EP0980390A2 - Human-cd28 spezifische monoklonale antikörper zur antigenunspezifischen aktivierung von t-lymphozyten - Google Patents

Human-cd28 spezifische monoklonale antikörper zur antigenunspezifischen aktivierung von t-lymphozyten

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EP0980390A2
EP0980390A2 EP98934848A EP98934848A EP0980390A2 EP 0980390 A2 EP0980390 A2 EP 0980390A2 EP 98934848 A EP98934848 A EP 98934848A EP 98934848 A EP98934848 A EP 98934848A EP 0980390 A2 EP0980390 A2 EP 0980390A2
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EP
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human
monoclonal antibodies
mouse
antibodies
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EP98934848A
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Thomas HÜNIG
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TeGenero AG
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Publication date
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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
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    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the invention relates to monoclonal antibodies which are specific for human CD28 and which activate T-lymphocytes without occupying an antigen receptor of the T-lymphocytes and thus antigen-nonspecifically, hybridoma cells for producing such antibodies, a method for producing such antibodies and uses of such antibodies.
  • Monoclonal antibodies are antibodies that are produced by hybrid cell lines (so-called hybridomas) that are formed by fusing an antibody-producing B cell of animal or human origin with a suitable myeloma tumor cell.
  • CD28 is a cell surface molecule of known amino acid sequence expressed on T lymphocytes of human and animal origin, which is part of the international "Human
  • T-lymphocytes means the increase in metabolic activity, increase in cell volume, synthesis of immunologically important molecules and entry into the cell division (proliferation) of T-lymphocytes due to an external stimulus. For example these processes are triggered by occupation of the CD28 molecule on T cells by special CD28-specific monoclonal antibodies
  • the activation of T lymphocytes with the described side effects is part of the physiological immune reaction, but can get out of control there in pathological situations (lymphoproliferative diseases ), or inadequate (immunodeficiency).
  • the following technological background is important for understanding the invention.
  • the activation of resting T cells for proliferation and functional differentiation first requires the occupation of two surface structures, so-called receptors: 1. the antigen receptor, which has a different specificity from cell to cell and for the detection of antigens, e.g. B. viral fission products is necessary; as well as the CD28 molecule expressed equally on all resting T cells, which naturally binds to ligands on the surface of other cells of the immune system.
  • receptors 1. the antigen receptor, which has a different specificity from cell to cell and for the detection of antigens, e.g. B. viral fission products is necessary; as well as the CD28 molecule expressed equally on all resting T cells, which naturally binds to ligands on the surface of other cells of the immune system.
  • costimulation of the antigen-specific immune reaction by CD28. In cell culture, these processes can be simulated by filling the antigen receptor and the CD28 molecule with suitable monoclonal antibodies. In the classic system of costimulation, neither the occupation of the antigen
  • Monoclonal antibodies of the type mentioned are known.
  • IL-2 growth factor interleukin-2
  • CD28-specific monoclonal antibodies with different functional properties were described: "classic antibodies” which only stimulate the activation of resting T cells when the antigen receptor is occupied; and "direct”, which can activate T lymphocytes of all classes in vitro and in the test animal for proliferation without the occupation of the antigen receptor. Both monoclonal antibodies known in this respect result from an immunization with cells on which rat CD28 is expressed and are obtainable by different selections directed towards their respective described properties.
  • CD28-specific monoclonal antibodies which have the direct activating effect bind to T-lymphocytes much more slowly than classic CD28-specific monoclonal antibodies; however, binding to a mouse fibroblast cell line (L-929), on the surface of which the CD28 molecule is artificially expressed by transfection, is for classic and "directly" stimulating CD28-specific monoclonal antibodies at the same rate.
  • the "directly" stimulating CD28-specific monoclonal antibodies known in this respect recognize an active form of the CD28 molecule, the presence of which on suppressed T cells is suppressed by a hitherto unknown mechanism, which, however, occurs when the molecule is expressed in non- T tumor cell lines is accessible.
  • the monoclonal antibodies known in this respect are, on the one hand, specific against rat CD28 and, on the other hand, mouse antibodies. For both reasons, therefore, they are not suitable for therapeutic purposes in humans.
  • the invention is based on the technical problem of providing "direct" human CD28-specific monoclonal antibodies which, on the one hand, are also compatible with humans and, on the other hand, to a large extent on human T cells activate assets.
  • the invention teaches human-compatible monoclonal antibodies which are specific for human CD28 and which activate human T-lymphocytes from several or all subgroups without occupying an antigen receptor of the human T-lymphocytes and thus antigen-nonspecifically, preferably with human constant components.
  • - Constant components of an antibody are areas that are not important for antigen recognition, in contrast to the variable areas that define the antigen specificity of an antibody.
  • constant components differ in the case of antibodies of different types and consequently also animals and humans.
  • the constant ranges of an antibody must correspond to those of antibodies of an organism that is to be treated with the antibodies in order to be compatible.
  • Monoclonal antibodies according to the invention are therefore on the one hand compatible with human beings, either per se or through humanization, and on the other hand can be used to treat various diseases which are based on insufficient T-lymphocyte activity, since the antibodies against human CD28 are specific and because the activation of the T-lymphocytes is comprehensive.
  • the invention naturally includes a wide variety of derivatives of monoclonal antibodies, provided that the claimed features are met.
  • Derivatives of monoclonal antibodies are to be understood as meaning modifications of the monoclonal antibody which have been produced by customary biochemical or genetic engineering manipulations. This is the case, for example, with the humanization of a mouse monoclonal antibody by partially replacing structural (constant) components of the mouse antibody with those of a human.
  • monoclonal antibodies according to the invention are obtainable by: A) producing hybridoma cells capable of producing monoclonal human CD28-specific animal antibodies by immunization with non-T tumor cell lines on which human CD28 is expressed, B) optionally humanization the monoclonal animal antibodies obtainable from hybridoma cells according to stage A by biochemical or genetic engineering exchange of constant components of the animal antibodies with analog constant components of a human antibody or replacement of the components of corresponding genes of the hybridoma cells, C) secretion of the antibodies in hybridoma cell cultures and
  • monoclonal antibodies can be obtained which are not only specific against human CD28, but which also cause a "direct" activation to a considerable extent.
  • monoclonal antibodies according to the invention have specificity for determinants of the human CD28 molecule which are difficult to access on the naturally expressed CD28 molecule and whose occupation by the novel monoclonal antibodies leads to the activation of the T cells.
  • a determinant is to be understood as the region of a molecule which is defined by the binding specificity of one or more antibodies.
  • hybridoma cells for the humanization and for the production of the monoclonal antibodies from (humanized) hybridoma cells are well known to the person skilled in the art and need not be explained in more detail here. Basically, all known, freely available cell lines which are customary, in particular, for the production of the hybridoma cells can be used. In addition to the procedure described below, the recombinant expression which is well known to the person skilled in the art can in principle be used to produce the monoclonal antibodies.
