EP0589983A1 - Verfahren zur detektion und/oder quantitativen bestimmung von 9-n/o-acetylierten sialinsäuren - Google Patents

Verfahren zur detektion und/oder quantitativen bestimmung von 9-n/o-acetylierten sialinsäuren

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EP0589983A1
EP0589983A1 EP92912384A EP92912384A EP0589983A1 EP 0589983 A1 EP0589983 A1 EP 0589983A1 EP 92912384 A EP92912384 A EP 92912384A EP 92912384 A EP92912384 A EP 92912384A EP 0589983 A1 EP0589983 A1 EP 0589983A1
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EP
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viruses
sialic acids
esterase
acetylated
bound
Prior art date
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Ceased
Application number
EP92912384A
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Inventor
Gert Zimmer
Gerd Reuter
Roland Schauer
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DR PALLMANN BIOTECHNIK GmbH
Original Assignee
DR PALLMANN BIOTECHNIK GmbH
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Publication date
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5756—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumour-associated glycolinkage [TAG]

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection and / or quantitative determination of 9-N / O-acetylated sialic acids, which are bound to carrier molecules.
  • the carrier molecules can be carbohydrates, in particular complex carbohydrates, cells, tissues or other biological materials.
  • the sialic acids can be synthetic or naturally 9-N / O-acetylated.
  • Neuraminic acid is widely used as an N- and O-acetylated compound.
  • Sialic acids are found everywhere in the human body, especially in the blood, in slimy secretions (mucins) and in cell membranes.
  • mucins slimy secretions
  • cell membranes As a component of glycoproteins and glycolipids, they cover all cells of higher animals and humans with an electronegative layer and have a variety of biological functions there. Some of these functions are closely related to certain modifications of N-acetylneuraminic acid, particularly their naturally occurring esterification with acetic acid at position 9 ⁇ 9-O-acetylation).
  • 9-O-acetylated ganglioside GD3 is a tumor marker in malignant melanoma in humans. In human breast carcinoma increased formation of Neu ⁇ , 9Ac 2 was found on T lymphocytes. Changes also occur during the development of the brain and other mammalian tissues and cells. 9-O-acetylation is reduced in tumors of the human colon. There are also lectins with a specificity for 9-0-acetylated sialic acids.
  • influenza C viruses can bind to 9-O-acetylated sialic acids.
  • influenza C viruses also infect human upper respiratory tract and cause mild febrile infections in children up to the age of 10. Because of the high antibody titers in the blood, older people are largely protected against infections with influenza C viruses, so that no expensive protective measures are necessary for working with these viruses.
  • the influenza C viruses can be propagated relatively easily in certain cell cultures or in fertilized chicken eggs. The associated working methods or working techniques are well known to the person skilled in the art. These visas are generally accessible viruses.
  • the influenza C viruses are surrounded by a membrane envelope in which several copies of a viral glycoprotein are anchored in the form of so-called "spikes".
  • Three mutually independent activities are located on this glycoprotein, which play an important role in the infection of the host cells.
  • it is hemagglutinin, which represents a section on the molecule with lectin character. Hemagglutinin specifically recognizes 9-N / O-acetylated sialic acids as receptor determinants and mediates the binding of the viruses to their host cells.
  • Another activity is sialat 9-0-acetylesterase.
  • influenza C viruses have also been made to use influenza C viruses as an "analytical instrument" for the detection or determination of 9-O-acetylated sialic acids.
  • the problem arises that the viral esterase cancels the virus binding by splitting off the 9-O-acetyl groups.
  • Attempts have therefore already been made to specifically inhibit the esterase activity of the influenza C viruses with the highly toxic esterase inhibitor diisopropyl fluorophosphate (DFP) in order to prevent the binding of biotin-labeled viruses to red blood cells
  • DFP diisopropyl fluorophosphate
  • the object of the present invention is to provide an improved method for the detection and / or quantitative determination of 9-N / O-acetylated sialic acids bound to carrier molecules.
  • the method according to the invention represents a biological test system which directly supports the specific binding of influenza C viruses or coronary viruses to naturally or synthetically 9-N / O-acetylated sialic acids, which can be bound to carrier molecules the viral O-acetylesterase is detected enzymatically.
  • Carbohydrates, in particular complex carbohydrates, cells, tissues and any other biological material can serve as carrier molecules. It is also possible to detect or determine naturally occurring free 9-0-acetylated sialic acids and artificially synthesized 9-N-acetylated sialic acids.
  • the viruses be used as a unit, but it is also possible to use the viral glycoproteins in isolated or recombinant form.
  • the method according to the invention it is possible, for example, to detect the general presence of 9-N / O-acetylated sialic acids. It is also possible to quantitatively estimate the amount of receptors present.
  • substance identification with previous separation (for example by electrophoresis, thin-layer chromatography).
