EP0518088A2 - Verfahren zur Clostripain-katalysierten Verknüpfung von Arg-Pro und Arg-B (B=proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren) enthaltenden Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Clostripain-katalysierten Verknüpfung von Arg-Pro und Arg-B (B=proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren) enthaltenden Peptiden Download PDF

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EP0518088A2
EP0518088A2 EP19920108509 EP92108509A EP0518088A2 EP 0518088 A2 EP0518088 A2 EP 0518088A2 EP 19920108509 EP19920108509 EP 19920108509 EP 92108509 A EP92108509 A EP 92108509A EP 0518088 A2 EP0518088 A2 EP 0518088A2
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EP
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clostripain
arg
pro
peptide
amino
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EP19920108509
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Wolfgang Dr. Müller
Johannes Dr. Meiwes
Manfred Dr. Schudok
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Hoechst AG
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Hoechst AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea

Definitions

  • the peptide synthesis is preferably carried out under kinetic control.
  • the inexpensive trypsin is preferably suitable for the aminolysis of N-protected arginine esters.
  • this does not apply to the case of the linkage with proline derivatives as N components.
  • Clostripain (EC 3.4.22.8) was isolated by Kochalaty (Kochalaty et al. Arch. Biochem. 18,1, 1948) from Clostridium histolyticum and by Labouesse and Gros (Bull. Soc. Chim. Biol. 42, 543, 1969), Kula (Biochem. Biophys. Res. Comm. 69, 389, 1976) and Mitchell (J. Biol. Chem. 242 , 4683, 1968).
  • Andersen Peptides, Proc. 9th APS, p. 355, 1986, Ed. Described the method of the enzymatic peptide linkage of N-protected arginine esters with proline derivatives or amino-terminal proline-containing di- and tripeptides. Deber, Hruby) and Fortier (Arch. Of Bioch. Biophys. 276 , 317, 1990). Andersen and Fortier used clostripain for their investigations, which had been highly purified by many steps in series and had a low specific activity (eg Fortier et al .: 38 U / mg).
  • Analytical scale means that the synthesized peptide can be detected by thin layer chromatography methods or HPLC.
  • Preparative isolation refers to the isolation of the synthesized peptide by extraction processes for further use of the peptide on an industrial scale, i.e. in grams or kilograms.
  • LHRH Gly-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
  • LHRH analogs gonadoliberin agonists, antagonists
  • Buserelin Gly-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-NHEt
  • Shorter peptides with the partial sequence Arg-Pro also have pharmacologically interesting properties.
  • Enzymatic peptide linkage methods are particularly characterized by the absence of disruptive racemization and the possible lack of side-chain protection.
  • the enzymatic process has the advantage that the guanidino group does not have to be modified with protective groups which are expensive and difficult to introduce and remove (e.g. -Mtr).
  • Enzymatic peptide linkages can be carried out in aqueous, aqueous / organic or purely organic solvent systems. If you use e.g. aqueous methanol as a solvent, isolation of the products with simple work-up processes is not possible, since the still sufficiently water-soluble Arg peptides generally do not precipitate or cannot be extracted sufficiently with an organic extracting agent such as ethyl acetate or methyl isobutyl ketone.
  • an organic extracting agent such as ethyl acetate or methyl isobutyl ketone.
  • clostripain catalyzes the linking of amino acids or peptides which have arginine as the acyl donor.
  • Clostripain can also be obtained by a different combination of the purification steps given in Scheme 1.
  • the strain DSM 627 is fermented for 12-28 hours with the optimized nutrient medium NL 1581 or the proteose peptone medium.
  • the temperature of the pre-culture is 33-39 ° C, preferably 37 ° C, that of the main culture 31-36 ° C, preferably 33 ° C.
  • the strain DSM627 is freely available from the German Society for Microorganisms and Cell Cultures, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig.
  • Culture medium NL 1581 (The information refers to 1l culture medium)
  • Proteose peptone medium (The data refer to 1l medium)
  • This enzyme quality is called CL1.
  • Ultrafiltration is used to concentrate the culture broth.
  • All membranes with a pore size of 5-50, preferably 10 KD (KD kilodalton) are suitable as the ultrafiltration membrane (e.g. Omega 10 K from the Filtron company). Larger batches (> 5l - 1m3) are concentrated using a tangential flow (crossflow) cassette system.
  • KD kilodalton
  • the enzyme has an activity of 80-100, especially 90 U / mg.
  • the clostripain obtained by ammonium sulfate precipitation can be further purified by means of hydrophobic chromatography, especially on aminobutyl or hexyl agarose.
  • the enzyme then has a quality of 150-250, in particular 150-170 (hexyl agarose) or 220-250 U / mg (aminobutyl agarose).
  • the Ca2+ ion content must be checked to stabilize the enzyme, otherwise CaCl2 or calcium acetate must be added (target value: 5-10 mM, 60 ° C, 15 min.).
  • the procedure is to add as much CaCl2 or calcium acetate to the culture broth until the final concentration of the culture broth reaches 5-10 mM.
  • the methanol precipitation enables a cost-effective and gram-scale enzyme production of quality CL3.
  • the clostripain obtained by means of alcohol precipitation can be purified again by adsorption on reactive dye, in particular Reactive Red 120 [Sigma], and subsequent elution using salts, preferably Na or KCl (0.4 M).
  • reactive dye in particular Reactive Red 120 [Sigma]
  • salts preferably Na or KCl (0.4 M).
  • This procedure allows the production of high-purity clostripain in a two-step process (1. methanol precipitation of the culture filtrate and 2. adsorption of the enzyme obtained in the first step on reactive dye). In addition, high yields are achieved.
  • the enzyme activity is 250-350, especially 280-330 U / mg.
  • Clostripain can be used for the linkage reaction in immobilized and non-immobilized form.
  • Carrier materials which are preferably adsorptive carriers, such as Silica gel or CNBr-Sepharose used.
  • the straps are commercially available.
  • the enzyme To immobilize the enzyme, it is mixed with the carrier.
  • the duration of the coupling reaction, the reaction environment and the mixing ratio of enzyme and carrier depend on the type of carrier chosen and can easily be determined by the expert for each individual case by preliminary experiments.
  • N-protected arginine alkyl esters or peptide fragments which have an arginine alkyl ester group at the carboxy terminus, but preferably Z-Arg-OMe, Z-Leu-Arg-OMe, Z-Gly-Pro-Arg-OMe, Boc-D-Arg- Arg-OMe used.
  • Amino acid derivatives or peptide fragments which have a proteinogenic amino acid as the amino terminus, with the exception of the amino acids, Asn, Gln or Thr, are proline esters and amides, preferably Pro-NH2, Pro-NHEt, Pro-Gly-NH2, Pro-Ala-NH2, Pro-AzaGly-NH2, D-amino acids or non-proteinogenic amino acids such as halogen substituted phenylalanines, furyl-, thienylalanines, phenylglycine, homophenylalanine, 2-aminonorbornane-2-carboxylic acid or phosphorus-containing amino acids .