  • the hybridoma cells capable of producing monoclonal human CD28-specific animal antibodies are obtainable by a) creation a plasmid by inserting human CD28 cDNA into the pH ⁇ APr-1-neo vector after excision of the Sall-Hindlll fragment and production of protoplasts from Escherichia coli (MC1061) which carry the plasmid, b) fusion of the protoplasts with mouse A20J and / or L929 tumor cells using polyethylene glycol, c) culturing the transfected cells obtained in stage b, d) screening the transfected mouse A20J and / or L929 cells for the expression of human CD28 and selection of human CD28 expressing mouse A20J and / or L929 Cells, e) immunization of BALB / c mice with the mouse CD20 expressing mouse A20J and / or L929 cells (for example by injections 6 x ip and then 1 x iV),
  • the pHßAPr-1-neo Vector is freely available from the authors of the Gunning reference, P, et al., 1987, "A human ⁇ -actin expression vector system directs high-level accumulation of antisense transcripts", Proc. Natl. Acad. Be. USA, 84: 4831. "neo” stands for neomycin resistance. Step c) is therefore carried out in the presence of neomycin.
  • the cell lines and / or microorganisms mentioned above are freely available and can be purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • the invention accordingly also relates to hybridoma cells according to claim 4 and a method for producing antibodies according to the invention according to claims 5 and 6.
  • monoclonal antibodies according to the invention for the production of medicaments, in particular for the treatment of diseases with pathologically reduced CD4 T cell numbers, such as AIDS or in the case of stem cell transplantation after chemotherapy of leukemic diseases, for potentiation and / or qualitative influencing of immune reactions in vaccinations and / or influencing the quality of the T cell reaction, in particular influencing the production of different effector molecules, for example cytokines and chemokines and their receptors, for example in autoimmune diseases and AIDS.
  • the pharmaceutical preparation of the pharmaceuticals for the various administration forms is well known to the person skilled in the art and need not be explained in more detail here.
  • the quality of the T cell reaction is, in particular, the production of certain Understanding cytokine patterns that can be pro- or anti-inflammatory, for example, or can selectively lead to the production of certain immunoglobulin classes in B lymphocytes (classic examples of different qualities of the T cell reaction are the functional TH1 and TH2 phenotypes, as described in the following examples ).
  • the invention also encompasses methods of curing the diseases mentioned above and below using monoclonal antibodies according to the invention.
  • CMY-2 Human CD28 from a cDNA library was recombinantly expressed in A20J and / or L929 cell lines.
  • a plasmid was first created by inserting human CD28 cDNA into the pH ⁇ APr-1-neo vector after excision of the Sall-HindIII fragment.
  • Protoplasts carrying the plasmid were produced from Escherichia coli (MC1061). The protoplasts were then fused with mouse A20J and / or L929 tumor cells using polyethylene glycol. The transfected cells thus obtained were cultivated in the usual way.
  • the transfected mouse A20J and / or L929 cells were then screened for the expression of human CD28 and selection of mouse A20J and / or L929 cells expressing human CD28.
  • FIG. 2 shows that the monoclonal antibody CMY-2 isolated in this way distinguishes transfected and untransfected cells by different fluorescence intensities.
  • Differential screening for antibodies against human CD28 was carried out as follows. 50 ⁇ l of supernatant each from cultured cell hybridomas were removed and incubated for 15 min with a mixture of L929 cells and L929-CD28 transfectants. After washing, the cells were stained with DaMIg-PE. Part A shows the negative control. The cells were incubated with DaMIg-PE only. Part B shows staining with a supernatant that was slightly positive but showed no difference in either cell. Part C shows the cells stained with a supernatant from CMY-2.
  • CMY-2 is a human CD28-specific antibody.
  • CMY-2 was then tested for classical costimulatory and for "direct" stimulating activity with human T-lymphocytes enriched from peripheral blood on approximately 80%.
  • the T cell proliferation was measured by incorporating 3 H thyme between the 2nd and 3rd day of culture. The following results were achieved:
  • CD3-specific antibody 3111 cp CD3-specific antibody + CMY-2 51676 cpm
  • Ant ⁇ -CD3 provides T cell receptor stimulation (CD3 is part of the TCR complex).
  • CMY-2 was used in the form of an unpurified culture supernatant (50% final volume).
  • the effective mAb concentration to be expected is suboptimal for direct activation, but sufficient for costimulation.
  • the experiment shows that CMY-2 has direct activating properties.
  • Hybridoma cells according to the invention which produce CMY-2 have been deposited with the DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, under the number DSM ACC2353 (20.05.1998).
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, under the number DSM ACC2353 (20.05.1998).
  • B-lymphocytes for the differentiation of further CD4 T cells to TH2 cells and thus the polarization of the immune system away from the inflammatory and towards the humoral immune response, and IL-10 is the central factor for the suppression of inflammatory (THl) reactions. Only the more important results of the in vivo treatment of rats are shown. Even clearer effects were found in vitro.
  • FIG. 3 shows the expressed cytokine profile of lymph nodes and spleen cells of young LEW rats three days after ip injection of the directly activating mAb JJ316, the costimulator JJ319, the TCR-specific mAb R73 or the vehicle PBS.
  • the illustration is a so-called RNAse protection test in which radioactively labeled antisense mRNA samples are protected from degradation of added RNAse by hybridization with the RNA extracted from the tissue. These give defined bands on the gel and make it possible to see at a glance the expressed cytokine profile at the mRNA level of a tissue.
  • the two smallest fragments, L32 and GADPH, are "household genes", the uniform expression of which is used to control the same amount of RNA used in the individual batches. The test was carried out using a kit commercially available from Pharmingen.
  • JJ316 but not JJ319 or R73, massively induce IL-10 and, to a lesser extent, IL-4 mRNA.
  • the effects are particularly evident in the spleen, but are also visible in the lymph nodes.
  • the cytokine IL-4 is detected at the protein and at the single cell level by flow cytophotometric analysis.
  • the cells are first stained with mAb against the surface molecule CD4, then fixed and permeabilized, so that in a subsequent cytoplasmic staining with an IL-4-specific mAb, which is labeled with a second fluorochrome, the IL-4 protein is detected can be.
  • the evaluation is carried out in the flow cytophotometer, each point represents a cell.
  • the quadrants introduced represent the boundaries between the background and the positive reaction.
  • the methodology is also described in detail in the Pharmingen catalog.
  • FIG. 5 A biological effect of the increased IL-4 production is shown in FIG. 5: The level of detectable antibodies of the class IGE increases significantly as a result of the treatment with mAb JJ316 and demonstrates the in vivo effectiveness of the "direct" CD28-specific monoclonal antibodies induced IL-4 secretion.
  • FIGS. 6 and 7 show so-called EMSAs (Electrophoretic Mobility Shift Assays) for the detection of the induction of transcription factors which promote the development of anti-inflammatory TH2 cells. The technique is as follows. T cells are stimulated in vitro for different lengths of time, then the proteins from the cell nuclei are brought into solution and incubated with a radioactively labeled short gene probe, the sequence of which they should recognize as transcription factors.
  • EMSAs Electrophoretic Mobility Shift Assays
  • Core receptors used chemokine receptors are switched off and the production of chemokines that bind to such receptors and thus block them for HIV I viruses are induced.
  • FIG. 9 shows this for lymph nodes of the rat which had received 1 mg on day 0 of the "directly” stimulating CD28-specific monoclonal antibody (JJ316) or of the "classic” CD28-specific monoclonal antibody (JJ319).
  • CD4 T cell number is only temporarily increased; this is because healthy animals have been treated with normal CD4 T cell counts.
  • the due to the Proliferation stimulation of "excess" cells is broken down by homeostatic mechanisms.
