IgE, gp IIb/IIIa, CD11a o a4integrin. En varios ejemplos en la aplicación de patente, la proteína que contiene la región Fc es producida de manera recombinante. En varios ejemplos en la aplicación de patente, la proteína que contiene la región Fc es producida de manera recombinante en una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO). En varios ejemplos en la aplicación de patente, la o las impurezas incluyen una o más proteínas de célula huésped, el DNA de una célula huésped, la proteína de un cultivo de células, una especie no deseada de la proteína que contiene la región Fc, y mezclas de las anteriores. Por ejemplo, en varios ejemplos en la aplicación de patente, la especie no deseada de una proteína que contiene una región Fc incluye una o más cadenas de anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen secuencias de intrones, una o más cadenas de anticuerpos o fragmentos de los mismos con un inadecuado enlace bisulfuro, la mitad de un anticuerpo o fragmentos del mismo, un dímero de cadena ligera o fragmentos del mismo, y un dímero de cadena pesada o fragmentos del mismo. En un aspecto, los métodos del presente invento purifican una proteína que contiene una región Fc de un líquido fuente compuesto por la proteína y una o más impurezas primero adsorbiendo la proteína en un agente enlazador del Fc, seguido de un lavado del agente enlazador del Fc con una solución búfer que contiene una sal de catión divalente para eliminar una o más impurezas, y posteriormente recuperando la proteína del agente enlazador del Fc. En varios ejemplos en la aplicación de patente, los pasos, para la adsorción de la proteína en un agente enlazador del Fc y de lavado del agente enlazador del Fc con una solución búfer que contiene una sal de catión divalente, son realizados a temperaturas en el rango de entre 2°C y 24°C. En varios ejemplos en la aplicación de patente, los pasos para la recuperación de la proteína a partir del agente enlazador del Fc incluyen hacer una elución de la proteína utilizando un búfer de elución con un pH en el rango de entre 2.0 y hasta alrededor de 6.5. En varios ejemplos en la aplicación de patente, el agente enlazador de la región Fc incluye uno o más Proteínas A y Proteínas G. En un ejemplo preferente en la aplicación de patente, el agente enlazador del Fc es inmovilizado en una fase sólida. Esta fase sólida puede incluir, por ejemplo, uno o más perlas [bead], una matriz agarosa, sílice, y mezclas de ellos. La sal de catión divalente presente en el búfer, que es utilizada para lavar al agente enlazador del Fc puede incluir, por ejemplo, una sal caotrópica. Las sales adecuadas de catión divalente para la preparación de la solución de lavado búfer incluyen, pero no están limitadas a, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de níquel y mezclas de ellas. En varios ejemplos en la aplicación de patente, las sales adecuadas de catión divalente para la preparación de la solución de lavado búfer incluyen, pero no están limitadas a, tiocianato (SCN-), perclorato (ClO4-), nitrato (NO3-), sales cloruros y bromuros de cationes del grupo divalente II (por ejemplo, magnesio, calcio, bario, etc.), de cationes de metales de transición divalentes (por ejemplo, cobre, níquel, manganeso, etc.), y combinaciones de estas sales. En varios ejemplos en la aplicación de patente, la solución búfer que contiene la sal de catión divalente tiene un valor de pH en el rango de entre alrededor de 4 y 9, y en algunos ejemplos en la aplicación de patente, entre alrededor de 4 y hasta alrededor de 8, entre alrededor de 4.5 y hasta alrededor de 7.5 o entre alrededor de 6 y hasta alrededor de 8. También se tiene la intención de incluir, como parte del alcance de este invento, los valores y rangos incluidos y/o intermedios dentro de los rangos establecidos anteriormente. Por ejemplo, la sal de catión divalente