  • the method according to the invention utilizes two of the biological activities of the viral glycoprotein described above, namely on the one hand the specific binding of the viruses to carrier molecules, in particular complex carbohydrates, with 9-N / O-acetylated sialic acids via their hemagglutinin and on the other hand the Esterase activity of the bound viruses for their detection.
  • the influenza C viruses or coronary viruses are bound to the carrier molecules at a temperature at which the esterase is practically inactive. It is preferably carried out at a temperature of 2 to 6 ° C and in particular at about 4'C. One can also work at temperatures Tempera ⁇ , the above 6 * C are, for example up to 10 'C. However, the higher the temperature, the more active the esterase.
  • the carrier molecules carrying the sialic acids are preferably also immobilized on a carrier material. This is then washed thoroughly after the viruses have bound, so that all viruses that are not bound or are bound non-specifically are washed away.
  • a particularly synthetic esterase substrate is offered, for example 4-methylumbelliferyl acetate (MU-Ac) or ⁇ -naphthyl acetate.
  • MU-Ac 4-methylumbelliferyl acetate
  • ⁇ -naphthyl acetate a particularly synthetic esterase substrate
  • the temperature is raised to such values may be in which proceed the enzymatic reaction, for example at 37 "C or to room temperature. Only where viruses are attached, a fluorescence or a color reaction developed. Since the Viruspar ⁇ Tikel numerous Glykoproteinspikes on have an enhancement effect that cannot be achieved with isolated glycoproteins. The detachment of the viruses from their receptors due to the esterase activity no longer plays a role at this point in time. The virus remains trapped in the individual wells that are no longer washed.
  • the chromogenic substrate ⁇ -naphthyl acetate is preferably used, which is cleaved many times more quickly than any natural substrate by the viral esterase.
  • the free naphthol immediately reacts with diazonium ions to form an insoluble dye that precipitates where the viruses are bound.
  • the methods for detecting and / or quantifying the esterase-substrate reaction are otherwise known.
  • Influenza C viruses are preferably used in the method according to the invention, since their affinity for 9-O-acetyl-N-acetylneuraminic acid (eu5.9Ac2) is greater than that of coronary viruses.
  • the specificity of the influenza C virus hemagglutinin for 9-N / O-acetylated sialic acid could also be adequately secured with the aid of the method according to the invention.
  • saponification of the ester group means that virus binding is completely lost.
  • influenza C viruses recognize both gangliosides and glycoproteins as diverse as mucins (mucus), serum glycoproteins or membrane-bound glycoproteins, provided that they have 9-N / 0-acetylated ones Sialic acids.
  • a highly specific test for 9-N / O-acetylated sialic acids is thus provided, which can be bound to a variety of carrier molecules.
  • the bound virus is directly detected by its enzyme activity.
  • the viruses are not labeled by radioactive isotopes, bio-tin or digoxigenin.
  • the method according to the invention allows both a qualitative and a quantitative evaluation, quantitative being understood to mean both semi-quantitative and fully quantitative.
  • the sensitivity of the method according to the invention is extremely high. For example, with a 9-0-acetylated ganglioside (GDla) as the receptor, immobilized on polystyrene microtiter plates, with MU-Ac as substrate 20 pg (57 fmol) Neu ⁇ , 9Ac2 could be detected.
  • GDla 9-0-acetylated ganglioside
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • test system according to the invention can also be combined with antibodies or lectins.
  • process according to the invention is explained in more detail with reference to the following examples which describe preferred embodiments:
  • Microtiter plates Immo-Modules Maxisorp F8, Nunc, Roskilde, Denmark
  • Fluori eter 1000 M, Perkin-Elmer, Sprint, or a device for fluorescence measurement in microtiter plates.
  • Buffer (a) PBS, pH, 2 8.0 g * NaCl
  • Influenza C viruses eg strain Johannesbur (1/66) are grown and cleaned as described. The viruses are grown in fertilized chicken eggs at 33 ° C. and the allantoic fluid is removed after 3 days. The viruses are removed by differential centrifugation enriched in two steps, was added in PBS + 1% BSA, sterile-filtered and frozen at -70 'C until further use. Examination material:
  • Glycoproteins secreted glycoproteins such as mucus or plasma proteins are particularly suitable for immobilization on microtiter plates. These connections are easily accessible and can be removed from the patient during routine examinations (endoscopy, puncture). Fresh or freeze-dried material can be used for the test. For glycoproteins that have to be detached from the plasma membrane with the aid of detergents, nitrocellulose is more suitable as a carrier material (see below).
  • Gangliosides These glycolipids are components of the cytoplasmic membrane and are extracted from small tissue samples (approx. 1 g) with organic solvents.
  • Freeze-dried glycoproteins are dissolved in PBS and 100 ⁇ l of this solution are pipetted into each well.
  • the adhesion er ⁇ follows h overnight at 4 'C, or at room temperature for 1-2.
