EP0970378A2 - $i(IN VITRO)-VERFAHREN ZUM PROGNOSTIZIEREN DES KRANKHEITSVERLAUFS VON PATIENTEN MIT MAMMAKARZINOM UND/ODER ZUM DIAGNOSTIZIEREN EINES MAMMAKARZINOMS - Google Patents

$i(IN VITRO)-VERFAHREN ZUM PROGNOSTIZIEREN DES KRANKHEITSVERLAUFS VON PATIENTEN MIT MAMMAKARZINOM UND/ODER ZUM DIAGNOSTIZIEREN EINES MAMMAKARZINOMS

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EP0970378A2
EP0970378A2 EP98917024A EP98917024A EP0970378A2 EP 0970378 A2 EP0970378 A2 EP 0970378A2 EP 98917024 A EP98917024 A EP 98917024A EP 98917024 A EP98917024 A EP 98917024A EP 0970378 A2 EP0970378 A2 EP 0970378A2
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EP
European Patent Office
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mrna
protein
patients
antibody
specific
Prior art date
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Withdrawn
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EP98917024A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Anne Katrin Werenskiold
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Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Publication date
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Publication of EP0970378A2 publication Critical patent/EP0970378A2/de
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57565—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen [CEA]
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro method for predicting the course of the disease in patients with breast cancer and / or for diagnosing breast cancer, kits which are suitable for carrying out this method and the use of T1 -specific antibodies or fragments thereof or of T1.
  • specific oligonucleotides for determining T1 protein or T1 mRNA in patients with breast cancer are suitable for carrying out this method and the use of T1 -specific antibodies or fragments thereof or of T1.
  • Invasive breast cancer is the most common malignant tumor in women; every 16th woman suffers from it on a statistical average.
  • the breast tumor is removed as the primary therapeutic measure.
  • the nodal status but also the tumor size, the histological type, the degree of differentiation and the hormone receptor status are the most important parameters for the prognosis and further therapy planning.
  • the focus is on assessing the axillary lymph node status. For example, in patients with lymph node involvement in the armpit area (nodal positive, N (+)) that is already present at the time of tumor diagnosis or surgery, chemotherapy is usually carried out immediately, possibly supported by additional radiation therapy.
  • N (0) negative axillary lymph node status
  • Vimentin synthesis correlates with the invasive growth of breast cancer cell lines in vitro (Thompson et al., 1991) and in some cases with rapidly growing invasive ductal breast cancer with poor prognosis in vivo (Domagala et al., 1990). Possible prognostic factors continue to be cytometrically determined morphometric and texture features as well as DNA parameters (Auer et al., 1994).
  • the object of the invention is therefore to provide a method which allows a sufficiently reliable prognosis of the further course of the disease in breast cancer patients.
  • this object is achieved by an in vitro method for predicting the course of the disease in patients with breast cancer and / or for diagnosing a breast cancer, which comprises the qualitative or quantitative determination of T1 protein and / or T1 mRNA in sample material obtained from the patient .
  • the T1 protein is an extracellular, soluble glycoprotein of 60-70 kDa (Werenskiold, 1992) with homology to members of the immunoglobulin superfamily, in particular the carcinoma embryonic antigen (Klemenz et al., 1989).
  • the molecule was identified in an analysis of the early effects of oncoproteins (p21 ras and p39 v'mos ) on gene expression in fibroblasts (Werenskiold et al., 1989).
  • the T1 protein is only synthesized in embryonic tissues; it cannot be detected in the adult animal (Roessler et al., 1995 a, b).
  • T1-M a second, membrane-based variant of the molecule
  • the membrane-bound T1-M protein is very similar to the IL-1 receptor type 1, but has no affinity for the cytokines IL-1 ⁇ and ⁇ (Roessler et al., 1995 b; Danescu and Werenskiold, 1995) or IL-1 ra (Gayle et al., 1996).
  • T1-M represents a new mast cell-specific cytokine receptor (Roessler et al., 1995 b; Thomassen et al., 1995).
  • the oncogene-inducible soluble variant of the T1 protein is a shortened form of this receptor and corresponds to its ligand-binding domain. Recombinantly produced, soluble T1 from the mouse (Rupp et al., 1995) blocks the growth of mast cells.
  • T1 protein In mouse breast cancer, overexpression of the soluble T1 protein has so far been observed only in invasively growing, poorly differentiated tumors. Both the tumor stroma and the anaplastic tumor cells synthesize T1. In situ hybridizations show an increased expression of T1 in tumor cells on the periphery of tumor cell complexes and - possibly induced by the tumor cells - in the stroma cells immediately adjacent to them (Roessler et al., 1993). The induction of T1 expression in the tumor cells correlates with their phenotypic transformation and is accompanied by a loss of E-cadherin and cytokeratin production.
  • T1 AP1-dependent promoter of the T1 gene
  • AP1-dependent promoter of the T1 gene which is only active in non-hemopoietic (eg fibroblastic) cells.
  • the induction of T1 takes place clearly before that of the also AP1-dependent, mesenchymal cytoskeletal protein vimentin and therefore forms an early marker for the transformation process.
  • the occurrence or absence of a T1 transcription or expression allows a statement about the future course of the disease, in particular indications of the likelihood of a recurrence or the development or growth of metastases.
  • a high T1 value surprisingly correlates with a good prognosis in patients with an N (0) node status
  • a high T1 protein or T1 level correlates in patients with an N (+) node status mRNA level means a poor prognosis
  • the T1 protein and / or the Tl mRNA is determined in a tumor tissue sample from the patient.
  • tissue sections are made and fixed, for example, using customary methods and then subjected either to an immunoassay to detect existing T1 protein or to hybridization with labeled or labelable oligonucleotides or DNA fragments.
  • Total RNA or poly (A) + mRNA can optionally be isolated from the tumor tissue by customary methods, which can then be determined, for example after gel electrophoretic separation or after fixation to a solid matrix, in turn by hybridization with a labeled or markable oligonucleotide.
  • T1 protein is not only detectable in the tumor tissue itself, but also in various body fluids of affected patients.
  • the method according to the invention is carried out with a blood or serum sample.
  • T1 mRNA A number of methods are available for determining the T1 mRNA. As already indicated above, it is possible, on the one hand, to detect T1 mRNA in situ or in corresponding RNA or mRNA preparations by hybridizing with an appropriate oligonucleotide probe or a DNA fragment.
  • the oligonucleotide probe or the DNA fragment can itself be a measured emit a clear signal, eg be radiolabelled, or be capable of signaling through interaction with other molecules. For better evaluation of the corresponding tests, it is recommended in most cases to bring about an amplification of the signal.
  • the target nucleic acid to be detected is usually amplified.
  • a cDNA copy is first produced using known methods. This cDNA copy is then subjected to a PCR.
  • the sequence of the human T1 gene is already partially known (Tominaga et al., 1992), the selection of suitable oligonucleotides for carrying out the reverse transcription and the PCR method is therefore within the range of skill in the art.
  • An example of a suitable oligonucleotide is the oligonucleotide with the sequence 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3 'or a fragment thereof.
  • Another suitable primer is the anti-sense primer 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3 'or a suitable fragment thereof.
  • Preferred primers come from the 3'-untranslated region and / or the region of exons 8 and 9. Primers from the regions mentioned have the advantage that they only hybridize with the RNA coding for the tumor-associated T1-S protein, but not with the T1-M mRNA resulting from alternative splicing.
  • One of the specific primers, sense or anti-sense can optionally be replaced by a commercially available random primer.
  • a number of other methods are now known in the prior art with which target nucleic acids can be amplified.
  • the amplification products formed are detected in a manner known to the person skilled in the art.
  • the incorporation of digoxigenin-containing nucleotides and subsequent reaction with enzyme-conjugated anti-digoxigenin antibodies makes the DNA synthesized with the PCR method visible.
  • Any enzyme capable of signaling can be conjugated to the anti-digoxigenin antibody, e.g. alkaline phosphatase, acid phosphatase, peroxidase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase and horseradish peroxidase.
  • the T1 mRNA can be quantitatively, e.g. by measuring the absorption or fluorescence of soluble products, or at least qualitatively.
  • the alkaline phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody available from Boehringer Mannheim is well suited for determining the T1 mRNA present. It is known to the person skilled in the art that there are still further possibilities for the detection of amplified nucleic acids, e.g. by incorporating biotin-labeled nucleotides and then reacting the products with avidin- or streptavidin-conjugated enzymes, which enable signaling. Finally, such an enzyme can also be coupled to a third oligonucleotide which is complementary to a section of a strand of one of the amplified nucleic acids.
  • the amplification products can be detected in the gel after gel electrophoresis of the reaction mixture, but it can also be done in solution or after binding to a solid matrix.
  • a large number of systems are currently available on the market which serve for the detection of amplified DNA and can be tailored to the needs of the detection of T1 mRNA.
  • the T1- involve mRNA and thereby enable detection of even the smallest amounts of Tl mRNA
  • other methods are based on the detection of the molecules by amplification of the signal.
  • An example of this is the bDNA method (Pachl et al., 1994), in which the nucleic acid to be detected is coupled to a solid matrix via hybridization with an oligonucleotide, via a further hybridization with a second oligonucleotide to a branched DNA, which in turn is linked to a A large number of oligonucleotides coupled to a signaling enzyme hybridize. By branching the DNA, it is possible to attach a large amount of signaling enzyme units per target molecule present.
  • the sample material is exposed to an antibody specific for T1 or fragments thereof.
  • Suitable antibody fragments are, for example, Fab and F (ab) 2 fragments.
  • the antibodies or antibody fragments can, for example, be incubated directly with the tissue section or else be exposed to an immunoassay in which protein extract is fixed, for example, on microtiter plates, separated on a gel matrix or made accessible to the antibody in another way and brought into contact with it.
  • the antibodies can be monoclonal or polyclonal antibodies, for example mouse, rabbit or rat antibodies. The antibodies should react specifically with the T1 protein or selected epitopes of this protein.
  • the method is carried out with antibodies which are specific for the p9 peptide or the p16 peptide from mouse T1 (Werenskiold, 1992).
  • the p9 peptide originates from an area that spans a complete immunoglobulin-like half-domain of the protein.
  • the p16 peptide corresponds to the carboxy-terminal part of the protein and contains no sequence related to the IgC2 motif of the immunoglobulin superfamily.
  • the antibodies can be directed against the mouse p9 or p16 peptide or corresponding peptides from other mammals as long as they cross-react with the corresponding T1 protein of human origin. In a preferred embodiment, the antibodies are directed against antigenic determinants of the human soluble T1 protein.
  • the antibody is directed against a peptide comprising the sequence p-SKEC.
  • the region coding for this peptide lies between exons 8 and 9 and is only expressed for the soluble protein (T1-S), but not for the receptor (T1-M).
  • kits which is suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the kit contains T1-specific antibodies or fragments thereof and, if appropriate, means for detecting the antibody or its fragments.
  • These agents can be, for example, enzyme-conjugated anti-Ig antibodies which bind specifically to the anti-T1 antibodies used in each case. These antibodies can be detected using conventional methods, which have already been discussed above.
  • the means required for this, e.g. Enzyme substrate can also be provided in the kit.
  • the kit can also be constructed in such a way that the antibodies or antibody fragments suitable for detection are coupled to a solid phase.
  • the solid phase can e.g. the shape of microparticles, e.g. Have glass, polyacrylamide or Sephadex balls, or consist of microtiter plates. Other ways of fixing the antibodies to a solid matrix are also included.
  • the antibody or fragments thereof provided in the kit according to the invention can be a monoclonal or polyclonal antibody. This is produced in a manner known to the person skilled in the art by immunizing with the antigen desired in each case, for example the p9 or p16 peptide. Sufficient amounts of these peptides can be obtained by recombinant expression in eukaryotic systems, for example in the vaccinia virus system (Werenskiold, 1992), or in prokaryotic hosts, for example in E. coli, B. subtilis or Streptomycetes. In a further embodiment, synthetically produced peptides are used for the immunization instead of natural or recombinantly expressed proteins. Peptides which comprise the sequence p-SEKC are particularly preferred.
  • kits which is suitable for the detection of T1-specific nucleic acids, preferably T1-specific mRNA.
  • the kit contains at least one oligonucleotide which is complementary to the T1 mRNA, therefore can hybridize with it and can optionally serve as a primer for reverse transcription and / or the polymerase chain reaction.
  • Kits which are ultimately intended to carry out a PCR may furthermore contain one or more further oligonucleotides which correspond to the sense strand of the T1 mRNA and which, in combination with the first oligonucleotide, permit the amplification of the T1 mRNA.
  • a kit according to the invention for detecting the T1 mRNA can also contain the enzymes necessary for reverse transcription and / or amplification, for example reverse transcriptase, DNA polymerase, RNAse H, T7 polymerase and / or agents for detecting the amplified products.
  • the amplification products can be detected, for example, by built-in modified nucleotides, for example digoxigenized or biotinylated nucleotides, or by hybridization of a labeled or markable oligonucleotide which is complementary to the T1 mRNA or its complementary strand.