tiene un valor de pH de entre alrededor de 7.1 y hasta alrededor de 7.9, de entre alrededor de 7.2 y hasta alrededor de 7.9, de entre alrededor de 7.3 y hasta alrededor de 7.7, de entre alrededor de 7.4 y hasta alrededor de 7.6, de entre alrededor de 4 y hasta alrededor de 5, de entre alrededor de 5 y hasta alrededor de 6, de entre alrededor de 6 y hasta alrededor de 7, o de entre alrededor de 8 y hasta alrededor de 9. Más aún, se tiene la intención de incluir como parte del alcance de este invento los rangos que tienen los valores enumerados en el presente como límites superiores o inferiores. Por ejemplo, la sal de catión divalente tiene un pH de al menos alrededor de (o de alrededor de) 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, u 8. En varios ejemplos en la aplicación de patente, la solución búfer tiene una concentración de sal de catión divalente en un rango de entre alrededor de 0.1 M hasta alrededor de 5 M, y en algunos ejemplos en la aplicación de patente, entre alrededor de 0.5 M y hasta alrededor de 3 M, entre alrededor 1.0 M y hasta alrededor de 3 M o entre alrededor de 0.6 M y hasta alrededor de 2.5 M. Por ejemplo, el búfer de catión divalente puede incluir CaCl2 al menos alrededor de 0.6 M o MgCl2 al menos alrededor de 2M o CaCl2 al menos alrededor de 2M. También se tiene la intención de incluir, como parte del alcance de este invento, los valores y rangos incluidos y/o intermedios dentro de los rangos establecidos anteriormente. Por ejemplo, la solución búfer tiene una concentración de sal de catión divalente de entre alrededor de 0.5M y hasta alrededor de 0.75 M, de entre alrededor de 0.5M y hasta alrededor de 0.8M, de entre alrededor de 0.5M hasta alrededor de 0.9M, de entre alrededor de 0.5M y hasta 1.0M, de entre alrededor de 0.5M y hasta 2 M, de entre alrededor de 1.5M y hasta alrededor de 2.0M, de entre alrededor de 1.5M y hasta alrededor de 2.5M, de entre alrededor de 1.5M y hasta alrededor de 3.0M, o de entre alrededor de 2.5M y hasta alrededor de 3.0M. Más aún, se tiene la intención de incluir como parte del alcance de este invento los rangos que tienen los valores enumerados en el presente como límites superiores o inferiores. Por ejemplo, la solución búfer tiene una concentración de sal de catión divalente de entre alrededor de (o de alrededor de) 0.6 M, 1 M, 1.5 M, 2 M, 2.5 M, o 3 M. En varios ejemplos en la aplicación de patente, la solución búfer que contiene una sal de catión divalente tiene una temperatura en el rango de entre 2°C y alrededor de 24°C. En varios ejemplos en la aplicación de patente, el paso de recuperación de la proteína a partir del agente enlazador del Fc incluye hacer una elución de la proteína utilizando un búfer de elución con un pH en el rango de entre 2.0 y hasta alrededor de 6.5, preferiblemente en el rango de entre alrededor de 2.0 y hasta alrededor de 4.0, más preferiblemente en el rango de entre alrededor de 2.5 y hasta alrededor de 3.5. También se tiene la intención de incluir, como parte del alcance de este invento, los valores y rangos incluidos y/o intermedios dentro de los rangos establecidos anteriormente. Por ejemplo, el búfer de elución tiene un pH de entre alrededor de 2 y hasta alrededor de 3 o entre alrededor de 3 y hasta alrededor de 4. Más aún, se tiene la intención de incluir como parte del alcance de este invento los rangos que tienen los valores enumerados en el presente como límites superiores o inferiores. Por ejemplo, el búfer de elución tiene un pH de por lo menos alrededor de (o de alrededor de) 2, 2.5, 3, 3.5, o 4.En varios ejemplos en la aplicación de patente, las proteínas recuperadas pueden ser sometidas a pasos adicionales de purificación sean éstos anteriores, o posteriores, al paso de cromatografía del agente enlazador del Fc. Por ejemplo, pasos ejemplares de purificación adicional incluyen, pero no se lim