EP0918853A2 - Anti-sinn-rna mit sekundärstruktur - Google Patents

Anti-sinn-rna mit sekundärstruktur

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EP0918853A2
EP0918853A2 EP97936610A EP97936610A EP0918853A2 EP 0918853 A2 EP0918853 A2 EP 0918853A2 EP 97936610 A EP97936610 A EP 97936610A EP 97936610 A EP97936610 A EP 97936610A EP 0918853 A2 EP0918853 A2 EP 0918853A2
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EP
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sense rna
expression
vector
secondary structure
pj3ω
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Withdrawn
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EP97936610A
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Dieter Werner
Christof Granzow
Gaby Joswig
Karsten Rothbarth
Marie Schubert
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Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01028—Chloramphenicol O-acetyltransferase (2.3.1.28)
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    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Definitions

  • the present invention relates to an anti-sense RNA with a secondary structure, a combination containing it and the use of both.
  • New techniques for inhibiting gene expression often involve the use of anti-sense RNA.
  • This is an RNA that is complementary to and binds to regions of the mRNA of a gene.
  • a duplex molecule is formed that is not translated by the mRNA. An inhibition of gene expression can thus be achieved.
  • duplex molecule is often not stable, i.e. the mRNA becomes free for translation again, whereby the inhibition of gene expression is weak or does not occur at all.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means with which a strong inhibition of gene expression can be achieved.
  • anti-sense RNA encompasses any RNA molecule which is suitable as anti-sense RNA, ie is complementary to regions of an RNA, in particular mRNA and very particularly regulatory elements thereof, and by binding to these regions inhibits the Gene expression.
  • the anti-sense RNA can also include DNA sequences.
  • the anti-sense RNA can be present as such or in the form of a vector encoding it. Such a vector can be a common expression vector. It can be favorable if the expression of the sequence coding for the anti-sense RNA is under the control of a constitutive or inducible promoter, such as a tissue- or tumor-specific promoter.
  • secondary structure encompasses any DNA and / or RNA sequence which can be present in an anti-sense RNA and which has an at least partially “hairpin” structure, ie individual base pairs are subject to refolding.
  • the secondary structure can exist within the anti-sense RNA. It can also be present at the 5 'and / or 3' end of the anti-sense RNA. If there are several secondary structures, these can be the same or different from one another.
  • Complicated palindromes such as (AGCT) n or (GAATTC) n are also preferred.
  • An anti-sense RNA according to the invention can be produced by customary methods. It is favorable to produce a double-stranded (GC) 20 EcoRI (GC) 20 sequence by oligonucleotide synthesis and to ligate this to the 5 'end of the cDNA sequence of a gene to be inhibited. The DNA molecule obtained is ligated in the 3 ' ⁇ 5' direction to the promoter of a vector. The vector obtained leads to the expression of the anti-sense RNA according to the invention.
  • GC double-stranded
  • EcoRI GC
  • An anti-sense RNA according to the invention can be introduced into cells as such or in the form of a vector encoding it.
  • the cells can be any cells, such as plant and animal, especially mammalian and very particularly human cells.
  • the cells can be inside or outside of an organism. The latter can be freshly isolated or kept in culture.
  • the anti-sense RNA can be introduced into the cells by conventional transfection techniques, such as electroporation.
  • Another object of the present invention is a combination of an anti-sense RNA according to the invention and a (ds) RNAse. This is an RNAse that can recognize and break down double-stranded RNA.
  • a (ds) RNAse is found, for example, in the yeast strain Schizosaccharomyces pombe (pad +).
  • the anti-sense RNA according to the invention can be present as such or in the form of a vector encoding it.
  • the (ds) RNAse can be present as such or in the form of a vector encoding it.
  • a vector can be a common expression vector. It can be advantageous if the expression of the sequence coding for the (ds) RNAse is under the control of a constitutive or inducible promoter, such as a tissue- or tumor-specific one
  • the combination consists in the presence of a vector which codes both for the anti-sense RNA according to the invention and for the (ds) RNAse.
  • vector With regard to the vector, reference is made to the above statements.
  • the combination of an anti-sense RNA according to the invention and a (ds) RNAse can be introduced into cells.
  • the (ds) RNAse as such, i.e. as a protein, by conventional methods such as lipofection.
