EP0663838A1 - Stabile hochkonzentrierte formulierungen von fluoresceinderivaten - Google Patents

Stabile hochkonzentrierte formulierungen von fluoresceinderivaten

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EP0663838A1
EP0663838A1 EP93919243A EP93919243A EP0663838A1 EP 0663838 A1 EP0663838 A1 EP 0663838A1 EP 93919243 A EP93919243 A EP 93919243A EP 93919243 A EP93919243 A EP 93919243A EP 0663838 A1 EP0663838 A1 EP 0663838A1
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EP
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fluorescein
cyclodextrin
hydroxypropyl
solution
diacetate
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EP93919243A
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Gyoergy Lajos Kis
Ernst Dieter Wachsmuth
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Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
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Filing date
Publication date
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    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the fluorescein diester is contained in the solutions according to the invention in particular in a concentration of up to about 200 micromol / 1 (200 ⁇ mol / 1), preferably in a concentration of about 40 to about 200 micromol / 1, in particular in a concentration of up to about 100 micromol / 1, and most preferably at a concentration of about 60 to about 100 micromol / 1.
  • partially etherified ⁇ -cyclodextrins are used which, in addition to the hydroxyalkyl radicals, can also contain alkyl radicals, namely methyl or ethyl radicals, up to a degree of substitution of 0.05 to 2.0, preferably 0.2 to 1.5.
  • the degree of substitution for the alkyl radicals is particularly preferably from about 0.5 to about 1.2.
  • the solubility of the fluorescein diesters is increased in particular by the fact that form the etherified ß-cyclodextrins inclusion compounds.
  • the partially etherified ⁇ -cyclodextrins are therefore contained in the formulations according to the invention in an amount which ensures that the amount of fluorescein diester used is completely dissolved.
  • the partially etherified ⁇ -cyclodextrins in the formulations according to the invention are preferably present in an amount of about 1 to about 20 percent by weight, particularly preferably in an amount of about 5 to about 12 percent by weight.
  • the invention relates to a solution containing a fluorescein din-lower alkyl ester and a partially etherified ⁇ -cyclodextrin, the ether substituents of which are hydroxypropyl groups.
  • the present invention also relates to a dry formulation comprising a fluorescein din-lower alkyl ester and a partially etherified ⁇ -cyclodextrin, the ether substituents of which are hydroxyethyl, hydroxypropyl or dihydroxypropyl groups.
  • non-ionic tonicity enhancers such as e.g. Urea, glycerin, sorbitol, mannitol, aminoethanol or propylene glycol.
  • ionic tonicity enhancers such as sodium chloride are rather unsuitable in connection with this invention.
  • a tonicity enhancer is contained in the solutions according to the invention in an amount which leads to the formation of an approximately isotonic solution.
  • An approximately isotonic solution is understood here to mean a solution that has an osmolarity of approximately 300 milliosmol (mOsm), i.e. 300 ⁇ 10% mOsm. It should be noted that all components of the solution contribute to osmolarity.
  • the non-ionic tonicity enhancers, if present, are added in customary amounts, ie in particular in amounts of about 1 to about 3.5 percent by weight, preferably in amounts of about 1.5 to about 3 percent by weight.
  • Suitable acids are, for example, ganic mono- or dicarboxylic acids such as acetic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid or propionic acid, or inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid.
  • ganic mono- or dicarboxylic acids such as acetic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid or propionic acid, or inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid.
  • a solvent is not absolutely necessary in the finished solution according to the invention. However, it does an excellent job in making the solutions.
  • a solution of the fluorescein diester in a solvent is advantageously mixed with an aqueous solution of the ⁇ -cyclodextrin derivative.
  • the solvent can be removed again after mixing the aqueous ⁇ -cyclodextrin phase and the solvent phase containing the fluorescein diester, for example by gentle evaporation or by lyophilization.
  • the solvent can remain in the solution, preferably if it is ophthalmologically acceptable.
  • Suitable solvents are polar organic aprotic solvents, e.g. Ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide or acetone.
  • Solvents, if present in the solutions according to the invention are used in amounts of up to 5 percent by weight, preferably in amounts of up to 1 percent by weight.
  • Thickeners can also be added to the solutions according to the invention in customary amounts, such as, for example, organic cellulose ethers, e.g. Hydroxypropyl methyl cellulose, or hyaluronic acid salts such as hyaluronic acid sodium salt. Common buffers can also be added in customary amounts.
  • organic cellulose ethers e.g. Hydroxypropyl methyl cellulose
  • hyaluronic acid salts such as hyaluronic acid sodium salt.
  • Common buffers can also be added in customary amounts.
  • the solution according to the invention can be stored in the frozen state (unchanged after 3 months of storage). In the fridge, i.e. at about 8 ° C, it is stable for at least 3 months, at room temperature about 2 to 3 weeks.
  • Another object of the invention relates to the use of the solution according to the invention in the photodynamic therapy of living cells, in particular in the prophylaxis of secondary cataracts.
  • Fluorescein diacetate has already been mentioned in connection with therapeutic methods.
  • EP-A-279.757 contains the teaching, i.a. Use fluorescein diacetate in the selective destruction of transformed cells or tumor cells.
  • a substance such as fluorescein diacetate is introduced into tumor cells by microinjection. The tumor cells are killed by subsequent irradiation.
  • EP-A-279.757 does not contain any concrete information on the type and concentration of the solution of fluorescein diacetate to be used. Neither is there any indication of an application in the prophylaxis of secondary cataracts.
  • Methocel E4M 40.00 g are dissolved in 960.00 g of water (aqua ad iniectabilia). The solution is autoclaved. The two solutions are mixed in a ratio of 1: 1. In this way, a solution with a pH of 4.5 ⁇ 0.3 and an osmolarity of about 300 mOsmol / kg is obtained.
  • the intracellular fluorescein concentration is 0.004 to 0.005 mmol / 1 after 0.01 mmol 1 FDA, 0.007 to 0.009 mmol / 1 after 0.02 mmol / 1 FDA and 0.019 mmol / 1 after 0.04 mmol / 1 FDA.
  • Example 8 The cytotoxic effect of the irradiation of intracellular fluorescein with 488 nm laser light (argon) is investigated in vivo on the cornea of the rabbit eye. For this purpose, the Comea is dripped with FDA solution for 10 minutes, washed with physiological saline, then the radiation is carried out.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft stabile hochkonzentrierte Formulierungen von bestimmten Fluoresceinderivaten, die Herstellung dieser Formulierungen und deren Verwendung, insbesondere bei der photodynamischen Therapie von sekundärer Katarakt. Die vorliegende Erfindung betrifft in erster Linie eine wässrige Lösung enthaltend einen Fluorescein-diester, insbesondere einen Fluorescein-diniederalkylester, vor allem Fluorescein-diacetat, und ein partiell verethertes β-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind, wobei ein Teil der Ethersubstituenten gegebenenfalls Methyl-oder Ethylgruppen sein können und wobei der β-Cyclodextrinether eine Wasserlöslichkeit von über 1,8 g in 100 ml Wasser aufweist, vor allem Hydroxypropyl-β-cyclodextrin.

