EP0917573A2 - Rekombinanter myelin protein zur behandlung von t-zell vermittelten autoimmunerkrankungen - Google Patents
Rekombinanter myelin protein zur behandlung von t-zell vermittelten autoimmunerkrankungenInfo
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- EP0917573A2 EP0917573A2 EP97935447A EP97935447A EP0917573A2 EP 0917573 A2 EP0917573 A2 EP 0917573A2 EP 97935447 A EP97935447 A EP 97935447A EP 97935447 A EP97935447 A EP 97935447A EP 0917573 A2 EP0917573 A2 EP 0917573A2
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Definitions
- the invention relates to the use of recombinant myelin protein for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases of the peripheral nervous system.
- autoimmune genetics have been treated by immunosuppressive or immunomodulating therapy.
- common treatment methods are the administration of steroids (e.g. cortisone), immunoglobulins and long-term immunosuppressive drugs (e.g. azathiopm) or the implementation of plasmaphoresis.
- steroids e.g. cortisone
- immunoglobulins e.g. azathiopm
- long-term immunosuppressive drugs e.g. azathiopm
- the object of the present invention is therefore to provide a possibility with which T-cell-mediated autoimmune diseases of the peripheral nervous system can be treated successfully and gently.
- autoimmune B-cell and T-cell responses directed against pe ⁇ phere myelin components play an important role in the pathogenesis of inflammatory demyelinating diseases of the nervous system.
- diseases are known as immune neuropathies of the peripheral nervous system, e.g. chronic inflammatory polyneuropathy,
- T-lymphocytes are generated, which are specific for structural proteins of the myelin of the peripheral nervous system and lead to demyelination and inflammation in the peripheral nervous system.
- This model disease is representative of the aforementioned autoimmune diseases of the peripheral nervous system, in which an increased number of T cells, demyelination and nerve inflammation also occur.
- T cell mediated autoimmune disorders of the peripheral nervous system by administration of high doses of the autoantigen, i.e. can be reversed or at least improved by high-dose administration of myelin protein.
- This therapy is called high-dose antigen therapy and leads to a gentle death of the T cells (T cell apoptosis), which is ultimately responsible for the triggering and the course of the
- Intravenous injection is particularly preferred.
- myelin proteins such as PO, peripheral myelin glycolipids (eg GM 1), MBP, PLP, MOG, MAG, S-100 protein and in particular P2 are suitable as the autoantigen to be administered.
- myelin protein should be understood to include mixtures of different proteins, protein fragments and mixtures of protein fragments. It should be emphasized that these proteins should have been produced recombinantly, since it is very expensive and time-consuming to purify the proteins in sufficient quantities from natural myelin . In addition, when using purified protein from bovine nerve myelin, BSE can easily be transmitted.
- Fig. 1 A + B Treatment of EAN with different doses of rhP2
- Fig. 2 Suppression of a rat T cell line by administration of antigen in high doses
- Fig. 3 A Immunocytochemical analysis of T cell infiltration in rhP2-treated rats and rhPO control animals in the presence of EAN. The values are given as the mean density of T cells / mm 2 ⁇ standard deviation of 3 animals / group.
- Fig. 3 B T cell apoptosis in treated animals compared to spontaneous T cell apoptosis in control animals.
- the values are given as the mean density of apoptotic cells / mm 2 ⁇ standard deviation of 3 animals / group.
- Fig. 4 Nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of the human recombinant (complete sequence) and bovine P2 proteins (only the amino acid exchanges are given). Introduced restriction enzyme sites and histidine tail sequences are underlined.
- mice Female Lewis rats (age: 6-8 weeks; weight: 1 25-1 60 g) were used.
- Neuritogenic P2-specific T cell lines G5 and G7 were produced as described in "Linington et al., J. Immunol. 1 33, 1 946- 1 950 (1 984)".
- the rats which had been injected with 8 ⁇ 10 6 P2-specific T cells, were divided into different groups 3 days after the T cell injection:
- Group 1 received 500 ⁇ g rhP2 twice a day
- Group 2 received 100 ⁇ g rhPO twice daily
- group 3 received 100 ⁇ g rhP2 twice daily
- group 4 received 500 ⁇ g ovalbumin twice daily.
