EP0349558A1 - Immobilisierungssubstanz - Google Patents

Immobilisierungssubstanz

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EP0349558A1
EP0349558A1 EP88902404A EP88902404A EP0349558A1 EP 0349558 A1 EP0349558 A1 EP 0349558A1 EP 88902404 A EP88902404 A EP 88902404A EP 88902404 A EP88902404 A EP 88902404A EP 0349558 A1 EP0349558 A1 EP 0349558A1
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EP
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substance according
adhesives
adhesins
immobilization
immobilizing
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Withdrawn
Application number
EP88902404A
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English (en)
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Inventor
Wolfgang Georg Konrad MÜLLER-LIERHEIM
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Dr Mueller-Lierheim AG
Original Assignee
Dr Mueller-Lierheim AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
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    • A61L24/106—Fibrin; Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier

Definitions

  • the following procedure can be carried out for obtaining the adhesins.
  • the corresponding E. coli bacteria can be cultivated on agar in, for example, petri dishes. Separation of the adhesins from the cell membranes of the bacteria are first sonicated and then separated by ultracentrifugation and then purified by subsequent chromatographic purification. In the cultivation in 10 petri dishes with a diameter of 14 cm, about 40 to 50 mg of coarsely purified adhesins or about 30 mg of highly purified adhesions are obtained.
  • the non-fimbria-associated adhesins obtained can have the following specificities depending on the E. coli strain:
  • NFA non-fimbria associated adhesins

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Description

Beschreibung
Immobilisierungssubstanz
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Immobilisie¬ rungssubstanz zur Bindung von biologischem Material an Trägern zu schaffen.
Diese Immobilisierungεsubstanz ist' dadurch gekennzeichnet, daß adhäεive Proteine, die aus extrazellulären Strukturen, inεbesonTlere Fimbrien, Pili, äußeren Membranen oder Kapsel von Gram-negativen Bakterien, insbesondere Colibakterien, isoliert sind, verwendet werden.
Diese adhäsiven Proteine (Adhäεine) besitzen typiεcherweis ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 12 000 bis 30 000 Dalton und können Kohlehydratkomponenten von Glyco- lipoiden und Glycoproteinen höherer Zellen erkennen. Diese adhäsiven Proteine vermitteln die Adhärenε der Bakterien an höhere Zellen (z. B. Erythrozyten, ymphozyten) und an Gewebe (z. B. Epithel). Diese adhäεiven Proteine werden im allgemeinen von Säugetier-Proteoεen nicht geεpalten.
Dieεe iεolierten adhäεiven Proteine (Glycoproteine) bzw. di entsprechenden Bindungsstellen dieser Proteine oder der Proteinfragmente oder der gegebenenfalls daraus z. B. durch Hydrolyse gewonnenen Polypeptide werden erfindungsgemäß zur Immobilisierung von Zellen, insbeεondere Säugerzellen, Gewe ben, von pharmazeutischen Wirkstoffen, Antikörpern oder
Wachstumεkörpern an Trägern verwendet. Inεbesondere für die Oberflächenaufbereitung von Implantaten lassen sich diese adhäsiven Proteine als Anheftfaktoren für Säugetierzellen bzw. Gewebe verwenden. Die Zellen bzw. Gewebe lassen sich über die adhäεiven Proteine an der Oberfläche eines Implan- tatgrundkörperε quaεi irreversibel binden. Als Wachεtumε- faktoren kommen Blutserum oder Beεtandteile davon εowie Fibronektin in Frage. Auch eine Kombination auε Stoff- Wechselprodukten von Zellen und auf biochemischem Weg modi- fizierten Naturprodukten sind als Wachstumεfaktoren geeig¬ net. Weitere Wachεtumsfaktoren können zur Zelldifferenzie¬ rung führende Proteine und Knochenεubstanz induzierende Pro teine sein. Bei den Implantaten kann es sich um extra- korporale oder implantierbare künstliche Organe, Gefäße, Prothesen, Hautersatz, Zahnersatz, künstliche Augenlinsen, Kontaktlinsen und dgl. handeln. Durch kovalente Bindung können die Adhäsine an den Implantatoberflächen gebunden sein.
Auch bei der Formulierung von Arzneimitteln lasεen εich die adhäsiven Proteine zur Bindung der pharmazeutischen Wirk¬ sto fe, insbesondere von Blutgerinnungsmitteln, an den Trä¬ gerkörpern, inεbeεondere pulverförmigen Trägerkörpern, ver¬ wenden.
Alε Trägerkörper kommen auch Kohlehydratkomponenten von Glycolipoiden und Glycoproteinen enthaltenden höheren Zelle in Frage, da dieεe von den adhäεiven Proteinen spezifisch erkannt werden.
Ferner können die adhäsiven Proteine als Immobilisierungε- substanz für Antikörper produzierende Zellen, inεbeεondere Säugerzellen, von Gewebe und dgl. verwendet werden. Ferner besteht eine Anwendungsmöglichkeit der Adhäεine in der Endo theliumbildung bei Gefäßverpflanzungen.
Eine weitere wichtige Anwendung besteht darin, daß die Ad¬ häεine in der Chirurgie als Gewebekleber zum Einsatz kommen Da die Adhäsine wasεerlöεlich sind, können sie als Einkompo nentenkleber zur Anwendung kommen. Die Anwendungεgebiete sind insbesondere die Unfallchirurgie, die Weichteilchirur gie und auch die Leberchirurgie, da in diesen Fällen Nähte häufig nicht zum gewünschten Erfolg führen. Gegenüber den bislang verwendeten Fimbrienklebern, bei denen es εich um einen Z"weikomponentenkleber handelt, der während der Opera tion angemischt und schnell verarbeitet werden muß, und in der Handhabung daher schwierig und nicht ohne Risiko für d Blutgerinnung ist, treten bei dem Adhäsine-Gewebekleber di se Nachteile nicht auf. Da Adhäsine wasserlöslich sind, kö nen siegln Form eines Einkomponentenklebers verwendet wer¬ den.
Bevorzugt kommen Nicht-Fi brien-assoziierte Adhäεine zum Einsatz, da diese εich mit größerer Ausbeute von der Zell¬ oberfläche der Bakterien isolieren laεsen. Diese Nicht- Fimbrien-assoziierten Adhäsine, welche bevorzugt aus Escherichia Coli-Bakterien gewonnen werden, binden selekti an Humanzellmembranen. Das Molekulargewicht liegt in der Größenordnung von 12 000 bis 30 000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 20 000 Dalton. Die Nicht-Fimbrien-aεsoziierten Adhäεine können Aggregate bilden. Dieses dann apparente
Molekulargewicht nach der Aggregatbildung beträgt etwa
6 7 10 bis 10 Dalton. Ferner sind dieεe Adhäsine wasserlösli
Für die Gewinnung der Adhäsine läßt εich folgendes Verfahr durchführen. Auf Agar lassen sich in beispielsweise Petri- schalen die entsprechenden E. Coli-Bakterien kultivieren. Trennung der Adhäsine von den Zellmembranen der Bakterien werden dieεe zunächst ultrabeschallt und dann durch Ultraz trifugieren getrennt urid nachfolgende chromatographische A reinigung gereinigt. Man erhält bei der Kultivierung in 10 Petrischalten mit 14 cm Durchmeεεer etwa 40 bis 50 mg grob gereinigte Adhäsine bzw. etwa 30 mg hoch gereinigte Adhäεi Die gewonnenen Nicht-Fimbrien-assoziierten Adhäsine können je nach E. Coli-Stamm folgende Spezifizitäten aufweisen:
Spezifitäten bei den Nicht-Fimbrien-assoziierten Adhäsinen (NFA)
NFA-1: Rezeptor ist das Glycophorin A (Vorkommen ist vor allem auf Erythrozyten, Bindung aber auch an Nierenzellen)
NFA-2: Rezeptor ist daε Glycophorin A
NFA-3: Rezeptor iεt daε Blutgruppenantigen N
NFA-4: Rezeptor iεt daε Blutgruppenantigen M
NFA-5: Rezeptor ist das Blutgruppenantigen M.