  • FIG. 10 shows an experiment for this, namely for the so-called adjuvant arthritis in the rat, a model system for certain forms of rheumatoid arthritis in humans.
  • "Paw volume increase” indicates the increase in the volume of the paws.
  • Days stands for days.
  • Healthy data points indicate values for healthy animals.
  • a monoclonal antibody of the same immunoglobulin class with specificity for an irrelevant human cell surface molecule was used for the isotype control.
  • AA stands for adjuvant arthritis.
  • PBS stands for "phosphate buffered saline".
  • W3 / 25 stands for a monoclonal antibody with specificity for the CD4 molecule of the rat.
  • the adjuvant arthritis is mediated by so-called THl cells.
  • THl cells arise from resting CD4 T cells in the course of activation under the influence of certain soluble factors of the immune system, so-called cytokines.
  • the antagonists of the TH1 cells are the anti-inflammatory TH2 cells, the production of which is controlled by other cytokines.
  • FIGS. 10 and 11 the development of the adjuvant arthritis, read from the joint swelling (FIG. 10) and the arthritic index (FIG.
  • monoclonal antibodies according to the invention can effect an immunomodulation.
  • classic monoclonal antibodies which are specific for human CD28 (and / or can be obtained by immunization with T cells) can effect an immunomodulation.
  • classic monoclonal antibodies is also not known.
  • the invention therefore also relates to the use of monoclonal antibodies specific for human CD28 (obtainable according to the above basic procedures, when immunized with T cell lines expressing human CD28 or non-T cell lines) for the production of medicaments for modulating immune reactions, and namely immunosuppression (for example with human CD28 analogs to JJ319) or immune enhancement (for example with human CD28 analogs to JJ316 such as CMY-2).

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Abstract

Die Erfindung lehrt humanverträgliche monoklonale Antikörper, welche gegen Human-CD28 spezifisch sind und Human-T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der Human-T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren.

Description

Human-CD28 spezifische monoklonale Antikörper zur antigenunspezifischen Aktivierung von T-Lymphozyten
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, welche für Human-CD28 spezifisch sind und T-Lymphozyten ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der T-Lymphozyten und somit antigen- unspezifisch aktivieren, Hybridomzellen zur Herstellung solcher Antikörper, ein Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper sowie Verwendungen solcher Antikörper. - Als monoklonale Antikörper sind Antikörper bezeichnet, die von Hybrid-Zellinien (sog. Hybridomen) produziert werden, die durch Fusion einer Antikörper produzierenden B-Zelle tierischer oder menschlicher Herkunft mit einer geeigneten Myelom Tumorzelle entstanden sind. Als CD28 wird ein auf T-Lymphozyten menschlicher und tierischer Herkunft expri- miertes Zeiloberflächenmolekül bekannter Aminosäuresequenz bezeichnet, dem im Rahmen der internationalen "Human
Leukocyte Typing Workshops" das Kürzel CD28 gegeben wurde. Mit Aktivierung von T-Lymphozyten ist die Vermehrung der Stoffwechselaktivität, Vergrößerung des Zellvolumens, Synthese immunologisch wichtiger Moleküle und Eintritt in die Zellteilung (Proliferation) von T-Lymphozyten auf einen äußeren Reiz hin gemeint. Beispielsweise werden diese Vorgänge durch Besetzung des CD28-Moleküls auf T-Zellen durch besondere CD28-spezifische monoklonale Antikörper ausgelöst. Die Aktivierung von T-Lymphozyten mit den beschriebenen Begleiterscheinungen ist Teil der physiologischen Immunreaktion, kann dort aber in pathologischen Situationen außer Kontrolle geraten (lymphoproliferative Erkrankungen) , oder unzureichend sein (Immundefizienz) . Zum Verständnis der Erfindung ist zunächst folgender technologischer Hintergrund wichtig. Die Aktivierung ruhender T-Zellen zur Proliferation und funktioneilen Differenzierung erfordert zunächst die Besetzung zweier Oberflächenstruk- turen, sogenannter Rezeptoren: 1. des Antigenrezeptors, der von Zelle zu Zelle eine unterschiedliche Spezifität besitzt und für die Erkennung von Antigenen, z. B. viralen Spaltprodukten, notwendig ist; sowie des auf allen ruhenden T-Zellen gleichermaßen exprimierten CD28 Moleküls, welches natürlicherweise an Liganden auf der Oberfläche anderer Zellen des Immunsystems bindet. Man spricht von der "Kostimulation" der antigenspezifischen Immunreaktion durch CD28. In Zellkultur können diese Vorgänge nachgestellt werden durch Besetzung des Antigenrezeptors sowie des CD28-Moleküls mit geeigneten monoklonalen Antikörpern. Im klassischen System der Kostimulation führt weder die Besetzung des Antigenrezeptors noch die des CD28-Moleküls allein zur T-Zellproliferation, die Besetzung beider Rezeptoren ist jedoch effektiv. Diese Beobachtung wurde an T-Zellen des Menschen, der Maus und der Ratte gemacht.
Monoklonale Antikörper der eingangs genannten Art sind bekannt. Eine "direkte", d. h. von der Besetzung des Antigenrezeptors unabhängige Aktivierung ruhender T-Lymphozyten durch CD28-spezifische monoklonale Antikörper, wurde in folgenden Systemen beobachtet: in der Literaturstelle Brinkmann et al., J. Immunology, 1996, 156: 4100-4106 wurde gezeigt, daß ein sehr kleiner Anteil (5 %) menschlicher T-Lymphozyten, die den für ruhende T-Lymphozyten typischen Oberflächenmarker CD45 RO tragen, durch den "klassischen" CD28-spezifischen monoklonalen Antikörper 9.3 bei Zusatz des Wachstumsfaktors Interleukin-2 (IL-2) ohne Besetzung des Antigenrezeptors aktiviert wird. In der Arbeit von Siefken et al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65, wurde gezeigt, daß ein auf konventionellem Wege, d.h. durch Immunisierung von Mäusen mit menschlichen T-Zellen, hergestellter CD28-spezifischer monoklonaler Antikörper in Zellkultur eine Untergruppe menschlicher T-Zellen ohne Besetzung des Antigenrezeptors zur Proliferation aktivieren kann, wenn CD28 durch diesen monoklonalen Antikörper besetzt wird und die zellgebundenen monoklonale Antikörpermoleküle zusätzlich durch weitere Antikörper miteinander vernetzt werden. In beiden Fällen sind die beschriebenen Antikörper zunächst grundsätzlich nicht zum Einsatz in der Humanmedizin geeignet, da es sich um Maus Antikörper handelt. Weiterhin ist beiden beschriebenen Antikörpern gemeinsam, daß nur ein sehr kleiner Anteil der T-Zellen "direkt" aktivierbar ist.