  • a further possibility of detection lies in the use of modified primers which, for example, are connected at their 5 'end to an antigen which is recognized by an enzyme-bound antibody.
  • the literature contains countless examples of such detection methods which are familiar to the person skilled in the art and which determine the design of the kit in detail.
  • the nucleotide sequence of the T1 gene and thus the coding regions of the T1 mRNA are known. Knowing the sequence, the person skilled in the art can easily select suitable primers.
  • Preferred embodiments see the use of an oligonucleotide with the sequence 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3 'as the first oligonucleotide and that of an oligonucleotide with the sequence 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3' another oligonucleotide.
  • at least one of the oligonucleotides is conjugated at its 5 'end with an antigen or an enzyme capable of signaling.
  • the invention further relates to the use of T1 -specific antibodies or fragments of such antibodies for detecting the presence of T1 protein in tissue samples, blood or serum samples from a patient with breast cancer.
  • the T1 protein can be detected using the method according to the invention.
  • the invention also relates to the use of T1-specific oligonucleotides for the detection of T1 mRNA in sample material from patients with breast cancer.
  • the oligonucleotide used can be sense or anti-sense oligonucleotides.
  • Figure 1 Detection of human T1 mRNA species in cultured cells and in primary tissue.
  • Total RNA (10 ⁇ g, lanes 1, 3, 5) or poly (A) + RNA (1 ⁇ g, lanes 2, 4) from established keratinocytes of the skin (Ha-Cat, lanes 1, 2) and mast cells (HMC- 1, lanes 3, 4) and from mature placenta (5) were fractionated with a 1% agarose gel, transferred to a nylon membrane and hybridized with T1-specific samples.
  • A Hybridization sample from the ORF (positions 45-602 of the cDNA sequence according to Tominaga, 1992); 3 mRNA species with sizes of 5 kb, 2.7 kb and 2 kb are detected.
  • Hybridization sample from the 3 'untranslated region (position 990-1310 of the cDNA sequence according to Tominaga, 1992); specifically detects the 2.7 kb T1 mRNA (as well as non-specific 28 S rRNA in total RNA samples). The position of the ribosomal RNA (28 S and 18 S) is shown on the left.
  • T1-positive total RNA from Planzenta was serially diluted in T1-negative total RNA of the U2OS cell line and the RNA mixtures were reverse transcribed. Aliquots of the cDNA, each corresponding to 25 ng RNA mixture / test, were analyzed by means of PCR (see material and methods: 25 ng for T1-PCR, 1 ⁇ l therefrom for actin-PCR). The amount of placental RNA (in ng) per 25 ng of total RNA is shown above the lanes. (Zero: reaction only with T1 negative RNA; minus: negative control, i.e. PCR without cDNA template). 10 ⁇ l each of the reaction products were separated in a 2% TBE (trisborate / EDTA buffer) gel and stained with ethidium bromide.
  • TBE trisborate / EDTA buffer
  • Figure 2 Semi-quantitative RT-PCR for the detection of 2.7 kb T1 mRNA in total RNA from breast cancer. For implementation see material and methods. 10 ⁇ l of the reaction products were separated on agarose gels and ethidium bromide was stained.
  • T1 mRNA expression was evaluated as follows:
  • T1 actin> 1: T1 positive
  • FIG. 4 Detection of T1 protein in breast cancer. The immunostaining was carried out as indicated in Example 5.
  • T1 -specific signals can only be observed in tumor cells, but not in surrounding stroma.
  • FIG. 5 Prognostic significance of the T1-S-RNA level for the course of the disease in patients with nodal-negative breast cancer.
  • the T1 RNA level was determined for a collective of 55 cases (Examples 6, 10).
  • the probability of recurrence-free survival is plotted in a follow-up period of 5 years.
  • RNAse powdered free mortar 1 ml of Gua SCN solution (4 M guanidinium isothiocyanate, 25 mM sodium citrate pH 7.0, 0.5% sodium lauroyl sarcosinate, 0.1 M ⁇ -mercaptoethanol) was pipetted into 100 mg of powdered mixture. The suspension was transferred to an Eppendorf reaction vessel (ERG).
  • Eppendorf reaction vessel Eppendorf reaction vessel
  • RNA was precipitated with 900 ⁇ l isopropanol (1 vol.) At -20 ° C. (> 1 hour).
  • RNA solution was always cooled on ice, only freshly autoclaved water was used; wearing gloves was mandatory).
  • RNA was first glyoxylated and separated on a 1% agarose gel (McMaster et al., 1977). The gels were stained with acridine orange prior to transfer to Biodyne membranes (Pall Ultrafine Filtration Co., Glen Cove N.Y.). The RNA was then fixed to the membrane by baking at 80 ° C. for one hour.
  • RNA blots were carried out for at least 3 hours in hybridization buffer (50% formamide, 10 mM Tris hydrochloride pH 7.5, 2 x SSC (20 x SSC: 3 M NaCl + 0.3 M sodium citrate), 5 x Denhardt's solution (50 x Denhardt's solution: 1% Ficoll, 1% polyvinylpyrrolidone, 1% bovine serum albumin), 1% sodium dodecyl sulfate and 0.1 mg denatured DNA per ml). They were then hybridized in fresh buffer containing 0.5 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 6 cpm radiolabeled probe per ml for 15 hours to 3 days at 45 ° C. in a rolling oven (Bachhofer). The filters were washed thoroughly in 0.1 x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C and autoradiographed.
  • hybridization buffer 50% formamide, 10 mM Tris hydrochloride pH 7.5, 2 x SSC (20 x S
  • RNA was denatured for 5 minutes at 95 ° C. in 20 ⁇ l of RT-PCR buffer (50 mM KCI, 20 mM Tris, 2.5 mM MgCl 2 , 0.1 mg / ml of bovine serum albumin, each 1 mM dATP, dCTP, dGTP and TTP pH 8.4, 0.5 units RNasin, 0.09 OD 26 o-units random primer (BRL, Eggenstein, DE) and taken up with 200 units Moloney -Mouse Leukemia Virus (MMLV) Reverse Transcriptase (BRL) were added, the reaction mixtures were incubated for 10 minutes at 20 ° C.
  • MMLV Moloney -Mouse Leukemia Virus
  • a 10 ⁇ l aliquot of the reverse transcription cocktail was used in each amplification test.
  • the aliquots were incubated in a total volume of 50 ⁇ l in RT-PCR buffer containing 10 pmol of each of the two specific primers and 1 unit of DNA polymerase (AmpliTaqu, Perkin Elmer). After completion of the reaction, the samples were extracted with chloroform and the reaction products were observed after separating the aliquots of the reaction on 2% agarose gels.
  • T13'seq CTTTGATCACCTGAACTTTCTCTAGCA
  • AGTTTTCGGTTGGTGCATTTC Acseq: GGTCACCCACACTGTGCCCATCTA Acrev: GCATTGCGGTGGACGATGGAGGG
  • the ratio of the band strengths of the T1- or actin-specific bands is determined densitometrically.
  • the primers described in 3.2 were used.
  • reverse transcripts of 25 to 250 ng RNA were used as a template for the PCR amplification of T1-S in a final volume of 25 ⁇ l.
  • 1 ⁇ l of the completely pipetted T1-PCR batches served as a template for the amplification of actin in a separate tube in a final volume of 25 ⁇ l.
  • the corresponding T1-S and actin-specific PCR reactions were amplified simultaneously. 10 ul of the reaction products were mixed and separated in 1.5% agarose gels (70 min, 4 V-CM).
  • the gels were stained with ethidium bromide and the ethidium bromide fluorescence was recorded using a Gelprint 2000 i video documentation system (MWG Biotech, Ebersberg, FRG). The signal intensity was quantified using the integrated 1 D scan software.
  • the T1-S mRNA expression levels were calculated after normalization of the T1 -S-specific signals using the actin-specific signals of the corresponding PCR reaction. Samples without the addition of an RNA template in all reverse transcription reactions and PCR approaches were used as a negative control. Placenta RNA has been used as an external standard for reverse transcription and PCR amplification. det and resulted in a T1 RNA level of 1.8 + 0.1.
  • T1 levels calculated from different dilutions usually differed by less than 10%.
  • the mean T1 levels for the individual tumor RNA samples were calculated from at least 2 independent PCR runs (with at least 2 dilutions of the cDNA) for each of the two independent reverse transcription reactions.
  • the quantitative resolution of the method is demonstrated here in a dilution experiment: T1-positive placenta RNA was diluted in a dilution series in a ratio of 1: 3 with T1-negative RNA from BeWo chorionic carcinoma cells. 25 ng of each RNA mixture was used as a template for RT-PCR.
  • the batches containing a decreasing amount of placental RNA led to decreasing amounts of the T1-specific amplification product in the presence of a constant amount of actin-specific products in all reactions.
  • Plotting the T1 mRNA level against the amount of T1 positive placenta RNA template in each reaction shows a linear correlation over a range of 0.8 to 8.3 ng template.
  • the T1 amplification exceeded the linear range of the test.
  • Frozen sections of frozen tumor tissue 7 to 9 ⁇ m thick were cut at -20 ° C, transferred to silane-coated slides and in 4% paraformaldehyde (PAF) in phosphate-buffered saline (PBS) (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4, 3 mM disodium hydrogen phosphate, 1, 4 mM potassium dihydrogen phosphate, pH 7.3) fixed for 30 minutes. Fixed sections were dried at 43 ° C. Before hybridization, the sections were rehydrated in PBS for 5 minutes at room temperature, treated with Proteinase K (2 ⁇ g / ml in 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) for 5 to 10 minutes at 37 ° C.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Each freezing section was then mixed with 20 ⁇ l hybridization buffer (50% formamide, 2 ⁇ SSC, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, 250 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, pH 7), containing 1 ⁇ 10 6 cpm 35 S-labeled RNA Probe added and hybridization carried out for 16 to 18 hours at 42 ° C in a humid chamber.
  • the sections were washed 3 times for 20 minutes in 4 times SSC at 42 ° C., with RNAse A (20 ⁇ g / ml in 0.5 M NaCl, 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) for 30 minutes at 37 ° C.
  • the polyclonal serum generated against a synthetic peptide that corresponds to the C-terminal sequence of mouse T1-S has already been described (Rössler, 1995b).
  • Purified IgG was used at a concentration of 7 ⁇ g / ml.
  • the monoclonal antibody M144 was generated in rats against recombinant human T1-S-Fc from COS cells, the working concentration was 16 ⁇ g / ml.
  • the immunohistochemical investigations were carried out on formalin-fixed sections embedded in paraffin using the ABC vector peroxidase staining kit (Camon, Wiesbaden, FRG).
  • T1 staining was determined by pre- adsorption confirmed with a 25-fold molar excess of purified antigen before immunostaining using irrelevant control antibodies. No signals were obtained in these reactions.
  • both T1-specific antisera reacted with T1-mRNA-positive, but not with T1-mRNA-negative, cultured cells under the experimental conditions that were used for the staining of the tumor sections.
  • the T1 immunohistochemical reactivity was determined using a modification of the method described in Remmele and Stegler, 1987, using two multipliers: The T1 staining intensity was found to be absent (0), low (1), medium (2) or high ( 3) classified. The percentage of T1-reactive tumor cells was classified with the following cut-off limits:> 80% (4),> 50% (3),> 20% (2), ⁇ 20% (1), 0% ( 0). The T1 protein level was obtained as the product of both variables and spanned a range from 0 to 12.
  • T1 mRNA expression was analyzed in total RNA and poly (A) + -enriched RNA, which had been isolated from continuous keratinocytes (Ha-Cat) and mature placenta.
  • Northern blot hybridization with probes containing the 5 'part of the open reading frame of the T1 cDNA showed 3 transcripts of 2 kb, 2.7 kb and 5 kb ( Figure 1A). The size of the latter 2 transcripts agrees well with results obtained in mouse cells in which a T1 mRNA of 5 kb encodes the transmembrane receptor T1-M and a T1 mRNA of 2.7 kb encodes the tumor-associated soluble T1 protein.
  • Hybridization with a fragment of the 3 'untranslated region (positions 45-602 of the cDNA sequence according to Tominaga, 1992) of the human T1 cDNA confirmed the identity of the human 2.7 kb mRNA with that coding for the secreted T1 protein Species ( Figure 1 B).
  • RT-PCR test was established for more sensitive detection of T1 mRNA in tumors.
  • PCR primers specific for the secreted tumor-associated T1 variant were selected so that they led to the generation of a 322 bp fragment in the 3 'untranslated region. Actin sequences were co-amplified as an internal control.
  • RT-PCR of RNA preparations which had proven positive in Northem blot hybridizations amplification products of the expected size were obtained. The quantitative resolution of the procedure was demonstrated in a dilution experiment.
  • a dilution series of T1-positive placenta RNA in T1-negative RNA of the same concentration was applied and analyzed using RT-PCR.
  • the co-amplified actin sequences from the same sample were used as the internal standard for the quantitative evaluation of T1 expression (see Fig. 2).
  • T1 mRNA levels showed a high variability in RNA obtained from tumor tissue.
  • the quantitative evaluation was carried out densitometrically (see legend to Fig. 2). A classification scheme with 3 categories was used for further analysis.