  • the form of a vector encoding it the
  • RNAse can be introduced by methods as they were called for the anti-sense RNA.
  • the present invention provides an anti-sense RNA and a combination containing it which cause potent inhibition of gene expression.
  • the present invention is thus widely used in molecular biology and medicine.
  • diseases in which individual proteins trigger or reinforce are, for example, diseases in which hormones play a major role, tumor diseases and viral infections, such as HIV and AIDS.
  • diseases in which hormones play a major role are, for example, diseases in which hormones play a major role, tumor diseases and viral infections, such as HIV and AIDS.
  • FIG. 1 shows the inhibition of gene expression by an anti-sense RNA according to the invention.
  • (1) is the rate of expression of the CAT gene in the presence of an anti-sense RNA.
  • (2) is the expression rate of the
  • CAT gene in the presence of an anti-sense RNA with secondary structure I.
  • (3) is the expression rate of the CAT gene in the presence of an anti-sense RNA with secondary structure II.
  • FIG. 2 shows the inhibition of gene expression by an anti-sense RNA according to the invention.
  • (1) is the rate of expression of the CAT gene in the presence of an anti-sense RNA with secondary structure I.
  • (2) is the rate of expression of the CAT gene in the presence of an anti-sense RNA with secondary structure I and a (ds) RNAse.
  • Example 1 Production of expression vectors which contain the chioramphenicolacetyl transferase (CAT) gene in the 5 ' ⁇ 3' or 3 ' ⁇ 5' direction.
  • CAT chioramphenicolacetyl transferase
  • the CAT gene was isolated from a conventional CAT vector and inserted into the "multiple cloning site" of the expression vector pJ3 ⁇ (cf. Nuclear acids res. 1 8, (1 990), 1068). In one case the insertion was in the 5 ' ⁇ 3' direction and the expression vector pJ3 ⁇ -CAT was obtained. In the other case, the insertion was carried out in the 3 '- * 5' direction and the expression vector pJ3 ⁇ -TAC was obtained.
  • Example 2 Production of expression vectors which contain the CAT gene in the 3 ' ⁇ 5' direction and a sequence coding for a secondary structure I or II.
  • AATTC- (GO 20-GAATTC- (GC) 20-GAATTC- (GC) 0-G.
  • Cloning vector pBluescript (Stratagene) was used, from which it could be removed by suitable restriction enzymes for recloning into the vector which has the CAT gene in the 3 '- * 5' direction.
  • the vector pJ3 ⁇ -TAC from Example 1 was cut in the "multiple cloning site" between the promoter and the TAC insert with suitable restriction enzymes.
  • Sequence was taken from the pBluescript vector of Example 2 (e) with the appropriate enzymes. The two nucleic acids were linked by ligation.
  • Example 3 Preparation of an expression vector which codes for a (ds) RNAse.
  • the gene (pad +) coding for a (ds) RNAse was isolated from a conventional genomic library of Schizosaccharomyces pombe by means of PCR amplification. For this purpose, primers were used which had been derived from the known sequence of the pad + gene (cf. database: embl: S78982). The pad + gene was cloned in the known vector pBluescript and confirmed by sequencing. After cloning into the usual expression vector pcDNA3 (InVitrogen), the expression vector pcDNA3-pad + was obtained.
  • Example 4 Inhibition of gene expression by an anti-sense RNA with a secondary structure
  • Ehrlich ascites tumor cells (10 7 cells / ml) were expressed with the expression vectors pJ3 ⁇ -CAT, pJ3 ⁇ -TAC, pJ3 ⁇ -TAC-sec. I or pJ3 ⁇ -TAC-sec. II transfected (see Table 1).
  • RNAse activity is produced or generated by means of the described methods.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anti-Sinn-RNA mit besonderen Sekundärstrukturen sowie eine Kombination umfassend die Anti-Sinn-RNA und eine (ds)RNAse. Die Anti-Sinn-RNA und die Kombination können zur Hemmung der Genexpression verwendet werden.

Description

Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur, eine sie enthaltende Kombination sowie die Verwendung beider.
Neue Techniken zur Hemmung der Genexpression umfassen häufig den Einsatz von Anti-Sinn-RNA. Dies ist eine RNA, die zu Bereichen der mRNA eines Gens komplementär ist und an diese bindet. Es entsteht ein Duplexmolekül, das der Translation der mRNA entzogen ist. Damit kann eine Hemmung der Genexpression erreicht werden.