In der Arbeit von Tacke et al., Eur. J. Immunol . , 1997, 27:239-247 wurden zwei Arten von CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen funktioneilen Eigenschaften beschrieben: "klassische Antikörper", die die Aktivierung ruhender T-Zellen nur bei gleichzeitiger Besetzung des Antigenrezeptors kostimulieren; und "direkte", die ohne Besetzung des Antigenrezeptors T-Lymphozyten aller Klassen in vitro und im Versuchstier zur Proliferation aktivieren können. Beide insofern bekannte monoklonale Antikörper rühren aus einer Immunisierung mit Zellen, auf denen Ratten-CD28 exprimiert ist und sind durch auf ihre jeweiligen beschriebenen Eigenschaften gerichtete unterschiedlichen Selektionen erhältlich. Ferner wird in dieser Literaturstelle gezeigt, daß CD28-spezifische monoklonale Antikörper, die den direkt aktivierenden Effekt besitzen, viel langsamer als klassische CD28-spezifische monoklonale Antikörper an T-Lymphozyten binden; die Bindung an eine Mausfibroblasten-Zellinie (L-929) , an deren Oberfläche das CD28-Molekül künstlich durch Transfektion exprimiert wird, erfolgt jedoch für klassische und "direkt" stimulierende CD28-spezifische monoklonale Antikörper mit der gleichen Geschwindigkeit. Daraus wird gefolgert, daß die insofern bekannten "direkt" stimulierenden CD28-spezifischen monoklonalen Antikörper eine aktive Form des CD28-Moleküls erkennen, deren Vorliegen auf ruhenden T-Zellen durch einen bisher unbekannten Mechanismus unterdrückt wird, die aber bei Expression des Moleküls in nicht-T Tumorzellinien zugänglich ist. Die insofern bekannten monoklonalen Antikörper sind jedoch einerseits gegen Ratten-CD28 spezifisch und andererseits Maus-Antikörper. Sie eignen sich daher aus beiden Gründen nicht für therapeutische Zwecke beim Menschen.
Gegenüber dem Stand der Technik gemäß der beiden erstgenannten Literaturstellen liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, "direkte" Human-CD28 spezifische monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum einen auch humanverträglich sind und die zum anderen Human T-Zellen in breitem Umfang zu aktivieren vermögen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung humanverträgliche monoklonale Antikörper, welche für Human-CD28 spezifisch sind und Human-T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der Human-T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren, vorzugsweise mit humanen konstanten Komponenten. - Konstante Komponenten eines Antikörpers sind Bereiche, die nicht für die Antigenerkennung bedeutsam sind, im Gegensatz zu den variablen Bereichen, die die Antigenspezifität eines Antikörpers definieren. Konstante Komponenten unterscheiden sich jedoch bei Antikörpern verschiedener Arten und folglich auch Tieren und Menschen. Die konstanten Bereiche eines Antikörpers müssen jenen von Antikörpern eines Organismus entsprechen, der mit den Antikörpern behandelt werden soll, um verträglich zu sein. Erfindungsgemäße monoklonalen Antikörper sind daher einerseits humanverträglich, sei es per se oder durch Humanisierung und können andererseits zur Behandlung verschiedener Krankheiten, die auf zu geringer T-Lymphozyten- Aktivität beruhen, dienen, da die Antikörper gegen Human-CD28 spezifisch sind und da die Aktivierung der T-Lymphozyten umfassend ist.
Unter die Erfindung fallen selbstverständlich verschiedenste Derivate von monoklonalen Antikörpern, sofern die beanspruch- ten Merkmale erfüllt sind. Unter Derivaten von monoklonalen Antikörpern sind Modifikationen des monoklonalen Antikörpers zu verstehen, die durch übliche biochemische oder gentechnische Manipulationen erzeugt wurden. Dies ist beispielsweise gegeben mit der Humanisierung eines monoklonale Antikörpers der Maus durch partiellen Ersatz struktureller (konstanter) Komponenten des Maus-Antikörpers durch solche eines menschlichen.
Im einzelnen sind erfindungsgemäße monoklonale Antikörper erhältlich durch: A) Herstellung von zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikörpern befähigten Hybridomzellen im Wege einer Immunisierung mit nicht-T-Tumorzelllinien, auf welchen Human-CD28 exprimiert ist, B) ggf. Humanisierung der aus Hybridomzellen gemäß Stufe A erhältlichen monoklonalen Tier-Antikörper durch biochemischen oder gentechnologischen Austausch konstanter Komponenten der Tierantikörper gegen analoge konstante Komponenten eines menschlichen Antikörpers bzw. Austausch den Komponenten entsprechender Gene der Hybridomzellen, C) Sez- ernierung der Antikörper in Hybridomzell-Kulturen und
Isolierung der Antikörper daraus oder Produktion der Antikörper durch Injektion der Hybridomzellen in Tiere, beispielsweise Mäuse, und Isolierung der Antikörper aus der Körperflüssigkeit der Tiere. - Der Kern der Erfindung besteht gegenüber den nächstliegenden Literaturstellen Brinkmann et al., J. Immunology,. 1996, 156: 4100-4106, und Siefken et al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65, demnach in der Erkenntnis, daß eine "direkte" Aktivierung praktisch aller T- Lymphozyten dann erreichbar ist, wenn die monoklonalen Antikörper durch Immunisierung mit nicht-T Tumorzellen, auf welchen Human-CD28 exprimiert ist, erhalten sind, anstelle einer Immunisierung mit T-Zellinien. Denn so können monoklonale Antikörper erhalten werden, die nicht nur gegen Human- CD28 spezifisch sind, sondern auch eine "direkte" Aktivierung in beachtlichem Umfang bewirken. Im einzelnen weisen erfindungsgemäße monoklonale Antikörper Spezifität für Determinanten des menschlichen CD28-Moleküls auf, die auf dem natürlicherweise exprimierten CD28-Molekül schwer zugänglich sind und deren Besetzung durch die neuartigen monoklonale Antikörper zur Aktivierung der T-Zellen führt. Unter einer Determinante ist der Bereich eines Moleküls zu verstehen, der durch die Bindungsspezifität eines oder mehrerer Antikörper definiert wird.
Die grundsätzliche Vorgehensweise bei der Herstellung von Hybridomzellen, bei der Humanisierung sowie bei der Produktion der monoklonalen Antikörper aus (humanisierten) Hybridomzellen ist dem Fachmann gut vertraut und braucht hier nicht näher erläutert zu werden. Grundsätzlich sind alle insbesondere für die Herstellung der Hybridomzellen üblichen, bekannten und frei verfügbaren Zellinien einsetzbar. Zur Herstellung der monoklonalen Antikörper kommt grundsätzlich neben der folgend beschriebenen Vorgehensweise die dem Fachmann im Detail gut geläufige rekombinante Expression in Frage.
