EP0994950A2 - Dns-sequenzen, expression dieser dns-sequenzen, durch die dns-sequenzen kodierte thermophile laccasen sowie deren verwendung - Google Patents

Dns-sequenzen, expression dieser dns-sequenzen, durch die dns-sequenzen kodierte thermophile laccasen sowie deren verwendung

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Publication number
EP0994950A2
EP0994950A2 EP98937446A EP98937446A EP0994950A2 EP 0994950 A2 EP0994950 A2 EP 0994950A2 EP 98937446 A EP98937446 A EP 98937446A EP 98937446 A EP98937446 A EP 98937446A EP 0994950 A2 EP0994950 A2 EP 0994950A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
laccase
dna
promoter
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98937446A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Günter Wich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Original Assignee
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH filed Critical Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Publication of EP0994950A2 publication Critical patent/EP0994950A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • DNA sequences expression of these DNA sequences, thermophilic laccases encoded by the DNA sequences and their use
  • the invention relates to DNA sequences which code for proteins with laccase activity, the expression of these DNA sequences, the ophilous laccases encoded by the DNA sequences and their use.
  • Laccases p-hydroxyphenol oxidase, EC 1.10.3.2.
  • Laccases belong to the protein family of the so-called "blue copper proteins” and generally contain four copper ions, which are arranged in three copper centers, type 1 to type 3.
  • Laccases are characterized by the fact that they are generally secreted proteins and that they can contain a glycosylation fraction of 10 to 45% of the molecular weight. Laccases have a very broad substrate specificity for aromatic compounds that oxidize them. The generated during this oxidation
  • Electrons are used to reduce oxygen. This creates water.
  • the function of the laccases that occur in white rot fungi is, among other things, lignin degradation. Hence the interest to use laccases in papermaking to delignify pulp.
  • laccases can also catalyze the polymerization of especially aromatic compounds.
  • An example of this is lignin biosynthesis in plants, in which laccases occurring in plants are involved.
  • Technical applications for laccases therefore generally arise in all types of polymerization reactions, for example in wastewater treatment.
  • the use of laccases is also known in organic chemical synthesis, for example in coupling reactions or the side chain oxidation of aromatics.
  • laccases are mesophilic, that is, they have a low temperature optimum and limited temperature stability.
  • laccase enzymes A prerequisite for the technical application of laccase enzymes is that they can be produced inexpensively. This is generally only possible through the use of recombinantly produced enzymes.
  • Various prokaryotic and eukaryotic expression systems are available for protein production. Examples of prokaryotic expression systems are Escherichia coli and Bacillus subtilis. Eukaryotic expression systems with widespread use are cell culture systems of both mammalian and insect cells as well as eukaryotic microorganisms such as yeasts or filamentous fungi.
  • WO96 / 00290 describes five laccase genes from the filamentous fungus of the subclass of the Basidiomycetes, Polyporus pinsitus.
  • One of these laccase genes (LCC1) was produced as a recombinant protein.
  • the thermophilic properties of this enzyme have not been investigated further, the use of LCC1 laccase described for hair coloring suggests that this enzyme has a mesophilic character.
  • thermophilic properties from the filamentous fungus of the subclass of Deuteromycetes, Scytalidiu thermophilum, is described in WO 95/33837. It is not known whether this enzyme is suitable for pulp bleaching.
  • CA: AN 96-203142 discloses various characteristics of a thermophilic laccase. DNA or protein sequence of this protein are not mentioned.
  • the invention relates to a DNA sequence which codes for a protein with laccase activity, characterized in that it includes the DNA sequence SEQ ID NO: 1 from position 76 up to and including position 1572 or SEQ ID NO: 2 from position 76 up to and including Position 1572 or a DNA sequence with a sequence homology greater than 80% to said DNA sequences.
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 represent the DNA sequence coding for the signal sequence for the secretion of the protein from position 1 to position 75. This signal sequence can be exchanged for any other signal sequences for protein secretion.
  • the DNA sequence according to the invention can be obtained, for example, by cloning from the basidiomycete strain Trametes versicolor TV-1 (deposited with the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38124 Braunschweig under the number DSM 11523).
  • a gene bank of Trametes versicolor TV-1 is created using methods known per se. It can be a cDNA or a genomic library.
  • DNA probes which contain laccase-specific DNA sequences.
  • DNA probes can be obtained, for example, by means of a PCR reaction using DNA primers from genomic DNA from Trametes versicolor TV-1.
  • DNA segments with a length of preferably 14 to 27 bp are used as primers, the sequence of which is determined by sequence comparison of known laccase genes.
  • the DNA segments suitable as primers are preferably obtained by oligonucleotide synthesis of the specified DNA segments.
  • a laccase gene according to the invention can be isolated, for example, as described in Examples 1 to 5.
  • a laccase gene isolated in this way can be modified using techniques known to those skilled in the art, such as, for example, site-directed mutagenesis, at the desired position in the sequence. Therefore, a DNA sequence coding for a protein with laccase activity comprising a DNA sequence with a sequence homology greater than 80% to the DNA sequence SEQ ID NO: 1 from position 76 up to and including position 1572 or SEQ ID NO: 2 from position 76 to position 1572 inclusive of the invention.
  • this expression vector containing the laccase gene is introduced into a microorganism and expressed in the microorganism.
  • the expression vector can be a DNA construct that is integrated into the genome of the host organism and replicated together with it.
  • the expression vector can be an autonomously replicating DNA construct that does not integrate into the host genome, e.g. a plasmid, an artificial chromosome or a comparable extrachromosomal genetic element.
  • a suitable expression vector should preferably contain the following genetic elements:
  • a promoter that mediates expression of the lacca gene in the host organism should preferably be a strong promoter so that high expression performance can be guaranteed.
  • the promoter is preferably operably linked to the 5 'end of the laccase gene. Promoters which are preferably suitable are selected from the group consisting of tac promoter, subtilisin promoter, GAL promoter, TAKA amylase promoter, polyhedrin promoter, glucoamylase promoter, gapDH promoter and alcohol oxidase promoter.
  • the tac promoter is preferably suitable for expression in E. coli, the subtilisin promoter for expression in Bacillus, the GAL promoter for expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the TAKA amylase promoter for the ex- pression in Aspergillus niger, the polyhedrin promoter for expression in baculovirus-infected insect cells, the glucoamylase promoter from Aspergillus niger or the alcohol oxidase promoter from the yeast Pichia pastoris.
  • the glucoamylase promoter from Aspergillus niger or the alcohol oxidase promoter from the yeast Pichia pastoris are particularly suitable for the expression of the thermophilic laccases according to the invention.
  • Signals for the transcription termination and in eukaryotes additionally contain signals for the polyadenylation in the expression vector and be functionally linked to the 3 'end of the laccase gene.
  • the expressed protein should preferably be secreted into the growth medium by the host organism. Secretion from the host organism is mediated by an N-terminal signal sequence.
  • the signal sequence is the natural signal sequence contained in the laccase gene or a heterologous signal sequence, the coding DNA of which is functionally linked in the expression vector to the 5 'end of the laccase gene.
  • alpha-cyclodextrin glucosyl transferase from Klebsieila oxytoca
  • subtilisin from Bacillus subtilis
  • alpha factor from Saccharomyces cerevisiae
  • acid phosphatase from Pichia pastoris
  • alpha-amylase from Aspergillus niger
  • glucoamylase from Aspergillus niger or Aspergillus awamori or the signal sequence naturally contained in the laccase gene.
  • the signal sequence naturally contained in the laccase gene and the following heterologous signal sequences are particularly suitable: the signal sequence of the glucoamylase from Aspergillus niger or from Aspergillus awamori, the signal sequence of the alpha factor from Saccharomyces cerevisiae and the acid phosphatase from Pichia pastoris.
  • the secretion of laccase can also be achieved by the expression of a fusion protein in which a gene for a secreted protein or for a secreted fragment of this protein is functionally linked to the laccase gene in the expression vector.
  • Expression of a fusion protein between an N-terminal fragment of the Aspergillus niger glucoamylase and the thermophilic laccase is particularly preferred here.
  • the linkage point between the glucoamylase and the laccase is preferably selected so that the amino acid sequence of this linkage point serves as a recognition site for a processing peptidase in the secretion apparatus of the host cell, the expressed fusion protein being cleaved in vivo and the laccase being released.
  • the expression vector preferably contains the gene for a selection marker.
  • the selection markers encoded by the gene can either confer resistance to an antibiotic to the host organism or complement a defect in the host organism.
  • Preferred selection markers are genes which confer resistance to antibiotics such as ampicillin, kanamycin, chloramphenicol, tetracycline, hygromycin, zeocin or bialaphos.
  • antibiotics such as ampicillin, kanamycin, chloramphenicol, tetracycline, hygromycin, zeocin or bialaphos.
  • a selection marker for the complementation of growth defects Genes such as amdS, pyrG, trpC, His4, niaD, argB, or hygB are preferred.
  • amdS and the pyrG gene as well as the His4 gene and the resistance gene for the antibiotic Zeocin are particularly suitable as selection markers.
  • the selection marker gene can be contained together with the laccase gene in one DNA molecule or both genes can be contained separately in different DNA molecules. In the latter case, the host organism is co-transformed with both DNA molecules.
  • the invention thus also relates to expression vectors which contain the DNA sequences according to the invention.
  • Suitable microorganisms for expression of the expression vectors according to the invention are preferably those of bacterial origin such as E. coli or Bacillus subtilis, microorganisms of eukaryotic origin such as yeasts of the genus Saccharomyces or Pichia, or filamentous fungi of the genus Aspergillus, Trichoderma, Neurospora or Schyzophillum cell culture or eukaryotic cell .
  • Baculovirus infected insect cells are preferably those of bacterial origin such as E. coli or Bacillus subtilis, microorganisms of eukaryotic origin such as yeasts of the genus Saccharomyces or Pichia, or filamentous fungi of the genus Aspergillus, Trichoderma, Neurospora or Schyzophillum cell culture or eukaryotic cell .
  • Filamentous mushrooms of the genus Aspergillus such as Aspergillus niger or Aspergillus awamori or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris are particularly suitable.
  • the proteins which are encoded by the DNA according to the invention have the following biochemical properties:
  • the proteins have the enzymatic activity of laccases.
  • the pH optimum of the enzyme activity is in the acidic range and is a maximum of pH 2.0, with half maximum enzyme activity at pH 4.0.
  • the enzyme stability at 45 ° C and a pH of 4.5 to 6.0 is 100% up to a period of 2 h.
  • the enzyme stability at 45 ° C and a pH of 3.0 is 50% up to a period of 1 h.
  • the temperature optimum is at a pH of 4.5 70 ° C. From 65 - 75 ° C the enzyme activity is still 80% of the maximum activity.
  • the enzyme stability at a pH of 4.5 and temperatures up to 55 ° C is 90% up to a period of 2 h.
  • the enzyme stability at a pH of 4.5 and a temperature of 65 ° C is 50% up to a period of 1 h.
  • the proteins according to the invention comprise the protein sequence SEQ ID NO: 3.
  • the protein according to the invention is preferably produced by expressing DNA sequences according to the invention in a microorganism mentioned above.
  • the DNA is preferably expressed in the microorganism using one of the expression vectors mentioned above.
  • the invention thus also relates to microorganisms which contain DNA sequences according to the invention or expression vectors according to the invention.
  • Combinations of microorganisms and expression systems are particularly preferably used which also enable the protein to be secreted from the microorganism. Examples of such preferred combinations are:
  • the signal sequence of the thermophilic laccase itself or the glucoamylase portion of the glucoamylase-laccase fusion protein is preferably used as the secretion signal in this expression system.
  • the signal sequence of the thermophilic laccase itself or the signal sequence of the alpha factor from Saccharomyces cerevisiae or else the signal sequence of the acidic phosphatase from Pichia pastoris is preferably used as the secretion signal in this expression system.
  • the proteins according to the invention are suitable for all applications known for laccases. They are particularly suitable for the delignification of pulp or the depolymerization of high-molecular aggregates. Laccases are also used in the deinking of waste paper, the polymerization of aromatic compounds in wastewater treatment, especially lignin-containing wastewater from cellulose bleaching, or in an extended application for the detoxification of contaminated soils. Further areas of application concern the oxidation of dyes or the activation of dyes by reaction with precursor components with pigment formation. Areas of application in organic synthesis include coupling reactions of aromatic compounds or the substituent oxidation of aromatics, here z. B.
  • the laccase can be used on its own in the corresponding reactions or else in combination with a reaction-enhancing mediator.
  • mediators are ABTS or N-hydroxybenzotriazole.
  • the invention thus also relates to the use of a protein according to the invention for the delignification of cellulose, the depolymerization of high molecular aggregates, the deinking of waste paper, the polymerisation of aromatic compounds in waste water, especially lignin-containing waste water from cellulose bleaching, the oxidation of dyes or the Activation of dyes for pigment formation, the use in organic synthesis in coupling reactions of aromatic compounds or the oxidation of aromatic side chains.
  • 1 shows the structure of the DNA vector pANlaclS.
  • 3 shows the structure of the DNA vector pL512.
  • Example 1 Production of a cDNA bank from Trametes versicolor TV-1
  • Trametes versicolor TV-1 strain was used. Trametes versicolor mycelium was first obtained by culturing for 7 days at 28 ° C on malt agar plates (3% malt extract, 0.3% peptone from soybean meal, 1.5% agar agar, pH 5.0). Three pieces were punched out of the malt agar plates and 100 ml of sterile malt extract medium (3% malt extract, 0.3% peptone from soybean meal, pH 5.0) were inoculated in 500 ml Erlenmeyer flasks. The culture was incubated with shaking at 100 rpm for 7 days at 28 ° C.
  • the mycelium suspension prepared in this way was sucked off through a porcelain suction filter, washed with 0.9% saline and the mycelium was frozen in liquid nitrogen and ground with a mortar and pestle.
  • RNS was isolated with an RNeasy kit (Qiagen). The yield from 200 mg mycelium was 100 ⁇ g RNA.
