EP0476025A1 - Souches modifiees de bacteries phytopathogenes et application en agriculture - Google Patents

Souches modifiees de bacteries phytopathogenes et application en agriculture

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EP0476025A1
EP0476025A1 EP90909457A EP90909457A EP0476025A1 EP 0476025 A1 EP0476025 A1 EP 0476025A1 EP 90909457 A EP90909457 A EP 90909457A EP 90909457 A EP90909457 A EP 90909457A EP 0476025 A1 EP0476025 A1 EP 0476025A1
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EP
European Patent Office
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gene
strains
hrp
activity
genes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP90909457A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christian Boucher
Pierre Boistard
Matthieu Arlat
Patrick Barberis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP0476025A1 publication Critical patent/EP0476025A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
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    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • the invention relates to modified strains of phytopathogenic bacteria and their applications for the screening of molecules usable for the protection of cultures.
  • the chemical fight which aims to slow down the development of a phytopathogenic microorganism or even to kill it by acting on some of its vital components has proven its effectiveness in the protection of plants against many diseases and, in particular, those caused by fungi.
  • broad-spectrum pesticides alter the balance between populations at the ecosystem level. This is why molecules presenting a narrow specificity and a minimum impact on the populations in place were sought.
  • the inventors have developed a new strategy based on the search for molecules which interfere with the expression of the deleterious effects of the pathogenic agent to be combated without seeking its elimination.
  • pathogenicity genes also control the ability to induce the hypersensitive reaction on non-host plants.
  • the invention also aims to provide a process allowing the construction of these strains.
  • the invention also aims to provide a method of screening substances for the detection of active materials capable of hampering the normal course of the infectious process of phytopathogenic bacteria comprising the use of these strains.
  • the strains of the invention are strains of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syringa, Xanthomonas campestris or Er inia amylovora, characterized in that they comprise at least one coding sequence of a reporter gene under the control of the promoter.
  • an hrp gene this sequence coding for a protein expressing a biological or enzymatic activity, the expression of this protein being able to be repressed totally or partially in the presence of molecules capable of interfering with the expression of the hrp gene, these strains not exhibiting other functional gene conferring the biological or enzymatic character encoded by the reporter gene, the reporter gene being different from the gene conferring the activity to nucleate the freezing.
  • strains of the invention are strains of Pseudomonas solanacearum, Xanthomonas campestris or Erwinia amylovora, characterized in that they comprise the coding sequence of a reporter gene under the control of the promoter of an hrp gene, this sequence coding for a protein expressing a biological or enzymatic activity capable of being repressed totally or partially in the presence of molecules capable of interfering with the expression of the hrp gene, these strains having no other functional gene conferring the biological or enzymatic character encoded by the reporter gene.
  • reporter gene is meant a coding sequence devoid of its own promoter and the expression of which is placed under the dependence of an exogenous promoter, derived from an hrp gene. It measures the transcriptional activity of this promoter.
  • the strains of the invention are obtained by transcriptional fusion and comprise, upstream of the coding sequence of the reporter gene, a ribosome binding and translation initiation site (Shine-Delgarno sequence).
  • the strains of the invention are obtained by translational fusion, the coding sequences being devoid of their ATG codon initiating translation and / or of their Shine-Delgarno sequence.
  • the coding sequence of the reporter gene codes for a protein endowed with a biological or enzymatic activity which can be revealed according to conventional techniques.
  • Appropriate strains for the implementation of the invention are haploid strains for the hrp sequences, carrying the fusion in an hrp gene.
  • suitable strains are constituted by merodiploid strains for all or part of the hrp genes, in which the fusion of genes is carried out in at least one of the copies of the hrp genes.
  • the invention also relates to a system which can be used for the detection of molecules for the purpose of culture protection, characterized in that it comprises on the one hand a strain as defined above, on the other hand a molecule capable of hindering the normal course of the infectious process of phytopathogenic bacteria.
  • the invention further relates to a process for obtaining the strains defined above.
  • the reintroduction is carried out either by a double homologous recombination which results in the replacement of the wild-type gene by the above construction, or by introduction of the copy of the mutated gene cloned on a vector capable of being maintained in a stable manner in the strain of P. solanacearum, P. syringae, X. campestris or E. amylovora.
  • the biological or enzymatic activity expressed by the strains thus modified is used to advantage according to the invention to carry out in a simple manner the screening of molecules capable of acting on the transcription of the hrp genes.
  • the invention therefore relates to a process for screening substances with a view to detecting active materials liable to hinder the normal course of the infectious process of phytophathogenic bacteria, this process being characterized in that a strain as defined above is used.
  • a strain as defined above is used.
  • Such a process is particularly suitable for combating phytopathogenic bacteria given the ban on the use of antibiotics in agriculture.
  • the demonstration of the activity of the materials tested involves in particular detections of enzymatic activity, differential behavior in the presence of antibiotics, a measurement of light emission or a glaciogenic activity.
  • a strain obtained by transcriptional fusion between the promoters ... a hrp genes and the coding sequence of the structural gene for ⁇ -galactosidase in pure culture, under appropriate conditions,? -Galactosidase is produced.
  • the strain gives a blue color due to the hydrolysis of X-gal by la, 9-galactosidase.
  • Any substance added to the culture medium and capable of specifically repressing an hrp gene for pathogenicity is manifested by the disappearance or the reduction in intensity of the coloration due to the expression of 3-gala ⁇ tosidase without the bacterial growth being affected.
  • the fusion between the coding sequence of the jS-galactosidase gene and the promoter of an hrp gene can be carried out by conventional techniques of DNA recombination in vitro or in vivo. Constructions usable for this purpose are presented in the review of Silhavy and Beckwith (14) and in the publication (5). By way of example of substances thus detected which can be used as active materials, mention will be made of casein hydrolysates or peptone. But it is clear that a wide spectrum of substances can be detected by implementing the provisions of the invention, by choosing an appropriate reporter gene.
  • the substances detected according to the invention make it possible to fight effectively not only in the fight against the bacterial wilting due to P. solanacearum, but also against other diseases caused by all the pathovars of P. syringae, and X. campestris or by E. amylovora.
  • the table below indicates the essential characteristics of the strains and of the plasmids used.
  • the strains of P. solanacearum are cultivated at 30 ° C.
  • the media used and their compositions given in grams per liter are medium B (peptone 10 yeast extract 1, casein hydrolyzate 1), BG (identical to B and supplemented with glucose: 5), BGT (identical to BG and supplemented with triphenyl tetrazolium chloride: 0.05), MMG (Fe S0 4 , 7H 2 0: 1.25.10 "4 ; (NH 4 ) 2 S0 4 : 0, 5; Mg S0 4 , 7H 2 0: 0.05; KOH (ION): 1.75 ll "1 ; KH 2 P0 4 : 3.4; glucose 2).
  • the strains of E. coli are grown at 37 ° C in medium L containing in grams per liter (yeast extract: 5; Bactotryptone: 10; NaCl: 10).
  • the media are supplemented if necessary with the following antibiotics: streptomycin (S) at 200 ⁇ g.ml “1 ; nalidixic acid (Nal) at 25 ⁇ g.ml * 1 ; tetracycline (Te) at 10 ⁇ g.ml “ 1 and kanamycin (Km ) to 25 ⁇ g.ml "1.