- T cells were incubated with increasing doses of rhP2 or the neuritogenic P2 peptide (amino acids 53-78).
- rhP2 or the neuritogenic P2 peptide amino acids 53-78.
- 1.5 x 10 4 responder G5 or G7 T cells, 7.5 x 10 5 irradiated (3000 rad) thymocytes and various concentrations of rhP2 or the neuritogenic P2 peptide in a total volume of 100 ⁇ l per well were mixed into one 96-well microtiter plate filled. After 48 hours, the cells were labeled with 0.2 ⁇ Ci / well 3 H-dT for 16 hours and harvested at the indicated time. The cells were collected on a glass fiber filter paper and the radioactivity distribution was evaluated.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinantem Myelinprotein zur Behandlung von T-Zell vermittelten Autoimmunerkrankungen des peripheren Nervensystems.
Description
REKOMBINANTER MYELIN PROTEIN ZUR BEHANDLUNG VON T-ZELL VERMITTELTEN AUTOIMMUNERKRANKUNGEN
Die Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinantem Myelinprotein zur Behandlung von T-Zell vermittelten Autoimmunerkrankungen des peripheren Nervensystems.
Bisher werden Nervenerkrankungen autoimmuner Genese durch eine i munsu- pressive oder immunmodulierende Therapie behandelt. Beispielsweise sind gewohnliche Behandlungsmethoden die Gabe von Steroiden (z.B. Kortison) , Im- munglobulinen und Langzeitimmunsuppressiva (z.B. Azathiopm) oder die Durchfuhrung von Plasmaphorese. Allerdings besteht bei diesen Maßnahmen der Nachteil vieler unerwünschter Nebenwirkungen, und der Erfolg ist oft unzureichend.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb dann, eine Möglichkeit bereitzustellen, mit dem T-Zell vermittelte Autoimmunkrankheiten des peripheren Nervensystems erfolgreich und schonend behandelt werden können.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verwendung von rekombinantem Myelinprotein gemäß Patentanspruch 1 bzw. 2. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteranspruchen.
Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß Autoimmun-B-Zell- und -T-Zell- Antworten, die gegen peπphere Myelin-Komponenten gerichtet sind, eine wichtige Rolle bei der Pathogenese entzündlicher demyelinierender Krankheiten des Nervensystems spielen. Bekannt sind diese Erkrankungen als Immunneuropa- thien des peripheren Nervensystems, z.B. chronisch entzündliche Polyneuπtis,
Guillain-Barre Syndrom, Vaskulitiden des peripheren Nervensystems und Nervenentzündungen bei Gammopathien.
Das Vorhandensein neuritogener Moleküle in Myelin wurde erstmals nachgewiesen durch die Induktion einer experimentellen Autoimmunneuritis (EAN) am Tiermodell, wo Nagetiere mit Homogenaten von peripherem Nervengewebe (Waksman et al., J. Exp. Med. 102, 21 3-235 ( 1 955)) oder gereinigtem P2- Protein (Brostoff et al. , Nature (New Biol.) 235, 210-21 7 ( 1 972)) immunisiert wurden. Bei dieser Modellerkrankung des peripheren Nervensystems erfolgt eine Disregulation des Immunsystems und es werden autoaggressive T-Lymphozyten erzeugt, die spezifisch für Strukturproteine des Myelins des peripheren Nervensystems sind und zu einer Demyelinisierung und zu Entzündungen im peripheren Nervensystem führen. Diese Modellerkrankung steht stellvertretend für die vorgenannten Autoimmunerkrankungen des peripheren Nervensystems, bei denen auch eine erhöhte T-Zellzahl, Demyelinisierung und Nervenentzündungen auftreten.