  • the T1 mRNA levels were evaluated as follows:
  • T1 negative T1 amplification product not detectable or only very slightly visible (T1: actin ⁇ 0.1);
  • T1 positive high T1 mRNA values, signal equally strong or stronger than the actin signal (T1: actin> 1).
  • the 40 carcinomas examined were 12 lobular carcinomas, 7 ductolobular and 21 ductal carcinomas.
  • the following T1 expression was found in these tumors:
  • T1 expression showed no correlation with tumor grading.
  • T1 expression and tumor size correlated as follows:
  • the nodal negative group included 18 patients, of whom 7 (39%) developed another carcinoma.
  • the level of T1 expression was a strong prognostic indicator of disease recurrence, comparable to the known Ki67 marker, while the tumor size proved to be prognostically worthless.
  • None of the 8 nodal-negative, T1-positive patients developed a recurring disease during the observation period. Bone metastases were diagnosed in two additional patients in this group at the time of the operation, both of whom survived during the observation period.
  • the Nodal positive patient group included 14 patients, 9 of whom developed a carcinoma recurrence. Of these, only 4 were T1 negative. Metastases were diagnosed in one patient at the time of surgery. The 3 nodal-negative patients without metastases remained carcinoma-free. Of the 10 nodal-positive, T1-positive patients, 8 (80%) developed another carcinoma and 6 (60%) died within the observation period.
  • Tissue sections of 5 ⁇ m thick from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue were deparaffinized and incubated with a polyclonal antiserum against the carboxy-terminal sequence of T1-S (Rössler, 1995a) (8.5 ⁇ g IgG / ml).
  • the T1-specific immune reaction was detected using a secondary biotinylated anti-rabbit antibody, an avidin peroxidase complex and diamino-benzide staining (immunostaining kit: Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories via SERVA, Heidelberg, FRG).
  • T1 -specific staining brown, counterstaining with hematoxylin: blue.
  • the analysis shows the presence of T1 protein in the tumor cells, but not in the surrounding stroma ( Figure 4). The results of the immunohistochemical analysis therefore correspond to those of in situ hybridization with T1-specific probes.
  • T1-S mRNA levels in the breast tissue were determined in the total RNA using the sensitive semi-quantitative RT-PCR test described above (see Material and Methods, 3.3), with which the 3 'untranslated region of the T1-S mRNA is detected. Normalized T1 RNA levels were calculated from the tumor-associated T1 S mRNA levels and classified as low (T1 level ⁇ 0.1) or high (T1 level> 0.1). The 6 FCD cases and 21 of the 55 breast cancer cases (38%) showed a low T1 RNA level. Of the 34 (62%) tumors with high T1 RNA levels, 26 (47%) had medium levels (T1 RNA levels ⁇ 0.5), while 8 (15%) tumors had high levels (T1 RNA Levels> 0.5) contained T1-S mRNA.
  • the correlation of the T1-RNA level with various clinicopathological parameters was examined in a univariate analysis; the results are summarized in Table 5.
  • the T1-RNA level showed no connection with the patient age, the histological tumor type, the tumor size or the expression of estrogen and / or progesterone receptors.
  • T1 expression For 31 of the breast carcinomas analyzed by RT-PCR in Example 6, formally fixed, paraffin-embedded tissue was available for the immunohistochemical analysis of T1 expression.
  • the antisera used here to determine the location of the T1 protein synthesis and the deposition in tumor tissue were (1) a monoclonal antibody which had been raised against human recombinant T1-S protein, and (2) a polyclonal one Antiserum that reacts specifically with murine T1-S but not with T1-M protein (anti-c peptide; Roessler et al., 1995a).
  • the immunohistochemical experiments were carried out with both antibodies; both antibodies gave similar results.
  • Tissue sections from normal breast tissue and FCD tissue showed a slight T1 reactivity in the ductal epithelial cells.
  • 30 showed T1 reactivity in the tumor cells, albeit to a very different extent.
  • the intensity of the T1 reactivity differed drastically between individual cells within a tumor cell cluster and in the fraction of the T1 reactive tumor cells in tissue from different patients (10% to> 90%).
  • ductal carcinomas such as Tumor cells that grew in solid or tubular districts very often had a higher T1 reactivity than disseminated, individual tumor cells. 6 out of 10 tumors that showed a high level of T1 reactivity in the tumor cells also showed a significant T1 reactivity in the stroma.
  • All 5 lobular and 2 medullary carcinomas showed a low to medium T1 reactivity of the tumor cells.
  • a tumor showed no immunoristologically detectable T1 reactivity, while it reacted with other antisera, eg for the detection of estrogen and progesterone receptors.
  • the immunohistochemical T1 reactivity was determined by means of a modification of the protocol by Remmele and Stegener, 1987, the fraction of the T1-reactive tumor cells and their staining intensity being used as parameters (see Material and Methods, 4.2).
  • the resulting classification (T1 protein level) spans a range from 0 (no T1 reactivity) to 12 (high T1 reactivity in> 80% of the tumor cells).
  • T1 RNA level 0.21).
  • T1-S mRNA levels were expected to reflect T1-S protein synthesis since the detailed study of mouse T1 gave no evidence of post-transcriptional regulation of T1 gene expression. This assumption was confirmed by comparing the results obtained with RT-PCR and after immunohistochemical detection of T1 protein for 31 tumors. Only two of the tumors led to inconsistent results when comparing the two methods, which could indicate a post-transcriptional or translational regulatory mechanism: One tumor showed high T1-S mRNA levels but no T1 reactivity.
  • the classic prognostic factors tumor size and hormone receptor status were in the group of Nodal-negative patients, which were examined according to Examples 6 to 9 and which were characterized by a high proportion of small ( ⁇ 3 cm) and poorly differentiated (G3) tumors with a positive status for Estrogen and progesterone receptors were labeled, not of prognostic value.
  • T1 RNA levels are another useful marker for identifying patients with G3 tumors who are at increased risk of relapse to have.
  • patients with G3 tumors were initially classified according to their T1 RNA level.
  • the resulting group of 12 G3 cases with low T1 RNA levels had a drastically increased risk of recurrence (6 relapses, 50%) compared to the 9 G3 cases with high T1 RNA levels (2nd Relapses, 22%).
  • T1 level is a promising new prognostic indicator to identify patients with nodal negative breast cancer who are at a greatly increased risk of recurrence to have.
  • the early identification and selective accompanying therapy of these high-risk patients can be a promising strategy for improving the individual prognosis.
  • Current efforts are focused on establishing simplified procedures for evaluating tumor-associated T1-S expression.
  • immunohistochemistry on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue is a promising alternative to RNA analysis.
  • the prognostic significance of immunohistochemically proven tumor-associated T1 in a larger patient population is currently being investigated.

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Abstract

Für die Prognose und weitere Therapieplanung von Mammakarzinompatienten werden heute in erster Linie der Nodalstatus sowie die Tumorgrösse, der histologische Typ, der Differenzierungsgrad und der Rezeptorstatus herangezogen, wobei der Schwerpunkt auf der Beurteilung des axillären Lymphknotenstatus liegt. Patienten mit negativem axillären Lymphknotenstatus werden, da sie eine bessere Prognose haben, in der Regel nicht nachbehandelt; 30 % dieser Patienten entwickeln jedoch Rezidive. Das Verfahren soll es ermöglichen, die Rezidivgefährdung von Patienten festzustellen. Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt durch die qualitative oder quantitative Bestimmung von T1-Protein und/oder T1-mRNA in aus dem Patienten gewonnenem Probenmaterial eine Vorhersage des weiteren Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom.

Description

In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms, Kits, die zum Durchführen dieses Verfahrens geeignet sind, sowie die Verwendung von T1 -spezifischen Antikörpern oder Fragmenten davon oder von T1 -spezifischen Oligonukleotiden zum Bestimmen von T1 -Protein bzw. T1-mRNA in Patienten mit Mammakarzinom.
Mammakarzinome, insbesondere invasive Mammakarzinome, sind maligne Tu- more mit extrem unterschiedlichem und bisher unvorhersagbarem klinischen Verlauf. Das invasive Mammakarzinom ist bei Frauen der am häufigsten auftretende maligne Tumor; an ihm erkrankt im statistischen Mittel jede 16. Frau. Bei bestehendem Mammakarzinom wird als primäre therapeutische Maßnahme zunächst der Mammatumor entfernt. Für die Prognose und weitere Therapieplanung gelten heute in erster Linie der Nodalstatus, aber auch die Tumorgröße, der histologische Typ, der Differenzierungsgrad sowie der Hormonrezeptorstatus als wichtige Parameter. Der Schwerpunkt liegt aber auf der Beurteilung des axil- liären Lymphknotenstatus. So wird z.B. bei Patienten mit zum Zeitpunkt der Tumordiagnose bzw. Operation bereits bestehendem Lymphknotenbefall im Achselbereich (Nodal-positiv, N(+)) in der Regel sofort eine Chemotherapie durchgeführt, gegebenenfalls unterstützt von einer zusätzlichen Strahlentherapie. Patienten mit negativem axilliären Lymphknotenstatus (Nodal-negativ, N(0)) haben generell eine bessere Prognose und werden deshalb in der Regel weder chemotherapeutisch noch strahlentherapeutisch nachbehandelt. Statistisch entwickeln jedoch bis zu 30 % der als N(0) eingestuften Patienten ein Rezidiv (Yuan 1992). Diese hohe Rezidivrate zeigt, daß die bisher bekannten Prognosefaktoren den Krankheitsverlauf nur sehr unvollständig beschreiben. In den letzten Jahren wurde eine große Zahl von Molekülen im Hinblick auf ihre mögliche Verwendung als Prognosefaktoren für das Mammakarzinom untersucht (zur Übersicht: Schmitt et al., 1994; Hoskins and Weber, 1995), z.B. (Proto)On- kogene wie c-erbB-2 (Allred et al., 1992, Archer et al., 1995), das Tumorsup- pressorgen p53 (Barnes et al., 1993, Lipponen et al., 1993), der Urokinase-Typ- Plasminogenaktivator uPA (Jaenicke et al., 1993; Wilhelm et al., 1994), das Adhäsionsmolekül E-Cadherin (Rasbridge et al., 1993; Graff et al., 1995) und das Zytoskelettprotein Vimentin (Sommers et al., 1992). Die Vimentinsynthese korre- liert mit dem invasiven Wachstum von Mammakarzinom-Zellinien in vitro (Thompson et al., 1991 ) und teilweise mit schnell wachsenden invasiven dukta- len Brustkarzinomen mit schlechter Prognose in vivo (Domagala et al., 1990). Mögliche Prognosefaktoren bilden weiterhin zytometrisch bestimmte morphome- trische und Texturmerkmale sowie DNS-Parameter (Auer et al., 1994).
Keiner der oben erwähnten Faktoren erlaubt jedoch eine ausreichend zuverlässige Prognose des weiteren Krankheitsverlaufs nach Mammakarzinomentfer- nung.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, das eine ausreichend zuverlässige Prognose des weiteren Krankheitsverlaufs bei Mamma- karzinompatienten erlaubt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein in vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufes von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms gelöst, das das qualitative oder quantitative Bestimmen von T1 -Protein und/oder T1-mRNA in aus dem Patienten gewonnenem Probenmaterial umfaßt.
Das T1 -Protein ist ein extrazelluläres, lösliches Glykoprotein von 60-70 kDa (Werenskiold, 1992) mit Homologie zu Mitgliedern der Immunglobulin-Super- familie, insbesondere dem karzinomembryonalen Antigen (Klemenz et al., 1989). Das Molekül wurde in einer Analyse früher Effekte von Onkoproteinen (p21ras und p39v'mos) auf die Genexpression in Fibroblasten identifiziert (Werenskiold et al., 1989). In der Maus erfolgt eine Synthese des T1 -Proteins nur in embryonalen Geweben, sie ist im adulten Tier nicht nachweisbar (Rößler et al., 1995 a,b). Die Funktion des T1 -Proteins ist noch nicht vollständig geklärt, doch gibt die Isolierung einer zweiten, membranständigen Variante des Moleküls (T1-M) Hinweise auf eine Funktion als Zytokinrezeptor. Das membranständige T1-M-Protein weist große Ähnlichkeit mit dem IL-1 -Rezeptor Typ 1 auf, besitzt jedoch keine Affinität zu den Zytokinen IL-1 α und ß (Rößler et al., 1995 b; Danescu and Werenskiold, 1995) oder IL-1 ra (Gayle et al., 1996). T1-M stellt einen neuen Mastzell-spezif- ischen Zytokinrezeptor dar (Rößler et al., 1995 b; Thomassen et al., 1995). Die Onkogen-induzierbare lösliche Variante des T1 -Proteins ist eine verkürzte Form dieses Rezeptors und entspricht dessen Liganden-bindender Domäne. Rekom- binant hergestelltes, lösliches T1 aus der Maus (Rupp et al., 1995) blockiert das Wachstum von Mastzellen.
