EP0973883A2 - Reinigung von dna in einer durchflusszentrifuge - Google Patents

Reinigung von dna in einer durchflusszentrifuge

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EP0973883A2
EP0973883A2 EP98901955A EP98901955A EP0973883A2 EP 0973883 A2 EP0973883 A2 EP 0973883A2 EP 98901955 A EP98901955 A EP 98901955A EP 98901955 A EP98901955 A EP 98901955A EP 0973883 A2 EP0973883 A2 EP 0973883A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
extrachromosomal dna
dna
centrifuge
flow
extrachromosomal
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98901955A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Kuhne
Friedrich Popp
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Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Priority to EP98901955A priority Critical patent/EP0973883A2/de
Publication of EP0973883A2 publication Critical patent/EP0973883A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
    • B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
    • B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2221/00—Applications of separation devices
    • B01D2221/10—Separation devices for use in medical, pharmaceutical or laboratory applications, e.g. separating amalgam from dental treatment residues

Definitions

  • the present invention relates to a method for the purification of extrachromosomal DNA using a flow-through centrifuge.
  • Plasmid DNA is generally expressed in cells, e.g. B. amplified in gram-negative bacteria, especially in E. coli. The cells are then disrupted and the plasmid DNA isolated therefrom. The isolated plasmid DNA can then be used for molecular biological or medical applications, e.g. B. for the construction of cloning vectors, for the transformation of prokaryotic and for the transfection of eukaryotic cells.
  • Various methods are known for disrupting the cells and for obtaining the plasmid DNA (see J. Sambrook et al., 5 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • WO92 / 12780 describes a technical design of a flow-through centrifuge and its use for the separation of macromolecule mixtures.
  • Four standard proteins, for example, are separated in an aqueous 2-phase system at a maximum of 1000 rpm in accordance with the respective distribution coefficients of the proteins. Due to the different elution times, the components of the mixture are obtained separately.
  • the present invention relates to a method for the purification of extrachromosomal DNA, which is characterized in that an extrachromosomal DNA and liquid containing further cell components is passed under conditions through a flow-through centrifuge which lead to the separation of the extrachromosomal DNA from insoluble cell components and the purified extrachromosomal DNA is obtained.
  • flow centrifuges have so far been used exclusively for cell separation. It has now surprisingly been found that flow centrifuges can also be used to purify extrachromosomal DNA in large quantities without the extrachromosomal DNA being damaged by the shear forces that occur. Also surprising was the fact that the chromosomal DNA present in the suspension of the disrupted cells is not fragmented during the flow centrifugation and can thus be separated quantitatively from the extrachromosomal DNA.
  • the extrachromosomal DNA which is purified by the method according to the invention, can be linear or circular, single or double-stranded.
  • the DNA is preferably a circular and double-stranded plasmid DNA.
  • the cell containing extrachromosomal DNA can be a prokaryotic or eukaryotic cell, preferably it is a bacterial cell, in particular a gram-negative cell, such as an E. coli cell. If necessary, cells can be used which contain so-called artificial chromosomes as extrachromosomal DNA.
  • Artificial chromosomes are linear double-stranded DNA molecules that are generally called YAC (yeast artificial chromosome) and are amplified in yeast cells.
  • the liquid containing extrachromosomal DNA used in the method according to the invention is preferably a cell lysate.
  • the cell lysate is particularly preferably produced by alkaline lysis of cells containing extrachromosomal DNA and subsequent acidification. But it can also other common cell bursting methods are used, such as combinations of enzyme (lysozyme) and heat treatment.
  • Any amount of cellular biomass can be used as the starting material for the method according to the invention.
  • a biomass of 100 g to 50 kg is preferably lysed per batch.
  • the liquid containing extrachromosomal DNA is generally introduced into the flow-through centrifuge by gradient or / and pumping.
  • a flow-through centrifuge with a volume adapted to the lysis approach is used in the method according to the invention.
  • a volume of at least 0.1 to 50 1, particularly preferably of 0.2 to 4 1, is preferably used.
  • the centrifuge container is preferably cylindrical.
  • the flow-through centrifuge is operated at a suitable g number, preferably at 10,000 to 40,000 x g. Examples of commercially available flow centrifuges are "CEPA" high-speed centrifuges or high-performance centrifuges from Carr (USA), which currently have a capacity of up to 9,000 l / h.
  • the process according to the invention is generally carried out continuously.
  • the suspension of the lysed biomass is introduced into the flow-through centrifuge from below.
