EP0386074A1 - Immunologisches trenn- und nachweisverfahren für mehrfachbestimmungen - Google Patents

Immunologisches trenn- und nachweisverfahren für mehrfachbestimmungen

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EP0386074A1
EP0386074A1 EP19880909756 EP88909756A EP0386074A1 EP 0386074 A1 EP0386074 A1 EP 0386074A1 EP 19880909756 EP19880909756 EP 19880909756 EP 88909756 A EP88909756 A EP 88909756A EP 0386074 A1 EP0386074 A1 EP 0386074A1
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EP
European Patent Office
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tube
antibodies
separation
ring
antigens
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Withdrawn
Application number
EP19880909756
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English (en)
French (fr)
Inventor
Armin Dr. Gilak
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Original Assignee
Individual
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5082—Test tubes per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the invention relates to an immunological separation and detection method for the determination of at least two antigens in a liquid using a tube coated on the inside with antibodies, a sphere coated with antibodies and only one type of labeling.
  • DE-C2 29 43 648 suggests using different solid phases coated with antibodies for the detection of different ligands in a liquid sample, which solid phases can be easily separated from one another. After the incubation of these solid phases with the sample solutions, the radioactive supernatant must be removed and then the solid phases separated.
  • a simplified separation method for immunological determinations is known from DE-C2 32 17 032. According to this method, an antigen / antibody complex is separated from the supernatant reagent solution by a dry chromatographic column. However, this method is only suitable for determining an unknown substance.
  • DE-C2 33 22 373 proposes to mark carrier particles with a fluorescent marking substance and then to load them with antigens and / or antibodies.
  • the distinction between the individual particles can be made either by using different fluorescent markers or by connecting the particles with different concentrations or with several markers. This method has disadvantages with regard to the different marking substances and the associated various settings on the detection device.
  • the aforementioned prior art has the disadvantages that either only one substance can be detected or the separation of the substances to be determined requires a comparatively high outlay.
  • the object of the invention is to provide a method which enables simple and rapid separation of immunologically detectable substances and which, in the case of the use of radioactive marking agents, permits a contamination-proof procedure.
  • a first antigen to be determined by the IRMA technique is bound to the inside wall of the reaction vessel and a second antigen according to a conventional solid-phase RIA to a ball
  • the supernatant liquid which, in addition to excess reagents, also contains a third contains immune complex to be determined, separated from the solid-phase complexes by a dry chromatography column and thereby the third complex to be determined migrates into the upper part of the column, then removes the chromatographic column for measurement and places it in a suitable measuring device, closes the tube, turns it upside down and the immune complex in the lower part and on the ball in the Closure part measures one after the other.
  • the method according to the invention can also be used for the determination of only two antigens either by omitting the coated sphere and detecting a second immune complex in the chromatography column or by using a sphere coated with antibodies and the chromatography column only for separation or Absorbing excess reagents used.
  • the labeling of the antibodies or antigens is preferably carried out using radioisotopes, but depending on the analytical problem or laboratory situation which is treating Z u, it can advantageously also be done by fluorescence and
  • Luminance labeling or by enzymatic methods. Iodine should be mentioned as the preferred radioisotope; fluorescein isothiocyanate could be used in a suitable manner for the fluorescence labeling. In case of a
  • Enzyme labeling would use a permeable chromatography column and the determination would be made photometrically.
  • polyclonal or monoclonal antibodies will preferably be used.
  • both types of antibody can also be used next to one another or microfine silica or proteins can be used to bind antigens.
  • the biological materials can advantageously be coupled to the solid phase using the carbodiimide process.
  • the device from DE-C2 is particularly suitable for carrying out the method according to the invention
  • a ring is provided in the upper inner part of the reaction vessel, the inner diameter of which is preferably 1 to 2% smaller than the diameter of the ball, thus the ball is measured either by adhesion in the cap of the device or fixed to the ring of the reaction vessel. It remains in this position even after the reaction vessel has been turned several times.
  • Magnetic means can advantageously be used to separate the two solid-phase immune complexes.
  • a permanent magnet in the closure flap is suitable for fixing a ball containing a metallic substance.
  • test combination contains the device described above, for example the lower part of the reaction vessel and the sphere being provided with biological materials, for example antigens, antibodies and other proteins.
  • biological materials for example antigens, antibodies and other proteins.
