EP0400083A1 - Isoformes de la trophoblastine, nouveaux interferons constitues par lesdites isoformes, leurs procedes d'obtention et leurs applications - Google Patents

Isoformes de la trophoblastine, nouveaux interferons constitues par lesdites isoformes, leurs procedes d'obtention et leurs applications

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EP0400083A1
EP0400083A1 EP19890903762 EP89903762A EP0400083A1 EP 0400083 A1 EP0400083 A1 EP 0400083A1 EP 19890903762 EP19890903762 EP 19890903762 EP 89903762 A EP89903762 A EP 89903762A EP 0400083 A1 EP0400083 A1 EP 0400083A1
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EP
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leu
asp
gln
arg
glu
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Withdrawn
Application number
EP19890903762
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German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Martal
Gilles Charpigny
Pierre Gaye
Jean-Claude Pernollet
Madia Charlier
Michel Guillomot
Jean-Claude Huet
Pierrette Reinaud
Dominique Hue
Nicole Chene
Claude La Bonnardiere
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique
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Filing date
Publication date
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Publication of EP0400083A1 publication Critical patent/EP0400083A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to trophoblastin isoforms corresponding to Class II interferons endowed, inter alia, with anti-viral properties.
  • WINTENBERGERTORRES described the identification of an anti-antioluteolytic component secreted by the embryo in the sheep, called trophoblast; he also established the protein nature of the trophoblast, which is thermolabile and sensitive to proteases; he further established that the period during which trophoblastin is secreted is very limited since its presence seems critical from day 12 of gestation only and is no longer detectable after days 21-23.
  • the main polypeptides produced in the culture medium of conceptus of day 16 were identified by two-dimensional electrophoresis as having molecular weights of 22 to 26 kDa (by electrophoretic mobility in the presence of SDS) and a migration in a range of isoelectric points of 6.8 to 5.6; minor polypeptides of PM 40-50 and isoelectric points 6.2 to 7.4 have also been identified in the medium.
  • This Publication also reports the hypothesis put forward that the study, after purification, of the proteins produced by the conceptus of bovines, should make it possible to elucidate their respective roles in the process of maintaining CL and to demonstrate that similar proteins produced by the sheep conceptus could be active in cattle.
  • lapinant ⁇ -oTP-1 serum was used for the immunological characterization of proteins secreted by the bovine conceptus.
  • the double immunodiffusion analysis by the Ouchterlony method with anti-oTP-1 serum, produced a double band against the unfractionated proteins secreted by bovine conceptus.
  • One of these two bands has a partial identity both with purified oTP-1 and with the unfractionated proteins secreted by the ovine conceptus.
  • Other experiments carried out in the presence of a radioactive amino acid, confirm the partial homology between the proteins produced by the ovine and bovine concepts and confirm the work of the MARTAL et al. Team. on transfers of inter-specific trophoblastic vesicles in sheep and cows, reported in J.
  • oTP-1 comprises both cysteines in position 1, 29, 99 and 139 and a sequence Cys-Ala-Trp-Gly-Ile-Val-Val-Arg 139 146 that the 'found in most interferons - ⁇ .
  • This Abstract also indicates that the Authors have demonstrated that oTP-1 has the antiviral and antiproliferative properties of an interferon, which leads them to suggest that oTP-1 not only corresponds to a signal of maternal recognition of gestation ( "maternai recognition of pregnancy") in sheep, but could also play the role of local immunomodulator.
  • oTP-1 consists of 3 - 4 isoelectric variants of isoelectric points 5.5 - 5.8, with a molecular mass of 18 kDa and oTP-1 obtained by in vitro translation (pre -oTP-1) from polyadenylated RNA, consists of several polypeptides each of which has a molecular mass of the order of 21 kDa.
  • oTPB or oT-1 or trophoblastin
  • the sequence of 45 amino acids represented in this publication differs from the corresponding sequence represented in the publication of NATURE only by the fact that it comprises a Gln residue in position 5, an Arg residue in position 6, while the sequence of corresponding amino acid published in NATURE comprises in these two successive positions respectively an Arg residue and a Lys residue.
  • the embryonic signal that constitutes trophoblastin is secreted at the time of differentiation of the embryo; its secretion begins on D 9, when the embryo is only an undifferentiated mass of cells and it disappears on the 22nd day of gestation, when the embryo is already formed.
  • the deepening of knowledge relating to the protein designated under the name of trophoblastine would make it possible to lower the threshold of detection of the embryonic signal in question, which is of particular importance in the techniques of transfer and transplantation of embryos, in which it is essential to detect as early as possible if the transferred embryo is alive, and in which it would be even more favorable to be able to detect the viability of the embryos in synthetic media before transplantation.
  • the subject of the present invention is isoforms of trophoblastin or of its embryonic analogs, characterized by a sequence of N-terminal amino acids which corresponds to a common general formula I: Cys-Tyr-Leu-Ser- (X) -Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala- (U) -Glu-Asn-Leu
  • T 1 isoform is characterized by an N-terminal amino acid sequence which corresponds to formula I 1 below:
  • the T 2 isoform is characterized by an N-terminal amino acid sequence which corresponds to the form I 2 below:
  • the T3 isoform is characterized by an N-terminal amino acid sequence which corresponds to formula I 3 below:
  • the T4 isoform is characterized by an N-terminal amino acid sequence which corresponds to formula 14 below: Cys-Tyr- Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-
  • T 5 is characterized by an N-terminal amino acid sequence which corresponds to formula I 5 below: Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Lys- Glu-Asn-Leu
  • the present invention also relates to a process for the isolation of trophoblastin isoforms by high performance liquid phase chromatography (HPLC), characterized in that a culture medium obtained after a concept incubation is subjected of mammals for an appropriate time, to an anion exchange column chromatography balanced by a cationic buffer, then to the action of a salt gradient in a cationic buffer, in the space of an appropriate time interval, followed of an isocratic elution during which the isoforms are successfully collected.
  • HPLC high performance liquid phase chromatography
  • the conceptus collection medium intended to be cultured is constituted by an appropriate buffer devoid of serum albumin and containing polyvinylpyrrolidone at a concentration of approximately 0.05 % to 0.5% weight / volume.
  • the concepts are cultured in a synthetic culture medium devoid of serum albumin and blood serum and containing the polyvinylpyrrolidone at a concentration of about 0.05% to
  • the polyvinylpyrrolidone is preferably chosen from polyvinylpyrrolidones of high molecular weight, in order to promote its elimination by exclusion on a chromatography column or by insolubilization at acid pH.
  • these isoforms each of which has a molecular weight of the order of 20 kDa, have an isoelectric point of approximately 5.4 for the Ti form, of approximately 5.3 for the T 2 form, d '' about 5.2 for the shape
  • the present invention further relates to an agent having antiviral, antiproliferative, antitumor, immunological, immunomodulatory, inhibition of rejection, cell differentiation and inhibition of luteolysis activities at the start of gestation in mammals, as well that of genetic selection, characterized in that it consists of a class II interferon a, which is one of the isoforms of trophoblastin as identified by their N-terminal sequences of formulas I 1 , I 2 , I 3 , I 4 and Is or their mixtures.
  • the present invention further relates to the nucleotide sequences of cDNA of each of the isoforms of trophoblastin, as well as the amino acid sequences. which are deduced from it.
  • the nucleotide sequence of cDNA of the isoform T 2 consists of a polypeptide whose molecular weight is of the order of 23 kDa, corresponding to the precursor of trophoblastin, and which corresponds to formula II below:
  • the present invention further relates to an oligodeoxynucleotide probe for the characterization of clones containing the cDNA of trophoblastin mRNA and its isoforms, which is deduced from the nucleotide sequence of the cDNA of one of the isoforms trophoblastin.
  • such a probe it is characterized in that it corresponds to residues 34 to 43 of the N-terminal sequence of trophoblastin and corresponds to formula III below: 34 35 40 43
  • TTT I which can be replaced by A, G or C.
  • the invention naturally includes any equivalent probe deduced from the sequence of formula II or from the sequences of formulas I 1 , I 2 , I 3 , I 4 , Is suitable for characterize clones containing the trophoblastin mRNA cDNA or the gene thereof.
  • the subject of the present invention is, moreover, a process for obtaining by cloning the cDNA of the mRNA of the isoforms of trophoblastin, characterized in that it comprises the following successive steps:
  • the search for clones containing the cDNA of the trophoblastin mRNA is carried out using monospecific anti-trophoblastin immune serum.
  • the search for said clones is carried out using an oligodeoxynucleotide probe deduced from the nucleotide sequence of the cDNA of one of the isoforms of trophoblastin, and in particular of the oligonucleotide probe of formula III above, by hybridization of said clones with said probe, followed by isolation of inserts of appropriate size and subcloning into an appropriate plasmid (in particular pUC18) to determine that one of the clones s' hybrid with a single 1.1 kb RNA coding for a polypeptide of approximately 23 kDa corresponding to the precursor of trophoblastin and that the other of the clones hybridizes with the mRNA corresponding to the cDNA of one of the isoforms trophoblastin.
