EP0417227A1 - Biokatalytisches verfahren sowie trägerteilchen, das aus magnetischem glas oder keramikteilchen besteht, und vorrichtung zur durchführung - Google Patents

Biokatalytisches verfahren sowie trägerteilchen, das aus magnetischem glas oder keramikteilchen besteht, und vorrichtung zur durchführung

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EP0417227A1
EP0417227A1 EP19900904292 EP90904292A EP0417227A1 EP 0417227 A1 EP0417227 A1 EP 0417227A1 EP 19900904292 EP19900904292 EP 19900904292 EP 90904292 A EP90904292 A EP 90904292A EP 0417227 A1 EP0417227 A1 EP 0417227A1
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EP
European Patent Office
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permanent magnet
particles
carrier particles
reactor
glass
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19900904292
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Kindervater
Rolf Dieter Schmid
Wolfgang Dr. Künneker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KINDERVATER Ralf
Original Assignee
Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Publication of EP0417227A1 publication Critical patent/EP0417227A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2446/10—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being used to coat a pre-existing polymer particle but not being present in the particle core
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    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/90—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids characterised by small molecule linker used to couple immunoreagents to magnetic particles
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Definitions

  • Biocatalytic process and carrier particles consisting of magnetic glass or ceramic particles and device for carrying them out.
  • biocatalysts such as proteins, DNA structures or microorganisms
  • the chemical or biological substance can also be measured indirectly by removing the substance or the reaction products from the reaction site and then allowing a further reaction to take place at the reaction site with which the course of the first reaction can be measured. This second reaction can thus be carried out without any interference from starting materials or products of the first reaction.
  • CPG porous glass
  • Chen modification have been subjected, for example with the help of aminopropylsilane.
  • Enzymes can be bound, for example, to such surface-modified CPG using the known Carbodii id, thiourea or azo method. Those skilled in the art are familiar with these techniques; see. for example Filbert, Controlled-Pore Glasses for Enzyme Immobilization. In: Messing, I mobilized Enzymes for Industrial Reactors, 39-62, NY, 1975.
  • a catalytic process which runs in liquid, in particular aqueous media, is now proposed, in which a biocatalyst is used which is fixed on glass or ceramic particles, in particular on porous glass (CPG) as a support, the process thereby resulting in is characterized in that the carrier particles are magnetic or magnetizable.
  • CPG porous glass
  • Such particles can be held in the liquid medium with the help of a magnetic field. If the process is carried out in a reactor through which the liquid medium flows, the carrier particles can easily be removed by switching off the magnetic field.
  • biocatalysts As in the prior art, biological macromolecules, such as antibodies, lectins, enzymes or DNA structures, organisms, such as microorganisms, or parts thereof, such as animal or plant tissue, are suitable as biocatalysts.
  • carrier particles which may be surface-modified ceramic material or glass, in particular porous glass (CPG), on which a fur / Felll mixed oxide / mixed hydroxide has been deposited.
  • a device which is characterized by a reactor for carrying out the catalytic process, a permanent magnet and an electromagnet, the reactor being arranged in the field of the permanent magnet and the permanent magnet using the Electromagnets can be switched off.
  • the device according to the invention can be used
  • the cover being a magnetizable element for the force connection between the poles of the permanent magnet and
  • FIG. 1 shows a schematic of a flow injection analysis (FIA);
  • FIG. 2 shows a device according to the invention for carrying out an FIA;
  • FIGS. 3 and 4 show further embodiments of the device according to the invention.
  • a water sample is to be examined for impurities, for example inhibitors of cholinesterase.
  • the water sample is included With the help of one of the pumps of the pump block 4 to 6 via the line 3 and the valve 12, it is fed to a reactor 17 in which the impurity sought is subjected to a reaction with the aid of a biocatalyst.
  • the reactor can be a reaction or line loop in a permanent magnet system which can be switched off and in which magnetizable CPGs are held by means of the magnetic field, on which, for example, cholinesterase has been immobilized.
  • the immobilized choline esterase is gradually poisoned by the impurity sought.
  • the outflow takes place via the valve 13 and the line 20.