In Mammakarzinomen der Maus ist eine Überexpression des löslichen T1- Proteins bisher ausschließlich in invasiv wachsenden, schlecht differenzierten Tumoren beobachtet worden. Sowohl das Tumorstroma als auch die anaplastischen Tumorzellen synthetisieren T1. In situ-Hybridisierungen zeigen eine erhöhte Expression von T1 in Tumorzellen an der Peripherie von Tumorzellkomplexen und - möglicherweise von den Tumorzellen induziert - in den unmittelbar diesen benachbarten Stromazellen (Rößler et al., 1993). Die Induktion der T1- Expression in den Tumorzellen korreliert mit deren phänotypischer Transformation und wird von einem Verlust der E-Cadherin- und Zytokeratin-Produktion begleitet. Sie wird von einem AP1 -abhängigen Promotor des T1-Gens gesteuert, der nur in nicht-hämopoetischen (z.B. fibroblastischen) Zellen aktiv ist (Thomassen et al., 1995). Während der phänotypischen Transformation der epithelialen Tumorzellen erfolgt die Induktion von T1 deutlich vor derjenigen des ebenfalls AP1 -abhängigen, mesenchymalen Zytoskelettproteins Vimentin und bildet daher einen frühen Marker für den Transformationsprozeß. Überraschenderweise hat sich nunmehr gezeigt, daß das Auftreten oder Fehlen einer T1 -Transkription bzw. -Expression eine Aussage über den zukünftigen Krankheitsverlauf erlaubt, insbesondere Hinweise auf die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines Rezidivs oder der Entwicklung bzw. des Wachstums von Metastasen. Wie in den Beispielen ausführlich erläutert werden wird, korreliert in Patienten mit einem N(0)-Nodalstatus überraschenderweise ein hoher T1-Wert mit einer guten Prognose, während in Patienten mit N(+)-Nodalstatus ein hoher T1 -Protein- bzw. T1-mRNA-Spiegel eine schlechte Prognose bedeutet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das T1 -Protein und/oder die Tl- mRNA in einer Tumorgewebeprobe des Patienten bestimmt. Dazu werden z.B. Gewebeschnitte nach üblichen Verfahren angefertigt und fixiert und anschließend entweder einen Immuntest zum Nachweis vorhandenen T1-Proteines oder einer Hybridisierung mit markierten oder markierbaren Oligonukleotiden oder DNA-Fragmenten unterworfen. Wahlweise kann aus dem Tumorgewebe nach üblichen Verfahren Gesamt-RNA oder Poly(A)+-mRNA isoliert werden, die dann z.B. nach gelelektrophoretischer Auftrennung oder nach Fixierung an eine feste Matrix wiederum durch Hybridisieren mit einem markierten oder markierbaren Oligonukleotid bestimmt werden kann.
T1 -Protein ist nicht nur im Tumorgewebe selbst nachweisbar, sondern auch in verschiedenen Körperflüssigkeiten betroffener Patienten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Blut- oder Serumprobe durchgeführt.
Für die Bestimmung der T1-mRNA stehen eine Reihe von Verfahren zur Verfügung. Wie oben bereits angedeutet, ist es zum einen möglich, T1-mRNA in situ oder in entsprechenden RNA oder mRNA-Präparaten durch Hybridisieren mit einer entsprechenden Oligonukleotidsonde oder einem DNA-Fragment nachzuweisen. Die Oligonukleotidsonde bzw. das DNA-Fragment kann selbst ein meß- bares Signal abgeben, z.B. radioaktiv markiert sein, oder durch Wechselwirkung mit anderen Molekülen zur Signalgebung fähig sein. Zur besseren Auswertung der entsprechenden Tests empfiehlt es sich in den meisten Fällen, eine Amplifi- kation des Signales herbeizuführen. Üblicherweise wird dazu die nachzuweisende Target-Nukleinsäure amplifiziert.
Für die Amplifizierung der Target-Sequenz, d.h. der T1 -mRNA, mit dem PCR- Verfahren (Polymerase-Ketten-Reaktion) wird zunächst nach bekannten Verfahren eine cDNA-Kopie hergestellt. Diese cDNA-Kopie wird anschließend einer PCR unterworfen. Die Sequenz des menschlichen T1 -Genes ist bereits teilweise bekannt (Tominaga et al., 1992), die Auswahl geeigneter Oligonukleotide zur Durchführung der reversen Transkription und des PCR-Verfahrens liegt daher im Bereich fachmännischen Könnens. Ein Beispiel eines geeigneten Oligonukleoti- des ist das Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3' oder ein Fragment davon. Ein weiterer geeigneter Primer ist der anti-sense-Primer 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3' oder ein geeignetes Fragment davon. Bevorzugte Primer entstammen dem 3'-untrans- latierten Bereich und/oder dem Bereich der Exons 8 und 9. Primer aus den genannten Bereichen haben den Vorteil, daß sie nur mit der für das tumorassoziierte T1-S-Protein kodierenden RNA hybridisieren, nicht jedoch mit der durch alternatives Spleissen entstandenen T1-M-mRNA. Einer der spezifischen Primer, sense- oder anti-sense-, kann gegebenenfalls durch einen kommerziell erhältlichen Random-Primer ersetzt werden. Im Stand der Technik sind inzwischen eine Reihe weiterer Verfahren bekannt, mit denen Target-Nukleinsäuren amplifiziert werden können. In diesem Zusammenhang wird z.B. verwiesen auf das Q- NASBA-Verfahren, bei dem die in der Probe vorliegende mRNA durch die konzertierte Aktion von reverser Transkriptase, RNAse H und T7-Polymerase amplifiziert wird (Kievits et al., 1991 ). Eine weitere Möglichkeit ist der Nachweis von nach reverser Transkription erhaltener DNA durch die sogenannte "Strand Dis- placement Amplification" (SDA) (Walker et al., 1996, sowie darin zitierte Literatur). Dem Fachmann sind noch eine Reihe weiterer Verfahren bekannt, die zum Nachweis oder der Bestimmung der T1-mRNA ebenfalls herangezogen werden können.
Die gebildeten Amplifikations-Produkte werden auf dem Fachmann bekannte Weise nachgewiesen. So kann z.B. durch den Einbau Digoxigenin-haltiger Nukleotide und anschließende Umsetzung mit enzymkonjugierten anti-Digoxigenin- Antikörpern die mit dem PCR-Verfahren synthetisierte DNA sichtbar gemacht werden. Mit dem anti-Digoxigenin-Antikörper kann jedes zur Signalgebung fähige Enyzm konjugiert werden, z.B. alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Peroxidase, ß-D-Galaktosidase, Glucoseoxidase und Meerrettichperoxidase. In Abhängigkeit vom verwendeten Substrat kann die T1-mRNA quantitativ, z.B. durch Messung der Absorption oder der Fluoreszenz löslicher Produkte, oder zumindest qualitativ nachgewiesen werden.
Zum Beispiel eignet sich der von Boehringer Mannheim erhältliche, mit alkalischer Phosphatase konjugierte anti-Digoxigenin-Antikörper gut zum Bestimmen der vorhandenen T1-mRNA. Dem Fachmann ist bekannt, daß es noch weitere Möglichkeiten des Nachweises amplifizierter Nukleinsäuren, z.B. durch den Einbau biotinmarkierter Nukleotide und anschließende Umsetzung der Produkte mit Avidin- oder Streptavidin-konjugierten Enzymen, die eine Signalgebung ermöglichen, gibt. Ein solches Enzym kann schließlich auch an ein drittes Oligonukleotid gekoppelt sein, das einem Teilstück eines Strangs einer der amplifizierten Nukleinsäuren komplementär ist.
Die folgende Tabelle gibt Aufschluß über üblicherweise verwendete Enzyme und in Verbindung mit diesen Enzymen möglicherweise zu verwendende chromoge- ne Substrate. TABELLE 1
Anm: (*): fluoreszierendes Produkt
Der Nachweis der Amplifikations-Produkte kann nach Gelelektrophorese des Reaktionsgemisches im Gel erfolgen, er kann aber auch in Lösung oder nach Bindung an eine feste Matrix erfolgen. Auf dem Markt ist derzeit eine Vielzahl von Systemen erhältlich, die dem Nachweis von amplifizierter DNA dienen und auf die Bedürfnisse des Nachweises von T1-mRNA zugeschnitten werden können.
Während die oben erwähnten Verfahren die reverse Transkription und/oder Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure, im vorliegenden Fall der T1- mRNA involvieren und dadurch einen Nachweis auch geringster Mengen Tl- mRNA ermöglichen, beruhen andere Verfahren auf dem Nachweis der Moleküle durch Amplifikation des Signals. Ein Beispiel dafür ist bDNA-Verfahren (Pachl et al., 1994), bei dem die nachzuweisende Nukleinsäure über Hybridisierung mit einem Oligonukleotid an eine feste Matrix gekoppelt wird, über eine weitere Hybridisierung mit einem zweiten Oligonukleotid an eine verzweigte DNA, die wiederum mit einer Vielzahl von mit einem signalgebenden Enzym gekoppelten Oli- gonukleotiden hybridisiert. Durch die Verzweigung der DNA ist das Anheften einer großen Menge signalgebender Enzymeinheiten pro vorhandenem Targetmolekül möglich.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Probenmaterial einem für T1 spezifischen Antikörper oder Fragmenten eines solchen ausgesetzt. Geeignete Antikörperfragmente sind z.B. Fab- und F(ab)2- Fragmente. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können beispielsweise direkt mit dem Gewebeschnitt inkubiert werden oder aber einem Immuntest ausgesetzt werden, bei dem Proteinextrakt z.B. an Mikrotiterplatten fixiert wird, auf einer Gelmatrix aufgetrennt oder auf andere Weise dem Antikörper zugänglich gemacht und mit diesem in Kontakt gebracht wird. Bei den Antikörpern kann es sich um monoklonale oder polyklonale Antikörper handeln, es können z.B. Maus-, Kaninchen- oder Ratten-Antikörper sein. Die Antikörper sollten spezifisch mit dem T1 -Protein bzw. ausgewählten Epitopen dieses Proteines reagieren. In einer Ausführungsform wird das Verfahren mit Antikörpern durchgeführt, die für das p9-Peptid oder das p16-Peptid aus Maus-T1 (Werenskiold, 1992) spezifisch sind. Das p9-Peptid stammt aus einem Bereich, der eine vollständige Immunglo- bulin-ähnliche Halbdomäne des Proteins überspannt. Das p16-Peptid entspricht dem carboxyterminalen Teil des Proteins und enthält keine mit dem lgC2-Motiv der Immunglobulinsuperfamilie verwandte Sequenz. Die Antikörper können gegen das p9- oder p16-Peptid aus der Maus oder korrespondierenden Peptiden anderer Säugetiere gerichtet sein, solange sie mit dem entsprechenden T1- Protein menschlicher Herkunft kreuzreagieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper gegen antigene Determinanten des menschlichen, löslichen T1 -Protein gerichtet. Zur Minimierung der Gefahr einer Kreuzreaktion mit vollständigem Membran-gebundenen Rezeptor empfiehlt es sich, ein Peptid zu wählen, das im T1 -Rezeptor nicht vorhanden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper gegen ein Peptid gerichtet, das die Sequenz p-SKEC umfaßt. Der für dieses Peptid kodierende Bereich liegt zwischen den Exons 8 und 9 und wird nur für das lösliche Protein (T1-S), nicht aber für den Rezeptor (T1-M) exprimiert.
Erfindungsgemäß wird weiter ein Kit zur Verfügung gestellt, der zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Der Kit enthält T1- spezifische Antikörper oder Fragmente davon sowie gegebenenfalls Mittel, den Antikörper oder seine Fragmente nachzuweisen. Bei diesen Mitteln kann es sich beispielsweise um enzymkonjugierte anti-lg-Antikörper handeln, die spezifisch an die jeweils verwendeten anti-T1 -Antikörper binden. Der Nachweis dieser Antikörper kann mit üblichen Methoden, die bereits oben diskutiert worden sind, erfolgen. Die dafür erforderlichen Mittel, z.B. Enzymsubstrat, können im Kit ebenfalls zur Verfügung gestellt werden. Der Kit kann weiterhin so aufgebaut sein, daß die zum Nachweis geeigneten Antikörper bzw. Antikörperfragmente an eine feste Phase gekoppelt vorliegen. Die feste Phase kann z.B. die Form von Mikro- partikeln, z.B. Glas-, Polyacrylamid- oder Sephadexkugeln haben, oder aus Mi- krotiterplatten bestehen. Andere Möglichkeiten der Fixierung der Antikörper an eine feste Matrix sind ebenfalls eingeschlossen.