Description

Stabile hochkonzentrierte Formulierungen von Fluoresceinderivaten
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile hochkonzentrierte Formulierungen, insbesonde¬ re Lösungen, von bestimmten Fluoresceinderivaten, die Herstellung dieser Formulierun¬ gen und deren Verwendung, insbesondere bei der photodynamischen Therapie, vor allem bei der Behandlung oder Vorbeugung von sekundärer Katarakt.
Bei den Fluoresceinderivaten handelt es sich um spezielle Diester von Fluorescein, bevor¬ zugt um Fluorescein-diacetat. Die erfindungsgemässen Formulierungen enthalten als Komponente, die das Herstellen von stabilen und hochkonzentrierten Lösungen der ge¬ nannten Fluoresceinderivate ermöglicht, spezielle Cyclodextrinderivate, insbesondere Hydroxypropyl- ß-cyclodextrin .
Aus der EP-A-149,197 sind bereits pharmazeutische Präparate von in Wasser schwerlösli¬ chen oder instabilen Arzneistoffen und Verfahren zu ihrer Herstellung bekannt. Unter an¬ derem wird auch Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin zur Verwendung mit Arzneistoffen wie Indomethacin oder Dexamethason vorgeschlagen.
Aus der EP-A-447,351 ist bereits bekannt, Fluorescein mit einem Cyclodextrin-sulfat zu komplexieren und in dieser Form als ophthalmologisches Reagens zur Verfügung zu stellen.
Demgegenüber sind Formulierungen enthaltend z.B. Fluorescein-diacetat und eine Ver¬ bindung vom Typ des Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin bisher nicht bekannt geworden. Ueberraschenderweise hat sich jedoch herausgestellt, dass derartige Formulierungen uner¬ wartete Vorteile gegenüber dem nächsten Stand der Technik bieten, insbesondere vor dem Hintergrund der Anwendung derartiger Formulierungen auf dem Gebiet der photodynami¬ schen Therapie bei sekundärer Katarakt. Die erfindungsgemässen Formulierungen erwei¬ sen sich nämlich z.B. als unerwartet stabil, ferner gelingt es mit den erfindungsgemässen Formulierungen erstmalig, ausreichend hohe Konzentrationen von Fluorescein-diacetat in Lösung zu bringen, die bei der photodynamischen Therapie, z.B. bei der Behandlung oder Vorbeugung von sekundärer Katarakt, erforderlich sind, um diese Therapie praktikabel zu machen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in erster Linie eine Formulierung, wie eine wässrige Lösung enthaltend einen Fluorescein-diester, insbesondere einen Fluorescein-di- niederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind, wobei ein Teil der Ethersubstituenten gegebenenfalls Methyl- oder Ethylgruppen sein können. Bevorzugt weist der der ß-Cyclodextrinether eine Wasserlöslichkeit von über 1,8 g in 100 ml Wasser auf. Die vorliegende Erfindung betrifft auch trockene Formulierungen enthaltend einen Fluorescein-diester, insbesondere einen Fluorescein-diniederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind, wobei ein Teil der Ethersubstituenten gegebenenfalls Methyl- oder Ethylgruppen sein können, aus denen die vorstehend beschriebenen Lösun¬ gen rekonstituiert werden können. Bevorzugt weist der ß-Cyclodextrinether eine Wasser¬ löslichkeit von über 1,8 g in 100 ml Wasser auf.
Der Begriff "Nieder" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Reste oder Gruppen mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit bis zu 4 Kohlenstoff¬ atomen.
Niederalkyl bedeutet Alkyl mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, und steht z.B. für Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, Butyl, tert. -Butyl, Pentyl oder 2,2-Dimethylpropyl.
Der Fluorescein-diester ist vorteilhafterweise ein ophthalmologisch annehmbarer Diester von Fluorescein. Geeignete Diester sind z.B. Fluorescein-diphosphat oder Fluorescein-di¬ niederalkylester, wie Fluorescein-diacetat, Fluorescein-dibutyrat oder Fluorescein-dipiva- lat. Der Fluorescein-diester kann auch ein gemischter Diester sein, z.B. ein Fluorescein - monophosphat-monoacetat, oder ein gemischtes Fluorescein-monoacetat-monobutyrat. Besonders bevorzugt ist Fluorescein-diacetat.
Der Fluorescein-diester ist in den erfindungsgemässen Lösungen insbesondere in einer Konzentration von bis zu etwa 200 Mikromol/1 (200 μMol/1) enthalten, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 40 bis etwa 200 Mikromol/1, insbesondere in einer Konzentration von bis zu etwa 100 Mikromol/1, und ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/1. Partiell veretherte ß-Cyclodextrine, deren Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxy¬ propyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind, wobei ein Teil der Ethersubstituenten gegebe¬ nenfalls Methyl- oder Ethylgruppen sein können und wobei der ß-Cyclodextrinether eine Wasserlöslichkeit von über 1,8 g in 100 ml Wasser aufweist, sind bereits in der EP-A- 149,197 beschrieben. Die erfindungsgemäss verwendeten ß-Cyclodextrinderivate sind vorteilhafterweise ophthalmologisch annehmbar und darüberhinaus nicht-toxisch.
ß-Cyclodextrin ist eine ringförmig aufgebaute Verbindung aus sieben Anhydroglucoseein- heiten. Sie wird auch als Cyclohepta-amylose bezeichnet. Jeder der sieben Glucoseringe enthält jeweils drei Hydroxygruppen, die verethert werden können. Die Hydroxygruppen befinden sich in 2-, 3- und 6-Stellung. Bei den partiell veretherten Cyclodextrinderivaten, die erfindungsgemäss eingesetzt werden, ist nur ein Teil dieser Hydroxygruppen mit den angegebenen Hydroxyalkylresten sowie gegebenenfalls ferner mit Methyl- oder Ethyl- resten verethert. Bei der Veretherung mit Hydroxyalkylresten, die durch Umsetzung mit den entsprechenden Alkylenoxiden erfolgen kann, wird der Substitutionsgrad als molarer Substitutionsgrad (MS) in Mol Alkylenoxid je Anhydroglucoseeinheit angegeben. Bei den erfindungsgemäss eingesetzten Hydroxyalkylethem von ß-Cyclodextrin beträgt der molare Substitutionsgrad insbesondere zwischen 0,05 und 10, vorzugsweise zwischen 0,2 und 2. Besonders bevorzugt ist ein molarer Substitutionsgrad von etwa 0,25 bis etwa 1.
In den erfindungsgemässen Formulierungen werden partiell veretherte ß-Cyclodextrine eingesetzt, die neben den Hydroxyalkylresten auch Alkylreste, nämlich Methyl- oder Ethylreste bis zu einem Substitutionsgrad von 0,05 bis 2,0, vorzugsweise 0,2 bis 1,5 ent¬ halten können. Besonders bevorzugt beträgt der Substitutionsgrad für die Alkylreste etwa 0,5 bis etwa 1,2.