  • the valve 12 is actuated so that the inflow of the water sample via line 3 is interrupted and the reactor via line 1 with the help of one of the pumps of pump block 4 to 6 a substrate is fed which is subjected to a reaction by the not yet inactivated biocatalyst.
  • the substrate is choline ester.
  • the substrate supplied to the reactor 17 via the line 1 and the valves 11 and 12 can be diluted with a liquid carrier which meets the substrate in the valve 11.
  • the liquid carrier can be a buffer solution.
  • the stream leaving the reactor 17 is fed via the valve 13 to a secondary reactor 21, in which the reaction product of the biocatalytic reaction is subjected to a further reaction, the result of which can be determined in the downstream detector 22.
  • the subsequent reaction is the oxidation of the choline released in the reactor 17 with the aid of choline oxidase, which produces hydrogen peroxide, which can be measured in the detector 22.
  • Carrier with unused biocatalyst is kept ready in the storage vessel 14 and can be stirred there with the aid of a stirrer 15 slurried. If the biocatalyst in the reactor 17 is used up, the permanent magnet (not shown) can be switched off, so that the used biocatalyst can be discharged via the valve 13 and the line 20 with the aid of the carrier stream 2. Unused biocatalyst can be fed to the reactor 17 from the storage vessel 14 via the line 16 and the valve 12.
  • the reactor 17 (FIG. 1) is shown in more detail in FIG. 2.
  • the permanent magnet 100 is formed like a gugelhupf, so that its two poles 101, 102 are formed by the edge of the ring wall 101 and the central pin 102.
  • This permanent magnet 100 is additionally provided with an electromagnet, of which only the connections 103, 104 can be seen.
  • the permanent magnet 100 can be switched off by the electromagnet, not shown.
  • the permanent magnet 100 carries a cover 105 made of a magnetically neutral material, for example brass. This cover 105 is provided on its side facing the permanent magnet 100 with a steel disk 106 which has a smaller diameter than the cover 105 and which produces the force fit between the poles 101 and 102.
  • a feed line 118 is brought to the periphery of the steel disk 106 and, as the actual reactor 117, runs around the steel disk 106 and then leads away as a line 119.
  • the actual reactor is thus placed as an approximately omega-shaped conductor loop 117 around the steel disk 106 and can lie on the periphery of the steel disk 106 in a groove in the cover 105.
  • 3 shows a further embodiment of a device according to the invention using a module.
  • the module consists of a base plate on which the coil of an electromagnet with a circular core is mounted so that a hose is guided between a gap in the core with tapered ends, which transports the magnetic particles.
  • a block made of non-magnetic material and fitted with a device for receiving a hose serves as the hose holder.
  • FIG. 4 shows a further embodiment in the form of a device according to the invention on the basis of a further module.
  • the module consists of a base plate on which a permanent magnet can be moved back and forth in the longitudinal direction by an actuator.
  • a block made of non-magnetic material which is firmly attached to the base plate and is equipped with a device for receiving a hose serves as the rear stop. At both ends of the block there are devices for holding the hose tight in the guide.
  • the servomotor is controlled so that the permanent magnet is moved against the stop block. So the tube through which the magnetic particles can flow comes under the direct influence of the magnetic field forces, which are concentrated in the slot of the magnet, between the two poles.
  • the magnet can be moved backwards by actuating the servomotor, so that the magnetic field acting on the hose is eliminated. She likes. Particles in the hose are no longer held and transported away in the direction of flow.
  • Cholinesterase was immobilized on the CPG particles obtained in Production Example 1 as follows. First with 5 percent. Glutaraldehyde activated in 0.1 M potassium phosphate buffer of pH 7.5. 50 mg glass and 2 ml aldehyde solution were slowly agitated in a sealed vessel for 30 minutes. The glass took on a strong pink color over the course of this time. The glass thus activated was washed six times with buffer, after which it was decanted and the supernatant was discarded. After the last washing, a solution of 10 mg / ml enzyme preparation in buffer could be added, after which the mixture was slowly rotated for 1 hour. The supernatant of the mixture was used for the Bradford protein determination. The slides were washed three times with buffer and then stored in buffer at 4C.