  • amino acids or peptides to be coupled must be protected against amino (carboxy) or carboxy (amino) components by methods known to those skilled in the art.
  • a carboxamide or hydrazide can also be used.
  • the reaction conditions for the coupling reaction depend on the amino acids or peptides to be coupled and are listed in the examples.
  • the nucleophile is added in a 2-10 fold excess.
  • Prolinamide or proline-containing nucleophiles with N-terminal proline are preferably used in 2-6 times excess compared to the acyl donor.
  • the methanol concentration is in the range of 40-90% when using a 2-6 fold excess.
  • the concentration of the reactants is increased by a factor of 3 in a 2-6-fold excess compared to a 10-fold excess. Since the solubility limit of the arginine derivatives is exceeded in spite of the high methanol content, the amino acids have to be pre-dissolved in the heat and the enzyme only added after the solution has cooled.
  • methanol which is preferably used for peptide coupling under the condition of a small excess of nucleophiles
  • the following can also be used: THF (tetrahydrofuran), dioxane, dimethoxyethane, ethylene glycol, diethylene glycol diethyl ether or ethanol.
  • THF tetrahydrofuran
  • dioxane dimethoxyethane
  • ethylene glycol diethylene glycol diethyl ether
  • ethanol ethanol
  • the peptide coupling can also be carried out in a mixed-phase system, which is simultaneously the reaction and extraction medium.
  • This mixed phase system preferably consists of butanol and aqueous NaCl solution.
  • the implementation takes place in a continuous or discontinuous process.
  • the linkage preferably takes place in a mixed-phase system which is simultaneously the reaction and extraction medium.
  • the peptide is converted into the butanol phase by extraction, which is separated off after the phase separation. Shaking the saline phase several times with butanol increases the peptide yield.
  • Clostripain can be ionically bound to DEAE-Sephadex® A 50 (Pharmacia). However, covalent immobilization is more advantageous for clostripain.
  • clostripain Before immobilization, clostripain can be activated with the reducing agent dithiothreitol (DTT). However, it is also possible to use the enzyme in a non-activated form. The highest activity per ml carrier is achieved with bromine-activated ®Sepharose 4B. However, this immobilizate has only moderate long-term stability. Robust carriers such as the VA epoxy immobilizate or glutardialdehyde / silica gel have a much lower occupancy density.
  • DTT dithiothreitol
  • Silica gel clostripain The immobilization was carried out analogously to EP 3 438 189. 50 ml of silica gel (Grace) is mixed with 100 ml of water and 3 g of aminopropylethoxysilane, stirred for 2 hours at 65 ° C., filtered hot and dried at 90 ° C. for 24 hours.
  • aminated carrier is mixed with 2 volumes of 0.25 M potassium phosphate buffer pH 8, with 2.5% glutardialdehyde and shaken gently for 2 hours.
  • the occupancy density is 45 - 70 U / ml moist carrier.
  • the silica gel immobilizate is particularly suitable for preparative purposes due to its low price.
  • VA epoxy (Riedel de Ha ⁇ n) Immobilization in 1M potassium phosphate buffer pH 7.5 / 20 ° C / 24 h.
  • Tresyl Sepharose 4B (Pharmacia): Execution analogous to Nilsson, Mosbach Biotech. Bioeng. 26, 1146-54, 1984.
  • Bromcyan Sepharose B (Pharmacia): Implementation analogous to Cobbs, Biotechnol. Techn. 5, 5-10, 1990.
  • Z-Arg-Pro-NH2 and Z-Arg-OH was determined as a function of the enzyme quality used after 10 and 30 minutes by HPLC.
  • Z-Arg-OH is a by-product of the competitive hydrolysis of Z-Arg-OMe.
  • the amount of this by-product is usually higher, the poorer the donor properties of the nucelophiles or impurities in the catalyzing enzyme have a disruptive effect on the course of the reaction.
  • Z-Arg-OH is also very difficult to separate from the peptide formed. The less Z-Arg-OH is formed, the more successful the peptide synthesis was.
  • the percentage of Z-Arg-OH or Z-Arg-Pro-NH2 is based on the total amount of Z-Arg-Pro-NH2, Z-Arg-OH and Z-Arg-OMe.
  • Example 1a The approach is as in Example 1a, but the stated amount of Z-Arg-OMe is dissolved together with 450 mg (2.5 eq.) H-Pro-NH2 * HCl in 1 ml of 50% MeOH and immediately after after cooling to 40 ° C with the enzyme. After a reaction time of 1 h, a conversion of 93% was reached according to HPLC. Refurbishment and product isolation are carried out as described under 1a.
  • the batch is passed over a 25 ml clostripain immobilizate column at a pumping speed of approximately 14 ml / min.
  • the reaction is stopped by adding a few drops of HClO4 (pH approx. 2-3).
  • the immobilizate After activation before the 4th run, the immobilizate only showed 50% of its initial activity.
  • the educts dissolved in the butanol / NaCl solution can be pumped in a circuit without a phase separation over a catalyst bed.

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Abstract

Für die Verknüpfung von aminoterminal geschütztem Arginin oder von aminoterminal geschützten Peptiden mit carboxyterminalem Arginin (Acyldonor) mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit Amindonor-Funktion wird das aus dem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM 627 gewonnene Clostripain eingesetzt. Das Enzym kann durch Alkoholfällung und anschließender Adsorption des aus dem alkoholgefällten Kulturfiltrat gewonnenen Enzyms an Reaktivfarbstoff in hoher Reinheit gewonnen und für die Verknüpfung verwendet werden. Die spezifische Aktivität von Clostripain beträgt mindestens 80 U/mg. Clostripain katalysiert außer der oben erwähnten Verknüpfung von proteinogenen Aminosäuren auch die Verknüpfung einer proteinogenen mit einer nichtproteinogenen Aminosäure.

Description

  • Enzymatische Peptidsynthesen mit α-Amino-geschützten Argininestern und diversen Amino-ungeschützten, Carboxy-geschützten oder ungeschützten Aminosäurederivaten als Aminodonatoren können prinzipiell mit Metallo-, Serin- oder Thiolproteasen durchgeführt werden. Diese Proteasen sind in der Lage, abhängig von dem Reaktionsgleichgewicht, nicht nur die Spaltung des Peptids bzw. des Proteins in Aminosäuren (= Hydrolyse), sondern auch die Umkehrreaktion zu katalysieren. Vorzugsweise läuft die Peptidsynthese unter kinetischer Kontrolle ab.
