EP0904409A1 - Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens

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EP0904409A1
EP0904409A1 EP97924874A EP97924874A EP0904409A1 EP 0904409 A1 EP0904409 A1 EP 0904409A1 EP 97924874 A EP97924874 A EP 97924874A EP 97924874 A EP97924874 A EP 97924874A EP 0904409 A1 EP0904409 A1 EP 0904409A1
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EP
European Patent Office
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blood
dna
paper
dna analysis
absorbent
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Withdrawn
Application number
EP97924874A
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English (en)
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Inventor
Richard Grosse
Eva Spitzer
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Institut fur Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh
Original Assignee
Institut fur Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut fur Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh filed Critical Institut fur Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh
Publication of EP0904409A1 publication Critical patent/EP0904409A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5023—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures with a sample being transported to, and subsequently stored in an absorbent for analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0409—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces centrifugal forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation

Definitions

  • the invention relates to a method for DNA analysis of blood and a means for performing the method.
  • the field of application of the invention is medical diagnostics.
  • Familial hypercholesterolemia is one of the most common autosomal dominant inherited diseases (about 1 in 500 people, arterosclerosis, thrombosis, and vascular biology: Vol. 15, 12 (1995)) with a high risk of heart attack.
  • a genetic test for FH would make high-risk patients 2 Detect early and deliver targeted drug therapy with cholesterol-lowering drugs that significantly reduces the risk of heart attack. This would affect several 100,000 people in Germany. Similar considerations apply to the early detection of cancer risk patients. The genetic test is the most accurate
  • DNA is isolated from a blood sample
  • a DNA section containing the mutation is amplified by means of polymerase chain reaction (PCR);
  • the mutated and the normal DNA section are compared with one another by gel electrophoretic separation methods and / or Southern blots.
  • the DNA section must be sequenced to identify an unknown mutation.
  • Whole blood is common as the starting material for the preparation of pure DNA in molecular biological research.
  • a minimum amount of blood of 5-10 ml is necessary to purify such DNA.
  • the DNA is usually purified according to the following scheme (Proc.Natl.Acad.Sc.: Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants 74, 1245 (1977)), which is still verified differently by the laboratories: - About 10 ml of EDTA blood are lysed in the buffer containing 1% Triton x-100;
  • An FTA® is from Fitzco, Inc., Maple Piain, MN, USA
  • Gene Guard System for blood samples for DNA analysis using PCR known to be a complex system for the collection Transport that represents storage and purification of DNA. It includes a cleaning reagent, a collection and
  • the method for DNA analysis in the blood is based on the surprising finding that an existing amount of blood must not exceed 0.05 ml of blood per cm 3 of an area carrier, since otherwise the PCR is inhibited. This is due to the fact that blood proteins, such as hemoglobin, carry metal ions such as Fe or Zn, which inhibit the PCR.
  • the blood to be examined is applied to an absorbent, porous surface carrier for transport or storage, this surface carrier is incubated with water for analysis and the blood cell suspension obtained is concentrated. This is preferably done by rapid centrifugation, particularly preferably for 3 minutes at 14,000 x g. A solid pellet is obtained which is processed further; over 90% of the supernatant is discarded.
  • the pellet is then mixed with a chelating agent and heated up to 100 ° C.
  • a chelating agent In a preferred one
  • This heating is carried out in two stages; in a first step to 50 to 60 ° C and then to 100 ° C. According to the invention, the heating can also take place immediately at 100 ° C. Surprisingly, this heating to 100 ° C. after chelex chromatography produces an optimal DNA yield for the subsequent PCR.
  • the mixture is then centrifuged again and the DNA solution obtained as a supernatant is analyzed in a conventional manner, if appropriate after further storage at -20 ° C.
  • the essential function of the chelating agent is that polyvalent metal ions are bound and the DNA is protected during the temperature treatment. This optimizes the subsequent PCR treatment.