  • S streptomycin
  • Nal nalidixic acid
  • Te tetracycline
  • Km kanamycin
  • the donor and recipient strains as well as the K12 "helper" strain (pRK2013) are cultivated for approximately 14 hours in non-selective liquid nutritive medium.
  • the precultures of the donor and helper strains are then diluted in fresh liquid nutritive medium.
  • OD (650 nm) of these new cultures reaches 0.2 (10 8 bacteria / ml)
  • 0.5 ml of these and 0.5 ml of the culture of the receptor strain are mixed and filtered on a Millipore filter. 0.4f ⁇ m pore diameter.
  • the filters are then placed on boxes of solid nutritive medium, the bacteria being above the membranes.
  • the nature of the nutrient medium and the conditions of incubation depend on the bacteria involved in the crossing:
  • the filters are deposited on L medium and incubated at 37 ° C for 4 hours, when one of the crossing partners is P. solanacearum, the filters are deposited on BG medium and incubated from 4 to 18 hours at 30 * vs. Two controls are performed by incubating the crossbreeding partners separately under the same conditions.
  • the transposon Tn5-B20 (5) was used to mutagenize the recombinant cosmids pVir2 and pAFE8.
  • This transposon is inserted on a lambda phage which carries an amber mutation.
  • Mutagenesis is carried out by infecting the strain of E. coli S17-1 containing the plasmid pVir2 or pAFE ⁇ with this phage lysate. To this end, the strains are cultivated at 37 ° C. in medium L containing 0.2% maltose. When the OD (650 nm) of the culture reaches 0.8 (10 9 bacteria / ml), the latter is infected at 37 ° C.
  • the mutants Km r are crossed en masse with the receptor strain C2110 Nal r in the presence of the strain K-12 (pRK2013), the cross product is then spread on L NalTcKm medium and incubated at 37 ° C. which makes it possible to select the transfer of the cosmids carrying the transposon.
  • the 0-galactosidase activity is assayed on bacterial cultures for which the OD at 600 nm must be between 0.2 and 0.8. After having measured the OD of the culture at 600 nm, 375 ⁇ l of the latter are mixed with an equal volume of buffer Z (Na ⁇ PO ⁇ 0.06M; NaH 2 P0 4 0.04M; KC1 0.01M; MgS0 4 0.005M, 0.05M 9-mercaptoethanol; pH: 7.0) in a 1.5 ml Eppendorf tube. The cells are lysed by adding 100 ⁇ l of chloroform and 50 ⁇ l of 0.1% SDS.
  • the OD ⁇ Q reflects the bacterial concentration before the test.
  • t reaction time expressed in minutes
  • v volume of the culture used for the test, expressed in ml. 6 / Pathogenicity tests on tomatoes
  • the surface of the tomato seeds (cultivar Marmande, supplied by the Vilmorin Company, Beaufort en Vallée, France) is sterilized at 30 ° C for 45 minutes in a solution of calcium hypochlorite 7% (w / v). The seeds are then thoroughly rinsed with sterile deionized water before being deposited on medium plates B. The plates are incubated 60 hours at 30 ° C, which provides seed germination and control sterility.
  • the managed seeds are transferred in pairs into sterile test tubes (22 mm in diameter) which contain 1.5 g of iculite worm and 6 ml of nutritive solution (KNOj, 5 ⁇ M; KH 2 P0 4 , 2mM, Ca ( ⁇ 3) 2, 2 mM; MgS0 4, l, 5 mM H 3 B0 4, 24 ⁇ M; MnS0 4, 8,9 ⁇ M; ZnS0 4, 3, l ⁇ M; CuS0 4, l ⁇ M; K 2 Mo0 4, 0, l ⁇ M and FeS0 4 , 0.1 lmM complexed with EDTA, 0.1 lmM).
  • the tubes are placed in a culture chamber (16 h 3600 lux, 30 * C and 85% relative humidity; 8 h of darkness, 28 * C and 85% relative humidity).
  • the seedlings with fully deployed cotyledons are inoculated in a sterile manner by adding to each tube 1 ml of water containing 10 7 to 10 8 of bacteria to be tested. Each bacterial strain is thus tested on 4 tubes.
  • 4 tubes are inoculated with the GMI1000 strain and four others with sterile water as a control.
  • Tobacco plants (cultivar Bottom Special) are grown in a greenhouse (18 + 2'C, 16h of light, 8h of darkness) in 15cm pots containing a mixture (l: l, v / v) of peat and horticultural compost.
  • Tobacco plants aged 9 weeks are inoculated with the mutants derived from the GMI1000 strain according to the protocol described in (8).
  • the cells of cultures in the exponential growth phase (10 8 bacteria / ml) of the strains to be tested are harvested by centrifugation (3000 g, 10 min) and resuspended in sterile water so as to have 10 7 bacteria per ml.
  • the suspensions are infiltrated into the tissues between 2 ribs of young leaves fully deployed. A sheet can thus receive 3 or 4 independent infiltrations.
  • the inoculated tobacco plants are placed in a culture chamber (16h 3600 lux, 30 # C and 85% relative humidity; 8h of darkness, 28 * C and 85% relative humidity). The results are noted 48 and 60 hours after the infiltration. 8 / Production of tomato root exudates
  • the developed method makes it possible to obtain 300 ml of solution of root exudates from 600 tomato seeds (cultivar Marmande).
  • tomato seeds are deposited in a Petri dish (13.5 cm diameter) and then covered by an aqueous solution of 0.7% soft agar supercooled.
  • the Petri dish is slightly shaken to ensure a uniform distribution of seeds in the agar.
  • the agar is cut and the pieces are transferred sterile into a beaker on a grid which rests on the surface of 300 ml of sterile deionized water.
  • the beaker is then placed in a culture chamber (16h 3600 lux, 30'C and 85% relative humidity; 8h of darkness, 28 * C and 85% relative humidity).
  • Tobacco cells are cultured according to the method described in (9) and are subcultured every 14 days in fresh JPL medium.
  • the cell suspensions obtained 14 days after transplanting were successively filtered on a fried glass filter n * l and on a Millipore filter of 0.45 ⁇ m pore diameter.
  • the sterility of the filtrate was tested by spreading part of it on medium B and by incubating the Petri dishes for 4 days at 30 ° C.
  • the tobacco extract thus produced is stored at -20 ° C. 10 / Induction of the expression of hrp genes
  • the derivatives of the strain GMI1000 carrying an insertion of the transposon Tn5-B20 in the hrp region were cultured in a minimum MMG medium.
  • This figure represents the location of the Tn5-B20 insertions in the genomic regions carried by the cos ides pVir2 and pAFE8 and the level of activity
  • the inserts with the lacZ gene sequences oriented from left to right are shown above the genetic map of the GMI1000 strain.
  • the inserts with the lacZ gene sequences oriented from right to left are shown below.
  • Insertions conferring ⁇ -galactosidase activity greater than 5 units are indicated by solid symbols: H,).
  • the insertions inducing a ⁇ -galactosidase activity of less than 5 units are indicated by the empty symbols: 1 ⁇ 1.Q).
  • the horizontal arrows below the genetic map represent the hrp transcription groups.
  • the direction of the arrow indicates the direction of transcription of each of these groups.