Im einzelnen ist es bevorzugt, wenn die zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikörper befähigten Hybridomzellen erhältlich sind durch a) Schaffung eines Plasmids mittels Insertion von Human-CD28 cDNA in den pHßAPr-1-neo Vector nach Excision des Sall-Hindlll Fragments und Herstellung von Protoplasten aus Escherichia coli (MC1061), welche das Plasmid tragen, b) Fusionierung der Pro- toplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels Polyethylenglykol, c) Kultivierung der in Stufe b erhaltenen transfektierten Zellen, d) Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder L929 Zellen auf die Expression von Human CD28 und Selektion von Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, e) Immunisierung von BALB/c Mäusen mit den Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen (beispielsweise durch Injektionen 6 x i.p. und anschließend 1 x i.V.), f) Entnahme von Milzzellen der so immunisierten Mäuse und Fusionierung der Milzzellen mit ("nonproducer"-, d.h. keine Antikörper produzierenden) Zellen der Zellinie X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol, g) Selektierung der so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybridomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 Zel- len binden und h) Kultivierung/Subclonierung der in Stufe g erhaltenen selektierten Hybridomzellen. Anstelle der Stufen a) bis d) können selbstverständlich aber auch andere dem Fachmann geläufige Expressionsysteme eingesetzt werden. Human-CD28 cDNA ist frei erhältlich von Dr. A. Aruffo und Dr. B. Seed, die die Sequenz und auch folgende Literaturstelle veröffentlicht haben: Aruffo, A. , and Seed, B, 1987, "Molecu- lar cloning of a CD28 cDNA by a high efficiency COS cell ex- pression System", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:8573. Dieser Literaturstelle ist daher im einzelnen die Herstellung der Human-CD28 cDNA entnehmbar. Darüberhinaus kann unschwer jeder Fachmann mit Hilfe der in der Genbank deponierten Sequenz und der Polymerasekettenreaktion sehr einfach und schnell einen Human-CD28 cDNA Klon herstellen. Der pHßAPr-1-neo Vector ist frei erhältlich von den Authoren der Literaturstelle Gunning, P, et al., 1987, "A human ß-actin expression vector system directs high-level accumulation of antisense transcripts", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:4831. "neo" steht dabei für Neomycin-Resistenz. Die Stufe c) wird daher in Anwesenheit von Neomycin durchgeführt. Die vorstehend angesprochenen Zel- linien und/oder Mikroorganismen sind frei verfügbar und käuflich erwerbbar bei der American Type Culture Collection (ATCC) . Bezüglich Escherichia coli (MC1061) wird ergänzend auf die Literaturstelle Meissner, P.S., et al., 1987, "Bacte- riophage gamma cloning system for the construction of direc- tional cDNA libraries", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:4171, verwiesen.
Gegenstand der Erfindung sind demnach auch gemäß Patentan- spruch 4 Hybridomzellen sowie ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Antikörpern gemäß der Patentansprüche 5 und 6.
Von eigenständiger Bedeutung ist aber im Rahmen der Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen mit pathologisch erniedrigten CD4-T-Zellzahlen, wie AIDS oder bei Stammzelltransplantation nach Chemotherapie von leukämischen Erkrankungen, zur Poten- zierung und/oder qualitativen Beeinflussung von Immunreaktionen bei Schutzimpfungen und/oder zur Beeinflussung der Qualität der T-Zellreaktion, insbesondere zur Beeinflussung der Produktion verschiedener Effektormoleküle, beispielsweise Zytokine und Chemokine und ihre Rezeptoren, bei beispiel- sweise Autoimmunerkrankungen und AIDS. Die galenische Herrichtung der Arzneimittel für die verschiedenen Verabreichungsformen ist dem Fachmann gut bekannt und braucht hier nicht näher erläutert zu werden. Als Qualität der T- Zellreaktion ist insbesondere die Produktion bestimmter Zytokinmuster zu verstehen, die z.B. pro- oder anti- inflammatorisch wirksam sein können oder selektiv zur Produktion bestimmter Immunglobulinklassen in B-Lymphozyten führen können (klassische Beispiele für verschiedene Qualitäten der T-Zellreaktion sind die funktioneilen THl und TH2 Phänotypen, wie folgend in Beispielen beschrieben) . Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Heilung der vorstehend und nachstehend genannten Krankheiten unter Verwendung erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Insbesondere wird die Herstellung erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper beschrieben. In diesen Ausführungsbeispielen werden auch Screeningverfahren im einzelnen deutlich, mit welchen erfindungsgemäße monoklonale Antikörper bzw. zugrundeliegende Hybridomzellen selektiert werden können. Aus den folgenden Beispielen werden auch erfindungsgemäße therapeutische Einsatzmöglichkeiten deutlich.
Die dargestellten Experimente bzw. die Beispiele zu den Wirkungen von "direkten" CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpern wurden im Tiermodell der Ratte durchgeführt, wobei als Beispiel für einen "klassischen" CD28-spezifischen An- tikörper der monoklonale Antikörper JJ319 und als Beispiel für einen "direkt" aktivierenden der monoklonale Antikörper JJ316 eingesetzt wird. Beide Antikörper sind frei verfügbar und käuflich erwerbar von der Firma Pharmingen, San Diego, USA. JJ319 und JJ316 Antikörper sind im übrigen erhältlich gemäß der Literaturstelle M. Tacke et al., Immunology, 1995, 154: 5121-5127, auf welche hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, auch im Hinblick auf Details der Herstellung von Hybridomzellen und monoklonalen Antikörpern. Beispiel 1
In diesem Beispiel wird die Herstellung erfindungsgemäßer, d.h. human-CD28-spezifischer monoklonaler Antikörper näher erläutert. Diese werden folgend auch als CMY-2 bezeichnet. Human CD28 aus einer cDNA Bibliothek wurde in A20J und/oder L929 Zellinien rekombinant exprimiert. Zunächst wurde hierzu ein Plasmid mittels Insertion von Human-CD28 cDNA in den pHßAPr-1-neo Vector nach Excision des Sall-Hindlll Fragments geschaffen. Aus Escherichia coli (MC1061) wurden Protoplasten hergestellt, welche das Plasmid tragen. Dann erfolgte eine Fusionierung der Protoplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels Polyethylenglykol. Die so erhaltenen transfektierten Zellen wurden auf übliche Weise kultiviert. Anschließend erfolgte ein Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder L929 Zellen auf die Expression von Human-CD28 und Selektion von Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen.
Der Nachweis der erfolgreichen Expression erfolgte mit Hilfe eines konventionellen, kommerziell erhältlichen fluoreszenzmarkierten Antikörpers mit Spezifität für Human CD28 (9.3-Phykoerythrin) . Als Negativkontrolle wurden nicht trans- fizierte A20J- bzw. L929-Zellen mit dem gleichen Antikörper gefärbt. Die Transfektanten (A20J-CD28 und L929-CD28) zeigten eine höhere Fluoreszenzintensität. Da nicht alle Zellen CD28 positiv waren, wurden CD28-positive Zellen subkloniert und zur Immunisierung verwendet. Wie in Fig. 1 an der Ver- Schiebung der Punktwolken nach oben in den beiden rechten Diagrammen erkennbar, reagierten diese Zellen mit dem käuflichen Antikörper, drückten also Human CD28 an ihrer Oberfläche aus. Die A20J Human-CD28 Zellinie wurde zur Immunisierung von BALB/c Mäusen verwendet. Zellfusion und screening wurden wie folgt durchgeführt: i) Immunisierung von BALB/c Mäusen mit den Human-CD28 exprimierenden Maus A20J Zellen (Injektionen 6 x i.p. und anschließend 1 x i.V.). ii) Entnahme von
Milzzellen der so immunisierten Mäuse und Fusionierung der Milzzellen mit Zellen der Zellinie X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol. iii) Selektierung der so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybridomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human-CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 Zellen binden.
Als read-out diente die Anfärbung einer Mischung aus CD28 transfizierten und untransfizierten Maus L929 Tumorzellen. Fig. 2 zeigt, daß der auf diesem Weg isolierte monoklonale Antikörper CMY-2 transfizierte und untransfizierte Zellen durch unterschiedliche Fluoreszenzintensität unter- scheidet. Das differentielle Screening auf Antikörper gegen Human-CD28 erfolgte wie folgt. Je 50 μl Überstand von kultivierten Zeilhybridomen wurden entnommen und mit einem Gemisch aus L929-Zellen und L929-CD28-Transfektanten 15 min inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit DaMIg-PE angefärbt. Teil A zeigt die Negativkontrolle. Die Zellen wurden nur mit DaMIg-PE inkubiert. Teil B zeigt die Färbung mit einem Überstand, der leicht positiv war, aber keinen Unterschied bei beiden Zellen zeigt. Teil C zeigt die mit einem Überstand von CMY-2 gefärbten Zellen.