  • This test combination also contains a cap, a dry chromatographic column, other labeled and unlabelled antibodies, as well as labeled and unlabelled antigens and 0.9% saline.
  • reaction, separation and detection can be carried out in one device without the need for centrifuging or decanting steps need to be carried out without any risk of contamination of the laboratory or laboratory personnel by splashing reagent solution. It is particularly suitable for immunologically detectable substances that are sensibly determined side by side.
  • One way of carrying out the method according to the invention is to use a reaction and separation device which has a ring 4 in the upper part of a tube 1 near the tube opening.
  • the difference between the outer and inner ring radius is about 1/10 of the outer diameter of the ring, between the bottom of the tube 1 and the ring 4 there is a ball 3, the diameter of which is slightly larger than the inner diameter of the ring 4.
  • the lower part of the inner tube wall 2 and / or the ball 3 are coated with biological material.
  • the device contains a removable chromatography column 6 between the ball 3 and a sealing cap 5.
  • Antibodies 1 and l1 react below with antigen A, antibody 2 with antigen B and antibody 3 with antigen C.
  • the lower part of an inner tube wall is coated with unlabeled antibody 1 directed against antigen A.
  • One sphere is directed against antigen B.
  • Antibody 2 coated to carry out the test, a mixture of antibody 3, 125 I-labeled antibody 1 'is added to the antigen A, B and C standard solutions and, if appropriate, diluted patient sera, which have been pipetted beforehand into a sample tube coated with unlabeled antibody 1. and also labeled antigen B and Antigen C added, for volume compensation and to increase the specificity of the detection reaction, further additives may be used.
  • the test tubes are closed with a cap, shaken thoroughly with a vibration mixer and then incubated for about 1 hour at room temperature.
  • a chromatography column is placed in the tube on the ball and the solution of the sample tube is sucked up by capillary action. It is separated from the antigen A sandwich complex located on the tube wall and the antigen B antibody complex present on the sphere.
  • the solid-phase immune complexes are washed and, moreover, material adsorbed on the vessel wall is dissolved and also sucked into the column.
  • Chromatography separates reaction products and reactants according to their molecular weight. Antibodies and immune complexes migrate to the upper part of the chromatography column due to their higher molecular weight, whereas low-molecular-weight reactants remain in the lower part of the column, including the labeled antigens.
  • the C-antibody complex will therefore be found in the upper part of the column.
  • the entire device is placed in the measuring vessel of a gamma counter and the pulse rate is determined.
  • the antigen B measurement is carried out without a column, the tube being turned over, that is to say with the opening facing downward, into the measuring vessel.
  • the sphere with the antigen B antibody complex to be measured is now in the cap.
  • To determine antigen A the tube is turned over again, that is to say brought into the normal position, the hollow sphere remaining in the cap in a slightly wetted state and not falling back onto the bottom of the tube. In this position, the tube is placed in the measuring cell of the gamma counter for measuring the wall-mounted antigen A solid-phase immune complex.
  • the method according to the invention can, however, also be carried out with a ring on the upper inside of the tube, in which case the ball does not adhere to the cap, but rather to the ring by means of adhesive force, and likewise does not fall back onto the bottom of the tube when the tube is in the normal, normal position.
  • TSH Thirotropic Hormone
  • FT FT 4
  • TSH TSH standard solutions
  • Rctcchen mouse anti-TSH antibodies
  • T 4 antibodies a mixture of 200 / ul of 1 25 j labeled monoclonal TSH antibodies and 125 j labeled T 3 and T 4 and corresponding highly specific polyclonal T 3 antibodies was added.
  • the reaction mixture is mixed on a vibratory mixer and incubated for about one hour at 37 ° C or overnight at room temperature.
  • Gamma counters placed for FT 3 measurement and the pulse rate measured.
  • Control 1 36989 36798 36893 3.40 Control 2 46322 46450 46386 12.50
  • T3 and total T4 and the TSH in the serum 100 ⁇ l of serum samples and standard solutions from total T3, total T4 and TSH are pipetted as in Example 1 into reaction tubes with the appropriate antibodies and 500 ⁇ .1 of a liquid Mixture of corresponding tracers and T3 antibodies with the addition of 0.03 M thiomersal as deblocking agent for the complete release of T3 and T4 from their carrier proteins such as TBG.
  • the procedure is then as described in Example 1.
  • the values obtained are listed in the following measurement reports and curves.