  • the rotation of the centrifuge tube (10,000 - 40,000 x g) separates solid components such as cell wall components and genomic DNA adhering to them from the wall of the centrifuge tube.
  • the purified solution containing extrachromosomal DNA generally emerges from the top of the flow-through centrifuge, although it is also conceivable for the solution containing extrachomosomal DNA to escape laterally, downward or elsewhere.
  • the flow-through centrifuge can be operated at different temperatures, preferably at 4 ° C carried out to room temperature.
  • extrachromosomal DNA of different sizes can be purified, preferably extrachromosomal DNA with a size of 1 kbp to 200 kbp is purified.
  • the extrachromosomal DNA is preferably linear, circular or supercoiled plasmid DNA.
  • the extrachromosomal DNA can be further purified. For example, in order to remove RNA from the solution, an RNase treatment is carried out. Furthermore, chromatographic purification steps, such as, for example, anion exchange chromatography, affinity chromatography or hydroxylapatite chromatography, can also be carried out.
  • suitable materials for anion exchange chromatography are organic or inorganic polymers and copolymers, such as, for example, polymethacrylate (Macroprep-Biorad, Germany), polystyrene-divinylbenzene (Poros-Perseptive, HyperD-Biosepra, Source-Pharmacia) or silica gel, positive on the surface thereof invited groups z. B.
  • Diethylaminoethyl (DEAE) or dimethylaminoethyl (DMAE) - groups are bound.
  • a particularly preferred material for anion exchange chromatography is Q-Sepharose.
  • a particularly preferred material for affinity chromatography is hydroxylapatite.
  • the DNA solution obtained can be subjected to cross-flow filtration for further purification, concentration and / or buffering.
  • cross-flow filtration extensive removal of endotoxins from the DNA preparation can also be achieved.
  • the DNA solution is guided tangentially past one or more semipermeable membranes, the exclusion size of which is chosen such that the DNA molecules are retained by the membranes and substances with a lower molecular weight can pass through the membranes, an endotoxin-free DNA Solution is obtained.
  • the extrachromosomal DNA obtained by the process according to the invention is essentially undamaged and has essentially no single or double strand breaks.
  • a plasmid DNA purified according to the invention after gel electrophoretic separation shows only one dominant band which corresponds to the "covalently closed circle” conformation. Furthermore, in addition to the bands corresponding to the "Open Circle” and “Linearized Circle” conformations, there are no other bands.
  • the DNA obtained by the method according to the invention can easily be used for conventional molecular biological and medical applications, such as for cloning, for transformation, for transfection, for microinjection into cells, for use in methods of gene therapy, DNA vaccination and / or for polymerase.
  • Chain reaction (PCR) can be used.
  • the present invention relates to the use of a flow-through centrifuge for the purification of extrachromosomal DNA.
  • a CEPA laboratory centrifuge LE (open design) with a clarification cylinder made of stainless steel (1.4571, V4A) is used in the test carried out. About 2,000 g of biomass are digested using the alkali lysis method (modified method according to Birnboim & Bolybo Birnboim & Doly, Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523).
  • the viscous suspension is pumped through the inlet opening into the flow-through centrifuge.
  • the centrifuge is operated with a g-number of 10,000-18,000 x g. As soon as escaping liquid becomes cloudy, the precipitate has to be removed from the cylinder and centrifugation has to be continued after inserting the cleaned cylinder.
  • the clear plasmid DNA solution freed from the cellular impurities emerges from the top of the flow-through centrifuge and is collected in a vessel.
  • chromatography is carried out on Q-Sepharose and hydroxylapatite.
  • the decanted centrifuge supernatant is adjusted to 49 - 50 mS / cm conductivity and to 5 + 4 ° by adding TE buffer (10 mmol / 1 Tris-HCl, 1 mmol / 1 EDTA pH 8.5 ⁇ 0.2) C cooled. All chromatography is carried out at this temperature. The centrifugation supernatant is drawn onto the equilibrated column. The column is then washed with about 8 SV 10 mmol / 1 Tris-HCl, 1 mmol / 1 EDTA, 0.65 mol / 1 NaCl pH 8.5 + 0.2.
  • a gradient (5 SV buffer A (10 mmol / 1 Tris-HCl, 1 mmol / 1 EDTA, 0.65 mmol / 1 NaCl pH 8.0 ⁇ 2), 5 SV buffer B (10 mmol / 1 Tris-HCl, 1 mmol / 1 EDTA, 0.85 mol / 1 NaCl pH 8.0 + 0.2)) and the eluate is fractionated, the detection takes place at 254 nm.