Von den Erfindern wurde nun gefunden, daß diese T-Zell vermittelten Autoimmunerkrankungen des peripheren Nervensystems durch Gabe von hohen Dosen des Autoantigens, d.h. durch hochdosierte Gabe von Myelinprotein, wieder rückgängig gemacht bzw. wenigstens verbessert werden können. Diese Therapie nennt sich Hoch-Dosis-Antigen-Therapie und führt zu einem schonenden Tod der T-Zellen (T-Zell-Apoptose), die letztendlich für die Auslösung und den Verlauf der
Krankheit verantwortlich sind. Es hat sich dabei als besonders geeignet herausgestellt, die Hoch-Dosis-Antigen-Therapie schon in einem frühen Krankheits¬ stadium durchzuführen. Aber auch bei einem fortgeschrittenen Krankheitsbild lassen sich noch beachtliche Erfolge verbuchen. So hat es sich bewährt, bei der Ratte das Antigen (Myelinprotein) in Dosen von 1 00 bis 500 μg zu verabreichen.
Beim Menschen müssen entsprechend des höheren Körpergewichts höhere Dosen angewandt werden, die der Fachmann leicht bestimmen kann. Besonders bevorzugt ist die intravenöse Injektion.
Als zu verabreichendes Autoantigen eignen sich alle bisher bekannten Myelinproteine, wie z.B. PO, periphere Myelinglykolipide (z.B. GM 1 ), MBP, PLP, MOG, MAG, S- 100 Protein und insbesondere P2. Erfindungsgemäß soll der Begriff
"Myelinprotein" so verstanden werden, daß darunter auch Gemische verschiedener Proteine, Proteinfragmente und Gemische von Proteinfragmenten fallen Hervorzuheben ist, daß diese Proteine rekombinant hergestellt worden sein sollten, da es sehr teuer und aufwendig ist, die Proteine in ausreichender Menge aus naturlichem Myelin zu reinigen. Außerdem kann es bei Verwendung von gereinigtem Protein aus Rindernervenmyelin leicht zu Übertragung von BSE kommen. Hinzu kommt, daß sich beim Menschen die Reaktion auf gereinigtes Rinderprotein sehr strak von der auf humanes P2 unterscheidet, da zwischen der menschlichen Sequenz und der vom Rind einige Aminosäurenunterschiede bestehen. Deshalb wurde bisher für T-Zellversuche natürliches humanes P2 eingesetzt, da rekombinantes Protein noch nicht verfugbar war. Dieses konnte jedoch inzwischen herstellt werden und es ist erfindungsgemaß besonders bevorzugt rekombinantes humanes P2-Proteιn zu verwenden. Die Sequenz und Isolierung dieses Proteins ist in "Weishaupt et al., J of Neuroimmunology 63, 1 49-1 56 ( 1 995)" beschrieben Die in dieser Veröffentlichung gezeigte Sequenz ist in Abb. 4 wiedergegeben. Weitere rekombinante Myelinproteine sind in Oettinger et al. , J. of Neuroimmmunology 44, 1 57- 1 63 ( 1 993) beschrieben.
Die Erfindung wird nun weiter anhand der Abbildungen beschrieben, von denen zeigen
Abb. 1 A + B: Behandlung von EAN mit verschiedenen Dosen von rhP2
Abb. 2 Suppression einer Ratten-T-Zellinie durch Gabe von Antigen in hoher Dosierung
Abb. 3 A: Immunocytochemische Analyse der T-Zell Infiltration in rhP2- behandelte Ratten und rhPO-Kontroll-Tiere bei Vorliegen von EAN. Die Werte sind als mittlere Dichte von T-Zellen/mm2 ± Standardabweichung von 3 Tieren/Gruppe angegeben.
Abb. 3 B* T-Zell-Apoptose bei behandelten Tieren im Vergleich zu
spontaner T-Zell-Apoptose bei Kontrolltieren. Die Werte sind als mittlere Dichte von apoptotischen Zellen/mm2 ± Standardabweichung von 3 Tieren/Gruppe angegeben.