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Description

Immunologisches Trenn- und Nachwei sverfahren für Mehrfachbestimmungen
Die Erfindung betrifft ein immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren zur Bestimmung von wenigstens zwei Antigenen in einer Flüssigkeit unter Verwendung eines an seiner Innenseite mit Antikörpern beschichteten Röhrchens, einer mit Antikörpern beschichteten Kugel und lediglich einer Markierungsart.
Bei der Vielzahl der zu diagnostischen oder therapeutischen zwecken zu bestimmenden Parameter besteht ein erhebliches Bedürfnis, solche Bestimmungen schnell und ungefährlich für das Laborpersonal, am besten parallel durchzuführen.
Für diese zwecke erweisen sich immunologische üntersuchungsmethoden als besonders geeignet.
So schlägt die DE-C2 29 43 648 vor, zum Nachweis verschiedener Liganden in einer Flüssigkeitsprobe verschiedenartige mit Antikörpern beschichtete Festphasen, die sich leicht voneinander trennen lassen, einzusetzen. Nach der Inkubation dieser Festphasen mit den Probelösungen muß der radioaktive überstand entfernt und anschließend die Festphasen voneinander getrennt werden.
Aus der DE-C2 32 17 032 ist ein vereinfachtes Separationsverfahren für immunologische Bestimmungen bekannt. Gemäß diesem Verfahren wird ein Antigen/Antikörperkomplex von der überstehenden Reagenzlösung durch eine trockene chromatographische Säule getrennt. Dieses Verfahren eignet sich aber nur zur Bestimmung einer unbekannten Substanz.
Die DE-C2 33 22 373 schlägt vor, Trägerpartikel mit einem fluoreszierenden Markierungsstoff zu markieren und anschließend mit Antigenen und/oder Antikörpern zu beladen. Die Unterscheidung zwischen den einzelnen Partikeln kann dadurch erfolgen, daß entweder unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsstoffe verwendet werden oder aber die Partikel mit unterschiedlichen Konzentration oder mit mehreren Markierungsstoffen verbunden sind. Dieses Verfahren ist hinsichtlich der verschiedenen Markierungsstoffe und der damit verbundenen verschiedenen Einstellungen am Nachweisgerät mit Nachteilen behaftet.
Allgemeine Verfahrensweisen zur Durchführung eines Radioimmunoessays oder eines sogenannten immunoradiometrischen Tests (IRMA) sind in der Chemiker - Zeitung, 103, (1979) Nr. 2, S. 53 - 68 festgehalten.
Dem vorgenannten Stand der Technik haften die Nachteile an, daß entweder nur eine Substanz nachgewiesen werden kann oder die Trennung der zu bestimmenden Substanzen einen vergleichsweise hohen Aufwand erfordern.
Demgemäß liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine einfache und schnelle Trennung immunologisch nachweisbarer Substanzen ermöglicht und im Falle der Verwendung radioaktiver Markierungsmittel eine kontaminationssichere Verfahrensweise erlaubt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man ein erstes zu bestimmendes Antigen nach der IRMA-Technik an der Innenwand des Reaktionsgefäßes und ein zweites Antigen gemäß einem herkömmlichen Festphasen-RIA an einer Kugel bindet, die überstehende Flüssigkeit, die neben überschüssigen Reagenzien noch einen dritten zu bestimmenden Immunkomplex enthält, durch eine trockene Chromatographiesäule von den Festphasenkomplexen abtrennt und dabei den dritten zu bestimmenden Komplex in den oberen Teil der Säule wandern läßt, anschließend zur Messung die chromatographische Säule entfernt und in eine geeignete Meßvorrichtung einbringt, das Röhrchen verschließt, auf den Kopf stellt und den Immunkomplex im unteren Teil sowie den an der Kugel im Verschlußteil nacheinander mißt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung von lediglich zwei Antigenen einsetzen, indem man entweder die beschichtete Kugel wegläßt und einen zweiten Immunkomplex in der Chromatographiesäule nachweist oder indem man eine mit Antikörpern beschichtete Kugel einsetzt und die Chromatographiesäule nur zum Abtrennen bzw. Aufsaugen überschüssiger Reagenzien verwendet.