  • RNA 600 ⁇ g RNA was used to isolate mRNA. This was done by chromatography over Oligo-dT Sepharose (mRNA isolation kit, Pharmacia). The yield of mRNA was 26 ⁇ g. 7.25 ⁇ g of the isolated mRNA was used to synthesize cDNA. A cDNA synthesis kit from Stratagene was used for this. After separation by agarose gel electrophoresis, the cDNA was fractionated into a size range of 0.8-2.1 kb and a size range of 2.1-5 kb. The cDNA of both fractions was isolated from the agarose (Qiagen gel extraction kit) and used to prepare the cDNA library.
  • the cDNA bank was produced in lambda phages (Stratagene, ZAP Express cloning system). 4 ⁇ 10 5 phages / ⁇ g vector DNA were obtained from the 0.8-2.1 kb fraction. 1 ⁇ 10 phages / ⁇ g vector DNA were obtained from the 2.1-5 kb fraction. The phages obtained were amplified by infection of the E. coli strain XL-1 Blue MRF '(Stratagene). 2nd example
  • Trametes versicolor TV-1 mycelium was prepared as described in Example 1.
  • the mycelium was aspirated through a porcelain suction filter and washed with 0.9% saline, then frozen in liquid nitrogen, crushed with a mortar and pestle and divided into 1g portions.
  • 1 g each of the ground mycelium was taken up in a sterile sample vessel and immediately with 5 ml extraction solution (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.25 M NaCl, 0.6 mg / ml Proteinase K ) and 0.5 ml of a 10% (w / v) sodium lauroyl sarcosine solution.
  • the mixture was mixed with 0.85 ml of 5 M NaCl and 0.7 ml of a 10% (w / v) CTAB solution in 0.7 M NaCl and 30 min at 65 ° C incubated.
  • 7 ml of a chloroform-isoamyl alcohol mixture (24: 1) the mixture was shaken and the two phases were separated by centrifugation. The aqueous phase was removed and chromosomal DNA was precipitated by adding 0.6 parts by volume of isopropanol. The precipitated DNA was then purified on a column (Qiagen Genomic Tip). In this way, 0.5 mg of chromosomal DNA could be isolated from 16 g of mycelium.
  • chromosomal gene bank 90 ⁇ g of chromosomal DNA from Trametes versicolor TV-1 were completely cut with Eco RI and separated by agarose gel electrophoresis.
  • the chromosomal DNA fragments were isolated in the size range from 2 - 4 kb and from 4 kb - 10 kb and cloned in each case in lambda phages (Stratagene, ZAP Express cloning system). 1 ⁇ 10 phages / ⁇ g vector DNA were obtained from the 2–4 kb DNA fraction and 5.4 ⁇ 10 4 phages / ⁇ g vector DNA were obtained from the 4–10 kb DNA fraction.
  • the phages were amplified by infection of the E. coli strain XL-1 Blue MRF '. 3rd example
  • a DNA probe for isolating laccase genes was generated by PCR amplification from T. versicolor genomic DNA with degenerate primers.
  • the degenerate primers were constructed using a sequence comparison of known laccase genes. The amino acid sequences of the laccase genes from Neurospora crassa, Coriolus hirsutus, Phlebia radiata, Agaricus bisporus and an unspecified filamentous fungus from the subclass of Basidiomycetes contained in the EMBL gene database were compared. The sequence comparison identified four peptides with a length of 5 to 7 amino acids that were completely conserved in all laccases. Taking into account degenerate codons, these peptides were translated back into DNA to produce degenerate primers.
  • the primers had the following sequences:
  • a 5 '-TGGCAYGGNTTYTTYCA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • B 5 '-TCDATRTGRCARTG-3' (SEQ ID NO: 5)
  • C 5 '-ATTCAGGGATCCTGGTAYCAYWSNCAY-3' (SEQ ID NO: 6)
  • D 5 '-ATACGARNGTR -3 ' (SEQ ID NO: 7)
  • Primers C and D contained a Barn HI cleavage site (underlined) at the 5 'end and the corresponding degenerate laccase sequence was connected to them.
  • PCR amplifications were carried out in accordance with the prior art known to the person skilled in the art.
  • 200 ng of chromosomal T. versicolor DNA were used in a 100 ⁇ l PCR reaction, which also contained 1.25 U Taq polymerase, 1.25 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of the four dNTPs and each Contained 100 pmol of primers A and B.
  • the further conditions for the specific amplification of the desired PCR Product were: 5 min at 94 ° C, followed by 7 cycles of 0.5 min at 94 ° C, 1 min at 40 ° C and 2.5 min at 60 ° C, and 30 cycles of 0.5 min at 94 ° C, 1 min at 50 ° C and 2.5 min at 72 ° C.
  • 1 ⁇ l of the first PCR reaction was used in a second PCR reaction, which also contained 1.25 U Taq polymerase, 1.25 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of the four dNTPs and 100 pmol each of the primers C and D contained.
  • the other conditions for the specific amplification of the desired PCR product were: 5 min at 94 ° C, followed by 7 cycles of 0.5 min at 94 ° C, 1 min at 40 ° C and 2.5 min at 60 ° C as well 30 cycles of 0.5 min at 94 ° C, 1 min at 50 ° C and 2.5 min at 72 ° C.
  • a PCR product of approx. 1.1 kb was obtained.
  • the PCR product was purified by agarose gel electrophoresis, cut with the restriction enzyme barn HI and cloned into a pUC18 vector cut with Barn HI and E. coli transformed.
  • the plasmid was isolated from the cultivation of transformed E. coli. DNA sequence analysis from the 5 1 and 3 'end confirmed that the cloned DNA fragment was the fragment of a laccase gene.
  • the laccase-specific PCR fragment was cut out by treatment with Bam HI, isolated by agarose electrophoresis and radioactively labeled with ⁇ - [32P] -dATP ("Random
  • the cDNA gene bank from Trametes versicolor TV-1 described in the first example was used.
  • the screening for laccase cDNA genes was carried out according to the prior art. In In a first round of screening, cells from E. coli XL-1 Blue MRF 'were first cultured on 10 petri dishes and then infected with 50,000 phages from the cDNA library (0.8-2.1 kb fraction, see 1st example) per petri dish. After incubation at 37 ° C overnight, the newly formed phages were placed on nylon filters
  • the screening for chromosomal laccase genes in the chromosomal library of Trametes versicolor TV-1 described in the 2nd example (2-10 kb fraction, see 2nd example) was carried out analogously to the screening for cDNA clones described in the 4th example. Again, the radioactively labeled laccase-specific probe described in the 3rd example was used.
  • the hybridization temperature was 45 ° C. in a hybridization buffer with 50% formamide.
  • Trametes versicolor Laccase Lac5.5 cDNA was functionally linked to expression signals which are specific for filamentous fungi from the Aspergillus family.
  • the following gene expression elements from Aspergillus were used: a) The promoter for the glucoamylase gene (glaA) from Aspergillus niger (JC Verdoes, PJ Punt, JM Schrickx, HW van Verseveld, AH Stouthamer and CAMJJ van den Hondel Transgenic Research 2 (1993), 84 - 92).
  • glaA The promoter for the glucoamylase gene from Aspergillus niger (JC Verdoes, PJ Punt, JM Schrickx, HW van Verseveld, AH Stouthamer and CAMJJ van den Hondel Transgenic Research 2 (1993), 84 - 92).
  • glaA promoter followed by a DNA fragment coding for the signal sequence and a fragment of the mature glucoamylase.
  • Lac5.5 cDNA gene was cloned into the vector pUC19.
  • the Lac5.5 cDNA gene was isolated as a 1.9 kb Eco RI-Xba I fragment from the pBK CMV vector obtained in Example 1 and subcloned into the pUC19 vector precut with Eco RI and Xba I.
  • the resulting 4.6 kb plasmid was called pLac5.
  • Primer F 5 '-GAGAGGCCCGGGAGCCTGG-3' (SEQ ID NO: 10)
  • primer E Underlined in primer E is an example HI interface, in primer F an Sma I or Xma I interface.
  • the primers G and H were used to modify the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene.
  • Primer G 5 '-GCTGAATTCGAAGACATCCCCGACACCAAGG-3' (SEQ ID NO: 11)
  • Primer H 5 '-TGCTCTAGAAAGCTTAAGTTCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGG-3' (SEQ ID NO: 12)
  • primer G Underlined in primer G is a Bbs I interface, in primer H an Afl II interface.
  • a 188 bp fragment was amplified in the 5 'region of the Lac5.5 cDNA gene with the primers E and F by a PCR reaction. With the primers G and H was in the 3 'range of
  • Lac5.5 cDNA gene amplified a 110 bp fragment A 100 ⁇ l PCR mixture each contained 10 ng Lac5.5 cDNA (in the pBK CMV vector), 0.5 U Tth polymerase, 1.25 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of the four dNTPs and 140 pmol each of the primer pair E and F, or the primer pair G and H.
  • the PCR reaction was carried out under the following conditions: 5 min at 94 ° C., followed by 30 cycles of 1 min at 94 ° C., 2 min at 50 ° C. and 1 min at 72 ° C and finally 7 min at 72 ° C.
  • the DNA fragment from the PCR reaction with the primers E and F was first cut with Eco RI and Xma I and then purified by gel electrophoresis and cloned into the vector pLac5, which had previously been cut with Eco RI and Xma I. This resulted in the vector pLac51, in which a Bsp HI interface was introduced at the ATG codon of the translation start.
  • the DNA fragment from the PCR reaction with the primers G and H was first cut with Eco RI and Xba I and then purified by gel electrophoresis and cloned into a pUC19 vector precut with Eco RI and Xba I.
  • the approximately 100 bp insert with Bbs I and Xba I was cut out from the plasmid pLT5 formed in the process.
  • the Bbs I - Xba I fragment was finally cloned into the vector pLac51 cut with Bbs I and Xba I. This created the vector pLac513, which contained a new Afl II site at the 3 'end of the laccase cDNA gene.
  • the cDNA gene for the Trametes versicolor Laccase Lac5.5 with the modified 5 'and 3' regions was isolated by partial digestion of the plasmid pLac513 with Example HI. This resulted in a 2.6 kb fragment which contained the coding region of the Lac5.5 cDNA gene and approximately 1.1 kb of the pUC19 vector.
  • Fragment was cut in a second step with Afl II and the resulting 1.5 kb Lac5.5 cDNA fragment was isolated. This fragment was ligated into the 7.4 kb Afl II - Nco I fragment of the vector pAN52-12, which contains a 4.0 kb fragment of the glaA promoter from Aspergillus niger and a 0.7 kb fragment of the trpC transcription terminator from Aspergillus nidulans and the 2.7 kb fragment of the pUC18 vector contained. The resulting 8.8 kb vector was called pANlacl.
  • the glaA promoter region was functionally linked to the translation start ATG codon of the laccase cDNA gene via an Nco I - Bsp HI crossing.
  • B Linking of the Laccase Lac5.5 cDNA with the glaA promoter via an exchange of the N-terminal signal sequence for a fragment of the glucoamylase
  • Primer I 5 '-CCGGAATTCGATATCCAAGCGCGGGATCGGGCCTGTGCTCGAC-3' (SEQ ID NO: 13)
  • Primer I Underlined in Primer I is an Eco RV interface. Primers G and H were used to modify the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene (see Section A of this example).
  • a 110 bp fragment in the 5 'region of the Lac5.5 cDNA gene was amplified by a PCR reaction.
  • a 110 bp fragment was amplified with the primers G and H in the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene.
  • the PCR reactions were carried out as described in Section A of this example.
  • the DNA fragment from the PCR reaction with primers I and F was first cut with Eco RI and Xma I and then purified by gel electrophoresis and cloned into the vector pLac5, which had previously been cut with Eco RI and Xmal.
  • This sequence is a recognition site for the KEX2 protease.
  • the 3 'region of the laccase cDNA gene in the vector pLac52 was modified as described for the vector pLac51.
  • the plasmid pLT5 became about 100 bp
  • the cDNA gene for the Trametes versicolor Laccase Lac5.5 with the modified 5 'and 3' regions was obtained by cutting the plasmid pLac523 with Eco RV and Afl II and the resulting 1.5 kb Lac5.5 cDNA fragment was isolated after agarose gel electrophoresis. This fragment was ligated into the 9.3 kb Afl II - Eco RV fragment of the vector pAN56-9.
  • Vector pAN56-9 contained a 4.0 kb fragment of the Aspergillus niger glaA promoter, followed by a 2.0 kb fragment coding for a fragment of the Aspergillus niger glaA glucoamylase, a short DNA section for encoded four amino acids of the KEX2 cleavage site, a 0.7 kb fragment of the trpC transcription terminator from Aspergillus nidulans and the 2.7 kb fragment of the pUC18 vector.
  • the Eco RV and Afl II interfaces were arranged 3 'to the KEX2 cleavage site. After transformation into E. coli, a 10.8 kb vector was obtained, which was called pANlac2.
  • the coding region of the cDNA gene for the mature laccase Lac5.5 was linked to the coding region of the glucoamylase gene in such a way that, when expressed, first a fusion protein from a fragment of the glucoamylase including signal sequence, the recognition sequence for the KEX2 protease and the complete laccase Lac5.5 was created. During the secretion, this fusion protein is cleaved by the KEX2 protease and the mature laccase is secreted into the culture supernatant.
  • pANlacl and pANlac2 were linearized by digestion of 5 ⁇ g of the vectors each night with Not I. This was followed by treatment with alkaline phosphatase from calf intestine, extraction with phenol / chloroform and precipitation with ethanol.
  • the genes for the amdS (acetamidase) and pyrG selection markers (Orotidine-5 '-monophosphate decarboxylase) were contained on the plasmid pAN52-II, from which they could be isolated as a 6.4 kb fragment after digestion with Not I.
  • each of the linearized and phosphatase-treated vectors pANlacl and pANlac2 were ligated with 0.6 ⁇ g of the isolated Not I fragment and thus E. coli JM109 were transformed.