  • an oligodeoxynucleotide probe deduced from the nucleotide sequence of the cDNA of one of the isoforms of trophoblastin, and in particular of the
  • the present invention also relates to a kit for detecting an embryonic signal to control the viability of an embryo at an early stage of its development, characterized in that it comprises, as detection agent, at least one trophoblastin isoform of formula I above.
  • the present invention further encompasses the application of the trophoblastin isoforms according to the present invention as agents for protecting embryos during their transfer into the uterus of a recipient mammal, and as agents therapeutic, in particular as antiviral, antiproliferative, antitumour, immunomodulatory agents, in veterinary or human medicine.
  • Trophoblastin is the first isolated class II ⁇ interferon naturally expressed in mammalian tissue. So far, the rare known class II ⁇ interferons (bovine, human, equine, porcine) have only been demonstrated using molecular DNA probes or by expression in bacterial systems. As a result, the properties of class II ⁇ interferons are little known. In addition, the structure of a natural interferon can differ significantly by its glycosylated parts, from interferons obtained by genetic engineering. Trophoblastine has the originality for an interferon not to be secreted following a viral infection. In addition, it is produced in an exceptionally high quantity compared to that of all naturally expressed interferons.
  • the embryos are eliminated and the culture medium is centrifuged at 10,000 g for 20 minutes at 4 ° C., then dialyzed and concentrated against 50 mM TRIS / HCl buffer pH 6.00.
  • Trophoblastin is purified to a high degree of purity by high performance liquid phase chromatography (HPLC) on a DEAE 5 PW column 7.5 mm in diameter and 75 mm in length, eluted at a flow rate of 0.5 ml / min by a gradient from 0 to 0.15 M KCl in a 0.05 M Tris HCl buffer pH 6.00, within 40 min, followed by an isocratic elution at 0.15 M KCl in the same buffer .
  • HPLC high performance liquid phase chromatography
  • the trophoblast is purified to a high degree of purity by high performance liquid chromatography (HPLC) on a column, semi-preparative anion exchange DEAE-5 PW of 21.5 mm in diameter over 150 mm in length, eluted with a flow rate of 4 ml / min, by a gradient from 0 to 0.15 M KCl in a 0.05 M Tris-HCl pH 6.00 buffer, within 60 minutes, followed by isocratic elution at 0.15 M KCl in the same buffer.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Figure 1 attached shows the isolation of the polypeptides T 1 , T 2 , T 3 in the isocratic part of the gradient close to 0.5 M KCl.
  • Purified trophoblastin has an apparent molecular weight of 20 kDa and an isoelectric point of approximately 5.3. It specifically binds to endometrial membrane receptors, which demonstrates the maintenance of its biological activity after the purification steps.
  • the uterine receptor for this embryonic signal exists at the end of the luteal phase of the oestrian cycle while the embryo is absent.
  • the five trophoblastin isoforms, T 1 , T 2 , T 3 , T 4 , T 5 , isolated in accordance with the present invention, are variants thereof, as demonstrated by the sequencing of the N-terminal end of these five proteins, as shown in Formulas I, I 1 , I 2 and I 3 , I 4 , I 5 above.
  • ovine trophoblastin possesses the antiviral activity of interferons, in the presence of bovine MDBK cells infected with bovine vesicular stomatitis virus (VSV).
  • VSV bovine vesicular stomatitis virus
  • the cells were infected with 100 PFU of VSV (Serotype Indiana) in 0.2 ml of MEM + 2% SVF, then finally covered with 3 ml of MEM + 2% VSF containing 0.6% of agarose, with which they were incubated for another 24 hours at 37 ° C.
  • the viral plaques were counted after staining with crystal violet and the dilution of the protein causing 50% inhibition of the VSV plaques was determined.
  • the titers expressed in international units of human IFN (iu / ml) were deduced from the titer of a standard laboratory IFN included in these tests and calibrated with respect to the human IFN reference Ga23-902-530 (NIH Bethesda, Md, 12,000 iu / ml).
  • the specific activity of isoforms 1, 2, 3 purified by HPLC is respectively 0.6 ⁇ 10 ei / mg of protein, 0.8 ⁇ 10 ei / mg of protein and 0.7 ⁇ 10 s iu / mg of protein in the presence of MDBK and VSV cells (of. Figure 6 attached).
  • the antiviral activity of two pools of culture media for 16-day-old sheep embryos is between 0.25 and 0.68 ui / mg trophoblastin.
  • the differential antiviral activity was measured in cells of different species by inhibition of the effect exerted on VSV carried by plates as described above.
  • the results obtained are collated in Table I below, in which MM6 designates a sheep cell line established from fetal lamb fibroblasts; PD-5 is a pig kidney cell line; WISH is a human cell line and L 929 is a murine cell line.
  • the three purified isoforms were diluted to give the same antiviral titer on the MDBK cells.
  • This Table shows that the three isoforms have the same relative activity pattern, at least on bovine, ovine, porcine and human cells, isoform 2 being more active on murine cells than the other two isoforms, of a factor of about 9 to 27.
  • trophoblastin not only exhibits strong structural homology with interferons, as indicated in the aforementioned FEBS LETTERS Publication, but it also has the antiviral activity characteristic of all families of interferons.
  • seroneutralization the inventors have been able to confirm that the ovine trophoblastin is indeed a class II ⁇ interferon: a class I anti-interferon ⁇ immune serum does not recognize trophoblastin and conversely a monospecific anti-trophoblastin immune serum does not recognize ⁇ interferons class I.
  • Table II illustrates the seroneutralization of viral activity in the presence of interferon (IFN) and anti-IFN immune serum.
  • IFN interferon
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the immuniser used is anti-T rabbit immuniser (mixture of isoforms T 1 , T 2 , T 3 ).
  • EXAMPLE 3 CLONING OF TROPHOBLASTIN.
  • Obtaining clones containing the cDNA for trophoblastin mRNA comprises the following steps. 1. Isolation of total poly (A) + embryonic RNAs, using the guanidine isothiocyanate method from 16-day-old sheep embryos (CATHALA et al., 1983). In order to have a "negative" control corresponding to a late stage during which trophoblastin is no longer secreted, mRNAs were also isolated from embryos 29 days old. After purification on an affinity column (oligo dT cellulose), approximately 50 to 60 ⁇ g of poly (A) + RNA were obtained from around twenty 16-day-old embryos, removed surgically.
  • affinity column oligo dT cellulose
  • trophoblastin precursor and quantification of the corresponding mRNA.
  • the biological activity of embryonic poly (A) + RNA was measured by in vitro translation in two acellular systems (reticulocyte lysate and wheat germ) in the presence of 35 S-methionine. In these two cases, the amount of trophoblastin synthesized was estimated by SDS electrophoresis, followed by immunoprecipitation, respectively using a monospecific antitrophoblastin antiserum prepared by the inventors. Under these conditions, a polypeptide with an apparent molecular weight of ⁇ 23 kDa was detected; it corresponds to the precursor of trophoblastin and represents approximately 1 to 2% of the total mRNAs.
  • the cDNAs were synthesized according to the method of GUBLER and HOFFMAN (1983) which makes it possible to obtain cDNAs of length close to that of the mRNAs. After addition of EcoRI "linkers", these cDNAs were inserted respectively into the EcoRI sites of a plasmid vector (pUC8) and of an expression vector, the bacteriophage Lambda gt 11 ( ⁇ gtll), then cloned into the strains ( DH5 and Y1088) of colibacilli (Esche ⁇ chia coli). The plasmid and phage banks contained respectively 4.10 5 and 1.2.10 6 recombinants per ⁇ g of DNA.
  • Mdp 7 hybridized with a single 1.1 kb mRNA (Northern-blot technique); this size was compatible with that of an mRNA coding for a polypeptide of ⁇ 23 kDa (precursor of the trophoblast). This is the reason why further analysis of these clones was undertaken.
  • IFN ⁇ lI class II ⁇ interferons
  • the amino acid sequence of isoform 2 determined by peptide hydrolysis is strictly identical to cDNA ( Figure 5). No N-glycosylation site (ASN-X-THR or SER) is observed. Furthermore, the region corresponding to the signal peptide has a homology of more than 95% at the nucleotide level and 100% at the level of the primary structure with that of bovine class II interferon ⁇ (CAPON, SHEPARD and GOEDDEL, ( MOL. CELL. BIOL. (1985), 5, 768-779), which suggests that these two molecules could derive from a common ancestral gene.
  • CAPON, SHEPARD and GOEDDEL bovine class II interferon ⁇
  • bovine class I IFN ⁇ 64% with bovine class I IFN ⁇ .
  • bovine class II IFN ⁇ 71% (and 56% with human IFN ⁇ lI), while it is only 48% with bovine class I IFN ⁇ .
  • trophoblastin corresponds to a class II ⁇ embryonic interferon.
  • a quantitative method for detecting the ovine trophoblast has been developed by the inventors. It consists of a radioimmunological assay by competition, using two antibodies, under the following conditions: the ovine trophoblastin used for labeling with Iodine 125 and for the calibration curves, is derived from the purification by HPLC chromatography of culture media sheep embryos. An anti-trophoblastin antiserum after immunization of rabbits is used at a final dilution of 1 / 360,000; it binds 35% radioactive trophoblastin under the dosage conditions established by the Inventors.