Die Markierung der Antikörper bzw. Antigene erfolgt vorzugsweise mit Radioisotopen, läßt sich aber je nach dem Zu behandelnden analytischen Problem bzw. Laborgegebenheiten vorteilhafterweise auch durch Fluoreszenz- und
Luminiszenzmarkierung oder durch enzymatische Methoden bewirken. Als bevorzugtes Radioisotop wäre 125Jod zu nennen, zur Fluoreszenzmarkierung ließe sich in geeigneter Weise Fluoresceinisothiocyanat einsetzen. Im Falle einer
Enzymmarkierung würde eine durchlässige Chromatographiesäule verwendet werden und die Bestimmung photometrisch erfolgen.
Je nach analytischem Problem wird man vorzugsweise polyclonale oder monoclonale Antikörper verwenden. In bevorzugter Weise können beide Antikörperarten auch nebeneinander verwendet werden oder zur Bindung von Antigenen mikrofeine Kieselsäure oder Proteine verwendet werden. Die biologischen Materialien können vorteilhafterweise mit dem Carbodiimidverfahren an die Festphase gekoppelt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich in besonderer Weise die Vorrichtung aus der DE-C2
33 47 464 in Verbindung. mit der Chromatographiesäule aus der DE-C2 37 17 032. Gegebenenfalls ist im oberen inneren Teil des Reaktionsgefäßes ein Ring vorgesehen, dessen innerer Durchmesser vorzugsweise 1 bis 2 % kleiner ist als der Durchmesser der Kugel, zur Messung wird somit die Kugel entweder durch Adhäsion in der Verschlußkappe der Vorrichtung oder am Ring des Reaktionsgefäßes fixiert. Sie verharrt in dieser Stellung auch noch nach mehrmaligem Wenden des Reaktionsgefäßes.
Vorteilhafterweise lassen sich zur Trennung der beiden Festphasen-Immunkomplexe magnetische Mittel einsetzen. So ist beispielsweise ein Permanentmagnet in der Verschlußklappe geeignet, eine eine metallische Substanz enthaltende Kugel zu fixieren.
Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Reagenzien und Vorrichtungsteile sind in einer Testkombination zusammengestellt. Diese Testkombination enthält die oben beschriebene Vorrichtung, wobei beispielsweise der untere Teil des Reaktionsgefäßes und die Kugel mit biologischen Materialien, beispielsweise Antigenen, Antikörpern und anderen Proteinen versehen sind. Weiterhin enthält diese Testkombination eine Verschlußkappe, eine trockene chromatographische Säule, weitere markierte und nichtmarkierte Antikörper sowie markierte und nichtmarkierte Antigene und 0,9 %-ige Kochsalzlösung.
Die mit der Erfindung erreichten Vorteile bestehen darin, daß Reaktionsdurchführung, Trennung und Nachweis in einer Vorrichtung durchgeführt werden können, ohne daß Zentrifugier- oder Dekantierschritte zwischengeschaltet werden müßen, ohne daß gegebenenfalls die Gefahr einer Kontaminierung des Labors oder Laborpersonals durch Verspritzen von Reagenzlösung besteht. Es eignet sich insbesondere für immunologisch nachweisbare Substanzen, die sinnvollerweise nebeneinander bestimmt werden.
Nachfolgend wird die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert.
Eine Möglichkeit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung einer Reaktions- und Separationsvorrichtung, die im oberen Teil eines Rδhrchens 1 nahe der Röhrchenöffnung einen Ring 4 aufweist. Die Differenz zwischen Ringaußen- und Ringinnenradius beträgt etwa 1/10 des Außendurchmessers des Rings, zwischen dem Boden des Röhrchens 1 und dem Ring 4 befindet sich eine Kugel 3, deren Durchmesser geringfügig größer als der Innendurchmesser des Rings 4 ist. Je nach durchzuführender Messung sind der untere Teil der Röhrcheninnenwand 2 und/oder die Kugel 3 mit biologischem Material beschichtet. Zwischen der Kugel 3 und einer Verschlußkappe 5 enthält die Vorrichtung eine herausnehmbare Chromatographiesäule 6.
Im folgenden reagieren Antikörper 1 und l1 mit Antigen A, Antikörper 2 mit Antigen B und Antikörper 3 mit Antigen C.
