EP0952987A2 - Antikörper gegen an oberflächen von carcinom-zellen ausserhalb von desmosomen exponierte epitope desmosomaler cadherine - Google Patents

Antikörper gegen an oberflächen von carcinom-zellen ausserhalb von desmosomen exponierte epitope desmosomaler cadherine

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EP0952987A2
EP0952987A2 EP96943842A EP96943842A EP0952987A2 EP 0952987 A2 EP0952987 A2 EP 0952987A2 EP 96943842 A EP96943842 A EP 96943842A EP 96943842 A EP96943842 A EP 96943842A EP 0952987 A2 EP0952987 A2 EP 0952987A2
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EP
European Patent Office
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antibodies
cells
dsg2
dsm acc
antibody according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96943842A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Franke
Stephan Schäfer
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Progen Biotechnik GmbH
Original Assignee
Progen Biotechnik GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Progen Biotechnik GmbH filed Critical Progen Biotechnik GmbH
Publication of EP0952987A2 publication Critical patent/EP0952987A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to antibodies against epitopes of desmosomal cadherins which are exposed on the surface of cells outside of desmosomes, in particular also to carcinoma cells not connected by desmosomes, to methods for producing such antibodies and their use.
  • Desmosomes Cells from epithelial tissues and carcinomas are connected to each other by certain adhesive structures called desmosomes.
  • desmosomes contain transmembrane glycoproteins, which are referred to as desmosomal cadherins.
  • desmosomal cadherins are Desmoglein 2 (Dsg2) and Desmocollin 2 (Dsc2).
  • the invention is therefore based on the object of providing a means with that metastatic carcinomas can be detected quickly and reliably.
  • the present invention thus relates to antibodies against parts of desmosomal cadherins, these parts (epitopes) also being exposed on the cell surface of cells not connected by desmosomes.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that on the surface of cells not connected by desmosomes, in particular individual epithelial and carcinoma cells as well as micrometastases, parts of des mosomal cadherins are exposed, which in cells connected by desmosomes as in normal tissues and carcinomas, are not accessible or are only accessible to a very limited extent. Against these extracellularly oriented parts, hereinafter referred to as "Cad-ex" parts, the applicant has produced antibodies.
  • the antibodies according to the invention are directed against extracellular epitopes of desmosomal cadherins, which are released in the form of stable molecular fragments in the course of invasive carcinoma growth.
  • the detection of corresponding fragments in body fluids serves as an indication of invasive and metastatic carcinoma growth.
  • Adjacent cells of normal epithelial tissues and malignant tumors (carcinomas) derived therefrom are connected to one another by adhesive structures which are referred to as desmosomes.
  • Cell-cell adhesion is mediated by desmomomal transmembrane proteins of the cadherin type.
  • Dsg Desmogleine
  • Dsc Desmocolline
  • Invasive-destructive carcinoma growth is accompanied by extensive proteolysis of the extracellular matrix on the invasion front. Usually through plasmin activated matrix metalloproteinases cause the breakdown of the extracellular matrix. Carcinoma cells leave the primary tumor to form metastases away from the organ after migration through lymph and blood vessels. Activated proteases cleave defined, stable molecular fragments of Desmogleine and Desmocolline from the cell surface, so that they can then be detected in the body fluids. This process takes place before the primary tumor and any existing metastases cause clinically diagnosable symptoms. The laboratory chemical detection of such molecular fragments in body fluids enables the introduction of further diagnostic measures for the early detection of a tumor.
  • the antibodies according to the invention can be polyclonal or monoclonal, with monoclonal antibodies being preferred.
  • the antibodies can be obtained from animals or humans, with guinea pigs and rabbits being preferred for polyclonal antibodies and mice being preferred for monoclonal antibodies.
  • the antibodies can be synthetic, parts or parts of them that are not necessary for the detection of Cad-ex parts of desmosomal cadherins may be missing in whole or in part, or these parts may be replaced by others that give the antibodies further favorable properties .
  • Antibodies against the Desmogleine Dsg1, Dsg2 and Dsg3 and Desmocolline Dsc1, Dsc2 and Dsc3 are preferably used.
  • the epitopes of the antibodies lie in the extracellular molecular domains, which preferably correspond to the amino acid sequence regions mentioned below: Dsg1: starting with the decapeptide EWIKFAAACR ending with the decapeptide AKDLLSDNVH Dsg2: starting with the decapeptide AWITAPVALR ending with the decapeptide REAQHDSYVG Dsg3: starting with the decapeptide EWVKFAKPCR ending with the decapeptide TRYGRPHSGRDPDDAP1 the Dekapeptide starting with the decapeptide RWAPIPCSML ending with the decapeptide IGGGGVQLGK Dsc3: starting with the decapeptide RWAPIPCSMQ ending with the decapeptide PTQCRATSRS
  • the antibodies are directed against Cad-ex parts of Dsg2.
  • Antibodies whose epitopes lie within the section of Dsg2 which is determined by the following amino acid sequence I are particularly preferred.