  • the plasmid DNA was prepared from ampicillin-resistant colonies from these transformations, cut with Not I and analyzed by agarose gel electrophoresis. 6 out of 8 clones analyzed from the transformation with the vector pANlacl and 5 out of 7 clones analyzed from the transformation with the vector pANlac2 contained the 6.4 kb Not I fragment.
  • the vectors equipped with the selection marker genes were designated as pANlaclS (size 15.3 kb, Fig.
  • Protoplasts from Aspergillus were obtained by treating the mycelium with Novozy ⁇ n 234.
  • mycelium from a flask was suspended in 15 ml of a freshly prepared and sterile-filtered solution of the lytic enzyme mixture Novozym 234 (Novo Nordisk) in OM medium (0.27 M calcium chloride, 0.6 M NaCl) .
  • the mycelium resuspended in the enzyme solution was used at low speed (80 rpm) Incubated for 1 to 3 h at 30 ° C. The formation of protoplasts was observed under the microscope during the incubation. Free moving protoplasts were usually seen after 1 h.
  • Protoplasts from Aspergillus niger and Aspergillus awamori were transformed with the plasmids pANlaclS and pANlac2S. Both plasmids contained the pyrG gene (coding for the orotidine 5'-phosphate decarboxylase) and the amdS gene (coding for acetamidase) as selection markers.
  • plasmids contained the pyrG gene (coding for the orotidine 5'-phosphate decarboxylase) and the amdS gene (coding for acetamidase) as selection markers.
  • 0.1 ml aliquots of the protoplasts were mixed with 10 ⁇ g plasmid DNA and incubated on ice for 25 min. Thereafter, 1.25 ml of a 60% PEG4000 solution (60% PEG4000, 50 mM calcium chloride, 10 mM
  • Tris-HCl, pH 7.5 Tris-HCl, pH 7.5 was added to the transformation mixture. After a further 20 min incubation at 20 ° C, the reaction vessels were filled with STC medium, mixed and centrifuged at 4 ° C for 10 min. The pellets were resuspended and plated on selective medium osmotically stabilized with sorbitol. The plates were incubated at 30 ° C for 7 days and checked for growth of colonies. The transformation rate from several experiments was 1 - 5 transformants / ⁇ g plasmid DNA for Aspergillus niger, 0.1 - 0.5 transformants / ⁇ g plasmid DNA for Aspergillus awamori.
  • Transformants were purified by inoculating on selective plates with acetamide. High copy number transformants were used identified by plating on selective plates with acrylamide. In contrast to acetamide, acrylamide is a poor substrate for the enzyme encoded by the amdS gene and can only support growth in transformants with a high copy number of the amdS gene.
  • Transformants that can functionally express laccase enzyme were identified by first plating on plates with maltodextrin, an inducer for the expression of the glaA promoter, and after two days of growth at 28 ° C. with ABTS agar (0.1% ABTS, 1 % Agarose, in Mclllvaine buffer, pH 4.5). Transformants expressing laccase were indicated by the formation of a green field. Spore suspensions were prepared from transformants which both showed good growth on acrylamide plates and reacted positively with ABTS in the activity test.
  • the following growth medium was used: A 5% (w / v) solution of maltodextrin in tap water was autoclaved for 20 minutes. Then 1 ml 1M IM MgSulfate, 0.5 ml 1000 x trace element solution, 10 ml 50 x Asp A solution and 5 ml 10% (w / v) casamino acids were added to 500 ml of this basic medium.
  • the 1000 x trace element solution had the following composition: 2.2 g of ZnS0 4 x 7 H 2 0, 1.1 g of H 3 B0 3 , 0.5 g of MnCl 2 x 4 H 2 0 .0 were dissolved in 80 ml of H 2 0.
  • the 50 ⁇ AspA solution had the composition: 150 g of NaNO 3 , 13 g of KC1, 38 g of KH 2 PO 4 , pH 5.5 with 10 M KOH were dissolved in 500 ml of H 2 O.
  • CuS0 4 x 5 H 0 was additionally added to the medium in a final concentration of 0.5 mM.
  • Substrate ABTS (0.1 mM in the test) was determined in Mclllvaine buffer pH 4.5 and at 37 ° C.
  • Mclllvaine buffer was prepared by titrating a 0.1 M citric acid solution to pH 4.5 with 0.2 M Na 2 HP0 4 solution. The increase in extinction was measured at 420 nm (extinction coefficient of ABTS at 420 nm: 3.6 x 10 4 1 x Mol x cm).
  • 1 U laccase activity was defined as 1 ⁇ mol ABTS substrate turnover / min.
  • a commercially available expression system from Invitrogen with the associated expression vectors (pPIC3 and pPIC9) and Pichia pastoris strains (GS115 and KM71) was used.
  • the Pichia pastoris strains GS115 and KM71 are histidine auxotrophic.
  • the expression vectors contained the promoter and terminator of the alcohol oxidase gene A0X1 from Pichia pastoris.
  • the cDNA gene of the Trametes versicolor Laccase Lac5.5 was cloned between these two genetic regulatory elements.
  • the vector pPIC9 located behind the AOX1 promoter, contained a DNA sequence which codes for the signal sequence of the alpha-factor protein from Saccharomyces cerevisiae, followed by a short section of DNA which is used for the recognition sequence Glu-Lys- Arg-Glu-Ala-Glu-Ala (Seq ID NO: 15).
  • the vectors contained the ampicillin resistance gene for selection in E. coli.
  • the vectors contained the HIS4 gene from Pichia pastoris.
  • A Construction of a Laccase Lac5.5 expression vector with the signal sequence of Laccase Lac5.5
  • the plasmid pLac5.5 and the primers K and L were used to amplify the laccase gene.
  • Primers F and G had the following sequence:
  • Primer K contained the sequence for an Eco RI interface (underlined) and then the DNA sequence for the first seven amino acids of the Laccase Lac5.5 signal sequence.
  • Primer L contained the sequence for a Not I interface (underlined) and connected to it, in complementary and reverse orientation, the translation stop codon and the DNA sequence for the last 7 amino acids of the Laccase Lac5.5.
  • PCR amplifications were carried out in accordance with the prior art known to the person skilled in the art. 20 ng pLac5.5 DNA were used in a 50 ⁇ l PCR reaction, which also contained 0.5 U vent polymerase, 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of the four dNTPs and 100 pmol each of the primers K and L.
  • the other conditions for the specific amplification of the desired PCR product were: 5 min at 94 ° C, followed by 25 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 2 min at 72 ° C. The expected PCR fragment of 1.5 kb size was obtained.
  • the PCR fragment was purified by agarose gel electrophoresis, cut with the restriction enzymes Eco RI and Not I, precipitated with ethanol and taken up in H 2 0.
  • the vector pPIC3 was cut with Eco RI and Not I, purified by agarose gel electrophoresis, isolated and treated with alkaline phosphatase. This was followed by extraction with phenol / chloroform (ratio 3: 1) and ethanol precipitation.
  • the pPIC3 vector prepared in this way was prepared by PCR amplification
  • Primer M had the following sequence:
  • Primer M 5 '-ACTCGAGAATTCGGGATCGGGCCTGTGCTCGACCTCACG-3' (SEQ ID NO: 18)
  • Primer M contained the sequence for an Eco RI interface (underlined) and then the DNA sequence for the first nine amino acids of the suspected N-terminus of the processed Laccase Lac5.5.
  • Laccase Lac5.5 was derived from the sequence comparison with other laccases.
  • the DNA fragment for the processed form of the laccase Lac5.5 was prepared, as described in section A of this example, by PCR amplification with pLac5.5 cDNA and the primers L and M.
  • the vector pPIC9 was generated with Eco RI and Not I cut and prepared as the pPIC3 vector described in section A of this example, ligated with the DNA fragment of laccase Lac5.5 produced by PCR amplification and thus transformed E. coli Top 10F 'cells (Invitrogen).
  • the plasmid DNA was isolated from ampicillin-resistant clones and the cloned 1.5 kb insert was identified by restriction digestion with Eco RI and Not I. Of the 12 clones examined, 3 were positive.
  • the vector thus obtained was named pL532 (Fig. 4).
  • Pichia pastoris strains GS115 and KM71 were first cultivated in 5 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) at 30 ° C. overnight. With 0.2 ml of this preculture, two main cultures of 250 ml of YPD medium were inoculated and again cultured at 30 ° C. overnight to an optical density (OD600 nm) of 1.3-1.5. The yeast cells of a 250 ml main culture were then centrifuged off (5 min 1500 xg), washed twice with 200 ml H 2 0 and once with 10 ml 1 M sorbitol and finally taken up in 0.5 ml 1 M sorbitol.
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose
  • Plasmid DNA of the vectors pL512 or pL532 were linearized either with Stu I or with Nsi I, precipitated with ethanol and taken up in H 2 0 at a concentration of 1 ⁇ g DNA / ⁇ l.
  • transformation approach contained 80 ⁇ l Pichia pastoris cells and 10 ⁇ g linearized vector DNA. Transformation was carried out by electroporation at 1500 V, 25 ⁇ F and 200 ohms (BioRad Gene Pulser). The discharge time was approximately 4.2 msec. The transformation mixture was mixed with 1 ml of 1 M sorbitol, incubated for 30 min on ice and then in 0.3 ml aliquots on MD plates without histidine (1.34% YNB, yeast nitrogen base, 4 x 10% biotin, 1% dextrose, 1.5% agar). Transformants appeared after 3-5 days incubation at 30 ° C. Transformants were cleaned by spreading twice on MD plates. Laccase producers were identified on MM indicator plates.
  • MM indicator plates contained 1.34% YNB, 4 x 10 "5 % biotin, 0.5% methanol, 1.5% agar, 1 mM ABTS and 0.1 mM Cu sulfate.
  • the inductor methanol was placed in the lid of the petri dishes and Renewed daily to ensure that the colonies were supplied with methanol by diffusion, and laccase producers produced a green yard after 2-3 days of incubation at 30 ° C.
  • BMGY medium 1% yeast extract, 2% peptone, 0.1 M K-phosphate, pH 6.0, 1.34% YNB, 4 x 10 "5 % biotin, 1% glycerin) were inoculated with a laccase-producing Pichia pastoris transformant and cultured on a shaker at 28 ° C. and 300 rpm for 48 h.
  • the cells of this preculture were isolated by centrifugation (10 min 1500 xg) and suspended in 10 ml main culture medium (MMY, 1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% YNB, 4 x 10% biotin, 3% methanol).
  • MMY medium was supplemented with 0.5 mM Cu sulfate and the main culture was further cultivated at room temperature and 300 rpm on a shaker.
  • the main culture was supplemented with methanol (0.3 ml / 10 ml medium) at intervals of 24 h.
  • the production of the recombinant Laccase Lac5.5 started after 24 h. Production rates of up to 4 U / ml were reached after 190 h after the start of the main culture.
  • Recombinant Laccase Lac5.5 was obtained by growing transformed Aspergillus strains in the shake flask as described in the 8th example. Culture supernatants containing Laccase Lac5.5 were concentrated by cross-flow filtration. Sartocon Micro Filtration Modules (Sartorius) with an exclusion limit of 30 kD were used. Concentrated Laccase Lac5.5 was then lyophilized and dissolved in 20 mM Na phosphate, pH 6.0. The activity of the concentrated recombinant laccase Lac5.5 was 18.6 U / ml.
  • laccase was dialyzed against 20 mM BisTris-HCl, pH 6.5. A conductivity of 1.5 mS / cm was then measured. Dialyzed laccase was then chromatographed on a column of DEAE Sepharose (Pharmacia), equilibrated in 20 mM BisTris-HCl (application buffer), pH 6.5. Under these conditions, the laccase binds to the DEAE Sepharose. When eluting with a linear gradient from 0 to 0.5 M NaCl in application buffer, the laccase activity was found again at a salt concentration of 0.15 M NaCl.
  • the laccase fraction from the DEAE Sepharose column was saturated with ammonium sulfate up to 20% as well mixed with Na acetate, pH 4.5 (final concentration 20 mM) and adjusted to pH 4.5 with acetic acid.
  • the laccase fraction thus prepared was then chromatographed on a column of phenylsepharose (Pharmacia), equilibrated in application buffer (20 mM Na acetate, pH 4.5, 20% saturated ammonium sulfate). Under these conditions, the laccase binds to the phenylsepharose.
  • the corresponding buffers were in each case mixed appropriately by unbuffered Na citrate and Na phosphate solutions.
  • the laccase activity at 37 ° C was then determined at the respective pH.
  • the Laccase Lac5.5 has an activity optimum in the strongly acidic range for the substrate ABTS.
  • Laccase Lac5.5 was in Mclllvaine buffer at pH 3, 0, 4.5 and
  • the laccase activity of the recombinant Laccase Lac5.5 was determined at the temperatures indicated in FIG. Laccase activity was determined with the ABTS test in Mclllvaine buffer, pH 4.5. It was surprisingly found that the temperature optimum of the Laccase Lac5.5 is 70 ° C. The temperatures at which half-maximum laccase activity was measured are between 50 ° C and 80 ° C.