  • Für die Aminolyse von N-geschützten Argininestern eignet sich in vielen Fällen vorzugsweise das preisgünstige Trypsin. Wie jedoch Untersuchungen von Oka (Oka et al. J. Biochem. 82, 1055-1062, 1977) zeigten, gilt dies nicht für den Fall der Verknüpfung mit Prolinderivaten als N-Komponenten.
  • Mitchell (Science 162, p. 374, 1968) zeigte, daß die Arg-Pro-Bindung in Met-Lys-Bradykininen nicht von Trypsin, jedoch von Clostripain hydrolysiert wird.
  • Clostripain (EC 3.4.22.8) wurde von Kochalaty (Kochalaty et al. Arch. Biochem. 18,1, 1948) aus Clostridium histolyticum isoliert und von Labouesse und Gros (Bull. Soc. Chim. Biol. 42, 543, 1969), Kula (Biochem. Biophys. Res. Comm. 69, 389, 1976) und Mitchell (J. Biol. Chem. 242, 4683, 1968) charakterisiert.
  • Die Methode der enzymatischen Peptidverknüpfung von N-geschützten Argininestern mit Prolin-Derivaten bzw. aminoterminal Prolin-enthaltenden Di- und Tripeptiden beschrieben Andersen (Peptides, Proc. 9th APS, p. 355, 1986, Ed. Deber, Hruby) und Fortier (Arch. of Bioch. Biophys. 276, 317, 1990). Andersen und Fortier setzten für ihre Untersuchungen Clostripain ein, welches durch viele hintereinandergeschaltete Schritte hochgereinigt worden war und eine niedrige spezifische Aktivität besaß (z.B. Fortier et al.: 38 U/mg).
  • Die Herstellung von Clostripain mit einer Aktivität ≧ 80U/mg, welches aus dem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM 627 durch Alkoholfällung des Kulturfiltrats und anschließender Adsorption an Reaktivfarbstoff aufgereinigt wird, sowie seine Verwendung zur enzymatischen Peptidverknüpfung von N-geschützten Argininestern mit Prolin-Derivaten bzw. aminoterminal Prolin-enthaltenden Peptiden wurde noch nicht beschrieben.
  • Nicht bekannt ist ferner die Clostripain-katalysierte Peptidsynthese mit nichtproteinogenen Aminosäuren als Amindonator statt der Aminosäure Prolin, sowie die Verwendung von Clostripain-Immobilisat für die Verknüpfungsreaktion.
  • Alle in der Literatur bisher beschriebenen Peptidverknüpfungen mit Clostripain wurden ferner nur im analytischen Maßstab ohne präparative Isolierung der Produkte durchgeführt.
  • Analytischer Maßstab bedeutet, daß das synthetisierte Peptid durch dünnschichtchromatographische Methoden oder HPLC detektiert werden kann.
  • Von präparativer Isolierung spricht man bei Isolierung des synthetisierten Peptids durch Extraktionsprozesse zur weiteren Verwendung des Peptids im industriellen Maßstab, d.h. in Gramm- oder Kilogrammengen.
  • Es ist bis jetzt außerdem kein Verfahren bekannt, mit dem man Arg-Pro oder Arg-B enthaltende Peptidverbindungen mittels Clostripain im industriellen Maßstab herstellen kann.
  • Es sind zahlreiche Peptidwirkstoffe, die in ihrer Sequenz ein Arg-Pro-Teilfragment aufweisen, bekannt. Sie werden teilweise als Pharmazeutika eingesetzt. So z.B. LHRH (Gly-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂) bzw. LHRH-Analoga (Gonadoliberin-Agonisten, Antagonisten) wie z.B. Buserelin (Gly-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt) u.a.m. Kürzere Peptide mit der Teilsequenz Arg-Pro haben ebenfalls pharmakologisch interessante Eigenschaften.
  • Enzymatische Peptidverknüpfungsverfahren zeichnen sich besonders durch das Ausbleiben störender Racemisierung sowie den möglichen Verzicht auf den Seitenketten-Schutz aus. So bietet speziell im Fall des Arginins das enzymatische Verfahren den Vorteil, daß die Guanidino-Gruppe nicht mit teuren, sowie schwer einführ- und abspaltbaren Schutzgruppen (z.B. -Mtr) modifiziert werden muß.
  • Die meisten industriell produzierten Peptidwirkstoffe werden nach der Methode der klassischer Peptidsynthese in Lösung synthetisiert.
  • Enzymatische Peptidverknüpfungen können in wäßrigen, wäßrig/organischen oder rein organischen Lösemittelsystemen durchgeführt werden. Verwendet man z.B. wäßriges Methanol als Solvens, ist eine Isolierung der Produkte mit einfachen Aufarbeitungsprozessen nicht möglich, da die noch ausreichend wasserlöslichen Arg-Peptide in der Regel nicht präzipitieren bzw. mit einem organischen Extraktionsmittel wie Essigsäureethylester oder Methylisobutylketon nur ungenügend extrahierbar sind.
  • Die Verwendung einer Mischphasen-Lösung für die Peptidreaktion, die gleichzeitig Reaktions- und Extraktionsmedium darstellt, ist bisher noch nicht beschrieben.
  • Es wurde nun gefunden, daß die enzymatische Peptidsynthese zur Darstellung von Peptiden, die Arginin als Acyldonor und proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren als Amindonoren enthalten, von Clostripain aus methanolgefälltem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM 627 und von adsorptiv an Reaktivfarbstoff aufgereinigtem Enzym effektiv katalysiert wird.
  • Die Erfindung betrifft somit:
    • 1. Clostripain mit einer Enzymaktivität von mindestens 80 U/mg erhältlich aus Clostridium histolyticum DSM 627 durch folgendes Herstellverfahren:
      • Fermentation von Clostridium histolyticum DSM 627
      • Herstellung eines Kulturfiltrats
      • Alkoholfällung des Clostripains aus dem Kulturfiltrat
      • Adsorption des alkoholgefällten Clostripains an Reaktivfarbstoff.
    • 2. Verfahren zur Herstellung von Clostripain, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Clostripain mit einer Enzymaktivität von mindestens 80 U/mg durch Fermentation von Clostridium histolyticum DSM 627 hergestellt wird.
    • 3. Verwendung des Clostripains zur Verknüpfung von aminoterminal geschütztem Arginin oder von aminoterminal geschützten Peptiden mit carboxyterminalem Arginin (Acyldonor) mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit Amindonor-Funktion, welche jeweils eine Carboxylschutzgruppe, ein Carbonsäureamid oder -hydrazid besitzen.
    • 4. Verwendung des Clostripains zur Verknüpfung einer Aminosäure oder eines Peptids mit einer nicht-proteinogenen Aminosäure, welche Amindonor-Funktion hat oder mit einem Peptid, welches eine derartige Aminosäure besitzt.
  • Im folgenden wird die Erfindung in ihren bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Ansprüche bestimmt.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren katalysiert Clostripain die Verknüpfung von Aminosäuren oder Peptiden, die als Acyldonor Arginin aufweisen.