  • Glucose oxidase (GOD) was immobilized on CPG analogously to Example 1 with an enzyme concentration of 10 mg / ml buffer.
  • the composition of the substrate was as follows: 0.1 M potassium phosphate buffer of pH 7.5; dissolved therein per ml 21, uM glucose, 2 ⁇ uM ABTS and 10 units POD. 0.1 M potassium phosphate buffer of pH 7.5 was used as the carrier stream. The hydrogen peroxide formed by oxidation of the dye ABTS was detected photometrically at a wavelength of 420 nm.
  • Alcohol oxidase (AOD) was immobilized on CPG at an enzyme concentration of 10 mg / ml buffer according to Example 1.
  • a flow injection analysis is carried out, pulsing every 40 seconds with a substrate solution of the following composition: 0.1 M potassium phosphate buffer of pH 7.5; dissolved per ml: 300.UM ethanol, 2.uM ABTS and 10 units POD.
  • the detection in the photometer was carried out at 420 ⁇ m.

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Description

Biokatalytisches Verfahren sowie Trägerteilchen das aus magnetischem Glas oder Keramikteilchen besteht und Vor¬ richtung zur Durc führung.
Es. ist bekannt, Biokatalysatoren, wie Proteine, DNA-Struk¬ turen oder Mikroorganismen auf Oberflächen zu immobilisieren, um sie mit einer chemischen oder biologischen Substanz in Kontakt zu bringen, die gemessen werden soll. Die Messung der chemischen oder biologischen Substanz kann auch mittel¬ bar erfolgen, indem man die Substanz bzw. die Reaktionspro¬ dukte vo Reaktionsort entfernt und danach am Reaktionsort eine weitere Reaktion stattfinden läßt, mit der der Ablauf der ersten Reaktion meßbar nachgewiesen werden kann. Diese zweite Reaktion kann so ohne eventuelle Störungen durch Edukte oder Produkte der ersten Reaktion durchgeführt werden.
Es ist auch bereits bekannt, Biokatalysatoren auf magneti¬ schen Trägern zu immobilisieren. Beispiele lassen sich der folgenden Tabelle entnehmen.
Katalysator Träger Quelle
Enzym Polyacrylamid/ LKB Ltd. Agarose-Gel- Bromma/Schweden Perlen mit eingebette¬ tem Eisenoxid
Enzyme magn. Teilchen Koch-Light (Eisenoxid ) Laboratories Antikörper magn. Teilchen Scand . J. Immunol. , (Seltenerden) 22 (1985) 207;
Tissue Antigens, 28 (1986) 46
Andererseits ist es bekannt, Biokatalysatoren auf keramischem Material oder Glas, beispielsweise porösem Glas (CPG), zu immobilisieren. CPG bietet den Vorteil, daß sich Perlen prak¬ tisch beliebiger Größe vorsehen lassen. Zur Immobilisierung der herangezogenen Biokatalysatoren kann CPG einer Oberflä- chenmodifizierung unterworfen worden sein, beispielsweise mit Hilfe von Aminopropylsilan. Enzyme lassen sich beispielsweise an derartig ober- flächenmodifiziertes CPG nach der bekannten Carbodii id-, Thioharnstoff- oder Azomethode binden. Der Fachmann ist mit diesen Techniken vertraut; vgl. beispielswei¬ se Filbert, Controlled-Pore Glasses for Enzyme Immobiliza- tion. In: Messing, I mobilized Enzymes for Industrial Reac- tors, 39-62, NY, 1975.
Bisher hat jedoch nicht befriedigt, daß man die mit immobili¬ sierten Biokatalysatoren durchgeführten Verfahren unterbre¬ chen muß, wenn die Aktivität der Biokatalysatoren abfällt, da dann die Katalysatorträger mit dem verbrauchten Biokataly¬ sator entfernt und durch frischen Biokatalysator ersetzt wer¬ den müssen.
Erfindungsgemäß wird nun dazu ein in flüssigen, insbesondere wässerigen Medien ablaufendes katalytisches Verfahren vorge¬ schlagen, bei dem ein Biokatalysator verwendet wird, der auf Glas- oder Keramikteilchen, insbesondere auf porösem Glas (CPG) als Träger fixiert ist, wobei das Verfahren dadurch ge¬ kennzeichnet ist, daß die Trägerteilchen magnetisch oder mag- netisierbar sind.