  • Ganglipsides are dissolved in methanol and 100 ⁇ l of this solution are added to each well. The solvent volatilizes at room temperature. Adherent growing cells (cell culture) are washed 3 times with PBS (test in small culture dishes).
  • Non-adherent cells are suspended at 1-2% in PBS and 100 ⁇ l each in those pretreated with poly-1-lysine
  • Positive controls eg rat serum, bovine submandibular mucin, bovine brain gangliosides.
  • Test 2 eg rat serum, bovine submandibular mucin, bovine brain gangliosides.
  • Cells or complex carbohydrates are not bound directly to the solid phase but with the aid of antibodies, lectins or cells which have not previously been adsorbed onto the carrier material and which themselves do not have 9-N / O-acetylated sialic acids
  • O-acetylated gangliosides on thin-layer plates using precipitating, chromogenic substrates (e.g. ⁇ -naphthyl acetate).
  • Thin-film panels e.g. B. HPTL silica gel plates on aluminum; 5 x 7.5 cm, layer thickness 0.2 mm (Merck, Darmstadt). Corresponding plates on glass or optionally cellulose plates can also be used.
  • Fixative 0.5% polyisobutyl ethacrylate in diethyl ether
  • step 1 Halve the thin-layer plate with samples carried in parallel after step 2. One half is sprayed with orcinol reagent and so all sialic acid-containing compounds are made visible; the other half is described in step 3-10.

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Description

Verfahren zur Dete tion und/oder quantitativen Bestimmung von 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung von 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren, δ die an Trägermoleküle gebunden sind. Bei den Trägermolekülen kann es sich um Kohlenhydrate, insbesondere komplexe Kohlenhy¬ drate, Zellen, Gewebe oder andere biologische Materialien han¬ deln. Die Sialinsäuren können synthetisch oder natürlich 9- N/O-acetyliert sein.
Die Neuraminsäure ist als N- und O-acetylierte Verbindung weit verbreitet. Es gibt etwa ca. 30 Abkömmlinge, die man zusammen¬ fassend als Sialinsäuren bezeichnet, die Bestandteil vieler bakterieller und tierischer Glykolipide und Glykoproteine sind. Sialinsäuren kommen im menschlichen Körper überall vor, insbesondere im Blut, in schleimigen Absonderungen (Mucinen) und in Zellmembranen. Sie überziehen als Bestandteil von Gly- koproteinen und Glykolipiden alle Zellen höherer Tiere und des Menschen mit einer elektronegativen Schicht und haben dort vielfältige biologische Funktionen. Einige dieser Funktionen stehen im engen Zusammenhang mit bestimmten Modifikationen der N-Acetylneuraminsäure, insbesondere mit ihrer häufig in der Natur vorkommenden Veresterung mit Essigsäure an der Position 9 { 9-O-Acetylierun ) . Als Beispiel hierfür kann man nennen: Schutz gegenüber Sialidaseeinwirkun ; Vermittlung der Bindung von Influenza-C-Viren und Coronarviren an ihren Wirtszellen; Maskierung der Rezeptoren für Influenza-A- und B-Viren; Anti- genität von bakteriellen Kapseln. Ferner ist bekannt, daß das 9-O-acetylierte Gangliosid GD3 ein Tumormarker beim malignen Melanom des Menschen ist. Beim Mamma-Karzinom des Menschen wurde eine vermehrte Bildung von Neuδ, 9Ac2 auf T-Lymphozyten festgestellt. Änderungen gibt es auch während der Entwicklung von Gehirn und anderen Geweben und Zellen von Säugetieren. Bei Tumoren des menschlichen Dickdarms ist die 9-O-Acetylierung verringert. Auch gibt es Lektine mit einer Spezifität für 9-0- acetylierte Sialinsäuren.
Es besteht daher ein Bedürfnis danach, Sialinsäuren und insbe¬ sondere 9-0-acetylierte Sialinsäuren erkennen oder bestimmen zu können, um aus den erhaltenen Daten beispielsweise schlie- ßen zu können, ob eine Tumorerkrankung vorliegt oder nicht.
Gängige Methoden zur Untersuchung von Sialinsäuren in biologi¬ schen Materialien beruhen noch heute weitgehend auf chemisch¬ analytischen Verfahren. Die meisten dieser Methoden machen eε notwendig, die Sialinsäure entweder enzymatisch oder chemisch von den Trägermolekülen, beispielsweise komplexen Kohlenhydra¬ ten, abzuspalten und zu reinigen. Es kann dann das Problem auftreten, daß die Sialinsäuren nur unvollständig abgespalten werden. Auch kann die labile Acetylgruppe zerstört werden. Für viele dieser Methoden sind im übrigen erhebliche Materialmen- gen erforderlich. Die Bedeutung der 9-0-acetylierten Sialin¬ säuren, insbesondere die veränderte Biosynthese bei verschie¬ denen Tumorarten, macht daher die Bereitstellung neuer, die genannten Nachteile vermeidender Analysenverfahren erforder¬ lich.