  • Das erfindungsgemäße Clostripain wird wie folgt gewonnen:
    • Fermentation von Clostridium histolyticum DSM 627
    • Herstellung eines Kulturfiltrats durch Zentrifugaton und Sterilfiltration
    • Alkoholfällung des Clostripains aus dem Kulturfiltrat, insbesondere Methanolfällung und
    • Adsorption des alkoholgefällten Clostripains an Reaktivfarbstoff, insbesondere an Reactive Red 120
    Das erfindungsgemäße Clostripain kann außerdem wie folgt gewonnen werden (s. Schema 1):
    • aus sterilfiltriertem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM627 welches vorzugsweise 50-fach aufkonzentriert wurde oder
    • aus ultrafiltriertem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM627 oder
    • aus Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM627 nach der Alkoholfällung, insbesondere nach der Methanolfällung oder
    • durch Ammoniumsulfatfällung des ultrafiltrierten Kulturfiltrats von Clostridium histolyticum DSM627 oder
    • durch Adsorption von Clostripain, gewonnen aus alkohol-, insbesondere methanolgefälltem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum DSM627 und Adsorption an Reaktivfarbstoff, insbesondere an Reactive Red 120, oder
    • durch hydrophobe Chromatographie der ammoniumsulfat- oder alkoholgefällten Kulturbrühe insbesondere an Aminobutyl- oder Hexylagarose.
  • Die Gewinnung von Clostripain ist ebenfalls durch eine andere Kombination der in Schema 1 angegebenen Aufreinigungsschritte möglich.
    Figure imgb0001
  • Für die Gewinnung des Clostripain wird der Stamm DSM 627 für 12-28 Stunden mit dem optimierten Nährmedium NL 1581 oder dem Proteose-Pepton-Medium fermentiert. Die Temperatur der Vorkultur beträgt 33-39°C, vorzugsweise 37°C, die der Hauptkultur 31-36°C, vorzugsweise 33°C.
  • Der Stamm DSM627 ist bei der Deutschen Gesellschaft für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, frei verfügbar.
    • Nährmedium NL 1581: (Die Angaben beziehen sich auf 1l Nährmedium)
  • - 30 g Fleischextrakt
    - 30 g Casein-Pepton
    - 5 g Hefeextrakt
    - 1,74 g K₂HPO₄
    - 0,5 g Cystein
    pH 7,4
    • Proteose-Pepton-Medium: (Die Angaben beziehen sich auf 1l Medium)
  • - 50 g Proteose Pepton
    - 1,74 g K₂HPO₄
    - 0,5g Cystein
    pH 7,2
  • Die Fermentation mit dem optimierten Nährmedium NL 1581 oder dem Proteose-Pepton-Medium ergibt nach Zentrifugation (10.000 g für 10 Min.) und Sterilfiltration (Porengröße der Membran 0,2-0,4 µm, vorzugsweise 0,3 µm, wie z.B. ®Omega 0,3 µm-Filter der Firma Filtron) das Kulturfiltrat mit bis zu 50000 U/L (entspricht 60-120, insbesondere 80-100 U/mg Clostripain), welches mittels Ultrafiltration ohne Proteinverlust aufkonzentriert wird. Diese Enzymqualität wird als CL1 bezeichnet.
  • Die Ultrafiltration dient der Konzentrierung der Kulturbrühe.
  • Als Ultrafiltrationsmembran sind alle Membranen mit einer Porengröße 5-50, vorzugsweise 10 KD (KD= Kilodalton) geeignet (z.B. Omega 10 K v.d. Firma Filtron). Größere Chargen (> 5l - 1m³) werden jedoch mittels Tangentialfluß (Crossflow)-Kassettensystem aufkonzentriert.
  • Bereits mit dem aus der Ultrafiltration gewonnenen Clostripain können Verknüpfungen durchgeführt werden. Das Enzym hat eine Aktivität von 80-100, insbesondere 90 U/mg.
  • Eine alternative Aufarbeitung über eine Ammoniumsulfat-Fällung (40 bzw. 70 % (NH₄)₂SO₄) analog Labouesse (Bull. Soc. Chim. Biol. 42, 543-68, 1960) führte zur Qualität CL2 in 32 % Ausbeute, während die Alkohol-, insbesondere die Methanol-Fällung analog Ogle (Arch. Biochem. Biophys 42, 327-36, 1953) CL3 in rund 70 % Ausbeute Enzym mit der spezifischen Aktivität bis zu 250 U/mg-Protein liefert.
  • Das durch die Ammoniumsulfatfällung gewonnene Clostripain kann mittels hydrophober Chromatographie, insbesondere an Aminobutyl- oder Hexylagarose weiter aufgereinigt werden. Das Enzym besitzt dann eine Qualität von 150-250, insbesondere 150-170 (Hexylagarose) bzw. 220-250 U/mg (Aminobutylagarose).
  • Vor der Methanolfällung muß zur Stabilisierung des Enzyms unbedingt der Ca²⁺ lonengehalt überprüft werden, andernfalls muß CaCl₂ oder Calciumacetat zugefügt werden (Sollwert: 5-10 mM, 60°C, 15 Min.). Dabei geht man so vor, daß man soviel CaCl₂ oder Calciumacetat zur Kulturbrühe gibt, bis die Endkonzentration der Kulturbrühe 5-10 mM erreicht.
  • Die Methanolfällung gestattet eine kostengünstige und auch im Gramm-Maßstab durchführbare Enzymgewinnung der Qualität CL3.
  • Das mittels Alkoholfällung gewonnene Clostripain kann durch Adsorption an Reaktivfarbstoff, insbesondere Reactive Red 120 [Sigma], und anschließender Elution mittels Salzen, vorzugsweise Na- oder KCl (0,4 M) nochmals aufgereinigt werden. Diese Vorgehensweise erlaubt die Gewinnung von hochreinem Clostripain in einem nur zweistufigen Vorgang (1. Methanolfällung des Kulturfiltrats und 2. Adsorption des im ersten Schritt gewonnenen Enzyms an Reaktivfarbstoff). Darüberhinaus werden hohe Ausbeuten erzielt. Die Enzymaktivität beträgt 250-350, insbesondere 280-330 U/mg.
  • Clostripain kann für die Verknüpfungsreaktion in immobilisierter und nichtimmobilisierter Form eingesetzt werden.
  • Als Trägermaterialien werden vorzugsweise adsorptiv wirkende Träger, wie z.B. Kieselgel oder CNBr-Sepharose eingesetzt. Die Träger sind handelsüblich erhältlich.
  • Zur Immobilisierung des Enzyms wird dieses mit dem Träger vermischt. Die Dauer der Kopplungsreaktion, das Reaktionsmilieu und das Mischungsverhältnis von Enzym und Träger ist von der Art des gewählten Trägers abhängig und kann für jeden Einzelfall durch Vorversuche vom Fachmann leicht bestimmt werden.
