EP0777718A2 - Enzymatische, aktiven sauerstoff liefernde mischung sowie herstellung von persäuren - Google Patents

Enzymatische, aktiven sauerstoff liefernde mischung sowie herstellung von persäuren

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EP0777718A2
EP0777718A2 EP95931190A EP95931190A EP0777718A2 EP 0777718 A2 EP0777718 A2 EP 0777718A2 EP 95931190 A EP95931190 A EP 95931190A EP 95931190 A EP95931190 A EP 95931190A EP 0777718 A2 EP0777718 A2 EP 0777718A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
mixture
oxidoreductase
peroxide
hydrogen peroxide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95931190A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karl-Heinz Van Pee
Hans-Jürgen HECHT
Albrecht Berkessel
Thomas Schrapel
Hartmut Laatsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
Publication of EP0777718A2 publication Critical patent/EP0777718A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38654—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/0101—Chloride peroxidase (1.11.1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01018—Bromide peroxidase (1.11.1.18)

Definitions

  • Oxygen-producing mixture and a process for the enzymatic production of peracids are used in oxidation reactions for the production of chemical compounds. Such mixtures are also effective as oxidative bleaches in detergent compositions.
  • the process according to the invention can be used in particular in the synthesis of organic compounds in which the peracid formed in situ participates as an oxidizing reaction partner.
  • peracid production takes place via the reaction of acid anhydrides and acid halides with hydrogen peroxide.
  • peracids can be produced from carboxylic acids and hydrogen peroxide in the presence of mineral acids.
  • the Persaurs are extremely unstable. When heated, such connections can explode without warning.
  • this system first sets an elaborate synthesis of defined compounds - here Glyzerideuren - expected.
  • longer-chain peracids develop here, whose reactivity towards low-chain organic peracids is reduced.
  • the temperature range of such enzymatic systems is also restricted, which limits their use as bleaching agents, for example in the case of full and cold detergents.
  • the object of the invention is to produce enzymatically organic peracids in a simple manner and to provide a mixture as a supplier of active oxygen for a wide variety of applications.
  • the enzymatic, active oxygen-producing mixture consists of
  • Oxidoreductase with an ⁇ / ⁇ hydrolase fold and a catalytic triad of the amino acids serine, histidine and aspartic acid a peroxide source and an organic acid or its salt
  • the peroxide source is kept separate from the other components.
  • the enzyme according to the invention can be freeze-dried and stored at room temperature for a long time, the enzyme can e.g. be used in conjunction with sodium acetate and sodium perborate in a solid mixture.
  • the enzyme catalyzes the conversion of the organic acid into peracid with the participation of the peroxide source.
  • the enzymes used according to the invention can be isolated from different organisms (pro and eukaryotes).
  • bacterial non-heme haloperoxidase e.g. B. chloroperoxidase or bromoperoxidase of different origins for the mixture according to the invention or the method according to the invention.
  • the organic acid used is preferably mono- and dicarboxylic acids and hydroxycarboxylic acids with 2 to 4 carbon atoms, such as, in particular, acetic acid, propionic acid or lactic acid or salts thereof.
  • Hydrogen peroxide or compounds releasing hydrogen peroxide, such as perborates, in particular sodium perborate, percarbonates, in particular sodium percarbonate, and persulfates are preferably used as the peroxide source.
  • the amount of enzyme used depends on the volume of the overall system and is preferably 0.15 to 50 ⁇ mol Hydrogen peroxide and 8 to 16 mU enzyme per 100 ⁇ mol acid or salt. If another peroxide source is used instead of hydrogen peroxide, for example sodium perborate, the amount to be used relates to the hydrogen peroxide released therefrom.
  • the enzyme unit U denotes the amount of enzyme that converts one ⁇ mol substrate per minute.
  • the pH range of the mixture according to the invention is buffered in the range 3.5 to 6 by the organic acid or its salts involved.
  • the application temperature of the mixture according to the invention can be between 20 and 80 ° C., depending on the enzyme used.
  • the oxidoreductases according to the invention have the same structural features, namely an ⁇ / ⁇ hydrolase fold and a catalytic triad of the amino acids serine, histidine and aspartic acid.
  • the bacterial non-heme haloperoxidases used in contrast to the hemoperoxidases containing heme, do not require a heme group as a prosthetic group and, in contrast to the eukaryotic non-heme
  • Haloperoxidases also have no metal ions or other cofactors for their activity.
  • the enzymes according to the invention form peracids by hydrolysis of a serine ester in conjunction with hydrogen peroxide, which then act as an oxidizing agent.
  • the ester is formed by reaction of the organic acid with a serine residue in the active center of the enzyme.
  • the oxidoreductases used according to the invention can easily be prepared in large amounts by cloning the genes and overexpression.
  • the mixture according to the invention can be used in various ways due to its oxidative effect, e.g. B. in the Synthesis of organic compounds, or generally as an oxidation reagent.