  • any commercially available chelating agent can be used.
  • Paper, cellulose, plastic films, cotton or linen are used as surface supports.
  • Preferred is the use of filter paper, especially filter paper, as is used in routine clinical diagnostics, e.g. B. as Guthrie paper, is used. Whatman blotting paper as used in Southern, Northern and analog techniques is also preferred.
  • This paper is expediently designed in the form of a card which has several circular fields for taking the blood samples, contains instructions for using the card and fields for information about the patient, the doctor treating the patient and the date (Fig. 1).
  • the filter paper used as a surface support preferably has an absorption capacity of 0.03-0.05 ml blood / cm 2 .
  • the invention also relates to the means for transporting or storing blood for DNA analysis, comprising absorbent, porous surface supports such as paper, cellulose, plastic film, cotton or linen.
  • the preferred medium is filter paper, especially filter paper with an absorption capacity of 0.03-0.05 ml blood / cm a .
  • the invention further relates to the use of blood applied to an absorbent, porous surface support for DNA analysis, preferably paper-dried blood.
  • the patient samples can be sent in normal envelopes as paper-dried blood spots for the genetic test. Express delivery and sample cooling are no longer necessary. The genetic test can therefore be offered nationwide
  • Vein blood is no longer required. The patient can send in finger blood himself.
  • the unused blood spots on the marked paper circles can be kept for archival purposes.
  • the DNA extract can be obtained within 2 hours and can be used directly for the PCR.
  • the process can be carried out without special and expensive reagents (buffer systems) for paper treatment or blood extraction. Furthermore, no special punches for removing the blood spots and no special PCR tubes are required, which reduces the price a DNA isolation according to the method of the invention can be reduced by more than 10 times (DNA isolation after
  • the invention thus provides a simple, quick and safe method for producing a DNA extract from paper-dried blood for carrying out genetic tests. Critical amounts of DNA can also be obtained with the method according to the invention. Since no special sample transport is required and the diagnosis can be made in the doctor's office about 7 days after the blood has been drawn, there is an essential prerequisite for being able to offer the genetic test according to the invention, in particular, to the general practitioner, in whose hands the responsibility for early detection and prevention lies.
  • the first step, the blood sample preparation for the genetic test by the "family doctor" is uncomplicated, safe, quick and inexpensive, and can be carried out by the patient himself at home.
  • Simple filter paper is provided with circles with a diameter of 1 cm. The circles are wetted with approx. 0.04 ml of blood, which can be taken from the finger, vein, heel or ear. Venous blood is not required. The paper must be such that it can absorb about 0.03-0.05 ml of blood per cm 2 . 3-4 mm strips of paper are cut out of the blood spot and placed in a small Eppendor tube (for comparison purposes, 3-10 microliters of fresh whole blood can be pipetted directly into an Eppendor tube). Then l ml of water are added and incubated on a rocker for 20 min by gently swirling the tube. Then the

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Abstract

Das erfindungsgemäße Verfahren zur DNS-Analytik im Blut ist dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht wird, der vorzugsweise eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 aufweist. Dieser Flächenträger wird anschließend mit Wasser inkubiert, die erhaltene Blutzellsuspension wird konzentriert, mit einem chelierenden Agens versetzt und auf exakt 100 °C erhitzt, danach zentrifugiert, und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung, ggf. nach weiterer Lagerung bei -20 °C, wird in an sich üblicher Weise analysiert.