Bei dem im erfindungsgemäßen Kit vorgesehenen Antikörper bzw. Fragmenten davon kann es sich um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper handeln. Dieser wird auf dem Fachmann bekannte Weise durch Immunisieren mit dem jeweils gewünschten Antigen, z.B. dem p9- oder p16-Peptid, hergestellt. Ausreichende Mengen dieser Peptide können durch rekombinante Expression in eukaryontischen Systemen, z.B. im Vacciniavirussystem (Werenskiold, 1992), oder in prokaryontischen Wirten, z.B. in E. coli, B. subtilis oder Streptomyceten, zur Verfügung gestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform werden statt natürlicher oder rekombinant exprimierter Proteine synthetisch hergestellte Peptide zum Immunisieren verwendet. Besonders bevorzugt sind dabei Peptide, die die Sequenz p-SEKC umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der zum Nachweis von T1 -spezifischen Nukleinsäuren, bevorzugt T1 -spezifischer mRNA geeignet ist. Der Kit enthält mindestens ein Oligonukleotid, das zur T1-mRNA komplementär ist, daher mit dieser hybridisieren kann und gegebenenfalls als Primer für die reverse Transkription und/oder die Polymerasekettenreaktion dienen kann. Kits, die letztlich der Durchführung einer PCR dienen sollen, können weiterhin ein oder mehrere weitere Oligonukleotide enthalten, die dem sense- Strang der T1-mRNA entsprechen und in Kombination mit dem ersten Oligonukleotid die Amplifikation der T1-mRNA erlauben.
Ein erfindungsgemäßer Kit zum Nachweis der T1 -mRNA kann darüber hinaus die zur reversen Transkription und/oder zur Amplifikation notwendigen Enzyme, z.B. reverse Transkriptase, DNA-Polymerase, RNAse H, T7-Polymerase und/oder Mittel zum Nachweis der amplifizierten Produkte enthalten. Die Amplifi- kations-Produkte können beispielsweise durch eingebaute modifizierte Nukleotide nachgewiesen werden, z.B. digoxigenierte oder biotinylierte Nukleotide, oder aber durch Hybridisierung eines markierten oder markierbaren Oligonukleotids, das zur T1-mRNA oder ihrem komplementären Strang komplementär ist, nachgewiesen werden. Eine weitere Möglichkeit des Nachweises liegt in der Verwendung modifizierter Primer, die beispielsweise an ihrem 5'-Ende mit einem Antigen verbunden sind, das von einem enzymgebundenen Antikörper erkannt wird. In der Literatur finden sich ungezählte Beispiele solcher Nachweisverfahren, die dem Fachmann vertraut sind und die Ausgestaltung des Kits im einzelnen bestimmen. Wie bereits erwähnt, ist die Nukleotidsequenz des T1 -Genes und damit der kodierenden Bereiche der T1-mRNA bekannt. In Kenntnis der Sequenz kann der Fachmann ohne weiteres geeignete Primer aussuchen. Bevorzugte Ausführungsformen sehen die Verwendung eines Oligonukleotids mit der Sequenz 5'- CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3' als erstem Oligonukleotid und die eines Oligonukleotids mit der Sequenz 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3' als weiterem Oligonukleotid vor. In bevorzugten Ausführungsformen ist mindestens eines der Oligonukleotide an seinem 5'-Ende mit einem Antigen oder einem zur Signalgebung fähigen Enzym konjugiert.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von T1 -spezifischen Antikörpern oder Fragmenten solcher Antikörper zum Nachweisen der Gegenwart von T1- Protein in Gewebeproben, Blut- oder Serumproben eines Patienten mit Mammakarzinom. Der Nachweis des T1-Proteines kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von T1- spezifischen Oligonukleotiden zum Nachweisen von T1-mRNA in Probenmaterial aus Patienten mit Mammakarzinom. Bei dem verwendeten Oligonukleotid kann es sich um sense- oder anti-sense-Oligonukleotide handeln.
Die Abbildungen und die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 : Nachweis humaner T1-mRNA-Spezies in kultivierten Zellen und in Primärgewebe. Gesamt-RNA (10μg, Spuren 1 , 3, 5) oder Poly(A)+-RNA (1 μg, Spuren 2, 4) aus etablierten Keratinozyten der Haut (Ha-Cat, Spuren 1 , 2) und Mastzellen (HMC-1 , Spuren 3, 4) sowie aus reifer Plazenta (5) wurden mit einem 1 %igen Agarosegel fraktioniert, auf eine Nylonmembran transferiert und mit T1 - spezifischen Proben hybridisiert. A: Hybridisierungsprobe aus dem ORF (Positionen 45-602 der cDNA-Sequenz nach Tominaga, 1992); detektiert werden 3 mRNA-Spezies mit Größen von 5 kb, 2,7 kb und 2 kb.
B: Hybridisierungsprobe aus dem 3'-untranslatierten Bereich (Position 990-1310 der cDNA-Sequenz nach Tominaga, 1992); detektiert spezifisch die 2,7 kb-T1- mRNA (sowie unspezifisch 28 S rRNA in Gesamt-RNA-Proben). Die Position der ribosomalen RNA (28 S und 18 S) ist links angegeben.
C: Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis der 2,7 kb-T1-mRNA. T1 -positive Gesamt-RNA aus Planzenta wurde in T1 -negativer Gesamt-RNA der Zellinie U2OS seriell verdünnt und die RNA-Gemische wurden revers transkribiert. Al- quots der cDNA, die jeweils 25 ng RNA-Gemisch/Test entsprechen, wurden mittels PCR analysiert (siehe Material und Methoden: 25 ng für T1-PCR, 1 μl daraus für Aktin-PCR). Die Menge von Plazenta-RNA (in ng) pro 25 ng Gesamt- RNA ist über den Spuren angegeben. (Null: Reaktion nur mit T1 -negativer RNA; Minus: Negativkontrolle, d.h. PCR ohne cDNA-Matrize). Je 10 μl der Reaktionsprodukte wurden in einem 2% TBE (Trisborat/EDTA-Puffer) Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt.
Abbildung 2: Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis von 2,7 kb T1-mRNA in Gesamt-RNA aus Mammakarzinomen. Durchführung siehe Material und Methoden. Es wurden je 10 μl der Reaktionsprodukte auf Agarosegelen aufgetrennt und Ethidiumbromid angefärbt.
Quantitative Auswertung: Densitometrische Bestimmung der Etidiumbromidin- tensität der spezifischen Amplifikate der Aktin- und T1-mRNA. Die beobachtete T1-mRNA-Expression wurde wie folgt bewertet:
Signalstärke T1 : Aktin < 0, 1 : T1 -negativ, Klasse I
Signalstärke T1 : Aktin = 0,1 bis 1 : T1 -positiv, Klasse II
Signalstärke T1 : Aktin > 1 : T1 -positiv, Klasse III Abbildung 3: Metastasierung in Nodal-negativen Patientinnen. Die Wahrscheinlichkeit für ein rezidivfreies Überleben wurde für das Kollektiv von 16 Nodal-negativen Patientinnen aus Beispiel 4 ermittelt. Aufgetragen ist die Anzahl überlebender Patientinnen in Abhängigkeit von der Zeit und unterteilt nach Patientinnen, deren Mammakarzinom-Zellen T1 -negativ (n = 8, 0 Rezidive) bzw. T1 -positiv (n = 8, 5 Rezidive) waren.
Abbildung 4: Nachweis von T1 -Protein in Mammakarzinomen. Die Immunfärbung wurde wie in Beispiel 5 angegeben durchgeführt.
A) Duktales Karzinom; B) Duktolobuläres Karzinom.
T1 -spezifische Signale (dunkle Färbung) können nur in Tumorzellen, nicht aber in umgebenden Stroma beobachtet werden.
Abbildung 5: Prognostische Bedeutung des T1-S-RNA-Spiegels für den Krankheitsverlauf von Patientinnen mit Nodal-negativem Mammakarzinom. Der T1- RNA-Spiegel wurde für ein Kollektiv von 55 Fällen ermittelt (Beispiele 6, 10). Aufgetragen ist die Wahrscheinlichkeit für ein rezidivfreies Überleben in einem Nachbeobachtungszeitraum von 5 Jahren. Der Kranheitsverlauf von Patientinnen, deren Mammakarzinom einen niedrigen T1-RNA-Spiegel (n = 21 , 7 Rezidive) bzw. einen hohen T1-RNA-Spiegel (n = 34, 3 Rezidive) zeigte, wurde getrennt aufgetragen.
Beispiele
Material und Methoden
1. RNA-Präparation
1.1 Für die Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem Tumorgewebe wurde das Gewebe zunächst unter flüssigem Stickstoff in einem RNAse- freien Mörser pulverisiert. Zu je 100 mg pulverisierten Gemisches wurde 1 ml Gua SCN-Lösung (4 M Guanidiniumisothiocyanat, 25 mM Natriumeitrat pH 7,0, 0,5 % Natriumlauroylsarcosinat, 0,1 M ß-Mercaptoethanol) pipet- tiert. Die Suspension wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (ERG) überführt. Zu dieser Suspension wurden nacheinander 90 μl 2 M NaAcetat pH 4,0 (1/10 Vol.), 900 μl wäßriges Phenol und 180 μl Chloroform/Isoamyl- alkohol (49:1 ; v:v) zupipettiert, wobei nach jedem Schritt sorgfältig gemischt wurde. Anschließend wurde 15 min auf Eis und 10 min bei RT inkubiert und danach 10 min mit 10000 x g zentrifugiert.
Die wäßrige Phase wurde vorsichtig abgehoben und in ein neues ERG transferiert. Die RNA wurde mit 900 μl Isopropanol (1 Vol.) bei -20°C gefällt (> 1 Std.).
Reinigung:
Sobald die RNA gefällt vorlag, wurde auf RNAse-freies Arbeiten geachtet (RNA-Lösung wurde stets auf Eis gekühlt, es wurde nur frisch autoklavier- tes Wasser verwendet; das Tragen von Handschuhen war obligatorisch).
Zur Reinigung der RNA wurde eine zusätzliche Ethanolfällung durchgeführt: Die Isopropanol-gefällte RNA wurde abzentrifugiert (4°C; 10000 g; 10 min) und mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 300 μl H2Obidest vollständig gelöst und danach mit 1/10 Vol. Na-Acetat (s.o.) und 900 μl (3 Vol.) eiskaltem Ethanol(absoiut) versetzt. Die RNA wurde erneut bei - 20°C über Nacht gefällt. Nach Zentrifugation bei 4°C (20 min; 10000 x g) wurde das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20-50 μl H2Obidest aufgenommen. Die RNA wurde entweder bei -70°C oder in Ethanol bei -20°C aufbewahrt.
1.2 Poly(A)+-RNA wurde unter Verwendung von Poly(A)-Quicksäulen (Strata- gene, Heidelberg, DE) angereichert oder durch Chromatographie auf Oli- go(dT)-Zellulose isoliert, wie beschrieben in Maniatis, T., et al., 1982, Mo- lecular Cloning: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor, N.Y.
2. Northern Blots
Zum Durchführen von Northern Blots wurden zunächst 5 μg RNA glyoxyliert und auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt, (McMaster et al., 1977). Die Gele wurden vor dem Transfer auf Biodyne-Membranen (Pall Ultrafine Filtration Co., Glen Cove N.Y.) mit Akridinorange gefärbt. Die RNA wurde anschließend durch einstündiges Backen bei 80°C an der Membran fixiert.
RNA-Blots wurden mindestens 3 Stunden in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 10 mM Tris-Hydrochlorid pH 7,5, 2 x SSC (20 x SSC: 3 M NaCI + 0,3 M Natriumeitrat), 5 x Denhardt's Lösung (50 x Denhardt's Lösung: 1 % Fi- coll, 1 % Polyvinylpyrrolidon, 1 % Rinderserumalbumin), 1 % Natriumdodecyl- sulfat und 0,1 mg denaturierte DNA pro ml) vorinkubiert. Anschließend wurden sie in frischem Puffer, enthaltend 0,5 x 106 bis 2 x 106 cpm radiomarkierter Sonde pro ml 15 Stunden bis 3 Tage bei 45°C in einem rollenden Ofen (Bachhofer) hybridisiert. Die Filter wurden gründlich in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS bei 65°C gewaschen und autoradiographiert.
3. PCR-Reaktion
3.1 Qualitative PCR
Für die Durchführung der PCR-Reaktion wurde 1 μg Gesamt-RNA 5 Minuten bei 95°C denaturiert, in 20 μl RT-PCR-Puffer (50 mM KCI, 20 mM Tris, 2,5 mM MgCI2, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, jeweils 1 mM dATP, dCTP, dGTP und TTP pH 8,4, 0,5 Einheiten RNasin, 0,09 OD26o-Einheiten Random- Primer (BRL, Eggenstein, DE) aufgenommen und mit 200 Einheiten Molo- ney-Maus-Leukämievirus (MMLV) Reverser Transkriptase (BRL) versetzt. Die Reaktionsansätze wurden 10 Minuten bei 20°C und anschließend 45 Minuten bei 42°C inkubiert und die Reaktion dann durch 5 Minuten Erwärmen auf 95°C beendet. Für die Amplifikation wurden die cyclischen Reaktionen in einem Thermalcycler (TC1 , Perkin Eimer, Überlingen, DE) durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 1 Minute Denaturieren bei 94°C, 1 Minute Hybridisieren bei 55°C und 3 Minuten Polymerisation bei 72°C. Es wurden 30 Amplifi- kationszyklen durchgeführt. Im letzten Zyklus wurde die Polymerisation um 10 Minuten verlängert.