Es hat sich allerdings gezeigt, daß das Duplexmolekül häufig nicht stabil ist, d.h. die mRNA wird wieder frei für die Translation, wodurch die Hemmung der Genexpression schwach ist oder gar nicht eintritt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu- stellen, mit dem eine starke Hemmung der Genexpression erzielt werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch eine Anti-Sinn-RNA mit besonderen Sekundärstrukturen erreicht.
Mit dem Ausdruck "besonderer Sekundärdruck" ist gemeint, daß es sich nicht um eine natürlich vorkommende Sekundärstruktur handelt, sondern daß diese künstlich erzeugt worden ist.
Der Ausdruck "Anti-Sinn-RNA" umfaßt jegliches RNA-Molekül, das sich als Anti- Sinn-RNA eignet, d.h. komplementär zu Bereichen einer RNA, insbesondere mRNA und ganz besonders Regulationselementen dieser, ist und durch Bindung an diese Bereiche eine Hemmung der Genexpression bewirkt. Die Anti-Sinn-RNA kann auch DNA-Sequenzen umfassen. Ferner kann die Anti-Sinn-RNA als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ein solcher Vektor kann ein üblicher Expressionsvektor sein. Günstig kann es sein, wenn die Expression der für die Anti-Sinn-RNA kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines kon- stitutiven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, steht.
Der Ausdruck "Sekundärstruktur" umfaßt jegliche DNA- und/oder RNA-Sequenz, die in einer Anti-Sinn-RNA vorliegen kann und eine zumindest teilweise "Hair- pin"-Struktur aufweist, d.h. einzelne Basenpaare unterliegen einer Rückfaltung. Die Sekundärstruktur kann innerhalb der Anti-Sinn-RNA vorliegen. Auch kann sie am 5'- und/oder 3'-Ende der Anti-Sinn-RNA vorliegen. Liegen mehrere Sekundärstrukturen vor, können diese gleich oder verschieden voneinander sein. Vorzugsweise ist die Sekundärstruktur eine (GC)n-Palindrom-(GC)n-, <AT)n-Palindrom- (AT)n-, oder (CG)n-Palindrom-(CG)n-Sequenz, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn n = 20 und das Palindrom eine EcoRI-Restriktionsstelle ist. Bevorzugt sind auch komplizierte Palindrome wie (AGCT)n oder (GAATTC)n.
Eine erfindungsgemäße Anti-Sinn-RNA kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Günstig ist es, durch Oligonukleotidsynthese eine doppelsträngige (GC)20-EcoRI-(GC)20-Sequenz herzustellen und diese an das 5'-Ende der cDNA- Sequenz eines zu hemmenden Gens zu ligieren. Das erhaltene DNA-Molekül wird in 3'→ 5' Richtung an den Promotor eines Vektors ligiert. Der erhaltene Vektor führt zur Expression der erfindungsgemäßen Anti-Sinn-RNA. Ergänzend wird auf Sambrook, Fritsch, Maniatis, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Labora- tory Press, 1 989, verwiesen.
Eine erfindungsgemäße Anti-Sinn-RNA kann als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors in Zellen eingebracht werden. Die Zellen können jegliche Zellen, wie Pflanzen- und tierische, insbesondere Säugetier- und ganz besonders menschliche Zellen, sein. Die Zellen können innerhalb eines Organismus oder außerhalb eines solchen vorliegen. Letztere können frisch isoliert oder in Kultur gehalten sein. Das Einbringen der Anti-Sinn-RNA in die Zellen kann durch übliche Transfektionstechniken, wie Elektroporation, erfolgen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination aus einer erfindungsgemäßen Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse. Dies ist eine RNAse, die doppelsträngige RNA erkennen und abbauen kann. Eine (ds)RNAse findet sich z.B. in dem Hefestamm Schizosaccharomyces pombe (pad + ) . In der Kombination kann die erfindungsgemäße Anti-Sinn-RNA als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ebenso kann die (ds)RNAse als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ein solcher Vektor kann ein üblicher Expressionsvektor sein. Günstig kann es sein, wenn die Expression der für die (ds)RNAse kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines konstituti- ven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen
Promotors, steht. Ferner kann es von Vorteil sein, wenn die Kombination darin besteht, daß ein Vektor vorliegt, der sowohl für die erfindungsgemäße Anti-Sinn- RNA als auch für die (ds)RNAse kodiert. Hinsichtlich des Vektors wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.