  • this method makes it possible to detect 15 pg of trophoblastin in 100 ⁇ l of sample to be tested.
  • ⁇ represent the culture medium for sheep embryos.
  • - Specificity of the assay there is no cross-immunoreactivity with porcine interferons, secretion products from bovine, porcine, rabbit embryos and serum compounds.
  • this assay it is possible to follow the evolution of the secretion of trophoblastin in vivo and in vitro.
  • the sensitivity of the assay makes it possible to detect small amounts of trophoblastin secreted by sheep and goat embryos at very early stages (20ng / embryo in sheep perfusates at 11 days of gestation, 1 ⁇ g / day for an 11-day cultivated embryo in vitro).
  • the cDNA of the trophoblastin isoforms which are the subject of the present invention or of their analogs can, moreover, be used for all the productions of class II ⁇ interferons by genetic engineering methods (bacterial, cellular expression , genetic engineering or through transgenic animals).

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Abstract

La présente invention est relative à des isoformes de la trophoblastine. Elle se caractérise par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à une formule générale commune (I), dans laquelle X5 représente: Glu ou Gln; U12 représente Arg ou Lys; Y35 représente Lys ou Asp et Z44 représente Glu ou Asp. W48 représente Asp ou Leu; V49 représente Leu ou Gln. Application à la détection d'un signal embryonnaire.

Description

ISOFORMES DE LA TROPHOBLASTINE, NOUVEAUX INTERFERONS CONSTITUES PAR LESDITES ISOFORMES, LEURS PROCEDES D'OBTENTION ET LEURS APPLICATIONS La présente invention est relative à des isoformes de la trophoblastine correspondant à des interférons a de Classe II doués, entre autres, de propriétés anti-virales.Un Article paru dans J. REPROD. FERT. (1979) 56. p. 63-73 sous la signature de J. MARTAL, M.C. LACROIX, C. LOUDES , M. SAUNIER et S. WINTENBERGERTORRES, a décrit l'identification d'un composant antiiutéolytique sécrété par l'embryon chez la brebis, appelé trophoblastme ; il a établi également la nature protéique de la trophoblastme, qui est thermolabile et sensible aux protéases ; il a de plus établi que la période durant laquelle la trophoblastine est sécrétée est très restreinte puisque sa présence semble critique à partir du jour 12 de la gestation seulement et n'est plus détectable après les jours 21-23.
Il a énoncé, en outre, deux hypothèses concernant le mécanisme d'action de la trophoblastine dont il a privilégié celle qui lui paraissait confirmée par les expérimentations conduites, selon laquelle l'action de la trophoblastine serait essentiellement locale.
Un Article de GODKIN, BAZER, TATCHER et ROBERTS paru dans J. REPROD. FERT. (1984), 71, p. 57-64, étudie des protéines libérées par le conceptus durant la culture de celui-ci et non pas comme chez MARTAL et al. des extraits d'homogénats de tissus de conceptus. La protéine de trophoblaste ovin identifiée par l'Equipe ROBERTS et al., oTP-1, sécrétée par le conceptus de brebis entre les jours 13 et 21 de la gestation, a été purifiée pour être ensuite injectée dans le tractus utérin et a fait l'objet d'une expérimentation afin de déterminer si elle est effectivement impliquée dans la fonction lutéale pendant la phase précoce de la gestation.
Après avoir rappelé une précédente publication dans laquelle ils ont décrit l'identification par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide, de protéines produites in vitro par le conceptus de brebis entre les jours 13 et 23 de la gestation et la purification des deux polypeptides majeurs sécrétés, les Auteurs ont cherché, dans les travaux dont cette Publication rend compte, à déterminer si l'oTP-1, libérée dans le milieu d'incubation par des conceptus aux jours 15 - 16, est capable de prolonger la durée de vie fonctionnelle du CL lorsqu'elle est injectée dans la lumière utérine de brebis cycliques. Ils ont établi, alors, que cette oTP-1 d'origine ovine n'est pas aussi active que les protéines totales de conceptus et qu'elle ne "prolonge" le cycle que de 4 jours en moyenne. Ils ont en outre suggéré que l'oTP-1 était susceptible de prolonger la durée de vie fonctionnelle du CL en agissant conjointement avec l'endométre utérin.
Dans un Article paru dans THERIOGENOLOGY de Janvier 1985, vol. 23 , N' 1, p. 129-143, l'Equipe ROBERTS et al. a étudié les protéines sécrétées par le conceptus (CSP) de vaches dans le milieu de culture : elle a établi que l'administration intra-utérine de CSP à des vaches cycliques prolonge la fonction CL de 8 jours au-delà de celle de la 50-P (5β-pregnan-3-ol-20-one) et de vaches témoins. Les polypeptides principaux produits dans le milieu de culture de conceptus de jour 16, ont été identifiés en électrophorèse bidimensionnelle comme présentant des poids moléculaires de 22 à 26 kDa (par mobilité électrophorétique en présence de SDS) et une migration dans une gamme de points isoélectriques de 6,8 à 5,6 ; des polypeptides mineurs de P.M. 40 - 50 et de points isoélectriques 6,2 à 7,4 ont également été identifiés dans le milieu. Cette Publication rapporte, en outre, l'hypothèse avancée selon laquelle l'étude, après purification, des protéines produites par le conceptus de bovins, devrait permettre d'élucider leurs rôles respectifs dans le processus du maintien du CL et de mettre en évidence que des protéines similaires produites par le conceptus ovin pourraient être actives chez les bovins. Pour vérifier cette hypothèse, du sérum de lapinantι-oTP-1 a été utilisé pour la caractérisation immunologique de protéines sécrétées par le conceptus de bovins . L ' analyse par double immunodiffusion par la méthode d'Ouchterlony, avec du sérum anti-oTP-1, a produit une double-bande contre les protéines non fractionnées sécrétées par du conceptus bovin. L'une de ces deux bandes présente une identité partielle aussi bien avec l'oTP-1 purifiée qu'avec les protéines non fractionnées sécrétées par du conceptus ovin. D'autres expériences, menées en présence d'un amino-acide radioactif, confirment l'homologie partielle entre les protéines produites par les conceptus ovin et bovin et confirment les travaux de l'Equipe MARTAL et al. sur les transferts de vésicules trophoblastiques inter-spécifiques chez les brebis et les vaches, rapportés dans J. REPROD. FERT. (1984), 70, p. 533 - 540 et Proc. 10th Intern. Congr. on Anim. Reprod. and A.I., Urbana-Champaign, USA 111, Nº 510, 3 p. L'Equipe ROBERTS et al. (ENDOCRINOLOGY (1984), 114, 120-130) montre que l'oTP-1 peut stimuler sélectivement quelques protéines de l'endométre et formule l'hypothèse que certaines pourraient inhiber la biosynthèse de la prostaglandine F2α dans l'endométre, bien qu'une telle hypothèse n'ait été vérifiée ni en ce qui concerne les protéines sécrétées par le conceptus bovin, ni en ce qui concerne les protéines sécrétées par le conceptus ovin. Dans un Article paru dans ENDOCRINOLOGY (1985), 111, N° 4, p. 1424 - 1430, l'Equipe ROBERTS et al. décrit la traduction d'ARNm de conceptus de brebis âgé de 16 jours, à l'aide d'un lysat acellulaire de germe de blé. L'immunoprécipitation de l'oTP-1 du mélange de traduction, à l'aide d'un anti-sérum spécifique de lapin, montre que l'oTP-1 synthétisée a un poids moléculaire de 21 kDA, alors que, selon les Auteurs, l'oTP-1 sécrétée par des conceptus intacts dans du milieu de culture, aurait un poids moléculaire de 17 kDa. Dans un Article paru dans LIVESTOCK PRODUCTION
SCIENCE (1987), 17, p. 193-210, l'Equipe MARTAL et' al. fait le point des connaissances sur la trophoblastine, dont elle montre l'identité avec l'oTP-1, qui est sécrétée par le trophectoderme et a été mise en évidence uniquement chez la brebis et la vache. Cette Publication établit que la trophoblastine inhibe la lutéolyse par action directe sur l'endométre en affectant le CL non pas directement, mais par l'intermédiaire soit de petits peptides qu'elle induits, soit des prostaglandmes lutéotrophiques endométriales.
Un Abrégé paru dans J. CELL. BIOL., 1.05 (4) PART. 2 (1987) sous la signature de l'Equipe ROBERTS et al. relate l'établissement d'une séquence de nucléotides d'une série de clones d'ADNc d'oTP-1, à partir d'une banque d'ADNc de lambda gtll construite à partir d'ARNm poly(A+) de conceptus de J. 16. La structure primaire qui est déduite de l'ADNc de l'oTP-1 présente une homologie de l'ordre de 50 % avec les interférons a de classe I d'homme, de boeuf, de porc, de souris et de rat, et d'environ 75 % avec celle d'interféron a bovin de classe II et avec celle d'interféron 0 humain. Cet Abrégé indique, en outre, que l'oTP-1 comporte à la fois des cystéines en position 1, 29, 99 et 139 et une séquence Cys-Ala-Trp-Gly-Ile-Val-Val-Arg 139 146 que l'on retrouve dans la plupart des interférons - α . Cet Abrégé indique également que les Auteurs ont démontré que l'oTP-1 possède les propriétés antivirales et antiprolifératives d'un interféron, ce qui les conduit à suggérer que l'oTP-1 non seulement correspond à un signal de reconnaissance maternelle de gestation("maternai récognition of pregnancy") chez la brebis, mais pourrait également jouer le rôle d'immunomodulateur local.