In jedem Amplifikationstest wurde ein 10 μl Aliquot des Reversen-Trans- kriptionscocktails verwendet. Die Aliquots wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl in RT-PCR-Puffer inkubiert, der 10 pmol jedes der beiden spezifischen Primer, und 1 Einheit DNA-Polymerase (AmpliTaqu, Perkin Eimer) enthielt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Proben mit Chloroform extrahiert und die Reaktionsprodukte nach Auftrennung der Aliquots der Reaktion auf 2%igen Agarosegelen beobachtet.
3.2 Semiquantitative PCR (für Beispiele 1 und 2)
Für die semiquantitative PCR-Analyse werden parallele Ansätze mit verschiedenen cDNA-Verdünnungen (entsprechend 500 ng/125 ng/31 ng Gesamt-RNA) für die T1 -PCR-Reaktion (50 μl) eingesetzt. Aus dem fertig pipet- tierten, aber noch nicht amplifizierten Reaktionsgemisch werden 2 μl entnommen und in einem separaten 50 μl Ansatz zusammen mit 10 pm Aktin- primer unter den gleichen Bedingungen, wie für die qualitative PCR beschrieben, amplifiziert. Die für die Amplifikationsreaktion verwendeten Primer flankierten ein 322 bp-Fragment des T1-S3ΗTR (T13'seq und T13'rev) oder ein 650 bp-Fragment der für humanes Aktin kodierenden Sequenz (Acseq und Acrev). Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
T13'seq: CTTTGATCACCTGAACTTTCTCTAGCA T13'rev: AGTTTTCGGTTGGTGCATTTC Acseq: GGTCACCCACACTGTGCCCATCTA Acrev: GCATTGCGGTGGACGATGGAGGG Für die Auswertung werden gleiche Mengen der amplifizierten T1 -Ansätze und der Aktinreaktionen auf 2 %igen Agarosegelen elektrophoretisiert. Das Verhältnis der Bandenstärken der T1- bzw. Aktin-spezifischen Banden wird densitometrisch bestimmt.
3.3 Semiquantitative RT-PCR (für Beispiel 6)
Die reverse Transkription und die PCR-Analyse wurden im wesentlichen durchgeführt, wie in 3.2 beschrieben, jedoch wurde ein PTC 100 Thermocycler (Biozym, Oberldorf, FRG) verwendet. Die Ansätze wurden 30 Amplifikationszy- klen unterworfen, wobei jeder Zyklus 30 Sekunden bei 92°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C umfaßte.
Es wurden die in 3.2 beschriebenen Primer verwendet. Für die semiquantitative Analyse wurden reverse Transkripte von 25 bis 250 ng RNA als Matrize für die PCR-Amplifikation von T1-S in einem Endvolumen von 25 μl verwendet. 1 μl der vollständig zusammenpipettierten T1-PCR-Ansätze diente als Matrize für die Amplifikation von Aktin in einem separaten Röhrchen in einem Endvolumen von 25 μl. Die entsprechende T1-S- und aktinspezifische PCR-Reaktionen wurden gleichzeitig amplifiziert. 10 μl der Reaktionsprodukte wurden gemischt und in 1 ,5%igen Agarosegelen (70 min, 4 V-CM) aufgetrennt. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid angefärbt und die Ethidiumbromidfluoreszenz unter Verwendung eines Gelprint 2000 i Videodokumentationssystems (MWG Biotech, Ebersberg, FRG) aufgezeichnet. Die Signalintensität wurde unter Verwendung der integrierten 1 D Scan Software quantifiziert. Die T1-S-mRNA-Expressionsspiegel wurden nach Normalisierung der T1 -S-spezifischen Signale anhand der aktinspezifi- schen Signale der entsprechenden PCR-Reaktion berechnet. Proben ohne Zusatz einer RNA-Matrize in allen reversen Transkriptionsreaktionen und PCR Ansätzen wurden als negative Kontrolle eingesetzt. Plazenta-RNA wurde als ein externer Standard für die reverse Transkription und PCR-Amplifikation verwen- det und führte zu einem T1-RNA-Spiegel von 1 ,8 + 0,1. In jedem PCR-Lauf wurden Verdünnungsreihen der cDNA analysiert. Die aus verschiedenen Verdünnungen berechneten T1 -Spiegel unterschieden sich normalerweise um weniger als 10%. Die mittleren T1 -Spiegel für die individuellen Tumor-RNA-Proben wurden aus mindestens 2 unabhängigen PCR-Läufen (mit mindestens 2 Verdünnungen der cDNA) für jede der beiden unabhängigen reversen Transkriptionsreaktionen berechnet. Die quantitative Auflösung des Verfahrens wird hier in einem Verdünnungsexperiment demonstriert: T1 -positive Plazenta-RNA wurde in einer Verdünnungsreihe im Verhältnis von 1 :3 mit T1 -negativen RNA aus BeWo- Chorionkarzinomzellen verdünnt. 25 ng jeder RNA-Mischung wurden als Matrize für RT-PCR verwendet. Die Ansätze, die eine abnehmende Menge von Plazenta- RNA enthielten (25 bis 0,8 ng), führten zu abnehmenden Mengen des T1- spezifischen Amplifikationsproduktes in Gegenwart einer konstanten Menge ak- tinspezifischer Produkte in allen Reaktionen. Das Auftragen des T1 -mRNA- Spiegels gegen die Menge T1 -positiver Plazenta-RNA-Matrize in jeder Reaktion zeigt eine lineare Korrelation über einen Bereich von 0,8 bis 8,3 ng Matrize. In Gegenwart von 25 ng Plazenta-RNA im RT-PCR-Test überstieg die T1 -Amplifikation den linearen Bereich des Testes.
4. In situ-Hvbridisierung
4.1 Immunhistochemische Methode für Beispiel 2
Gefrierschnitte gefrorenen Tumorgewebes von 7 bis 9 μm Dicke wurden bei - 20°C geschnitten, auf Silan-beschichtete Objektträger übertragen und in 4% Paraformaldehyd (PAF) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 1 ,4 mM Kali- umdihydrogenphosphat, pH 7,3) 30 Minuten fixiert. Fixierte Schnitte wurden bei 43°C getrocknet. Vor der Hybridisierung wurden die Schnitte 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBS rehydriert, mit Proteinase K (2 μg/ml in 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) 5 bis 10 Minuten bei 37°C behandelt und 5 Minuten in 4% PAF in PBS bei Raumtemperatur refixiert. Anschließend wurden die Proben 3 x 3 Minuten in PBS gewaschen und 10 Minuten unter tropfenweisem Zusatz von 0,25% Essigsäureanhydrid in 100 mM Triäthanolamin inkubiert. Die Schnitte wurden mindestens 1 Stunde bei 37°C in 50% Formamid, 2 x SSC (0,3 M NaCI, 30 mM Natriumeitrat, pH 7) vorhybridisiert. Anschließend wurden jedem Gefrierschnitt 20 μl Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 2 x SSC, 10% Dextransulfat, 0,1 % SDS, 250 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, pH 7), enthaltend 1 x 106 cpm 35S-markierte RNA-Sonde, zugefügt und die Hybridisierung 16 bis 18 Stunden bei 42°C in einer feuchten Kammer durchgeführt. Die Schnitte wurden 3 x für 20 Minuten in 4 x SSC bei 42°C gewaschen, mit RNAse A (20 μg/ml in 0,5 M NaCI, 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) 30 Minuten bei 37°C behandelt, 1 x mit 2 x SSC und 1 x mit 1 x SSC 30 Minuten bei 42°C gewaschen, in Ethanol dehydriert und luftgetrocknet. Die trockenen Objektträger wurden in Kodak NTB-2 Fotoemulsion (Tecnomara, Fernwald) getaucht, 1 bis 3 Wochen exponiert, dann entwickelt (Kodak D19) und fixiert (Unifix, Kodak). Schließlich wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, dehydriert, in Eukitt (Kindler, Freiburg, DE) eingebettet und unter Verwendung eines Zeiss Axioskops mit Hell- und Dunkelfeldeinrichtung angesehen.
4.2 Immunhistochemische Methode für Beispiele 7 und 8
Das polyklonale Serum, das gegen ein synthetisches Peptid erzeugt worden ist, das der C-terminalen Sequenz von Maus-T1-S entspricht, ist bereits beschrieben worden (Rössler, 1995b). Gereinigtes IgG wurde bei einer Konzentration von 7 μg/ml verwendet. Der monoklonale Antikörper M144 wurde in Ratten gegen rekombinates humanes T1-S-Fc aus COS-Zellen erzeugt, die Arbeitskonzentration betrug 16 μg/ml. Die immunhistochemischen Untersuchungen wurden an formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitten unter Verwendung des ABC-Vektorperoxidase-Färbungskits (Camon, Wiesbaden, FRG) durchgeführt. Die Spezifität der T1 -Färbung wurde durch Prä- adsorption mit einem 25-fachen molaren Überschuß gereinigten Antigens vor der Immunfärbung unter Verwendung von irrelevanten Kontrollantikörpern bestätigt. In diesen Reaktionen wurden keine Signale erhalten. Außerdem reagierten beide T1 -spezifischen Antiseren mit T1-mRNA-positiven, aber nicht mit T1 -mRNA-negativen kultivierten Zellen unter den Versuchsbedingungen, die für die Anfärbung der Tumorschnitte verwendet worden sind.
Die immunhistochemische T1 -Reaktivität wurde mittels einer Modifikation des in Remmele und Stegler, 1987, beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von zwei Multiplikatoren bestimmt: Die T1 -Färbungsintensität wurde als nicht vorhanden (0), niedrig (1 ), mittel (2) oder hoch (3) klassifiziert. Die Klassifizierung des Prozentsatzes T1 -reaktiver Tumorzellen wurde mit den folgenden Cut-off-Grenzen durchgeführt: > 80% (4), > 50% (3), > 20% (2), < 20% (1), 0% (0). Der T1 -Proteinspiegel wurde als Produkt beider Variablen erhalten und überspannte einen Bereich von 0 bis 12.
5. Statistische Methoden
Univariate Analysen wurden mittels Fisher's T-Test bzw. Chi-Quadrat-Test durchgeführt.
Beispiel 1
Expression von T1-mRNA in Humanzellen und -gewebe
Die T1 -mRNA-Expression wurde in Gesamt-RNA und Poly(A)+-angereicherter RNA analysiert, die aus kontinuierlichen Keratinozyten (Ha-Cat) und reifer Plazenta isoliert worden waren. Die Northern Blot-Hybridisierung mit Sonden, die den 5'-Teil des offenen Leserasters der T1-cDNA enthalten, zeigte 3 Transkripte von 2 kb, 2,7 kb und 5 kb (Abbildung 1A). Die Größe der letztgenannten 2 Transkripte stimmt gut mit Ergebnissen überein, die in Mäusezellen erhalten worden sind, in denen eine T1-mRNA von 5 kb den Transmembranrezeptor T1- M und eine T1-mRNA von 2,7 kb das tumorassoziierte lösliche T1 -Protein kodiert. Die Hybridisierung mit einem Fragment des 3'-nicht-translatierten Bereiches (Positionen 45-602 der cDNA-Sequenz nach Tominaga, 1992) der humanen T1-cDNA bestätigte die Identität der humanen 2,7 kb mRNA mit der das ausgeschiedene T1 -Protein kodierenden Spezies (Abbildung 1 B).
Für einen empfindlicheren Nachweis von T1-mRNA in Tumoren wurde ein semiquantitativer RT-PCR-Test etabliert. Für die ausgeschiedene tumorassoziierte T1 -Variante spezifische PCR-Primer wurden so ausgewählt, daß sie zur Erzeugung eines 322 bp-Fragmentes im 3'-nicht-translatierten Bereich führten. Als interne Kontrolle wurden Aktinsequenzen koamplifiziert. Nach RT-PCR von RNA- Präparationen, die sich in Northem-Blot-Hybridisierungen als positiv erwiesen hatten, wurden Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe erhalten. Die quantitative Auflösung des Verfahren wurde in einem Verdünnungsexperiment demonstriert. Es wurde eine Verdünnungsreihe von T1 -positiver Plazenta-RNA in T1 -negativer RNA gleicher Konzentration angelegt und mittel RT-PCR analysiert. Wie in Abbildung 1 C gezeigt ist, wurde eine lineare Abnahme des T1- spezifischen Amplifikationsproduktes in Reaktionen beobachtet, die 25 bis 1 ,5 ng Plazenta-RNA enthielten. Aufgrund der Gegenwart ansteigender Mengen T1- negativer RNA in diesem Test wurden konstante Mengen Aktin-spezifischer Produkte in allen Reaktionen erhalten.
Beispiel 2
T1-mRNA-Expression in Mammakarzinomen
Es wurde die Gesamt-RNA aus frisch eingefrorenem Gewebe von 41 Patienten mit invasivem Mammakarzinom und 6 Patienten mit Mastopathie isoliert; als positives Kontrollgewebe wurde Plazenta verwendet. Die Expression der 2,7 kb T1 -mRNA wurde mittels des oben beschriebenen semiquantitativen RT-PCR untersucht. Für die quantitative Bewertung der T1 -Expression wurden die coamplifizierten Aktinsequenzen aus der gleichen Probe als interner Standard verwendet (siehe Abb. 2).