  • Such an area of application is bleaching agents, for example bleaching agents for paper and textiles, in particular for bleaching processes in the acidic to neutral pH range.
  • the mixture according to the invention is also suitable as a disinfectant for disinfecting aqueous solutions and surfaces or for producing disinfectants.
  • the peracids formed in situ from the mixture according to the invention react by oxidation with contaminants, coloring components and microorganisms.
  • the process for the enzymatic production of organic peracids is carried out in such a way that
  • bacterial non-heme haloperoxidase e.g. B. chlorine peroxidase or bromine peroxidase, hydrogen peroxide or sodium perborate as the peroxide compound and acetic acid or propionic acid or lactic acid or its salts as the organic acid.
  • the enzyme content is preferably 0.1 to 50 ⁇ mol hydrogen peroxide and 100 ⁇ mol acid or salt 8 to 16 mU enzyme. If sodium perborate is used instead of hydrogen peroxide, the amount to be used relates to the hydrogen peroxide released therefrom.
  • the peracid produced by the process according to the invention is extremely reactive. It oxidizes compounds or decomposes to form active oxygen and free acid. The active oxygen can thus be used as a reaction partner.
  • the peracid formed in situ can also be detected by such oxidation reactions, for example by oxidation of aniline to nitrobenzene.
  • oxidation reactions for example by oxidation of aniline to nitrobenzene.
  • halide ions these are oxidized in situ and in the presence of substrates suitable for electrophilic substitution, halogenation reactions occur. Irrespective of the fact that the peracids formed in situ can be detected via the aforementioned oxidation reactions, these examples show an advantageous field of application of the method according to the invention in the synthesis of organic compounds.
  • Fig. 1 three-dimensional structure of the enzyme
  • Fig. 2 Detail from the three-dimensional structure of the enzyme Bromperox ⁇ dase-A2 from Streptomyces aureofaciens ATCC 10762
  • CPO-P Chloroperoxidase from Pseudomonia pyrrocmia
  • BPO-A2 Bromoperoxidase A2 from Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, hereinafter referred to as BPO-A2
  • CPO-T Chloroperoxidase from Streptomyces aureofaciens Tu 24, hereinafter referred to as CPO-T
  • CPO-L Chloroperoxidase from Streptomyces lividans
  • CPO-F Chloroperoxidase from Pseudomonas fluorescens
  • CPO-S Chloroperoxidase from Serratia marcescens
  • Acetylcholmesterase from electric eel hereinafter referred to as Ace
  • the enzymes are produced essentially after cell disruption and removal of the insoluble cell components by centrifugation, depending on the enzyme, using a heat step, precipitation of foreign proteins by lowering the pH and subsequent column chromatography on different media.
  • a preparation procedure for the enzyme CPO-L can be found in J. of Bacteriology, Vol. 176, pp. 2339-2347 (1994).
  • the enzyme CPO-S is isolated from the wild strain (FEMS Microbiol. Lett. Vol. 129, pp. 255-260 (1995)).
  • the enzyme Ace is commercially available (Sig a).
  • this oligonucleotide was labeled with a DIG oligonucleotide 3 '- END labeling kit from Boehringer Mannheim and hybridized with EcoRI-digested total DNA from Pseudomonas fluorescens. DNA in the hybridizing region was isolated and ligated into the plasmid vector pUC18 and used for the transformation of E. coli TG 1 cells. Ampicillin-resistant E. coli transformants were examined for the presence of the chloroperoxidase gene using the oligonucleotide by colony hybridization. The clone obtained contained a 9 kb insert which was reduced to a 3.8 kb insert with BamHI / EcoRI digestion.
  • E. coli clones contained the plasmid pSK380.
  • pSK 380 a 2.3 kb insert was obtained by digestion with Xhol, which in turn was ligated into pUC18 (pSK230).
  • E. coli clones containing the plasmid pSK 230 produced increased amounts of CPO-F.
  • E. coli was grown with the plasmid pSK230 for 24 h, the cells were harvested by centrifugation and disrupted by ultrasound treatment. Nac ⁇ _ Ammoniumsulfatfallung (35 - 55 _ saturation) the protein solution was slowly heated to 55 ° C, then cooled on ice and precipitated protein removed by centrifugation. Then the solution was to one
  • the sequence listing shows the ammosaur sequences of the enzymes CPO-P, BPO-Al, BPO-A2, CPO-T, CPO-L and CPO-F.
  • the ammosaic sequences were derived from the DNA sequences obtained by the chain termination method.
  • ammosaic sequences of the enzymes shown have the same amino acids in the same place, namely the amino acids serine (Ser), histidine (His) and aspartic acid (Asp). These amino acids form the catalytic triad of the enzymes.
  • Fig. 1 shows an overall view of a three-dimensional structure of the enzyme bromperoxidase-A2 from Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, which was obtained by X-ray structure analyzes (Hecht et. Al, Nature Struct. Biol. 1, pp. 532-537 (1994).