  • Antibodies whose epitopes lie within the section determined by the following amino acid sequence II of Dsg2 are very particularly preferred: INDNEPVFTQDVFVGSVEELS AAHTLVMKIN ATDADEPNTL NSKISYRIVS LEPAYPPVFY LNKDTGEIYT TSVTLDREEH SSYTLTVEAR DGNGEVTDKP VKQAQVQIRI LDVNDNIPW ENKVLEGMVE ENQVNVEVTR IKVFDADEIG SDNWLANFTF ASGNEGGYFH IETDAQTNEG IVTLIKEVDY EEMKNLDFSV IVANKAAFHK SIRSKYKPTP IPIKVKVKNV KEGIHFKSSV ISIYVSESMD RSSKGQIIGN FQ
  • the antibody Dsg2-G6 was deposited under DSM ACC 2236 on September 20, 995.
  • the antibodies are directed against Cadex parts of Dsc2.
  • Antibodies according to the invention can be produced by customary methods. If polyclonal or monoclonal antibodies are to be produced, it is expedient to immunize animals, in particular guinea pigs and rabbits, for the former and mice for the latter antibodies with a desmosomal cadherin and / or fragments thereof.
  • fragments thereof also encompasses synthetic peptides which have partial sequences of desmosomal cadherins. It can also be advantageous to immunize the animals with a mixture of desmosomal cadherins and / or fragments thereof. Further “boosters" of the animals can be carried out with the same desmosomal cadherins and / or fragments thereof.
  • Desmosomal cadherins and / or fragments thereof or a combination of these and the preceding desmosomal cadherins and / or fragments can also be used of which can be used for "boosters".
  • Polyclonal antibodies can then be obtained from the animal serum.
  • animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • Antibodies obtained are finally incubated with cells not connected by desmosomes, in particular individual epithelial and carcinoma cells and micrometastases, whereby those antibodies are identified which recognize Cad-ex parts of desmosomal cadherins.
  • Dsg2 The production of antibodies against Cad-ex parts of Dsg2 is described as an example.
  • isolated or recombinant e.g. Dsg2 and / or fragments thereof produced in E. coli, animal cells or yeast used for immunization of animals and for other "boosters", e.g. a polypeptide of Dsg2 which lies at least partially within the domains E1, EM, EMI, EIV and EA of Dsg2, for example the above amino acid sequence I, very particularly the above amino acid sequence II. Either glycosylated or non-glycosylated forms are used. Spleen cells are removed from the mice and fused with myeloma cells.
  • Monoclonal antibodies obtained are incubated with individual epithelial and carcinoma cells and micrometases.
  • individual epithelial and carcinoma cells and micrometases For example, the following, Cad-ex parts of Dsg2-recognizing monoclonal antibodies of the IgG 1 class, Dsg2-G6, Dsg2-G11, Dsg2-G91, Dsg2-G96 and Dsg2-129.
  • Antibodies according to the invention are distinguished by the fact that they recognize parts of desmosomal cadherins which are exposed on the free cell surface of cells which are not or only partially connected by desmosomes. Such cells are in particular individual epithelial and carcinoma cells as well as micrometastases.
  • the present invention is therefore suitable for the detection of these cells and cell groups.
  • the detection can be carried out by conventional detection methods, in particular a "western blot", an ELISA, an immunoprecipitation or by immunofluorescence microscopy.
  • antibodies according to the invention can, if appropriate, be labeled or be used in combination with labeled antibodies directed against them.
  • Antibodies according to the invention can also be used in a biosensor method.
  • the reaction of the antibodies according to the invention can take place on living or fixed cells.
  • kits which contain antibodies according to the invention together with carrier materials and customary auxiliaries such as buffers.
  • antibodies according to the invention are suitable for enriching cells which are not connected by desmosomes, in particular individual epithelial and carcinoma cells, and micrometastases, consisting of a few carcinoma cells which are partially coupled by desmosomes, in conventional cell sorting methods, in particular by FACS methods or by Conventional immunoadsorption onto suitable carriers such as coated beads, which means that these can be subjected to further diagnostic tests or used for therapeutic tests and measures.
  • suitable detection methods are e.g. Immunoblot analysis or ELISA.
  • antibodies according to the invention are suitable as mediators, further antibodies and ligands, e.g. B. toxic substances to protruding cells and Introduce cell groups.
  • the antibodies according to the invention can also be used as carriers for toxins and toxic substances.
  • they are suitable for removing tumor cells from cell suspensions.
  • Figure 1 shows an example of human carcinoma cells in immunofluorescence microscopy after they have been fixed as intact cells and have reacted with antibodies against Cad-ex parts of Dsg2, such as a single cell of a squamous epithelium in the left half.
  • Carcinoma of the vulva line A-431 of the American Type Culture Collection, catalog number ATCC CRL 1 555
  • ATCC CRL 8024 a cell pair of the line PLC of a primary liver cell carcinoma
  • the brightly lit spots in the fluorescence are the reaction sites of the externally accessible Cad-ex parts of the Dsg2 glycoprotein.