Description

Verfahren zur DNS-Analytik von Blut und Mittel zur Durchführung des Verfahrens
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNS-Analytik von Blut und ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Es gilt heute als gesichert, daß mindestens 5000 Krankheiten genetisch bedingt, das heißt erblich übertragbar, sind. Etwa 450 Erbkrankheiten sind aufgrund der Entschlüsselung der zugrunde liegenden Gene und ihrer krankheitsauslösenden Defekte (Genmutationen) einer Diagnostik zugänglich (JAMA: Statement on use of DNA testing for presymptomatic identification of cancer risk 271, 785 (1994)). Die meisten dieser Erbkrankheiten sind monogen ( gleichbedeutend mit der Zuordnung nur eines einzelnen Gens zu einer bestimmten Krankheit) und umfassen relativ seltene Krankheiten, die im frühen Kindesalter auftreten und als unheilbar gelten. Dazu gehören beispielsweise Mukoviszidose, Muskeldystrophie oder das Fragile(X) Syndrom (BioEssays: Trinucleotide repeat expansion and human genetic diseases 16, 277 (1994)). In den letzten 5 Jahren hat sich überraschend herausgestellt, daß auch eine Vielzahl von sogenannten Volkserkrankungen vererbt werden können. Dazu gehören solche häufig vorkommenden Krankheiten wie Hypertonie und Arteriosklerose, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Diabetes, Alzheimer u.a. Die meisten dieser Krankheiten können bei rechtzeitiger Diagnose erfolgreich therapiert werden. Damit haben sich die Anwendungsmöglichkeiten der Gendiagnostik dramatisch erweitert. Familiäre Hyper¬ cholesterinämie (FH) zum Beispiel ist eine der am häufigsten auftretenden autosomal dominanten Erbkrankheiten (etwa 1 von 500 Menschen, Arterosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology: Vol. 15, 12 (1995)) mit einem starken Risiko für Herzinfarkt. Ein Gentest für FH würde Hochrisikopatienten 2 frühzeitig erfassen und einer gezielten medikamentösen Therapie mit Cholesterinsenkern zuführen, die das Infarktrisiko deutlich senkt. Davon wären in Deutschland mehrere 100.000 Menschen betroffen. Ähnliche Betrachtungen gelten für die Früherkennung von Krebsrisikopatienten. Der Gentest ist die genaueste
Vorsorgemaßnahme, da er die Ursache, nicht das Symptom, der
Krankheit bestimmt. Wir sprechen in diesem Zusammenhang von der präsymptomatischen, also vorbeugenden genetischen Diagnostik.
In den USA belaufen sich wirtschaftliche Betrachtungen zum Gen- testmarkt auf etwa 7 Milliarden Dollar für die kommenden 5-10
Jahre.
Die molekulargenetische Gendiagnostik wird in folgenden Schritten durchgeführt (Nature Medicine: Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients 2, 169 (1996)):
1. Aus einer Blutprobe wird DNS isoliert;
2. Mittels Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) wird ein die Mutation enthaltender DNS-Abschnitt amplifiziert;
3. Der mutierte und der normale DNS-Abschnitt werden durch gelelektrophoretische Trennverfahren und/oder Southern Blots miteinander verglichen.
4. In besonderen Fällen muß der DNS-Abschnitt zur Identifizierung einer unbekannten Mutation sequenziert werden.
Als Ausgangsmaterial zur Präparation reiner DNS in der molekularbiologischen Forschung ist Vollblut üblich. Zur Reinigung derartiger DNS ist eine Mindestmenge an Blut von 5-10 ml notwendig.
Üblicherweise wird die DNS nach folgendem Schema (Proc.Natl.Acad.Sc. : Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants 74, 1245 (1977)) gereinigt, das von den Laboren noch unterschiedlich verifiziert wird: - ca. 10 ml EDTA Blut werden im Puffer lysiert, der 1% Triton x-100 enthält;
- 10 min Zentrifugation;
- Aufnahme des Pellets in 1 ml 0,9% NaCl; - Lyse in 10% SDS plus EDTA;
- Zugabe von Na-perchlorat;
- Zugabe von Chloroform/Octanol zur Herausbildung von 2 Phasen;
- 20 min Zentrifugation;
- obere Phase plus 5ml Chloroform; - 5 min Zentrifugation;
- obere Phase abnehmen;
- mit Isopropanol die DNS fällen und mit Glasstab aufwickeln;
- in kaltem Alkohol waschen;
- in NaCl/Na-citrat über Nacht lösen; - Umfallen mit Alkohol, zentrifugieren, trocknen und bei -20°C aufbewahren.