  • CORRECTED SHEET (RULE 91) ISA / EP 2 shows a section of the three-dimensional structure of the enzyme BPO-A2.
  • the mixture consists of
  • the hydrogen peroxide solution is stored separately from the other components. This mixture should subsequently be used for the oxidation of thioanisole to the corresponding sulfoxide.
  • the mixture consists of
  • bromine peroxidase catalyzes the conversion of sodium acetate into peracetic acid.
  • the peracetic acid formed then continues to react with the sodium bromide.
  • the bromide ion is oxidized and the monochlorodimedone used is completely brominated within 10 min.
  • Table 1 shows the enzyme activity over a wide temperature range, good results being achieved at 40 to 70 ° C. and the best at 60 ° C.
  • the activity of the enzymatic mixture is determined on the basis of the bromination reaction of monochlorodimedone to monobromomochlorodimedone. Bromide is oxidized by the enzymatically formed peracid and then reacts with the organic substrate monochlorodimedone. One mole of peracid leads to the bromination of one mole of monochlorodimedone.
  • the enzymes show different specific activities depending on their origin:

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Abstract

Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischungen können Anwendung als Oxidationsmittel zur Herstellung chemischer Verbindungen sowie in Bleich-, Wasch-, Reinigungs- und Desinfektionsmitteln finden. Erfindungsgemäß besteht die Mischung aus Oxidoreduktase mit einer α/β-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure, einer Peroxidquelle, einer wäßrigen Lösung einer organischen Säure oder deren Salz. Die Herstellung organischer Persäuren erfolgt erfindungsgemäß derart, daß in Anwesenheit von Oxidoreduktase mit einer α/β-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure und Wasserstoffperoxid oder Peroxidverbindungen organische Säuren oder deren Salze in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und bei Temperaturen zwischen 15 und 80 °C zu organischen Persäuren umgewandelt werden.

Description

Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung sowie Herstellung von Persauren
Beschreibung π U±i flr- ___,_■_-»_. - JP_. -! _V_. _ _-. 1_.4 L- i« *v.cMiW_l. -L uc / αJ
Sauerstoff liefernde Mischung sowie ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Persauren. Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischungen finden Anwendung bei Oxidationsreaktionen zur Herstellung chemischer Verbindungen. Derartige Mischungen sind aber auch als oxidative Bleichmittel in Waschmittelzusammensetzungen wirksam. Das erfindungsgemaße Verfahren ist insbesondere bei der Synthese organischer Verbindungen anwendbar, bei denen die in situ gebildete Persaure als oxidierender Reaktionspartner teilnimmt.
Bekannt ist die chemische Persaureherstellung, die über die Umsetzung von Saureanhydriden und Saurehalogeniden mit Wasserstoffperoxid erfolgt. Technisch lassen sich Persauren aus Carbonsauren und Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Mineralsauren herstellen. Die Persauren sind außerordentlich instabil. Bei Erhitzen können derartige Verbindungen ohne Vorwarnung explodieren.
Auch wenn die hohe Reaktivität organischer Persauren bekannt und für viele chemische Reaktionen von Vorteil ist, fanden bislang im wesentlichen Natriumperborate als Bleichmittel in Waschmitteln Anwendung. Aus der US-PS 5,296,161 ist ein Verfahren beKannt, das ausgenend von der enzymatischen Aktivität von Esterasen - katalytisch Ester zu verseifen - diese Wirkung nutzt, um organische Persauren in Losung herzustellen und deren sauerstoffbildende Aktivität beispielsweise für Bleichprozesse zu nutzen. Dabei werden in Gegenwart von Esterasen und Lipasen Fettsaureester definierter Struktur enzymatisch unter Bildung von Persauren gespalten. Aufgrund der Anwendung von Fettsaureestern erfordern derartige Systeme jedoch zusatzliche Emulgatoren, um das System in Lösung bzw. Suspension zu halten und dadurch die enzymatische Reaktion zu ermöglichen. ττnabhängig dessen, daß bei diesem System nach Verbrauch bzw. Reaktion der Reaktionskomponenten ökologisch schwer abbaubare Produkte entstehen können, setzt dieses System zunächst eine aufwendige Synthese definierter Verbindungen - hier Glyzeridverbindungen - voraus. Zum anderen entwickeln sich hier längerkettige Persäuren, deren Reaktivität gegenüber niederkettigen organischen Persauren vermindert ist. Eingeschränkt ist auch der Temperaturbereich derartiger enzymatischer Systeme, was deren Anwendung als Bleichmittel, beispielsweise bei Voll- und Kaltwaschmitteln begrenzt.
Bedingt durch die hohe Reaktivität niederkettiger organischer Persäuren, sind solche Verbindungen bevorzugt Reaktionspartner in der Synthese organischer Verbindungen. Die Anwendung von Persäuren war aufgrund der Reaktivität bislang aber auf die laborchemische Synthese beschränkt.