  • Für die Peptidkopplung muß eine Aminokomponente (= Amindonor) und eine Carboxykomponente (= Acyldonor) vorhanden sein.
  • Als Carboxykomponente werden N-geschützte Argininalkylester bzw. Peptidfragmente, welche am Carboxyterminus eine Argininalkylestergruppe aufweisen, vorzugsweise jedoch Z-Arg-OMe, Z-Leu-Arg-OMe, Z-Gly-Pro-Arg-OMe, Boc-D-Arg-Arg-OMe, verwendet.
  • Als Aminokomponente werden Aminosäurederivate bzw. Peptidfragmente, welche als Aminoterminus eine proteinogene Aminosäure, mit Ausnahme der Aminosäuren, Asn, Gln oder Thr aufweisen, Prolinester und -amide, vorzugsweise Pro-NH₂, Pro-NHEt, Pro-Gly-NH₂, Pro-Ala-NH₂, Pro-AzaGly-NH₂, D-Aminosäuren oder nichtproteinogene Aminosäuren wie z.B. Halogen substituierte Phenylalanine, Furyl-, Thienylalanine, Phenylglycin, Homophenylalanin, 2-Aminonorbornan-2-carbonsäure oder phosphorhaltige Aminosäuren verwendet.
  • Die zu koppelnden Aminosäuren bzw. Peptide müssen vor der Kopplungsreaktion nach dem Fachmann bekannten Methoden amino-(Carboxykomponente) bzw. carboxygeschützt (Aminokomponente) werden.
  • Hierfür eignen sich die Aminoschutzgruppen: Z, Boc, Ac, For, Bz und die Carboxylschutzgruppen OR (mit R= C₁-C₅, Bzl, tBUx) NH₂ und NHR' (R'= C₁-C₅, NH-CONH₂). Statt der Carboxylschutzgruppe kann auch ein Carbonsäureamid oder -hydrazid verwendet werden.
  • Die Reaktionsbedingungen für die Kopplungsreaktion sind abhängig von den zu koppelnden Aminosäuren bzw. Peptiden und sind in den Beispielen aufgeführt. Das Nucleophil wird in 2-10 fachem Überschuß zugesetzt. Prolinamid oder prolinhaltige Nucleophile mit N-terminalem Prolin werden vorzugsweise in 2-6 fachem Überschuß im Vergleich zum Acyldonor eingesetzt.
  • Die Peptidkopplung kann bei diesem geringen Nucleophilüberschuß nur erfolgreich durchgeführt werden, wenn
    • a) die Methanolkonzentration und gleichzeitig
    • b) die absolute Konzentration der Reaktanden erhöht wird.
  • Die Methanolkonzentration liegt bei Verwendung des 2-6 fachen Überschusses im Bereich von 40-90%. Die Konzentration der Reaktanden wird bei 2-6 fachem Überschuß im Vergleich zum 10fachen Überschuß bis um den Faktor 3 erhöht. Da trotz des hohen Methanolanteils die Löslichkeitsgrenze der Argininderivate überschritten wird, müssen die Aminosäuren in der Hitze vorgelöst und erst nach dem Abkühlen der Lösung das Enzym zugegeben werden.
  • Außer Methanol, welches vorzugsweise zur Peptidkopplung unter der Bedingung des geringen Nucleophilüberschusses eingesetzt wird, können außerdem noch verwendet werden: THF (Tetrahydrofuran), Dioxan, Dimethoxyethan, Ethylenglycol, Diethylenglycoldiethylether oder Ethanol.
    Die für Methanol angegebenen Reaktionsbedingungen gelten ebenso für diese Lösemittel.
  • Die Verwendung des Lösemittels Butanol erfordert einen 10fachen Nucleophilüberschuß.
  • Die Peptidkopplung kann auch in einem Mischphasen-System durchgeführt werden, welches gleichzeitig Reaktions- und Extraktionsmedium darstellt. Dieses Mischphasen-System besteht vorzugsweise aus Butanol und wäßriger NaCl-Lösung.
  • Die Umsetzung erfolgt im kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Verfahren.
  • Wie oben beschrieben, findet die Verknüpfung vorzugsweise in einem Mischphasen-System statt, welches gleichzeitig Reaktions- und Extraktionsmedium ist. Durch Extraktion erfolgt Überführung des Peptids in die Butanolphase, welche nach der Phasenseparation abgetrennt wird. Ein mehrmaliges Ausschütteln der Kochsalzphase mit Butanol erhöht die Peptidausbeute.
    • BEISPIELE l. Immobilisierung von Clostripain:
  • Clostripain kann ionogen an DEAE-Sephadex® A 50 (Pharmacia) gebunden werden. Die kovalente Immobilisierung ist jedoch für Clostripain vorteilhafter.
  • So werden für die in Tabelle 1 aufgeführten Materialien z.T. sehr hohe Bindungsausbeuten erreicht.
  • Vor der Immobilisierung kann Clostripain mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) aktiviert werden. Es ist jedoch auch möglich, das Enzym in nicht-aktivierter Form zu verwenden. Die höchste Aktivität pro ml Träger wird mit Bromcyan-aktivierter ®Sepharose 4B erreicht. Dieses Immobilisat hat jedoch nur eine mäßige Langzeitstabilität.
    Robustere Träger wie das VA-Epoxy-Immobilisat oder Glutardialdehyd/Kieselgel weisen eine wesentlich geringere Belegungsdichte auf.
    Figure imgb0002
  • DEAE-Sepharose A 50-Clostripain:
    Die Immobilisierung erfolgte analog H. Woodward, Imm. Cells and Enzymes, IRL Press, Oxford 1985.
  • Kieselgel-Clostripain:
    Die Immobilisierung erfolgte analog EP 3 438 189.
    50 ml Kieselgel (Grace) wird mit 100 ml Wasser und 3 g Aminopropylethoxysilan versetzt, 2 h bei 65°C gerührt, heiß filtriert und 24 h bei 90°C getrocknet.
  • Danach wird ein Volumenteil aminierter Träger mit 2 Volumenteile 0,25 M Kaliumphosphatpuffer pH 8, mit 2,5 % Glutardialdehyd versetzt und 2 Std. leicht geschüttelt.
  • Nach Absaugen des Trägers und mehrmaligem Waschen, beträgt die Ausbeute an fixiertem Enzym 90 - 95 %. Die Belegungsdichte liegt bei 45 - 70 U/ml feuchten Träger.
  • Das Kieselgel-Immobilisat ist aufgrund seines günstigen Preises besonders für präparative Zwecke geeignet.
  • Eupergit C (Röhm):
    Immobilisierung in 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5/4 °C/48 h.
  • VA-Epoxy (Riedel de Haën)
    Immobilisierung in 1M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5/20°C/24 h.