  • the number of each transcription group is shown above the arrow.
  • the level of 3-galactosidase activity measured for the insertions which made it possible to define these groups is reported under each arrow (200:> 200 units; 150: from 120 to 170 units; 100: from 70 to 120 units; 50: from 30 to 70 units; 20: 18 to 25 units; 15: 12 to 16 units).
  • the Tn5-B20 transposon creates transcriptional fusions between the lacZ gene devoid of its own promoter and the genes into which it is inserted.
  • the activity / 9-galactosidase produced by each of the derivatives of the strain GMI1000 carrying an insertion of Tn5-B20 cultivated in minimum medium was measured. It was found that the level of 0-galactosidase activity produced by these derivatives was variable and that it was possible to classify them into 6 groups according to the level of ⁇ -galactosidase activity obtained: - for the first group of derivatives, the activity level / 3-galactosidase sure is greater than or equal to 200 units;
  • this level is of the order of 150 units (from 120 to 170 units); - for the third, this level is of the order of 100 units (from 70 to 120 units);
  • this level is close to 50 units (30 to 70 units);
  • this level is between 15 and 20 units
  • this level is less than 5 units.
  • the mutants belonging to the other activity level groups certainly carry localized insertions at the level of regions transcribed in MMG.
  • Tn5-B20 can be used to detect the transcription of genes in P. solanacearum.
  • the existence of several regions transcribed at the level of groups of hrp genes has been established.
  • the orientation of the transposons within these different regions made it possible to determine their sense of transcription.
  • 9 different groups of trancription were distinguished (figurel).
  • the hrpl and II groups which are contiguous and transcribed in the same orientation were separated into two different groups because the insertions of the hrpl group induce a 50-unit / 3-galactosidase activity while the hrpll group insertions induce activity of 200 units.
  • This separation is confirmed by the fact that the insertions 1484, 1457 and 1443 located at the 3 'end of the transcript (potential) of the hrpll group and the 5' end of the trancrit (potential) of the hrpl group induce a phenotype wild while the adjacent insertions of the hrpl and II groups induce an Hrp * phenotype.
  • Insertions 1484 and 1457 do not affect pathogenicity although they are located at the 3 'end of the hrpl1 transcription group. However, they give the strain the ability to produce ⁇ -galactosidase at a level equivalent to that of the other fusions carried out in the hrpll region. This can be explained by the fact that Tn5-B20 produces transcriptional fusions and that these insertions are located upstream of the transcription termination sequences of this region II and downstream of the coding sequences.
  • insertion 1421 inducing a wild phenotype confirms the existence of 2 distinct transcription groups.
  • This insertion located at the 3 ′ end of the (potential) trancrit of the hrpVII group and whose orientation (relative to the lacZ gene) is analogous to the sense of transcription of this transcription group produces a jS- activity galactosidase similar to that produced by localized insertions in this group can be justified by the same reasons as those invoked previously for insertions 1484 and 1457 of the hrpll transcription group.
  • the inserts 1503 and 1415 which do not alter the pathogenic power, show the existence of a non-transcribed region between the hrpVI and VII transcription groups whose opposite transcription directions. In this case again, the results obtained by the analysis of activities, 3-galactosidase and phenotypes on plants agree. 3. STUDIES OF THE REGULATION OF GENES hrp; INDUCTION BY PLANT EXTRACTS
  • the derivatives of the strain GMI1000 carrying an insertion of Tn5-B20 were cultured in MMG in the presence and in the absence of exudates of tomato root or of filtrates of tobacco cell culture . After 20 hours of bringing the bacteria into contact with the extracts, the ratio between the? -Galactosidase activity produced in the MMG containing the tomato or tobacco extracts and the activity produced in the MMG without extract was determined for each insertion. . This experiment was repeated at least three times for each insertion.
  • This transcription group is the group which has the lowest 3-galactosidase activity (15 units) in MMG. This low level was measured for all the insertions present in this region and appears significantly different from the level detected for the insertions whose lacZ gene is not transcribed ( ⁇ 5 units). It is therefore considered to be a transcription group.
  • FIG. 2 (units of 0-galactosidase as a function of time in hours after subculturing in the presence or absence of tomato exudates) represents the kinetics of induction of the 0-galactosidase activity for the mutant Hrp ", which carries l insertion 1388, cultivated in MMG in the presence (curve 0 - 0) or in the absence of 1 tomato root exudate
  • the curves presented show that the increase in S-galactosidase activity induced by this extract is detectable after 9 hours and reached a plateau after 12 hours 4.
  • the mutant carrying the insertion 1388 was cultured on the one hand in complete medium B supplemented by each of the constituents entering into the composition of MMG and on the other hand in MMG supplemented by each of the constituents of MMG. In both cases, the concentration of the added constituents is equal to that found in the original medium. The 5-galactosidase activity produced by the mutant in each of these cultures was then assayed. The level of activity in medium B is not modified by the addition constituents of MMG.

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Abstract

L'invention concerne des souches de Pseudomonas solanacearum ou de Pseudomonas syringae ou de Xanthomonas campestris ou de Ewinia amylovora caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une séquence codante d'un gène reporteur sous le contrôle du promoteur d'un gène hrp, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas, soit naturellement, soit après traitement préalable, l'activité exprimée par la séquence codante du gène reporteur.

Description

SOUCHES MODIFIEES DE BACTERIES PHYTOPHATHOGENES ET APPLICATION EN AGRICULTURE
L'invention a pour objet des souches modifiées de bactéries phytopathogènes et leurs applications pour le criblage de molécules utilisables pour la protection des cultures.
La lutte chimique qui vise à freiner le développement d'un microorganisme phytopathogene ou même à le tuer en agissant sur certains de ses composants vitaux a prouvé son efficacité dans la protection des plantes vis-à-vis de nombreuses maladies et, notamment, de celles provoquées par des champignons. Toutefois, des pesticides à large spectre modifient les équilibres entre populations au niveau de l'écosystème. C'est pourquoi des molécules présentant une spécificité étroite et un impact minimum au niveau des populations en place ont été recherchées. Les inventeurs ont mis au point une nouvelle stratégie basée sur la recherche de molécules interférant avec l'expression des effets délétères de l'agent pathogène à combattra sans rechercher son élimination.
Les données récentes de la génétique et de la biologie moléculaire ont permis de mettre en évidence que les gènes hrp sont communs à de grands groupes de bactéries phytopathogènes responsables de bactérioses très diverses sur des plantes hôtes très variées.
Ces gènes de pathogénécité contrôlent en outre l'aptitude à induire la réaction hypersensible sur les plantes non hôtes.
En modifiant les gènes hrp chez Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syringae (1) , Xanthomonas campestris et Erwinia amylovora (2), on a constaté qu'il est possible d'utiliser de telles souches pour le criblage de molécules actives susceptibles d'interférer avec l'expression de ces gènes. (Les . références bibliographiques sont données en fin de description) . L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles souches de P. solanacearum, P. syringae, X. ca pestris et E. amylovora.
Elle vise également à fournir un procédé permettant la construction de ces souches. L'invention a également pour but de fournir un procédé de criblage de substances en vue de la détection de matières actives susceptibles d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytopathogènes comportant la mise en oeuvre de ces souches.