Der untere Teil einer Rδhrcheninnenwand ist mit gegen Antigen A gerichteten nicht markiertem Antikörper 1 überzogen. Eine Kugel ist mit gegen Antigen B gerichtetem
Antikörper 2 beschichtet, zur Testdurchführung werden zu den Antigen A-, B- und C-Standardlösungen sowie gegebenenfalls verdünnten Patientenseren, die zuvor in ein mit nichtmarkiertem Antikörper 1 beschichtetes Probenrδhrchen pipettiert worden sind, ein Gemisch aus Antikörper 3, 125J markiertem Antikörper 1' und ebenso markiertem Antigen B und Antigen C hinzugegeben, zum Volumenausgleich sowie zur Erhöhung der Spezifität der Nachweisreaktion werden gegebenenfalls noch weitere Zusätze verwendet. Die Testrδhrchen werden mit einer Verschlußkappe verschlossen, gründlich mit einem Vibrations-Mischer geschüttelt und anschließend etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Da ein Überschuß von Antikörper 1 vorliegt, sind nach der Inkubation alle Antigen A-Moleküle sandwichartig zwischen den an der Gefäßwand immobilisierten Antikörpern 1 und den radioaktiv markierten Antikörpern l' gebunden. Gleichzeitig konkurrieren nicht markiertes Antigen C und markiertes Antigen C ebenso wie nicht markiertes, an der Kugel gebundenes Antigen B, sowie markiertes Antigen B um die Bindungsstellen an ihren jeweiligen Antikörpern.
Nach der etwa einstündigen Inkubation wird eine Chromatographiesäule in das Rδhrchen auf die Kugel gestellt und durch Kapillarwirkung die Lösung des Probenrδhrchens aufgesaugt. Dabei wird sie von dem an der Röhrchenwand befindlichen Antigen A-Sandwich-Komplex und dem an der Kugel vorhandenen Antigen B-Antikörper-Komplex getrennt. Durch Hinzufügen von 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung werden die Festphasen-Immunkomplexe gewaschen und überdies an der Gefäßwand adsorbiertes Material gelöst und ebenfalls in die Säule aufgesaugt.
Durch die Chromatographie werden Reaktionsprodukte und Reaktanten entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt. Antikörper und Immunkomplexe wandern aufgrund ihres höheren Molekulargewichtes in den oberen Teil der Chromatographiesäule, wohingegen niedermolekulare Reaktionsmittel im unteren Teil der Säule verbleiben, so auch die markierten Antigene. Der Antigen
C-Antikörper-Komplex wird somit im oberen Teil der Säule zu finden sein. Zur Antigen C-Messung wird die gesamte Vorrichtung in das Meßgefäß eines Gamma-Counters gestellt und die Impulsrate bestimmt. Die Antigen B-Messung erfolgt ohne Säule, wobei das Röhrchen umgedreht, also mit der Öffnung nach unten, ins Meßgefäß hineingestellt wird. Die Kugel mit dem zu messenden Antigen B Antikörper-Komplex befindet sich nun in der Verschlußkappe. Zur Bestimmung des Antigen A wird das Röhrchen wiederum umgedreht, also in die normale Position gebracht, wobei die Hohlkugel in leicht benetztem Zustand in der Verschlußkappe bleibt und nicht auf den Boden des Rδhrchens zurückfällt. In dieser Stellung wird das Rδhrchen in die Meßzelle des Gamma-Counters zur Messung des wandständigen Antigen A-Festphasen-Immunkomplexes hineingestellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich aber auch mit einem Ring an der oberen Rδhrcheninnenseite durchführen, wobei dann die Kugel nicht in der Verschlußkappe, sondern durch Adhäsionskraft an dem Ring haftet und ebenfalls bei senkrecht, in Normalposition stehendem Röhrchen nicht auf den Röhrchenboden zurückfällt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Zur Bestimmung unbekannter Mengen TSH (Thyreotropes Hormon) und FT. (freies Trijodthyronin) und FT. (freies Thyroxin) wird zu jeweils 100 ul Serumproben und FT3-, FT4- und TSH-Standardlösungen in ein mit Maus-anti-TSH-Antikörpern beschichtetes Rctcchen, welches eine mit T4-Antikörpern beschichtete Hohlkugel enthält, ein Gemisch von 200 /ul aus 125j markiertem monoklonalen TSH-Antikörpern und 125j markierten T3 und T4 sowie entsprechenden hochspezifischen polyklonalen T3-Antikörpern hinzugegeben. Das Reaktionsgemischwird auf einem Vibrations-Mischer gemischt und etwa eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Nun wird eine Chromatographiesäule in das Reaktionsgefäß eingebracht und dadurch die flüssige Phase aufgesaugt und entsprechend ihres Molekulargewichts derart getrennt, daß die hochmolekularen Lösungsbestandteile in den oberen Teil der Säule wandern. Nachdem die Röhrchenwand und damit die Festphasen-Immunkomplexe sowohl der Hohlkugel als auch der Rδhrchenwand mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen worden sind und diese Lösung ebenfalls durch die Chromatographiesäule aufgesaugt wurde, wird das Röhrchen aufrecht mit Hohlkugel und Säule in die Meßzelle eines
Gamma-Counters zur FT3-Messung gestellt und die Impulsrate gemessen.