  • Figure 2 shows such a reaction site on an intact cell in immunoelectron microscopy, a human epidermis cell from the HaCaT line being used as an example and the surface-bound antibodies against Cad-ex parts of Dsg2 with a specific against the nature of these antibodies directed second antibodies were detected, which was coupled to colloidal gold particles with an average diameter of about 10 nanometers.
  • the group of six high-contrast gold particles thus marks a surface structure containing Dsg2 that does not occur in a desmosome.
  • Figure 3 shows an example of the result of the immunoblot analysis of the cell culture fluid from human HaCaT cell cultures.
  • the proteins the cell culture fluid was size fractionated electrophoretically and transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the staining of the membrane with Ponceau reagent unspecifically shows the quantitatively most strongly represented proteins of the sample (Fig. 3, a, lane 2) and size marker proteins (Fig. 3, a, lane 2).
  • the membrane was then examined with the monoclonal antibodies Dsg2-G 1 1 (Fig. 3, b) or Dsc3-U1 14 (Fig. 3, c).
  • the specific antibodies detect a specific, approximately 90 kDa large molecular fragment of the extracellular molecular domain both for Dsg2 and for Dsg2 and for Dsc3.
  • Balb / c strain mice were used for immunization.
  • a Dsg2 polypeptide containing the above amino acid sequence II was used as the antigen.
  • Dsg2-G11, Dsg2-G91, Dsg2-G96 and Dsg2-G129 were used in the DSM under DSM ACC 2226, DSM ACC 2227, DSM ACC 2228 and DSM ACC 2229 on August 9, 1 995.
  • the antibody Dsg2-G6 was deposited with the DSM under ACC 2236 on September 20, 1995.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Teile von desmosomalen Cadherinen, wobei die Teile an der Zelloberfläche auch von nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen exponiert sind. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper sowie deren Verwendung.

Description

Antikörper gegen an Oberflächen von Carcinom-Zellen außerhalb von Desmo¬ somen exponierte Epitope desmosomaler Cadherine
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Epitope desmosomaler Cadherine, die auf der Oberfläche von Zellen außerhalb von Desmosomen exponiert sind, insbesondere auch auf nicht durch Desmosomen verbundenen Carcinom-Zellen, Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und ihre Ver¬ wendung.
Zellen von Epithelgeweben und Carcinomen sind durch bestimmte Haftstrukturen miteinander verbunden, die als Desmosomen bezeichnet werden. Solche Desmo¬ somen enthalten transmembrane Glykoproteine, die als desmosomale Cadherine bezeichnet werden. Beispiele solcher desmosomaler Cadherine sind Desmoglein 2 (Dsg2) und Desmocollin 2 (Dsc2) .
Der Nachweis von metastasierenden Carcinomen ist schwierig. Oft enthalten Biopsieproben wie Punktate aus Knochenmark oder anderen Metastasen-ver¬ dächtigen Geweben oder Körperflüssigkeiten nur wenige Carcinom-Zellen, die unter einer Überzahl nicht-maligner Zellen übersehen werden. Damit ist eine quantitative und qualitative Beurteilung und Absicherung eines Befundes durch Untersuchung hinreichender Zahlen verdächtiger Zellen und mit verschiedenen Reagentien nicht möglich. Auch sind viele der zu untersuchenden Merkmale intrazellulär, was sie erst nach Aufbruch der Zellen für eine Nachweisreaktion zugänglich macht. Dies erfordert einen erheblichen Zeit- und Kostenaufwand, bzw. den Zeil-Aufbruch, d.h. irreversiblen Verlust der Zellen für weitere biologi¬ sche Untersuchungen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem metastasierende Carcinome schnell und zuverlässig nachgewiesen werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände der Patentansprüche erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Antikörper gegen Teile von desmosomalen Cadherinen, wobei diese Teile (Epitope) auch an der Zellober¬ fläche von nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen exponiert sind.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis der Anmelderin, daß an der Oberfläche von nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen, insbesondere einzelnen Epithel- und Carcinom-Zellen sowie Mikrometastasen, Teile von des¬ mosomalen Cadherinen exponiert sind, die bei durch Desmosomen verbundenen Zellen wie sie in normalen Geweben und in Carcinomen vorliegen, nicht oder in nur sehr geringem Ausmaß zugänglich sind. Gegen diese extrazellulär orientier¬ ten Teile, nachstehend als "Cad-ex"-Teile bezeichnet, hat die Anmelderin Anti¬ körper hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind gegen extrazelluläre Epitope desmoso¬ maler Cadherine gerichtet, die im Verlauf des invasiven Karzinomwachstums in Form stabiler Molekülfragmente freigesetzt werden. Der Nachweis entsprechen¬ der Fragmente in Körperflüssigkeiten dient als Indiz für invasives und metastasie- rendes Karzinomwachstum. Benachbarte Zellen von normalen Epithelgeweben und davon abgeleiteten malignen Tumoren (Karzinomen) werden durch Haft¬ strukturen miteinander verbunden, die als Desmosomen bezeichnet werden. Die Zell-Zell-Haftung wird durch desmosomale Transmembran-Proteine vom Cadhe- rin-Typ vermittelt. Man unterscheidet Desmogleine (Dsg) und Desmocolline (Dsc), die mit jeweils 3 genotypisch verschiedenen Isoformen in den verschiede¬ nen Epithelgeweben gebildet werden.