Les souches de 1'invention sont des souches de Pseudomonas solanacearum, de Pseudomonas syringa , de Xanthomonas campestris ou de Er inia amylovora, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une séquence codante d'un gène reporteur sous le contrôle du promoteur d'un gène hrp, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzymatique, l'expression de cette protéine pouvant être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas d'autre gène fonctionnel conférant le caractère biologique ou enzymatique codé par le gène reporteur, le gène reporteur étant différent du gène conférant l'activité à nucléer la prise en glace.
D'autres souches de l'invention sont des souches de Pseudomonas solanacearum, de Xanthomonas campestris ou de Erwinia amylovora, caractérisées en ce qu'elles comportent la séquence codante d'un gène reporteur sous le contrôle du promoteur d'un gène hrp, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas d'autre gène fonctionnel conférant le caractère biologique ou enzymatique codé par le gène reporteur.
Ces dispositions présentent l'avantage de permettre la détection de molécules actives vis-à-vis de souches pathogènes, mais dépourvues d'activité antibiotique.
Par gène reporteur, on désigne une séquence codante dépourvue de son propre promoteur et dont l'expression est placée sous la dépendance d'un promoteur exogène, issu d'un gène hrp. Il permet de mesurer l'activité transcriptionnelle de ce promoteur.
Selon une variante, les souches de l'invention sont obtenues par fusion transcriptionnelle et comportent, en amont de la séquence codante du gène reporteur, un site de fixation des ribosomes et d'initiation de la traduction (séquence de Shine-Delgarno) .
Selon une autre variante, les souches de l'invention sont obtenues par fusion traductionnelle, les séquences codantes étant dépourvues de leur codon ATG initiateur de la traduction et/ou de leur séquence de Shine-Delgarno
(13).
Selon un aspect avantageux de l'invention, la séquence codante du gène reporteur code pour une protéine dotée d'une activité biologique ou enzymatique pouvant être révélée selon les techniques classiques.
Parmi les gènes reporteurs utilisables, on citera le gène de structure de la jS-galactosidase, de la glucuronidase, de la néomycine phosphotransférase, de la chloramphénicol acétyltransférase, un gène conférant l'activité à nucléer la prise en glace ou des gènes conférant la bioluminescence.
Des souches appropriées pour la mise en oeuvre de l'invention sont des souches haploïdes pour les séquences hrp, portant la fusion dans un gène hrp.
D'autres souches appropriées sont constituées par des souches mérodiploïdes pour tout ou partie des gènes hrp, dans lesquelles la fusion de gènes est réalisée dans une au moins des copies des gènes hrp.
L'invention vise également un système utilisable pour la détection de molécules aux fins de protection de culture, caractérisé en ce qu'il comporte d'une part une souche telle que définie ci-dessus, d'autre part une molécule susceptible d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytopathogènes.
L'invention vise en outre un procédé d'obtention des souches définies ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes:
- d'insertion dans les gènes hrp d'une séquence codante d'un gène reporteur codant pour une protéine à activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression d'un gène hrp,
- de réintroduction de la fusion ainsi réalisée dans une souche dépourvue de l'activité conférée par le gène reporteur introduit. De manière avantageuse, la réintroduction est réalisée soit par une double recombinaison homologue qui aboutit au remplacement du gène sauvage par la construction ci-dessus, soit par introduction de la copie du gène muté clone sur un vecteur capable de se maintenir de façon stable dans les souche de P. solanacearum, P. syringae, X. campestris ou E. amylovora. L'activité biologique ou enzymatique exprimée par les souches ainsi modifiées est mise à profit selon l'invention pour effectuer de façon simple le criblage de molécules susceptibles d'agir sur la transcription des gènes hrp.
L'invention vise donc un procédé de criblage de substances en vue de la détection de matières actives susceptibles d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytophathogènes, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on utilise une souche telle que définie ci-dessus, qu'on met en évidence l'aptitude de la matière active testée à réduire l'activité transcriptionnelle des gènes hrp. les matières actives sélectionnées étant utilisées pour la lutte contre les bactéries phytogènes.
On observera que selon ce procédé, on retient les molécules réprimant, au moins partiellement, l'expression d'un gène hrp, ce qui correspond à une stratégie présentant l'avantage de respecter les équilibres de populations.
Un tel procédé est particulièrement adapté à la lutte contre les bactéries phytopathogènes étant donné l'interdiction d'emploi d'antibiotiques en agriculture. La mise en évidence de l'activité des matières testées fait intervenir notamment des détections d'activité enzymatique, des comportements différentiels en présence d'antibiotiques, une aesure d'émission lumineuse ou une activité glaciogène. En utilisant par exemple une souche obtenue par fusion transcriptionnelle entre les promoteurs ...a gènes hrp et la séquence codante du gène de structure de la β- galactosidase, en culture pure, dans des conditions appropriées, de la ?-galactosidase est produite. En présence de X-gal dans le milieu de culture, la souche donne une coloration bleue due à l'hydrolyse de X-gal par la ,9-galactosidase. Toute substance ajoutée au milieu de culture et capable de réprimer spécifiquement un gène hrp de pathogénicité se manifeste par la disparition ou la diminution d'intensité de la coloration due à l'expression de la 3-galaσtosidase sans que la croissance bactérienne soit affectée.
La fusion entre la séquence codante du gène de la jS-galactosidase et le promoteur d'un gène hrp peut être réalisée par les techniques classiques de recombinaison de l'ADN in vitro ou in vivo. Des constructions utilisables à cette fin sont présentées dans la revue de Silhavy et Beckwith (14) et dans la publication (5) . A titre d'exemple de substances ainsi détectées utilisables comme matières actives, on citera les hydrolysats de caséine ou la peptone. Hais il est clair qu'un large spectre de substances peut être détecté en mettant en oeuvre les dispositions de l'invention, en choisissant un gène reporteur approprié.
Les substances détectées selon 1'invention permettent de lutter efficacement non seulement dans la lutte contre le flétrissement bactérien dû à P. solanacearum, mais aussi contre d'autres maladies causées par l'ensemble des pathovars de P. syringae, et X. campestris ou par E. amylovora.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la suite de la description, en se référant aux exemples et aux figures 1 et 2, - la figure 1 représentant dans la région pVir2 et pAFE8, les groupes d'activité transcriptionnels tels qu'ils ont pu être définis au moyen des constructions de l'invention, et - la figure 2, la cynétique d'induction de l'activité β- galactosidase mesurée sur un mutant de l'invention en présence d'extraits végétaux. EXEMPLE 1 : SOUCHE DE P. SOLANACEARUM MODIFIEE PAR INSERTION DU TRANSPOSON Tn5-B20 * MATERIEL ET METHODES 1/ Souches bactériennes et plasmides utilisés
Le tableau ci-après indique les caractéristiques essentielles des souches et des plasmides utilisés.