Es ist bekannt, daß sich Influenza-C-Viren an 9-O-acetylierte Sialinsäuren binden können.
Diese Influenza-C-Viren infizieren im übrigen die oberen Atem¬ wege des Menschen und verursachen bei Kindern bis zum 10. Le¬ bensjahr leichte fiebrige Infekte. Ältere Personen sind auf- grund hoher Antikörpertiter im Blut gegenüber Infektionen mir Influenza-C-Viren weitgehend geschützt, so daß keine aufwendi¬ gen Schutzmaßnahmen für die Arbeit mit diesen Viren erforder¬ lich sind. Die Influenza-C-Viren können in bestimmten Zellkulturen oder in befruchteten Hühnereiern relativ leicht vermehrt werden. Die damit im Zusammenhang stehenden Arbeitsweisen bzw. Ar¬ beitstechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Bei diesen Visen handelt es sich um allgemein zugängliche Viren.
Die Influenza-C-Viren sind von einer Membranhülle umgeben, in welcher mehrere Kopien eines viralen Glykoproteins in Form so¬ genannter "Spikes" verankert sind. Auf diesem Glykoprotein sind drei voneinander unabhängige Aktivitäten lokalisiert, die bei der Infektion der Wirtszellen eine wichtige Rolle spielen. Es handelt sich dabei zum einen um das Hämagglutinin, welches einen Abschnitt auf dem Molekül mit Lektincharakter darstellt. Das Hämagglutinin erkennt spezifisch 9-N/O-acetylierte Sialin¬ säuren als Rezeptordeterminanten und vermittelt die Bindung der Viren an ihre Wirtszellen. Eine andere Aktivität ist die Sialat 9-0-Acetylesterase . Es handelt sich dabei um ein Enzym, das die Rezeptoren zerstört, indem es die 9-O-Acetylgruppen, nicht jedoch die 9-N-Acetylgruppen von den Sialinsäuren ab¬ spaltet. Eine weitere Aktivität ist die Fusionsaktivität, die im Rahmen der vorstehenden Betrachtungen jedoch keine ent¬ scheidende Rolle spielt.
Ähnliche Verhältnisse werden auch bei verschiedenen Coronarvi- ren gefunden, die ebenfalls 9-O-acetylierte Sialinsäuren als Rezeptordeterminante benutzen und ein O-Acetylesterase besit- zen. Auch hier sind Hämagglutinin und Esterase zwei Aktivitä¬ ten eines Glykoproteins.
Es ist auch schon versucht worden, Influenza-C-Viren als "analytisches Instrument" zur Detektion bzw. Bestimmung von 9- O-acetylierten Sialinsäuren einzusetzen. Dabei taucht jedoch das Problem auf, daß die virale Esterase die Virusbindung wie¬ der aufhebt, indem es die 9-O-Acetylgruppen abspaltet. Es wurde daher auch schon versucht, die Esteraseaktivität der In- fluenza-C-Viren mit dem hochtoxischen Esterasehemmer Diisopro- pylfluorophosphat (DFP) spezifisch zu hemmen, um die Bindung von mit Biotin markierten Viren an rote Blutkörperchen der Maus mit Avidinkonjugaten nachzuweisen, man vergleiche E. A. Muchmore et al. , Science 236 (1987), S. 1293 - 1295.. Eine derartige Vorgehensweise hat unter anderem den Nachteil, daß Biotin von sich aus bereits in biologischen Materialien vorkommt, wodurch die Zuverlässigkeit der gewonnenen analytischen Daten beeinträchtigt wird. Außerdem kann die chemische Modifikation der Viren mit Biotin deren Bindungseigenschaften unkontrolliert beeinflussen oder sogar aufheben.
A. Garchia-Sastre et al. , Biochem. J. 273 (1991) 435 - 441 beschreiben die enzymatische Charakterisierung der Sialat O-Acetylesterase aus Influenza C Virus und die Spezifität gegenüber O-acetylierten Substanzen. .Bei diesen Substanzen handelt es sich jedoch nicht um Sialinsäuren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung von an Trägermoleküle gebundenen 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Lehre des Anspruchs 1.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein biologisches Testsy¬ stem dar, das die spezifische Bindung von Influenza-C-Viren oder Coronarviren an natürlich oder synthetisch 9-N/O-acety- lierte Sialinsäuren, die an Trägermoleküle gebunden sein kön¬ nen, direkt mit Hilfe der viralen O-Acetylesterase enzy atisch nachweist. Als Trägermoleküle können dabei Kohlenhydrate, ins¬ besondere komplexe Kohlenhydrate, Zellen, Gewebe und jedes an¬ dere beliebige biologische Material dienen. Es ist auch mög¬ lich, in der Natur vorkommende frei 9-0-acetylierte Sialinsäu¬ ren sowie künstlich synthetisierte 9-N-acetylierte Sialinsäu- ren zu detektieren bzw. zu bestimmen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur die Viren als Einheit eingesetzt werden, sondern es ist auch möglich, die viralen Glykoproteine in isolierter oder rekombinanter Form zur Anwendung zu bringen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es beispielsweise mög¬ lich, das generelle Vorkommen 9-N/O-acetylierter Sialinsäuren nachzuweisen. Ferner ist es möglich, die Menge der vorhandenen Rezeptoren quantitativ abzuschätzen. Eine weitere Anwendungs- möglichkeit ist die Substanzidentiiizierung bei vorhergehender Auftrennung (beispielsweise durch Elektrophorese, Dünnschicht¬ chromatographie).