Invasiv-destruktives Karzinomwachstum wird von ausgedehnten Proteolysen der extrazellulären Matrix an der Invasionsfront begleitet. Größtenteils durch Plasmin aktivierte Matrixmetalloproteinasen besorgen den Abbau der extrazellulären Matrix. Karzinomzellen verlassen den Primärtumor, um nach Wanderung über Lymph- und Blutgefäße organferne Metastasen zu bilden. Aktivierte Proteasen spalten definierte, stabile Molekülfragmente der Desmogleine und Desmocolline von der Zelloberfläche ab, so daß diese anschließend in den Körperflüssigkeiten nachweisbar werden. Dieser Prozeß läuft bereits ab, bevor Primärtumor und gegebenenfalls vorhandene Metastasen klinisch-diagnostizierbare Symptome verursachen. Der laborchemische Nachweis solcher Molekülfragmente in Körper¬ flüssigkeiten ermöglicht die Einleitung weiterer diagnostischer Maßnahmen zur Früherkennung eines Tumors.
Von den Anmeldern wurde herausgefunden, daß desmosomale Oberflächen- Antigene unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel auch unter der in vitro- Kultivierung von Epithelzellen, von der Zelloberfläche abgespalten und an den extrazellulären Raum abgegeben werden. Gegen diese Molekülfragmente sind die erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Die Antikörper können aus Tieren oder dem Menschen erhalten sein, wobei für polyklonale Antikörper Meer¬ schweinchen und Kaninchen und für monoklonale Antikörper Mäuse bevorzugt sind.
Ferner können die Antikörper synthetisch sein, wobei ihnen ggfs. Teile, die für die Erkennung von Cad-ex-Teilen desmosomaler Cadherine nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen, bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind, die den Antikörpern weitere günstige Eigenschaften verleihen.
Bevorzugt werden Antikörper gegen die Desmogleine Dsg1 , Dsg2 und Dsg3 sowie Desmocolline Dsc1 , Dsc2 und Dsc3 eingesetzt. Die Epitope der Antikörper liegen in den extrazellulären Moleküldomänen, die bevorzugt den nachfolgend genannten Aminosäuresequenzbereichen entsprechen: Dsg1 : beginnend mit dem Dekapeptid EWIKFAAACR endend mit dem Dekapeptid AKDLLSDNVH Dsg2: beginnend mit dem Dekapeptid AWITAPVALR endend mit dem Dekapeptid REAQHDSYVG Dsg3: beginnend mit dem Dekapeptid EWVKFAKPCR endend mit dem Dekapeptid TRYGRPHSGR Dsc1 : beginnend mit dem Dekapeptid RWAPIPASLM endend mit dem Dekapeptid DKSTRDVRPN Dsc2: beginnend mit dem Dekapeptid RWAPIPCSML endend mit dem Dekapeptid IGGGGVQLGK Dsc3: beginnend mit dem Dekapeptid RWAPIPCSMQ endend mit dem Dekapeptid PTQCRATSRS
In bevorzugter Ausführungsform sind die Antikörper gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 gerichtet. Besonders bevorzugt sind Antikörper, deren Epitope innerhalb des Abschnitts von Dsg2 liegt, der durch die folgende Aminosäuresequenz I bestimmt ist.
AWITAPVALR EGEDLSKKNP IAKIHSDLAE ERGLKITYKY TGKGITEPPF GI FVFNKDTG ELNVTS ILDR EETPFFLLTG YALDARGNNV EKPLELRIKV LDINDNEPVF TQDVFVGSVE ELSAAHTLVM KINATDADEP NTLNSKISYR IVSLEPAYPP VFYLNKDTGE IYTTSVTLDR EEHSSYTLTV EARDGNGEVT DKPVKQAQVQ IRILDVNDNI PWENKVLEG MVEENQVNVE VTRIKVFDAD EIGSDNWLAN FTFASGNEGG YFHIETDAQT NEGIVTLIKE VDYEEMKNLD FSVIVANKAA FHDS IRSKYK PTPI PIKVKV KNVKEGIHFK SSVIS IYVSE SMDRSSKGQI IGNFQAFDED TGLPAHARYV KLEDRDNWIS VDSVTSEI KL AKLPDFESRY VQNGTYTVKI VAI SEDYPRK TITGTVLINV EDINDNCPTL IEPVQTI CHD AEYVNVTAED LDGHPNSGPF SFSVIDKPPG MAEKWKIARQ ESTSVLLQQS EKKLGRSE I Q FLI SDNQGFS CPEKQVLTLT VCEVLHGSGC REAQHDSYVG
Ganz besonders bevorzugt sind Antikörper, deren Epitope innerhalb des durch die folgenden Aminosäuresequenz II von Dsg2 bestimmten Abschnitts liegt: INDNEPVFTQDVFVGSVEELS AAHTLVMKIN ATDADEPNTL NSKISYRIVS LEPAYPPVFY LNKDTGEIYT TSVTLDREEH SSYTLTVEAR DGNGEVTDKP VKQAQVQIRI LDVNDNIPW ENKVLEGMVE ENQVNVEVTR IKVFDADEIG SDNWLANFTF ASGNEGGYFH IETDAQTNEG IVTLIKEVDY EEMKNLDFSV IVANKAAFHK SIRSKYKPTP IPIKVKVKNV KEGIHFKSSV ISIYVSESMD RSSKGQIIGN FQ
Solche Antikörper wurden bei der DSM als Antikörper
Dsg2-G 1 1 unter DSM ACC 2226,
Dsg2-G91 unter DSM ACC 2227,
Dsg2-G96 unter DSM ACC 2228,
Dsg2-G 1 29 unter DSM ACC 2229 am 9. August 1 995 hinterlegt.