TABLEAU
SOUCHES BACTERIENNES ET PLASMIDES
DESIGNATION GENOTYPE ET/OU ORIGINE/
DE LA SOUCHE CARACTERES ESSENTIELS; REFERENCE CONSTRUCTION
E.coli
C600 Smr lambda",F*,thi,thr,leu (11) rpsL,supE44,hsdR,hsdM*
S17-1 pro, hsdR, recA, RP4-2 (15)
K12(pRK2013) lambda',P*; kmr du (12) pRK2013
P. solanacearum
GMI1000 Souche sauvage, (3) pathogène sur tomate; pathotype I, Biovar 4
PLASMIDES CARACTERISATION
PRK2013 TraRK2+, delta(rep RK2) , (2) repEl* ; Kmr
pVir2 Dérivé de pLAFR3 portant (4) une partie des gènes hrp de P. solanacearum
pAFE8 Plas ide portant un insert de 25kb chevauchant les 3,5kb environ à l'extrémité gauche de l'insert de pVir2 2/ Cultures et conservation des souches bactériennes
Les souches de P. solanacearum sont cultivées à 30*C: Les milieux utilisés et leurs compositions données en gramme par litre sont le milieu B (peptone 10 extrait de levure 1, hydrolysat de caséine 1) , BG (identique à B et complémenté avec glucose : 5) , BGT (identique à BG et complémenté avec du chlorure de triphényl tétrazolium : 0,05), MMG (Fe S04, 7H20 : 1,25.10"4; (NH4)2 S04 : 0,5; Mg S04, 7H20 : 0,05; KOH (ION) : 1,75 l.l"1; KH2P04 : 3,4; glucose 2) .
Les souches d'E. coli sont cultivées à 37*C en milieu L contenant en grammes par litres (extrait de levure : 5; Bactotryptone : 10 ; NaCl : 10).
Les milieux sont co plémentés le cas échéant avec les antibiotiques suivants : streptomycine (S ) à 200μg.ml"1; acide nalidixique (Nal) à 25μg.ml*1; tétracycline (Te) à lOμg.ml"1 et kanamycine (Km) à 25μg.ml"1. Ils sont éventuellement rendus solides par addition de gélose à 15 g.l'1. 3/ Conjugaisons bactériennes
Les souches donatrices et réceptrices ainsi que la souche "helper" K12 (pRK2013) sont cultivées environ 14 heures dans du milieu nutritif liquide non sélectif. Les précultures des souches donatrices et helper sont ensuite diluées dans du milieu nutritif liquide frais. Lorsque la DO (650nm) de ces nouvelles cultures atteint 0,2 (108 bactéries/ml), 0,5 ml de celles-ci et 0,5 ml de la culture de la souche réceptrice sont mélangés et filtrés sur filtre Millipore de 0,4f μm de diamètre de pores.
Lr-s filtres sont ensu.ee placés sur des boîtes de milieu nutritif solide, les bactéries étant au-dessus des membranes. La nature du milieu nutritif et les conditions d'incubation dépendent des bactéries impliquées dans le croisement :
- pour les croisements entre souches d'E. coli, les filtres sont déposés sur du milieu L et incubés à 37*C pendant 4 heures, lorsqu'un des partenaires du croisement est P. solanacearum, les filtres sont déposés sur du milieu BG et incubés de 4 à 18 heures à 30*C. Deux témoins sont réalisés en incubant séparément les partenaires du croisement dans les mêmes conditions.
Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans 3 ml de milieu nutritif et les dilutions adéquates de la suspension sont étalées sur milieu sélectif. 4/ Mutaqénèse par le transposon Tn5-B20
Le transposon Tn5-B20 (5) a été utilisé pour mutagéniser les cosmides recombinants pVir2 et pAFE8.
Ce transposon est inséré sur un phage lambda qui porte une mutation ambre. Un lysat de ce phage a été produit par infection de la souche C600 (su*=supE) , selon le protocole de préparation de lysat sur boîte de Pétri décrit dans (6) . La mutagénèse est réalisée en infectant la souche de E. coli S17-1 renfermant le plasmide pVir2 ou pAFEδ par ce lysat de phage. A cet effet, les souches sont cultivées à 37*C en milieu L contenant 0,2% de maltose. Lorsque la DO(650 nm) de la culture atteint 0,8 (109 bactéries/ml), celle-ci est infectée à 37*C pendant 2 heures par le lysat de phage à une multiplicité d'infection de 0,5 phages par bactérie. Les cellules subissent ensuite 2 lavages successifs pour les débarrasser des phages et sont étalées sur du milieu L SmTcKm, ce qui permet de sélectionner les souches portant une copie du transposon. Les mutants Kmr sont croisés en masse avec la souche réceptrice C2110 Nalr en présence de la souche K-12(pRK2013) , le produit du croisement est ensuite étalé sur milieu L NalTcKm et incubé à 37*C ce qui permet de sélectionner le transfert des cosmides portant le transposon.
5/ Dosage d'activité β-galactosidase
Les dosages d'activité ,9-galactosidase ont été effectués selon le protocole décrit par Miller (7) , modifié de façon à réaliser le test enzymatique en tube Eppendorf de 1,5 ml.
L'activité 0-galactosidase est dosée sur des cultures bactériennes pour lesquelles la DO à 600nm doit être comprise entre 0,2 et 0,8. Après avoir mesuré la DO de la culture à 600nm, 375 μl de celle-ci sont mélangés avec un volume égal de tampon Z (Na^PO^ 0,06M; NaH2P04 0,04M; KC1 0,01M; MgS04 0,005M ,9-mercaptoéthanol 0,05M; pH : 7,0) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Les cellules sont lysées en ajoutant lOOμl de chloroforme et 50 μl de SDS 0,1%. Après 5 mn d'incubation à 28*C, 150μl d'ONPG (4mg.ml*1) sont ajoutés pour démarrer la réaction. Lorsque le jaunissement du milieu réactionnel s'intensifie, la réaction est arrêtée par l'addition de 375 μl de Na2Cθ3 (1M) . La DO du milieu réactionnel débarrassé des débris cellulaires par centrifugation (12000g, 3 mn) est mesurée à 420 nm et 550 nm. La DO à 420 nm permet de mesurer la quantité de o-nitrophénol formé. La DO à 550 nm permet de corriger l'erreur sur la lecture à 420 nm générée par la présence de débris cellulaires. Les unités d'activité S-galactosidase sont calculées en appliquant la formule présentée ci-dessous:
Unités = 1000 (DO420 - 1,75 . DC^/t . v . DO^
La DO^Q reflète la concentration bactérienne avant le test. t : temps de la réaction exprimé en minutes, v : volume de la culture utilisé pour le test, exprimé en ml. 6/ Tests du pouvoir pathogène sur tomate
La surface des graines de tomate (cultivar Marmande, fournis par la Société Vilmorin, Beaufort en Vallée, France) est stérilisée à 30*C pendant 45 minutes dans une solution d'hypochlorite de calcium 7% (p/v) . Les graines sont ensuite abondamment rincées avec de l'eau stérile déionisée avant d'être déposées sur des boîtes de milieu B. Les boîtes sont incubées 60 heures à 30*C, ce qui permet d'obtenir la germination des graines et de contrôler la stérilité. Les graines ger ées sont transférées par paire dans des tubes à essai (22 mm de diamètre) stériles qui contiennent 1,5 g de ver iculite et 6 ml de solution nutritive (KNOj, 5œM; KH2P04, 2mM, Ca( θ3)2, 2mM; MgS04, l,5mM; H3B04, 24μM; MnS04, 8,9μM; ZnS04, 3,lμM; CuS04, lμM; K2Mo04, 0,lμM et FeS04, 0,lmM complexé par de l'EDTA, 0,lmM). Les tubes sont placés dans une chambre de culture (16 h 3600 lux, 30*C et 85% d'humidité relative; 8 h d'obscurité, 28*C et 85% d'humidité relative) . Quatre jours après, les plantules aux cotylédons entièrement déployés sont inoculées strérilement en ajoutant dans chaque tube 1 ml d'eau contenant 107 à 108 de bactéries à tester. Chaque souche bactérienne est ainsi testée sur 4 tubes. Par ailleurs lors de chaque essai, 4 tubes sont inoculés par la souche GMI1000 et quatre autres par de l'eau stérile à titre de contrôle.