In allen 6 Proben von Mastopathiepatienten wurde keine T1-mRNA oder nur vernachlässigbar geringe Mengen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigten die T1-mRNA-Spiegel in aus Tumorgewebe gewonnener RNA eine hohe Variabilität. Die quantitative Auswertung erfolgte densitometrisch (siehe Legende zu Abb. 2). Für die weitere Analyse wurde ein Klassifikationsschema mit 3 Kategorien verwendet. Die T1-mRNA-Spiegel wurden wie folgt bewertet:
(I): T1 -negativ: T1 -Amplifikationsprodukt nicht nachweisbar oder nur sehr schwach sichtbar (T1 : Aktin < 0,1 );
(II): T1 -positiv: mittlere T1-mRNA-Werte, eindeutig nachweisbar, aber schwächer als das Aktinsignal (T1 : Aktin = 0,1 bis 1 );
(III): T1 -positiv: hohe T1 -mRNA-Werte, Signal gleich stark oder stärker als das Aktinsignal (T1 : Aktin > 1 ).
Beispiele für das Bewertungsmuster sind in Abbildung 2 gezeigt. Bei Anwendung dieses Schemas umfaßte die Klasse I alle 6 Mastopathie-Proben und 34% der Tumore (N = 13). 49% der Tumore (N = 21 ) wurden als II bewertet und 17% der Tumore (N = 7) zeigten hohe T1-mRNA-Spiegel (III) (siehe Tabelle 2). Beispiel 3
Korrelation der T1 -Expression mit bekannten Prognosekriterien 3.1 T1 -Expression und histologischer Typ
Bei den 40 untersuchten Karzinomen handelte es sich um 12 lobuläre Karzinome, 7 duktolobuläre und 21 duktale Karzinome. Bei diesen Tumoren wurde folgende T1 -Expression festgestellt:
TABELLE 2
3.2 T1 -Expression und Tumorgrading
Die T1 -Expression zeigte keine Korrelation mit dem Tumorgrading.
3.3 T1 -Expression und Tumorgröße
T1 -Expression und Tumorgröße korrelierten wie folgt:
TABELLE 3
3.4 T1 -Expression und Nodalstatus
Zwischen T1 -Expression und Nodalstatus wurden folgende Zusammenhänge beobachtet:
TABELLE 4
Beispiel 4
Prognostische Signifikanz der T1-mRNA-Expression
4.1 Prognostische Signifikanz für alle Patienten
Von 32 beobachteten Patienten überlebten den Beobachtungszeitraum von 47 Monaten 24 Patienten (75%). Innerhalb dieses Zeitraums traten Karzinome in 16 der beobachteten Patienten wieder auf (50%). Bei einer univariaten Analyse aller Patienten erlaubte die T1 -Messung keine Vorhersage über Rezidiv oder Überleben. Die klassischen Prognosefaktoren Lymphknotenstatus und Tumorgröße waren dagegen von hohem prognostischem Wert.
4.2 Prognostische Signifikanz der T1-mRNA-Expression in axilliär Nodal- negativen Patienten
Die Nodal-negative Gruppe umfaßte 18 Patienten, von denen 7 (39%) ein erneutes Karzinom entwickelten. In der Nodal-negativen Patientengruppe war der Grad der T1 -Expression ein starker prognostischer Indikator für ein Wiederauftreten der Erkrankung, vergleichbar dem bekannten Ki67-Marker, während sich die Tumorgröße als prognostisch wertlos erwies. Keiner der 8 Nodal-negativen, T1 -positiven Patienten entwickelte während des Beobachtungszeitraums eine erneut auftretende Erkrankung. In 2 zusätzlichen Patienten dieser Gruppe wurden bereits zum Zeitpunkt der Operation Knochenmetastasen diagnostiziert, beide überlebten während des Beobachtungszeitraums. Im Gegensatz dazu entwickelten 5 von 8 Nodal-negativen, T1 -negativen Patienten (62,5%) ein erneutes Karzinom und 2 (25%) starben innerhalb des Beobachtungszeitraums (siehe Abbildung 3).
4.3 Prognostische Signifikanz der T1-mRNA-Expression in axilliär Nodal- positiven Patienten
Die Nodal-positive Patientengruppe umfaßte 14 Patienten, von denen 9 ein Karzinomrezidiv entwickelten. Von diesen waren nur 4 T1 -negativ. In einem Patienten wurden zum Zeitpunkt der Operation Metastasen diagnostiziert. Die 3 Nodal- negativen Patienten ohne Metastasen blieben karzinomfrei. Von den 10 Nodal- positiven, T1 -positiven Patienten entwickelten 8 (80%) ein erneutes Karzinom und 6 (60%) verstarben innerhalb des Beobachtungszeitraums.
Beispiel 5
Immunhistochemische Analyse von Mammakarzinomproben
5 μm dicke Gewebeschnitte von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettetem Gewebe wurden deparaffiniert und mit einem polyklonalen Antiserum gegen die carboxyterminale Sequenz von T1-S (Rössler, 1995a) inkubiert (8,5 μg IgG/ml). Die T1 -spezifische Immunreaktion wurde mittels eines sekundären biotinylierten anti-Kaninchen-Antikörpers, eines Avidinperoxidasekomplexes und Diamino- benzidinfärbung nachgewiesen (Immunostaining Kit: Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories via SERVA, Heidelberg, FRG). T1 -spezifische Färbung: braun, Gegenfärbung mit Hämatoxylin: blau. Die Analyse belegt die Anwesenheit von T1 -Protein in den Tumorzellen, nicht aber im umgebenden Stroma (Abbildung 4). Die Ergebnisse der immunhistochemischen Analyse entsprechen daher denen der in situ-Hybridisierung mit T1 -spezifischen Sonden.
Beispiel 6
T1-S-mRNA-Spiegel und Progression des Krankheitsverlaufs von axilliär Nodal- negativen Patienten
In einer späteren Studie wurde der Spiegel tumorassoziierter T1 -S-mRNA in Gewebe von 55 Patienten mit primärem invasivem Nodal-negativen Brustkrebs und 6 Fällen von FCD (fibrozystische Dysplasie ohne Atypien; eine benigne, fi- brotische Veränderung der Brust) analysiert. Alle Patienten wurden zwischen 1989 und 1993 im Krankenhaus der technischen Universität München mastek- tomiert und für die Untersuchung ausgewählt, weil von ihnen frisch eingefrorenes Gewebe und klinikopathologische Daten zur Verfügung standen. Die klinischen Daten der Patienten sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.
TABELLE 5
Klinische Daten des Patientenkollektivs:
* zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung
Die T1-S-mRNA-Spiegel im Brustgewebe wurden in der Gesamt-RNA unter Verwendung des oben beschriebenen empfindlichen semiquantitativen RT-PCR- Tests bestimmt (siehe Material und Methoden, 3.3), mit dem der 3' nicht-transla- tierte Bereich der T1-S-mRNA nachgewiesen wird. Normalisierte T1 -RNA- Spiegel wurden aus den tumorassoziierten T1-S-mRNA-Spiegeln berechnet und als niedrig (T1 -Spiegel < 0, 1 ) oder hoch (T1 -Spiegel > 0, 1 ) klassifiziert. Die 6 FCD-Fälle und 21 der 55 Brustkrebsfälle (38%) zeigten einen niedrigen T1 -RNA- Spiegel. Von den 34 (62%) Tumoren mit hohem T1 -RNA-Spiegel wiesen 26 (47%) mittlere Spiegel auf (T1-RNA-Spiegel < 0,5), während 8 (15%) Tumoren hohe Spiegel (T1-RNA-Spiegel > 0,5) T1-S-mRNA enthielten.
Die Korrelation des T1-RNA-Spiegels mit verschiedenen klinikopathologischen Parametern wurde in einer univariaten Analyse untersucht; die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Der T1-RNA-Spiegel zeigte keinen Zusammenhang mit dem Patientenalter, dem histologischen Tumortyp, der Tumorgröße oder der Expression von Östrogen- und/oder Progesteronrezeptoren. Der T1 - RNA-Spiegel war jedoch signifikant assoziiert mit der Tumordifferenzierung (p=0,022): 25 von 34 (70%) der Tumore mit hohem T1 -RNA-Spiegel, aber nur 9 von 21 (43%) der Tumore mit niedrigem T1 -RNA-Spiegel waren gut oder mäßig differenziert (G1 , G2). Weiterhin war der T1 -RNA-Spiegel signifikant mit dem erkrankungsfreien Überleben der Patienten innerhalb eines mittleren Beobachtungszeitraums von 5 Jahren (37 bis 93 Monate) assoziiert: 10 von 55 Patienten (18%) entwickelten wiederum eine Erkrankung. Es traten Rezidive in 7 von 21 (33%) Tumoren mit niedrigem T1 -RNA-Spiegel, aber nur in 3 von 34 (9%) Tumoren mit hohem T1 -RNA-Spiegel auf. 91 % der Fälle mit hohem T1 -RNA-Spiegel blieben krankheitsfrei. Diese Gruppe mit einer ausgezeichneten Prognose umfaßte alle 8 Patienten mit dem höchsten T1 -RNA-Spiegel (> 0,5). Infolge der niedrigen Anzahl an Patienten war diese Feststellung statistisch nicht signifikant. Das Risiko für ein späteres Wiederauftreten der Krankheit war in Tumoren mit hohem T1 -RNA-Spiegel 3,7-fach geringer im Vergleich mit Tumoren mit niedrigem T1 -RNA-Spiegel (p=0,022). Kaplan-Meyer-Kurven für das erkrankungsfreie Überleben der Patienten mit hohem versus niedrigem tumorassoziierten T1- RNA-Spiegel zeigten einen signifikanten Unterschied innerhalb eines 17 Monate währenden Beobachtungszeitraums (Abb. 5).
Beispiel 7
Immunhistologischer Nachweis von T1 -Protein in Brustkrebsgewebe
Für 31 der in Beispiel 6 mittels RT-PCR analysierten Brustkarzinome stand for- malinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe für die immunhistochemische Analyse der T1 -Expression zur Verfügung. Bei den hierbei zur Bestimmung des Ortes der T1 -Proteinsynthese und der Ablagerung in Tumorgewebe verwendeten Antiseren handelte es sich (1 ) um einen monoklonalen Antikörper, der gegen humanes rekombinates T1-S-Protein erzeugt worden war, und (2) ein polyklona- les Antiserum, das spezifisch mit murinem T1-S-, aber nicht mit T1-M-Protein reagiert (Anti-c-Peptid; Rössler et al., 1995a). Die immunhistochemischen Versuche wurden mit beiden Antikörpern durchgeführt; beide Antikörper führten zu ähnlichen Ergebnissen.
Gewebeschnitte von normalem Brustgewebe und FCD-Gewebe zeigte eine leichte T1 -Reaktivität in den duktalen epithelialen Zellen. Von den 31 analysierten primären Brustkarzinomen wiesen 30 eine T1 -Reaktivität in den Tumorzellen, wenn auch in sehr unterschiedlichem Ausmaß, auf. Die Intensität der T1 -Reaktivität unterschied sich drastisch zwischen individuellen Zellen innerhalb eines Tumorzell-Clusters und in der Fraktion der T1 -reaktiven Tumorzellen in Gewebe aus unterschiedlichen Patienten (10% bis > 90%). In duktalen Karzinomen wie- sen Tumorzellen, die in festen oder tubulären Bezirken wuchsen, sehr häufig eine höhere T1 -Reaktivität auf als disseminierte, einzelne Tumorzellen. 6 von 10 Tumoren, die ein hohes Maß an T1 -Reaktivität in den Tumorzellen zeigten, zeigten auch eine signifikante T1 -Reaktivität im Stroma. Alle 5 lobulären und 2 medulläre Karzinome zeigten eine niedrige bis mittlere T1 -Reaktivität der Tumorzellen. Ein Tumor zeigte keinerlei immunhistochemisch nachweisbare T1- Reaktivität, während er mit anderen Antiseren, z.B. zum Nachweis von Östrogen- und Progesteronrezeptoren, reagierte.
Beispiel 8
Immunhistochemische Bestimmung des T1 -Proteinspiegels
Die immunhistochemische T1 -Reaktivität wurde mittels einer Modifikation des Protokolls von Remmele und Stegener, 1987, bestimmt, wobei die Fraktion der T1 -reaktiven Tumorzellen und ihre Färbungsintensität als Parameter dienten (siehe Material und Methoden, 4.2). Die resultierende Klassifizierung (T1- Proteinspiegel) überspannt einen Bereich von 0 (keine T1 -Reaktivität) bis 12 (hohe T1 -Reaktivität in > 80% der Tumorzellen).
11 der 21 Karzinome mit niedrigem T1 -RNA-Spiegel wurden immunhistochemisch untersucht und zeigten eine niedrige T1 -Reaktivität mit einem mittleren T1 -Proteinspiegel von 2,9 (Bereich: 0 bis 6). Von den 34 Tumoren mit hohem T1- RNA-Spiegel wurden 20 immunhistochemisch untersucht. 19 von 20 zeigten eine T1 -Reaktivität mit einem mittleren T1 -Proteinspiegel von 7,6 (Bereich: 2 bis 12). Ein Tumor wies keinerlei immunhistochemisch nachweisbare T1 -Reaktivität auf (T1-RNA-Spiegel = 0,21 ).