Der Antikörper Dsg2-G6 wurde unter DSM ACC 2236 am 20. September 1 995 hinterlegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper gegen Cad- ex-Teile von Dsc2 gerichtet. Besonders bevorzugt sind Antikörper, deren Epitope in dem Aminosäuresequenz-Bereich von Dsc2 liegt, der mit dem Dekapeptid RWAPIPCSML beginnt und dem Dekapeptid DCTHRVDPRI endet.
Erfindungsgemäße Antikörper können nach üblichen Verfahren hergestellt werden. Sollen polyklonale bzw. monoklonale Antikörper hergestellt werden, ist es günstig, Tiere, insbesondere Meerschweinchen und Kaninchen für erstere und Mäuse für letztere Antikörper mit einem desmosomalen Cadherin und/oder Fragmenten davon zu immunisieren. Der Ausdruck "Fragmenten davon" umfaßt auch synthetische Peptide, die Teilsequenzen von desmosomalen Cadherinen aufweisen. Vorteilhaft kann es auch sein, die Tiere mit einem Gemisch aus desmosomalen Cadherinen und/oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weite¬ re "Booster" der Tiere können mit dem oder den gleichen desmosomalen Cadhe¬ rinen und/oder Fragmenten davon erfolgen. Auch können andere desmosomale Cadherine und/oder Fragmente davon oder eine Kombination aus diesen und dem oder den vorhergehenden desmosomalen Cadherinen und/oder Fragmenten davon für "Booster" verwendet werden. Polyklonale Antikörper können dann aus dem Serum der Tiere erhalten werden. Für monoklonale Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert. Erhaltene Antikörper werden schließlich mit nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen, insbesondere einzelnen Epithel- und Carcinom-Zellen sowie Mikrometastasen inkubiert, wo¬ durch diejenigen Antikörper identifiziert werden, die Cad-ex-Teile von desmoso¬ malen Cadherinen erkennen.
Beispielhaft wird die Herstellung von Antikörpern gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 beschrieben. Hierzu werden aus Gewebe isoliertes oder rekombinant, z.B. in E.coli, tierischen Zellen oder Hefe, hergestelltes Dsg2 und/oder Fragmente davon zur Immunisierung von Tieren und für weitere "Booster" benutzt, z.B. ein Poly¬ peptid von Dsg2, das zumindest teilweise innerhalb der Domänen El, EM, EMI, EIV und EA von Dsg2 liegt, etwa die vorstehende Aminosäuresequenz I, ganz besonders die vorstehende Aminosäuresequenz II umfaßt. Dabei werden entwe¬ der glykosylierte oder nicht-glykosylierte Formen eingesetzt. Milzzellen werden den Mäusen entnommen und mit Myelomzellen fusioniert. Erhaltene monoklonale Antikörper werden mit einzelnen Epithel- und Carcinomzellen sowie Mikrometa¬ stasen inkubiert. Es werden so z.B. die folgenden, Cad-ex-Teile von Dsg2 erken¬ nenden monoklonalen Antikörper der IgG 1 -Klasse, Dsg2-G6, Dsg2-G 1 1 , Dsg2- G91 , Dsg2-G96 und Dsg2- 129 erhalten.
Zur Herstellung von synthetischen Antikörpern kann z.B. von vorstehenden monoklonalen Antikörpern ausgegangen werden. Hierzu bietet sich an, die Antigen-Bindungsregion der monoklonalen Antikörper zu analysieren und die für die spezifische Erkennung von Cad-ex-Teile eines desmosomalen Cadherins notwendigen und nicht-notwendigen Teile zu identifizieren. Die notwendigen Teile können dann modifiziert und die nicht-notwendigen Teile ganz oder teilwei¬ se eliminiert bzw. durch Teile ersetzt werden, die den Antikörpern weitere günstige Eigenschaften verleihen. Auch können Teile außerhalb der Bindungs¬ region der Antikörper modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Der Fachmann weiß, daß sich für vorstehende Maßnahmen insbesondere die DNA-Rekom- binationstechnologie eignet. Diese ist ihm bestens vertraut.