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Da¬ ten ermöglichen Rückschlüsse beispielsweise darüber, ob eine Tumorerkrankung vorliegt oder nicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt zwei der oben geschilder¬ ten biologischen Aktivitäten des viralen Glykoproteins aus, nämlich einerseits die spezifische Bindung der Viren an Trä- germoleküle, insbesondere komplexe Kohlenhydrate, mit 9-N/O- acetylierten Sialinsäuren über ihr Hämagglutinin und anderer¬ seits die Esteraseaktivität der gebundenen Viren zu deren Nachweis.
Es ist als äußerst überraschend anzusehen, daß es möglich ist, die Esteraseaktivität der gebundenen Viren' zu deren Nachweis einsetzen zu können, denn diese Esterase würde normalerweise die Virusbindung wieder aufheben, indem es die 9-O-Acetylgrup- pen abspaltet. Dieses Problem der Rezeptorzerstörung durch dieses Enzym wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die bei¬ den Aktivitäten, nämlich Hämagglutinin und Esterase, zeitlich getrennt bei verschiedenen Temperaturen aktiv sind. Daher ist es auch nicht erforderlich, wie dies im Stand der Technik be¬ schrieben ist, die Esterase zu hemmen. Vielmehr kann ihre Ak¬ tivität für die Detektion der gebundenen Viren genutzt werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Bindung der In- fluenza-C-Viren bzw. Coronarviren an die Trägermoleküle bei einer Temperatur, bei der die Esterase praktisch inaktiv ist. Man arbeitet dabei vorzugsweise bei einer Temperatur von 2 bis 6°C und insbesondere bei etwa 4'C. Man kann auch bei Tempera¬ turen arbeiten, die oberhalb von 6*C liegen, z.B. bis zu 10 'C. Jedoch wird die Esterase umso aktiver, je höher die Temperatur ist. Vorzugsweise immobilisiert man außerdem die die Sialinsäuren tragenden Trägermoleküle an einem Trägermaterial. Dieses wäscht man dann nach der Bindung der Viren gründlich, so daß alle nicht oder unspezifisch gebundenen Viren fortgespült wer- den.
Im zweiten Schritt des er indungsgmeäßen Verfahrens bietet man ein insbesondere synthetisches Esterasesubstrat an, zum Bei¬ spiel 4-Methylumbelliferyl-Acetat (MU-Ac) oder α-Naphthyl-Ace- tat. Außerdem erhöht man die Temperatur auf solche Werte, bei denen die Enzymreaktion ablaufen kann, z.B. auf 37"C oder auf Raumtemperatur. Nur dort, wo Viren gebunden sind, entwickelt sich eine Fluoreszenz bzw. eine Farbreaktion. Da die Viruspar¬ tikel zahlreiche Glykoproteinspikes auf ihrer Oberfläche be¬ sitzen, kommt es auf diese Weise zu einem Verstärkereffekt, der mit isolierten Glykoproteinen nicht zu erzielen ist. Die Loslösung der Viren von ihren Rezeptoren aufgrund der Esteraseaktivität spielt zu diesem Zeitpunkt keine Rolle mehr. Wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise in Mikroti- terplatten ausgeführt, dann bleiben die Viren in den einzelnen Vertiefungen gefangen, die nicht mehr gewaschen werden.