In nicht dargestellten Experimenten wurden periphere Blutzellen des Menschen mit dem neu isolierten CMY-2 und dem "klassischen" CD28-spezifischen Antikörper 9.3 gefärbt. Es wurde ein identisches Expressionsmuster auf den Subpopula- tionen menschlicher Blutzellen gefunden. Zusammengefaßt zeigen die Experimente, daß CMY-2 ein human CD28-spezιfischer Antikörper ist.
CMY-2 wurde sodann mit aus peπpherem Blut auf circa 80 % angereicherten menschlichen T-Lymphozyten auf klassische kostimulierende und auf "direkt" stimulierende Aktivität getestet. Die T-Zellproliferation wurde durch Einbau von 3H-Thymιdm zwischen dem 2. und 3. Tag der Kultur gemessen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
Kostimulation:
Unst ulierte Zellen 276 cpm
CD3-spezιfischer Antikörper 3111 cp CD3-spezιfιscher Antikörper + CMY-2 51676 cpm
Direkte Stimulation:
Solid-phase anti-mouse Ig 379 cpm
Solid-phase anti-mouse Ig + Kontroll-mAk 258 cpm Solid-phase anti-mouse Ig plus CMY-2 19115 cpm
Zur Erläuterung: Antι-CD3 sorgt für T-Zellrezeptor- Stimulation (CD3 ist Teil des TCR-Komplexes) . CMY-2 wurde m Form eines nicht aufgereinigten Kulturuberstandes (50% Endvolumen) verwendet. Erfahrungsgemäß ist die dabei zu erwartende effektive mAk-Konzentration suboptimal für eine direkte Aktivierung, aber ausreichend für die Kostimulation. Das Experiment zeigt, daß CMY-2 direkt aktivierende Eigenschaften hat.
Erfmdungsgemaße Hybridomzellen, welche CMY-2 produzieren, sind bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, unter der Nummer DSM ACC2353 (20.05.1998) hinterlegt worden. Beispiel 2
In diesem Beispiel wird die immunmodulierende Wirkung von "direkten" CD28-spezifischen monomlonalen Antikörpern näher erläutert. Zielrichtung der Experimente ist der Nachweis der Leitzytokine der TH2 Zellen, nämlich IL-4 und IL-10, als Folge der direkten Aktivierung in vitro und in vivo. IL-4 ist entscheidend für die Kooperation der TH2-Zellen mit
B-Lymphozyten, für die Differenzierung weiterer CD4 T-Zellen zu TH2-Zellen und damit die Polarisation des Immunsystems weg von der Entzündungs- und hin zur humoralen Immunreaktion, und IL-10 ist der zentrale Faktor für die Unterdrückung inflammatorischer (THl) Reaktionen. Es sind nur die wichtigeren Ergebnisse der in vivo Behandlung von Ratten dargestellt. In vitro wurden sogar noch deutlichere Effekte gefunden.
Fig. 3 zeigt das exprimierte Zytokinprofil von Lymphknoten und Milzzellen junger LEW-Ratten drei Tage nach i. p. Injektion des direkt aktivierenden mAk JJ316, des Kostimulators JJ319, des TCR-spezifischen mAk R73 oder des Vehikels PBS. Die Darstellung ist ein sogenannter RNAse Protektionstest, in dem radioaktiv markierte antisense mRNA-Proben durch Hybridisierung mit der aus dem Gewebe extrahierten RNA vor dem Abbau zugesetzter RNAse geschützt werden. Diese geben auf dem Gel definierte Banden und erlauben, auf einen Blick das exprimierte Zytokinprofil auf mRNA Ebene eines Gewebes zu überblicken. Die beiden kleinsten Fragmente, L32 und GADPH, sind "Haushaltsgene", deren gleichförmige Expression zur Kontrolle gleich großer Mengen eingesetzter RNA in den einzelnen Ansätzen dient. Der Test wurde mit einem kommerziell von der Firma Pharmingen erhältlichen Kit durchgeführt.
JJ316, aber nicht JJ319 oder R73, induzieren massiv IL-10 und, in einem geringeren Ausmaß, IL-4 mRNA. Die Effekte sind in der Milz besonders deutlich, aber auch im Lymphknoten sichtbar.
In Fig. 4 wird das Zytokin IL-4 auf Protein- und gleichzeitig auf Einzelzellebene durch durchflußzytophotometrische Analyse nachgewiesen. Die Zellen werden zu diesem Zweck zunächst mit mAk gegen das Oberflächenmolekül CD4 gefärbt, dann fixiert und permeabilisiert, so daß in einer anschließenden zytoplasmatischen Färbung mit einem IL-4-spezifischen mAk, der mit einem zweiten Fluorochrom markiert ist, das IL-4 Protein nachgewiesen werden kann. Die Auswertung erfolgt im Durchflußzytophotometer, jeder Punkt stellt eine Zelle dar. Die eingeführten Quadranten stellen die Grenzen zwischen Hintergrund und positiver Reaktion dar. Die Methodik ist aber auch detailliert im Katalog der Firma Pharmingen beschrieben.
Wie die Fig. 4 zeigt, induziert die Injektion des mAk JJ316, nicht aber die des klassischen Kostimulators JJ319 die Produktion von IL-4 in einem substantiellen Anteil der isolierten CD4 T-Zellen.
In Fig. 5 wird eine biologische Auswirkung der erhöhten IL-4 Produktion gezeigt: Das Niveau an nachweisbaren Antikörpern der Klasse IGE steigt als Folge der Behandlung mit mAk JJ316 deutlich an und belegt die in vivo Effektivität der von "direkten" CD28-spezifischen monoklonalen Antikörper induzierten IL-4 Sekretion. Die Figuren 6 und 7 zeigen sogenannten EMSAs (Electrophoretic Mobility Shift Assays) zum Nachweis der Induktion von Transkriptionsfaktoren, die die Entwicklung von anti-inflam- matorischen TH2-Zellen fördern. Die Technik ist folgende. T-Zellen werden unterschiedlich lange in vitro stimuliert, dann werden die Proteine aus den Zellkernen in Lösung gebracht und mit einer radioaktiv markierten kurzen Gensonde inkubiert, deren Sequenz sie als Transkriptionsfaktoren erkennen sollten. Nach Inkubation wird das Gemisch auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die ungebundene markierte Gensonde läuft unten aus dem Gel heraus (hier nicht zu sehen). Banden wie die hier abgebildeten sind z. T. unspezifisch (überall vorhanden) oder selektiv induziert (starke, schwache Signale je nach Stimulus) .
Aus der Betrachtung der Figuren 6 und 7 wird folgendes deutlich. Sowohl mit einer GATA3-spezifischen wie mit einer c-Maf-ResponseElement-spezifischen Probe zeigt sich verstärkte Induktion bei Kostimulation (TCR + classical CD28) sowie direkter Stimulation ("direct" CD28) im Vergleich zur Stimulation nur über den T-Zellrezeptor (TCR) . Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Stimulation des CD28-Moleküls die Expression dieser Transkriptionsfaktoren im Zellkern fördert, und daß dies auch ohne TCR-Stimulation durch direkte CD28-Stimulation möglich ist. Zur Bedeutung dieser Faktoren für die Differenzierung von TH2-Zellen wird auf Current Opinion in Immunology 1997, 9:776-781, verwiesen.