Erfindungsgemäße Antikörper zeichnen sich dadurch aus, daß sie Teile von desmosomalen Cadherinen erkennen, die an der freien Zelloberfläche von nicht oder nur teilweise durch Desmosomen verbundenen Zellen exponiert sind. Solche Zellen sind insbesondere einzelne Epithel- und Carcinomzellen sowie Mikrometastasen. Damit eignet sich die vorliegende Erfindung zum Nachweis dieser Zellen und Zellgruppen. Der Nachweis kann durch übliche Nachweisver¬ fahren, insbesondere einem "Western Blot", einem ELISA, einer Immunpräzipita- tion oder durch Immunfluoreszenzmikroskopie, erfolgen. Hierzu können erfin¬ dungsgemäße Antikörper, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kom¬ bination mit markierten, gegen sie gerichteten Antikörpern eingesetzt werden. Ferner können erfindungsgemäße Antikörper in einem Biosensor-Verfahren einge¬ setzt werden. Die Reaktion der erfindungsgemäßen Antikörper kann auf leben¬ den oder fixierten Zellen stattfinden.
Erfindungsgemäß werden auch Kits bereitgestellt, die erfindungsgemäße Antikör¬ per zusammen mit Trägermaterialien und üblichen Hilfsstoffen wie Puffer enthal¬ ten.
Desweiteren eignen sich erfindungsgemäße Antikörper dazu, nicht durch Desmo¬ somen verbundene Zellen, insbesondere einzelne Epithel- und Carcinom-Zellen sowie Mikrometastasen, bestehend aus wenigen, teilweise durch Desmosomen gekoppelten Carcinom-Zellen, in üblichen Zeilsortierungsverfahren anzureichern, insbesondere durch FACS-Methoden oder durch übliche Immunadsorption an geeignete Träger wie beschichtete Kügelchen (Beads), wodurch diese weiteren diagnostischen Untersuchungen unterzogen bzw. für therapeutische Tests und Maßnahmen herangezogen werden können. Als Nachweisverfahren eignen sich z.B. Immunblot-Analysen oder ELISA.
Darüber hinaus eignen sich erfindungsgemäße Antikörper als Vermittler, weitere Antikörper und Liganden, z. B. toxische Substanzen, an vorstehende Zellen und Zellgruppen heranzuführen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch als Carrier für Toxine und toxisch wirksame Substanzen eingesetzt werden. Deswei¬ teren eignen sie sich zum Entfernen von Tumorzellen aus Zellsuspensionen.
Mit der vorliegenden Erfindung sind somit neue diagnostische und therapeuti¬ sche Maßnahmen bei Carcinomen, insbesondere metastasierenden Carcinomen, möglich.
Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die Abbildungen beschrieben:
In der Abbildung 1 sind beispielhaft menschliche Carcinom-Zellen in der Immun¬ fluoreszenzmikroskopie dargestellt, nachdem sie als intakte Zellen fixiert worden sind und mit Antikörpern gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 reagiert haben, so in der linken Hälfte eine einzelne Zelle eines Plattenepithel-Carcinoms der Vulva (Linie A-431 der American Type Culture Collection, Katalog-Nr. ATCC CRL 1 555) und in der rechten Hälfte ein Zellpaar der Linie PLC eines primären Leberzell-Carci- noms (American Type Culture Collection, Katalog-Nr. ATCC CRL 8024) . Die in der Fluoreszenz hell aufleuchtenden Punkte sind die Reaktionsstellen der von außen zugänglichen Cad-ex-Teile des Dsg2 Glykoproteins.
In der Abbildung 2 ist eine solche Reaktionsstelle auf einer intakten Zelle in der Immunelektronenmikroskopie dargestellt, wobei hier eine menschliche Epidermis- Zelle der Linie HaCaT als Beispiel benutzt wurde und die an der Oberfläche gebundenen Antikörper gegen Cad-ex-Teile von Dsg2 mit einem spezifisch gegen die Art dieser Antikörper gerichteten zweiten Antikörper nachgewiesen wurden, der an kolloidale Goldpartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich etwa 1 0 Nanometer gekoppelt war. Die Gruppe der sechs kontrastreichen Goldpartikel markiert so eine Dsg2-haltige Oberflächenstruktur, die nicht in einem Desmosom vorkommt.