  • Laccase Lac5.5 was pre-incubated in Mclllvaine buffer pH 4.5 at 45, 55 and 65 ° C. After 0, 30, 60 and 120 min aliquots were taken, diluted in Mclllvaine buffer at pH 4.5 and the laccase activity at 37 ° C determined. At 45 ° C the laccase activity was not affected by the pretreatment. At 55 ° C, 80% residual activity was measured after 120 min preincubation. At 65 ° C the half-life of the laccase was 60 min. (Fig.8). SEQUENCE LOG
  • thermophilic laccases Sequences encoded thermophilic laccases and their use
  • ACCATGCTTA AATCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG CACGAACTGG
  • CTCTACGATG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CCGATTGGTA CCATACTGCT
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • ATACTGCTGC CAAGCTTGGG CCGGCCTTCC CGTAAGTTGG ATTGTCAGTC TGTCTGTTCT 1320
  • CTACTTACTA ATCACGGGCT GCAGTCCTGG CTCTGATGCG ACGTTGATCA ATGGGCTCGG
  • GACTAGCACT TCATCTTTGA TGGTATGCTC ATGCAACTCT CCAGCCTGGC TCTGCTGTGT 1920 CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CGTACGTCCA ACTCACGATT 1980
  • GCAGACTGAC AACCCTGGCC CGTGGTTCCT CCACTGCCAC ATCGACTTCC ACTTGGAGGC 2520
  • CTATTTGCGA ACCCCCGCTC TCCCCTCTCT CACACTACGG TCCCTTCGTG AACATGGACT 2820
  • GCATGGTAGT GCCGCTGGCC TTTACCTCAA TCATTGTTAT CATGATATGG CCATCATAAA
  • ORGANISM Saccharomyces cerevisiae

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Abstract

Die Erfindung betrifft DNS-Sequenzen, die für Proteine mit Laccase-Aktivität kodieren und eine der DNS-Sequenzen (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2) umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Expression dieser DNS-Sequenzen, die durch die DNS-Sequenzen kodierte thermophilen Laccasen sowie deren Verwendung für die Delignifizierung von Zellstoff, die Depolymerisierung hochmolekularer Aggregate, das Deinking von Altpapier, die Polymerisierung aromatischer Verbindungen in Abwässern, vor allem von ligninhaltigen Abwässern aus der Zellstoffbleiche, die Oxidation von Farbstoffen, bzw. die Aktivierung von Farbstoffen zur Pigmentbildung, die Verwendung in der organischen Synthese bei Kopplungsreaktionen von aromatischen Verbindungen oder der Oxidation aromatischer Seitenketten.

Description

DNS-Sequenzen, Expression dieser DNS-Sequenzen, durch die DNS- Sequenzen kodierte thermophile Laccasen sowie deren Verwendung
Die Erfindung betrifft DNS-Sequenzen, die für Proteine mit Laccase-Aktivität kodieren, die Expression dieser DNS-Sequenzen, die durch die DNS-Sequenzen kodierten ther ophilen Laccasen sowie deren Verwendung.
Eine Enzymklasse, die für industrielle Anwendungen von großem Interesse ist, ist die Enzymklasse der Laccasen (p-Hydroxyphe- noloxidase, EC 1.10.3.2.). Laccasen gehören zur Proteinfamilie der sogenannten "blauen Kupferproteine" und enthalten in der Regel vier Kupferionen, die in drei, Typ 1 bis Typ 3 bezeich- neten Kupferzentren angeordnet sind. Laccasen zeichnen sich dadurch aus, daß es sich allgemein um sekretierte Proteine handelt und daß sie einen Glykosylierungsanteil von 10 bis 45 % des Molekulargewichts enthalten können. Laccasen besitzen eine sehr breite Substratspezifität für aromatische Verbindun- gen, die sie oxidieren. Die bei dieser Oxidation erzeugten
Elektronen werden verwendet um Sauerstoff zu reduzieren. Dabei entsteht Wasser. Die Funktion der Laccasen, die in Weißfäulepilzen vorkommen, besteht unter anderem im Ligninabbau. Daher stammt auch das Interesse, Laccasen bei der Papierherstellung zur Delignifizierung von Zellstoff einzusetzen.
Neben der Depolymerisierung von makromolekularen Verbindungen wie Lignin können Laccasen auch die Polymerisierung vor allem aromatischer Verbindungen katalysieren. Als Beispiel hierfür dient die Ligninbiosynthese in Pflanzen, bei der in Pflanzen vorkommende Laccasen beteiligt sind. Technische Anwendungsmöglichkeiten für Laccasen ergeben sich daher auch allgemein bei Polymerisierungsreaktionen aller Art, z.B. bei der Abwasserbehandlung. Die Verwendung von Laccasen ist auch in der organi- sehen chemischen Synthese bekannt, z.B. bei Kopplungsreaktionen oder der Seitenkettenoxidation von Aromaten. Für viele dieser potentiellen Anwendungen ist es jedoch von Nachteil, daß die meisten bekannten Laccasen mesophil sind, d. h. sie besitzen ein niedriges Temperaturoptimum und eine begrenzte Temperaturstabilität .
Voraussetzung für die technische Anwendung von Laccaseenzymen ist, daß sie kostengünstig hergestellt werden können. Dies ist im allgemeinen nur durch Verwendung rekombinant hergestellter Enzyme möglich. Verschiedene prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme stehen für die Proteinproduktion zur Verfügung. Beispiele prokaryontischer Expressionssysteme sind Escherichia coli und Bacillus subtilis. Eukaryontische Expressionssysteme mit breiter Anwendung sind Zellkultursysteme sowohl von Säugerzellen wie auch Insektenzellen sowie eukaryontische Mikroorganismen wie Hefen oder filamentöse Pilze.
In WO96/00290 werden fünf Laccasegene aus dem filamentösen Pilz der Unterklasse der Basidiomyceten, Polyporus pinsitus, beschrieben. Eines dieser Laccasegene (LCC1) wurde als rekom- binantes Protein hergestellt. Die thermophilen Eigenschaften dieses Enzyms wurden nicht weiter untersucht, die beschriebene Verwendung der LCC1 Laccase für Zwecke der Haarfärbung läßt darauf schließen, daß dieses Enzym einen mesophilen Charakter hat.
Die Herstellung einer rekombinanten Laccase mit thermophilen Eigenschaften aus dem filamentösen Pilz der Unterklasse der Deuteromyceten, Scytalidiu thermophilum wird in WO 95/33837 beschrieben. Von diesem Enzym ist nicht bekannt, ob es sich für die Zellstoffbleiche eignet.
Es wurde noch kein Verfahren für die Herstellung als rekombi- nantes Protein einer thermophilen Laccase aus einem filamentösen Pilz aus der Unterklasse der Basidiomyceten beschrieben.
In dem CA: AN 96-203142 werden verschiedene Charakteristika einer thermophilen Laccase offenbart. DNS oder Proteinsequenz dieses Proteins sind nicht genannt. Die Erfindung betrifft eine DNS-Sequenz, die für ein Protein mit Laccaseaktivität kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie die DNS-Sequenz SEQ ID NO : 1 ab Position 76 bis einschließlich Position 1572 oder SEQ ID NO : 2 ab Position 76 bis einschließ- lieh Position 1572 oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 80 % zu den genannten DNS-Sequenzen umfasst .
SEQ ID NO:l und SEQ ID NO : 2 geben von Position 1 bis Position 75 die DNS Sequenz kodierend für die Signalsequenz zur Sekretion des Proteins wieder. Diese Signalsequenz läßt sich gegen beliebige andere Signalsequenzen zur Proteinsekretion austauschen.
Die erfindungsgemäße DNS-Sequenz läßt sich beispielsweise durch Klonierung aus dem Basidiomycetenstamm Trametes versico- lor TV-1 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11523) erhalten. Dazu wird mittels an sich bekannter Methoden eine Genbank von Trametes versicolor TV-1 erstellt. Es kann sich dabei um eine cDNS- oder um eine genomische Genbank handeln.
Zur Isolierung der erfindungsgemäßen DNS-Sequenz in der Gen- bank werden DNS-Sonden verwendet, die laccasespezifische DNS- Sequenzen enthalten. Solche DNS-Sonden lassen sich beispielsweise mittels PCR-Reaktion unter Verwendung von DNS-Primern aus genomischer DNS von Trametes versicolor TV-1 gewinnen.
Als Primer werden degenerierte DNS Abschnitte einer Länge von vorzugsweise 14 bis 27 bp verwendet, deren Sequenz durch Sequenzvergleich bekannter Laccasegene festgelegt wird.
Die als Primer geeigneten DNS-Abschnitte erhält man vorzugs- weise durch Oligonukleotidsynthese der festgelegten DNS- Abschnitte. Die Isolation eines erfindungsgemäßen Laccasegens kann beispielsweise wie in den Beispielen 1 bis 5 beschrieben erfolgen.
Ein beispielsweise derart isoliertes Laccasegen läßt sich mittels dem Fachmann bekannter Techniken wie beispielsweise der site directed Mutagenese an jeweils gewünschter Position der Sequenz modifizieren. Daher ist auch eine DNS-Sequenz kodierend für ein Protein mit Laccaseaktivität umfassend eine DNS- Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 80 % zu der DNS- Sequenz SEQ ID NO:l ab Position 76 bis einschließlich Position 1572 oder SEQ ID NO : 2 ab Position 76 bis einschließlich Position 1572 von der Erfindung umfasst .
Zur Expression der erfindungsgemäßen DNS wird diese in an sich bekannter Art und Weise in einem Expressionsvektor kloniert, dieser das Laccasegen enthaltende Expressionsvektor in einen Mikroorganismus eingebracht und in dem Mikroorganismus exprimiert .
Bei dem Expressionsvektor kann es sich um ein DNS-Konstrukt handeln, das in das Genom des Wirtsorganismus integriert und zusammen mit diesem repliziert wird. Alternativ kann es sich bei dem Expressionsvektor um ein autonom replizierendes DNS- Konstrukt handeln, das nicht in das Wirtsgenom integriert, wie z.B. ein Plasmid, ein artifizielles Chromosom oder ein vergleichbares extrachromosomales genetisches Element.
Ein geeigneter Expressionsvektor sollte vorzugsweise folgende genetische Elemente enthalten:
Einen Promotor, der die Expression des Laccasegens in dem Wirtsorganismus vermittelt. Es sollte sich dabei vorzugsweise um einen starken Promotor handeln, damit eine hohe Expressi- onsleistung gewährleistet werden kann. Der Promotor ist vorzugsweise funktionell mit dem 5 ' -Ende des Laccasegens verknüpft . Vorzugsweise geeignete Promotoren sind ausgewählt aus der Gruppe tac-Promotor, Subtilisin-Promotor, GAL-Promotor, TAKA- Amylase-Promotor, Polyhedrin-Promotor, Glucoamylase-Promotor, gapDH-Promotor und Alkoholoxidase Promotor.
Vorzugsweise eignet sich der tac-Promotor für die Expression in E. coli, der Subtilisin-Promotor für die Expression in Bacillus, der GAL-Promotor für die Expression in der Hefe Sac- charomyces cerevisiae, der TAKA-Amylase-Promotor für die Ex- pression in Aspergillus niger, der Polyhedrin-Promotor für die Expression in Baculovirus-infizierten Insektenzellen, der Glucoamylase-Promotor aus Aspergillus niger oder der Alkoho- loxidase-Promotor aus der Hefe Pichia pastoris.
Insbesondere eignen sich der Glucoamylase-Promotor aus Aspergillus niger oder der Alkoholoxidase-Promotor aus der Hefe Pichia pastoris für die Expression der erfindungsgemäßen thermophilen Laccasen.
Ferner sollten vorzugsweise für den Wirtsorganismus passende
Signale für die Transkriptionstermination und in Eukaryonten zusätzlich Signale für die Polyadenylierung in dem Expressionsvektor enthalten und funktioneil mit dem 3 ' -Ende des Laccasegens verknüpft sein.
Vorzugsweise soll das exprimierte Protein durch den Wirtsorganismus in das Anzuchtsmedium sekretiert werden. Die Sekretion aus dem Wirtsorganismus wird durch eine N-terminale Signalsequenz vermittelt. Bei der Signalsequenz handelt es sich um die natürliche im Laccasegen enthaltene Signalsequenz oder um eine heterologe Signalsequenz, deren kodierende DNS im Expressions- vektor funktionell mit dem 5 ' -Ende des Laccasegens verknüpft ist .
Bevorzugt sind die Signalsequenzen folgender sekretierter Proteine: alpha-Cyclodextrin-Glucosyltransferase aus Klebsieila oxytoca, Subtilisin aus Bacillus subtilis, alpha-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae, saure Phosphatase aus Pichia pastoris, alpha-Amylase aus Aspergillus niger, Glucoamylase aus Aspergillus niger bzw. aus Aspergillus awamori oder die natürlich im Laccasegen enthaltene Signalsequenz.
Insbesondere eignet sich die natürlich im Laccasegen enthaltene Signalsequenz sowie folgende heterologe Signalsequenzen: Die Signalsequenz der Glucoamylase aus Aspergillus niger, bzw. aus Aspergillus awamori, die Signalsequenz des alpha-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae sowie der sauren Phosphatase aus Pichia pastoris.
Die Sekretion der Laccase kann auch durch die Expression eines Fusionsproteins erreicht werden, bei dem im Expressionsvektor ein Gen für ein sekretiertes Protein, bzw. für ein sekretier- tes Fragment dieses Proteins, funktioneil mit dem Laccasegen verknüpft ist. Insbesondere bevorzugt ist hier die Expression eines Fusionsproteins zwischen einem N-terminalen Fragment der Glucoamylase aus Aspergillus niger und der thermophilen Laccase .
Die Verknüpfungsstelle zwischen der Glucoamylase und der Laccase ist dabei vorzugsweise so gewählt, daß die Aminosäuresequenz dieser Verknüpfungsstelle als Erkennungsstelle für eine prozessierende Peptidase im Sekretionsapparat der Wirtszelle dient, wobei das exprimierte Fusionsprotein in vivo gespalten und die Laccase freigesetzt wird.
Des weiteren enthält der Expressionsvektor vorzugsweise das Gen für einen Selektionsmarker. Die durch das Gen kodierten Selektionsmarker können dem Wirtsorganismus entweder Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen oder einen Defekt im Wirtsorganismus komplementieren.
Bevorzugte Selektionsmarker sind Gene, die Resistenz gegen An- tibiotika wie Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol, Tetracy- clin, Hygromycin, Zeocin oder Bialaphos verleihen. Als Selektionsmarker für die Komplementation von Wachstumsdefekten sind Gene wie amdS, pyrG, trpC, His4, niaD, argB, oder hygB bevorzugt .
Insbesondere eignen sich als Selektionsmarker das amdS und das pyrG Gen sowie das His4 Gen und das Resistenzgen für das Antibiotikum Zeocin.