Beispiele für die partiell veretherten ß-Cyclodextrine, die in den erfindungsgemässen For¬ mulierungen eingesetzt werden können, sind Hydroxyethyl-ß-cyclodextrin, Hydroxy¬ propyl-ß-cyclodextrin, Dihydroxypropyl-ß-cyclodextrin, Mischformen davon, also z.B. Hydroxyethyl-hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, und ferner Mischether mit Methyl- oder Ethylgruppen, wie z.B. Methyl-hydroxyethyl-ß-cyclodextrin, Methyl-hydroxypropyl- ß-cyclodextrin, Ethyl-hydroxyethyl-ß-cyclodextrin oder Ethyl-hydroxypropyl-ß-cyclo- dextrin. Besonders bevorzugt ist Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
Die Löslichkeit der Fluorescein-diester wird insbesondere dadurch erhöht, dass diese mit den veretherten ß-Cyclodextrinen Einschlussverbindungen bilden. Die partiell veretherten ß-Cyclodextrine sind daher in den erfindungsgemässen Formulierungen in einer Menge enthalten, die gewährleistet, dass die eingesetzte Menge Fluorescein-diester vollständig gelöst wird. Bevorzugt sind die partiell veretherten ß-Cyclodextrine in den erfindungsge¬ mässen Formulierungen in einer Menge von etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsprozent enthal¬ ten, besonders bevorzugt in einer Menge von etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer bevorzugten Ausführungsform eine Lö¬ sung enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclo¬ dextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropyl¬ gruppen sind.
Die Erfindung betrifft in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Lösung ent¬ haltend Fluorescein-diacetat, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersub¬ stituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind.
Die Erfindung betriftt in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Lösung ent¬ haltend einen Fluorescein-diniederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxypropylgruppen sind.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Lösung enthaltend etwa 40 bis etwa 200 Mikro- mol/1 Fluorescein-diacetat und etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsprozent Hydroxypropyl- ß-cyclodextrin. Besondes bevorzugt betrifft die Erfindung eine Lösung enthaltend etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/1 Fluorescein-diacetat und etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls eine trockene Formulierung enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind.
Die Erfindung betrifft in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine trockene Formulierung enthaltend Fluorescein-diacetat, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind. Die Erfindung betriftt in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine trockene For¬ mulierung enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxypropylgruppen sind.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine trockene Formulierung geeignet zur Rekonstitu- ierung einer Lösung enthaltend etwa 40 bis etwa 200 Mikromol/1 Fluorescein-diacetat und etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin. Besondes bevorzugt betrifft die Erfindung eine trockene Formulierung geeignet zur Rekonstituierung einer Lösung enthaltend etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/1 Fluorescein-diacetat und etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
Die erf ndungsgemässe wässrige Lösung kann zusätzlich zu den beiden genannten Be¬ standteilen weitere Bestandteile enthalten, z.B. Tonizitätsverstärker, den pH-Wert beein¬ flussende Substanzen, Lösungsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel oder Puffer.
Als Tonizitätsverstärker kommen insbesondere nicht-ionische Tonizitätsverstärker in Fra¬ ge, wie z.B. Harnstoff, Glycerin, Sorbit, Mannit, Aminoethanol oder Propylenglykol. Demgegenüber sind ionische Tonizitätsverstärker, wie Natriumchlorid, im Zusammen¬ hang mit dieser Erfindung eher ungeeignet. Ein Tonizitätsverstärker ist, soweit anwesend, in einer Menge in den erfindungsgemässen Lösungen enthalten, die dazu führt, dass eine annähernd isotone Lösung entsteht. Unter einer annähernd isotonen Lösung wird hier eine Lösung verstanden, die eine Osmolarität von etwa 300 Milliosmol (mOsm) aufweist, also z.B. 300 ± 10 % mOsm. Dabei ist zu berücksichtigen, dass alle Bestandteile der Lösung einen Beitrag zur Osmolarität leisten. Die nicht-ionischen Tonizitätsverstärker werden, so¬ weit anwesend, in üblichen Mengen zugesetzt, also insbesondere in Mengen von etwa 1 bis etwa 3,5 Gewichtsprozent, vorzugsweise in Mengen von etwa 1,5 bis etwa 3 Gewichts¬ prozent.
Als den pH- Wert beeinflussende Substanzen sind insbesondere Säuren geeignet. Es wurde nämlich gefunden, dass die Stabilität der erfindungsgemässen Lösungen überraschender¬ weise im Bereich von pH 4,5 bis 5 ausgesprochen hoch ist. Es gilt jedoch allgemein, dass die Hydrolyseneigung von beispielsweise Fluorescein-diacetat im sauren Bereich vermin¬ dert ist. Es wird daher mit Vorteil eine Säure in einer Menge zugesetzt, die geeignet ist, den pH- Wert der erfindungsgemässen Lösung auf einen Wert im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 einzustellen, bevorzugt auf einen Wert im Bereich von etwa 4 bis 5,5, und ganz be¬ sonders bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 4,5 bis 5. Geeignete Säuren sind z.B. or- ganische Mono- oder Dicarbonsäuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Weinsäure, Milch¬ säure oder Propionsäure, oder anorganische Säuren, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure.
Ein Lösungsmittel ist in der fertigen erfindungsgemässen Lösung nicht unbedingt erfor¬ derlich. Es leistet jedoch ausgezeichnete Dienste bei der Herstellung der Lösungen. So wird mit Vorteil eine Lösung des Fluorescein-diesters in einem Lösungsmittel mit einer wässrigen Lösung des ß-Cyclodextrinderivates gemischt. Das Lösungsmittel kann nach der Vermischung der wässrigen ß-Cyclodextrin-Phase und der den Fluorescein-diester ent¬ haltenden Lösungsmittelphase wieder entfernt werden, beispielsweise durch schonendes Eindampfen oder durch Lyophilisieren. Das Lösungsmittel kann jedoch in der Lösung ver¬ bleiben, vorzugsweise dann, wenn es ophthalmologisch annehmbar ist. Geeignete Lö¬ sungsmittel sind polare organische aprotische Lösungsmittel, z.B. Essigsäureethylester, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Aceton. Lösungsmittel, soweit in den erfin¬ dungsgemässen Lösungen vorhanden, werden in Mengen von bis zu 5 Gewichtprozent eingesetzt, bevorzugt in Mengen von bis zu 1 Gewichtsprozent.
Lösungsvermittler, wie z.B. Cremophor-Typen, insbesondere Cremophor RH 40, oder Tween-Typen oder andere gebräuchliche Lösungsvermittler können den erfindungsge¬ mässen Lösungen in üblichen Mengen zugesetzt werden.
Ebenfalls können den erfindungsgemässen Lösungen Verdickungsmittel in üblichen Men¬ gen zugesetzt werden, wie beispielsweise organische Celluloseether, z.B. Hydroxypropyl- methylcellulose, oder Hyaluronsäuresalze, wie Hyaluronsäurenatriumsalz. Auch ge¬ bräuchliche Puffer können in üblichen Mengen zugesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Lösung enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Di¬ hydroxypropylgruppen sind, einen nichtionischen Tonizitätsverstärker, eine Säure und ge- gebenfalls ein Lösungsmittel.
Die vorüegende Erfindung betrifft in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Lösung enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, ein partiell verethertes ß-Cyclo¬ dextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropyl¬ gruppen sind, Sorbit als nichtionischen Tonizitätsverstärker, Essigsäure als Säure und ge- gebenfalls Essigester als Lösungsmittel. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Fluores¬ cein-diniederalkylester um Fluorescein-diacetat und bei dem partiell veretherten ß-Cyclo¬ dextrin um Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
Ganz besonders bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung enthaltend a) etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/1 Fluorescein-diacetat, b) etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, c) Sorbit zur Einstellung einer Osmolarität von etwa 300 Milliosmol, d) Essigsäure zur Einstellung eines pH-Bereiches von etwa 4,5 bis 5 und e) gegebenenfalls Essigester in einer Menge von bis zu etwa 5 Gewichtsprozent.