Auch die enzymatische Synthese nach US-PS 5,296,161 erlaubt nicht die gezielte Herstellung reaktiver, niederkettiger organischer Persäuren und ist aufgrund der beteiligten, spezifischen Reaktionspartner in ihrem Einsatzbereich bei der Synthese organischer Verbindungen eingeschränkt.
Aufgabe der Erfindung ist es, m einfacher Weise enzymatisch organische Persäuren herzustellen und eine Mischung als Lieferant aktiven Sauerstoffs für die unterschiedlichsten Anwendungen bereitzustellen.
Erfmdungsgemaß besteht die enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung aus
Oxidoreduktase mit einer α/ß-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure einer Peroxidquelie und einer organischen Saure oder derem Salz,
wobei die Mischung in wassriger Losung angewandt wird.
Bei flüssiger Form der Mischungskomponenten wird die Peroxidquelle getrennt von den anderen Komponenten aufbewahrt.
Dadurch, daß sich das erfindungsgemäße Enzym gefriertrocknen und bei Raumtemperatur auch über längere Zeiten aufbewahren läßt, kann das Enzym z.B. in Verbindung mit Natriu acetat und Natriumperborat in einer Feststoffmischung angewandt werden.
Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Mischung in wassriger Lösung katalysiert das Enzym die Umwandlung der organischen Säure in Persäure unter Beteiligung der Peroxidquelle.
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme können aus unterschiedlichen Organismen (Pro- und Eukaryonten) isoliert werden. Vorzugsweise wird als Enzym bakterielle Nicht-Häm-Haloperoxidase, z. B. Chlorperoxidase oder Bromperoxidase unterschiedlicher Herkunftsstamme für die erfindungsgemaße Mischung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren angewandt.
Als organische Saure werden vorzugsweise Mono- und Dicarbonsauren und Hydroxycarbonsauren mit 2 bis 4 C- Atomen, wie insbesondere Essigsaure, Propionsaure oder Milchsäure bzw. deren Salze eingesetzt. Als Peroxidquelle werden vorzugsweise Wasserstoffperoxid oder Wasserstoffperoxid freisetzende Verbindungen, wie Perborate, insbesondere Natriumperborat, Percarbonate, insbesondere Natriumpercarbonat, und Persulfate genutzt.
Die angewandte Enzymmenge ist abhangig vom Volumen des Gesamtsystems und betragt vorzugsweise pro 0,15 bis 50 μmol Wasserstoffperoxid und pro 100 μmol Säure oder Salz 8 bis 16 mU Enzym. Wird statt Wasserstoffperoxid eine andere Peroxidquelle eingesetzt, beispielsweise Natriumperborat, bezieht sich die einzusetzende Menge auf das daraus freigesetzte Wasserstoffperoxid. Die Enzymeinheit U bezeichnet die Enzymmenge, die ein μmol Substrat pro Minute umsetzt.
Der pH-Bereich der erfindungsgemäßen Mischung wird durch die beteiligte organische Säure oder deren Salze im Bereich 3,5 bis 6 gepuffert. Die Anwendungstemperatur der erfindungsgemäßen Mischung kann je nach verwendetem Enzym zwischen 20 und 80 °C liegen.
Die erfindungsgemäßen Oxidoreduktasen besitzen gleiche Strukturmerkmale, nämlich eine α/ß-Hydrolase-Faltung und eine katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure. Neben diesen Merkmalen benötigen die angewandten bakteriellen Nicht-Häm- Haloperoxidasen im Gegensatz zu den hämhaltigen Haloperoxidasen keine Häm-Gruppe als prosthetische Gruppe und im Gegensatz zu den eukaryontischen Nicht-Häm-
Haloperoxidasen auch keine Metallionen oder andere Co- Faktoren für ihre Aktivität.
Überraschend hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Enzyme durch Hydrolyse eines Serinesters in Verbindung mit Wasserstoffperoxid Persauren bilden, die dann als oxidierendes Agens wirken. Der Seπnester entsteht dabei durch Reaktion der organischen Säure mit einem Serinrest im aktiven Zentrum des Enzyms.
Die erfindungsgemäß verwendeten Oxidoreduktasen sind durcn Klonierung der Gene und Uberexpression leicht m großen Mengen darstellbar.
Die erfindungsgemaße Mischung läßt sich aufgrund ihrer oxidativen Wirkung verschiedentlich anwenden, z. B. in der Synthese organischer Verbindungen, oder generell als Oxidationsreagenz. Ein derartiges Anwendungsgebiet sind Bleichmittel, etwa Bleichmittel für Papier und Textilien, insbesondere für Bleichprozesse im sauren bis neutralen pH- Bereich. Aufgrund der hohen bioziden Wirksamkeit von niederen Percarbonsäuren eignet sich die erfindungsgemäße Mischung auch als Desinfektionsmittel zur Desinfektion von wäßrigen Lösungen und Oberflächen oder zur Herstellung von Desinfektionsmitteln. Als Zusatz in Wasch-, Bleich-, Reinigungs- und Desinfektionsmitteln angewendet, reagieren die in situ aus der erfindungsgemäßen Mischung gebildeten Persäuren durch Oxidation mit Schmutzstoffen, färbenden Komponenten und Mikroorganismen.