In Abbildung 3 wird beispielhaft das Ergebnis der Immunblot-Analyse der Zell¬ kulturflüssigkeit von menschlichen HaCaT-Zellkulturen dargestellt. Die Proteine der Zellkulturflüssigkeit wurden elektrophoretisch größenfraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Färbung der Membran mit Ponceau- Reagenz zeigt unspezifisch die quantitativ am stärksten vertretenen Proteine der Probe (Abb. 3, a, Spur 2) sowie Größenmarker-Proteine (Abb. 3, a, Spur 2). Die Membran wurde anschließend mit den monoklonalen Antikörpern Dsg2-G 1 1 (Abb. 3, b) beziehungsweise Dsc3-U1 14 (Abb. 3, c) untersucht. Die spezifi¬ schen Antikörper detektieren sowohl für Dsg2 als auch für Dsg2 als auch für Dsc3 ein spezifisches, etwa 90kDa großes Molekülfragment der extrazellulären Moleküldomäne.
Die Gewinnung solcher der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Antikör¬ per wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Cad-ex-Teile von Dsg2
Zur Immunisierung wurden Mäuse des Stammes Balb/c verwendet. Als Antigen wurde ein Dsg2-Polypeptid verwendet, das die vorstehende Aminosäuresequenz II enthielt. Einer Maus wurden dann etwa 100μg Polypeptid, emulgiert in voll¬ ständigem Freund's Adjuvans, verabreicht. Es folgten drei "Booster"-Injektionen mit jeweils 1 00 μg Polypeptid, wobei das Polypeptid in nicht-vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert war. Vier Tage vor Entnahme der Milzzellen wurden der Maus 1 00μg Polypeptid intraperitoneal verabreicht. Die dann entnommenen Milzzellen wurden mit Maus-Myelomzellen des bekannten Stammes X63-Ag8 653 fusioniert. Es wurden monoklonale Antikörper erhalten. Diese wurden mit einzelnen Epithel- und Carcinom-Zellen inkubiert, wodurch jene Antikörper identifiziert wurden, die Cad-ex-Teile von Dsg2 erkennen. Von diesen Antikör¬ pern wurden die mit Dsg2-G 1 1 , Dsg2-G91 , Dsg2-G96 und Dsg2-G 1 29 bezeich¬ neten Antikörper bei der DSM unter DSM ACC 2226, DSM ACC 2227, DSM ACC 2228 bzw. DSM ACC 2229 am 9. August 1 995 hinterlegt. Der Antikörper Dsg2-G6 wurde bei der DSM unter ACC 2236 am 20. September 1995 hinter¬ legt.

Claims

Patentansprüche
1 . Antikörper gegen Teile von desmosomalen Cadherinen, wobei die Teile an der Zelloberfläche auch von nicht durch Desmosomen verbundenen Zellen exponiert sind.
2. Antikörper nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die dadurch erkannten Zellen einzelne Epithel-Zellen, einzelne Carcinom-Zellen und/- oder kleine Carcinom-Zellgruppen, insbesondere Mikrometastasen, sind.
3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das desmosomale Cadherin das Desmoglein Dsg2 ist.
4. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das desmosomale Cadherin das Desmocollin Dsc2 ist.
5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie polyklonal sind.
6. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonal sind.
7. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 3 und 5 - 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß ihr Epitop innerhalb des Molekülabschnitts von Desmoglein Dsg2 liegt, der durch die folgende Aminosäuresequenz bezeichnet ist:
AWITAPVALR EGEDLSKKNP IAKIHSDLAE ERGLKITYKY TGKGITEPPF
GIFVFNKDTG ELNVTSILDR EETPFFLLTG YALDARGNNV EKPLELRIKV LDINDNEPVF TQDVFVGSVE ELSAAHTLVM KINATDADEP NTLNSKISYR IVSLEPAYPP VFYLNKDTGE IYTTSVTLDR EEHSSYTLTV EARDGNGEVT DKPVKQAQVQ IRILDVNDNI PWENKVLEG MVEENQVNVE VTRIKVFDAD EIGSDNWLAN FTFASGNEGG YFHIETDAQT NEGIVTLIKE VDYEEMKNLD FSVIVANKAA FHDSIRSKYK PTPIPIKVKV KNVKEGIHFK SSVISIYVSE SMDRSSKGQI IGNFQAFDED TGLPAHARYV KLEDRDNWIS VDSVTSEIKL AKLPDFESRY VQNGTYTVKI VAISEDYPRK TITGTVLINV EDINDNCPTL IEPVQTICHD AEYVNVTAED LDGHPNSGPF SFSVIDKPPG MAEKWKIARQ ESTSVLLQQS EKKLGRSEIQ FLISDNQGFS CPEKQVLTLT VCEVLHGSGC
REAQHDSYVG
8. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 3 und 6 - 7, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß er bei der DSM unter einer der folgenden Bezeichnungen DSM ACC 2226, DSM ACC 2227, DSM ACC 2228, DSM ACC 2229 bzw. DSM ACC 2236 hinterlegt ist.
9. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 3 und 5 - 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß ihr Epitop innerhalb des Molekülabschnitts von Desmoglein Dsg2 liegt, der durch die folgende Aminosäuresequenz bezeichnet ist.