Ebenfalls ganz besonders bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung eine trockene For¬ mulierung enthaltend a) etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/1 Fluorescein-diacetat, b) etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, c) Sorbit zur Einstellung einer Osmolarität von etwa 300 Milliosmol, wobei sich die Mengenangaben oder Konzenzentrationsangaben jeweils auf die zu rekon¬ stituierende wässrige Lösung beziehen.
Die Herstellung der erfindungsgemässen Lösungen erfolgt auf an sich bekannte Weise durch konventionelles Vermischen der Bestandteile. Vorteilhafterweise wird dabei ein Lö¬ sungsmittel, wie insbesondere Essigester, zur Auflösung des Fluorescein-diesters verwen¬ det. Der ß-Cyclodextrinether wird in Wasser dispergiert. Diese beiden Lösungen werden sodann miteinander vermischt. Die übrigen Komponenten können bereits in der wässrigen Lösung des ß-Cyclodextrinethers enthalten sein oder der vereinigten Lösung von wässri- ger Phase und Lösungsmittel-Phase nachträglich zugegeben werden. Das Lösungsmittel kann bei Bedarf wieder aus der Lösung entfernt werden, z.B. durch schonendes Ein¬ dampfen oder durch Lyophilisieren.
Die erfindungsgemässe Lösung ist in gefrorenem Zustand lagerfähig (nach 3 Monaten Lagerung unverändert). Im Kühlschrank, d.h. bei etwa 8°C, ist sie mindestens 3 Monate stabil, bei Raumtemperatur etwa 2 bis 3 Wochen.
Auch die Herstellung der erfindungsgemässen trockenen Formulierungen kann auf an sich bekannte Weise erfolgen, beispielsweise aus den erfindungsgemässen Lösungen. So lässt sich eine erfindungsgemässe Lösung schonend zur Trockene eindampfen, insbesondere nach Zugabe von Lösungsmitteln, die dem azeotropischen Wasserentzug dienen, bei¬ spielsweise einer Mischung von Toluol und Ethanol. Der so erhältliche Rückstand wird vorteilhafter Weise nachgetrocknet, z.B. einige Stunden in einem Trockenschrank. Der auf diese Weise gewinnbare Rückstand besteht im wesentlichen aus einem Hydroxypropyl- ß-cyclodextrin-Fluorescein-diacetat- Komplex sowie, falls in der verwendeten erfindungs¬ gemässen Lösung vorhanden, aus dem Isotonisierungsmittel, beispielsweise Sorbit.
Erfindungsgemässe trockene Formulierungen sind lagerfähig. Aus diesen lassen sich ohne weiteren Zusatz von organischen Lösungsmitteln erfindungsgemässe wässrige Lösungen rekonstituieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen Lösung bei der photodynamischen Therapie von lebenden Zellen, insbesondere bei der Prophylaxe von sekundärer Katarakt. Fluorescein-diacetat wurde bereits im Zusammen¬ hang mit therapeutischen Verfahren erwähnt. So enthält die EP-A-279,757 die Lehre, u.a. Fluorescein-diacetat bei der selektiven Zerstörung von transformierten Zellen oder Tumor¬ zellen einzusetzen. Dazu wird eine Substanz wie Fluorescein-diacetat durch Mikroinjek- tion in Tumorzellen eingebracht. Durch anschliessende Bestrahlung werden die Tumorzel¬ len abgetötet. Die EP-A-279,757 enthält keinerlei konkrete Hinweise auf Art und Konzen¬ tration der zu verwendenden Lösung von Fluorescein-diacetat. Ebenso wird auch kein Hinweis auf eine Anwendung bei der Prophylaxe von sekundärer Katarakt gegeben.
Demgegenüber leistet die erwähnte Verwendung der erfindungsgemässen Lösungen einen wichtigen Beitrag bei der Prophylaxe und Behandlung von sekundärer Katarakt, der sich aus dem bekannten Stand der Technik nicht in naheliegender Weise ergibt. Zum besseren Verständnis wird diese Verwendung nachfolgend im einzelnen anhand des am besten untersuchten Fluorescein-diacetat geschildert.
Fluorescein-diacetat (FDA) ist ein nicht-fluoreszierender Ester, der von den meisten le¬ benden Zellen aufgenommen und durch Esterasen hydrolysiert wird. Das fluoreszierende Produkt, Fluorescein, wird aus den Zellen nur langsam wieder freigesetzt. Fluorescein rei¬ chert sich daher vorübergehend in den Zellen an. Je höher die extrazelluläre Konzentration an FDA ist, desto höher ist die resultierende intrazelluläre Konzentration an Fluorescein. Beispielsweise werden in T4-Tumorzellen innerhalb von 10 Minuten Plateaukonzentratio¬ nen von 25 μM Fluorescein erreicht, wenn man eine 1 μM FDA-Lösung verwendet, oder von 70 μM Fluorescein, falls man eine 100 μM FDA-Lösung verwendet. Das Fluorescein innerhalb einer Zelle hat eine Halbwertszeit von etwa 15 Minuten. Bestrahlung von intra¬ zellulärem Fluorescein mit Energie geeigneter Wellenlänge von etwa 480 nm ruft eine grüne Lichtemission mit einem Maximum von 515 nm hervor. Durch intensive Bestrah¬ lung verblasst die Intensität der Fluoreszenz. Lebende Zellen, die Fluorescein enthalten, sterben dann ab, wenn die BeStrahlungsintensität ausreichend hoch ist. Je geringer die in¬ trazelluläre Konzentration an Fluorescein ist, desto höher muss die kritische Bestrahlungs¬ energie sein. Daher kann die Intensität der Bestrahlung so gewählt werden, dass Zellen, die nur wenig oder kein Fluorescein enthalten, nicht beeinträchtigt werden.
Die vorstehend beschriebene Methode beruht also auf der Induktion lokaler Cytotoxizität durch die gezielte und lokal genau definierte Bestrahlung von intrazellulärem Fluorescein an bestimmten Zielen von Organen. Dies geschieht mittels eines Lichtstrahls kontrollierter Intensität und Wellenlänge des Lichts, insbesondere mit einem Laser oder einer Quarz- Iod-Lampe, wobei der Lichtstrahl präzise auf die gewünschte Stelle gerichtet wird. Die bestrahlten, Fluorescein enthaltenden Zellen werden dadurch abgetötet, das umgebende Gewebe hingegen wird nicht beeinträchtigt. Hierfür geeignete Lasertechnik ist dem Fach¬ mann bereits bekannt und zugänglich. Die lokale Photoaktivierung, hervorgerufen durch einen fokussierten Laserstrahl, der auf intrazelluläres Fluorescein trifft, erfordert sehr viel weniger lokale Lichtenergie als die konventionelle Lasertechnik, die auf einem Verbren¬ nen der Zellen beruht.