  • Tresyl Sepharose 4B (Pharmacia):
    Durchführung analog Nilsson, Mosbach Biotech. Bioeng. 26, 1146-54, 1984.
  • Bromcyan Sepharose B (Pharmacia):
    Durchführung analog Cobbs, Biotechnol. Techn. 5, 5-10, 1990.
    • 2. Test unterschiedlicher Aufreinigungsfraktionen des Clostripains auf die Peptidsyntheseaktivität bzw. konkurrierende Esterhydrolyse während der Reaktion von Z-Arg-OMe mit Pro-NH₂ in 30 %iger Methanollösung (Z-Arg-OMe:Pro-NH₂= 1:10)
  • Mit diesen Untersuchungen sollte geklärt werden, inwieweit das Enzym aufgereinigt werden muß, um eine Arg-Pro-Knüpfung mit hoher Ausbeute und möglichst geringer Verseifung des Argininesters zu erhalten.
  • Es wurde die Bildung von Z-Arg-Pro-NH₂ und Z-Arg-OH in Abhängigkeit der eingesetzten Enzymqualität nach 10 und 30 Min. per HPLC bestimmt.
  • Die Produktbildung (Z-Arg-Pro-NH₂) im Verhältnis zur Konkurrenzhydrolyse des Z-Arg-OMe zu Z-Arg-OH ist ein Hinweis auf die Güte des Reaktionsverlaufs der Peptidsynthese.
  • Z-Arg-OH entsteht als Nebenprodukt durch die Konkurrenzhydrolyse von Z-Arg-OMe. Die Menge dieses Nebenproduktes ist in der Regel um so höher, je schlechter die Donoreigenschaften des Nucelophils sind oder Verunreinigungen des katalysierenden Enzyms sich störend auf den Reaktionsverlauf auswirken. Z-Arg-OH ist darüberhinaus sehr schlecht von dem entstandenen Peptid abtrennbar. Die Peptidsynthese ist um so erfolgreicher abgelaufen, je weniger Z-Arg-OH entsteht.
  • Nach 10 bzw. 30 Min. Reaktionszeit entstanden folgende Mengen von Z-Arg-OH bzw. Z-Arg-Pro-NH₂:
    Bei Verwendung des Clostripains aus
    Figure imgb0003
  • Die in Prozenten angegebene Menge Z-Arg-OH bzw. Z-Arg-Pro-NH₂ ist bezogen auf die Gesamtmenge von Z-Arg-Pro-NH₂, Z-Arg-OH und Z-Arg-OMe.
    • III. Peptidsynthesen mit Clostripain: Peptidverknüpfung: A). Peptidverknüpfung ...Arg-Pro-... Beispiel 1a:
  • Synthese von Z-Arg-Pro-NH₂ mit löslichem Clostripain der Qualität CL1: 358,8 mg (1 mmol) Z-Arg-OMe x HCl sowie 1,5 g (10 mmol) Pro-NH₂ xHCl werden in 3 ml 30 % Methanol gelöst, der pH-Wert auf 7,8 eingestellt und bei 40°C mit 26 U Clostripain (CL1) inkubiert. 1 U Clostripain ist definiert als die Menge Enzym, die 1 mol N-Benzoyl-L-Argininethylester/min bei 25°C, pH 7,6 in Anwesenheit von 2,5 mM Dithiothreitol hydrolysiert.
  • Während der Reaktion wird der pH-Wert konstant gehalten. Nach 90 Min. erreicht man laut HPLC 94 % Peptid. Zur Isolierung wird Methanol entfernt, die wäßrige Lösung mit Kochsalz gesättigt und mehrmals mit n-Butanol ausgeschüttelt. Die eingeengte Butanolphase enthält analysenreines Peptid in 85 - 90 % Ausbeute.
    • Beispiel 1b:
  • Der Ansatz erfolgt wie in Beispiel 1a, jedoch wird die angegebene Menge Z-Arg-OMe zusammen mit 450 mg (2,5 eq.) H-Pro-NH₂*HCl in der Hitze in 1 ml 50 %igem MeOH gelöst und unmittelbar nach dem Abkühlen auf 40°C mit dem Enzym versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 h hat man laut HPLC einen Umsatz von 93 % erreicht. Aufarbeitung und Produktisolierung erfolgen wie unter 1a beschrieben.
    • Beispiel 2: Synthese von Z-Arg-Pro-NH₂ mit immobilisiertem CL1 im Methanol/Wasser-System
  • Ansatz wie in Beispiel 1, jedoch Zugabe von 100 U Clostripain-Kieselgel-Immobilisat. Der Ansatz wird unter pH-statischen Bedingungen langsam gerührt. Nach 40 min liegen 95 % Peptid vor, der Katalysator kann abgetrennt und mit Puffer gewaschen werden.
    • Beispiel 3: Synthese von Z-Arg-Pro-NH2 mit immobilisiertem Clostripain in NaCl-Lösung (6.1M)/n-Butanol = (50:50 im Batch-Betrieb).
  • 1 mmol Z-Arg-OMe x HCl und 10 mmol Pro-NH₂ x HCl werden in 1,5 ml 6.1M NaCl-Lösung und 1,5 ml n-Butanol bei pH 7,8 und 40°C gelöst. Es werden 48 U Kieselgel-Immobilisat zugegeben. Nach 40 Min. sind 89 % Peptid gebildet. Nach der Phasenseparation wird die Butanolphase abgetrennt und die Kochsalzphase noch dreimal mit n-Butanol ausgeschüttelt. Man isoliert 78 % Z-Arg-Pro-NH₂.
    • Beispiel 4: Synthese von Z-Arg-Pro-Gly-NH₂ mit Säulenbettreaktor/NaCl-Butanol:
  • 7,18 g (20 mMol) Z-Arg-OMe x HCl und 41,5 g (200 mmol) H-Pro-Gly-NH₂ x HCl werden in 30 ml gesättigter NaCl-Lösung und 30 ml Butanol gelöst, mit 16,5 ml 10 N NaOH wird der pH auf 7,8 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt 40°C.
  • Mit einer Umpumpgeschwindigkeit von ca. 14 ml/min wird der Ansatz über eine 25 ml-Clostripain-Immobilisat-Säule geführt.
  • Nach 80 Min wird die Reaktion abgebrochen und es werden die Phasen separiert. Das Tripeptid wurde mit 86 %iger Ausbeute aus der Butanolphase isoliert. Die verbleibende Solephase kann nun wieder mit den abreagierten Äquivalenten nachgespeist werden und erneut über die Enzymsäule gepumpt werden.
  • Nach 4-5 maliger Verwendung der Solephase konnte das Diketopiperazinderivat cyclo-(Pro-Gly) beobachtet werden, was insgesamt zu einer Verzögerung der Reaktionsgeschwindigkeit führte.