  • the prepeak (impurities) becomes the main peak (Plasmid DNA) separated by collecting the main peak from the rising flank in a separate vessel.
  • Equilibration buffer 0.1 mol / 1 potassium phosphate, 6 mol / 1 urea pH 7.0, 0 ⁇ 0.2.
  • Wash buffer 1 0.15 mol / 1 potassium phosphate, 6 mol / 1 urea pH 7.0 ⁇ 0.2.
  • Wash buffer 2 0.02 mol / 1 potassium phosphate buffer pH 7.0 ⁇ 0.2.
  • Elution buffer 0.5 mol / 1 potassium phosphate pH 7.0 + 0.2.
  • Detection takes place at 254 nm with a UV detector / recorder unit.
  • a 1% product solution (plasmid DNA), measured with a calibrated photometer, is used as the calibration solution.
  • the Q-Sepharose pool is brought to a final concentration of 1.1 mmol / 1 calcium chloride and drawn onto the equilibrated column.
  • the peak is collected and concentrated to approximately 50 ml with cross-flow filtration.
  • the CFF is operated with a retentate flow rate of 100-200 l / h «m 2 , a transmembrane pressure of approx. 0.8 bar and an overflow pressure of approx. 1.2 bar carried out.
  • the retentate is then fluidly diafiltered against TE buffer (10 mmol / 1 Tris / HCl, 1 mmol / 1 EDTA, pH 8.0) until the values for pH and conductivity of the retentate and TE buffer match. After the diafiltration process has ended, the retentate is adjusted to a plasmid DNA concentration of 1 mg / ml by dilution with diafiltration buffer.
  • the intactness of the plasmid DNA obtained is checked by agarose gel electrophoresis.
  • an aliquot of the plasmid DNA in various concentrations is applied to an agarose gel.
  • the agarose gel shown shows lanes 1 and 10 of DNA length standard No. II (fragment sizes: 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp) and lanes 2 and 9 of DNA length standard III (fragment sizes : 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3530, 4268, 4973, 5148, 21226 bp).
  • Lane 3 shows pBR322 (4162 bp) as a reference plasmid, which was purified using the conventional cesium chloride gradient method.
  • plasmid DNA purified by this method essentially contains plasmid DNA which corresponds to the conformation "covalently closed circle” (dominant "supercoiled band”).
  • plasmid DNA pCMV-CAT
  • This plasmid DNA had been further purified following the process according to the invention via Q-Sepharose and hydroxylapatite chromatography, as well as cross-flow filtration.
  • Lane 1 DNA length standard II (Boehringer Mannheim GmbH, cat.no.236250)
  • Lane 2 DNA length standard III (Boehringer Mannheim GmbH, cat.no.528552)
  • Lane 3 pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Cat.No. 481238)
  • Lane 9 DNA length standard III (Boehringer Mannheim GmbH, cat.no.528552) Lane 10 DNA length standard II (Boehringer Mannheim GmbH, cat.no.236250)
  • the plasmid DNA purified according to the invention essentially shows a dominant band. This shows that the plasmid DNA obtained according to the invention is not damaged and remains in its original conformation. In addition, the lack of additional bands in the agarose gel shows that the chromosomal DNA contained in the digested cell suspension is not fragmented during the continuous centrifugation, but can be completely separated from the plasmid DNA as a precipitated macromolecule.

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Abstract

In der Erfindung wird zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA eine extrachromosomale DNA und weitere Zellbestandteile enthaltende Flüssigkeit unter Bedingungen durch eine Durchflußzentrifuge geleitet, was zur Abtrennung der extrachromosomalen DNA von den übrigen Zellbestandteilen führt und man gewinnt die gereinigte extrachromosomale DNA. Im weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der gereinigten extrachromosomalen DNA zum Klonieren, zur Transformation, zur Transfektion, zur Mikroinjektion in Zellen, zur Verwendung bei Verfahren der Gentherapie, der DNA-Vakzinierung oder/und zur Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), sowie die Verwendung einer Durchflußzentrifuge zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA.

Description

Reinigung von DNA in einer Durchflußzentrifuge
Beschreibung
5
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreini- gung von extrachromosomaler DNA unter Verwendung einer Durchflußzentrifuge .