Un Article paru dans NATURE (1987) Vol. 330, 26 Novembre 1987 sous la signature de l'Equipe ROBERTS et al. rapporte la séquence en amino-acides de l'oTP-1 telle que déduite d'un ADNc clone et démontre que la protéine est très probablement un interféron α. L'une des figures de cet Article reproduit la séquence nucléotidique et la séquence d'amino-acides qui en est déduite, de la totalité de la longueur d'ADNc d'oTP-1 de clones kaz-6 et kaz-2 ; elle comporte 972 bases, la séquence d'amino-acides déduite identifiée comporte 172 amino-acides, dont la séquence 139 - 146 :
Cys-Ala-Trp-Glu-Ile-Val-Arg-Val 139 146
Cet Article rapporte la vérification de l'identité de la formule avec l'oTP-l purifiée et l'homologie de celle-ci avec celle des interférons -α de divers mammifères, y compris l'homme, ce qui suggérerait que les isoformes de l'oTP-1 pourraient être des interférons très spécialisés, qui pourraient participer à l'immunoprotection du foetus eu égard au fait que les interférons peuvent retarder le rejet d'allogreffes et inhiber l'activation des lymphocytes par les lectines et les antigènes . Ces isoformes ont été identifiées comme suit : l'oTP-1 consiste en 3 - 4 variants isoélectriques de points isoélectriques 5,5 - 5,8, de masse moléculaire de 18 kDa et l'oTP-1 obtenue par traduction in vitro (pré-oTP-1) à partir d'ARN polyadénylé, consiste en plusieurs polypeptides dont chacun présente une mase moléculaire de l'ordre de 21 kDa.
Un Article paru dans FEBS LETTERS, Vol. 228, Nº 1, p. 12 - 16 de Février 1988, sous la signature de l'Equipe MARTAL et al. décrit la purification de la trophoblastme ou encore oTPB (ovine trophoblastic protem B) par HPLC analytique et la détermination des 45 premiers aminoacides. Les Auteurs ont, en outre, démontré par comparaison des séquences, une homologie significative entre l'oTPB (qui paraît immunologiquement identique à l'oTP-1) et les interférons α bovins de classe II ; 64 % des amino-acides sont identiques et 75 % sont homologues ; la région 23 - 44 présente une homologie de 82 % . De plus, en raison de l'identité de 55 % entre l'oTPB et l'interféron-σ-I.9 humain, d'une part, et l'interféron α -I.1 murin, d'autre part, à partir de l'extrémité N-terminale, les. Auteurs considèrent que l'oTPB (ou oT- 1 ou trophoblastine) devraitêtre un interféron embryonnaire. La séquence de 45 aminoacides représentée dans cette Publiation ne se distingue de la séquence correspondante représentée dans la Publication de NATURE que par le fait qu'elle comporte un résidu Gln en position 5, un résidu Arg en position 6, alors que la séquence d'amino-acides correspondante publiée dans NATURE comporte dans ces deux positions successives respectivement un résidu Arg et un résidu Lys.
Ainsi que cela ressort des publications citées dans ce qui précède, le signal embryonnaire que constitue la trophoblastine est sécrété au moment de la différenciation de l'embryon ; sa sécrétion commence à J 9, alors que l'embryon n'est qu'un amas de cellules indifférencié et elle disparaît au 22ème jour de la gestation, alors que l'embryon est déjà formé. L'approfondissement des connaissances relatives à la protéine désignée sous le nom de trophoblastine, permettrait d'abaisser le seuil de détection du signal embryonnaire en question, ce qui revêt une importance particulière dans les techniques de transfert et de transplantation d'embryons, dans lesquelles il est indispensable de détecter aussi précocement que possible si l'embryon transféré est vivant, et dans lesquelles il serait plus favorable encore de pouvoir détecter la viabilité des embryons dans des milieux synthétiques avant transplantation. L'approfondissement des connaissances relatives à cette protéine, dont l'homologie avec des interférons de classe α a récemment été mise en évidence, permettrait probablement, du fait qu'il mettrait à disposition un modèle physiologique bien identifié, capable de donner des informations sur le mode de fonctionnement d'un interféron embryonnaire dans une cellule normale, de comprendre le comportement d'un interféron dans une cellule infectée par un virus et d'améliorer les propriétés des interférons.
La présente invention a pour objet des isoformes de la trophoblastine ou de ses analogues embryonnaires, caractérisées par une .séquence d'amino-acides N- terminale qui répond à une formule générale commune I : Cys-Tyr-Leu-Ser- (X) -Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala- (U)-Glu-Asn-Leu
1 5 10 12 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30
Gln-Asp-Arg-Lys-(Y)-Phe-Gly-Leu-Pro-Glu-Glu-Met-Val-(Z)-Gly
35 40 45
Asp-Gln-(W)-(V)-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro
50 55 (I) dans laquelle (X5) représente Glu ou Gln (V12) représente Arg ou Lys (Y35) représente Lys ou Asp (Z44) représente Glu ou Asp (W48) représente Asp ou Leu
(V49) représente Leu ou Gln. Selon un mode de réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, l'isoforme T1 est caractérisée par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la formule I1 ci-après:
Cys-Tyr-Leu-Ser-Glu-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu
1 5 10 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Lys-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly
35 40 44 45
Asp-Gln-Asp-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro
50 55
(II) Selon un autre mode de réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, l'isoforme T2 est caractérisée par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la forme I2 ci-après :
Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30
Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly
35 40 44 45
Asp-Gln-Leu-Gln-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro-Val-Leu 50 55
(I2) Selon encore un autre mode de réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, l'isoforme T3 est caractérisée par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond a la formule I3 ci-après :
Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Le
1 5 10 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Le
20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Asp-Gl
35 40 44 45
(I3) Selon un autre mode de réalisation avantageu d'une isoforme de la trophoblastine, l' isoforme T4 es caractérisée par une séquence d' amino-acides N-terminal qui répond à la formule 14 ci-après : Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-
1 5 10 12
Leu-Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser- 15 20 25
Cys-Leu-Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-
30 35 40
Va1-Glu-Gly-Asp-Gln-Leu 44 45 48 (I4) Selon encore un autre mode de réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, L'isoforme
T5 est caractérisé par une séquence d'amino-acides N- terminale qui répond à la formule I5 ci-après : Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Lys-Glu-Asn-Leu
1 5 10 12 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30
Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 40 45
Asp-Gln-Leu-Gln-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro-Val-Leu
48 49 50 55
(15)
La présente invention a également pour objet un procédé d'isolement des isoformes de la trophoblastine par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC), caractérisé en ce que l'on soumet un milieu de culture obtenu à la suite d'une incubation de conceptus de mammifères pendant un temps approprié, à une chromatographie sur colonne échangeuse d'anions équilibrée par un tampon cationique, puis à l'action d'un gradient salin dans un tampon cationique, en l'espace d'un intervalle de temps approprié, suivi d'une élution isocratique pendant laquelle les isoformes sont succèssivement recueillies. Bien entendu, l'invention couvre ledit procédé et ses variantes.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, le milieu de collecte des conceptus destinés à être mis en culture est constitué par un tampon approprié dépourvu de sérumalbumine et contenant de la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à 0,5 % poids/volume.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, les conceptus sont mis en culture dans un milieu de culture synthétique dépourvu de sérumalbumine et de sérum sanguin et contenant la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0 , 05 % à
0,5 % poids/volume.
La polyvinylpyrrolidone est choisie de préférence parmi les polyvinylpyrrolidones de poids moléculaire élevé, afin de favoriser son élimination par exclusion sur colonne de chromatographie ou par insolubilisation à pH acide.
Conformément a l'invention ces îsoformes, dont chacune présente un poids moléculaire de l'ordre de 20 kDa, ont un point isoélectrique d'environ 5,4 pour la forme Ti, d'environ 5,3 pour la forme T2, d'environ 5,2 pour la forme
T3.
La présente invention a, de plus, pour objet un agent présentant des activités antivirales, antiprolifératives, antitumorales, immunologiques, immunomodulatrices, d'inhibition de rejet, de différenciation cellulaire et d'inhibition de la lutéolyse en début de gestation chez les mammifères, ainsi que de sélection génétique, caractérisé en ce qu'il est constitué par un interféron a de classe II, qui est l'une des isoformes de la trophoblastine telles qu'identifiées par leurs séquences N-terminales de formules I1, I2, I3, I4 et Is ou leurs mélanges.
La présente invention a, en outre, pour objet, les séquences nucléotidiques d'ADNc de chacune des isoformes de la trophoblastine, ainsi que les séquences d'amino-acides. qui en sont déduites.