Benutzt man als Trägermaterialien Nitrocellulose-Membranen öder Dünnschichtplatten, dann verwendet man vorzugsweise das chromogene Substrat α-Naphthyl-Acetat, welches durch die vi¬ rale Esterase um ein Vielfaches schneller gespalten wird als jedes natürliche Substrat. Das freie Naphthol reagiert, sofort mit Diazoniumionen zu einem unlöslichen Farbstoff weiter, der unmittelbar dort ausfällt, wo die Viren gebunden sind. Die Verfahren zur Detektion und/oder zur Quantifizierung der Esterase-Substrat-Reaktion sind im übrigen bekannt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Influ- enza-C-Viren eingesetzt, da ihre Affinität zu 9-O-Acetyl-N- Acetylneuraminsäure ( eu5,9Ac2 ) größer ist als die von Co- ronarviren. Die Spezifität des Influenza-C-Virus Hämaggluti- nins für 9-N/O-acetylierte Sialinsäure konnte mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens im übrigen hinreichend abgesi¬ chert werden. Zum Beispiel hat eine Verseifung' des Estergruppe zur Folge, daß die Virusbindung vollständig verlorengeht. Estergruppen an anderen Positionen der N-Acetylneuraminsäure , wie etwa an der Position 4 oder 7., können dagegen keine Virus¬ bindung bewirken. Dieser einzigartigen Spezifität steht eine bemerkenswerte Vielfalt gegenüber, denn Influenza-C-Viren er- kennen sowohl Ganglioside als auch so unterschiedliche Glyko- proteine wie Mucine (Schleime), Serumglykoproteine oder mem¬ brangebundene Glykoproteine, vorausgesetzt sie besitzen 9-N/0- acetylierte Sialinsäuren.
Erfindungsgemäß wird somit ein hochspezifischer Test für 9- N/O-acetylierte Sialinsäuren bereitgestellt, welche an eine Vielfalt von Trägermolekülen gebunden sein können. Das gebun¬ dene Virus wird durch seine Enzymäktivität direkt nachgewie¬ sen. Eine Markierung der Viren durch radioaktive Isotope, Bio¬ tin oder Digoxigenin entfällt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Auswertung, wobei unter quantitativ sowohl semi-quantitativ als auch voll-quantitativ verstanden wird. Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahren ist außerordentlich hoch. So konnten beispielsweise mit einem 9-0- acetylierten Gangliosid (GDla) als Rezeptor, immobilisiert auf Polystyrol-Mikrotiterplatten, mit MU-Ac als Substrat noch 20 pg (57 fmol) Neuδ , 9Ac2 nachgewiesen werden.
Zudem können unterschiedliche Träg'ermaterialien, wie Mikroti- terplatten ( Polystyrol , PVC ) , Nitrocellulose , Dünnschichtplat- ten (Kieselgel, Cellulose ) , eingesetzt werden. Ferner können Gewebedünnschnitte (z.B. histologische Schnitte) zur Anwendung gebracht werden. In letzterem Fall kann man somit Gewebe, das die hier in Rede stehenden Sialinsäuren aufweist, direkt ein¬ setzen bzw. untersuchen. Die sialinsäurehaltigen Trägermole- küle müssen nicht erst an einem "künstlichen" Trägermaterial immobilisiert werden. Das Gewebe selbst stellt somit das Trä¬ germaterial dar.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und schnell durch¬ führbar. Das erfindungsgemäße Testsystem kann auch mit Anti- körpern oder Lektinen kombiniert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden, be¬ vorzugte Ausführungen beschreibenden Beispiele näher erläu¬ tert:
Beispiele
Test 1:
Immobilisierung von Glykoproteinen, Gangliosiden oder Zellen auf Mikrotiterplatten. Nachweis des gebundenen Virus mit einem fluorigenen Substrat (z.B. MU-Ac) .
Materialien
Mikrotiterplatten: Immo-Module Maxisorp F8, Fa. Nunc, Ros- kilde, Dänemark
Fluori eter: 1000 M, Perkin-Elmer, Überlingen, oder ein Gerät für die Fluoreszenzmessung in MikrotiterpTatten.
Puffer: (a) PBS, pH , 2 8,0 g* NaCl
0,2 g KC1
1,15 g Na2HPθ4 x 2 H2O
0.2 g KH2PO4 ad 1 1, aq.bidest.
(b) Blockierungspuffer PBS + 1 % (2 % ) Rinderserumalbumin IPBS/BSA)
(c) Waschpuffer PBS + 0,05 % Tween 20 (PBS/Tween)
(d) Substrat 60 μm Mü-Ac in PBS
Influenza-C-Viren:
Influenza-C-Viren (z.B. Stamm Johannesbur ( 1/66 ) werden ange¬ zogen und gereinigt wie beschrieben. Die Viren werden in be¬ fruchteten Hühnereiern bei 33 C angezogen und die Allantois- flüssigkeit nach 3 Tagen entnommen. Die Viren werden durch Differentialzentrifugation in zwei Schritten angereichert, in PBS + 1 % BSA aufgenommen, sterilfiltriert und bei -70' C bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Untersuchungsmaterial :
Glykoproteine; Für die Immobilisierung auf Mikrotiterplatten eignen sich besonders sezernierte Glykoproteine wie etwa Schleime (Muzine) oder Plasmaproteine. Diese Verbindungen sind leicht zugänglich und können dem Patienten bei Routineuntersu¬ chungen (Endoskopie, Punktion) entnommen werden. Für den Test kann frisches oder gefriergetrocknetes Material eingesetzt werden. Für Glykoproteine, die mit Hilfe von Detergenzien aus Plasmamembran herausgelöst werden müssen, ist Nitrocellulose als Trägermaterial (siehe unten) besser geeignet.