0 Die Gewinnung von Nucleinsäuren insbesondere von Plasmid-DNA, hat in der Molekularbiologie und in der modernen Medizin eine große Bedeutung. Als Plasmid-DNA werden extrachromosomale DNA- Duplex-Moleküle bezeichnet, die üblicherweise eine Größe von 1 bis mehr als 200 kb aufweisen und in Wirtszellen in einer bis 5 mehreren Hundert von Kopien vorliegen. Plasmid-DNA wird im allgemeinen in Zellen, z. B. in gram-negativen Bakterien, insbesondere in E.coli amplifiziert . Anschließend werden die Zellen aufgeschlossen und die Plasmid-DNA daraus isoliert. Die isolierte Plasmid-DNA kann dann für molekularbiologische oder o medizinische Anwendungen, z. B. zur Konstruktion von Klonie- rungsvektoren, zur Transformation von prokaryontisehen und zur Transfektion von eukaryontisehen Zellen, eingesetzt werden. Zum Aufschluß der Zellen und zur Gewinnung der Plasmid-DNA sind verschiedene Methoden bekannt (siehe J. Sambrook et al . , 5 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) .
Bei einem von Birnboim & Doly entwickelten Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Zellen (Birnboim & Doly, Nucl . 0 Acid Res. 7 (1979) 1513-1523) wird die Biomasse mit einer NaOH/Detergenzlösung lysiert und anschließend der pH-Wert mit K-Acetat auf ca. 5,0 eingestellt. Dabei entsteht ein Niederschlag, der überwiegend genomische DNA und Zellwandfragmente enthält. Zur Abtrennung dieser Verunreinigungen wird die Sus- 5 pension in Zentrifugenbecher überführt. Der Niederschlag wird dann mittels einer Becherzentrifuge abzentrifugiert , um den Überstand mit der Plasmid-DNA zu erhalten. Auch bei Fermentationsprozessen ist die Verwendung von Zentrifugen gebräuchlich, um beispielsweise Fermenterüberstände von Zellen und Zellfragmenten zu trennen. Hierzu werden üblicherweise Siebzentrifugen und Festwandzentrifugen verwendet (siehe Gerhartz W., Enzymes in industry: production and app- lications, 1990, VCH, Weinheim, Deutschland, Kap. 3.2.1).
Mit gebräuchlichen Laborzentrifugen ist das bearbeitbare Volumen durch das Volumen des Rotors bzw. der Rotorbecher auf unter zehn Liter begrenzt (z. B. Sorvall-Zentrifuge, GSA-Ro- tor, 6 x 250 ml) . Somit kann dieses Verfahren nur zur Gewinnung von Plasmid-DNA in geringen Mengen eingesetzt werden. Eine Übertragung des Verfahrens auf großtechnische Prozesse bereitet aufgrund des begrenzten Zentrifugenvolumens erheb- liehe Probleme.
Große Volumina können mittels Durchflusszentrifugen verarbeitet werden. WO92/12780 beschreibt eine technische Ausgestaltung einer Durchflußzentrifuge und ihre Verwendung zur Auf- trennung von Makromolekülgemischen. Die Trennung von bespiels- weise vier Standardproteinen erfolgt dabei in einem wässrigen 2 -Phasensystem bei maximal 1000 Upm entsprechend den jeweiligen Verteilungskoeffizienten der Proteine. Aufgrund der zeitlich verschiedenen Elution werden die Bestandteile des Gemi- sches getrennt voneinander erhalten.
Durch die immer größere Verbreitung von molekularbiologischen Methoden steigt jedoch der Bedarf nach gereinigter Plasmid-DNA für analytische und therapeutische Anwendungen in der For- schung und Medizin. Eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe war es deshalb, ein Verfahren bereitzustellen, das eine effiziente und schnelle Reinigung von Plasmid- DNA in großen Mengen ermöglicht.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine extrachromosomale DNA und weitere Zellbestandteile enthaltende Flüssigkeit unter Bedingungen durch eine Durchflußzentrifuge geleitet wird, die zur Abtrennung der extrachromosomalen DNA von unlöslichen Zell- bestandteilen führen und die gereinigte extrachromosomale DNA gewonnen wird.
Im Stand der Technik wurden Durchflußzentrifugen bisher ausschließlich zur Zellabtrennung verwendet. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß Durchflußzentrifugen auch dazu verwendet werden können, extrachromosomale DNA in großen Mengen aufzureinigen, ohne daß die extrachromosomale DNA durch die auftretenden Scherkräfte geschädigt wird. Überraschend war ebenfalls die Tatsache, daß die in der Suspension der aufgeschlossenen Zellen anwesende chromosomale DNA während der Durchflußzentrifugation nicht fragmentiert wird und damit quantitativ von der extrachromosomalen DNA abgetrennt werden kann.