INDNEPVFTQDVFVGSVEELS AAHTLVMKIN ATDADEPNTL NSKISYRIVS
LEPAYPPVFY LNKDTGEIYT TSVTLDREEH SSYTLTVEAR DGNGEVTDKP
VKQAQVQIRI LDVNDNI PW ENKVLEGMVE ENQVNVEVTR I KVFDADEIG SDNWLANFTF ASGNEGGYFH IETDAQTNEG IVTLIKEVDY EEMKNLDFSV
IVANKAAFHK SIRSKYKPTP I PIKVKVKNV KEGIHFKSSV IS IYVSESMD RSSKGQI IGN FQ
1 0. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 3, 6 und 9, dadurch gekenn- zeichnet, daß er bei der DSM unter einer der folgenden Bezeichnungen
DSM ACC 2226, DSM ACC 2227, DSM ACC 2228, DSM ACC 2229 bzw. DSM ACC 2236 hinterlegt ist.
1 1 . Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 2 und 4 - 6, dadurch gekenn- zeichnet, daß ihr Epitop in dem Aminosäuresequenz-Bereich von Desmo- collin Dsg2 liegt, der mit dem Dekapeptid RWAPIPCSML beginnt und dem Dekapeptid DCTHRVDPRI endet.
12. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß Tiere mit einem oder mehreren desmosomalen Cadherinen und/oder Fragmenten davon immunisiert werden, und
(a) polyklonale Antikörper aus den Seren der Tiere erhalten werden, oder
(b) monoklonale Antikörper nach Fusion von Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen erhalten werden, oder
(c) Antikörper mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technik hergestellt wurden
(d) die nach (a), (b) oder (c) erhaltenen Antikörper mit nicht durch Des¬ mosomen verbundenen Zellen inkubiert werden, wodurch die ent- sprechenden Antigene auf der Oberfläche dieser Zellen identifiziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immuni¬ sierung der Tiere ein Desmoglein Dsg2-Fragment mit folgender Aminosäu- resequenz verwendet wird:
AWITAPVALR EGEDLSKKNP IAKIHSDLAE ERGLKITYKY TGKGITEPPF GIFVFNKDTG ELNVTSILDR EETPFFLLTG YALDARGNNV EKPLELRIKV LDINDNEPVF TQDVFVGSVE ELSAAHTLVM KINATDADEP NTLNSKISYR IVSLEPAYPP VFYLNKDTGE IYTTSVTLDR EEHSSYTLTV EARDGNGEVT
DKPVKQAQVQ IRILDVNDNI PWENKVLEG MVEENQVNVE VTRIKVFDAD EIGSDNWLAN FTFASGNEGG YFHIETDAQT NEGIVTLIKE VDYEEMKNLD FSVIVANKAA FHDSIRSKYK PTPIPIKVKV KNVKEGIHFK SSVISIYVSE SMDRSSKGQI IGNFQAFDED TGLPAHARYV KLEDRDNWIS VDSVTSEIKL AKLPDFESRY VQNGTYTVKI VAISEDYPRK TITGTVLINV EDINDNCPTL
IEPVQTICHD AEYVNVTAED LDGHPNSGPF SFSVIDKPPG MAEKWKIARQ ESTSVLLQQS EKKLGRSEIQ FLISDNQGFS CPEKQVLTLT VCEVLHGSGC REAQHDSYVG 14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immuni¬ sierung der Tiere ein Desmoglein Dsg2-Fragment mit folgender Aminosäu¬ resequenz verwendet wird:
INDNEPVFTQDVFVGSVEELS AAHTLVMKIN ATDADEPNTL NSKISYRIVS
LEPAYPPVFY LNKDTGEIYT TSVTLDREEH SSYTLTVEAR DGNGEVTDKP VKQAQVQIRI LDVNDNI PW ENKVLEGMVE ENQVNVEVTR IKVFDADEIG SDNWLANFTF ASGNEGGYFH IETDAQTNEG IVTLIKEVDY EEMKNLDFSV IVANKAAFHK SIRSKYKPTP IPIKVKVKNV KEGIHFKSSV ISIYVSESMD RSSKGQI IGN FQ
1 5. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 1 - 1 1 für diagno¬ stische und/oder therapeutische Maßnahmen.
1 6. Verwendung nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß die diagno¬ stischen Maßnahmen den Nachweis von nicht durch Desmosomen ver¬ bundenen Carcinom-Zellen und kleinen Carcinom-Zellgruppen umfassen.
1 7. Verwendung nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß lebende oder fixierte Carcinom-Zellen durch Anwendung von Zeilsortierungsver¬ fahren abgetrennt, angereichert oder diagnostiziert werden.
1 8. Verwendung nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß die thera¬ peutischen Maßnahmen das Hinzuführen von weiteren Antikörpern oder Liganden an die bezeichneten Epitope umfassen.
1 9. Verwendung nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß die diagno¬ stischen Maßnahmen die klinisch-chemische Detektion von Molekülfrag¬ menten der extrazellulären Domäne desmosomaler Cadherine in Körper- flüssigkeiten umfassen.
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