Ganglioside: Diese Glykolipide sind Bestandteile der Cytoplas- mamembran und werden aus kleinen Gewebeprofen (ca. 1 g) mit organischen Lösungsmitteln extrahiert.
Zellen: - Kulturen - - Gewinnung aus Blut, Trennung verschiedener
Zellpopulationen mit Dichtegradienten- Zentrifugation, Adhärenzverhalten usw. - Gewinnung aus Gewebe, mechanisch, enzymatisch
Vorgehen
1. Beschichten der Platten:
Gefriergetrocknete Glykoproteine werden in PBS gelöst und 100 μl dieser Lösung in jeden Napf pipettiert. Die Adhäsion er¬ folgt über Nacht bei 4'C oder bei Raumtemperatur während 1-2 h.
Ganglipside werden in Mehtanol gelöst und 100 μl dieser Lösung in jeden Napf gegeben. Das Lösungsmittel werflüchtigt sich beim Raumtemperatur. Adhärierend wachsende Zellen (Zellkultur) werden 3 x mit PBS gewaschen (Test in kleinen Kulturschalen).
Nicht-adhärierende Zellen werden zu 1-2 % in PBS suspendiert und jeweils 100 μl in die mit Poly-1-Lysin vorbehandelten
Näpfe gegeben. Nach 30 bis 45 min bei 37*C wird die Platte 3 x mit PBS gewaschen. 2. Entfernen des Puffers durch Ausschlagen der Platten. Dieser Schritt entfällt bei Gangliosiden und Zellen.
3. Blockieren noch freier Bindungsstellen auf der Platte mit PBS/1 % BSA (200 μl/Napf) während 1 h Inkubation bei Raumtem- δ peratur (Ganglioside: 2 % BSA).
4. 2 x Waschen der Platte mit PBS/Tween (200 μl/Napf), für Zellen und Ganglioside wird nur PBS verwendet.
5. Zugabe einer Virussuspension in PBS (100 μl/Napf) mit einer Acetylesteraseaktivität von 10 mU/ml, Inkubation für 1 h bei 4'C.
6. 3 x Waschen (vgl. 4. )
7. Zugabe von jeweils 100 μl Substratlösun , Inkubation für 45 min bei 37'C.
8. Stoppen der Reaktion mit jeweils 100 μl Ethanol abs.
9. Messung der Fluoreszenz:
Transfer der Lösungen in Eppendorf-Reaktionsgefäße, Zugabe von 800 μl H2O, Messen gegen Kontrolle 1 im Fluorimeter (Anregung: 365 nm, Emission; 450 nm).
Kontrollen:
1. Inkubation der immobilisierten komplexen Kohlenhydrate mit PBS statt mit Influenza-C-Viren (vgl. δ. ) - Detektion von nicht-viralen Esterasen im biologischen Material.
2. Durchführung des Tests mit verseiften komplexen Kohlenhy¬ draten (0,2 N NaOH, 1 h, 2δ"C, Entsalzen) oder mit Zellen, die mit isolierter 9-0-Acetylesterase behandelt und anschließend gewaschen wurden.
3. Inkubation von Substratpuffer bei 37"C - Überprüfen des nicht-enzymatischen Zerfalls des Substrates.
4. Positive Kontrollen (komplexe Kohlenhydrate mit bekannter- weise 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren): z.B. Rattenserum, Rin- dersubmandibularmuzin, Rinderhirnganglioside. Test 2 :
Zellen oder komplexe Kohlenhydrate werden nicht direkt an die fest Phase gebunden sondern mit Hilfe von vorher an das Trä¬ germaterial adsorbierten Antikörpern, Lektinen oder Zellen, die selber keine 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren besitzen
(Negativkontrolle nach Test 1 erforderlich). Der Nachweis der 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren auf den so gebundenen komple¬ xen Kohlenhydraten oder Zellen erfolgt dann wie in Test 1 be¬ schrieben.
Test 3:
Nachweis von O-acetylierten Gangliosiden auf Dünnschichtplat¬ ten unter Verwendung präzipitierender, chromogener Substrate (z.B. α-Naphthyl-Acetat ) .
Materialien (vgl. auch Test 1)
Densitometer: CD 60, Desaga, Heidelberg
Dünnschichtplatten: z. B. HPTL-Kieselgel-Platten auf Aluminium; 5 x 7,5 cm, Schichtdicke 0,2 mm (Merck, Darmstadt). Es können auch entsprechende Platten auf Glas oder gegebenenfalls Cellulose-Platten verwendet werden.