Die extrachromosomale DNA, die durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgereinigt wird, kann linear oder zirkulär, ein- zel- oder doppelsträngig sein. Vorzugsweise ist die DNA eine zirkuläre und doppelsträngige Plasmid-DNA. Die extrachromosomale DNA enthaltende Zelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, vorzugsweise ist sie eine Bakte- rienzelle, insbesondere eine gram-negative Zelle, wie etwa eine E. coli-Zelle . Gegebenenfalls können Zellen verwendet werden, in denen als extrachromosomale DNA sogenannte artifi- zielle Chromosomen enthalten sind. Artifizielle Chromosomen sind lineare doppelsträngige DNA-Moleküle, die im allgemeinen als YAC (yeast artificial chromosome) bezeichnet werden und in Hefezellen amplifiziert werden.
Die in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte, extrachromosomale DNA enthaltende Flüssigkeit, ist vorzugsweise ein Zell-Lysat. Besonders bevorzugt wird das Zell-Lysat durch alkalische Lyse von extrachromosomale DNA enthaltenden Zellen und anschließendes Ansäuern hergestellt. Es können aber auch andere gebräuchliche Zellaufschußmethoden verwendet werden, wie beispielsweise die Kombinationen von Enzym- (Lysozym) und Hitzebehandlung.
Es kann jede beliebige Menge an zellulärer Biomasse als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Vorzugsweise wird pro Ansatz eine Biomasse von 100 g bis 50 kg lysiert.
Die extrachromosomale DNA enthaltende Flüssigkeit wird im allgemeinen durch Gefälle oder/und Pumpen in die Durchflußzentrifuge eingeleitet. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Durchflußzentrifuge mit einem dem Lyse-Ansatz angepaßten Volumen eingesetzt. Vorzugsweise wird ein Volumen von minde- stens 0,1 bis 50 1, besonders bevorzugt von 0,2 bis 4 1 verwendet. Der Zentrifugenbehälter ist vorzugsweise zylinderför- mig ausgebildet. Die Durchflußzentrifuge wird bei einer geeigneten g-Zahl, vorzugsweise bei 10.000 bis 40.000 x g betrieben. Beispiele für kommerziell erhältliche Durchflußzen- trifugen sind "CEPA" -Schnellzentrifugen oder Hochleistungszen- trifungen der Fa. Carr (USA) , die momentan eine Kapazität von bis zu 9.000 1/h aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen kontinuier- lieh durchgeführt. Die Suspension der lysierten Biomasse wird von unten in die Durchflußzentrifuge eingeleitet. Durch die Rotation des Zentrifugengefäßes (10.000 - 40.000 x g) scheiden sich feste Bestandteile wie etwa Zellwandbestandteile und an ihr haftende genomische DNA an der Wand des Zentrifugengefäßes ab. Die gereinigte extrachromosomale DNA enthaltende Lösung tritt im allgemeinen nach oben aus der Durchflußzentrifuge aus, wobei jedoch auch ein Austreten der extrachomosomale DNA enthaltenden Lösung seitlich, nach unten oder an anderer Stelle denkbar ist.
Die Durchflußzentrifuge kann mit unterschiedlichen Temperaturen betrieben werden, vorzugsweise wird das Verfahren bei 4° C bis Raumtemperatur durchgeführt.
In dem vorliegenden Verfahren kann extrachromosomale DNA unterschiedlicher Größe aufgereinigt werden, vorzugsweise wird extrachromosomale DNA mit einer Größe von 1 kbp bis 200 kbp aufgereinigt. Die extrachromosomale DNA ist vorzugsweise lineare, zirkuläre oder supercoiled Plasmid-DNA.
Nach dem Verlassen der Zentrifuge kann die extrachromosomale DNA weiter aufgereinigt werden. So wird, um RNA aus der Lösung zu entfernen, gegebenenfalls eine RNase-Behandlung durchgeführt. Weiterhin können auch chromatographische Reinigungsschritte, wie beispielsweise Anionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hydroxylapatitchromatographie durchgeführt werden. Beispiele geeigneter Materialien für die Anionenaustauschchromatographie sind organische oder anorganische Polymere und Copolymere, wie etwa Polymethacrylat (Ma- kroprep-Biorad, Deutschland) , Polystyrol -Divinylbenzol (Poros- Perseptive, HyperD-Biosepra, Source-Pharmacia) oder Silicagel , an deren Oberfläche positiv geladene Gruppen z. B. Diethylami- noethyl (DEAE) oder Dimethylaminoethyl (DMAE) - Gruppen gebunden sind. Ein besonders bevorzugtes Material für die Anionen- austauschchromatographie ist Q-Sepharose. Ein besonders bevorzugtes Material für die Affinitätschromatographie ist Hydrox- ylapatit.