    • Beispiel 5: Weitere Arg-Pro-Verknüpfungen
  • Es wurde die Synthese von Clostripain-katalysierten Peptidsynthesen mit Z-Arg-OMe als Acyldonor (also Arg in P1-Position) und Prolin (als aminoterminale Aminosäure des Nucelophils) in P1- und besetzter P2'-, P3'-Position durchgeführt.
    Figure imgb0004
     Tabelle 2:
    Nucleophil Peptid (Ausbeute-Bereich %)
    Pro-NHEt Z-Arg-Pro-NHEt 80 - 96
    Pro-Gly-NH₂xHCl Z-Arg-Pro-Gly-NH₂ 70 - 90
    Pro-Azagly-NH₂xHCl Z-Arg-Pro-AzaGly-NH₂ 80 - 90
    Pro-Ala-NH₂xHCl Z-Arg-Pro-Ala-NH₂ 85 - 95
    • a) Z-Arg-Pro-NHEt:
      Reaktionsansatz:
      Ester:Amin = 1:10 in 10 % MeOH, pH 7,8; 0,25 ml CL3 (230 U/ml) pro 1mmol Ester; Reaktionszeit: 30 Min.;
      HPLC-Ausbeute: 80 %.
    • b) Z-Arg-Pro-NHEt:
      Reaktionsansatz:
      Ester:Amin= 1:10 in NaCl/BuOH= 1:1, pH 8,3; 0,5 ml CL3 (230 U/ml) pro 1mmol Ester; Reaktionszeit 50 Min.;
      HPLC-Ausbeute: 96%
    • c) Z-Arg-Pro-Gly-NH₂:
      Reaktionsansatz:
      Ester:Amin= 1:10 in NaCL-BuOH (1:1), 2 ml CL3-Kieselgel pro 1mmol Ester;
      Reaktionszeit 1 Std.;
      HPLC-Ausbeute: >95 %.
      Die Butanol-Phase enthält Peptid mit 94 % Reinheit.
    • d) Z-Arg-Pro-Ala-NH₂:
      Reaktionsansatz:
      Ester:Amin= 1:10, in 10 % MeOH; 0,25 ml (CL3-Lösung (230 U/ml) pro 0,05 mmol Ester. Nach 45 Min. ist kein Ester mehr nachweisbar.
      Laut HPLC entstand ca. 94 % Peptid, 5 % Z-Arg-OH.
    • e) Z-Arg-Pro-OCAM:
      CAM =
      Figure imgb0005
       Reaktionsansatz:
      Ester:Amin= 1:10 in 10% MeOH,
      0,15 ml CL3-Lösung (400 U/ml) pro 1 mmol Ester; Reaktionszeit: 2 h.
      HPLC-Ausbeute: 30 %
    • f) Z-Arg-Pro-N₂H₃
      Reaktionsansatz:
      Ester:Amin= 1:10 in 10 % MeOH;
      0,1 ml CL3-Lösung (600 U/ml) pro 1 mmol Ester; Reaktionszeit : 3/4 h
      HPLC-Ausbeute: 56 %
    • g) Z-Arg-Hyp-NH₂
      Reaktionsansatz:
      Ester:Amin= 1:10 in 10 % MeOH;
      0,15 ml CL3-Lösung (660 U/ml) pro 1 mmol Ester; Reaktionszeit: 1,5 h
      HPLC-Ausbeute: 81 %
    • B) Peptidverknüpfung von nichtproteinogenen Aminosäuren als Amindonor
    1 mmol Z-Arg-OMe x HCl und 1-2 mmol Nucleophil werden in 2-4 ml 10 %igem wäßrigem Methanol gelöst und mit 5N NaOH auf pH 7,8 - 8 eingestellt.
    Es folgt dann die Zugabe von 0,25 - 0,5 ml CL3-Enzymlösung (400 - 500 U/ml). Das Enzym wurde zuvor mindestens 1 Std. mit Aktivierungspuffer behandelt (2,5 mM CaCL₂, 10 mM DTT). Die Reaktionslösung wird unter pH-stat. Bedingungen gefahren (Titration mit 1N NaOH).
    Einige Produkte fallen direkt aus der Reaktionslösung aus (z.B. Z-Arg-4F-Phe-NH₂) und werden durch Filtration/Nachwaschen mit 5 % Methanol/dest. Wasser isoliert.
  • Nach 0,75 - 2 Std. ist laut HPLC kein Z-Arg-OMe zu erkennen. Es entstand neben dem Peptid 2 - 50 % Z-Arg-OH durch Konkurrenzhydrolyse des eingesetzten Esters.
  • Man stoppt die Umsetzung durch Zugabe von einigen Tropfen HClO₄ (pH ca. 2-3).
  • Die Lösung wird zur Entfernung des Methanols ca. auf 1/3 des Volumens eingeengt, mit NaCl gesättigt und dreimal mit Butanol extrahiert. Häufig ist das Peptid noch mit wenigen Prozenten an Z-Arg-OH verunreinigt. (Die präparativen Ausbeuten liegen wegen unvollständiger Extraktion häufig erheblich niedriger als die HPLC-Angaben.) Tabelle 2
    Nucleophil (Formel) Peptid HPLC-,Präp.-(Ausbeute %)
    4F-Phe-NH₂ Z-Arg-4F-Phe-NH₂ 97,73
    4F-Phe-OMe Z-Arg-4F-Phe-OMe 91,70
    DL-4F-Phe-OProp Z-Arg-D,L-4F-Phe-OProp 90,69
    4F-Phe-4F-Phe-NH₂ Z-Arg-4F-Phe-4F-Phe-NH₂ 85,80
    4Cl-Phe-OProp Z-Arg-4Cl-Phe-OProp >95,76
    Nal-OProp 1 Z-Arg-Nal-OProp >95,88
    DL-Phg-OMe 2 Z-Arg-D,L-Phg-OMe >95,78
    Phgly-OtBu Z-Arg-Phgly-OtBu 90,70
    HPhe-OEt 3 Z-Arg-HPhe-OEt 85,72
    DL-DMPO-Ala-OProp 4 Z-Arg-D,L-DMPO-Ala-OProp 40,10
    Thiaz-Cys-OProp 5 Z-Arg-Thiaz-Cys-OProp 70,50
    PTC-Phe-NH₂ 6 Z-Arg-PTC-Phe-NH₂ >95,63
    Fur-Ala-OMe 7 Z-Arg-Fur-Ala-OMe 75,45
    Thi-OMe 8 Z-Arg-Thi-OMe 73,59
    H-Sar(*)-NH₂ Z-Arg-Sar-NH₂ 66
    H-Gly-N₂H₄ Z-Arg-Gly-N₂H₄ 92
    H-Leu-N₂H₄ Z-Arg-Leu-N₂H₄ 66
    (*)Sar= N-Methylglycin
    (Aminosäurehydrazide müssen eher als nicht proteinogene Aminosäuren als z.B. geschützte Derivate proteinogener Aminosäuren aufgefaßt werden, denn im Gegensatz zu diesen sind Carbonsäurehydrazide der Peptide bzw. Aminosäuren nicht in diese rückspaltbar).