Nun besteht das Problem, dass Fluorescein von lebenden Zellen praktisch nicht aufgenom¬ men wird. Im Gegensatz dazu wird der Ester FDA von den meisten lebenden Zellen gut aufgenommen, und das unter der Einwirkung von Esterasen entstehende Produkt, Fluo¬ rescein, wird nur langsam wieder in die extrazelluläre Flüssigkeit abgegeben. Die Bela¬ dung des Intrazellularraums von Zellen mit Fluorescein wird aber dadurch kompliziert, dass FDA auch in der extrazellulären Flüssigkeit bereits durch Esterasen hydrolysiert wird. Dadurch wird die Menge von FDA, die für die Beladung der Zellen zur Verfügung steht, reduziert. Für die reproduzierbare klinische Anwendung ist es daher ratsam, die Konzentration extrazellulärer Esterasen vorher abzusenken. Dies geschieht geeigneterwei¬ se durch Waschen der Umgebung desjenigen Gebietes, das behandelt werden soll. Ein weiteres Problem kann sich daraus ergeben, dass das FDA vom Ort der eigentlichen An¬ wendung wegdiffundiert und als Folge davon auch in Zellen aufgenommen wird, die gar nicht behandelt werden sollen. Diesem Problem kann begegnet werden, indem sowohl die lokale Applikation von FDA als auch die definierte Bestrahlung optimiert werden, bei¬ spielsweise durch Verwendung eines besonders gut fokussierten Lichtstrahls. Die prinzipielle Vorgehensweise bei der Anwendung von FDA in der vorstehend beschrie¬ benen photodynamischen Therapie, bei der mittels FDA lokale Phototoxizität induziert wird, lässt sich beispielhaft wie folgt beschreiben: a) Der zu behandelnde Bereich wird mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, um extrazelluläre Körperflüssigkeiten an je¬ ner Stelle zu entfernen, b) Der zu behandelnde Bereich wird für etwa 10 Minuten mit 40 μM FDA in Kochsalzlösung inkubiert, um die Zellen mit Fluorescein zu beladen, c) Der inkubierte Bereich wird mit Kochsalzlösung gewaschen, um nicht aufgenommenes FDA zu entfernen, d) Der Bereich wird durch Bestrahlung mit Licht niedriger Energie un¬ tersucht, um die Zielzellen unterscheiden zu können, ohne dass bereits Cytotoxizität indu¬ ziert wird, e) Innerhalb von 10 bis 30 Minuten werden ausgewählte Zielzellen etwa 15 Se¬ kunden bis einige Minuten, z.B. bis zu 3 Minuten lang mit fokussiertem Licht hoher Ener¬ gie bestrahlt, um lokal Cytotoxizität zu induzieren, f) Abschliessend wird der Bereich er¬ neut gewaschen, um Rückstände zu entfernen und die Diffusion des Fluorescein aus den übrigen Zellen zu erleichtem.
Unter Katarakt versteht man die Trübung der kristallinen Augenlinse. Die Katarakt kann die Sehfähigkeit stark beeinträchtigen, bis hin zur Blindheit. Eine chirurgische Entfernung der Linse und das Einsetzen einer Intraokularlinse können die Sehfähigkeit wieder herstel¬ len. Extrakapsuläre Chirurgie dieser sogenannten primären Katarakt wird allgemein be¬ vorzugt, da weniger Nebenwirkungen auftreten und auch wegen der Leichtigkeit, mit der künstliche Augenlinsen eingesetzt werden können. Die rückwärtige Kapsel der Augenlin¬ se wird dabei unversehrt gelassen, während ungefähr ein Viertel der vorderen Kapsel für das Entnehmen der Augenlinse entfernt wird. In ungefähr 50 % aller Fälle wächst das Epi¬ thel an der vorderen Seite der zurückbleibenden vorderen Linsenmembran zum vorderen Teil der rückwärtigen Membran und verursacht auf diese Weise eine sekundäre Katarakt (Nachstar). Heutzutage werden diese Membranen in der Regel durch Laserbestrahlung entfernt. Diese Art der Behandlung verursacht jedoch in etwa 50 % der Fälle eine Zerstö¬ rung der rückwärtigen Membran, der in etwa 5 % der Fälle die Erblindung des operierten Auges folgt, zum Beispiel wegen eines Oedems der macula densa. Davon sind bis zu 2,5 % der Patienten betroffen, die ursprünglich wegen einer primären Katarakt operiert wurden. Würde man demgegenüber die Epithelzellschicht der äquatorialen und vorderen Membran der Kapsel der Augenlinse entfernen, könnte eine sekundäre Katarakt nicht ent¬ stehen.
Bei der Lösung dieses Problems kann man sich nun überraschenderweise der erfindungs- gemässen Formulierungen respektive Lösungen bedienen. Das Prinzip der Verwendung von hochkonzentrierten Lösungen von Fluorescein-diestern, erläutert am Beispiel des FDA, lässt sich beispielsweise wie folgt beschreiben.
Der chirurgische Eingriff am Auge wird gemäss der Standardprozedur ausgeführt, bis die Augenlinse extrahiert ist. Die Linsenhöhlung wird dann mit physiologischer Kochsalzlö¬ sung gewaschen und mit erfindungsgemässer FDA-Lösung gefüllt. Man lässt die Lösung etwa 10 Minuten einwirken und wäscht erneut, um den Ueberschuss FDA zu entfernen. Durch den Einsatz eines nicht-fokussierten Laserstrahls bei ungefähr 480 nm (z.B. ein Ar¬ gon-Blau-Laser) und bei niedriger Energie werden die Linsen-Epithel-Zellen durch die in¬ trazelluläre grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht. Die vordere und die rückwärtige Mem¬ bran der Linse werden innerhalb der folgenden etwa 20 Minuten abgetastet, und Positio¬ nen mit Zellen werden nachfolgend mit dem nun gut fokussierten Laserstrahl (Fokustiefe 1/10 bis 1/100 mm) für etwa 10 bis 20 Sekunden und mit einer Energie bestrahlt, die grösser ist als die Energie, die zuvor für die Sichtbarmachung verwendet wurde. Ab- schliessend wird die Höhlung erneut gewaschen, und man führt die Operation gemäss der Standardprozedur weiter durch Einsetzen der künstlichen Linse usw.
Alternativ dazu können Zellen innerhalb des Epithels der Linsenkapsel auch abgetötet werden, indem FDA-Lösung subcapsulär direkt in die noch intakte Linse injiziert wird (Hydrodissection in Kombination mit FDA). Das Beladen der Zellen lässt sich bei niedrigem Energieniveau mit einem Argonlaser beobachten. Der Ueberschuss FDA wird zusammen mit Linsenkernfragmenten herausgewaschen, anschliessend wird die Bestrah¬ lung der Zielzellen mit hoher Energie durchgeführt. Unpräzise appliziertes FDA kann auch von anderen Zellen aufgenommen werden als von Zellen des Linsenepithels. Dieser Umstand ft aber nur dann Cytotoxizität hervor, wenn diese Zellen ausreichend mit Fluo¬ rescein beladen sind und innerhalb einer Zeitspanne von etwa 20 Minuten bestrahlt wer¬ den. Das kann vermieden werden, wenn man zu Beobachtungszwecken bei niedriger Energie arbeitet und die eigentliche Hochenergie-Bestrahlung nur mit einem fokussierten Lichtstrahl an zuvor ausgewählten Stellen mittels eines flächendeckenden Abtastverfah¬ rens (Scanning) durchführt.