Les mutants dérivant de la souche GMI1000 qui ont tué toutes les plantules 15 jours après l'inoculation sont considérés comme pathogènes. Les mutants qui n'induisent aucun symptôme 21 jours après l'inoculation sont considérés comme non pathogènes. Enfin, les mutants qui ne tuent qu'une partie des plantules de tomate inoculées, ou qui entraînent un retard dans l'apparition des symptômes de la maladie, ou bien encore un ralentissement notable dans la croissance des plantules, sont considérés comme hypoagressifs. 7/ Tests de la HR (réaction hypersensible) sur tabac
Les plants de tabac (cultivar Bottom Spécial) sont cultivés en serre (18+2'C, 16h de lumière, 8h d'obscurité) dans des pots de 15 cm contenant un mélange (l:l,v/v) de tourbe et de terreau horticole.
Les plants de tabac âgés de 9 semaines sont inoculés par les mutants dérivant de la souche GMI1000 selon le protocole décrit dans (8) . Les cellules de cultures en phase exponentielle de croissance (108 bactéries/ml) des souches à tester sont récoltées par centrifugation (3000g, 10 mn) et remises en suspension dans de l'eau stérile de manière à avoir 107 bactéries par ml. Les suspensions sont infiltrées dans les tissus compris entre 2 nervures de jeunes feuilles entièrement déployées. Une feuille peut ainsi recevoir 3 ou 4 infiltrations indépendantes. Les plants de tabac inoculés sont placés en chambre de culture (16h 3600 lux, 30#C et 85% d'humidité relative; 8h d'obscurité, 28*C et 85% d'humidité relative). Les résultats sont notés 48 et 60 heures après l'infiltration. 8/ Production d'exsud s de racines de tomate
La méthode mise au point permet d'obtenir 300 ml de solution d'exsudats racinaires à partir de 600 graines de tomate (cultivar Marmande) .
Après stérilisation et rinçage (cf paragraphe 6), les graines de tomate sont déposées dans une boîte de Pétri (de 13,5 cm de diamètre) et recouvertes ensuite par une solution aqueuse à 0,7% de gélose molle en surfusion. La boîte de Pétri est légèrement agitée pour assurer une répartition uniforme des graines dans la gélose. Après solidification, la gélose est découpée et les morceaux sont transférés stérilement dans un bêcher sur une grille qui repose à la surface de 300ml d'eau stérile désionisée. Le bêcher est ensuite placé en chambre de culture (16h 3600 lux, 30'C et 85% d'humidité relative; 8h d'obscurité, 28*C et 85% d'humidité relative) .
Ces conditions permettent d'obtenir, dès le deuxième jour d'incubation, des plantules dont les racines se développent dans l'eau stérile. Après 5 jours d'incubation, lorsque les cotylédons des plantules sont entièrement déployés, les 300 ml d'eau sont recueillis et filtrés sur membrane Millipore de 0,45 μm de diamètre de pores. Deux cent microlitres de cette préparation d'exsudats de racines sont étalés sur une boîte de milieu B incubée ensuite plusieurs jours à 30*C pour tester la stérilité. Le reste de la solution est conservée à -20*C. 9/ Extraits de tabac Les extraits de tabac ont été préparés au laboratoire à partir de suspensions de cellules de parenchyme médullaire de Nicotiana tabacum cultivar Wisconsin 38 (lignée 19-3) .
Les cellules de tabac sont cultivées selon la méthode décrite dans (9) et sont repiquées tous les 14 jours dans du milieu JPL frais. Pour préparer l'extrait de tabac, les suspensions cellulaires obtenues 14 jours après le repiquage (phase stationnaire de croissance) ont successivement été filtrées sur filtre de verre frite n*l et sur filtre Millipore de 0,45 μm de diamètre de pores. La stérilité du filtrat a été testée en étalant une partie de celui-ci sur milieu B et en incubant les boîtes de Pétri 4 jours à 30*C. L'extrait de tabac ainsi produit est stocké à -20*C. 10/ Induction de l'expression des gènes hrp Les dérivés de la souche GMI1000 portant une insertion du transposon Tn5-B20 dans la région hrp ont été cultivés en milieu minimum MMG. Lorsque les cultures entraient en phase exponentielle de croissance, celles-ci étaient diluées au lOOème ou au 50ème dans 5 ml de milieu MMG frais et dans 4 ml de milieu MMG contenant 1 ml d'extrait de tabac ou d'exsudât de racine de tomates. Ces nouvelles cultures réalisées dans des tubes à essai de 22 mm étaient alors incubées avec agitation à 30*C pendant 20 heures avant de doser l'activité 3-galactosidase. 11/ Techniques de biologie moléculaire
Les techniques utilisées (extraction de plasmides, analyse des fragments de restriction, fabrication de sondes radioactives, hybridation sur membrane de nylon ou autres) sont celles couramment employées et déjà décrites dans (10) . * RESULTATS 1. CARACTERISATION DU GROUPE DE GENES hrp Chaque clone portant une insertion du Tn5-B20 au niveau de l'insert des cosmides pVir2 ou pAFE8 a été conjugué avec la souche GMI1000 dépourvue d'activité β- galactosidase pour introduire chacune des insertions dans le génome de cette souche par la technique d'échange de marqueur. Après conjugaison, les transconjugants de P. solanacearum résistants à la kanamycine ont été sélectionnés. Tous les clones ainsi isolés se sont révélés sensibles à la tétracycline indiquant que le cosmide avait été perdu chez ces transconjugants et que le transposon s'était certainement intégré dans le génome de ces souches par un double événement de recombinaison homologue.
Ceci a été vérifié par hybridation de l'ADN génomique de ces transconjuguants avec les sondes constituées par les plasmides pVir2 et pAFE8. Les souches recombinantes dérivées de GMI1000 ont individuellement été inoculées sur des tomates axéniques et infiltrées dans les feuilles de tabac. La localisation du site d'insertion du Tn5-B20 dans chaque clone obtenu a été réalisée par analyse de la taille des fragments de restriction. Ces sites sont donnés sur la figure 1.
Cette figure représente la localisation des insertions Tn5-B20 dans les régions génomiques portées par les cos ides pVir2 et pAFE8 et le niveau d'activité
0-galactosidase et les propriétés sur plantes des mutants correspondants.
Les insertions dont les séquences du gène lacZ sont orientées de la gauche vers la droite sont figurées au- dessus de la carte génétique de la souche GMI1000. Les insertions dont les séquences du gène lacZ sont orientées de la droite vers la gauche sont figurées en-dessous.