Derartige Teilchen lassen sich in dem flüssigen Medium mit Hilfe eines Magnetfeldes halten. Wird das Verfahren in einem Reaktor durchgeführt, der von dem flüssigen Medium durchflös¬ sen wird, so lassen sich die Trägerteilchen durch Ausschal¬ ten des Magnetfeldes leicht austragen.
Als Biokatalysatoren bieten sich, wie beim Stand der Technik, biologische Makromoleküle, wie Antikörper, Lectine, Enzyme oder DNA-Strukturen, Organismen, wie Mikroorganismen, oder Teile davon an, wie Tier- oder Pflanzengewebe. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich mit Trägerteilchen durchführen, bei denen es sich um gegebenenf lls oberflächen¬ modifiziertes Keramikmaterial oder Glas handelt, insbesondere poröses Glas (CPG), auf dem ein Fell/Felll-Mischoxid/Misch- hydroxid niedergeschlagen worden ist.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich ferner eine Vorrichtung, die durch einen Reaktor zur Durch¬ führung des katalytischen Verfahrens, einen Permanentmagneten und einen Elektromagneten gekennzeichnet ist, wobei der Reak¬ tor im Feld des Permanentmagneten angeordnet ist und der Per¬ manentmagnet mit Hilfe des Elektromagneten ausgeschaltet wer¬ den kann.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann die erfindungs¬ gemäße Vorrichtung durch
- einen topf- oder gugelhupfartigen Permanentmagneten und
- einen die Öffnung des Permanentmagneten bedeckenden Deckel aus einem magnetisch neutralen Material, wie Messing, ge¬ kennzeichnet sein,
- wobei der Deckel ein magnetisierbares Element für den Kraft¬ schluß zwischen den Polen des Permanentmagneten und
- als Reaktor eine im Kraftfeld des Permanentmagneten liegen¬ de Leitungsschleife trägt.
Nachstehend wird die Erfindung durch Figuren und Beispiele näher erläutert.
Figur 1 zeigt ein Schema einer Fließinjektionsanalyse (FIA); Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durch¬ führung einer FIA;
Figuren 3 und 4 zeigen weitere Ausführungsformen der erfin¬ dungsgemäßen Vorrichtung.
Bei dem Reaktionsschema nach Fig. 1 soll eine Wasserprobe auf Verunreinigungen untersucht werden, beispielsweise auf Inhi¬ bitoren der Cholinesterase. Dazu wird die Wasserprobe mit Hilfe einer der Pumpen des Pumpenblocks 4 bis 6 über die Lei¬ tung 3 und das Ventil 12 einem Reaktor 17 zugeführt, in dem die gesuchte Verunreinigung mit Hilfe eines Biokatalysators einer Reaktion unterworfen wird. Bei dem Reaktor kann es sich um eine Reaktions- bzw. Leitungsschleife in einem ab¬ schaltbaren Permanentmagnetsystem handeln, in der mit Hilfe des Magnetfeldes magnetisierbare CPG gehalten werden, auf denen beispielsweise Cholinesterase immobilisiert worden ist. Im gewählten Beispiel wird die immobilisierte Cholin¬ esterase durch die gesuchte Verunreinigung allmählich ver¬ giftet. Der Abstrom erfolgt über das Ventil 13 und die Lei¬ tung 20. Nach einem bestimmten Zeitintervall wird das Ventil 12 so betätigt, daß der Zufluß der Wasserprobe über die Leitung 3 unterbrochen und dem Reaktor über die Leitung 1 mit Hilfe einer der Pumpen des Pumpenblocks 4 bis 6 ein Substrat zugeführt wird, das vom noch nicht inaktivierten Biokatalysator einer Reaktion unterworfen wird. Im gewähl¬ ten Beispiel handelt es sich bei dem Substrat um Cholin- ester. Das über die Leitung 1 und die Ventile 11 und 12 dem Reaktor 17 zugeführte Substrat kann mit einem Flüssig¬ träger verdünnt werden, der mit dem Substrat im Ventil 11 zusammentrifft. Bei dem Flüssigträger kann es sich um eine Pufferlösung handeln. Der den Reaktor 17 verlassende Strom wird über das Ventil 13 einem Sekuπdärreaktor 21 zugeführt, in dem das Reaktionsprodukt der biokatalytischen Reaktion einer weiteren Umsetzung unterworfen wird, deren Ergebnis im nachgeschalteten Detektor 22 ermittelt werden kann. Im gewählten Beispiel handelt es sich bei der nachgeschalteten Reaktion um die Oxidation des im Reaktor 17 f eigesetzten Cholins mit Hilfe von Cholinoxidase, bei der Wasserstoff¬ peroxid anfällt, das im Detektor 22 gemessen werden kann.