Conformément à l'invention, la séquence nucléotidique d'ADNc de l'isoforme T2, et la séquence déduite en amino-acides, est constituée par un polypeptide dont le poids moléculaire est de l'ordre de 23 kDa, correspondant au précurseur de la trophoblastine, et qui répond à la formule II ci-après :
AGAGAACCTACCTGAAG ATTCCCCCTGACCCCATCTCAGCCAGCCCAGCAGCAGCCGCATCTTCCCCATGGCC 53
Met Ala -23 TTC GTG CTC TCT CTA CTG ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAT GGC 98 Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr Gly
CCA GGA GGA TCT CTG GGT TGT TAC CTA TCT CAG AGA CTC ATG CTG 143 Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu
-1 +1 5
GAT GCC AGG GAG AAC CTC AAG CTC CTG GAC CGA ATG AAC AGA CTC 188 Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu 10 15 20
TCC CCT CAT TCC TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTT GGT CTT CCC 233 Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro 25 30 35
CAG GAG ATG GTG GAG GGC GAC CAG CTC CAG AAG GAC CAG GCC TTC 278 Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe 40 45 50
CCT GTG CTC TAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC TAC 323 Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr 55 60 65
ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAC CAG 368 Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Asp Gln 70 75 80
CTC TGC ACT GGA CTC CAA CAG CAG CTG GAC CAC CTG GAC ACC TCG 413 Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys 85 90 95
AGG GGT CAA GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GAA CTG GGT AAC ATG 458 Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met 100 105 110
GAC CCC ATT GTG ACC GTG AAG AAG TAC TTC CAG GGC ATC TAT GAC 503 Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp 115 120 125
TAC CTG CAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ATC GTC 548 Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140
AGA GTC GAG ATG ATG AGA GCC CTC ACT GTA TCA ACC ACC TTG CAA 593 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln 145 150 155
AAA AGG TTA ACA AAG ATG GGT GGA GAT CTG AAC TCA CCT TGATGACT 640 Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 160 165 170 172
CTTGCCGACTAAGATGCCACATCAGCCTCCTACACCCGCCTGTGTTCATTTCAGAAGACT 700
CTGATTTCTGCTCCAGCCACCAAATTCATTGAATTACTTTAGCTGATACTTTGTCAGTAG 760
TAAAAAGCAAGTAGATATAAAAGTATTCAGCTGTAGGGGCATGAGTCCTGAAATGATG 820
CCTTCCCTGATGTTATCTGTTGCTGATTTATTTATACCTTCTAGCATTTAACATACTTAA 880
AATATTAGGAAATTTGTTAAGTTACATTTCATCTGTACATCATATTAAAATTTCTAAAAC 940
ATG polyA (II) 943 La présente invention a, en outre, pour objet une sonde oligodéoxynucléotidique pour la caractérisation de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine et de ses isoformes, qui est déduite de la séquence nucléotidique de l'ADNc d'une des isoformes de la trophoblastine.
Selon un mode de réalisation d'une telle sonde, celle-ci est caractérisée en ce qu'elle correspond aux résidus 34 à 43 de la séquence N-terminale de la trophoblastine et répond à la formule III ci-après : 34 35 40 43
Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val (III) 3' TTC CTI AAI CCI IAI GGI GTC CTC TAC CA 5'
T T T les I pouvant être remplacées par A, G ou C. L'invention englobe bien entendu, toute sonde équivalente déduite de la séquence de formule II ou des séquences de formules I1, I2, I3, I4, Is apte à caractériser des clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine ou le gène de celle-ci. La présente invention a, de plus, pour objet un procédé d'obtention par clonage de l'ADNc de l'ARNm des isoformes de la trophoblastine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
- isolement des ARN poly(A)+ totaux embryonnaires, à partir d'embryons de mammifères, par une méthode appropriée ;
- mesure de l'activité biologique des ARN poly(A)+ embryonnaires isolés au cours de l'étape précédente, par traduction in vitro dans un système acellulaire approprié et estimation par électrophorèse-SDS de la quantité de trophoblastine synthétisée, suivie d'une immunoprécipitation à l'aide d'un sérum anti-trophoblastine monospécifique, et détection d'un polypeptide de poids moléculaire d'environ 23 kDa, correspondant au précurseur de la trophoblastine ;
- construction d'une banque d'ADN complémentaire d'embryons de mammifères, par synthèse des ADNc à partir d'une reverse-transcriptase et insertion de ces ADNc dans un vec teur d'expression, puis clonage dans des systèmes d'expression cellulaire appropriés propres à produire de la trophoblastine ou l'une de ses isoformes, recombinante ; - recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de l'isoforme de la trophoblastine, par tous moyens appropriés.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de clonage de la trophoblastme, conforme à la présente invention, la recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine est réalisée à l'aide d'immunsérum monospécifique anti-trophoblastine.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de ce procédé, la recherche desdits clones est réalisée à l'aide d'une sonde oligodéoxynucléotidique déduite de la séquence nucléotidique de l'ADNc de l'une des isoformes de la trophoblastine, et notamment de la sonde oligonucléotidique de formule III ci-dessus, par hybridation άesdits clones avec ladite sonde, suivie de l'isolement des inserts de taille appropriée et du sous-clonage dans un plasmide approprié (notamment pUC18) pour déterminer que l'un des clones s'hybride avec un ARN unique de 1,1 kb codant pour un polypeptide d'environ 23 kDa correspondant au précurseur de la trophoblastine et que l'autre des clones s'hybride avec l'ARNm correspondant à l'ADNc de l'une des isoformes de la trophoblastine.
La présente invention a également pour objet un kit de détection d'un signal embryonnaire pour contrôler la viabilité d'un embryon à un stade précoce de son développement, caractérisé en ce qu'il comprend en tant qu'agent de détection, au moins une isoforme de la trophoblastine de formule I ci-dessus.
La présente invention englobe, de plus, l'application des isoformes de la trophoblastine conformes à la présente invention en tant qu'agents de protection des embryons lors de leur transfert dans l'utérus d'un mammifère receveur, et en tant qu'agents thérapeutiques, notamment en tant qu'agents antiviraux, antiprolifératifs, antitumoraux, immunomodulateurs, en médecine vétérinaire ou humaine.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la Description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : PREPARATION DES ISOFORMES DE LA
TROPHOBLASTINE : La trophoblastine est le premier interféron α de classe II isolé, naturellement exprimé dans un tissu de mammifère. Jusqu'ici, les rares interférons α de classe II connus (bovin, humain, équin, porcin) n'ont été mis en évidence qu'à l'aide de sondes moléculaires d'ADN ou par expression dans des systèmes bactériens. Il en résulte que les propriétés des interférons α de classe II sont peu connues. De plus, la structure d'un interféron naturel peut différer sensiblement par ses parties glycosylées, des interférons obtenus par génie génétique. La trophoblastine présente l'originalité pour un interféron de ne pas être sécrétée à la suite d'une infection virale. De plus, elle est produite en quantité exceptionnellement élevée par rapport à celle de tous les interférons naturellement exprimés. En raison des activités immunomodulatrices des interférons, on peut suspecter une participation de la trophoblastine dans la tolérance immunologique de la mère vis-à-vis de l'embryon. Alors que l'activité antilutéolytique de la trophoblastine n'a été démontrée que chez les ruminants, l'existence de molécules identiques dans de nom breuses autres espèces a pu être recherchée par les Inventeurs, par leur propriété antivirale/ ainsi qu'à l'aide de sondes d'ADNc de la trophoblastine ou grâce aux propriétés iramunologigues croisées. Par contre, les milieux de culture de conceptus bovins et caprins présentent une activité antivirale comparable à celle de la trophoblastine ovine, ceux de conceptus porcins ou de lapin présentent également une activité antivirale, quoique nettement plus réduite. 1. Culture des embryons ovins :
Des embryons âgés de 15 et 16 jours sont prélevés chez des brebis de race Préalpes du Sud, par lavages des trompes utérines à l'aide d'une solution saline physiologique tamponnée par du phosphate, puis transférés dans des boites de Pétri contenant 15 ml de milieu essentiel minimum d'Eagle (milieu MEM), dans lesquelles ils sont mis en culture à 38ºC dans une atmosphère d'air contenant 5 % de CO2, sur une plateforme oscillante.
A la fin de la période d'incubation, les embryons sont éliminés et le milieu de culture est centrifugé à 10 000 g pendant 20 minutes à 4°C, puis dialyse et concentré contre du tampon 50 mM TRIS/HCl pH 6,00.