Darüber hinaus kann die erhaltene DNA-Lösung zur weiteren Reinigung, Konzentrierung oder/und Umpufferung einer Cross-Flow- Filtration ausgesetzt werden. Bei dieser Cross-Flow-Filtration kann auch eine weitgehende Entfernung von Endotoxinen aus der DNA-Präparation erreicht werden. Dazu wird die DNA-Lösung tangential an einer oder mehreren semipermeablen Membranen vorbeigeleitet, deren Ausschlußgröße so gewählt wird, daß die DNA-Moleküle von den Membranen zurückgehalten werden und Sub- stanzen mit einem geringeren Molekulargewicht durch die Membranen durchtreten können, wobei eine endotoxinfreie DNA-Lösung erhalten wird. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene extrachromosomale DNA ist im wesentlichen unbeschädigt und weist im wesentlichen keine Einzel- oder Doppel -Strangbrüche auf. Insbesondere zeigt eine erfindungsgemäß aufgereinigte Plasmid-DNA nach gelelektrophoretischer Auftrennung nur eine dominante Bande, die der Konformation "Covalently Closed Circle" entspricht. Des weiteren sind neben den Konformationen "Open Circle" und "Linearized Circle" entsprechenden Banden keine weiteren Banden vorhanden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene DNA kann ohne weiteres für übliche molekularbiologische und medizinische Anwendungen, wie etwa zum Klonieren, zur Transformation, zur Transfektion, zur Mikroinjektion in Zellen, zur Verwendung bei Verfahren der Gentherapie, der DNA-Vakzinierung oder/und zur Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Durchflußzentrifuge zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA.
Beis iel
In dem durchgeführten Versuch wird eine CEPA-Laborzentrifuge LE (offene Ausführung) mit einem Klärzylinder aus rostfreiem Stahl (1.4571, V4A) verwendet. Ca.2.000 g Biomasse werden nach der Alkali-Lysemethode (modifiziertes Verfahren nach Birnboim & Doly; Birnboim & Doly, Nucl . Acid Res . 7 (1979) 1513-1523) aufgeschlossen.
1. Lyse der E.coli Biomasse
2.000 g feuchte E.coli Biomasse wird aus dem Fermenter in entpyrogenisierte Becher abgefüllt. Es werden 22,5 1 Resuspen- sionspuffer (50 mmol/1 Tris-HCl, 10 mmol/1 EDTA-Na2, pH 8 ±
0,2) zugegeben und mindestens 24 Stunden bei 5 ± 4° C langsam (ca. 35 RPM) gerührt, bis die Biomasse vollständig suspendiert ist. Dann wird die Temperatur der Suspension langsam auf 25° C erhöht. Zur Suspension werden 22,5 1 0,2 mol/1 NaOH, 1 % SDS unter Rühren mit ca. 80 RPM zugegeben und bei 25° C 5 Minuten inkubiert. Es werden 22,5 1 Kaliumacetatpuffer (3 mol/1 Kali- umacetatpuffer pH 5,5) unter Rühren zugefügt und die Temperatur der Biomasse möglichst schnell auf 4° C abgesenkt. Der erhaltene Aufschluß wird mit Hilfe der Durchflußzentrifuge im "continuous-flow-through-mode" klarfiltriert .
2. Durchflußzentrifugation
Die viskose Suspension wird durch die Einlaßöffnung in die Durchflußzentrifuge gepumpt. Die Zentrifuge wird dabei mit einer g-Zahl von 10.000-18.000 x g betrieben. Sobald austretende Flüssigkeit trüb wird, ist der Niederschlag vom Zylinder zu entfernen und nach Einsetzen des gereinigten Zylinders die Zentrifugation fortzusetzen. Die klare von den zellulären Verunreinigungen befreite Plasmid-DNA-Lösung tritt nach oben aus der Durchflußzentrifuge aus und wird in einem Gefäß gesammelt .