Träger mit unverbrauchtem Biokatalysator wird in dem Vorrats¬ gefäß 14 bereitgehalten und kann dort mit Hilfe eines Rührers 15 aufgeschlämmt werden. Ist der Biokatalysator im Reaktor 17 verbraucht, so kann der Permanentmagnet (nicht dargestellt) abgeschaltet werden, so daß der verbrauchte Biokatalysator über das Ventil 13 und die Leitung 20 mit Hilfe des Träger¬ stroms 2 ausgetragen werden kann. Aus dem Vorratsgefäß 14 kann über die Leitung 16 und das Ventil 12 unverbrauchter Biokatalysator dem Reaktor 17 zugeführt werden.
Der Reaktor 17 (Fig. 1) ist in Fig. 2 näher dargestellt. Der Permanentmagnet 100 ist gugelhupfartig ausgebildet, so daß seine beiden Pole 101 , 102 durch den Rand der Ring¬ wandung 101 und den mittigen Zapfen 102 gebildet werden. Dieser Permanentmagnet 100 ist zusätzlich mit einem Elektro¬ magneten versehen, von dem nur die Anschlüsse 103, 104 zu sehen sind. Der Permanentmagnet 100 kann durch den nicht dargestellten Elektromagneten abgeschaltet werden. Der Per¬ manentmagnet 100 trägt einen Deckel 105 aus einem magnetisch neutralen Material, beispielsweise Messing. Dieser Deckel 105 ist auf seiner dem Permanentmagneten 100 zugewandten Seite mit einer Stahlscheibe 106 versehen, die einen gerin¬ geren Durchmesser als der Deckel 105 besitzt und den Kraft¬ schluß zwischen den Polen 101 und 102 herstellt. Eine Zu¬ leitung 118 ist an die Peripherie der Stahlscheibe 106 heran¬ geführt und umläuft als eigentlicher Reaktor 117 die Stahl¬ scheibe 106, um dann als Leitung 119 wegzuführen. Der eigent¬ liche Reaktor ist also als etwa omega-förrnige Leitungsschlei¬ fe 117 um die Stahlscheibe 106 gelegt und kann an der Peri¬ pherie der Stahlscheibe 106 in einer Nut des Deckels 105 liegen. Fig. 3 zeigt anhand eines Moduls eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Das Modul besteht aus einer Grundplatte, auf die die Spule eines Elektromagneten mit einem kreisförmigen Kern so montiert ist, daß zwischen einem Spalt im Kern mit spitz zulaufenden Enden ein Schlauch geführt wird, der die magnetischen Partikel transportiert. Als Schlauchhalterung dient ein auf die Grundplatte aufgesetzter Block aus nichtmagnetischem Material, der mit einer Vorrichtung zur Aufnahme eines Schlauches ausgestattet ist. Durch Anschalten eines Stromes wird das Magnetfeld aktiviert und Magnetpartikel im Spalt des Kerns gehalten. Wird der elektrische Strom ausgeschaltet, können die Partikel mit der Strömung weiterfließeπ.
Fig. 4 zeigt anhand eines weiteren Moduls eine weitere Ausführung form einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Das Modul besteht aus einer Grundplatte, auf der ein Permanentmagnet beweglich in Längsrichtung von einem Stellmotor hin und her bewegt werden kann. Als hinterer Anschlag dient ein fest auf die Grundplatte aufgesetzter Block aus nichtmagnetischem Material, der mit einer Vorrichtung zur Aufnahme eines Schlauches ausgestattet ist. An den beiden Enden des Blockes befinden sich Vorrichtungen zum straffen Halten des Schlauches in der Führung.