Das Selektionsmarkergen kann dabei zusammen mit dem Laccasegen in einem DNS-Molekül enthalten sein oder beide Gene können ge- trennt in verschiedenen DNS-Molekülen enthalten sein. Im letzteren Fall wird der Wirtsorganismus mit beiden DNS-Molekülen gemeinsam cotransformiert .
Die Erfindung betrifft somit auch Expressionsvektoren die er- findungsgemäße DNS-Sequenzen enthalten.
Als Mikroorganismen zur Expression der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren eignen sich vorzugsweise solche bakteriellen Ursprungs wie E. coli oder Bacillus subtilis, Mikroorganismen eukaryontisehen Ursprungs wie Hefen der Gattung Saccharomyces oder Pichia, oder aber filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, Trichoderma, Neurospora oder Schyzophillum oder eukaryontische Zellkulturen wie z. B. mit Baculoviren infizierte Insektenzellen .
Insbesondere eignen sich filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus wie Aspergillus niger oder Aspergillus awamori oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris.
Die Proteine, die durch die erfindungsgemäße DNS kodiert werden haben folgende biochemischen Eigenschaften:
Die Proteine besitzen die enzymatische Aktivität von Laccasen. Das pH-Optimum der Enzymaktivität liegt im sauren Bereich und ist maximal bei pH 2.0, mit halbmaximaler Enzymaktivität bei pH 4.0.
Die Enzymstabilität bei 45°C und einem pH von 4.5 bis 6.0 beträgt bis zu einer Zeitdauer von 2 h 100 %. Die Enzymstabilitat bei 45°C und einem pH von 3.0 beträgt bis zu einer Zeitdauer von 1 h 50 %.
Das Temperaturoptimum beträgt bei einem pH von 4.5 70°C. Von 65 - 75°C beträgt die Enzymaktivität noch 80 % der maxima- len Aktivität.
Von 50 - 80°C beträgt die Enzyτnaktivität noch 50 % der maximalen Aktivität.
Die Enzymstabilität bei einem pH von 4.5 und Temperaturen bis zu 55°C beträgt bis zu einer Zeitdauer von 2 h 90 %. Die Enzymstabilitat bei einem pH von 4.5 und einer Temperatur von 65°C beträgt bis zu einer Zeitdauer von 1 h 50 %.
Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen die Proteinsequenz SEQ ID NO: 3.
Das erfindungsgemäße Protein wird vorzugsweise durch Expression erfindungsgemäßer DNS-Sequenzen in einem vorstehend genannten Mikroorganismus hergestellt.
Vorzugsweise wird die DNS unter Verwendung eines der vorstehend genannten Expressionsvektoren im Mikroorganismus exprimiert .
Die Erfindung betrifft somit auch Mikroorganismen, die erfin- dungsgemäße DNS-Sequenzen oder erfindungsgemäße Expressionsvektoren enthalten.
Besonders bevorzugt werden Kombinationen von Mikroorganismen und Expressionssystemen verwendet, die auch die Sekretion des Proteins aus dem Mikroorganismus ermöglichen. Beispiele für solche bevorzugten Kombinationen sind:
Die Verwendung des Glucoamylase Promoters zur Expression der erfindungsgemäßen DNS-Sequenzen in Aspergillus niger oder As- pergillus awamori. Als Sekretionssignal in diesem Expressionssystem dient vorzugsweise die Signalsequenz der thermophilen Laccase selbst oder der Glucoamylaseanteil des Glucoamylase- Laccase-Fusionsproteins . Die Verwendung des Alkoholoxidasepromotors zur Expression der erfindungsgemäßen DNS Sequenzen in Pichia pastoris. Als Sekretionssignal in diesem Expressionssystem dient vorzugsweise die Signalsequenz der thermophilen Laccase selbst oder die Signal- sequenz des alpha-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae oder aber die Signalsequenz der sauren Phosphatase aus Pichia pastoris .
Die erfindungsgemäßen Proteine eignen sich für alle Anwendungen die für Laccasen bekannt sind. Insbesondere eignen sie sich für die Delignifizierung von Zellstoff bzw. die Depolyme- risierung von hochmolekularen Aggregaten. Weitere Verwendung finden Laccasen beim Deinking von Altpapier, der Polymerisie- rung von aromatischen Verbindungen bei der Abwasserreinigung, hier vor allem von ligninhaltigen Abwässern aus der Zellstoffbleiche oder in einer erweiterten Anwendung bei der Entgiftung von verseuchten Böden. Weitere Einsatzgebiete betreffen die Oxidation von Farbstoffen bzw. die Aktivierung von Farbstoffen durch Reaktion mit Vorstufenkomponenten unter Pigmentbildung. Einsatzgebiete in der organischen Synthese umfassen Kopplungsreaktionen von aromatischen Verbindungen oder die Substituen- tenoxidation von Aromaten, hier z. B. die Oxidation von Ben- zylalkoholen zu den entsprechenden Aldehyden unter Vermeidung der weiteren Oxidation zur Carbonsäure. Bei den o. g. Verwendungen kann die Laccase für sich allein genommen in die entsprechenden Reaktionen eingesetzt werden oder aber auch durch Kombination mit einem reaktionsverstärkenden Mediator. Beispiele für solche Mediatoren sind ABTS oder N-Hydroxybenzotriazol .
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins für die Delignifizierung von Zellstoff, die Depolymerisierung hochmolekularer Aggregate, das Deinking von Altpapier, die Polymerisierung aromatischer Verbindungen in Abwässern, vor allem von ligninhaltigen Abwässern aus der Zellstoffbleiche, die Oxidation von Farbstoffen, bzw. die Aktivierung von Farbstoffen zur Pigmentbildung, die Verwendung in der organischen Synthese bei Kopplungsreaktionen von aromatischen Verbindungen oder der Oxidation aromatischer Seitenketten .
Die o. g. Verwendungen können durch Einsatz der erfindungsgemäßen Laccaseproteine für sich allein genommen oder aber durch Kombination mit einem reaktionsverstärkenden Mediator ausgeführt werden.
Fig. 1 zeigt die Struktur des DNS-Vektors pANlaclS.
Fig. 2 zeigt die Struktur des DNS-Vektors pANlac2S.
Fig. 3 zeigt die Struktur des DNS-Vektors pL512.
Fig. 4 zeigt die Struktur des DNS-Vektors pL532.
Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit der Aktivität einer erfindungsgemäßen Laccase vom pH.
Fig. 6 zeigt die pH-Stabilität der erfindungsgemäßen Laccase.
Fig. 7 zeigt die Abhängigkeit der Aktivität einer erfindungs- gemäßen Laccase von der Temperatur.
Fig. 8 zeigt die Temperaturstabilität der erfindungsgemäßen Laccase .
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die in den Beispielen verwendeten Standardmethoden zur Behandlung von DNS oder RNS, wie die Behandlung mit Re- striktionsendonukleasen, DNS Polymerasen, Reverser Transkrip- tase etc. sowie die Standardverfahren wie Transformation von Bakterien, Southern und Northern Analyse, DNS-Sequenzierung, radioaktive Markierung, Screening und PCR-Technologie wurden, wenn nicht anders angegeben, durchgeführt wie vom Hersteller der verwendeten Kits empfohlen oder, wenn keine Herstelleranleitung vorhanden war, entsprechend dem aus den Standardlehrbüchern bekannten Stand der Technik.
1. Beispiel: Herstellung einer cDNS-Bank aus Trametes versicolor TV-1
Es wurde der Stamm Trametes versicolor TV-1 verwendet. Mycel von Trametes versicolor wurde zuerst durch Anzucht für 7 Tage bei 28 °C auf Malzagarplatten (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, 1,5 % Agar-Agar, pH 5,0) gewonnen. Von den Malzagarplatten wurden drei Stücke ausgestanzt und damit 100 ml steriles Malzextrakt Medium (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, pH 5,0) in 500 ml Erlenmeyerkolben angeimpft. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 100 rpm für 7 Tage bei 28°C inkubiert. Die auf diese Weise hergestellte Mycelsus- pension wurde über eine Porzellannutsche abgesaugt, mit 0,9 % Saline gewaschen und das Mycel in flüssigem Stickstoff gefroren und mit Mörser und Pistill zerkleinert. RNS wurde mit einem RNeasy-Kit (Qiagen) isoliert. Die Ausbeute aus 200 mg My- cel betrug 100 μg RNS.
600 μg RNS wurden verwendet, um mRNS zu isolieren. Dies erfolgte durch Chromatographie über Oligo-dT Sepharose (mRNA- Isolierungskit , Pharmacia) . Die Ausbeute an mRNS betrug 26 μg . 7,25 μg der isolierten mRNS wurden zur Synthese von cDNS verwendet. Dazu wurde ein cDNS-Synthesekit der Fa. Stratagene verwendet. Die cDNS wurde nach Auftrennung durch Agarose Gelelektrophorese fraktioniert in einen Größenbereich von 0,8 - 2,1 kb und einen Größenbereich von 2,1 - 5 kb. Die cDNS beider Fraktionen wurde aus der Agarose isoliert (Qiagen Gelextraktionskit) und zur Herstellung der cDNS-Bank verwendet. Die cDNS- Bank wurde in Lambda-Phagen hergestellt (Stratagene, ZAP Express Klonierungssystem) . Von der 0,8 - 2,1 kb Fraktion wurden 4 x 105 Phagen/μg Vektor-DNS erhalten. Von der 2,1 - 5 kb Fraktion wurden 1 x 10 Phagen/μg Vektor-DNS erhalten. Die erhaltenen Phagen wurden durch Infektion des E. coli Stammes XL-1 Blue MRF' (Stratagene) amplifiziert . 2 . Beispiel
Herstellung einer chromosomalen Genbank von Trametes versicolor
Mycel von Trametes versicolor TV-1 wurde hergestellt wie im 1. Beispiel beschrieben. Das Mycel wurde über eine Porzellannut- sche abgesaugt und mit 0,9% Saline gewaschen, anschließend in flüssigem Stickstoff gefroren, mit Mörser und Pistill zerklei- nert und in lg Portionen aufgeteilt. Je 1 g des zerriebenen Mycels wurden in einem sterilen Probengefäß aufgenommen und sofort mit 5 ml Extraktionslösung (0,1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 M EDTA, 0,25 M NaCl , 0,6 mg/ml Proteinase K) und 0 , 5 ml einer 10 % (w/v) Natriumlauroylsarcosinlösung versetzt. Nach Inkubation bei 50 °C für mindestens 2 h wurde das Gemisch mit 0,85 ml 5 M NaCl und 0 , 7 ml einer 10 % (w/v) CTAB-Lösung in 0,7 M NaCl versetzt und 30 min bei 65°C inkubiert. Nach Zugabe von 7 ml eines Chloroform-Isoamylalkoholgemisches (24:1) wurde der Ansatz geschüttelt und die beiden Phasen durch Zentrifuga- tion getrennt. Die wassrige Phase wurde entfernt und chromoso- male DNS durch Zugabe von 0,6 Volumenanteilen Isopropanol gefällt. Die gefällte DNS wurde anschließend über eine Säule (Qiagen Genomic Tip) gereinigt. Auf diese Weise konnten aus 16 g Mycel 0 , 5 mg chromosomale DNS isoliert werden.
Zur Herstellung der chromosomalen Genbank wurden 90 μg chromosomale DNS von Trametes versicolor TV-1 vollständig mit Eco RI geschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese aufgetrennt . Die chromosomalen DNS-Fragmente wurden im Größenbereich von 2 - 4 kb und von 4 kb - 10 kb isoliert und jeweils in Lambda- Phagen kloniert (Stratagene, ZAP Express Klonierungssystem) . Von der 2 - 4 kb DNS-Fraktion wurden 1 x 10 Phagen/μg Vektor- DNS und von der 4 - 10 kb DNS-Fraktion wurden 5.4 x 104 Pha- gen/μg Vektor-DNS erhalten. Die Phagen wurden durch Infektion des E. coli Stammes XL-1 Blue MRF ' amplifiziert . 3 . Beispiel
Herstellung einer Laccase-spezifischen DNS-Sonde aus genomischer DNS von Trametes versicolor
Eine DNS-Sonde zur Isolierung von Laccasegenen wurde durch PCR-Amplifikation aus T. versicolor genomischer DNS mit degenerierten Primern erzeugt . Die degenerierten Primer wurden anhand eines Sequenzvergleichs bekannter Laccasegene konstruiert . Es wurden die Aminosäuresequenzen der in der EMBL Gen- datenbank enthaltenen Laccasegene von Neurospora crassa, Co- riolus hirsutus, Phlebia radiata, Agaricus bisporus und eines nicht näher charakterisierten filamentösen Pilzes aus der Unterklasse der Basidiomyceten verglichen. Durch den Sequenzvergleich konnten vier Peptide mit einer Länge von 5 bis 7 Ami- nosäuren identifiziert werden, die in allen Laccasen vollständig konserviert waren. Unter Berücksichtigung degenerierter Codons wurden diese Peptide in DNA zurück übersetzt, um degenerierte Primer herzustellen. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
A 5 ' -TGGCAYGGNTTYTTYCA-3 ' (SEQ ID NO : 4 ) B 5 ' -TCDATRTGRCARTG-3 ' (SEQ ID NO : 5 ) C 5 ' -ATTCAGGGATCCTGGTAYCAYWSNCAY-3 ' (SEQ ID NO: 6) D 5 ' -ATACGAGGATCCRTGNCCRTGNARRTG-3 ' (SEQ ID NO : 7 )
Primer C und D enthielten am 5 ' -Ende eine Barn HI Schnittstelle (unterstrichen) und daran angeschlossen jeweils die entsprechende degenerierte Laccasesequenz .