3. Weitere Aufreinigungsschritte :
Q-Sepharose-Chromatographie, Hydroxylapatit -Chromatographie und Cross-Flow-Filtration
In einem nächsten Schritt wird eine Chromatographie an Q-Se- pharose und Hydroxylapatit durchgeführt. Der dekantierte Zen- trifugenüberstand wird durch Zugabe von TE-Puffer (10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA pH 8,5 ± 0,2) auf 49 - 50 mS/cm Leitfähigkeit eingestellt und auf 5 + 4° C abgekühlt. Die gesamte Chromatographie wird bei dieser Temperatur durchgeführt . Der Zentrifugationsüberstand wird auf die aquilibrierte Säule aufgezogen. Anschließend wird die Säule mit ca. 8 SV 10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,65 mol/1 NaCl pH 8,5 + 0,2 gewaschen. Zur Elution wird an die Säule ein Gradient (5 SV Puffer A (10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,65 mmol/1 NaCl pH 8,0 ± 2), 5 SV Puffer B (10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,85 mol/1 NaCl pH 8,0 + 0,2)) angelegt und das Eluat fraktioniert, die Detektion erfolgt bei 254 nm. Der Vorpeak (Verunreinigungen) wird vom Hauptpeak (Plasmid-DNA) abgetrennt, indem der Haupt - peak ab ansteigender Flanke in einem separatem Gefäß aufgefangen wird.
Im folgendem wird eine Chromatographie an Hydroxylapatit (HA Ceramic) bei 5 ± 4° C durchgeführt.
Äquilibrierungspuffer : 0,1 mol/1 Kaliumphosphat, 6 mol/1 Harnstoff pH 7, 0 ± 0,2.
Waschpuffer 1: 0,15 mol/1 Kaliumphosphat, 6 mol/1 Harnstoff pH 7,0 ± 0,2.
Waschpuffer 2: 0,02 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 ± 0,2.
Elutionspuffer : 0,5 mol/1 Kaliumphosphat pH 7,0 + 0,2.
Die Detektion erfolgt bei 254 nm mit einer UV-Detektor/Schrei- bereinheit. Als Eichlösung wird eine 1 % Produktlösung (Plas- mid-DNA) , vermessen mit einem kalibrierten Photometer, verwendet .
Der Q-Sepharose-Pool wird auf eine Endkonzentration von 1,1 mmol/1 Calciumchlorid gebracht und auf die äquilibrierte Säule aufgezogen.
Anschließend wird die Säule nacheinander gewaschen mit:
1. 0,1 mol/1 Kaliumphosphat, 6 mol/1 Harnstoff pH 7,0 + 0,2, bis am Detektor keine Absorption mehr erkennbar ist.
2. 2-4 SV, 0,15 mol/1 Kaliumphosphat, 6 mol/1 Harnstoff pH 7,0 ± 0,2. 3. 5 SV, 0,02 mol/1 Kaliumphosphat pH 7,0 ± 0,2.
Im Anschluß an die Waschschritte wird mit 0,5 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 + 0,1 bei einer Flußrate von 5-6 SV/h eluiert .
Der Peak wird gesammelt und mit einer Cross-Flow-Filtration auf ca. 50 ml konzentriert. Die CFF wird mit einer Retentat- durchflußrate von 100-200 l/h«m2 , einem Transmembrandruck von ca. 0,8 bar und einem Uberströmdruck von ca . 1,2 bar durchgeführt. Anschließend wird das Retentat gegen TE-Puffer (10 mmol/1 Tris/HCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 8.0) fließend diafiltriert, bis die Werte für pH und Leitfähigkeit von Retentat und TE- Puffer übereinstimmen. Nach Beendigung des Diafiltrationsvor- ganges wird das Retentat durch Verdünnung mit Diafiltrationspuffer auf eine Plasmid-DNA-Konzentration von 1 mg/ml eingestellt.
4. Gelelektrophorese
Die Intaktheit der erhaltenen Plasmid-DNA wird mittels Aga- rose-Gelelektrophorese überprüft .
Dazu wird ein Aliquot der Plasmid-DNA in verschiedenen Konzentrationen auf ein Agarosegel aufgetragen. Das dargestellte Agarosegel zeigt in den Spuren 1 und 10 den DNA-Längenstandard Nr. II (Fragmentgrößen: 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp) und in den Spuren 2 und 9 DNA-Längenstandard III (Fragmentgrößen: 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3530, 4268, 4973, 5148, 21226 bp) . Als Vergleichplasmid ist in Spur 3 pBR322 (4162 bp) aufgetragen, das nach konventioneller Cäsiumchloridgradientenmethode aufgereinigt wurde. Es ist bekannt, daß nach dieser Methode gereinigte Plasmid-DNA im wesentlichen Plasmid-DNA enthält, die der Konformation "Covalently Closed Circle" (dominante "Supercoiled-Bande" ) entspricht. In den Spuren 4, 5 und 6 ist die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigte Plasmid-DNA (pCMV-CAT) in unterschiedlichen Mengen aufgetragen.