Erfindungsgemäß wird das Verfahren zur enzymatischen Herstellung organischer Persäuren so geführt, daß
Oxidoreduktase mit einer α/ß-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure in Gegenwart von Wasserstoffperoxid, einer organischen Säure oder deren Salze bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und bei Temperaturen zwischen 15 und 80 °C die Bildung der organischen Persäure katalysieren. Verwendet man in diesem Prozeß Essigsäure, bildet sich in situ als Reaktionsprodukt Peressigsäure, bei Verwendung von Propionsäure oder Milchsäure analog Perpropionsäure oder Permilchsäure.
Vorzugsweise wird als Enzym bakterielle Nicht-Häm- Haloperoxidase, z. B. Chlorperoxidase oder Bromperoxidase, als Peroxidverbindung Wasserstoffperoxid oder Natriumperborat und als organische Säure Essigsäure oder Propionsäure oder Milchsäure oder deren Salze eingesetzt. Der Enzymanteil beträgt vorzugsweise pro 0,15 bis 50 μmoi Wasserstoffperoxid und pro 100 μmol Säure oder Salz 8 bis 16 mU Enzym. Wird statt Wasserstoffperoxid Natriumperborat eingesetzt, bezieht sich die einzusetzende Menge auf das daraus freigesetzte Wasserstoffperoxid. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Persaure ist außerordentlich reaktiv. Sie oxidiert Verbindungen oder zersetzt sich unter Bildung von aktivem Sauerstoff und freier Säure. Der aktive Sauerstoff kann damit als Reaktionspartner genutzt werden. Über derartige Oxidationsreaktionen läßt sich auch die in situ gebildete Persäure nachweisen, beispielsweise durch Oxidation von Anilin zu Nitrobenzol. In Gegenwart von Halogenidionen werden diese in situ oxidiert und bei Anwesenheit von für die elektrophile Substitution geeigneten Substraten kommt es zu Halogenierungs-reaktionen. Unabhängig dessen, daß sich über die vorgenannten Oxidationsreaktionen die m situ gebildeten Persauren nachweisen la se , zeigen diese Beispiele ein vorteilhaftes Anwendungsgebiet des erfmdungsgemaßen Verfahrens bei der Synthese organischer Verbindungen.
Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele, eines beigefügten Sequenzprotokolls mit Aminosäuresequenzen untersuchter Enzyme sowie der Figuren 1 und 2 soll die Erfindung näher erläutert werden. Dabei zeigen:
Fig. 1: dreidimensionale Struktur des Enzyms
Bromperoxιdase-A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 - Gesamtansicht
Fig. 2: Ausschnitt aus der dreidimensionalen StruKtur des Enzyms Bromperoxιdase-A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762
Enzyme
Folgende Enzyme werαen verwandt:
- Chlorperoxidase aus Pseudomonia pyrrocmia, nachfolgend mit CPO-P bezeichnet
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP Bromperoxidase AI aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, nachfolgend mit BPO-Al bezeichnet
Bromperoxidase A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, nachfolgend mit BPO-A2 bezeichnet
- Chlorperoxidase aus Streptomyces aureofaciens Tu 24, nachfolgend mit CPO-T bezeichnet
Chlorperoxidase aus Streptomyces lividans, nachfolgend mit CPO-L bezeichnet
Chlorperoxidase aus Pseudomonas fluorescens, nachfolgenα mit CPO-F bezeichnet
Chlorperoxidase aus Serratia marcescens, nachfolgend mit CPO-S bezeichnet
Acetylcholmesterase aus Zitteraal, nachfolgend mit Ace bezeichnet
Die Herstellung der Enzyme erfolgt im wesentlichen nach Zellaufschluß und Entfernen der unlöslichen Zeilbestandteile durch Zentrifugation je nach Enzym über Hitzeschritt, Fallung von Fremdproteinen durch pH- Erniedrigung und anschließender Saulenchromatographie an unterschiedlichen Medien.
Das Gen der Bromperoxidase A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 sowie auch die Überexpression mit anschließender Reinigung ist im J. Gen.Microbiol. 138, S. 1123-1131 (1992) beschrieben. Die Reinigungen αer Bromperoxidasen BPO-Al und BPO-A2 aus S. aureofaciens ATCC 10762 sind in J. Gen. Microbiol. 137, S. 2539-2546 (1992) veröffentlicht.