Auf grundsätzlich analoge Weise wie vorstehend im Zusammenhang mit sekundärer Katarakt beschrieben, können die erfindungsgemässen Lösungen auch verwendet werden, um andere Krankheiten basierend auf dem Grundprinzip der photodynamischen Therapie zu behandeln. Ein Beispiel hierfür ist die primäre erworbene Melanosis der Konjunktiva. Hierbei müsste man zunächst die Konzentration der extrazellulären Esterasen vermindern, indem man bei¬ spielsweise den Konjunktivalsack mit physiologischer Kochsalzlösung wäscht. Erfin¬ dungsgemässe FDA-Lösung wird dann für eine Inkubationszeit von etwa 10 Minuten in den Konjunktivalsack gegeben. Ueberschüssiges FDA wird durch intensives Waschen ent¬ fernt. Innerhalb der nächsten 20 Minuten wird der Tumor mit einem fokussierten Laser¬ strahl unter visueller Kontrolle bestrahlt. Erneut wird mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Diese Vorgehensweise kann in beliebigen Zeitabständen mehrfach wiederholt werden, so dass Zellen schichtweise abgetragen werden können. Um unerwünschte Akti¬ vierungen von intrazellulärem Fluorescein zu vermeiden, sollten eventuell als Vorsichts- massnahme alle Verfahrens schritte von der Zeit der FDA-Applikation bis 50 Minuten nach Entfernen des FDA im grün-roten Licht erfolgen (>530 nm).
Das Verfahren der Bestrahlung von Zielzellen, die mit erfindungsgemässen Lösungen be¬ laden wurden und die infolge der Einwirkung von Esterasen Fluorescein enthalten, lässt sich auf alle zu behandelnden Zielzellen anwenden, die von einer Oberfläche aus zugäng¬ lich sind für einen lokalen Waschvorgang, für eine lokale Inkubation mit einer FDA-Lö¬ sung und für die lolake Bestrahlung mit einem fokussierten Lichtstrahl. Eine wesentliche Voraussetzung für die Durchführbarkeit der Methode ist das Vorhandensein entweder ei¬ ner natürlichen Höhlung (Kavität) oder einer durch chirurgischen Eingriff künstlich ge¬ formten Kavität. Ein derartiger chirurgischer Eingriff kann beispielsweise durch Auf¬ blasen des proximalen und distalen Endes des Zielbereiches in einem tubulären Gewebe erfolgen. Beispielhaft seien hierfür gutartige oder bösartige Tumore der oralen oder nasa¬ len Kavität genannt, femer der Speiseröhre oder des intestinalen Traktes, des Urogenital¬ traktes oder der Kavitäten von Gelenken. So sollte es möglich sein, die Methode bei der Rektoskopie oder bei der trans-urethralen Prostatachirurgie anzuwenden. Darüberhinaus dürfte die Anwendbarkeit bei Hauttumoren gegeben sein, wenn das Inkubationsmedium mit FDA lokal entweder als viskoser Tropfen oder in einer anhaftenden glockenförmigen Schale (bell jarr) verabreicht wird, die den Tumor bedeckt.
Ein grundsätzlicher Aspekt der photodynamischen Therapie unter Einsatz von beispiels¬ weise FDA besteht darin, dass um so weniger Energie für die Bestrahlung benötigt wird, je höher die lokale intrazelluläre Konzentration von Fluorescein ist. Darüberhinaus ist die Präzision der Bestrahlung deutlich verbessert, wenn eine hohe lokale intrazelluläre Kon¬ zentration von Fluorescein vorliegt. Es kann daher nur dann eine gezielte Abtötung von Zellen unter gleichzeitiger Schonung von umgebendem Gewebe erfolgen. Um das Ziel ei¬ ner hohen lokalen intrazellulären Konzentration von Fluorescein zu erreichen, ist es daher von herausragender Bedeutung, hochkonzentrierte FDA-Lösungen zur Verfügung zu stel¬ len. Diese Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung erstmalig gelöst, da es auf her¬ kömmliche Weise nicht möglich war, die erforderlichen Mengen von Fluorescein-diester, beispielsweise FDA, in die Form stabiler Formulierungen, insbesondere wässriger Lösun¬ gen zu bringen. Demzufolge war es ebenfalls bisher nicht möglich, die erforderlichen bzw. wünschenswert hohen Konzentrationen von Fluorescein intrazellulär aufzubauen.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung illustrieren, ohne sie jedoch in irgend einer Weise, etwa auf den Umfang der Beispiele zu beschränken. Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1: In 784,12 g Wasser (Aqua ad iniectabilia) werden 200,00 g Encapsin HPB (Hydroxypropyl- ß-cyclodextrin) und 57,0 g Sorbit gegeben und gelöst. Anschliessend wird der pH- Wert mit 1 % Essigsäure auf 4,5 eingestellt. Danach wird Fluorescein-diace¬ tat, gelöst in Essigsäureethylester (2,88 g einer Lösung von 1250 mg Fluorescein-diacetat in 100,0 ml Essigsäureethylester), zugegeben und mit der wässrigen Phase gemischt. Die Lösung wird steril filtriert. In 960,00 g Wasser (Aqua ad iniectabilia) werden 40,00 g Methocel E4M gelöst. Die Lösung wird autoklaviert. Die beiden Lösungen werden im Verhältnis 1:1 gemischt. Man erhält auf diese Weise eine Lösung mit einem pH- Wert von 4,5 ± 0,3 und einer Osmolarität von etwa 300 mOsmol/kg.
Beispiel 2: Auf zu Beispiel 1 analoge Weise wird eine Lösung hergestellt, die die folgen¬ den Bestandteile enthält:
Encapsin HPB (Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin) 100.00 mg
Sorbit 28.50 mg
Essigsäure 1 % q.s.
Fluorescein-diacetat 0.0333 mg
Essigsäureethylester 2,88 mg
Wasser für Injektionszwecke ad 1 ml
Diese Lösung enthält 80 μMol/1 Fluorescein-diacetat. Es handelt sich um eine klare farblo¬ se Lösung mit einem pH-wert von 4,72 und einer Osmolarität von 313 mOsmol/kg. Beispiel 3: Die Lösung von Beispiel 2 weist nach Lagerung von einem Monat folgende Kenngrössen auf: Nach Lagerung bei -18°C beträgt der pH- Wert 4,61, die Osmolarität 306 mOsmol/kg, der Gehalt an Fluorescein-diacetat beträgt noch 99,8 % des Anfangsge¬ haltes. Nach Lagerung bei +8°C beträgt der pH- Wert 4,57, die Osmolarität 304 mOsmol/kg, der Gehalt an Fluorescein-diacetat beträgt noch 94,0 % des Anfangsge¬ haltes. Nach Lagerung bei +25 °C beträgt der pH- Wert 4,51, die Osmolarität 298 mOsmol/kg, der Gehalt an Fluorescein-diacetat beträgt noch 69,7 % des Anfangsge¬ haltes.