Nach Entfernung der Chromatographiesäule und Drehung des nahezu trockenen Röhrchens auf den Kopf wird es mit der Öffnung nach unten, wobei die Hohlkugel auf dem Ring aufliegt, in die Meßzelle zur Bestimmung der FT4-Impulsrate gebracht. Anschließend wird das Röhrchen wieder in die normale Stellung, mit Rδhrchenöffnung nach oben, gedreht, wobei die Kugel durch den Ring im oberen Teil des Röhrchens festgehalten wird, und zur Bestimmung der TSH-Impulsrate in die Meßzelle des Gamma-Counters gestellt.
Die Auswertung der Meßergebnisse von FT3, FT4 und TSH erfolgte unter Verwendung der vorliegenden Meßprotokolle und Eichkurve aus 5 Standards. Zur Erstellung der Standardeichkurve wurde die gemessene Prozentbindung gegen die entsprechende Standardkonzentration nach der Spline-Approximatiσn-Standardkurve aufgetragen. Messung zu Beispiel (1)
Protokoll: FT3-RIA
Standards cpm 1 cσm 2 cpm x (pmol FT3/1)
S0 34230 34501 34365 0,00 S1 35541 35303 35422 2,20 S2 38328 38720 38524 4,40 S3 43310 43219 43264 8,80 S4 50701 50501 50601 17,60 S5 61420 61880 61650 35,20
Kontrolle 1 36989 36798 36893 3,40 Kontrolle 2 46322 46450 46386 12,50
Protokoll: FT4-RIA
Standards cpm 1 cpm 2 cpm x (pmol FT4/1)
S0 12363 12280 12321 0,00
S1 11500 11620 11560 3,20
S2 9435 9530 9482 6,40
S3 7004 7100 7052 12,80
S4 4910 4790 4850 25,60
S5 2783 2801 2792 51,20
Kontrolle 1 5901 5699 5650 19,4
Kontrolle 2 3288 3201 3244 43,1
Protokoll: TSH-IRMA
Standards cpm 1 cpm 2 cpm x (mU TSH/ml)
So 252 263 257 0,00
S1 990 1005 997 1 ,50
S2 2271 2199 2235 5,00
S3 4171 1161 1166 10,00
S4 9831 9888 9859 25,00
S5 13270 18360 1S315 50 ,00
Kontrolle 1 755 770 762 0,90
Kontrolle 2 8148 8190 8169 20,90 Beispiel 2
Zur Bestimmung des Total-T3 und Total-T4 und des TSH im Serum werden jeweils 100 ul Serumproben und Standardlösungen aus Total-T3, Total-T4 und TSH wie in Beispiel 1 in Reaktionsröhrchen mit den entsprechenden Antikörpern pipettiert sowie 500 μ.1 eines flüssigen Gemisches von entsprechenden Tracern und T3-Antikörpern mit Zusatz von 0,03 M Thiomersal als Deblockierungsmittel zur vollständigen Freisetzung von T3 und T4 aus ihren Trägerprόteinen wie z.B. TBG. Anschließend wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, verfahren. Die erhaltenen Werte sind in den folgenden Meßprotokollen und Kurven aufgeführt.