2. Purification par chromatographie liquide à haute performance : 2.1. Conditions de séparation à l'échelle analytique :
La trophoblastine est purifiée à un haut degré de pureté par chromatographie à haute performance en phase liquide (HPLC) sur une colonne DEAE 5 PW de 7,5 mm de diamètre sur 75 mm de longueur, éluée à un débit de 0,5 ml/mn par un gradient de 0 à 0,15 M KCl dans un tampon 0,05 M Tris HCl pH 6,00, en l'espace de 40 mn, suivie d'une élution isocratique à 0,15 M KCl dans le même tampon. La figure 3 annexée montre le temps de rétention des isoformes : pic 4 (T4) 34,8 minutes pic 5 (T5) 37,2 minutes pic 1 (T1) 45,6 minutes pic 2 (T2) 47,2 minutes pic 3 (T3) 49,0 minutes. 2.2. Conditions de purification semi-préparative La trophoblastme est purifiée à un haut degré de pureté par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC) sur une colonne, d'échange d'anions semi-préparative DEAE-5 PW de 21,5 mm de diamètre sur 150 mm de longueur, éluée avec un débit de 4 ml/mn, par un gradient de 0 à 0,15 M KCl dans un tampon 0,05 M Tris-HCl pH 6,00, en l'espace de 60 minutes, suivie d'une élution isocratique à 0,15 M KCl dans le même tampon.
Ion développeur utilisé - Ion chlorure (Cl) du KCl ; KCl introduit à 0,5 M dans le tampon Tris/HCL 50 mM pH 6,00 Conditions d'élution : Débit : 4 ml/minute.
Gradient : formation d'un gradient KCl dans le tampon d'élution, de manière à parvenir à 0,15 M de KCl à la 60ème minute. L'élution est poursuivie de la 60ème à la 80ème minute en condition isocratique à 0,15 M de KCl dans le tampon Tris/HCl 50 mM pH 6,00, De la 80ème à la 100ème minute, le gradient est linéaire jusqu'à 0,5 M de KCl. De la 100ème à la 120ème minute, l'élution est poursuivie à 0,5 M de KCl dans le tampon Tris/HCl 50 mM pH 6,00.
Temps de réte nti on des isoformes trophoblastine en condi tions semipréparatives .
Isoformes Temps de Rétention Volume d'élution pic 4 (T4) 46,4 minutes 185,6 ml pic 5 (T5) 49,8 minutes 199,2 ml pic 1 (T1) 61,2 minutes 244,8 ml pic 2 (T2) 64,4 minutes 257,6 ml pic 3 (T3) 66,6 minutes 266,4 ml
La Figure 1 annexée montre l'isolement des polypeptides T1 , T2, T3 dans la partie isocratique du gradient voisin de 0,5 M KCl. La trophoblastine purifiée présente un poids moléculaire apparent de 20 kDa et un point isoélectrique d'environ 5,3. Elle se lie spécifiquement aux récepteurs membranaires endométriaux, ce qui démontre le maintien de son activité biologique après les étapes de purification. Le récepteur utérin de ce signal embryonnaire existe dès la fin de la phase lutéale du cycle oestrien alors que l'embryon est absent.
Les cinq isoformes de la trophoblastine, T1, T2, T3, T4, T5, isolées conformément à la présente invention, sont des variants de celle-ci, comme le démontre le séquençage de l'extrémité N-terminale de ces cinq protéines, tel qu'il ressort des Formules I, I1, I2 et I3, I4, I5 ci-dessus.
EXEMPLE 2 - DEMONSTRATION DES PROPRIETES ANTIVIRALES DE LA TROPHOBLASTINE.
Les Inventeurs ont démontré que la trophoblastine ovine possède l'activité antivirale des interférons, en présence de cellules bovines MDBK infectées par le virus bovin de la stomatite vésiculeuse (VSV). Cette démonstration a été faite à l'aide des deux tests suivants : a) l'activité antivirale spécifique de chaque isoforme a été mesurée par un essai standard sur plaques : des monocouches de cellules MDBK âgées de 24 heures ont été incubées dans des puits de 0,6 cm2 pendant 18 heures avec des dilutions X 3 de trophoblastine ou d'un interféron (IFN) de référence dans du milieu MEM contenant 5 % de sérum de veau foetal (SVF). Après élimination du surnageant, les cellules ont été infectées par 100 PFU de VSV (Sérotype Indiana) dans 0,2 ml de MEM + 2 % SVF, puis finalement recouvertes de 3 ml de MEM + 2 % VSF contenant 0,6 % d'agarose, avec lesquels elles ont été incubées pendant 24 heures encore à 37º C. Les plaques virales ont été dénombrées après coloration au cristal violet et la dilution de la protéine provoquant 50 % d'inhibition des plaques de VSV a été déterminée. Les titres, exprimés en unités internationales d'IFN humain (iu/ml) ont été déduits du titre d'un IFN standard de laboratoire inclus dans ces tests et calibré par rapport à la référence IFN humaine Ga23-902-530 (N.I.H. Bethesda, Md, 12 000 iu/ml). L'activité spécifique des isoformes 1, 2, 3 purifiées par HPLC est respectivement de 0,6.10e ui/mg de protéine, 0,8.10e ui/mg de protéine et de 0,7.10s ui/mg de protéine en présence de cellules MDBK et de VSV (of. Figure 6 annexée). L'activité antivirale de deux pools de milieux de culture d'embryons ovins âgés de 16 jours est comprise entre 0,25 et 0,68 ui/mg de trophoblastine. b) l'activité antivirale différentielle a été mesurée dans des cellules d'espèces différentes par inhibition de l'effet exercé sur des VSV portées par des plaques comme décrit ci-dessus. Les résultats obtenus sont réunis dans le Tableau I ci-après, dans lequel MM6 désigne une lignée cellulaire de mouton établie à partir de fibroblastes d'agneau foetal ; PD-5 est une lignée de cellules de rein de porc ; WISH est une lignée cellulaire humaine et L 929 est une lignée cellulaire murine. Les trois isoformes purifiées ont été diluées pour donner le même titre antiviral sur les cellules MDBK
(prises comme la lignée cellulaire de référence). Les titres sont exprimés comme étant l'inverse de la dilution protectrice la plus haute. Dans le cas des cellules endométriales et des cellules WISH, les titres n'ont pas pu être lus avec une grande précision ; c'est pourquoi les limites inférieures et supérieures estimées ont été données.
TABLEAU I
ACTIVITE ANTIVIRALE DE 3 ISOFORMES DE LA TROPHOBLASTINE
SUR DIFFERENTES LIGNEES CELLULAI RES
Cellules Cellules Cellules Cellules Cellules Cellules bovines ovines ovines porcines humaines murines
I se; forme MDBK MM6 Endo- PD5 WISH L929 métriales
1 6500 550 3800-11000 46 27-81 3
2 6500 420 2100- 6500 81 81-243 27-81
3 6500 550 1200- 3800 46 27-81 9
Ce Tableau montre que les trois isoformes présentent le même schéma d'activité relative, tout au moins sur les cellules bovines, ovines, porcines et humaines, l'isoforme 2 étant plus active sur les cellules murines que les deux autres isoformes, d'un facteur de 9 à 27 environ.
Par conséquent, la trophoblastine ne présente pas seulement une forte homologie structurale avec les interférons, comme indiqué dans la Publication FEBS LETTERS précitée, mais elle possède aussi l'activité antivirale caractéristique de toutes les familles d'interférons. Par séroneutralisation, les Inventeurs ont pu confirmer que la trophoblastine ovine est bien un interféron α de classe II : un immunsérum anti-interféron α de classe I ne reconnaît pas la trophoblastine et réciproquement un immunsérum monospécifique anti-trophoblastine ne reconnaît pas les interférons a de classe I.
Le Tableau II ci-après illustre la séroneutralisation de l'activité virale en présence d'interféron (IFN) et d'immunsérum anti-IFN. L'activité antivirale a été testée sur des cellules bovines MDBK infectées par du virus de la stomatite vésiculaire (VSV).
L'immunsérum mis en oeuvre est de l' immunsérum de lapin anti-T (mélange des isoformes T1, T2, T3).
EXEMPLE 3 - CLONAGE DE LA TROPHOBLASTINE. L'obtention de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine comprend les étapes suivantes. 1. Isolement des ARN poly(A)+ totaux embryonnaires, en utilisant la méthode de l' isothiocyanate de guanidine à partir d'embryons ovins âgés de 16 jours (CATHALA et al., 1983). Afin de posséder un témoin "négatif" correspondant à un stade tardif pendant lequel la trophoblastine n'est plus sécrétée, des ARNm ont également été isolés à partir d'embryons âgés de 29 jours. Après purification sur colonne d'affinité (oligo dT cellulose), environ 50 à 60 μg d'ARN poly(A)+ ont été obtenus à partir d'une vingtaine d'embryons âgés de 16 jours, prélevés chirurgicalement. - Caractérisation du précurseur de la trophoblastine et quantification de l'ARNm correspondant. L'activité biologique des ARN poly(A)+ embryonnaires a été mesurée par traduction in vitro dans deux systèmes acellulaires ( lysat de réticulocytes et germe de blé) en présence de 35S-méthionine. Dans ces deux cas, la quantité de trophoblastine synthétisée a été estimée par électrophorèse-SDS, suivie d'une immunoprécipitation, respectivement à l'aide d'un immunsérum antitrophoblastine monospécifique préparé par les Inventeurs. Dans ces conditions, un polypeptide de poids moléculaire apparent de ≈ 23 kDa a été détecté ; il correspond au précurseur de la trophoblastine et représente environ 1 à 2 % des ARNm totaux. Ce type de molécule n'a pu être détecté à partir des ARN poly(A)+ d'embryons plus tardifs (29 jours), ce qui confirme la brève expression de la trophoblastine. Lorsque les ARN poly(A)+d'embryons âgés de 16 jours sont traduits en présence de membranes microsomiales , une protéine immunoprécipitable de poids moléculaire apparent identique à la trophoblastine native (20 kDa) est observée en électrophorèse sur gel d'acrylamide en milieu dénaturant (cf. figure 2 annexée). 2. Construction d'une banque d'ADN complémentaires d'embryons ovins âgés de 16 jours.