Genomische DNS von T. versicolor wurde aus dem Mycel einer
Schüttelkolbenkultur isoliert wie im 2. Beispiel beschrieben. PCR-Amplifikationen wurden nach dem für den Fachmann geläufigen Stand der Technik durchgeführt. In einer ersten PCR-Reak- tion wurden 200 ng chromosomaler T. versicolor DNS in einer 100 μl PCR Reaktion eingesetzt, die darüberhinaus 1,25 U Taq Polymerase, 1,25 mM MgCl2, je 0,2 mM der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer A und B enthielt. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR- Produkts waren: 5 min bei 94°C, gefolgt von 7 Zyklen von 0,5 min bei 94°C, 1 min bei 40°C und 2,5 min bei 60°C sowie 30 Zyklen von 0,5 min bei 94°C, 1 min bei 50°C und 2,5 min bei 72 °C. 1 μl der ersten PCR-Reaktion wurden in einer zweiten PCR-Reaktion eingesetzt, die darüberhinaus 1,25 U Taq Polyme- rase, 1,25 mM MgCl2, je 0,2 mM der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer C und D enthielt . Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 5 min bei 94°C, gefolgt von 7 Zyklen von 0,5 min bei 94°C, 1 min bei 40°C und 2,5 min bei 60°C sowie 30 Zyklen von 0,5 min bei 94°C, 1 min bei 50°C und 2,5 min bei 72°C. Es wurde ein PCR-Produkt von ca. 1 , 1 kb erhalten. Das PCR-Produkt wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt, mit dem Restriktionsenzym Barn HI geschnitten und in einen mit Barn HI geschnit- tenen pUC18 Vektor kloniert und E. coli transformiert. Aus der Anzucht transformierter E. coli wurde das Plasmid isoliert. DNS-Sequenzanalyse vom 51- und 3 ' -Ende bestätigte, daß es sich bei dem klonierten DNS-Fragment um das Fragment eines Laccasegens handelte.
Zur Vorbereitung der DNS-Sonde für das Screening von Laccase- genen wurde das Laccase-spezifische PCR-Fragment durch Behandlung mit Bam HI ausgeschnitten, über Agarose-Elektrophorese isoliert und mit α- [ 32P] -dATP radioaktiv markiert ("Random
Priming" Kit, Boehringer Mannheim) . Freie Radioaktivität wurde durch Chromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia) abgetrennt. Die spezifische Aktivität der radioaktiv markierten DNS-Sonde betrug 1 x 107 cpm/μg DNS.
4. Beispiel
Isolierung des cDNS-Gens einer Laccase aus Trametes versicolor
TV-1
Es wurde die im 1. Beispiel beschriebene cDNS Genbank von Trametes versicolor TV-1 verwendet. Das Screening nach Laccase cDNS-Genen wurde nach dem Stand der Technik durchgeführt. In einer ersten Screeningrunde wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue MRF ' auf 10 Petrischalen zuerst kultiviert und dann mit 50000 Phagen der cDNS-Bank (0,8 - 2,1 kb Fraktion, siehe 1. Beispiel) pro Petrischale infiziert. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die neu gebildeten Phagen auf Nylonfilter
(Stratagene) transferiert. Die Filter wurden dann entsprechend den Empfehlungen des Herstellers mit der radioaktiv markierten Laccase-spezifischen Sonde (siehe 3. Beispiel) hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur betrug 45°C in einem Hybridisie- rungspuffer mit 50% Formamidgehalt. Positive Klone wurden gepickt und durch Wiederholung des Screeningverfahrens gereinigt. Nach drei Runden der Vereinzelung wurden bei dem Screening 20 stark hybridisierende Phagenklone isoliert, die nach einer Vorschrift des Herstellers (Stratagene) durch "in vivo excision" in den pBK CMV Vektor (Stratagene) umkloniert wurden. Analyse der Klone durch Verdau mit Restriktionsendo- nucleasen und DNS-Sequenzierung ergab, daß zwei Laccasegene isoliert worden waren, die auf DNS-Ebene fast identisch waren. Die vollständige DNS-Sequenzierung der beiden Klone ergab, daß es sich um Allele eines Laccasegens handelte, deren Aminosäuresequenz identisch war. Die beiden Laccase cDNS-Gene erhielten die Bezeichnung Lac5.5 und Lac5.6. Entsprechend wurden die Plasmide mit den beiden Laccase cDNS-Genen pLac5.5 und pLac5.6 bezeichnet .
5. Beispiel
Isolierung des chromosomalen Gens einer Laccase aus Trametes versicolor TV-1
Das Screening nach chromosomalen Laccasegenen in der im 2. Beispiel beschriebenen chromosomalen Genbank von Trametes versicolor TV-1 (2 - 10 kb Fraktion, siehe 2. Beispiel) erfolgte analog dem im 4. Beispiel beschriebenen Screening nach cDNS- Klonen. Es wurde wiederum die im 3. Beispiel beschriebene, radioaktiv markierte Laccase-spezifische Sonde verwendet. Die Hybridisierungstemperatur betrug 45 °C in einem Hybridisie- rungspuffer mit 50% Formamidgehalt. Bei dem Screening wurden drei stark hybridisierende Phagenklone isoliert, die nach einer Vorschrift des Herstellers (Stratagene) durch "in vivo excision" in den pBK CMV Vektor (Stratagene) umkloniert wurden. Analyse mit Restriktionsendonucleasen führte zu dem Schluß, daß alle drei Klone identisch waren und eine Länge von ca. 7 kb hatten. Analyse durch DNS-Sequenzierung ergab, daß alle drei Klone dem chromosomalen Gen der Laccase Lac5.6 entsprachen. Es wurden der codierende Bereich eines Klons und jeweils ca. 1 kb flankierende Sequenz im 5 ' - und im 3 ' -Bereich sequenziert. (SEQ ID NO: 8)
6. Beispiel
Herstellung von DNS-Konstrukten für die Expression von Laccase
Lac5.5 in Aspergillus
cDNS der Trametes versicolor Laccase Lac5.5 wurde mit Expressionssignalen funktioneil verknüpft, die spezifisch für filamentöse Pilze aus der Familie Aspergillus sind. Folgende Genexpressionselemente aus Aspergillus wurden verwendet: a) Der Promotor für das Glucoamylase Gen (glaA) aus Aspergillus niger ( J.C. Verdoes, P.J. Punt , J.M. Schrickx, H.W. van Verseveld, A.H. Stouthamer und C.A.M.J.J. van den Hondel Transgenic Research 2 (1993), 84 - 92). b) Der glaA Promotor gefolgt von einem DNS-Fragment, das für die Signalsequenz und ein Bruchstück der reifen Glucoamylase kodiert. Daran angeknüpft wurde eine DNS-Sequenz, die für die Spaltstelle der KEX2-Protease kodiert (M.P. Broekhuij sen, I.E. Mattern, R. Contreras, J. R. Kinghorn, C.A.M.J.J. van den Hondel (1993), J. Biotechnol. 3., 135-145). c) der Transkriptionsterminator des trpC Gens aus Aspergillus nidulans (E. J. Mullaney, J. E. Hamer, M. M. Yelton und W. E. Timberlake (1985), Mol. Gen. Genet . 19 , 37-45). Für die funktioneile Verknüpfung der Lac5.5 cDNS mit den As- pergillus-Expressionssignalen war es jedoch zuerst notwendig, die 5'- und 3 ' -Bereiche des Lac5.5 cDNS Gens zu modifizieren.
A: Verknüpfung der Laccase Lac5.5 cDNS mit dem glaA Promotor: Für die weitere Bearbeitung wurde das Lac5.5 cDNS Gen in den Vektor pUC19 umkloniert . Dazu wurde das Lac5.5 cDNS Gen als 1,9 kb Eco Rl-Xba I Fragment aus dem im 1. Beispiel erhaltenen pBK CMV Vektor isoliert und in den mit Eco RI und Xba I vorgeschnittenen pUC19 Vektor subkloniert. Das dabei entstandene 4.6 kb Plasmid wurde pLac5 genannt .
Zur Modifizierung des Start-ATG Kodons des Lac5.5 cDNS Gens wurden die Primer E und F verwendet .
Primer E: 5 ' -CCGGAATTCATGACTGGGCTGCGTCTCCTTCCTTCCTTC-3 ' (SEQ
ID NO: 9)
Primer F: 5 ' -GAGAGGCCCGGGAGCCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 10)
Unterstrichen in Primer E ist eine Bsp HI Schnittstelle, in Primer F eine Sma I, bzw. Xma I Schnittstelle.
Zur Modifizierung des 3 ' -Bereiches des Lac5.5 cDNS Gens wurden die Primer G und H verwendet .
Primer G: 5 ' -GCTGAATTCGAAGACATCCCCGACACCAAGG-3 ' (SEQ ID NO: 11) Primer H: 5 ' -TGCTCTAGAAAGCTTAAGTTCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGG-3 ' (SEQ ID NO: 12)
Unterstrichen in Primer G ist eine Bbs I Schnittstelle, in Primer H eine Afl II Schnittstelle.
Mit den Primern E und F wurde im 5 ' -Bereich des Lac5.5 cDNS Gens ein 188 bp großes Fragment durch eine PCR-Reaktion ampli- fiziert. Mit den Primern G und H wurde im 3 ' -Bereich des
Lac5.5 cDNS Gens ein 110 bp großes Fragment amplifiziert . Ein 100 μl PCR-Ansatz enthielt jeweils 10 ng Lac5.5 cDNS (im pBK CMV-Vektor) , 0,5 U Tth Polymerase, 1,25 mM MgCl2, je 0,2 mM der vier dNTPs und je 140 pmol des Primerpaares E und F, bzw. des Primerpaares G und H. Die PCR-Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 5 min bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 1 min bei 94°C, 2 min bei 50°C und 1 min bei 72°C und schließlich 7 min bei 72 °C. Das DNS-Fragment aus der PCR-Reaktion mit den Primern E und F wurde zuerst mit Eco RI und Xma I geschnitten und anschließend durch Gelelektrophorese gereinigt und in den Vektor pLac5 kloniert, der vorher mit Eco RI und Xma I geschnitten worden war. Dabei entstand der Vektor pLac51, bei dem am ATG-Codon des Translationsstarts eine Bsp HI Schnittstelle eingeführt wurde .
Das DNS-Fragment aus der PCR-Reaktion mit den Primern G und H wurde zuerst mit Eco RI und Xba I geschnitten und anschließend durch Gelelektrophorese gereinigt und in einen mit Eco RI und Xba I vorgeschnittenen pUC19 Vektor kloniert. Aus dem dabei entstanden Plasmid pLT5 wurde das ca. 100 bp große Insert mit Bbs I und Xba I herausgeschnitten. Das Bbs I - Xba I Fragment wurde schließlich in den mit Bbs I und Xba I geschnittenen Vektor pLac51 kloniert. Dadurch entstand der Vektor pLac513, der am 3 ' -Ende des Laccase cDNS Gens eine neue Afl II Schnittstelle enthielt.
Das cDNS Gen für die Trametes versicolor Laccase Lac5.5 mit den modifizierten 5 ' - und 3 ' -Bereichen wurde isoliert durch Partialverdau des Plasmids pLac513 mit Bsp HI. Dabei entstand ein 2,6 kb Fragment, das den kodierenden Bereich des Lac5.5 cDNS Gens und ca. 1 , 1 kb des pUC19 Vektors enthielt. Dieses
Fragment wurde in einem zweiten Schritt mit Afl II geschnitten und das dabei entstandene 1,5 kb große Lac5.5 cDNS Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in das 7,4 kb große Afl II - Nco I Fragment des Vektors pAN52-12 ligiert, der ein 4,0 kb großes Fragment des glaA Promotors aus Aspergillus niger, ein 0,7 kb großes Fragment des trpC Transkriptionsterminators aus Aspergillus nidulans und das 2,7 kb große Fragment des pUC18 Vektors enthielt. Der dabei entstandene 8,8 kb große Vektor wurde pANlacl genannt. In pANlacl war die glaA Promotorregion über eine Nco I - Bsp HI Kreuzung funktioneil mit dem Translationsstart ATG-Kodon des Laccase cDNS Gens verknüpft. B: Verknüpfung der Laccase Lac5.5 cDNS mit dem glaA Promotor über einen Austausch der N-terminalen Signalseguenz gegen ein Fragment der Glucoamylase
Für die Modifizierung des für den N-Terminus der reifen Laccase Lac5.5 kodierenden Bereichs des cDNS Gens wurden die Primer I und F verwendet .
Primer I: 5 ' -CCGGAATTCGATATCCAAGCGCGGGATCGGGCCTGTGCTCGAC-3 ' (SEQ ID NO: 13)
Unterstrichen in Primer I ist eine Eco RV Schnittstelle. Zur Modifizierung des 3 ' -Bereiches des Lac5.5 cDNS Gens wurden die Primer G und H verwendet (siehe Abschnitt A dieses Beispiels) .
Mit den Primern I und F wurde im 5 ' -Bereich des Lac5.5 cDNS Gens ein 110 bp großes Fragment durch eine PCR-Reaktion ampli- fiziert. Mit den Primern G und H wurde im 3 ' -Bereich des Lac5.5 cDNS Gens ein 110 bp großes Fragment amplifiziert . Die PCR-Reaktionen wurden, wie in Abschnitt A dieses Beispiels beschrieben, durchgeführt.
Das DNS-Fragment aus der PCR-Reaktion mit den Primern I und F wurde zuerst mit Eco RI und Xma I geschnitten und anschließend durch Gelelektrophorese gereinigt und in den Vektor pLac5 kloniert, der vorher mit Eco RI und Xmal geschnitten worden war. Dabei entstand der Vektor pLac52, bei dem im 5 ' -Bereich vor dem Kodon für die erste Aminosäure des reifen Laccaseproteins eine Eco RV Schnittstelle gefolgt von den Kodons für die Aminosäuren der Sequenz Ile Ser Lys Arg (Seq ID NO: 14) eingeführt worden waren. Diese Sequenz ist eine Erkennungsstelle für die KEX2 Protease . Der 3 ' -Bereich des Laccase cDNS Gens im Vektor pLac52 wurde modifiziert wie für den Vektor pLac51 be- schrieben. Aus dem Plasmid pLT5 wurde das ca. 100 bp große
Insert aus der PCR-Reaktion mit den Primern G und H mit Bbs I und Xba I herausgeschnitten und isoliert. Das Bbs I - Xba I Fragment wurde schließlich in den mit Bbs I und Xba I geschnittenen Vektor pLac52 kloniert. Dadurch entstand der Vektor pLac523, der am 3 ' -Ende des Laccase cDNS Gens eine neue Afl II Schnittstelle enthielt.