Les propriétés sur plantes sont indiquées par les symboles suivants :
1 I , B réaction identique à la souche GMI1000; / φ perte totale ou partielle de l'aptitude à induire la HR sur tabac et du pouvoir pathogène sur tomate. Le cadre hachuré par le trait fin délimite le groupe de gènes hrp.
Les insertions conférant une activité β- galactosidase supérieure à 5 unités sont indiquées par des symboles pleins : H , ) . Les insertions induisant une activité β- galactosidase inférieure à 5 unités sont indiquées par les symboles vides :1~~1.Q) .
Les flèches horizontales situées sous la carte génétique représentent les groupes de transcription hrp. Le sens de la flèche indique le sens de transcription de chacun de ces groupes. Le numéro de chaque groupe de transcription est figuré au-dessus de la flèche. Le niveau d'activité 3-galactosidase mesuré pour les insertions ayant permis de définir ces groupes est reporté sous chaque flèche (200 : > 200 unités ; 150 : de 120 à 170 unités ; 100 : de 70 à 120 unités ; 50 : de 30 à 70 unités ; 20 : 18 à 25 unités ; 15 : 12 à 16 unités) . 2. EXPRESSION DES GENES hrp Le transposon Tn5-B20 crée des fusions transcriptionnelles entre le gène lacZ dépourvu de son propre promoteur et les gènes dans lesquels il s'insère. Cette propriété a été utilisée pour caractériser les séquences hrp transcrites, leur sens de transcription, et les conditions dans lesquelles elles s'expriment. L'expression au niveau d'un site d'insertion est testée en dosant l'activité 3-galactosidase, l'apparition d'une activité î-galactosidase significative dans un dérivé de la souche GMI1000 portant une insertion du Tn5-320 dans le génome indique que les séquences du gène lacZ sont situées en aval d'un promoteur dans une région trancrite et dans la même orientation transcriptionnelle.
L'activité /9-galactosidase produite par chacun des dérivés de la souche GMI1000 portant une insertion du Tn5-B20 cultivés en milieu minimum a été mesurée. On a constaté que le niveau d'activité 0-galactosidase produit par ces dérivés était variable et qu'il était possible de les classer en 6 groupes suivant le niveau d'activité β- galactosidase obtenu : - pour le premier groupe de dérivés, le niveau d'activité /3-galactosidase sure est supérieur ou égal à 200 unités;
- pour le second, ce niveau est de l'ordre de 150 unités (de 120 à 170 unités) ; - pour le troisième, ce niveau est de l'ordre de 100 unités (de 70 à 120 unités) ;
- pour le quatrième, ce niveau est voisin de 50 unités (30 à 70 unités) ;
- pour le cinquième, ce niveau est compris entre 15 et 20 unités;
- enfin, pour le sixème groupe, qui correspond à peu près à la moitié des souches testées, ce niveau est inférieur à 5 unités.
Ce dernier groupe correspond, probablement, à des insertions dont le gène lacZ n'est pas transcrit soit parce qu'elles sont:
- situées en dehors d'une région transcrite, - localisées dans une région transcrite mais orientées (par rapport au gène lacZ) dans le sens inverse du sens de trancription;
- insérées dans l'orientation correcte au niveau d'une région transcrite mais qui ne s'exprime pas dans les conditions expérimentales utilisées.
Par contre, les mutants appartenant aux autres groupes de niveau d'activités portent certainement des insertions localisées au niveau de régions transcrites en MMG. En reliant pour chaque mutant le niveau d'activité 5-galactosidase conféré par l'insertion avec sa position et son orientation sur la carte physique de la région étudiée, on a observé une corrélation entre ces 3 paramètres. Ces résultats confirment que le Tn5-B20 est utilisable pour détecter la transcription des gènes chez P. solanacearum. L'existence de plusieurs régions transcrites au niveau des groupes de gènes hrp a été établie. L'orientation des transposons au sein de ces différentes régions a permis de déterminer leur sens de transcription. En se basant sur les niveaux d'activité induits par les insertions présentes dans ces différentes régions, sur leur sens de trancription et sur le phénotype sur plante qu'elles confèrent aux souches, 9 groupes de trancription différents ont été distingués (figurel) .
Les groupes hrpl et II qui sont contigus et transcrits dans la même orientation (de la droite vers la gauche ≈ dg) ont été séparés en deux groupes différents car les insertions du groupe hrpl induisent une activité /3-galactosidase de 50 unités alors que les insertions du groupe hrpll induisent une activité de 200 unités. Cette séparation est confirmée par le fait que les insertions 1484, 1457 et 1443 situées au niveau de l'extrémité 3' du transcrit (potentiel) du groupe hrpll et de l'extrémité 5' du trancrit (potentiel) du groupe hrpl induisent un phénotype sauvage alors que les insertions adjacentes des groupes hrpl et II induisent un phénotype Hrp*. Ces trois insertions suggèrent par conséquent que les groupes hrpl et II sont séparés par une région non codante et n'appartiennent pas aux mêmes unités de trancription. Les insertions 1484 et 1457 n'affectent pas le pouvoir pathogène bien qu'étant situées à l'extrémité 3' du groupe de transcription hrpll. Elles confèrent toutefois à la souche l'aptitude à produire la β- galactosidase à un niveau équivalent à celui des autres fusions réalisées dans la région hrpll. Ceci peut être expliqué par le fait que le Tn5-B20 produit des fusions transcriptionnelles et que ces insertions sont localisées en amont des séquences de terminaison de la transcription de cette région II et en aval des séquences codantes.
De même, pour les groupes de transcriptions hrpVII et VIII, contigus et ayant un sens de transcription identique mais des niveaux d'expression différents. l'insertion 1421 induisant un phénotype sauvage confirme 1'existence de 2 groupes de transcription distincts. Le fait que cette insertion située au niveau de l'extrémité 3' du trancrit (potentiel) du groupe hrpVII et dont l'orientation (par rapport au gène lacZ) est analogue au sens de transcription de ce groupe de transcription produise une activité jS-galactosidase semblable à celle produite par les insertions localisées dans ce groupe peut être justifié par les mêmes raisons que celles invoquées précédemment pour les insertions 1484 et 1457 du groupe de transcription hrpll.
Les insertions 1503 et 1415 qui n'altèrent pas le pouvoir pathogène, montrent l'existence d'une région non transcrite entre les groupes de transcription hrpVI et VII dont les sens de transcription sont opposés. Dans ce cas encore, les résultats obtenus par l'analyse des activités ,3-galactosidase et des phénotypes sur plantes s'accordent. 3. ETUDES DE LA REGULATION DES GENES hrp ; INDUCTION PAR DES EXTRAITS DE PLANTE
Pour étudier la régulation de la trancription des gènes hrp, les dérivés de la souche GMI1000 portant une insertion du Tn5-B20 ont été cultivés en MMG en présence et en absence d'exsudats de racine de tomate ou de filtrats de culture de cellules de tabac. Après 20 heures de mise en présence des bactéries avec les extraits, on a déterminé pour chaque insertion le rapport entre l'activité ?-galactosidase produite dans le MMG contenant les extraits de tomate ou de tabac et l'activité produite dans le MMG sans extrait. Cette expérience a été répétée au moins trois fois pour chaque insertion.