Beispiel 4: Zu 5,0 ml der Lösung von Beispiel 2 werden 40 ml abs. Ethanol und 10 ml To- luol gegeben (Die 4:1 -Mischung von EthanokToluol dient zur azeotropen Entfernung des Wassers). Diese Mischung wird an einem Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtem¬ peratur von 80°C bis zur Trockene eingedampft. Zum Entfernen von Lösungsmittelresten wird der verbliebene Rückstand 2 Stunden bei 120°C im Trockenschrank getrocknet. Die so erhaltene trockene Formulierung besteht praktisch aus dem Hydroxypropyl- ß-cyclo- dextrin-Fluorescein-diacetat-Komplex sowie aus dem Isotonisierungsmittel Sorbit. Sie ist ohne weitere Zugabe von organischen Lösungsmitteln jederzeit in Wasser wieder lösbar.
Die Stabilitätsprüfung (mittels HPLC) einer wässrigen Lösung, die aus einer 3 Monate lang gelagerten trockenen Formulierung rekonstituiert wird, zeigt keine Abnahme an FDA oder irgendwelche anderen Zersetzungserscheinungen. Das bedeutet, dass die erfindungs¬ gemässe trockene Formulierung für längere Zeit stabil bleibt und bei Raumtemperatur (15 - 25 °C) haltbar ist. Die rekonstituierte Lösung ist für den unmittelbaren Gebrauch be¬ stimmt und mindestens 2 Stunden haltbar.
Beispiel 5: Die intrazelluläre Aufnahme und Freisetzung von Fluorescein (fluoreszierend) aus FDA (nicht fluoreszierend) wird in Gewebekultur am Beipiel individueller humaner T24 Karzinom-Zellen mit Hilfe der mikroskopischen Fluorimetrie (Excitation 480 nm; Emission 520 nm) untersucht. Die intrazelluläre Fluorescein-Konzentration steigt für etwa 4 Minuten linear an und erreicht etwa Plateau-Werte nach 10 Minuten. Sie ist abhängig von der Konzentration des extrazellulär angebotenen FDA: nach 10 Minuten beträgt die intrazelluläre Fluorescein-Konzentration 0,017 mMol/1 mit 0,04 mMol/1 FDA, 0,015 mMol/1 mit 0,02 mMol/1 FDA, 0,01 mMol/1 mit 0,01 mMol/1 FDA und 0,004 mMol/1 mit 0,001 mMol/1 FDA, während die Fluorescein-Konzentration mit 0,0001 mMol/1 FDA nicht mehr messbar ist. Keine Aufnahme ist feststellbar, wenn den Zellen reines Fluores¬ cein angeboten wird. Nach Entfernen des FDA aus dem Gewebekulturmedium kann die Freisetzung von Fluorescein aus den Zellen gemessen werden. Der Ausschluss des Fluo- resceins aus den individuellen Zellen folgt der Kinetik erster Ordnung, die Halbwertszeit beträgt etwa 10 bis 25 Minuten. Die Fluoreszenzintensität intrazellulären Fluoresceins verblasst, wenn das Fluorescein entsprechend angeregt wird. Dieses Verblassen ist um so stärker, je höher die intrazelluläre Fluorescein-Konzentration bei einer gegebenen Bestrah¬ lungs-Energie ist: die untere Grenze für einen Verblassungs-Effekt ist 0,004 mMol/1 intra¬ zelluläres Fluorescein für 71 mJ/mm2 und 0,002 mMol/1 für 560 mJ/mm2 (Bestrahlungs¬ zeit 120 Sekunden). Eine 1 bis 10-minütige Beleuchtung mit 0,1 mW/mm2 (zur Beobach¬ tung der Zellen) bewirkt kein messbares Verblassen.
Beispiel 6: Die zytotoxische Wirkung der Bestrahlung (Excitation 480 nm) intrazellulären Fluoresceins aus FDA wird in Gewebekultur am Beispiel der humanen T24 Karzinom- Zellen untersucht. Hierzu wird die intrazelluläre Fluorescein-Konzentration fluorimetrisch im Mikroskop (Excitation 480 nm; Emission 520 nm) an Einzelzellen und die Vitalität über die Aufnahme von Propidium-Iodid bestimmt. Je geringer die intrazelluläre Fluores¬ cein-Konzentration ist, desto geringer ist die zytotoxische Wirkung. Eine intrazelluläre Fluorescein-Konzentration von < 0,0015 mMol 1 Fluorescein und ein Verbleichen von < 0,001 m.Mol/1 Fluorescein bewirken keine Zytotoxizität, nicht einmal unter extremen Be- strahlungsbedingunen wie 1,2 J/mm2 (für 2 Minuten). Bei gleicher Bestrahlungsenergie ist der zytotoxische Effekt um so ausgeprägter, je höher intrazelluläre Fluorescein-Konzen¬ tration und Bestrahlungszeit sind. 50 % der Zellen werden mit 200 mJ/mm2 getötet, wenn Zellen mit 0,013 mMol/1 intrazellulärem Fluorescein für 15 Sekunden, respektive Zellen mit 0,005 mMol/1 Fluorescein für 120 Sekunden bestrahlt werden, oder mit 500 mJ/mm2, wenn Zellen mit 0,007 mMol Fluorescein für 15 Sekunden, respektive Zellen mit 0,003 mMol Fluorescein für 120 Sekunden bestrahlt werden.
Beispiel 7: Die intrazelluläre Aufnahme von Fluorescein aus in dem viskosen Medium Hymecel® (Hydroxypropylmethylcellulose) gelöstem FDA wird in Gewebekultur an hu¬ manen T24 Karzinom-Zellen untersucht. Hierzu wird die intrazelluläre Fluorescein-Kon¬ zentration fluorimetrisch im Mikroskop (Excitation 480 nm; Emission 520 nm) an Einzel¬ zellen bestimmt. Anstieg der intrazellulären Fluorescein-Konzentration und Plateau- Werte entsprechen in etwa denen nach Inkubation der Zellen in wässrigem Milieu. Acht Minuten nach Entfernen der viskosen Lösung und Waschen der Zellen beträgt die intrazelluläre Fluorescein-Konzentration 0,004 bis 0,005 mMol/1 nach 0,01 mMol 1 FDA, 0,007 bis 0,009 mMol/1 nach 0,02 mMol/1 FDA und 0,019 mMol/1 nach 0,04 mMol/1 FDA. Beispiel 8: Der zytotoxische Effekt der Bestrahlung intrazellulären Fluoresceins mit 488 nm Laser-Licht (Argon) wird in vivo an der Cornea des Kaninchenauges untersucht. Hierzu wird die Comea mit FDA-Lösung für 10 Minuten betropft, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, danach wird die Bestrahlung durchgeführt. Die Fluoreszenz¬ intensität auf der Comea steigt in dieser Zeit stark an, fällt dann langsam innerhalb von etwa 5 Stunden nach dem Waschen auf Null ab. Bestrahlung der fluoreszierenden Comea resultiert in schwarzen Flecken, deren Grosse der durch den Laser beleuchteten Fläche entspricht. Die geringste effektive Energie für diesen Verblassungseffekt ist etwa 2,4 J/mm2 mit 0,01 mMol/1 FDA und 0,11 J/mm2 mit 0,02 mMol/1 FDA. Die makrosko¬ pisch sichtbaren schwarzen Flecke entsprechen histologisch Flächen von toten Epithelial- Zellen in der äussersten Schicht der Comea. Die untere Grenze der Bestrahlungsenergie für diesen zytotoxischen Effekt beträgt 0,38 mJ/ram2 (5 Sekunden und 20 Sekunden) bei Verwendung von 0,02 mMol/1 FDA.