Das cDNS Gen für die Trametes versicolor Laccase Lac5.5 mit den modifizierten 5 ' - und 3 ' -Bereichen wurde gewonnen, indem das Plasmid pLac523 mit Eco RV und Afl II geschnitten und das dabei entstandene 1,5 kb große Lac5.5 cDNS Fragment nach Aga- rose-Gelelektrophorese isoliert worden war. Dieses Fragment wurde in das 9,3 kb große Afl II - Eco RV Fragment des Vektors pAN56-9 ligiert. Vektor pAN56-9 enthielt ein 4 , 0 kb großes Fragment des glaA Promotors aus Aspergillus niger, gefolgt von einem 2,0 kb großen Fragment, das für ein Fragment der Aspergillus niger glaA Glucoamylase kodiert, einem kurzen DNS-Ab- schnitt, der für vier Aminosäuren der KEX2 -Spaltstelle kodiert, ein 0,7 kb großes Fragment des trpC Transkriptionsterminators aus Aspergillus nidulans und das 2 , 7 kb große Fragment des pUC18 Vektors. Die Eco RV und Afl II Schnittstellen waren 3' zur KEX2-Spaltstelle angeordnet. Nach Transformation in E. coli erhielt man einen 10,8 kb großen Vektor, der pANlac2 genannt wurde. In pANlac2 war der kodierende Bereich des cDNS Gens für die reife Laccase Lac5.5 so mit dem kodierenden Bereich des Glucoamylasegens verknüpft, daß bei der Expression zuerst ein Fusionsprotein aus einem Bruchstück der Glucoamylase inklusive Signalsequenz, der Erkennungssequenz für die KEX2 Protease und der vollständigen Laccase Lac5.5 entstand. Bei der Sekretion wird dieses Fusionsprotein durch die KEX2 Protease gespalten und die reife Laccase in den Kulturüberstand sekretiert.
C: Einbau der amdS und pyrG Selektionsmarker in die Vektoren pANlacl und pANlac2
pANlacl und pANlac2 wurden linearisiert durch Verdau von je 5 μg der Vektoren über Nacht mit Not I. Darauf folgte eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm, Extraktion mit Phenol/Chloroform und Fällung mit Ethanol . Die Gene für die Selektionsmarker amdS (Acetamidase) und pyrG (Orotidin-5 ' -Monophosphat-Decarboxylase) waren auf dem Plasmid pAN52-ll enthalten, aus dem sie nach Verdau mit Not I als ein 6,4 kb großes Fragment isoliert werden konnten. Je 0,2 μg der linearisierten und Phosphatase-behandelten Vektoren pANlacl und pANlac2 wurden mit 0,6 μg des isolierten Not I Fragments ligiert und damit E. coli JM109 transformiert. Von Ampicillin- resistenten Kolonien aus diesen Transformationen wurde die Plasmid-DNS präpariert, mit Not I geschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese analysiert. 6 von 8 analysierten Klonen aus der Transformation mit dem Vektor pANlacl und 5 von 7 analysierten Klonen aus der Transformation mit dem Vektor pANlac2 enthielten das 6.4 kb Not I Fragment. Die mit den Selektions- markergenen ausgestatteten Vektoren wurden als pANlaclS (Größe 15,3 kb, Fig.l) und pANlac2S (Größe 17,2 kb, Fig.2) bezeich- net . 3 der 6 erhaltenen pANlaclS Klone enthielten das Not I Fragment in der gewünschten, in Fig.l angegebenen Orientierung, 1 der 5 erhaltenen pANlac2S Klone enthielt das Not I Fragment in der gewünschten, in Fig. 2 angegebenen Orientierung.
7. Beispiel
Transformation von Aspergillus
Für die Transformation wurden die Stämme Aspergillus niger ABI.13 (pyrG") (W. van Hartingsveldt , I.E. Mattern, C.M.J. van Zeijl, P.H. Pouwels und C.A.M.J.J. van den Hondel (1987) Mol. Gen. Genet . 206, 71 - 75) und Aspergillus awamori (Stamm ATCC 11358) verwendet. Die Transformation von Aspergillus wurde nach dem Stand der Technik durchgeführt (P. J. Punt und C.A.J.J. van den Hondel (1992) , Meth. Enzymology 216, 447-457)
Protoplasten von Aspergillus wurden durch Behandlung des My- cels mit Novozyτn 234 gewonnen. In einem sterilen Erlenmeyer- kolben wurde Mycelium eines Kolbens in 15 ml einer frisch her- gestellten und sterilfiltrierten Lösung des lytischen Enzymgemisches Novozym 234 (Novo Nordisk) in OM-Medium (0,27 M Calci- umchlorid, 0,6 M NaCl) suspendiert. Das in der Enzymlösung re- suspendierte Mycelium wurde bei geringer Drehzahl (80 rpm) für 1 bis 3 h bei 30°C inkubiert. Während der Inkubation wurde die Bildung der Protoplasten im Mikroskop beobachtet. Frei bewegliche Protoplasten waren üblicherweise nach 1 h zu sehen. Nachdem eine große Zahl frei beweglicher Protoplasten erhalten worden war, wurden sie durch Filtration über Miracloth (Cal- biochem) in einem Glasfilter von restlichem Mycelium abgetrennt und sorgfältig mit STC-Medium (1,2 M Sorbitol, 50 mM Calciumchlorid, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) gewaschen. Protoplasten wurden durch Zentrifugation der Suspension in ei- nem sterilen Probengefäß isoliert (2000 rpm, 4°C, 10 min) und zweimal mit STC-Medium gewaschen. Die Konzentration von Protoplasten wurde unter dem Mikroskop in einer Zählkammer bestimmt. Die Protoplastensuspension wurde für Experimente zur Protoplastenregenerierung oder für Transformationen auf eine Konzentration von 1 x 10" Protoplasten/ml eingestellt.
Protoplasten von Aspergillus niger und Aspergillus awamori wurden mit den Plasmiden pANlaclS und pANlac2S transformiert. Beide Plasmide enthielten als Selektionsmarker das pyrG Gen (kodiert für die Orotidin 5 '-Phosphat Decarboxylase) und das amdS Gen (kodiert für Acetamidase) . In Inkubationsgefäßen von 12 ml Volumen wurden 0,1 ml Aliquots der Protoplasten mit 10 μg Plasmid-DNS versetzt und 25 min auf Eis inkubiert. Danach wurde langsam und unter wiederholtem mischen 1,25 ml einer 60 % PEG4000 Lösung (60 % PEG4000, 50 mM Calciumchlorid, 10 mM
Tris-HCl, pH 7,5) zum Transformationsansatz gegeben. Nach weiteren 20 min Inkubation bei 20°C wurden die Reaktionsgefäße mit STC-Medium aufgefüllt, gemischt und 10 min bei 4°C zentri- fugiert . Die Pellets wurden resuspendiert und auf mit Sorbitol osmotisch stabilisiertem, selektivem Medium ausplattiert. Die Platten wurden bei 30°C für 7 Tage inkubiert und auf Wachstum von Kolonien überprüft. Die Transformationsrate aus mehreren Experimenten betrug für Aspergillus niger 1 - 5 Transforman- ten/μg Plasmid DNS, für Aspergillus awamori 0,1 - 0,5 Trans- for anten/μg Plasmid DNS.
Transformanten wurden durch überimpfen auf Selektivplatten mit Acetamid gereinigt. Transformanten mit hoher Kopienzahl wurden durch plattieren auf Selektivplatten mit Acrylamid identifiziert. Acrylamid ist im Gegensatz zu Acetamid ein schlechtes Substrat für das vom amdS Gen kodierte Enzym Acetamidase und kann nur bei Transformanten mit hoher Kopienzahl des amdS Gens das Wachstum unterstützen. Transformanten, die Laccaseenzym funktioneil exprimieren können, wurden identifiziert, indem sie zuerst auf Platten mit Maltodextrin, einem Induktor für die Expression vom glaA Promotor, ausplattiert und nach zwei Tagen Wachstum bei 28°C mit ABTS-Agar (0,1 % ABTS, 1 % Agaro- se, in Mclllvainepuffer, pH 4,5) überschichtet wurden. Laccase exprimierende Transformanten wurden durch Bildung eines grünen Hofes angezeigt. Von Transformanten, die sowohl auf Acryla- midplatten gutes Wachstum zeigten als auch im Aktivitätstest mit ABTS positiv reagierten, wurden Sporensuspensionen hergestellt.
8. Beispiel
Expression der Trametes versicolor Laccase Lac5.5 in
Aspergillus Die Expression von Laccase Lac5.5 in Aspergillus wurde im
Schüttelkolbenmaßstab untersucht. Es wurde folgendes Anzuchtsmedium verwendet : Eine 5 % (w/v) Lösung von Maltodextrin in Leitungswasser wurde 20 min autoklaviert . Dann wurden zu 500 ml dieses Grundmediums 1 ml IM MgSulfat, 0,5 ml 1000 x Spuren- elementlösung, 10 ml 50 x Asp A Lösung und 5 ml 10 % (w/v) Ca- saminosäuren zugegeben. Die 1000 x Spurenelementlösung hatte folgende Zusammensetzung: In 80 ml H20 waren gelöst 2,2 g ZnS04 x 7 H20, 1,1g H3B03, 0,5 g MnCl2 x 4 H20, 0,5 g FeS04 x 7 H20, 0,17 g CoCl2 x 5 H20, 0,16 g CuS04 x 5 H20, 0,15 g Na2Mo04 x 2 H20 und 5 g EDTA. Die 50 x AspA Lösung hatte die Zusammensetzung: In 500 ml H20 waren gelöst 150 g NaN03 , 13 g KC1, 38 g KH2P04, pH 5,5 mit 10 M KOH eingestellt. Dem Medium wurde zusätzlich CuS04 x 5 H 0 in einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt.
Für Expressionsexperimente wurden 50 ml des Anzuchtsmediums in einem 300 ml Erlenmeyerkolben mit 1 x 10 Sporen/ml inokuliert. Die Anzucht erfolgte in einem Schüttelinkubator bei 30°C und 300 rpm. Während einer Woche wurden täglich Proben entnommen und die Laccaseaktivität im Kulturüberstand bestimmt. Die maximale Laccaseaktivität wurde zwischen 60 und 100 h Wachstum beobachtet und betrug zwischen 0,5 und 2,5 U/ml . Die Laccaseaktivität wurde colorimetrisch mit dem
Substrat ABTS (0,1 mM im Test) in Mclllvaine Puffer pH 4 , 5 und bei 37 °C bestimmt. Mclllvaine Puffer wurde hergestellt, indem man eine 0,1 M Zitronensäurelösung mit 0,2 M Na2HP04 -Lösung auf pH 4,5 titrierte. Die Extinktionszunähme wurde bei 420 nm (Extinktionskoeffizient von ABTS bei 420 nm: 3,6 x 104 1 x Mol x cm ) gemessen. 1 U Laccaseaktivität wurde definiert als 1 μmol ABTS-Substratumsatz/min.
9. Beispiel Expression der Trametes versicolor Laccase Lac5.5 in Pichia pastoris
Es wurde ein kommerziell erhältliches Expressionssystem der Fa. Invitrogen mit den dazugehörenden Expressionsvektoren (pPIC3 und pPIC9) und Pichia pastoris Stämmen (GS115 und KM71) verwendet. Die Pichia pastoris Stämme GS115 und KM71 sind Hi- stidin auxotroph. Die Expressionsvektoren enthielten Promotor und Terminator des Alkoholoxidasegens A0X1 aus Pichia pastoris. Zwischen diese beiden genetischen Regulationselementen wurde das cDNS Gen der Trametes versicolor Laccase Lac5.5 kloniert. Der Vektor pPIC9 enthielt, hinter dem AOX1 Promotor angeordnet, eine DNS-Sequenz, die für die Signalsequenz des al- pha-Faktor Proteins aus Saccharomyces cerevisiae kodiert, gefolgt von einem kurzen DNS-Abschnitt , der für die Erkennungs- sequenz Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala (Seq ID NO: 15) kodiert.
Für die Selektion in E. coli enthielten die Vektoren das Ampi- cillin Resistenzgen. Für die Selektion in Pichia pastoris enthielten die Vektoren das HIS4 Gen aus Pichia pastoris.
A: Konstruktion eines Laccase Lac5.5 Expressionsvektors mit der Signalsequenz von Laccase Lac5.5 Zur Amplifikation des Laccasegens wurde das Plasmid pLac5.5 und die Primer K und L verwendet. Primer F und G hatten folgende Sequenz :
Primer K:
5 ' -ACTCGAGAATTCACCATGACTGGGCTGCGTCTTCTTCC-3 ' (SEQ ID NO : 16 )
Primer L:
5 ' -ACTAGAGCGGCCGCCTATCACTGGTCGTCAGCGTCGAGGGC-3 ' (SEQ ID NO : 17)
Primer K enthielt die Sequenz für eine Eco RI Schnittstelle (unterstrichen) und daran angeschlossen die DNS-Sequenz für die ersten sieben Aminosäuren der Laccase Lac5.5 Signalsequenz. Primer L enthielt die Sequenz für eine Not I Schnittstelle (unterstrichen) und daran angeschlossen, in komplemen- tärer und reverser Orientierung, das Translationsstopcodon und die DNS-Sequenz für die letzten 7 Aminosäuren der Laccase Lac5.5.