Der Nachteil dieses bisher in der klinischen Diagnostik angewandten Verfahrens besteht darin, daß generell 5-10 ml EDTA-Blut des Patienten (immer Venenblut!) innerhalb von 48 Std. kühl gelagert in das genetische Labor transportiert werden müssen.
Das erfordert gewöhnlich einen Express-Probentransport bevorzugt auf Eis, dem sich die 2 tägige DNS-Isolierung anschließt. Der eigentliche Gentest mit der PCR beginnt also erst etwa 4 Tage nach Blutabnahme in der Arztpraxis. Das bedeutet, daß beispielsweise die Diagnose für den Gentest Mukoviszidose frühestens nach 14 Arbeitstagen gestellt werden kann. Schickt der Arzt das Blut nicht sofort nach Entnahme per Express ein, so gerinnt das Blut häufig, wodurch eine ordentliche DNS-Isolierung unmöglich wird.
Von der Firma Fitzco, Inc., Maple Piain, MN, USA ist ein FTA®
Gene Guard System für Blutproben zur DNA-Analyse mittels PCR bekannt, das ein komplexes System für die Kollektion, den Transport, die Lagerung und Reinigung von DNA darstellt. Es umfaßt ein Reinigungsreagenz, einen Kollektions- und
Reinigungskit sowie eine Stanze. Dieses System ist jedoch relativ teuer, da es für jeden Patienten dieses speziell kostenaufwendig vorbehandelten Trägers bedarf.
Die Erfindung hat deshalb das Ziel, den Gentest für die medizinische Diagnostik zu verbessern. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein schnelles, unkompliziertes und kostensparendes Verfahren zur Erfassung von Blutproben durch den Hausarzt und selbstversorgenden Patienten und ihrer Weiterverarbeitung zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Mittel zum Transport und zur Lagerung von Blutproben bereitzustellen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Das Verfahren zur DNS-Analytik im Blut beruht auf der überaschenden Erkenntnis, daß eine vorhandene Blutraenge 0,05 ml Blut pro cm3 eines Flächenträgers nicht übersteigen darf, da ansonsten die PCR gehemmt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Blutproteine, wie z.B. Hämoglobin, Metallionen wie Fe oder Zn tragen, welche die PCR hemmen.
Erfindungsgemäß wird das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht, dieser Flächenträger wird zur Analyse mit Wasser inkubiert und die erhaltene Blutzellsuspension wird konzentriert. Das geschieht vorzugsweise durch schnelle Zentrifugation, besonders bevorzugt für 3 Minuten bei 14.000 x g. Man erhält einen festen Pellet, der weiter verarbeitet wird; der Überstand wird zu über 90 % verworfen.
Anschließend versetzt man den Pellet mit einem chelierenden Agens und erhitzt bis zu 100 °C. In einer bevorzugten
Ausführungsvariante erfolgt dieses Erhitzen in zwei Etappen; in einem ersten Schritt auf 50 bis 60 °C und anschließend auf 100 °C. Erfindungsgemäß kann das Erhitzen auch sofort auf 100 °C erfolgen. Überraschend bewirkt erst dieses Erhitzen auf 100 °C nach der Chelexchromatographie eine optimale DNS-Ausbeute für die nachfolgende PCR.
Danach wird wiederum zentrifugiert und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung wird, ggf. nach weiterer Lagerung bei -20° C, in an sich üblicher Weise analysiert. Die wesentliche Funktion des chelierenden Agens besteht darin, daß polyvalente Metallionen gebunden werden und die DNS bei der Temperaturbehandlung geschützt wird. Die spätere PCR-Behandlung wird dadurch optimiert. Gemäß der Erfindung kann jedes handelsübliche chelierende Agens eingesetzt werden.