Die Reinigungen der Chlorperoxidasen von Streptomyces aureofaciens TU 24 (CPO-T) und Pseudomonas pyrrocima finden sich im Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, S. 1225-1232 (1987) bzw. J. Biol. Chem. 263, S. 13725-13732 (1988) . Die Klonierung der Gene, die Uberexpression und die neuen, vereinfachten Reinigungsverfahren sind in J. Bacteriol. 170, S. 5890-5894 (1988) bzw. Gene 130, S. 131-135 (1993) beschrieben.
Eine Herstellungsvorschrift für das Enzym CPO-L findet sich in J. of Bacteriology, Vol. 176, S. 2339-2347 (1994). Das Enzym CPO-S wird aus dem Wildstamm isoliert (FEMS Microbiol. Lett. Vol. 129, S. 255-260 (1995)). Das Enzym Ace ist käuflich erwerbbar (Fa. Sig a) .
Zur Herstellung des Enzyms CPO-F wurde zur Klonierung des Gens ein synthetisches Oligonukleotid folgender Zusammensetzung verwendet:
TTT TAT AAA GAT TGG GG C C G C
Dieses Oligonukleotid wurde entsprechend der Angaben des Herstellers mit einem DIG Oligonukleotid 3' - END Labeling Kit der Firma Boehringer Mannheim markiert und mit EcoRI- verdauter Gesamt-DNA aus Pseudomonas fluorescens hybridisiert. DNA im hybridisierenden Bereich wurde isoliert und in den Plasmid-Vektor pUC18 ligiert und für' die Transformation von E. coli TG 1-Zellen verwendet. Ampicillin-resistente E. coli-Transformanten wurden mit Hilfe des Oligonukleotids durch Koloniehybridisierung auf Vorhandensein des Chlorperoxidasegens hin untersucht. Der erhaltene Klon enthielt ein 9 kb großes Insert, das mit BamHI/EcoRI-Verdauung zu einem 3.8 kb großen Insert verkleinert wurde. Dieses Fragment wurde ebenfalls in pUC18 ligiert und damit E.coli TG1 transformiert. Die resultierenden rekombinanten E. coli-Klone enthielten das Plasmid pSK380. Ausgehend von pSK 380 wurde durch Verdauung mit Xhol ein 2,3 kb großes Insert erhalten, das wiederum in pUC18 ligiert wurde (pSK230) . E. coli-Klone, die das Plasmid pSK 230 enthielten, produzierten erhöhte Mengen an CPO-F. Dazu wurde E. coli mit dem Plasmid pSK230 für 24 h gezüchtet, die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. NacΛ_ Ammoniumsulfatfallung (35 - 55 _ Sättigung) wurde die Proteinlosung langsam auf 55 °C erhitzt, dann auf Eis gekühlt und ausgefallenes Protein durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wurde die Losung auf einen
Proteingehalt von 5 mg/ml eingestellt und mit 1/100 Volumen einer Trypsmlosung (10 mg/ml) versetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert . Nach Ultrafiltrat cn (YM30-Membran) wurde die Proteinlosung auf eine mit 10 mM Natπumacetat-Puffer, pH 5,5, equilibrierte DEAE-Sephacel-Saule (10 ml) aufgetragen. Die Elution erfolgte mit einem NaCl-Gradienten von 0 - 0,6 M m 10 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,5 (10 ml) . Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Die Protemlosung wurde dann auf eine Sephacryl S 300-Saule, equiiibriert mit 0, 1 M Ammoniumacetat, pH 6,8, aufgetragen und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und bei -20 °C gelagert.
Das Sequenzprotokoll zeigt die Ammosauresequenzen αer Enzyme CPO-P, BPO-Al, BPO-A2, CPO-T, CPO-L und CPO-F. Die Ammosauresequenzen wurden von den nach der Kettenabbruchmethode erhaltenen DNA-Sequenzen abgeleitet.
Sichtbar ist, daß die Ammosauresequenzen der dargestellten Enzyme an gleicher Stelle gleiche Aminosäuren, nämlich die Aminosäuren Serin (Ser) , Histidin (His) und Asparaginsäure (Asp) aufweisen. Diese Aminosäuren bilden die kataly ische Triade der Enzyme.
Fig. 1 zeigt Gesamtansicht eine dreidimensionale Struktur des Enzyms Bromperoxιdase-A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, die αurch Rontgenstrukturanalysen erhalten wurde (Hecht et. al, Nature Struct. Biol. 1, S. 532-537 (1994) .
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP In Fig. 2 ist ein Ausschnitt der dreidimensionalen Struktur des Enzyms BPO-A2 dargestellt. Das aktive Zentrum mit der katalytischen Triade, bestehend aus Serin (Ser 101A) , Histidin (His 264A) und Aspartat (Asp 235A) , ist deutlich zu erkennen. Zusatzlich sind in Fig. 2 angegeben: Met 102A, Tyr 76A und Trp 211A.