Die vorstehend im einzelnen erläuterten Zusammenhänge zur immunregulierenden bzw. immunmodulierenden Wirkung "direkter" CD28-spezifischer monoklonaler Antikörper hinsichtlich der Bildung von THl und/oder TH2 Zellen machen diese folglich besonders geeignet zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von solchen Immunreaktionen abhängiger Krankheiten. Dies sind grundsatzlich alle allergisch-inflam- matorischen sowie autoimmun-inflammatorischen Krankheitsbilder. Zu ersterem gehören beispielsweise die unter der Bezeichnung "Inflammatory Bowel Disease" (IBD) zusammenge- faßten entzündlichen Darmerkrankungen und Kontaktdermatitis. Zu letzterem gehören Typ I Diabetes und Multiple Sklerose. Auch ist zu erwarten, daß eine starke Stimulation des menschlichen CD28 Moleküls durch erfindungsgemaße monoklonale Antikörper in der Lage ist, HIV I infizierte T-Zellen zu heilen. Denn dadurch können von den Viren als zellulare
Korezeptoren benutzte Chemokinrezeptoren abgeschaltet und die Produktion von Chemokinen, die an solche Rezeptoren binden und sie damit für HIV I Viren blockieren, induziert werden.
Beispiel 3
Fig. 8 zeigt die proliferative Antwort ungetrennter Lymphknotenzellen der Ratte auf den "direkt" stimulierenden υ CD28-spezifischen monoklonalen Antikörper (JJ316) und das Ausbleiben einer solchen Antwort bei Einsatz eines "klassischen " CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpers (JJ319) . Die Zellen wurden zwei Tage lang in 0,2 ml Medium
(RPMI 1640, erhaltlich von GIBCO/BRL, enthaltend 5 % FCS
[fetal calf serum] ) in An- oder Abwesenheit der angegebenen
Zusätze bei einer Dichte von 1 Mio. Zellen pro ml im begasten
Brutschrank kultiviert. Die Zellteilungsaktivitat wurde durch den Einbau radioaktiv markierten Thymidins (1 μCi/Ansatz für
16 Std., lCi = 37GBq, Bestimmung mit ß-Detektor) bestimmt. 0
Im Gegensatz zu veröffentlichten Resultaten (Siefken et al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65) zeigt dieses Ergebnis, daß es für die T-Zell-Aktivierung durch direkt aktivierende CD28-spezifische monoklonale Antikörper nicht notwendig ist, diese artifiziell durch einen zweiten Antikörper miteinander zu vernetzen. Vielmehr reicht die Anwesenheit von nicht-T- Zellen aus lymphoiden Organen, nämlich von B-Lymphozyten und sogenannten akzessorischen Zellen, um eine direkte Akti- vierung durch löslich zugegebene CD28-spezifische monoklonale Antikörper zu ermöglichen. Wahrscheinlich geschieht dies durch Bindung der monoklonale Antikörper an sogenannte Fc-Rezeptoren dieser nicht-T-Zellen. Dieses Ergebnis ist eine wichtige Voraussetzung für den thera- peutischen Einsatz "direkt" stimulierender CD28-spezifischer monoklonale Antikörper, in dem eine artifizielle Vernetzung mit anti-Immun- globulin Antikörpern im Gesamtorganismus nicht praktikabel ist.
Beispiel 4.
"Direkt" aktivierende CD28-spezifische monoklonale Antikörper führen zu einer Erhöhung der CD4 T-Zellzahl im intakten Organismus. Fig. 9 zeigt dies für Lymphknoten der Ratte, die am Tag 0 1 mg des "direkt" stimulierenden CD28-spezifischen monoklonale Antikörpers (JJ316) oder des "klassischen" CD28- spezifischen monoklonalen Antikörpers (JJ319) erhalten hatten. Mit erfindungsgemäßen direkt aktivierenden monoklonalen Antikörpern mit Spezifität für Human-CD28, und deren Fähigkeit, die Vermehrung von T-Lymphozyten zu stimulieren, werden ganz analoge Effekte erreicht. Dies kann dann insbesondere in Situationen Anwendung finden, in denen der Anteil von CD4 T-Zellen pathologisch erniedrigt ist und dem Normalniveau wieder angenähert werden soll. Solche Situa- tionen sind insbesondere im Krankheitsbild von AIDS und nach Chemotherapie und Knochenmarkstransplantation gegeben. Im vorliegenden Beispiel ist die CD4 T-Zellzahl nur vorübergehend erhöht; das liegt daran, daß gesunde Tiere mit normalen CD4 T-Zellzahlen behandelt wurden. Die aufgrund der Proliferationsstimulierung "überschüssigen" Zellen werden durch homöostatische Mechanismen abgebaut.
Beispiel 5.
Wie aus den vorstehenden aus den Figuren 5 - 7 gezogenen Schlußfolgerungen zu erwarten, sind direkt aktivierende CD28-spezifische monoklonale Antikörper therapeutisch einsetzbar, u.a. zur Verhinderung einer inflammatorischen Autoimmunreaktion. Fig. 10 zeigt ein Experiment hierzu, und zwar zur sogenannten Adjuvans Arthritis in der Ratte, einem Modellsystem für bestimmte Formen der rheumatoiden Arthritis beim Menschen. "Paw volume increase" gibt die Zunahme des Volumens der Pfoten an. "Days" steht für Tage. "Healthy"-Da- tenpunkte geben Werte für gesunde Tiere an. Zur Isotyp-Kontrolle wurde ein monoklonaler Antikörper der gleichen Immunglobulinklasse mit Spezifität für ein irrelevantes menschliches Zelloberflächenmolekül verwendet. AA steht für Adjuvans Arthritis. PBS steht für "phosphate buffered saline". W3/25 steht für einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für das CD4 Molekül der Ratte. Die Adjuvans Arthritis wird durch sogenannte THl-Zellen vermittelt. THl-Zellen entstehen aus ruhenden CD4 T-Zellen im Verlauf der Aktivierung unter dem Einfluß bestimmter löslicher Faktoren des Immunsystems, sogenannter Zytokine. Die Gegenspieler der THl-Zellen sind die anti-inflammatorisch wirkenden TH2-Zel- len, deren Entstehung durch andere Zytokine gesteuert wird. Bei dem in Fig. 10 und 11 gezeigten Versuch wurde die Entstehung der Adjuvans Arthritis, abgelesen an der Gelenkschwellung (Fig. 10) und dem arthritischen Index (Fig. 11) nach Immunisierung mit Mykobakterien in Adjuvans, durch den "direkt" aktivierenden CD28-spezifischen monoklonale Antikörper JJ316 fast vollständig unterdrückt. Der "klassische" CD28-spezifische monoklonale Antikörper (JJ319) hatte den gegenteiligen Effekt, d. h. er verschlechterte das Krankheitsbild. Daraus ist erkennbar, auch zur Anwendung beim Menschen, daß durch die Applikation konventioneller bzw. erfindungsgemäßer "direkt" stimulierender CD28-spezi- fischer monoklonaler Antikörper die Immunreaktion beeinflußt werden kann, hier im Sinne einer "Immundeviation" zu THl bzw. TH2. Mit anderen Worten ausgedrückt, können erfindungsgemäße monoklonale Antikörper, aber auch "klassische" monoklonale Antikörper, die für Human-CD28 spezifisch sind (und/oder durch Immunisierung mit T-Zellen erhältlich sind) eine Immunmodulation bewirken. Ein solcher Einsatzzweck "klassischer" monoklonaler Antikörper ist ebenfalls nicht bekannt.