Als Flächenträger werden Papier, Zellulose, Kunststoffolien, Baumwolle oder Leinen verwendet. Bevorzugt ist der Einsatz von Filterpapier, speziell von Filterpapier, wie es in der klinischen Routinediagnostik, z. B. als Guthriepapier, Verwendung findet. Ebenfalls bevorzugt ist Whatman-Blotting- Papier, wie es bei Southern, Northern und analogen Techniken gebraucht wird.
Dieses Papier ist zweckmäßigerweise in Form einer Karte ausgebildet, welche mehrere kreisförmige Felder zur Aufnahme der Blutproben aufweist, eine Anweisung zum Gebrauch der Karte sowie Felder für Angaben zum Patienten, zum behandelnden Arzt und zum Datum enthält (Abb. 1).
Das als Flächenträger eingesetzte Filterpapier weist bevorzugt eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 auf.
Gegenstand der Erfindung ist auch das Mittel zum Transport bzw. zur Lagerung von Blut für die DNS-Analyse, umfassend saugfähige, poröse Flächenträger wie Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen. Das bevorzugte Mittel ist Filterpapier, speziell Filterpapier mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cma.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von auf einem saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebrachtem Blut zur DNS-Analytik, bevorzugt von papiergetrocknetem Blut.
Das neue erfindungsgemäße Verfahren bietet folgende Vorteile gegenüber dem üblichen Verfahren zur DNS-Gewinnung aus frischem Vollblut:
1. Die Patientenproben können per Normalpost im Briefumschlag als papiergetrocknete Blutspots für den Gentest eingesandt werden. Expresszustellung und Probenkühlung entfallen. Der Gentest kann also überregional angeboten werden
2. Venenblut ist nicht mehr erforderlich. Der Patient kann selbst Fingerblut einsenden.
3. Die nicht verwendeten Blutspots auf den vorgezeichneten Papierkreisen können für archivarische Zwecke aufbewahrt werden.
4. Der DNS-Extrakt kann innerhalb von 2 Stunden gewonnen werden und ist direkt einsetzbar für die PCR.
5. Die Erstellung einer Gentestdiagnose (Mutations-und Deletionsscreening) verkürzt sich von ca. 14 Tagen mit Beginn der Blutabnahme in der Arztpraxis bei konventionellem Vollblut auf ca. 7 Tage bei papiergetrocknetem Blut, d.h. um fast die Hälfte.
Im Vergleich zu anderen Trägern (Firma Fitzco) ist eine kostenaufwendige Vorbehandlung des erfindungsgemäßen Trägers nicht erforderlich. überraschend ist das Verfahren ohne spezielle und teure Reagenzien (Puffersysteme) für die Papierbehandlung bzw. Blutextraktion durchführbar. Desweiteren sind keine speziellen Stanzen zur Entfernung der Blutspots und auch keine speziellen PCR-Röhrchen vonnöten, wodurch der Preis einer DNS-Isolierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren um mehr als das 10-fache gesenkt werden kann (DNS-Isolierung nach
Fitzco, Inc.: pro Patient ca. 3 Dollar, DNS-Isolierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ca. 0,20 DM/Patient). Das bedeutet darüber hinaus, daß das erfindungsgemäße Verfahren in jedem
Labor für die jeweilige PCR eingesetzt werden kann.