Die Kombination aus einer erfindungsgemäßen Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse kann in Zellen eingebracht werden. Hinsichtlich der Zellen und des Einbringens der Anti-Sinn-RNA wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Die (ds)RNAse kann als solche, d.h. als Protein, durch übliche Verfahren, wie Lipofektion, eingebracht werden. In Form eines sie kodierenden Vektors kann die
(ds)RNAse durch Verfahren eingebracht werden, wie sie für die Anti-Sinn-RNA genannt wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Anti-Sinn-RNA und eine sie enthaltende Kombination bereit, die eine starke Hemmung der Genexpression bewirken. Die vorliegende Erfindung findet somit eine breite Anwendung in der Molekularbiologie und der Medizin. Insbesondere kann an die Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen gedacht werden, bei denen einzelne Proteine auslösend oder verstärkend sind. Dies sind z.B. Erkrankungen, bei denen Hormone eine große Rolle spielen, Tumorerkrankungen und virale Infektionen, wie HIV und AIDS. Kurze Beschreibung der Zeichnung
Fig. 1 zeigt die Hemmung der Genexpression durch eine erfindungsgemäße Anti-Sinn-RNA. ( 1 ) ist die Expressionsrate des CAT-Gens in Anwesenheit einer Anti-Sinn-RNA. (2) ist die Expressionsrate des
CAT-Gens in Anwesenheit einer Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur I. (3) ist die Expressionsrate des CAT-Gens in Anwesenheit einer Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur II.
Fig. 2 zeigt die Hemmung der Genexpression durch eine erfindungsgemäße Anti-Sinn-RNA. ( 1 ) ist die Expressionsrate des CAT-Gens in Anwesenheit einer Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur I. (2) ist die Expressionsrate des CAT-Gens in Anwesenheit einer Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur I und einer (ds)RNAse.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung von Expressions- Vektoren, die das Chioramphenicolace- tyltransferase (CAT)-Gen in 5'→ 3' bzw. 3'→ 5' Richtung enthalten.
Das CAT-Gen wurde aus einem üblichen CAT-Vektor isoliert und in die "multiple cloning site" des Expressionsvektors pJ3Ω (vgl. Nu- cleic acids res. 1 8, ( 1 990), 1068) inseriert. In einem Fall erfolgte die Insertion in 5'→3' Richtung und es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-CAT erhalten. Im anderen Fall erfolgte die Insertion in 3'-*5' Richtung und es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-TAC erhalten. Beispiel 2: Herstellung von Expressionsvektoren, die das CAT-Gen in 3'→ 5' Richtung und eine für eine Sekundärstruktur I bzw. II kodierende Sequenz enthalten.
(A) Expressionsvektor mit einer (GC)20-EcoRI-{GC)20-Sequeπz am 5'-Ende des CAT-Gens (Sekundärstruktur I)
1 . Herstellung einer (GC)20-EcoRI-(GC)20-Sequenz.
(a) Mittels eines automatischen Synthese-Geräts (Oligonukleotid-
Synthesizer) wurden 2 Oligodesoxynukleotide hergestellt:
AATTC- (GC) 20-G und
G- (GC ) 2θ-CTTAA
(b) Die beiden Oligodesoxynukleotide wurden im Verhältnis 1 : 1 gemischt, auf 90°C erhitzt, danach langsam unter "annea- Iing"-Bedingungen auf Raumtemperatur abgekühlt. Dabei ent- stand ein DNA Dopplestrang folgender Struktur:
AATTC- (GC ) 20-G * * * *
G- ( GC ) 20-CTTAA
(c) Unter Ligationsbedingungen entstanden Vielfache der in (b) beschriebenen DNA
AATTC- (GO 20-GAATTC- (GC ) 20-GAATTC- (GC ) 0-G .
* ** ****** ** ***** ** →,
G- (GC) 20-CTTAAG- (GC) 20-CTTAAG- (GC) 20-CTTAA..
(d) Die Ligationsprodukte wurden durch Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt und eine Sequenz, bestehend aus Dimeren, wurde aus dem Gel eluiert und mittels Polynukleotidkinase /ATP phosphoryliert.