Messung zu Beispiel (2)
Protokoll: TT3-RIA
Standards cpm 1 cpm 2 cpm x (nmol TT3/ml)
S0 41411 41112 41261 0,00
S1 42461 42220 42340 0,76
S2 46801 46422 46611 1,53
S3 51961 51798 51879 3,07
S4 61433 61433 61317 6,15
S5 74533 74333 74433 12,30
Kontrolle I 44255 43998 44126 1,13
Kontrolle II 55693 55100 55396 3,89
Protokoll: TT4-RIA
Standards cpm 1 cpm 2 cpm x (nmol TT4/ml)
S0 14835 14750 14792 0,00
S1 13944 13855 13899 25,74
S2 11322 11299 11310 64,35
S3 8523 8460 8491 102,96
S4 5868 5766 5817 157,44
S5 3372 3402 3387 257,40
Kontrolle I 6828 6730 6779 138,99
Kontrolle II 4066 3999 4032 217,50
Protokoll: TSH-IRMA
Standards cpm 1 cpm 2 cpm x (mU TSF/ml)
S0 210 215 212 0,00
S1 990 960 975 1 ,50
S2 2381 2299 2340 5,00
S3 4330 4420 4375 .10,00
S4 10982 10882 10932 25,00
S5 16840 16799 16S19 50,00
Kontrolle I 822 7S9 805 1,10
Kontrollo II 8433 8400 S416 19,40

Claims

Patentansprüche
1. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren zur Bestimmung von wenigstens zwei Antigenen in einer Flüssigkeit unter Verwendung eines an seiner Innenseite mit Antikörpern beschichteten Rδhrchens, dadurch gekennzeichnet, daß man
-ein erstes zu bestimmendes Antigen mittels der IRMA-Technik an der Rδhrcheninnenwand, ein zweites
Antigen mittels eines herkömmlichen Festphasen-RIA an einer Kugel bindet,
die überstehende Flüssigkeit, die neben überschüssigen Reagenzien noch einen dritten zu bestimmenden Immunkomplex enthält, durch eine trockene Chromatographiesäule von den Festphasenkomplexen abtrennt und dabei den dritten zu bestimmenden Immunkomplex in den oberen Teil der Säule wandern läßt.
zur Messung die chromatographische Säule in eine geeignete Meßvorrichtung einbringt, das Röhrchen verschließt, auf den Kopf stellt und getrennt die Messung im unteren Teil des Röhrchens und im Verschlußteil in einer Meßvorrichtung durchführt.
2. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von zwei Antigenen mit dem beschichteten Röhrchen und der chromatographischen Säule arbeitet.
3. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
Antikörper bzw. Antigene mit einem Radioisotop markiert.
4. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach
Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Radioisotop125 Jod einsetzt.
5. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach
Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man monoclonale Antikörper einsetzt.
6. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
Antikörper bzw. Antigene fluoreszenzmarkiert.
7. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene luminiszenzmarkiert.
8. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene enzymatisch markiert.
9. Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugel zur Messung an einem im oberen inneren Teil des Röhrchens angeordneten Ring fixiert.
10. Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugel durch magnetische Mittel von dem am Boden des Rδhrchens vorliegenden Festphasenkomplexes trennt.
11. Reaktions- und Separationsvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Röhrchen (1) im oberen Teil nahe der Öffnung einen Ring (4) aufweist, wobei die Differenz zwischen Ringaußen- und Ringinnenradius etwa 1/10 des Außendurchmessers des Rings beträgt und zwischen dem Röhrchenboden und dem Ring (4) eine Hohlkugel (3) vorgesehen ist, deren Durchmesser geringfügig größer als der Innendurchmesser des Rings (4) ist.
12. Reaktions- und Separationsvorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Kugeldurchmesser 1 bis 2 % größer als der Innendurchmesser des Rings ist.
13. Reaktions- und Separationsvorrichtung nach Anspruch 11 und 12 , dadurch gekennzeichnet, daß an die Röhrcheninnenwand und/oder die Kugel biologische Materialien gebunden sind.
14..Testkombination, enthaltend eine Vorrichtung nach
Anspruch 11 bis 13 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche aus mit Antikörpern beschichteten Röhrchen und Kugeln, einem Verschlußteil und einer chromatographischen Säule, wobei gegebenenfalls das Röhrchen einen im oberen inneren Teil angeordneten Ring enthält, dessen Innendurchmesser 1 bis 2 % kleiner als der Kugeldurchmesser ist, sowie markierte und nicht markierte Antikörper bzw. Antigene und 0,9 %-ige Kochsalzlösung.
EP19880909756 1987-11-13 1988-11-10 Immunologisches trenn- und nachweisverfahren für mehrfachbestimmungen Withdrawn EP0386074A1 (de)

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