Abb. 4: Nukleotidsequenz und entsprechende Aminosäuresequenz des menschlichen rekombinanten (komplette Sequenz) und Rinder-P2-Proteιns (nur die Aminosäurenaustausche sind angegeben). Eingeführte Restriktionsenzymschnittstellen und Histidin-Schwanz Sequenzen sind unterstrichen.
Die Erfindung wird nun weiter anhand der Beispiele beschrieben:
BEISPIELE
Es wurden weibliche Lewis-Ratten (Alter: 6-8 Wochen; Gewicht: 1 25-1 60 g) verwendet.
Vollständiges menschliches P2-Proteιn (rhP2) und die extrazelluläre Domäne von menschlichem PO-Protein (rhPO) wurden in wie in "Weishaupt et al., J. of Neuroim- munology 63, 149-1 56 ( 1 995) " beschrieben in E. coli expπmiert und durch Ni2 + - NTA Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt.
Neuritogene P2-spezιfische T-Zellinien G5 und G7 wurden wie in "Linington et al. , J. Immunol. 1 33, 1 946- 1 950 ( 1 984) " beschrieben hergestellt.
BEISPIEL 1
In einem ersten Experiment erhielten mehrere Ratten zweimal täglich 500μg rhP2 bzw. 100 μg rhP2 intravenös für 7 Tage, wobei an Tag 0 8 x 1 06 aktivierte P2- spezifische T-Zellen mit übertragen wurden, die fähig sein sollten EAN auszulösen. Bei den Tieren traten aber bis zum Tag 24 (Versuchsende) keine Krankheitssymptome auf. Im Gegensatz dazu zeigten die Ratten der Kontrollgruppe,
welche anstatt rhP2 Ovalbumin erhalten hatten, den typischen Krankheitsverlauf von EAN, wobei ein Maximum der Krankheit mit Paraplegie und Tetraparese an Tag 6 nach der T-Zellinjektion beobachtet wurde. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 A gezeigt.
BEISPIEL 2
Die Ratten, denen 8 x 1 06 P2-spezιfιsche T-Zellen injiziert worden waren, wurden 3 Tage nach der T-Zell-Injektion in verschiedene Gruppen geteilt:
Gruppe 1 erhielt zweimal täglich 500 μg rhP2,
Gruppe 2 erhielt zweimal täglich 1 00 μg rhPO, Gruppe 3 erhielt zweimal täglich 1 00 μg rhP2, Gruppe 4 erhielt zweimal täglich 500 μg Ovalbumin.
Ratten, die zweimal täglich mit entweder 500 μg oder 1 00 μg rhP2 (Gruppen 1 und 3) behandelt worden waren, entwickelten nur milde Krankheitssymptome mit einem Maximum an Tag 5 nach der Zel njektion. Schon an Tag 6 begannen die Krankheitssymptome in den rhP2-behandelten Gruppen 1 und 3 abzunehmen. Da man P2-spezιfιsche T-Zellen zur Auslosung von EAN injiziert hatte, konnte die Gabe von PO-Protein erwartungsgemäß keinen positiven Effekt ausgelosen. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 B gezeigt.
In der nachfolgenden Tabelle 1 ist gezeigt, daß die histologische Analyse des Ischiasnervs bei den Gruppen 2 und 4 (rhPO-Gruppe und Ovaibumin-Gruppe) eine starke Entzundungsreaktion mit starker Infiltration von T-Zellen und Makro- phagen zeigte. Bei den mit rhP2 behandelten Gruppen 1 und 3 fanden sich nur wenige Infiltrate.