Beispiel 9
Vergleich der Ergebnisse aus RT-PCR und immunhistochemischer Untersuchung Bei der in Beispiel 6 beschriebenen Untersuchung beruhte die Analyse der Expression der tumorassoziierten T1-S-Spiegel auf dem empfindlichen Nachweis von T1-S-mRNA mittels RT-PCR. Es wurde erwartet, daß die T1-S-mRNA- Spiegel die T1 -S-Proteinsynthese reflektieren, da die ausführliche Untersuchung von Maus-T1 keinerlei Hinweis auf posttranskriptionale Regulation der T1- Genexpression gab. Diese Annahme bestätigte sich beim Vergleich der mit RT- PCR und nach immunhistochemischem Nachweis von T1 -Protein erhaltenen Ergebnisse für 31 Tumore. Nur zwei der Tumore führten zu inkonsistenten Ergebnissen beim Vergleich der beiden Methoden, die auf einen posttranskriptionalen oder translationalen Regulationsmechanismus hinweisen könnten: Ein Tumor zeigte hohe T1-S-mRNA-Spiegel, aber keine T1 -Reaktivität. Eine mögliche Erklärung für diese Diskrepanz wäre ein Block der T1 -Translation. Der andere Tumor zeigte niedrige T1-S-mRNA-Spiegel und eine hohe zelluläre T1 -Reaktivität. Diese Diskrepanz könnte entweder auf einer gesteigerten Translationsaktivität oder einer intrazellulären Akkumulation des T1 -Genproduktes in Folge eines Sekretionsdefektes der Zellen beruhen.
Die Konsistenz der T1 -Expressionsspiegel nach Bestimmung mit zwei unabhängigen Verfahren bestätigt die Anwendbarkeit des hierin verwendeten Ansatzes.
Beispiel 10
Prognostischer Wert der T1-RNA-Bestimmung in Nodal-negativen Patienten
Die klassischen prognostischen Faktoren Tumorgröße und Hormonrezeptorstatus waren in der Gruppe Nodal-negativer Patienten, die gemäß den Beispielen 6 bis 9 untersucht worden sind und die durch einen hohen Anteil kleiner (< 3 cm) und schlecht differenzierter (G3) Tumoren mit einem positiven Status für Östro- gen- und Progesteronrezeptoren gekennzeichnet waren, nicht von prognostischem Wert. Der einzige andere Faktor, der für die Prognose der Patienten Signifikanz hat, ist das Tumor-"Grading" (p=0,001 ), das den besten prognostischen Indikator für dieses Kollektiv darstellte. 9 von 10 Rezidiven traten in den 21 schlecht differenzierten (G3) Tumoren auf (43%). Obwohl angesichts der begrenzten Anzahl von Patienten eine multivariate Analyse nicht durchgeführt worden ist, weisen die Daten der Erfinder darauf hin, daß der T1 -RNA-Spiegel ein weiterer nützlicher Marker zur Identifizierung von Patienten mit G3-Tumoren ist, die ein erhöhtes Risiko für Rezidive haben. Um diesen Effekt zu demonstrieren, wurden Patienten mit G3-Tumoren zunächst entsprechend ihrem T1 -RNA-Spiegel eingeteilt. Die resultierende Gruppe von 12 G3-Fällen mit niedrigem T1- RNA-Spiegel hatte ein drastisch erhöhtes Risiko für ein erneutes Auftreten der Erkrankung (6 Rezidive, 50 %) im Vergleich mit den 9 G3-Fällen mit hohem T1 - RNA-Spiegel (2 Rezidive, 22%). Eine statistisch signifikante Auftrennung (p=0,029) dieser G3-Untergruppen wurde mit dem korrigierten T1 -Spiegel erhalten: bei 7 von 12 G3-Fällen mit niedrigem T1 -Spiegel (58%), aber nur bei einem von 9 Fällen mit hohem T1 -Spiegel (11 %) wurde innerhalb des Beobachtungszeitraums ein erneutes Karzinom beobachtet.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß der T1 -Spiegel, entweder allein oder in Kombination mit dem Tumor-Grading, einen vielversprechenden neuen prognostischen Indikator darstellt, um Patienten mit Nodal-negativem Brustkrebs zu identifizieren, die ein stark erhöhtes Risiko für ein erneutes Auftreten der Erkrankung haben. Die frühe Identifizierung und eine selektive begleitende Therapie dieser Hochrisikopatienten kann eine vielversprechende Strategie zur Verbesserung der individuellen Prognose darstellen. Gegenwärtige Bemühungen konzentrieren sich auf die Etablierung vereinfachter Verfahren für die Bewertung der tumorassoziierten T1-S-Expression. Wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt worden ist, ist die Immunhistochemie an formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe eine erfolgversprechende Alternative zur RNA-Analyse. Gegenwärtig wird die prognostische Signifikanz von immunhistochemisch nachgewiesenen tumorassoziierten T1 in einem größeren Patientenkollektiv untersucht. Literaturliste
Allred, D.C., et.al., 1992, Human Pathol. 23, 974-979.
Archer, S.G., et.al., 1995, Br. J. Cancer. 72, 1259-1266.
Auer, G., et.al., 1994, Cancer Res. 44, 394-396.
Barnes, D.M., et.al., 1993, Human Pathol. 24, 469-476.
Danescu, J., und Werenskiold, A.K. 1995, FEBS Lett. 367, 89-92.
Domagala, W„ et.al., 1990, Am. J. Pathol. 137, 1059-1064.
Gayle, J. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 , 5784-5789.
Graff, J.R., et.al., 1995, Cancer Res. 55, 5195-5199.
Hoskins, K., und Weber, B.L., 1995, Curr. Opin. Oncol. 7, 495-499.
Jaenicke, F., et.al., 1993, Breast Cancer Res. Treatment. 24, 195-208.
Kievits, T., et al., 1991 , J. Virol. Methods 35, 273-286.
Klemenz, R., et.al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 5708-5712.
Lipponen, P., et.al., 1993, Int. J. Cancer. 55, 51-56.
Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, N.Y.
McMaster et al., 1977, G.K., und G.G. Carmichael, PNAS 74, 4835-4838, 1977.
Pachl, C, et al., 1994, J. AIDS ?, ?
Rasbridge, S. A., et.al., 1993, J. Pathol. 169, 245-250. Remmele und Stegener, 1987, Frauenarzt 2, 41-43.
Rößler, U., et.al., 1993, Oncogene 8, 609-617.
Rößler, U., et.al., 1995a, Dev. Biol. 168, 86-97.
Rößler, U., et.al., 1995b, E. J. Pathol. 1 , file 952-03.
Rupp, B., et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Com. 216, 595-601.
Schmitt, M., Graff, H., and Kindermann, G. (1994) Elsevier, Amsterdam.
Sommers, C.L., et.al., 1992, Cancer Res. 52, 5190-5197.
Thomassen, E., et.al., Cell Growth Differ. 6, 178-184.
Thompson, E.W., et.al., 1991 , J. Cell. Physiol. 150, 534-544.
Tominaga, S., et al., 1992, Biochem. Biophys. Acta 1171 , 215-218.
Walker, G.T., et al., 1996, Nucleic Acids Research 24, 348-353.
Werenskiold, A.K., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 1041-1047.
Werenskiold, A.K., et.al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9, 5207-5214.
Wilhelm, O., et.al., In: Prospects in diagnosis and treatment of breast cancer. Elsevier, Excerpta Medica, 145-156.
Yuan, J., et.al., 1992, Br. J. Cancer 65, 461-465.

Claims

Patentansprüche
1. In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms, umfassend das qualitative oder quantitative Bestimmen von T1 -Protein und/oder T1-mRNA in aus dem Patienten gewonnenem Probenmaterial.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß T1 -Protein und/oder T1-mRNA einer Tumorgewebeprobe des Patienten bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß T1 -Protein in einer Blut- oder Serumprobe bestimmt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß T1-mRNA mit einem auf PCR beruhenden Verfahren bestimmt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenmaterial einem für T1 spezifischen Antikörper oder Fragmenten davon ausgesetzt wird und T1 -Protein qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen das p9-Peptid gerichtet ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen das p16-Peptid gerichtet ist.
9. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 8 geeignet ist und einen T1 -spezifischen Antikörper oder Fragmente enthält.
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der T1 -spezifische Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
11. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der T1 -spezifische Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
12. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der T1 -spezifische Antikörper gegen das p9-Protein gerichtet ist.
13. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der T1 -spezifische Antikörper gegen das p16-Protein gerichtet ist.
14. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 geeignet ist und mindestens ein Oligonukleotid enthält, das zur T1-mRNA komplementär ist, sowie gegebenenfalls ein oder mehrere weitere Oligonukleotide, die die Amplifikation von T1 -spezifischer mRNA und/oder eines dazu komplementären Stranges erlauben.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin RNAse H und reverse Transkriptase enthält.
16. Kit nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das zur T1-mRNA komplementäre Oligonukleotid die Sequenz 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3' aufweist.
17. Kit nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das weitere Oligonukleotid die Sequenz 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC- 3' als weiterem Oligonukleotid vor. In bevorzugten Ausführungsformen aufweist.
18. Verwendung eines T1 -spezifischen Antikörpers oder von Fragmenten davon zum Nachweisen der Gegenwart von T1 -Protein in Gewebeproben, Blut- oder Serumproben eines Patienten mit Mammakarzinom.
19. Verwendung eines T1 -spezifischen Oligonukleotids zum Nachweisen von T1-mRNA in Gewebeproben, Blut- oder Serumproben eines Patienten mit Mammakarzinom.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das T1- spezifische Oligonukleotid zur T1-mRNA komplementär ist.
21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des T1 -spezifischen Oligonukleotids einem Teil der Sequenz der T1-mRNA entspricht.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die T1-mRNA ganz oder teilweise amplifiziert wird.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6356782B1 (en) 1998-12-24 2002-03-12 Vivant Medical, Inc. Subcutaneous cavity marking device and method
US6371904B1 (en) 1998-12-24 2002-04-16 Vivant Medical, Inc. Subcutaneous cavity marking device and method
US9669113B1 (en) 1998-12-24 2017-06-06 Devicor Medical Products, Inc. Device and method for safe location and marking of a biopsy cavity
AU2001218871A1 (en) * 2000-03-21 2001-10-03 Takao Arai Monoclonal antibody and method and kit for the immunoassay of soluble human st2 with the use of the same
DK3072978T3 (en) 2002-05-09 2018-09-17 Brigham & Womens Hospital Inc : 1L1RL-1 AS A CARDIOVASCULAR DISEASE MARKER
DE10337368A1 (de) * 2003-08-08 2005-03-03 Technische Universität Dresden Verfahren und Mittel zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren
FR2886946B1 (fr) * 2005-06-09 2007-08-10 Biomerieux Sa Procede pour le diagnoctic/pronostic du cancer du sein
DK2848938T3 (da) 2006-04-24 2017-11-13 Critical Care Diagnostics Inc Evaluering af effektiviteten af en behandling hos et individ baseret på st2- niveauer
PT2021796E (pt) 2006-05-01 2012-04-19 Critical Care Diagnostics Inc Diagnóstico de doença cardiovascular
JP5526122B2 (ja) 2008-04-18 2014-06-18 クリティカル ケア ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 主要有害心イベントのリスクを予測する方法
US8810522B2 (en) * 2008-09-29 2014-08-19 Smart Technologies Ulc Method for selecting and manipulating a graphical object in an interactive input system, and interactive input system executing the method
US20100083109A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Smart Technologies Ulc Method for handling interactions with multiple users of an interactive input system, and interactive input system executing the method
US20100079409A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Smart Technologies Ulc Touch panel for an interactive input system, and interactive input system incorporating the touch panel
WO2011003171A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Smart Technologies Ulc Three-dimensional widget manipulation on a multi-touch panel
CN102597935A (zh) * 2009-09-01 2012-07-18 智能技术无限责任公司 具有提高的信噪比(snr)的交互输入系统和图像捕获方法
US8502789B2 (en) * 2010-01-11 2013-08-06 Smart Technologies Ulc Method for handling user input in an interactive input system, and interactive input system executing the method
CN106620692B (zh) 2010-04-09 2021-04-09 重症监护诊断股份有限公司 可溶性人st-2抗体和分析法
AR091069A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas contra el receptor st2

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9843090A3 *

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Publication number Publication date
WO1998043090A2 (de) 1998-10-01
CA2284790A1 (en) 1998-10-01
WO1998043090A3 (de) 1999-11-11
US6399748B1 (en) 2002-06-04
DE19711932A1 (de) 1998-09-24

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KAPITANOVIČ et al. LS kkk SkkkkkkS including the HER-2/neu gene (also called c-erb H-2), represent a family of normal cellular genes involved in cell growth and differentiarion. There
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