Diese Plasmid-DNA war im Anschluß an das erfindungegemäße Verfahren über Q-Sepharose und Hydroxylapatit -Chromatographie, sowie Cross-Flow-Filtration weitergereinigt worden.
Legende : l%iges Agarosegel
Spur 1 : DNA-Längenstandard II (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 236250)
Spur 2 : DNA-Längenstandard III (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 528552)
Spur 3 : pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 481238)
(0,4 μg) Spur 4 pCMV-CAT nach CFF, 0,19 μg (Bulk-Wirkstofflösung) Spur 5 pCMV-CAT nach CFF, 0,45 μg (Bulk-Wirkstofflösung) Spur 6 pCMV-CAT nach CFF, 0,71 μg (Bulk-Wirkstofflösung) Spur 7 TE-Puffer Spur 8 pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 481238)
(0,4 μg)
Spur 9 : DNA-Längenstandard III (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 528552) Spur 10 DNA-Längenstandard II (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 236250)
Die erfindungsgemäß gereinigte Plasmid-DNA zeigt wie auch die Vergleichsplasmid-DNA (Spur 3) im wesentlichen eine dominante Bande. Dies zeigt, daß die erfindungsgemäß gewonnene Plasmid- DNA nicht geschädigt wird und in ihrer ursprünglichen Konfor- mation erhalten bleibt. Außerdem zeigt das Fehlen von zusätzlichen Banden in dem Agarosegel, daß die in der aufgeschlossenen Zellsuspension enthaltene chromosomale DNA während der Durchlaufzentrifugation nicht fragmentiert wird, sondern als prazipitiertes Makromolekül vollständig von der Plasmid-DNA abgetrennt werden kann.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA, dadurch gekennzeichnet, daß eine extrachromosomale DNA und weitere Zellbestandteile enthaltende Flüssigkeit unter Bedingungen durch eine Durchflußzentrifuge geleitet wird, die zur Abtrennung der extrachromosomalen DNA von unlöslichen Zellbe- standteilen führen und die gereinigte extrachromosomale DNA gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die extrachromosomale DNA enthaltende Flüssigkeit durch Lyse von extrachromosomale DNA enthaltenden Zellen gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse eine alkalische Lyse ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die extrachromosomale DNA enthaltende Zelle eine Bakterienzelle, vorzugsweise eine E.coli-Zelle ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die in die Zentrifuge eingeleitete Flüssigkeit durch Lyse von 100 g - 50 kg Biomasse erhalten wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die extrachromosomale DNA enthaltende Flüssigkeit durch Gefälle oder/und Pumpen in die Durchflußzentrifuge eingeleitet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Durchflußzentrifuge mit einem Volumen des Zen- trifugenbehälters von mindestens 0,1 - 50 1 verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Durchflußzentrifuge mit einem Volumen des Zentrifugenbehälters von 0,2 - 4 1 verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußzentrifuge mit einer Beschleunigung von 10.000 - 40.000 x g betrieben wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren kontinuierlich durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der extrachromosomalen DNA 1 kbp - 200 kbp ist .
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die extrachromosomale DNA lineare, zirkuläre oder supercoiled Plasmid-DNA ist .
5
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigte extrachromosomale DNA enthaltende Lösung weiter aufgereinigt werden kann.
10
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Aufreinigen eine Anionenaustauschchroma- tographie, eine Affinitätschromatographie, eine Hydroxyl- 15 apatitchromatographie, eine RNase-Behandlung oder/und eine Cross-Flow-Filtration umfaßt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
20 daß man eine extrachromosomale DNA gewinnt, die im wesentlichen keine Strangbrüche aufweist.
16. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche gereinigten extrachromosomalen DNA zum Klonieren, zur
25 Transformation, zur Transfektion, zur Mikroinjektion in Zellen, zur Verwendung bei Verfahren der Gentherapie, der DNA-Vakzinierung oder/und zur Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) .
30 17. Verwendung einer Durchflußzentrifuge zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA.
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