Frühe Krankheit Anzahl Dauer der Krankheitsgrad T-Zell-Infiltrate am Makrophagen Infiltrate
[Behandlung pro Tag] der Behandlung ±SD Maximum am Maximum Ratten [Tage nach der am Maximum T-Zellen/mm^ Makrophagen/mm---
Immunisierung] [Mittelwert + SD] [Mittelwert ± SD] m 2x 500 μg Ovalbumin (ova) 2 1-7 7.75 ±0.3 248.7 ±21.5 113-2 -t 17.8
3) co lx 100μgrhP2 + Ixova 2 1-7 . 0 . 21.5 ±5.8* 13.1 ±5.2*
2x 100μgrhP2 2 1-7 0 13.7 ± 4.1* 9.2 ±3.2*
09 lx500μgrhP2+ Ixova 2 1-7 0 13.5 ±4.8* 8.5 ±2.8*
2x 500 μg rhP2 2 1-7 0 6.3 ±2.7* 3.2 ±2.2*
33 m Fortgeschrittene O m Krankheit
[Behandlung pro Tag]
2x 500 μg Ovalbumin 3 3-7 7.7 ±0.2 258.7 ± 38.1 100.4 ±38.8
2x 500 μg rhPO -* j 3-7 7.75 ± 0.3 249.2 ±26.7 95.7 ± 19.1
2x 100μgrhP2 3 3-7 3.0 ± 0.5** 37.6 ± 12.2* 16.1 ±7.2*
2x 500 μg rhP2 3 3-7 2.7 ± 0.8** 6.5 ±2.8* 2.2 ± 1.7*
* = p < 0.01 vs. Ovalbumin , ** p < 0.05 vs. Ovalbumin.
BEISPIEL 3
T-Zellen wurden mit ansteigenden Dosen von rhP2 oder dem neuritogenen P2- Peptid (Aminosäuren 53-78) inkubiert. Dazu wurden 1 ,5 x 104 Responder-G5 oder G7 T-Zellen, 7,5 x 105 bestrahlte (3000 rad) Thymozyten und verschiedene Konzentrationen von rhP2 oder dem neuritogenen P2-Peptid in einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Vertiefung in eine 96-Loch-Mikrotiter-Platte eingefüllt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit 0,2 μCi/Vertiefung 3H-dT für 1 6 Stunden markiert und zu dem angezeigten Zeitpunkt geerntet. Die Zellen wurden auf einem Glasfaserfilterpapier gesammelt und die Radioaktivitätsverteilung ausge- wertet.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 gezeigt. Daraus ist ersichtlich, daß die Proliferation der neuritogenen T-Zellen bei 3 μg/ml des neuritogenen P2-Peptids und bei 30 μg/ml des rhP2-Proteins maximal war und dann stetig mit höheren Konzentrationen fiel.
Beispiel 4
An Tag 3 oder 6 nach einer intravenösen Injektion von 8 x 106 aktivierten P2- spezifischen T-Zellen erhielten Lewis-Ratten 500 μg rhP2 oder 500 μg des Kon- trollantigens rhPO, was nach 1 2 Stunden wiederholt wurde. 6 Stunden nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet und der Ischiasnerv entnommen. Die histologische Analyse des Ischiasnervs von rhP2-Empfängern zeigte eine Reduktion der entzündlichen Infiltrate um ungefähr 30% verglichen mit den rhPO- Kontrollen. Morphologisch zeigten die T-Zellen typische Zeichen von Apoptose. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 3 A + B zusammengefaßt.
Claims
PATENTANSPRÜCHE
1 ) Verwendung von rekombinantem Myelinprotein oder Fragmenten davon zur Behandlung von T-Zell vermittelten Autoimmunerkrankungen des peripheren Nervensystems.
2) Verwendung von rekombinantem Myelinprotein oder Fragmenten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behand- lung von T-Zell vermittelten Autoimmunerkrankungen des peripheren
Nervensystems.
3) Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Myelinprotein P2, PO, MBP, PLP, MOG, MAG oder S-100-Proteιn ist.
4) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Myelinprotein ein Gemisch verschiedener Proteine und/oder Fragmente ist.
5) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Zell vermittelten Autoimmunerkrankungen des peripheren Nervensystems chronisch-entzündliche Polyneurιtιs, Guillaιne-Barre-Syndrom, Vaskulitiden im peripheren Nervensystem und Nervenentzündungen bei Gammopathien sind.
6) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Myelinprotein in Form einer Hoch-Dosis-Antigen- Therapie eingesetzt wird.
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| Publication Number | Publication Date |
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| EP0917573A2 true EP0917573A2 (de) | 1999-05-26 |
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Family Applications (1)
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