AATTC- (GC) 0-GAATTC- (GC) 20-G-P
* * * * * * * * * * * *
P-G- ( GC ) 20-CTTAAG- (GC) 20"C
(e) Diese Sequenz wurde zunächst in die EcoRI-Stelle des üblichen
Klonierungsvektors pBluescript (Stratagene) eingesetzt, aus dem sie durch geeignete Restriktionsenzyme zur Umklonierung in- den Vektor, der das CAT-Gen in 3'-* 5' Richtung aufweist, entnommen werden konnte.
2. Einbau der {GC)2o-EcoRI-(GC)2o) Sequenz in den Vektor, der das CAT- Gen in 3'→ 5' Richtung aufweist.
Der Vektor pJ3Ω-TAC von Beispiel 1 wurde in der "multiple cloning site" zwischen dem Promotor und der TAC-Insertion mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten. Die (GC)20-EcoRI-(GC)20| Sequenz wurde mit den entsprechenden Enzymen aus dem pBluescript-Vektor von Beispiel 2(e) entnommen. Die beiden Nukleinsäuren wurden per Ligation verbunden. Es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-TAC-Sek. I erhalten.
(B) Expressionsvektor mit einer (GC)20-EcoRI-(GC,20-Sequenz am 3'-Ende des CAT-Gens (Sekundärstruktur II).
Die unter Beispiel 2 (A) hergestellte (GC)20-EcoRI-(GC)20-Sequenz wurde in den Vektor pJ3Ω-TAC am 3'-Ende des TAC-Gens eingesetzt. Es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-TAC-Sek.ll erhalten. Beispiel 3: Herstellung eines Expressionsvektors, der für eine (ds) RNAse kodiert.
Aus einer üblichen genomischen Bibliothek von Schizosaccharomy- ces pombe wurde mittels einer PCR-Amplifikation das für eine (ds)RNAse kodierende Gen (pad + ) isoliert. Hierzu wurden Primer verwendet, die aus der bekannten Sequenz des Gens pad + (vgl. Datenbank: embl: S78982) abgeleitet worden waren. Das Gen pad + wurde in dem bekannten Vektor pBluescript kloniert und durch Sequenzierung bestätigt. Nach Umklonierung in den üblichen Expressionsvektor pcDNA3 (InVitrogen) wurde der Expressionsvektor pcDNA3-pad + erhalten.
Beispiel 4: Hemmung der Genexpression durch eine Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
(a) Ehrlich Ascites Tumorzellen ( 107 Zellen/ml) wurden mit den Expressionsvektoren pJ3Ω-CAT, pJ3Ω-TAC, pJ3Ω-TAC-Sek. I bzw. pJ3Ω-TAC-Sek. II transfiziert (vgl. Tabelle 1 ) . Die Transfektion wurde mittels Elektroporation (366V/950μF/Ele- ktrodenabstand D = 4mm) durchgeführt. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und Aliquote mit radioaktiv markiertem Chloramphenicol inkubiert. Es wurde die Konversionsrate (in Ac-, Di-Ac-Chloramphenicol) nach DC durch Messung der Radioaktivität bestimmt.
Tabelle 1 :
pJ3Ω-CAT 3//g 3/yg 3/ g
pJ3Ω-TAC-Sek. I - 7,5/yg
pJ3Ω-TAC-Sek. II - - 7,5μg
Aus Fig. 1 geht hervor, daß durch Transfektion von pJ3Ω-TAC-Sek. I bzw. pJ3Ω-TAC-Sek. II (vgl. Fig. 1 , (2), (3) eine stärkere Hemmung der Expression des CAT-Gens erreicht werden kann, als wenn ρJ3Ω-TAC (vgl. Fig. 1 , ( 1 ) verwendet wird.
(b) Ehrlich Ascites Tumorzellen ( 107 Zellen/ml) wurden mit den Expressionsvektoren pJ3Ω-CAT, pJ3Ω-TAC-Sek. I bzw. pcDNA3-pad + tranfiziert (vgl. Tabelle 2). Die Transfektionsbedingungen waren wie in Beispiel 4 (a) beschrieben.