Les ADNc ont été synthétisés selon le procédé de GUBLER et HOFFMAN (1983) qui permet d'obtenir des ADNc de longueur voisine de celle des ARNm. Après addition de "linkers" EcoRI, ces ADNc ont été insérés respectivement dans les sites EcoRI d'un vecteur plasmidique (pUC8) et d'un vecteur d'expression, le bactériophage Lambda gt 11 (Λgtll), puis clones dans les souches (DH5 et Y1088) de colibacilles (Escheπchia coli). Les banques plasmidique et phagique contenaient respectivement 4.105 et 1,2.106 recombinants par μg d'ADN.
3. Recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine à l'aide de sondes oligodéoxynucléotidiques synthétiques.
Un oligodéoxynucléotide de 29 bases partiellement dégénéré, complémentaire de l'ARNm de la trophoblastine et correspondant aux résidus d'acides aminés 34 à 43 de la séquence de la trophoblastine, a été synthétisé. Afin de limiter le problème posé par la dégénérescence du code génétique, certaines bases variables de la sonde étaient remplacées par l'inosine qui a la propriété de ne pas déstabiliser les hybrides :
Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val 3' TTC-CTI-AAI-CCI-IAI-GGI-GTC-CTC-TAC-CA 5' T T T
Parmi les 300 000 phages recombinants, trois clones positifs ont été détectés par hybridation avec cette sonde. Après réétalements successifs à faible densité, deux d'entre eux donnent encore un signal permanent. L'ADN de ces deux clones a été digéré par EcoRI et deux inserts. de taille voisine (≈ 1 kb), dénommés mdp 7 et mdp 13, ont été isolés et sous-clonés dans le plasmide pUC18. 4. Caracterisation des clones isolés et analyse structurale de l'ADNc de la trophoblastine. L'homologie de ces inserts a été mise en évidence après marquage de l'un d'entre eux par nick-translation et analyse par Southern-blot. Mdp 7 s'hybridait avec un ARNm unique de 1,1 kb (technique de Northern-blot) ; cette taille était compatible avec celle d'un ARNm codant pour un polypeptide de ≈ 23 kDa (précurseur de la trophoblastme). C'est la raison pour laquelle l'analyse plus approfondie de ces clones a été entreprise.
L'hybridation-traduction de l'ARNm complémentaire de ces clones, suivie de 1'immunoprécipitation et de l'électrophorèse en gel dénaturant de la protéine synthétisée, a démontré que l'on était bien en présence de l'ADNc de la trophoblastine. L'ensemble de ces résultats a, par ailleurs, été confirmé par la détermination de la séquence de l'ADNc de mdp 7 selon la technique de SANGER (1977). 943 nucléotides ont été identifiés. La séquence codante est de 585 nucléotides qui déterminent 195 amino-acides du précurseur de la trophoblastine (23 kDa). La structure primaire de la trophoblastine correspond à 172 amino-acides comme celle des interférons α de classe II (IFNαlI), alors que les IFNσ de classe I présentent une séquence de 166 résidus. La séquence en acides aminés de l'isoforme 2déterminée par hydrolyses peptidiques est rigoureusement identique au cDNA (Figure 5). Aucun site de N-glycosylation (ASN-X-THR ou SER) n'est observé. Par ailleurs, la région correspondant au peptide-signal présente une homologie de plus de 95 % au niveau nucléotidique et de 100 % au niveau de la structure primaire avec celle de l'interféron α bovin de classe II (CAPON, SHEPARD et GOEDDEL, (MOL. CELL. BIOL. (1985), 5 , 768-779), ce qui suggère que ces deux molécules pourraient dériver d'un gène ancestral commun.
Ainsi que cela ressort du Tableau III ci-après, l'identité entre les séquences nucléotidiques de la trophoblastine ovine et l'IFNα bovin de classe II est de 80 % (et de 71 % avec l'IFNαlI humain), alors qu'elle n'est que de
64 % avec l'IFNα bovin de classe I. L'identité entre les structures primaires de la trophoblastine ovine et. de l'IFNα bovin de classe II est de 71 % (et de 56 % avec. l'IFNαlI humain), alors qu'elle n'est que de 48 % avec l'IFNα bovin de classe I. Il en résulte que la trophoblastine correspond à un interféron embryonnaire α de classe II. Ces résultats sont résumés dans le Tableau III ci-dessous :
TABLEAU III
COMPARAISON DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE ( - - - -) et de la
STRUCTURE PRIMAIRE (====) DE LA TROPHOBLASTINE AVEC CELLES DES INTERFERONS α DE CLASSE I ET II BOVINS ET HUMAINS.
L analyse par Northern-blot d'ARN totaux d'embryons âgés de 15 à 18 jours de différentes espèces (Chèvre, Vache, Truie) à l'aide d'une sonde trophoblastine ovine, conforme à l'invention, a permis l'identification d'ARNm de longueur similaire dans deux de ces espèces (Chèvre, Vache). Ces résultats signent d'une part une homologie de structure très importante et, d'autre part, l'existence d'une chronologie similaire dans l'expression de ce gène. Dans l'espèce ovine, ce gène devient très rapidement silencieux, puisgu'à partir du 22ème jour de développement," l'ARNm de la trophoblastine n'est plus détectable, ce qui précise et confirme rigoureusement les résultats des expériences d'injections intra-utérines d'homogénats de conceptus âgés de 21-23 jours.
EXEMPLE 4 - DETECTION DE LA TROPHOBLASTINE PAR UN TEST RIA.
Une méthode quantitative de détection de la trophoblastme ovine a été mise au point par les Inventeurs. Elle consiste en un dosage radioimmunologique par compétition, utilisant deux anticorps, dans les conditions suivantes : la trophoblastine ovine utilisée pour le marquage à l'Iode 125 et pour les courbes d'étalonnage, est îssue de la purification par chromatographie HPLC de milieux de culture d'embryons ovins. Un antisérum anti-trophoblastine après immunisation de lapins est utilisé à une dilution finale de 1/360 000 ; il lie à 35 % la trophoblastine radioactive dans les conditions de dosage établies par les Inventeurs.
Caractéristiques du dosage
- Sensibilité : cette méthode permet de détecter 15 pg de trophoblastine dans 100 μl d'échantillon à tester.
- la Reproductibilité intra- et inter-dosage : exprimée par le coefficient de variation, est de 8 % et 10 % respectivement. - parallélisme : différents milieux de culture d'embryons ovinset de perfusats utérins de brebis gestantes présentent des courbes doses-réponses parallèles à la courbe .de référence, comme le montre la figure 4 qui représente la courbe d'inhibition de la liaison trophoblastine marquée à l'I125 /anticorps anti-trophoblastine par dilutions croissantes : les représentent la trophoblastine standard, les Δ représentent le perfusat utérin de brebis gestantes
les Δ représentent le milieu de culture d'embryons ovins.
Les autres composés sécrétés dans le milieu de culture par les embryons, ou présents dans le liquide utérin, n'interfèrent donc pas dans le dosage de trophoblastine. - Spécificité du dosage : il n'y a pas d' immunoréactivité croisée avec des interférons α porcins, des produits de sécrétion d'embryons bovins, porcins, de lapins, et des composés de sérum.
Grâce à ce dosage, on peut suivre l'évolution de la sécrétion de la trophoblastine in vivo et in vitro. La sensibilité du dosage permet de déceler de faibles quantités de trophoblastine sécrétée par des embryons ovins et caprins à des stades très précoces (20ng/embryon dans des perfusats de brebis à 11 jours de gestation, 1 μg/jour pour un embryon de 11 jours cultivé in vitro).