Mit der Erfindung wird also ein einfaches, schnelles und sicheres Verfahren zur Herstellung eines DNS-Extraktes aus papiergetrocknetem Blut für die Durchführung von Gentests zur Verfügung gestellt. Auch kritische Mengen DNA können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden. Da kein spezieller Probentransport erforderlich ist und die Diagnose in ca. 7 Tagen nach Blutentnahme in der Arztpraxis gestellt werden kann, ist eine wesentliche Voraussetzung gegeben, um den erfindungsgemäßen Gentest insbesondere der niedergelassenen Ärzteschaft anbieten zu können, in deren Händen die Verantwortung für Früherkennung und Vorsorge liegt. Der erste Schritt, die Blutprobenbereitstellung für den Gentest durch den "Hausarzt", ist unkompliziert, sicher, schnell und preiswert, und kann selbst vom Patienten zu Hause durchgeführt werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Ausführunσsbeispie1
Einfaches Filterpapier wird mit Kreisen eines Durchmessers von 1 cm versehen. Die Kreise werden mit je ca. 0,04 ml Blut, das beliebig aus Finger, Vene, Ferse oder Ohr entnommen werden kann, benetzt. Venenblut ist nicht erforderlich. Das Papier muß so beschaffen sein, daß es etwa 0,03-0,05 ml Blut per cm2 aufsaugen kann. Aus dem Blutspot werden 3-4 mm Papierstreifen ausgeschnitten und in ein kleines Eppendorfröhrchen gelegt (für Vergleichszwecke können 3-10 Mikroliter frisches Vollblut direkt in ein Eppendorfröhrchen pipettiert werden). Dann wird l ml Wasser zugegeben und bei leichtem Schwenken des Röhrchens auf einer Wippe 20 min inkubiert. Anschließend werden die
Blutzellen für 3 min bei 14.000 x g zentrifugiert. Der
Überstand wird bis auf 20-30 Mikroliter verworfen. Zum Niederschlag werden 0,18 ml 5% Chelex 100 der Firma Bio-Rad,
Richmond,USA, (BioTechniques: Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR based typing from forensic material
513, 506 (1991)) bis auf ein Gesamtvolumen von 0,2 ml unter
Schütteln zugegeben. Anschließend wird bei 56° C für 20 min auf einem Vortex-Schüttler, danach bei 100° C für 8 min geschüttelt. Die Suspension wird dann bei 14.000 x g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgenommen und bei -20° C aufbewahrt. Direkt aus dieser Lösung werden in den PCR Ansatz 1-15 Mikroliter per 25 Mikroliter Ansatzvolumen pipettiert. Zum Vergleich wurde das Verfahren, wie oben ausgeführt, mit 3-10 Mikroliter Vollblut durchgeführt. Für Vergleichszwecke wurden ein Mutationssreening für Mukoviszidose, ein Deletionsscreening für Muskeldystrophie Typ Duchenne/Becker und ein Mutationsscreening für Familiäre Hypercholesterinämie parallel mit papiergetrocknetem bzw. mit Vollblut aus Probanden durchgeführt. Die Ergebnisse sind identisch.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur DNS-Analytik im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht wird, dieser Flächenträger mit Wasser inkubiert wird, die erhaltene Blutzellsuspension konzentriert, mit einem Chelator versetzt und erhitzt wird, zentrifugiert wird und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung, ggf. nach weiterer Lagerung, in an sich üblicher Weise analysiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Blutzellsuspension durch schnelle Zentrifugation für 3 Minuten bei 14.000 x g erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß daß nach dem Chelatschritt das Erhitzen auf exakt 100 °c erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei Etappen erhitzt wird, in einem ersten Schritt auf 50-60 °C und in einem zweiten Schritt auf 100 °c.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Flächenträger mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Flächenträger Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
Filterpapier verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Blottingpapier verwendet wird.
9. Mittel zum Transport bzw. zur Lagerung von Blut für die DNS- Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß es saugfähige, poröse Flächenträger wie Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen umfaßt.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 aufweist.
11. Verwendung von auf einem saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebrachtem Blut zur DNS-Analytik.
12. Verwendung von papiergetrocknetem Blut mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 zur DNS-Analytik.
EP97924874A 1996-05-03 1997-05-02 Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens Withdrawn EP0904409A1 (de)

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