Ausfύhrungsbeispiel 1
Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung unter Beteiligung von Chlorperoxidase
Die Mischung besteht aus
0,5 mg Chlorperoxidase aus Streptomyces aureofaciens TU 24 gelöst Wasser
4 ml 1 M Natriumacetat-Puffer pH 4, 0 und
- 15,7 μl (152 μmol) H202 (30%ιg) .
Vor Reaktion wird die Wasserstoffperoxidlosung getrennt von den anderen Komponenten gelagert. Diese Mischung soll nachfolgend für die Oxidation von Thioanisol zum entsprechenden Sulfoxid verwendet werαen.
Dazu werden zu 4 ml 1 M Natriumacetat-Puffer pH 4, 0 und 1 ml 1,4-Dιoxan 11,8 μl Thioanisol μnd 15,7 μl H202 30'.ιg gegeben. Dieser Losung werden 0,5 mg Chlorperoxidase aus Streptomyces aureofaciens TU 24 zugefugt und die Reaktion für 78 mm bei 22 °C inkubiert. Als alleiniges Proαukt wurde zu 100 % das Sulfoxid erhalten.
Ausfuhrungsbeispiel 2
Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung unter Beteiligung von Bromperoxiαase
Die Mischung besteht aus
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP 1 ml 0, 1 M Natriumacetat, pH 5,5
100 μl 0,03 % H202-Lösung
0,3 μg Bromperoxidase aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762.
Bis zur Reaktion wird die Wasserstoffperoxidlösung getrennt von den anderen Mischungskomponenten gelagert. Anhand einer Bromierungsreaktion von Monochlordimedonlösung soll die Anwendung der vorbenannten Mischung beschrieben werden:
Dazu werden zu 1 ml 0,1 M Natriumacetat pH 5,5 10 μl 4,8 mM Monochlordimedonlösung in Ethanol und 100 μl 0,03 % H202-Lösung gegeben. Dieser Lösμng werden 0,3 μg Bromperoxidase aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 sowie 100 μl 1 M Natriumbromidlösung zugefügt.
In dieser Lösung katalysiert die Bromperoxidase die Umwandlung von Natriumacetat in Peressigsäure. Die gebildete Peressigsäure reagiert dann weiter mit dem Natriumbromid. Dadurch wird das Bromidion oxidiert und es kommt zur vollständigen Bromierung des eingesetzten Monochlordimedons innerhalb von 10 min.
Ausführungsbeispiel 3
Enzymatisch, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung unter Beteiligung von Chlorperoxidase
Die Mischung besteht analog Ausführungsbeispiel 2 aus
1 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5
- 100 μl 0,03 % H202-Lόsung
0,3 μg Chlorperoxidase aus Pseudomonas pyrrocmia.
Bis zur Reaktion werden die Mischungkomponenten getrennt voneinander gelagert. Analog Ausführungsbeispiel 2 wird diese Mischung zur Bromierung einer Monochlordimedonlösung angewandt .
In der nachfolgenden Tabelle ist die Abhängigkeit der bromierenden Aktivität der Chlorperoxidase aus Pseudomonas pyrrocinia von der Temperatur aufgeführt:
Tabelle 1
% Aktivität
20 30
30 50
40 70
50 90
60 100
70 50
Tabelle 1 zeigt die Enzymaktivität über einen weiten Temperaturbereich, wobei bei 40 bis 70 °C gute und bei 60 °C die besten Ergebnisse erzielt werden.
Ausführungsbeispiel 4
Bromierung von Monochlordimedon mit einer enzymatischen, aktiven Sauerstoff liefernden Mischung unter Verwendung von Enzymen unterschiedlicher Herkunft
Analog Ausführungsbeispiel 2 wird jeweils eine Mischung aus
- 1 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5 100 μl 0,03 _ H202-Lösung und
10 mU Enzym CPO-P, CPO-T, BPO-Al, BPO-A2, CPO-F, CPO-L, CPO-S bzw. Ace hergestellt.
Bis zur Reaktion wird die Wasserstoffperoxidlösung getrennt von den anderen Mischungskomponenten gelagert. Anhand einer Bromierungsreaktion von Monochlordimedonlösung soll die Anwendung der vorbenannten Mischung beschrieben werden:
Dazu werden zu 1 ml 0, 1 M Natriumacetat pH 5,5 10 μl 4,8 mM Monochlordimedonlösμng in Ethanol μnd 100 μl 0,03 % H2θ2-Lösung gegeben. Dieser Lösung werden 10 mU Enzym sowie 100 μl 1 M Natriumbromidlösung zugefügt.