Beispiel 9: Die zytotoxische Wirkung der Bestrahlung intrazellulären Fluoresceins mit 488 nm Laser-Licht (Argon) wird in vivo am Linsenepithel des Kaninchenauges unter¬ sucht. Hierzu werden zunächst beide Augen des Kaninchens mit Voltaren® Augentropfen (3 mal innerhalb 24 Stunden) vorbehandelt, und kurz vor dem Eingriff werden die Pupil¬ len mit einem Mydriaticum weitgestellt. Die Kaninchen werden in Vollnarkose operiert. Nach einer kleinen Inzision der Comea wird die Vorderkammer des Auges für 1 Minute mit Kochsalzlösung (zur Entfernung des natürlichen Kammerwassers) durchspült, danach langsam mit 5 ml FDA-Lösung (1 ml / Min) gespült und aufgefüllt, dann für weitere 5 Mi¬ nuten so belassen und wiedemm mit Kochsalzlösung für 1 Minute gespült (zur Entfernung überschüssiger FDA-Lösung). Während der Spülung der Kammer mit FDA-Lösung wird die Comea mit Kochsalzlösung betropft (zur raschen Verdünnung und Entfernung der aus der Kammer zurückfliessenden FDA-Lösung). Die Beobachtung der Linse mit dem Ste¬ reo-Mikroskop in epifluoreszentem Modus ergibt eine stetige, eindeutige Zunahme der Fluoreszenz der vorderen Linsen-Kapsel. Zusätzlich fluoresziert geringgradig auch die Cornea-Oberfläche in der näheren Umgebung der Inzisionsstelle. Schliesslich wird die Be¬ strahlung (0,92 Watt bis 0,64 Watt) für die Dauer von 30 Sekunden durchgeführt, wobei die kreisrunde Bestrahlungsfläche auf der Ebene der Linse 95 mm2 (11 mm Durchmesser) beträgt. Nach der Bestrahlung fluoresziert die Linsenoberfläche nicht mehr. Die histologi- sche Befundung der Augen (Serienschnitte) so behandelter und ca. 18 Stunden später getö¬ teter Kaninchen liefert den Nachweis der zytotoxischen Wirkung auf das Epithel im Be¬ strahlungsfeld: totale Nekrose des Linsenepithels bei mikroskopisch unveränderter Basal- membran, pyknotische Kernreste und ödematöse Schwellung des vorderen, subkapsulären Bereiches der Linse. Alle untersuchten Bestrahlungs-Dosen (291 mJ/mm2 bis 19 mJ/mm2) waren effektiv. Im Gegensatz hierzu zeigten Augen, die bestrahlt aber nicht mit FDA-Lö¬ sung injiziert wurden, keine histopathologisch nachweisbaren Verändemngen.

Claims

Patentansprüche:
1. Formulie ng enthaltend einen Fluorescein-diester und ein partiell verethertes ß-Cyclo¬ dextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropyl¬ gruppen sind, wobei ein Teil der Ethersubstituenten gegebenenfalls Methyl- oder Ethyl¬ gruppen sein können.
2. Formuliemng gemäss Anspmch 1, worin der ß-Cyclodextrinether eine Wasserlöslich¬ keit von über 1,8 g in 100 ml Wasser aufweist.
3. Formuliemng gemäss Anspmch 1 enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind.
4. Formuliemng gemäss Anspmch 1 enthaltend Fluorescein-diacetat und ein partiell ver¬ ethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind.
5. Formuliemng gemäss Anspmch 1 enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, und ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxypropylgmppen sind.
6. Formuliemng gemäss Anspmch 1 enthaltend zusätzlich eine oder mehrere Komponen¬ ten, die ausgewählt sind aus der Gmppe Tonizitätsverstärker, den pH-Wert beeinflussende Substanzen, Lösungsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel und Puffer.
7. Formuliemng gemäss Anspmch 6 enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxy¬ propyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind, einen nichtionischen Tonizitätsverstärker, ei¬ ne Säure und gegebenfalls ein Lösungsmittel.
8. Formuliemng gemäss Anspmch 7 enthaltend einen Fluorescein-diniederalkylester, ein partiell verethertes ß-Cyclodextrin, dessen Ethersubstituenten Hydroxyethyl-, Hydroxy¬ propyl- oder Dihydroxypropylgruppen sind, Sorbit als nichtionischen Tonizitätsverstärker, Essigsäure als Säure und gegebenfalls Essigester als Lösungsmittel.
9. Formuliemng gemäss Anspmch 8 worin es sich bei dem Fluorescein-diniederalkylester um Fluorescein-diacetat handelt und bei dem partiell veretherten ß-Cyclodextrin um Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
10. Formuliemng gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der es sich um eine wässrige Lösung handelt.
11. Lösung gemäss Anspmch 10, worin der Fluorescein-diester in einer Konzentration von bis zu etwa 200 Mikromol/l (200 μMol/1) enthalten ist, vorzugsweise in einer Kon¬ zentration von etwa 40 bis etwa 200 Mikromol/l, insbesondere in einer Konzentration von bis zu etwa 100 Mikromol/l, und ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/l.
12. Lösung gemäss Anspmch 10 enthaltend etwa 40 bis etwa 200 Mikromol/l Fluores¬ cein-diacetat und etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
13. Lösung gemäss Anspmch 10 enthaltend etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/l Fluoresc¬ ein-diacetat und etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin.
14. Lösung gemäss Anspmch 10 enthaltend a) etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/l Fluorescein-diacetat, b) etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, c) Sorbit zur Einstellung einer Osmolarität von etwa 300 Milliosmol, d) Essigsäure zur Einstellung eines pH-Bereiches von etwa 4,5 bis 5 und e) gegebenenfalls Essigester in einer Menge von bis zu etwa 5 Gewichtsprozent.
15. Formuliemng gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der es sich um eine trockene Formuliemng handelt.
16. Formuliemng gemäss Anspmch 15 enthaltend a) etwa 60 bis etwa 100 Mikromol/l Fluorescein-diacetat, b) etwa 5 bis etwa 12 Gewichtsprozent Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, c) Sorbit zur Einstellung einer Osmolarität von etwa 300 Milliosmol, wobei sich die Mengenangaben oder Konzenzentrationsangaben jeweils auf die zu rekon¬ stituierende wässrige Lösung beziehen.
17. Verfahren zur Herstellung einer Lösung gemäss Anspmch 10 gekennzeichnet durch konventionelles Vermischen der Bestandteile.
18. Verfahren gemäss Anspmch 17, dadurch gekennzeichnet dass der Fluorescein-diester als Lösung in einem Lösungsmittel mit den übrigen Bestandteilen vermischt wird.
19. Verwendung einer Lösung gemäss Anspmch 10 als Inkubierungsmedium zur Bela¬ dung von lebenden Zellen mit Fluorescein.
20. Verwendung gemäss Anspmch 19, wobei die Beladung von lebenden Zellen als Vor¬ stufe zu einer photodynamischen Therapie stattfindet.
21. Verwendung gemäss Anspmch 20, wobei die photodynamische Therapie der Prophy¬ laxe von sekundärer Katarakt dient.
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