Daher betrifft die Erfindung schließlich auch die Verwendung von gegen Human-CD28 spezifischen monoklonalen Antikörpern (erhältlich nach vorstehenden grundsätzlichen Verfahrensweisen, bei Immunisierung mit Human-CD28 exprimierenden T-Zellinien oder nicht-T-Zellinien) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Modulation von Immunreaktionen, und zwar Immunsupression (beispielsweise mit Human-CD28 Analogen zu JJ319) oder Immunverstärkung (beispielsweise mit Human-CD28 Analogen zu JJ316 wie CMY-2) .

Claims

Patentansprüche :
1. Humanverträgliche monoklonale Antikörper, welche für Human-CD28 spezifisch sind und Human-T-Lymphozyten mehrerer bis aller Untergruppen ohne Besetzung eines Antigenrezeptors der Human-T-Lymphozyten und somit antigenunspezifisch aktivieren.
2. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 1, die erhältlich sind durch
A) Herstellung von zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikörpern befähigten Hybridomzellen im Wege einer Immunisierung mit nicht-T-Tumorzelllinien, auf welchen Human-CD28 exprimiert ist,
B) ggf. Humanisierung der aus Hybridomzellen gemäß Stufe A erhältlichen monoklonalen Tier-Antikörper durch biochemischen oder gentechnologischen Austausch konstanter Komponenten der Tierantikörper gegen analoge konstante Komponenten eines menschlichen Antikörpers bzw. Austausch den Komponenten entsprechender Gene der Hybridomzellen, C) Sezernierung der monoklonalen Antikörper in
Hybridomzell-Kulturen und Isolierung der monoklonalen Antikörper daraus oder Produktion der monoklonalen Antikörper durch Injektion der Hybridomzellen in Tiere, beispielsweise Mäuse, und Isolierung der monoklonalen Antikörper aus der
Körperflüssigkeit der Tiere.
3. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikörpern befähigten Hybridomzellen erhältlich sind durch a) Schaffung eines Plasmids mittels Insertion von Human-CD28 cDNA in den pHßAPr-1-neo Vector nach Excision des Sall-Hindlll Fragments und Herstellung von Protoplasten aus Escherichia coli (MC1061), welche das Plasmid tragen, b) Fusionierung der Protoplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels Polyethylenglykol, c) Kultivierung der in Stufe b erhaltenen transfektierten Zellen, d) Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder
L929 Zellen auf die Expression von Human-CD28 und Selektion von Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, e) Immunisierung von BALB/c Mäusen mit den Human- CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929
Zellen, f) Entnahme von Milzzellen der so immunisierten Mäuse und Fusionierung der Milzzellen mit Zellen der Zellinie X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol, g) Selektierung der so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybridomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human-CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 Zellen binden und h) Kultivierung/Subclonierung der in Stufe g erhaltenen selektierten Hybridomzellen. 4) Hybridomzellen zur Herstellung von monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die durch folgende Verfahrensschritte erhältlich sind: a) Schaffung eines Plasmids mittels Insertion von Human-CD28 cDNA in den pHßAPr-1-neo Vector nach
Excision des Sall-Hindlll Fragments und Herstellung von Protoplasten aus Escherichia coli (MC1061) , welche das Plasmid tragen, b) Fusionierung der Protoplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels
Polyethylenglykol, c) Kultivierung der in Stufe b erhaltenen transfektierten Zellen, d) Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder L929 Zellen auf die Expression von Human-CD28 und
Selektion von Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, e) Immunisierung von BALB/c Mäusen mit den Human- CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, f) Entnahme von Milzzellen der so immunisierten Mäuse und Fusionierung der Milzzellen mit Zellen der Zellinie X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol und g) Selektierung der so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybridomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human-CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 binden.
5) Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit folgenden Verfahrenstufen : A) Herstellung von zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikorpern befähigten Hybridomzellen im Wege einer Immunisierung mit nicht-T-Tumorzelllinien, auf welchen Human-CD28 exprimiert ist,
B) ggf. Humanisierung der aus Hybridomzellen gemäß Stufe A erhältlichen monoklonalen Tier-Antikorper durch biochemischen oder gentechnologischen Austausch konstanter Komponenten der Tierantikorper gegen analoge konstante Komponenten eines menschlichen Antikörpers bzw. Austausch den Komponenten entsprechender Gene der Hybridomzellen,
C) Sezernierung der monoklonalen Antikörper in Hybridomzellen-Kulturen und Isolierung der monok- lonalen Antikörper daraus oder Produktion der monoklonalen Antikörper durch Injektion der Hybridomzellen in Tiere, beispielsweise Mause, und Isolierung der monoklonalen Antikörper aus der Korperflussigkeit der Tiere.
6) Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zur Produktion von monoklonalen Human-CD28 spezifischen Tier-Antikorper befähigten Hybridomzellen in folgenden Verfahrensstufen hergestellt werden: a) Schaffung eines Plasmids mittels Insertion von Human-CD28 cDNA in den pHßAPr-1-neo Vector nach Excision des Sall-Hindlll Fragments und Herstellung von Protoplasten aus Escherichia coli (MC1061) , welche das Plasmid tragen, b) Fusionierung der Protoplasten mit Maus A20J und/oder L929 Tumorzellen mittels Polyethylenglykol, c) Kultivierung der in Stufe b erhaltenen transfektierten Zellen, d) Screenen der transfektierten Maus A20J und/oder L929 Zellen auf die Expression von Human-CD28 und Selektion von Human-CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, e) Immunisierung von BALB/c Mäusen mit den Human- CD28 exprimierenden Maus A20J und/oder L929 Zellen, f) Entnahme von Milzzellen der so immunisierten Mäuse und Fusionierung der Milzzellen mit Zellen der Zellinie X63-Ag 8.653 mittels Polyethylenglykol und g) Selektierung der so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe, daß im Überstand selektierter Hybridomzellen Antikörper enthalten sind, die an Human-CD28 exprimierende Maus A20J und/oder L929 Zellen binden.
7) Verwendung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arneimittels zur therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers.
8) Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen mit pathologisch erniedrigten CD4-T-Zellzahlen, insbesondere AIDS oder nach Stammzelltransplantation nach Chemotherapie von leukämischen Erkrankungen. 9) Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Potenzierung und/oder qualitativen Beeinflussung von Immunreaktionen bei Schutzimpfungen.
10) Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beeinflussung der Qualität der T- Zellreaktion, insbesondere zur Beeinflussung der Produktion verschiedener Effektormoleküle, beispielsweise Zy- tokine und Chemokine und ihre Rezeptoren, bei beispielsweise Autoimmunerkrankungen und AIDS.
11) Verwendung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung von Krankheiten des menschlichen Körpers.
12) Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers, wobei monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 verwendet werden.
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