Pour toutes les insertions localisées dans les groupes de transcription hrpl, II, IV, V, VI, VII, VIII et IX telles que l'orientation du gène lacZ corresponde 2". au sens de transcription de chacun de ces groupes, on a observé que ce rapport est compris entre 2 et 5, suivant les expériences et ce quelque soit l'extrait végétal utilisé (tomate ou tabac) .
Par contre, pour les insertions situées au niveau de ces groupes mais dans l'orientation inverse, aucune augmentation de l'activité ,3-galactosidase en présence d'extraits de plantes n'a été observée. Pour les insertions localisées au niveau du groupe de transcription hrpIII, le rapport est toujours voisin de 1 quelque soit l'orientation des insertions.
Il a été considéré que les insertions pour lesquelles le rapport est supérieur à 2 traduisent une activation de la transcription par les extraits de plante. Ces résultats montrent que l'expression des gènes situés dans les groupes de transcription hrpl, II, IV, V, VI, VII, VIII et IX est induite par les extraits de tomate et de tabac. Le niveau d'induction décelé au cours de ces expériences s'est révélé semblable pour tous ces groupes de transcription et aucune différence du niveau d'induction en fonction du type d'extrait végétal utilisé n'a été observée.
Au contraire, le niveau de trancription du groupe hrpIII n'est pas affecté par ces extraits. Ce groupe de transcription est le groupe qui présente la plus faible activité 3-galactosidase (15 unités) en MMG. Ce faible niveau a été mesuré pour toutes les insertions présentes dans cette région et apparaît significativement différent du niveau détecté pour les insertions dont le gène lacZ n'est pas transcrit (<5 unités). Il est donc considéré comme un groupe de transcription.
L'ensemble des résultats obtenus au cours de ces travaux indiquent que l'expression de certains gènes hrp est régulée positivement par un ou des produits de plante.
La figure 2 (unités de 0-galactosidase en fonction du temps en heures après repiquage en présence ou en absence d'exsudats de tomate) représente la cinétique d'induction de l'activité 0-galactosidase pour le mutant Hrp", qui porte l'insertion 1388, cultivé en MMG en présence (courbe 0 - 0) ou en absence d1exsudât de racine de tomate. Les courbes présentées montrent que l'augmentation de l'activité S-galactosidase induite par cet extrait est détectable dès 9 heures et qu'elle atteint un plateau après 12 heures. 4. REGULATION NEGATIVE DES GENES hrp En cultivant le mutant Hrp' portant l'insertion 1388 en milieu B liquide, on a observé que l'activité β- galactosidase produite par les cellules bactériennes était inférieure à 10 unités alors qu'en MMG, l'insertion induit une activité voisine de 150 unités. Ce résultat suggère que l'expression du groupe de trancription hrpVII est soit réprimée en milieu B, soit spécifiquement induite en MMG. Des résultats similaires ont été obtenus avec des insertions localisées dans l'ensemble des groupes de transcription. Pour déterminer si la transcription de ces gènes hrp est induite en MMG ou réprimée en milieu B, le mutant portant l'insertion 1388 a été cultivé d'une part dans du milieu complet B complémenté par chacun des constituants entrant dans la composition du MMG et d'autre part en MMG complémenté par chacun des constituants du MMG. Dans les deux cas, la concentration des constituants ajoutés est égale à celle que l'on trouve dans le milieu d'origine. L'activité 5-galactosidase produite par le mutant dans chacune de ces cultures a ensuite été dosée. Le niveau d'activité en milieu B n'est pas modifié par l'addition des constituants du MMG. Par contre, l'addition d'un hydrolysat de caséine ou de peptone dans le MMG entraîne une baisse de l'activité ,3-galactosidase produite par le mutant. Le niveau détecté alors est comparable à celui obtenu en milieu B. Ces résultats montrent que l'expression des gènes hrp (appartenant au groupe hrpVII) est réprimée en milieu B et que les hydrolysats de caséine ou la peptone sont responsables de cette répression.
Une autre série d'expériences a montré que l'addition des extraits de tomate ou de tabac dans le milieu B ne permet pas de lever la répression de l'expression déterminée par les hydrolysats de caséine ou la peptone.
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Claims

i REVENDICATIONS
1. Souches de Pseudomonas solanacearum, de Pseudomonas syringae, de Xanthomonas campestris ou de Erwinia amylovora, caractérisées en ce qu'elles comportent la séquence codante d'un gène reporteur sous le contrôle du promoteur d'un gène hrp, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzymatique, l'expression de cette protéine pouvant être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas d'autre gène fonctionnel conférant le caractère biologique ou enzymatique codé par le gène reporteur, le gène reporteur étant différent du gène conférant l'activité à nucléer la prise en glace.
2. Souches de Pseudomonas solanacearum ou de Erwinia amylovora, caractérisées en ce qu'elles comportent la séquence codante d'un gène reporteur sous le contrôle du promoteur d'un gène hrp, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas d'autre gène fonctionnel conférant le caractère biologique ou enzymatique codé par le gène reporteur.
3. Souches selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fusion transcriptionnelle et comportent en amont de la séquence codante du gène reporteur un site de fixation des ribosomes et d'initiation de la traduction (séquence de Shine-Delgarno) .
4. Souches selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fusion traductionnelle et que la séquence codante est dépourvue de son codon ATG initiateur de la traduction et/ou de sa séquence de Shine-Delgarno.
5. Souches selon l'une des revendications 1, 3 ou 4, caractérisées en ce que la séquence codante du gène reporteur est choisie parmi le gène de structure de la 9-galactosidase, de la glucuronidase, de la néo ycine phosphotransférase, de la chloramphénicol acétyltrans- férase, ou des gènes conférant la bioluminescence.
6. Souches selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisées en ce que la séquence codante du gène reporteur est choisie parmi le gène de structure de la ,3-galactosidase, de la glucuronidase, de la néomycine phosphotransférase, de la chloramphénicol acétyltrans- férase, un gène conférant l'activité à nucléer la prise en glace, ou des gènes conférant la bioluminescence.
7. Souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches haploïdes pour les séquences hrp, portant la fusion dans un gène hrp.
8. Souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches mérodiploïdes pour tout ou partie des gènes hrp, dans lesquelles la fusion de gènes est réalisée dans une au moins des copies des gènes hrp.
9. Système utilisable pour la détection de molécules aux fins de protection de culture, caractérisé en ce qu'il comporte d'une part une souche selon la revendication 1 ou 2, d'autre part une molécule susceptible d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytopathogènes.
10. Procédé d'obtention d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par les étapes : - d'insertion dans les gènes hrp d'une séquence d'un gène reporteur codant pour une protéine à activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression d'un gène hrp,
- de réintroduction de la fusion ainsi réalisée dans une souche sauvage dépourvue de l'activité conférée par le gène reporteur introduit.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la réintroduction est réalisée soit par une double recombinaison homologue qui aboutit au remplacement du gène sauvage par la construction ci- dessus, soit par introduction de la copie du gène muté clone sur un vecteur capable de se maintenir de façon stable dans lesdites souches.
12. Procédé de criblage de substances en vue de la détection de matières actives susceptibles d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytophathogènes, caractérisé en ce qu'on utilise une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, et qu'on met en évidence l'aptitude de la matière active à réduire l'activité transcriptionnelle des gènes hrp.
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