    Sar= N-Methylglycin
    Figure imgb0006
    Figure imgb0007
    • 3. Zweiphasige Verfahren mit Immobilisat im Rührreaktor mit Akkumulierung des Produkts
  • Es wurden vier aufeinanderfolgende Batchläufe (je 1 mmol) mit Kieselgel/CL3 in einer NaCL/Butanol-Lösung (50 %iges Butanol) durchgeführt.
  • In diesem System ist die Umsetzung langsamer, die Ausbeute an Peptid niedriger und der prozentuale Anteil an gebildeter Säure höher als in einem vergleichbaren Einphasensystem. Ferner sinkt die Aktivität des Katalysators schneller als beim einphasigen Methanol/Wasser-System.
  • Nach der Aktivierung vor dem 4. Lauf zeigte das Immobilisat nur noch 50 % seiner Anfangsaktivität.
    • Beispiel 6: Z-Arg-Pro-AzaGly-NH₂
  • Cyclus Nr. Ester mmol Amin mmol 10% MeOH ml CL3-Lsg* ml Reakt.zeit min Ausbeute HPLC
    1 5 50 15 3 20 78
    2 +5 +5 15 - 45 81
    3 +5 +5 20 2,5 40 80
    4 +5 +5 25 - 30 79
    5 +5 +5 15 3 20 76
    6 +5 +5 20 1 30 84
    * CL3: 80 U/ml

    Nach 6 Cyclen wird abgebrochen und mit n-Butanol extrahiert.
    • 4. Zweiphasige Verfahren mit Immobilisat im Säulenreaktor mit Akkumulierung des Produkts
  • Wie Vorversuche zeigten, lassen sich die in der Butanol/NaCl-Lösung gelösten Edukte problemlos ohne Phasenseparation über ein Katalysatorbett im Kreislauf pumpen.
  • Daraufhin wurden je 2 Batchläufe (a 15 mmol) mit einer Kieselgel- bzw. einer Eupergitsäule durchgeführt.
  • Die Reaktionsgeschwindigkeit ist etwas verlangsamt, die Ausbeute etwas geringer. Im zweiten Batchlauf zeigt die Säule einen deutlichen Aktivitätsschwund. Ferner reagiert der Acyldonor nicht quantitativ ab.
  • Dennoch lassen sich präparative Mengen mit dieser Methode bequem darstellen, denn ein wichtiger Vorteil des Zweiphasensystems ist darin zu sehen, daß nach der Phasenseparation aus der Butanolphase direkt das Produkt ausgeschleußt werden kann.
    • Beispiel 7: Z-Arg-Pro-Gly-NH₂:
  • Es wurden 3 Cyclen gefahren, wobei nur für den ersten Ansatz ein 10-facher Nucleophil-Überschuß gewählt wurde. Für die folgenden Cyclen wurden nur die wegreagierten Äquivalente ersetzt, sowie die Reaktionsgeschwindigkeit durch zusätzliche Enzymzugabe korrigiert.
    Figure imgb0008
  • Die vereinigten Butanolphasen werden getrocknet und eingeengt. Nach DC, HPLC sind noch 2-5 % Z-Arg-OH enthalten, die durch mehrmaliges Umkristallisieren entfernt werden können.
    Präp. Gesamtausbeute 72 % (Ca. 95 % Reinheit).
  • Je mehr Cyclen durchgeführt werden, umso rascher sinkt die Ausbeute. Mit zunehmender Reaktionsdauer entsteht bei diesen Reaktionsbedingungen relevante, geringe Mengen des Diketopiperazins: cyclo-(Pro-Gly), welches erstens die effektive Aminokonzentration herabsetzt und eventuell noch zusätzliche inhibierende Effekte auf die Reaktion haben könnte. Sinnvollerweise sollte diese Reaktion also nur für eine beschränkte Anzahl von Batch-Läufen angewendet werden.
  • Ein über lange Zeit ablaufendes kontinuierliches Verfahren ist wegen der Instabilität des Amins nicht ratsam.

Claims (9)

  1. Clostripain mit einer Enzymaktivität von mindestens 80 U/mg, erhältlich aus Clostridium histolyticum DSM 627 durch
    - Fermentation von Clostridium histolyticum DSM 627
    - Herstellung eines Kulturfiltrats
    - Alkoholfällung des Clostripains aus dem Kulturfiltrat
    - Adsorption des alkoholgefällten Clostripains an Reaktivfarbstoff.
  2. Verfahren zur Herstellung von Clostripain, dadurch gekennzeichnet, daß Clostripain mit einer Enzymaktivität von mindestens 80 U/mg durch Fermentation von Clostridium histolyticum DSM 627 hergestellt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Clostripain aus der Kulturbrühe von Clostridium histolyticum DSM 627 durch Filtration, Ultrafiltration, Ammoniumsulfatfällung, Alkoholfällung, hydrophobe Chromatographie oder Affinitätschromatographie hergestellt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Clostripain aus der Kulturbrühe von Clostridium histolyticum DSM 627 durch Alkoholfällung des Clostripains aus dem Kulturfiltrat und anschließender Adsorption des alkoholgefällten Enzyms an Reaktivfarbstoff gewonnen wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Alkoholfällung des Clostripains Methanol verwendet wird.
  6. Verwendung des Clostripains nach Anspruch 1 oder des nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 erhältlichen Clostripains zur Verknüpfung von aminoterminal geschütztem Arginin oder von aminoterminal geschützten Peptiden mit carboxyterminalem Arginin (Acyldonor) mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit Aminodonor-Funktion, welche jeweils eine Carboxylschutzgruppe, ein Carbonsäureamid oder -hydrazid besitzen.
  7. Verwendung des Clostripains nach Anspruch 1 oder des nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 erhältlichen Clostripains zur Verknüpfung einer Aminosäure oder eines Peptids mit einer nicht-proteinogenen Aminosäure, welche Amindonor-Funktion hat, oder mit einem Peptid, welches eine derartige Aminosäure besitzt.
  8. Verwendung des Clostripains nach Anspruch 1 oder des nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 erhältlichen Clostripains, dadurch gekennzeichnet, daß Clostripain in immobilisierter Form eingesetzt wird.
  9. Verwendung des Clostripains nach Anspruch 1 oder des nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 erhältlichen Clostripains, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktions- und Extraktionsmedium der Peptidverknüpfung eine Mischphasen-Lösung ist.
EP19920108509 1991-05-23 1992-05-20 Verfahren zur Clostripain-katalysierten Verknüpfung von Arg-Pro und Arg-B (B=proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren) enthaltenden Peptiden Withdrawn EP0518088A2 (de)

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