Tabelle 2:
1 2 pJ3Ω-CAT 5 vg 5μg pJ3Ω-TAC-Sek. 10/yg 10/yg pcDNA3-pad + - 10/yg
Aus Fig. 2 geht hervor, daß durch Kotransfektion von pJ3Ω-TAC-Sek. I mit pcDNA3-pad + (vgl. Fig. 2 (2)) eine stärkere Hemmung der Expres- sion von CAT erhalten wird, als wenn pJ3Ω-TAC-Sek. I (vgl. Fig. 2, ( 1 ) alleine verwendet wird. Somit wird deutlich, daß eine Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur eine größere Hemmwirkung auf die Genexpression hat als eine Anti-Sinn-RNA ohne Sekundärstruktur. Ferner wird deutlich, daß die Hemmwirkung der Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur noch gesteigert werden kann, wenn zusätzlich zu gegebenenfalls natürlich vorhandenen (ds)RNAsen eine
(ds)RNAse-Aktivität mittels der beschriebenen Verfahren hervorgerufen bzw. erzeugt wird.

Claims

Patentansprüche
1 . Anti-Sinn-RNA mit besonderen Sekundärstrukturen.
2. Anti-Sinn-RNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sekundärstruktur am 5'- und/oder 3'-Ende der Anti-Sinn-RNA geschaffen wor- den ist.
3. Anti-Sinn-RNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sekundärstruktur eine (GOn-PalindrorrHGC),,- oder (CG)n-Palindrom-(CG)n- Sequenz ist.
4. Anti-Sinn-RNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß n = 20 und das Palindrom eine EcoRI-Restriktionsstelle ist.
5. Anti-Sinn-RNA nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sinn-RNA durch einen Vektor kodiert ist.
6. Kombination, umfassend die Anti-Sinn-RNA nach einem der Ansprüche 1 - 5 und eine (ds)RNAse.
7. Kombination nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-
Sinn-RNA und die (ds)RNAse durch einen oder mehrere Vektoren kodiert sind.
8. Verwendung der Anti-Sinn-RNA nach einem der Ansprüche 1 -5 und der Kombination nach Anspruch 6 oder 7 zur Hemmung der Genexpression.
EP97936610A 1996-08-07 1997-08-05 Anti-sinn-rna mit sekundärstruktur Withdrawn EP0918853A2 (de)

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EP97936610A Withdrawn EP0918853A2 (de) 1996-08-07 1997-08-05 Anti-sinn-rna mit sekundärstruktur

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EP (1) EP0918853A2 (de)
DE (1) DE19631919C2 (de)
WO (1) WO1998005770A2 (de)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CN101818145A (zh) 1998-03-20 2010-09-01 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
KR20070118315A (ko) 1999-04-21 2007-12-14 와이어쓰 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 조성물
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
ATE383433T1 (de) 1999-08-26 2008-01-15 Calgene Llc Pflanzen mit veränderten mehrfachungesättigten fettsäuren
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10100586C1 (de) * 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
DE10160151A1 (de) * 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
ES2336887T5 (es) 2000-03-30 2019-03-06 Whitehead Inst Biomedical Res Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN
CA2429814C (en) 2000-12-01 2014-02-18 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
CA2369944A1 (en) 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US7612194B2 (en) 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
WO2003035083A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-01 Ribopharma Ag Medikament zur behandlung einer fibrotischen erkrankung durch rna interferenz
CA2478904A1 (en) 2002-03-14 2003-09-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified gene-silencing rna and uses thereof
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
US7601888B2 (en) 2002-03-21 2009-10-13 Monsanto Technology L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
DE60310944T3 (de) 2002-08-05 2017-08-03 Silence Therapeutics Gmbh Weitere neue formen von interferierende rns moleküle
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
JP5102959B2 (ja) * 2002-12-23 2012-12-19 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫刺激配列オリゴヌクレオチド及びその使用方法
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
WO2004087878A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Monsanto Technology, Llc Novel plant promoters for use in early seed development
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
AU2005244258B2 (en) 2004-04-09 2010-07-01 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