Zum Fixieren der Magnetpartikel wird der Stellmotor so angesteuert, daß der Permanentmagnet gegen den Anschlagblock gefahren wird. So kommt der Schlauch, durch den die magnetischen Partikel fließen können, in den direkten Einfluß der magnetischen Feldkräfte, die im Schlitz des Magneten, zwischen den beiden Polen, konzentriert sind. Nach Durchführung der entsprechenden Analyseschritte, die die mag. Fixierung erfordern, kann durch Ansteuerung des Stellmotors der Magnet nach hinten bewegt werden, sodaß das auf den Schlauch einwirkende Magnetfeld wegfällt. Die mag. Partikel im Schlauch werden nicht mehr gehalten und in Strömungsrichtung abtransportiert.
Herstellungsbeispiel 1.
In 20 ml einer Lösung von 8,0 g/1 Eisen-II-chlorid und 21,6 g/1 Eisen-III-chlorid in destilliertem Wasser wurden 2 g Amiπopropyl-CPG eingebracht. Durch Anlegen von Vakuum (50 bar) wurden die Kapillarräume des CPG von Luft befreit und mit der genannten Lösung gefüllt. Die aufgeschüttelte Lösung wurde nun in 50 ml einer auf 70 C erwärmten Lösung von 100 g/1 Natriumhydroxid in destilliertem Wasser einge¬ rührt. Der gebildete schwarze Niederschlag wurde zusammen mit dem CPG noch über 1 h lang gerührt. Die mit einer magne¬ tischen Inkrustierung versehenen CPG-Partikel wurden in mehreren Waschvorgängen mit jeweils anschließender Dekan¬ tierung des kolloidalen Überstandes gereinigt. Die CPG- Partikel wurden in einer Porzellanschale im Exsikkator ge¬ trocknet.
Beispiel 1.
Es wurde Cholinesterase auf den im Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen CPG-Partikeln folgendermaßen immobilisiert. Zuerst wurde mit 5-proz. Glutaraldehyd in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer vom pH 7,5 aktiviert. 50 mg Glas und 2 ml Aldehydlösung wurden 30 min lang in einem verschlossenen Gefäß langsam bewegt. Das Glas nahm im Verlauf dieser Zeit eine kräftige rosa Färbung an. Das so aktivierte Glas wurde sechsmal mit Puffer gewaschen, wonach abdekaπtiert und der Überstand verworfen wurde. Nach dem letzten Waschvorgang konnte eine Lösung von 10 mg/ml Eπzympräparat in Puffer zugegeben werden, wonach man das Gemisch 1 h lang langsam rotieren ließ. Der Überstand des Gemisches wurde zur Proteiπbestimmung nach Bradford herangezogen. Die Träger wurden dreimal mit Puffer gewaschen und dann in Puffer bei 4 C aufbewahrt.
Beispiel 2.
Es wurde Glucoseoxidase (GOD) analog zu Beispiel 1 mit einer Enzymkonzentration von 10 mg/ml Puffer auf CPG immobilisiert.
In einer Vorrichtung gemäß den Fig. 1 und 2 wurde eine Flie߬ injektioπsanalyse durchgeführt, wobei der Reaktor alle 40 - 3 -
sec mit einer Substratiπjektion beschickt wurde. Die Zusammen¬ setzung des Substrats war wie folgt: 0,1 M Kaliumphosphat¬ puffer vom pH 7,5; darin pro ml gelöst 21 ,uM Glucose, 2^uM ABTS und 10 Einheiten POD. Als Trägerstrom diente 0,1 M Kaliumphosphatpuffer von pH 7,5. Die Detektion des durch Oxidation des Farbstoffes ABTS entstehenden Wasserstoff¬ peroxids erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 420 nm.
Beispiel 3.
Es wurde Alkoholoxidase (AOD) auf CPG bei einer Enzymkonzen- tration von 10 mg/ml Puffer gemäß Beispiel 1 immobilisiert.