Cette méthode de dosage fiable, rapide et sensible permet d'étudier des facteurs de régulation de la sécrétion de la trophoblastine et apparaît comme pouvant être une méthode d'évaluation de la viabilité embryonnaire. L'ADNc des isoformes de la trophoblastine qui font l'objet de la présente invention ou de leurs analogues peut, en outre, être utilisable pour toutes les productions d'interférons σ de classe II par des procédés de génie génétique (expression bactérienne, cellulaire, génie génétique ou par l'intermédiaire d'animaux transgéniques).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims
REVENDICATIONS
1º) Isoformes de la trophoblastine ou de ses analogues embryonnaires, caractérisées par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à une formule généraie commune I :
Cys-Tyr-Leu-Ser-(X)-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-A.la-(U)-Glu-Asn-Leu
1 5 10 12 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-(Y)-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-(Z)-Gly
35 40 45
Asp-Gln-(W)-(V)-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro
50 55
(I) dans laquelle (X5) représente Glu ou Gln
(U12) représente Arg ou Lys (Y35) représente Lys ou Asp (Z44) représente Glu ou Asp (W48) représente Asp ou Leu (V49) représente Leu ou Gln
2º) Isoforme de la trophoblastine, selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'isoforme T1 comprend une séquence d' amino-acides N-terminale qui répond à la formule Ii ci-après: Cys-Tyr-Leu-Ser-Glu-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30
Gln-Asp-Arg-Lys-Lys-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 40 44 45
Asp-Gln-Asp-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro
50 55
(I1) 3º) Isoforme de la trophoblastine, selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'isoforme T2 comprend une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la forme I2 ci-après :
Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu
1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30
Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly
35 40 44 45
Asp-Gln-Leu-Gln-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro 50 55
( I2 )
4') Isoforme de la. trophoblastine, selon la revendication 1, caractérisée en ce que l' isoforme T3 comprend une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond a la formule I3 ci-après :
Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu
1 5 10 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Asp-Gly
35 40 44 45
(I3)
5°) Isoforme de la trophoblastine selon la revendication 1, ca,actérisée en ce que l'isoforme T4 comprend une séquence d' amino-acides N-terminale qui
répond à la formule I4 ci-après :
Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-
1 5 10 12
Leu-Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser- 15 20 25
Cys-Leu-Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-
30 35 40
Val-Glu-Gly-Asp-Gln-Leu
44 45 48 (14)
6°) Isoforme de la trophoblastine selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'isoforme T5 comprend une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la formule I5 ci-après : Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Lys-Glu-Asn-Leu
1 5 10 12 15
Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu
20 25 30
Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 40 45
Asp-Gln-Leu-Gln-Lys-Asp-Gln-Ala-Phe-Pro-Val-Leu
48 49 50 55
(l5)
7º) Procédé d'isolement des isoformes de la trophoblastine par. chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC), caractérisé en ce que l'on soumet un milieu de culture, obtenu à la suite d'une incubation de conceptus de mammifères, pendant un temps approprié, à une chromatographie sur colonne échangeuse d'anions équilibrée par un tampon cationique, puis à l'action d'un gradient salin dans un tampon cationique, en l'espace d'un intervalle de temps approprié, suivie d'une élution saline isocratique pendant laquelle les isoformes sont successivement recueillies. 8°) Procédé selon la Revendication 7, caractérisé en ce que le milieu de collecte des conceptus destinés à être mis en culture est constitué par un tampon approprié dépourvu de sérumalbumine et contenant de la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à 0,5 % poids/volume;
9') Procédé selon la Revendication 7, caractérisé en ce que les conceptus sont mis en culture dans un milieu de culture synthétique dépourvu de sérumalbumine et de sérum sanguin et contenant la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à 0,5 % poids/volume.
10º) Agent présentant des activités antivirales, antiprolifératives, antitumorales, immunologiques, immunomodulatrices, d'inhibition de rejet, de différenciation cellulaire et d'inhibition de la lutéolyse en début de gestation chez les mammifères, ainsi que de sélection génétique, caractérisé en ce qu'il est constitué par un interféron α de classe II, qui est l'une des isbformes de la trophoblastine telles qu'identifiées par leurs séquences N-terminales de formules I1, I2, I3, I4, Is ou leurs mélanges.
11º) Séquence nucléotidique d'ADNc d'une isoforme de la trophoblastine et séquence, déduite en aminoacides, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un polypeptide dont le poids moléculaire est de l'ordre de 23 kDa, correspondant au précurseur de la trophoblastine, et qui répond à la formule II ci-après, qui est celle de l'isoforme T2 :
AGAGAACCTACCTGAAG ATTCCCCCTGACCCCATCTCAGCCAGCCCAGCAGCAGCCGCATCTTCCCCATGGCC 53
Met Ala -23 TTC GTG CTC TCT CTA CTG ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAT GGC 98 Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr Gly
CCA GGA GGA TCT CTG GGT TGT TAC CTA TCT CAG AGA CTC ATG CTG 143 Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu
-1 +1 5
GAT GCC AGG GAG AAC CTC AAG CTC CTG GAC CGA ATG AAC AGA CTC 188 Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu 10 15 20
TCC CCT CAT TCC TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTT GGT CTT CCC 233 Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro 25 30 35
CAG GAG ATG GTG GAG GGC GAC CAG CTC CAG AAG GAC CAG GCC TTC 27S Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe 40 45 50
CCT GTG CTC TAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC TAC 323 Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr 55 60 65
ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAC CAG 368 Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Asp Gln 70 75 80
CTC TGC ACT GGA CTC CAA CAG CAG CTG GAC CAC CTG GAC ACC TCG 413 Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys 85 90 95
AGG GGT CAA GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GAA CTG GGT AAC ATG 458 Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met 100 105 110
GAC CCC ATT GTG ACC GTG AAG AAG TAC TTC CAG GGC ATC TAT GAC 503 Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp 115 120 125
TAC CTG CAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ATC GTC 548 Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140
AGA GTC GAG ATG ATG AGA GCC CTC ACT GTA TCA ACC ACC TTG CAA 593 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln 145 150 155
AAA AGG TTA ACA AAG ATG GGT GGA GAT CTG AAC TCA CCT TGATGACT 640 Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 160 165 170 172
CTTGCCGACTAAGATGCCACATCAGCCTCCTACACCCGCCTGTGTTCATTTCAGAAGACT 700
CTGATTTCTGCTCCAGCCACCAAATTCATTGAATTACTTTAGCTGATACTTTGTCAGTAG 760
TAAAAAGCAAGTAGATATAAAAGTATTCAGCTGTAGGGGCATGAGTCCTGAAATGATG 820
CCTTCCCTGATGTTATCTGTTGCTGATTTATTTATACCTTCTAGCATTTAACATACTTAA 880
AATATTAGGAAATTTGTTAAGTTACATTTCATCTGTACATCATATTAAAATTTCTAAAAC 940
ATG polyA (II) 943 12°) Sonde oligonucléotidique pour la caractérisation de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine et de ses isoformes , caractérisée en ce qu'elle est déduite de la séquence de l'ADNc de la trophoblastine de Formule II selon la revendication 11 ou des séquences de Formules I1, I2, I3 selon l'une des revendications 2 à 4.
13º) Sonde oligodéoxynucléotidique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle correspond aux résidus 34 à 43 de la séquence N-terminale de la trophoblastine et répond à la formule III ci-après : 34 35 40 43
Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val (III) 3' TTC CTI AAI CCI IAI GGI GTC CTC TAC CA 5' T T T Les I pouvant être remplacées par A, G ou C.
14º) Procédé d'obtention par clonage de l'ADNc de l'ARNm des isoformes de la trophoblastine, et notamment de l'ADNc de formule II, selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
- isolement des ARN poly(A)+ totaux embryonnaires, à partir d'embryons de mammifères, par une méthode appropriée ;
- mesure de l'activité biologique des ARN poly(A)+ embryonnaires isolés au cours de l'étape précédente, par traduction in vitro dans un système acellulaire approprié et estimation par électrophorèse-SDS de la quantité de trophoblastine synthétisée, suivie d'une immunoprécipitation à l'aide d'un sérum anti-trophoblastine monospécifique, et détection d'un polypeptide de poids moléculaire d'environ 23 kDa, correspondant au précurseur de la trophoblastine ;
- construction d'une banque d'ADN complémentaires d'embryons de mammifères, par synthèse des ADNc à partir d'une reverse-transcriptase et insertion de ces ADNc dans un vecteur d'expression, puis clonage dans des systèmes d* expression cellulaire appropriés propres à produire de la trophoblastine, ou l'une de ses isoformes, recombinante ; - recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de l'isoforme T1, T2 , T3 de la trophoblastine, par tous moyens appropriés.
15º) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine est réalisée à l'aide d' immunsérum monospécifique anti-trophoblastine.
16º) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la recherche desdits clones est réalisée à l'aide d'une sonde oligodéoxynucléotidique déduite de la séquence nucléotidique de l'ADNc de Formule II selon la revendication 11, par hybridation desdits clones avec ladite sonde, suivie de l'isolement des inserts de taille appropriée et du sous-clonage dans un plasmide approprié pour déterminer que l'un des clones s'hybride avec un ARN unique de 1,1 kb codant pour un polypeptide d'environ 23 kDa correspondant au précurseur de la trophoblastine et que l'autre des clones s'hybride avec l'ARNm correspondant à l'ADNc correspondant à l'une des isoformes de la trophoblastine.
17º) Kit de détection d'un signal embryonnaire pour contrôler la viabilité d'un embryon à un stade précoce de son développement, caractérisé en ce qu'il comprend en tant qu'agent de détection, au moins l'une des isoformes de la trophoblastine de formule I selon la revendication 1.
18º) Application des isoformes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en tant qu'agents de protection des embryons lors de leur transfert, pour améliorer leur aptitude à la survie. 19º) Application des isoformes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en tant qu'agents thérapeutiques, notamment en tant qu'agents antiviraux, antiprolifératifs, antitumoraux, immunomodulateurs, en médecine humaine et vétérinaire.
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