Anhand der Bromierungsreaktion von Monochlordimedon zu Monobrommonochlordimedon wird die Aktivität der enzymatischen Mischung bestimmt. Dabei wird Bromid durch die enzymatisch gebildete Persäure oxidiert und reagiert dann mit dem organischen Substrat Monochlordimedon. Hierbei führt ein mol Persäure zur Bromierung eines mols Monochlordimedon. Die Enzyme zeigen je nach Herkunft unterschiedliche spezifische Aktivitäten:
Enzym spez. Aktivität (unit/mg Protein)
CPO-P 63
CPO-T 9
BPO-Al 45
BPO-A2 15
CPO-F 4
CPO-L 19
CPO-S 390
Ace 0,013 Ausführungsbeispiel 5
Verfahren zur Herstellung von Peressigsäure
19 μg Chlorperoxidase werden in 1 ml IM Natriumacetat, pH 4,0 gelöst und mit 5 μl 30 % H2θ2~Lösung versetzt und für 50 min. bei 30 oC inkubiert. Die dabei entstehende Peressigsäure wird anhand der Oxidationsreaktion von 2-Chloranilin zu 2-Nitrochlorbenzol nachgewiesen.
Nachfolgende Tabellen geben Reaktionsergebnisse bei unterschiedlichen Mengen der Reaktionspartner Acetat und Wasserstoffperoxid wieder.
Tabelle 2:
2-Nitrochlorbenzolbildung in Abhängigkeit von unterschiedlichen H2θ2-Konzentrationen
H2θ2-Anteil Reaktionsprodukt
110 mM H202 95 ng 2-Nitrochlorbenzol
176 mM H202 160 ng 2-Nitrochlorbenzol
220 mM H202 200 ng 2-Nitrochlorbenzol
330 mM H202 230 ng 2-Nitrochlorbenzol
440 mM H20 240 ng 2-Nitrochlorbenzol Tabel le 3 :
2 -Nitrochlorbenzoibi ldung in Abhängigkeit von unterschiedlichen Acetatkonzentrat ionen
Acetat-Konzentration Reaktionsprodukt
20 mM Acetat 30 ng 2-Nitrochlorbenzol
100 mM Acetat 120 ng 2-Nitrochlorbenzol
200 mM Acetat 180 ng 2-Nitrochlorbenzol
500 mM Acetat 240 ng 2-Nitrochlorbenzol
1000 mM Acetat 240 ng 2-Nitrochlorbenzol
Die oben aufgeführten Tabellen zeigen eine Abhängigkeit sowohl von der Konzentration von Wasserstoffperoxid als auch von Acetat. Acetatgehalte bis zu 500 mM führen zu erhöhter Persäureproduktion.

Claims

Patentansprüche
1. Enzymatische, aktiven Sauerstoff bildende Mischung in trockener oder flussiger Form, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus
Oxidoreduktase mit einer α/ß-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure, einer Peroxidquelle und - einer organischen Saure oder derem Salz besteht,
und wassriger Losung angewandt wird.
2. Mischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus
- in Wasser gelöster Oxidoreduktase mit einer α/ß- Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure, Peroxidlosung - einer wassrigen Losung einer organischen Saure oder derem Salz besteht,
wobei bis zur Anwendung dieser Mischung die Peroxidlosung getrennt von den anderen Komponenten aufbewahrt wird.
3. Mischung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase bakterielle Nicht-Ham- Haloperoxidase, als organische Saure Essigsaure oder Propionsäure oder Milchsaure oder deren Salze und als Peroxidquelle Wasserstoffperoxid oder Natriumperborat eingesetzt werden.
4. Mischung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als bakterielle Nicht-Ham-Haloperoxidase Chlorperoxidase oder Bromperoxidase eingesetzt werden.
5. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil Oxidoreduktase pro 0,15 bis 50 μmol Wasserstoffperoxid und pro 100 umol Säure oder deren Salz 8 bis 16 mU betragt.
6. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil Oxidoreduktase bei Einsatz von Natriumperborat 8 bis 16 mU pro 0,15 bis 50 umol in Lösung freigesetztem Wasserstoffperoxid betragt.
7. Verfahren zur Herstellung von organischen Persauren, dadurch gekennzeichnet, daß in Anwesenheit von Oxidoreduktase mit einer α/ß- Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure und Wasserstoffperoxid oder Peroxidverbindungen organische Sauren oder deren Salzen in wassriger Losung bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und bei Temperaturen zwischen 15 und 80 °C zu organischen Persauren umgewandelt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase bakterielle Nicht-Ham- Haloperoxidase, als Peroxidverbindung Natnumperborat und als organische Saure Essigsaure oder Propionsäure oder Milchsäure oder deren Salze eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als bakterielle Nicht-Häm-Haloperoxidase Chlorperoxidase oder Bromperoxidase eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß pro 0,15 bis 50 μmol Wasserstoffperoxid und pro 100 umol Säure oder Salz 8 bis 16 mU Nicht-Häm- Haloperoxidase eingesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei Einsatz von Natriumperborat 8 bis 16 U Oxidoreduktase pro 0, 15 bis 50 umol in Lösung freigesetztem Wasserstoffperoxid eingesetzt werden.
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