Claims

Λ101520Patentansprüche:
1. Immobilisierungεsubstanz, gekennzeichnet durch adhäsive 25 Proteine (Adhäsine), die aus extrazellulären Strukturen, insbesondere Fimbrien, Pili, äußeren Membranen oder Kapsel von Gram-negativen Bakterien, insbeεondere Colibakterien, iεoliert sind, zur Bindung von Zellen, insbesondere Säuger zellen,, Geweben, pharmazeutischen Wirkstoffen, Antikörpern 30 Wachεtumsfaktoren an Trägern.
2. Immobilisierungssubstanz nach Anspruch 1, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß durch die Adhäεine εpezifiεch Kohle¬ hydratkomponenten von Glycolipoiden oder Glycoproteinen er
35 kannt bzw. adsorptiv gebunden werden.
Λ
3. Immobiliεierungssubstanz nach Anεpruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Adhäεinen erkannten bzw. ge bundenen Kohlehydratkomponenten Glycolipoide oder Glyco- proteine sind, die in der äußeren Membran von Säugetier- zellen vorkommen.
4. Immobilisierungsεubstanz nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet", daß die Bindung der Adhäεine an Säugetier-zellmembranbeεtändige Glycolipoide oder Glyco- proteine artεpezifisch erfolgt.
5. Immobilisierungεεubεtanz nach einem der Anεprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäεine auε extrazellu¬ lären Strukturen von Eεcherichia Coli-Bakterien iεoliert sind.
6. Immobiliεierungεεubεtanz nach einem der Anεprüche 1 bis
5, gekennzeichnet durch Nicht-Fimbrien-asεoziierte Adhäεine aus E.coli.
7. Immobilisierungssubεtanz nach einem der Anεprüche 1 bis
6, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäεine waεserlöslich εind.
8. Immobiliεierungεsubεtanz nach einem der Anεprüche 1 bis
7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Fimbrien-asεoziier ten Adhäsine ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 12000 bis 30 000 Dalton aufweisen.
9. Immobilisierungssubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis
8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Fimbrien-assoziier ten Adhäsine im Aggregationszustand ein apparenteε Moleku-
6 7 largewicht von etwa 10 biε 10 Dalton aufweisen.
10. Immobilisierungssubstanz nach den Ansprüchen 1 biε 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäεine zur Immobiliεieru von Säugetierzellen und -geweben, inεbesondere menschliche Zellen und Gewebe, an Implantate oder künstliche Organe ve wendet werden.
11. Immobilisierungssubstanz nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäsine zur Formulierung oder als Wirkstoff von Arzneimitteln oder zur Herstellung von Diagnostika Verwendung finden.
12. Immobilisierungεsubεtanz nach den Ansprüchen 1 biε 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäεine zur Zellkultur oder Zelltrennung in vitro Verwendung finden.
13. Immobiliεierungssubεtanz nach einem der Anεprüche 1 bi
12, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäεine alε Gewebe¬ kleber für menschliches oder tierisches Gewebe ausgebildet sind.
14. Immobiliεierungssubεtanz nach einem der Ansprüche 1 bi
13, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäsine in einer Lösu (insbesondere wäßrigen Lösung) vorliegen.
15. Verwendung einer Immobilisierungεεubεtanz nach einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Endotheliumbildung an ver¬ pflanzten Gefäßen.
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