AU2006204997B2 (en) 2005-01-12 2011-09-01 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
EP1874938B1 (de) 2005-04-19 2012-04-04 BASF Plant Science GmbH Endosperm-spezifische Expression und/oder Expression in keimenden Embryos monokotyledoner Pflanzen
ATE548459T1 (de) 2005-09-16 2012-03-15 Monsanto Technology Llc Verfahren zur genetischen kontrolle von insektenbefall bei pflanzen und zusammensetzungen
CA2622671C (en) 2005-09-16 2020-12-22 Devgen Nv Methods for controlling pests using rnai
EP2281896A3 (de) 2005-09-16 2012-04-11 deVGen N.V. Verfahren auf Basis von transgenen Pflanzen zur Bekämpfung von Schadinsekten unter Verwendung von RNAi
WO2007095469A2 (en) 2006-02-10 2007-08-23 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
CN105385679B (zh) 2006-02-13 2020-05-26 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
CN101195821A (zh) 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
EP2074219B1 (de) 2007-02-16 2013-11-20 BASF Plant Science GmbH Nukleinsäuresequenzen zur regulierung embryospezifischer expression in einkeimblättrigen pflanzen
CN107699545A (zh) 2008-09-29 2018-02-16 孟山都技术公司 大豆转基因时间mon87705及其检测方法
CA2759291C (en) 2009-04-20 2020-09-15 Monsanto Technology Llc Multiple virus resistance in transgenic tomato plants
EP3339440A1 (de) 2010-12-30 2018-06-27 Dow AgroSciences LLC Auf die v-atpase-c-untereinheit gerichtete und resistenz gegenüber coleopteran-schädlingen verleihende nukleinsäuremoleküle
AP2013007005A0 (en) 2010-12-30 2013-07-31 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target the RHO1 small GTP-binding protein and confer resistance to coleopteran pests
CA2822958A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
US8987552B2 (en) 2010-12-30 2015-03-24 Dow Agrosciences, Llc. Nucleic acid molecules that target the vacuolar ATPase H subunit and confer resistance to coleopteran pests
US9688983B2 (en) 2012-12-20 2017-06-27 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
EP2810952A1 (de) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Neuartige Schädlingsbekämpfungsverfahren
JP2017510246A (ja) 2013-12-20 2017-04-13 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 鞘翅目害虫に対する抵抗性を付与するｒｎａｐＩＩ−１４０核酸分子
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
JP2017512070A (ja) 2014-03-12 2017-05-18 ザ ユニバーシティ オブ シドニー 高等植物におけるｒｎａの生成
EP3140406B1 (de) 2014-05-07 2022-06-29 Dow AgroSciences LLC Dre4-nukleinsäuremoleküle zur verleihung von resistenz gegen coleoptera-schädlinge
ES2811279T3 (es) 2014-12-22 2021-03-11 Fraunhofer Ges Forschung Moléculas de ácido nucleico de Nucampholin para controlar plagas de insectos coleópteros
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
CN107529762A (zh) 2015-04-13 2018-01-02 弗劳恩霍夫应用研究促进协会 新型黄曲霉毒素和真菌感染控制方法
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
WO2017066041A2 (en) 2015-10-12 2017-04-20 Dow Agrosciences Llc Wupa nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
EP3389361A4 (de) 2015-12-18 2019-09-11 Dow Agrosciences LLC Nukleinsäuremoleküle von ribosomalem protein l40 (rpl40) zur verleihung von resistenz gegen coleopteren- und hemipteren-schädlingen
US10392620B2 (en) 2016-11-10 2019-08-27 Dow Agrosciences Llc Cytochrome B (CYTB) nucleic acid molecules that control pathogens
EP3342780A1 (de) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Nukleinsäuremoleküle mit prä-mrna-verarbeitungsfaktor 8 (prp8) zur kontrolle von insektenschädlingen
EP3825408A1 (de) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur insektenschädlingsbekämpfung für mehrere arten

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
DK0592685T3 (da) * 1992-04-17 2002-02-11 Kirin Brewery Plante, som er resistent over for to eller flere vira, og fremstilling deraf
PL172710B1 (pl) * 1992-07-02 1997-11-28 Hybridon Inc Samostabilizujacy sie oligonukleotyd PL PL
GB2273932A (en) * 1992-11-24 1994-07-06 Stiefel Laboratories Stable oligonucleotides
FR2703053B1 (fr) * 1993-03-26 1995-06-16 Genset Sa Oligonucleotides agrafes et semi-agrafes, procede de preparation et applications .
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9805770A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998005770A2 (de) 1998-02-12
DE19631919A1 (de) 1998-02-12
WO1998005770A3 (de) 1998-03-26
DE19631919C2 (de) 1998-07-16

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