Mit einer in den Fig. 1 und 2 dargestellten Vorrichtung erfolgt eine Fließinjektioπsanalyse, wobei alle 40 sec mit einer Substratlösung folgender Zusammensetzung pulsiert wurde: 0,1 M Kaliumphosphatpuffer von pH 7,5; darin pro ml gelöst: 300.uM Ethanol, 2.uM ABTS und 10 Einheiten POD. Die Detektion im Photometer erfolgte bei 420 πm.

Claims

- 3 "Patentansprüche:
1. In einem flüssigen, insbesondere wässerigen Medium ablaufen¬ des katalytisches Verfahren, bei dem ein Biokatalysator verwen¬ det wird, der auf Glas- oder Keramikteilchen, insbesondere porösem Glas (CPG) als Träger fixiert ist, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Trägerteilchen magnetisch oder magnetisierbar sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet; daß die Oberfläche der Trägerteilchen mit einer Trennschicht aus einem organischen Polymeren versehen ist, beispielsweise Glutaral¬ dehyd oder Polyurethan.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerteilchen zur Fixierung des Biokatalysators ober¬ flächenmodifiziert sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trägerteilchen in dem flüssigen Medium mit Hilfe eines Magnetfeldes hält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren in einem Reaktor durchführt, der von dem flüssi¬ gen Medium durchflössen wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Biokatalysatoren biologische Makro¬ moleküle, wie Antikörper, Enzyme, DNA-Strukturen oder Lectine, oder Organismen, wie Mikroorganismen, oder Teile davon, wie Tier- oder Pflanzengewebe, verwendet.
7. Trägerteilchen insbesondere zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich¬ net, daß es sich um Keramikmaterial oder Glas, insbesondere poröses Glas (CPG) handelt, auf dem ein Fell/Felll-Misch- oxid/Mischhydroxid niedergeschlagen worden ist und das gegebe¬ nenfalls auf seiner Oberfläche mit einer Trennschicht aus einem organischen Polymeren versehen, beispielsweise mit Glutaral¬ dehyd oder Polyurethan und gegebenenfalls oberflächen¬ modifiziert ist.
8. Trägerteilchen nach Anspruch 7, dadurch herstellbar, daß man
- Keramik- oder Glasteilchen mit einer wässerigen Fell- und Felll-ionen enthaltenden Lösung zusammenbringt,
- durch Unterdruck die Teilchenhohlräume mit der Lösung füllt und
- alkalisch auf den Teilchen ein Fell/Felll-Mischoxid/Misch- hydroxid fällt,
- gegebenenfalls die Trägerteilchen mit einem organischen Poly¬ meren überzieht, beispielsweise mit Glutaraldehyd oder Polyurethan und
- gegebenenfalls eine Oberflächenmodifizierung durchführt.
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere mechanisch bewegbare Permanentmagnete, an- und ab¬ schaltbare Elektromagnete oder elektromagnetisch an- und ab¬ schaltbare Permanentmagnete aufweist, mit deren Hilfe der Bio¬ katalysator zeitweise in dem die Vorrichtung durchströmenden flüssigen Medium gehalten werden kann.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Durchführung einer chemischen oder biologi¬ schen Analyse vorgesehen ist, beispielsweise einer Fließinjek¬ tionsanalyse. - II-
11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, gekennzeichnet durch einen Reaktor zur Durchführung des katalytischen Verfahrens, einen Permanentmagneten und einen Elektromagneten, wobei der Reaktor im Feld des Permanentmagneten angeordnet ist und der Permanentmagnet mit Hilfe des Elektromagneten ausgeschaltet werden kann.
12. Vorrichtung insbesondere nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch
- einen topfartigen Permanentmagneten und
- einen die Öffnung des Permanentmagneten bedeckenden Deckel aus einem magnetisch neutralen Material, wie Messing,
- wobei der Deckel ein magnetisierbares Element für den Kraft¬ schluß zwischen den Polen des Permanentmagneten und
- als Reaktor eine im Kraftfeld des Permanentmagneten liegende Leitungsschleife trägt.
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