Fixativ: 0,5 % Polyisobutyl ethacrylat in Diethylether
Substrat: ImM α-Naphthyl-Acetat in PBS + 0,1 % 2-Amino-δ- Chlortoluol x ZnCl2 , filtriert
Vorgehen
1. Dünnschichtchromatographische Auftrennung eines Lipidex- traktes aus 1 g frischem Gewebe (Laufmittel z.B. Chloro- form/Methanol/0,02 % CaCl2 x 2 H2O).
2. Trocknen der Platte
3. Eintauchen der Platte in das Fixativ für 2 min bei Raumtem¬ peratur.
4. Trocknen der Platte. 5. Eintauchen in PBS/1 % BSA für 60 min bei Raumtemperatur, leicht Schütteln.
6. Eintauchen in Influenza-C-Virussuspension (PBS/0,5 % BSA) mit einer Acetylesterase-Aktivität von mindestens 10 mü/ml oder Au"*ftropfen der Virussuspension sowie Abdecken mit
Parafilm und Inkubieren für 60 min bei 4*C, leicht Schütteln.
7. Waschen der Platte, 3 x je 3 min in PBS/Tween bei 4"C.
8. Inkubieren der Platte mir Substratlösung für 30 bis 45 min bei Raumtemperatur.
9. Stoppen der Raumtemperatur durch Eintauchen der Platte in H2θ bei 4'C und anschließendem Trocknen.
10. Quantifizierung der Farbreaktion mit dem Densitometer
Kontrollen:
1. Halbierung der Dünnschichtplatte mit parallel auf etragenen Proben nach Schritt 2. Eine Hälfte wird mit Orcinol-Reagenz eingesprüht und so alle sialinsäurehaltigen Verbindungen sichtbar -gemacht, mit der anderen Hälfte wird in Schritt 3-10 beschrieben verfahren.
2. Verseifung einer Parallelen mit NH3.
3. Bekannte O-acetylierte Ganglioside als Standards.
Weitere Anwendungen
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von gebundenen Influenza-C-Viren über ihre Esteraseaktivität ist in analoger Weise auch auf andere Systeme anwendbar:
- Immobilisierung von Glykoproteinen auf Nitrocellulosemembra- nen, entweder direkt ( "dot-blot" ) oder nach Auftrennung im SDS-Polyacrylamidgel ( "western-blot" ) .
- Nachweis von Zellen mit 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren im Gewebedünnschnitt. - Markierung von biologischen Sonden wie z.B. Antikörpern oder Lektinen mit 9-N/O-acetylierten S.ialinsäuren oder Analogen da¬ von (z.B. 9-N-Acetyl-Neu5Ac ) . Detektion der Bindung dieser Sonden an ihre Liganden mit dem oben beschriebenen Prinzip.

Claims

.-m-PATENTA SPRÜCHE
1. Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmun von 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren, die an Trägermole- küle (Kohlenhydrate, insbesondere komplexe Kohlenhydrate Zellen, Geweben oder andere biologische Materialien) ge¬ bunden sein können, wobei man a) die sialinsäurehaltigen Trägermoleküle mit Viren, die sich an die 9-N/O-acetylierten Sialinsäure spezifisch binden können und über eine Esteraseaktivität zur Abspal tung der 9-0-Acetylgruppe der Sialinsäuren verfügen, bei einer Temperatur, bei der die Esteraseaktivität praktisc nicht aktiv ist, zur Reaktion bringt, b) zu den in Stufe a) erhaltenen sialinsäurehaltigen Trä germolekülen mit den darin gebundenen Viren ein Substrat für die virale Esterase hinzugibt und die Temperatur so weit erhöht, daß die Esterase mit dem hinzugegebenen Sub strat reagiert, und c) die Esterase-Substrat-Reaktion detektiert und/oder quantifiziert.
2. Ver ahren nach Anspruch 1,
•dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man als Viren Influenza-C-Viren einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Stufe a) bei 2 bis 6' C, insbesondere bei etwa 4" C durchführt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Temperatur in Stufe b) auf Raumtemperatur bis zu 37° C erhöht.
5 δ. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man die sialinsäurehaltigen Trägermoleküle vor der Durchführung der Stufe a) an einem Trägermaterial immobi¬ lisiert.
10 6. Verfahren nach Anspruch δ, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man das Trägermaterial zur Entfernung aller nicht oder unspezifisch gebundenen Viren vor der Durchführung der Stufe b) gründlich wäscht bzw. spült.
lδ
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man als Trägermaterial Mikrotiterplatten, Nitrocellu- lose-Membranen oder Dünnschichtplatten einsetzt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 0 dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man Gewebeschnitte einsetzt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß man als Substrat für die Esterase ein synthe- δ tisches Substrat, insbesondere 4-Methylumbelliferyl-Ace- tat (Mu-Ac) oder α-Naphthyl-Acetat einsetzt.
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