PCR-Amplifikationen wurden nach dem für den Fachmann geläufi- gen Stand der Technik durchgeführt. 20 ng pLac5.5 DNS wurden in einer 50 μl PCR Reaktion eingesetzt, die darüberhinaus 0,5 U Vent Polymerase, 1 mM MgCl2, je 0,2 mM der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer K und L enthielt. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 5 min bei 94 °C, gefolgt von 25 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C und 2 min bei 72°C. Es wurde das erwartete PCR-Fragment der Größe von 1,5 kb erhalten. Das PCR-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Not I geschnitten, mit Ethanol gefällt und in H20 aufgenommen. Der Vektor pPIC3 wurde mit Eco RI und Not I geschnitten, durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Es folgte eine Extraktion mit Phenol/Chloroform (Verhältnis 3:1) und eine Ethanolfällung. In den so vorbereiteten pPIC3 -Vektor wurde das durch PCR-Amplifikation hergestellte
DNS-Fragment der Laccase Lac5.5 ligiert und damit E. coli Top 10F' Zellen (Invitrogen) transformiert. Von Ampicillin-resi- stenten Klonen wurde die Plasmid DNS isoliert und das klonierte 1,5 kb Insert durch Restriktionsverdau mit Eco RI und Not I identifiziert. Von 12 untersuchten Klonen waren 9 positiv. Der so erhaltene Vektor wurde mit dem Namen pL512 (Fig.3) bezeichnet.
B: Konstruktion eines Laccase Lac5.5 Expressionsvektors mit der Signalsequenz des alpha-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae
Zur Amplifikation des Laccasegens wurde das Plasmid pLac5.5 und die Primer L und M verwendet . Primer M hatte folgende Sequenz :
Primer M: 5 ' -ACTCGAGAATTCGGGATCGGGCCTGTGCTCGACCTCACG-3 ' (SEQ ID NO: 18)
Primer M enthielt die Sequenz für eine Eco RI Schnittstelle (unterstrichen) und daran angeschlossen die DNS-Sequenz für die ersten neun Aminosäuren des vermuteten N-terminus der pro- zessierten Laccase Lac5.5. Der N-terminus der prozessierten
Laccase Lac5.5 war aus dem Sequenzvergleich mit anderen Laccasen abgeleitet worden.
Die Herstellung des DNS-Fragments für die prozessierte Form der Laccase Lac5.5 erfolgte, wie in Abschnitt A dieses Beispiels beschrieben, durch PCR-Amplifikation mit pLac5.5 cDNS und den Primern L und M. Der Vektor pPIC9 wurde mit Eco RI und Not I geschnitten und wie der in Abschnitt A dieses Beispiels beschriebene pPIC3 Vektor vorbereitet, mit dem durch PCR- Amplifikation hergestellten DNS-Fragment der Laccase Lac5.5 ligiert und damit E. coli Top 10F' Zellen (Invitrogen) transformiert. Von Ampicillin-resistenten Klonen wurde die Plasmid DNS isoliert und das klonierte 1,5 kb Insert durch Restriktionsverdau mit Eco RI und Not I identifiziert. Von 12 unter- suchten Klonen waren 3 positiv. Der so erhaltene Vektor wurde mit dem Namen pL532 (Fig.4) bezeichnet.
C: Transformation von Pichia pastoris Pichia pastoris Stämme GS115 bzw. KM71 wurden zuerst in 5 ml YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Dextrose) bei 30 °C über Nacht kultiviert. Mit je 0,2 ml dieser Vorkultur wurden zwei Hauptkulturen von je 250 ml YPD-Medium inokuliert und wiederum bei 30°C über Nacht bis zu einer optischen Dichte (OD600 nm) von 1,3 - 1,5 kultiviert. Die Hefezellen einer 250 ml Hauptkultur wurden daraufhin abzentrifugiert (5 min 1500 x g) , zweimal mit je 200 ml H20 und einmal mit 10 ml 1 M Sorbi- toi gewaschen und schließlich in 0,5 ml 1 M Sorbitol aufgenommen .
Plasmid DNS der Vektoren pL512 oder pL532 wurden entweder mit Stu I oder mit Nsi I linearisiert , mit Ethanol gefällt und in H20 in einer Konzentration von lμg DNS/μl aufgenommen.
Ein Transformationsansatz enthielt 80 μl Pichia pastoris Zellen und 10 μg linearisierte Vektor-DNS. Transformation erfolgte durch Elektroporation bei 1500 V, 25 μF und 200 Ohm (BioRad Gene Pulser) . Die Entladungszeit betrug ca. 4,2 msec. Der Transformationsansatz wurde mit 1 ml 1 M Sorbitol versetzt, 30 min auf Eis inkubiert und anschließend in Aliquots zu je 0,3 ml auf MD-Platten ohne Histidin (1,34 % YNB, Hefe Stickstoff- base, 4 x 10 % Biotin, 1 % Dextrose, 1,5 % Agar) ausplattiert . Transformanten erschienen nach 3 - 5 Tagen Inkubation bei 30°C. Transformanten wurden durch zweimaliges Ausstreichen auf MD-Platten gereinigt. Laccaseproduzenten wurden auf MM-In- dikatorplatten identifiziert. MM- Indikatorplatten enthielten 1,34 % YNB, 4 x 10"5 % Biotin, 0,5 % Methanol, 1,5 % Agar, 1 mM ABTS und 0 , 1 mM CuSulfat. Der Induktor Methanol wurde im Deckel der Petrischalen vorgelegt und täglich erneuert, um eine Versorgung der Kolonien mit Methanol durch Diffusion zu gewährleisten. Laccaseproduzenten erzeugten nach 2 - 3 Tagen Inkubation bei 30°C einen grünen Hof.
E: Expression in Schüttelkolben:
50 ml BMGY Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 0,1 M K-Phos- phat, pH 6,0, 1,34 % YNB, 4 x 10"5 % Biotin, 1 % Glycerin) wurden mit einer Laccase produzierenden Pichia pastoris Trans- formante inokuliert und 48 h bei 28°C und 300 rpm auf einem Schüttler kultiviert. Die Zellen dieser Vorkultur wurden durch Zentrifugation (10 min 1500 x g) isoliert und in 10 ml Haupt- kulturmedium (MMY, 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1,34 % YNB, 4 x 10 % Biotin, 3 % Methanol) suspendiert. MMY-Medium wurde mit 0 , 5 mM CuSulfat Supplementiert und die Hauptkultur bei Raumtemperatur und 300 rpm auf einem Schüttler weiterkultiviert . In Abständen von 24 h wurde die Hauptkultur mit Metha- nol (0,3 ml/10 ml Medium) supplementiert . Die Produktion der rekombinanten Laccase Lac5.5 setzte nach 24 h ein. Produkti- onsraten bis zu 4 U/ml nach 190 h nach Start der Hauptkultur wurden erreicht .
10. Beispiel
Isolierung von rekombinanter Laccase Lac5.5
Rekombinante Laccase Lac5.5 wurde durch Anzucht transformierter Aspergillusstämme im Schüttelkolben gewonnen, wie im 8. Beispiel beschrieben. Laccase Lac5.5 enthaltende Kulturüberstände wurden durch Querstromfiltration konzentriert. Dazu wurden Sartocon Micro Filtrationsmodule (Sartorius) mit einer Ausschlußgrenze von 30 kD verwendet. Konzentrierte Laccase Lac5.5 wurde anschließend lyophilisiert und in 20 mM Na-Phos- phat , pH 6.0 gelöst. Die Aktivität der konzentrierten rekombinanten Laccase Lac5.5 betrug 18,6 U/ml.
Nach Querstromfiltration konzentrierte Laccase wurde gegen 20 mM BisTris-HCl, pH 6.5 dialysiert . Danach wurde eine Leitfä- higkeit von 1,5 mS/cm gemessen. Dialysierte Laccase wurde anschließend über eine Säule von DEAE Sepharose (Pharmacia) , äquilibriert in 20 mM BisTris-HCl (Auftragspuffer), pH 6.5, chromatographiert . Unter diesen Bedingungen bindet die Laccase an die DEAE Sepharose. Bei der Elution mit einem linearen Gra- dienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Auftragspuffer wurde die Laccaseaktivität bei einer Salzkonzentration von 0,15 M NaCl wiedergefunden. Die Laccasefraktion von der DEAE Sepharosesäule wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 20 % sowie mit Na-Acetat, pH 4.5 (Endkonzentration 20 mM) versetzt und pH 4,5 mit Essigsäure eingestellt. Die so vorbereitete Laccase- fraktion wurde dann über eine Säule von Phenylsepharose (Pharmacia) , äquilibriert in Auftragspuffer (20 mM Na-Acetat, pH 4,5, 20 % gesättigtes Ammoniumsulfat), chromatographiert . Unter diesen Bedingungen bindet die Laccase an die Phenylsepha- rose. Bei der Elution mit einem linearen Gradienten von 20 - 0 % gesättigtem Ammoniumsulfat, in 20 mM Na-Acetat, pH 4,5 wurde die Laccaseaktivität bei einer Ammoniumsulfatsättigung von 16 % wiedergefunden. Die Laccasefraktion wurde gegen 20 mM BisTris-HCl, pH 6.5 dialysiert und durch Bindung an DEAE Sepharose und anschließender Stufenelution mit 0,3 M NaCl konzentriert. Bindung und Elution mit 0,3 M NaCl erfolgten jeweils in 20 mM BisTris-HCl, pH 6.5. Die Ausbeute an Laccaseaktivität bezogen auf das Startmaterial betrug 20 %. Die isolierte Laccase wurde durch N-terminale Aminosäuresequenzierung analysiert. Die dabei bestimmte Sequenz,
Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp Leu Thr Ile Ser Arg Ala Val (SEQ ID NO:19)
befand sich in Übereinstimmung mit dem aus der cDNS-Sequenz und Homologievergleichen abgeleiteten N-terminus der reifen Laccase Lac5.5.
11. Beispiel
Biochemische Eigenschaften von rekombinanter Laccase Lac5.5
Es wurden das pH- und Temperaturoptimum sowie die pH- und Tem- peraturstabilität von rekombinanter Laccase Lac5.5, in Aspergillus hergestellt wie im 8. Beispiel beschrieben, untersucht. Für diese Experimente wurde rekombinante Laccase Lac5.5 zuerst über Sephadex G25 (Pharmacia, PDIO-Säulen) in Mclllvaine-Puf- fer, pH 4.5 umgepuffert.
A: pH-Optimum:
Es wurden für die in Fig.5 angegebenen pH-Werte jeweils die entsprechenden Puffer durch geeignetes mischen von ungepufferten Na-Citrat- und Na-Phosphatlösungen hergestellt. Für rekombinante Laccase Lac5.5 wurde anschließend beim jeweiligen pH-Wert die Laccaseaktivität bei 37°C bestimmt. Wie aus Fig.5 hervorgeht, hat die Laccase Lac5.5 für das Substrat ABTS ein Aktivitätsoptimum im stark sauren Bereich.
B: pH-Stabilität:
Laccase Lac5.5 wurde in Mclllvaine Puffer bei pH 3 , 0 , 4,5 und
6,0 vorinkubiert (Temperatur 37°C) . Nach 0, 30, 60 und 120 min wurden jeweils Aliquots entnommen, in Mclllvaine Puffer mit pH 4,5 verdünnt und die Laccaseaktivität bei 37°C bestimmt. Bei pH 4,5 und 6,0 wurde die Laccaseaktivität durch die Vorbehandlung nicht beeinträchtigt. Bei pH 3 , 0 betrug die Halbwertszeit der Laccase zwischen 60 und 120 min. (Fig.6)
C: Temperaturoptimum:
Die Laccaseaktivität der rekombinanten Laccase Lac5.5 wurde bei den in Fig.7 angegebenen Temperaturen bestimmt. Die Laccaseaktivität wurde mit dem ABTS-Test in Mclllvaine-Puffer, pH 4,5 bestimmt. Überraschenderweise wurde dabei festgestellt, daß das Temperaturoptimum der Laccase Lac5.5 bei 70°C liegt. Die Temperaturen, bei der noch halbmaximale Laccaseaktivität gemessen wurde, liegen bei 50 °C und 80°C.
D: Temperaturstabilität:
Laccase Lac5.5 wurde in Mclllvaine Puffer pH 4,5 bei 45, 55 und 65°C vorinkubiert. Nach 0, 30, 60 und 120 min wurden jeweils Aliquots entnommen, in Mclllvaine Puffer mit pH 4,5 verdünnt und die Laccaseaktivität bei 37°C bestimmt. Bei 45°C wurde die Laccaseaktivität durch die Vorbehandlung nicht beeinträchtigt. Bei 55°C wurden nach 120 min Vorinkubation noch 80 % Restaktivität gemessen. Bei 65°C betrug die Halbwertszeit der Laccase 60 min. (Fig.8) . SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Consortium fuer elektrochemische Industrie GmbH
(B) STRASSE: Zielstattstrasse 20
(C) ORT: Muenchen
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-81379
(G) TELEPHON: 089 74844 0 (H) TELEFAX: 089 74844 350
(ii) ANMELDETITEL: DNS-Sequenzen, Expression dieser DNS-Sequenzen, durch die DNS-
Sequenzen kodierte thermophile Laccasen sowie deren Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 19
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1 :
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 1572 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN (vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Trametes versicolor
(B) STAMM: TV-1
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: plac55
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1 :
ATGACTGGGC TGCGTCTTCT TCCTTCCTTC GCGGCGTTGG CCGTGACCGT GTCTCTCGCG 60
CTCAACGCGT TGGCTGGGAT CGGGCCTGTG CTCGACCTCA CGATCTCCAA CGCGGTGGTG 120
TCGCCCGATG GCTTCTCTCG CGCGGCGGTC GTTGCGAACG ACCAGGCTCC CGGGCCTCTC 180
ATTACGGGCC AGATGGGCGA CCGTTTCCAG ATCAATGTGG TCAACAAGCT GTCGAACCAC 240
ACTATGCTCA AGTCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG TACGAACTGG 300
GCCGATGGCC CCGCGTTCGT GAACCAGTGC CCGATCGCGA CTGGTCACTC GTTCCTTTAC
360
GACTTCCAGG TCCCGGACCA GGCCGGGACG TTCTGGTACC ACAGCCATTT GTCTACCCAG
420
TACTGTGACG GGTTGAGAGG TCCTTTCGTC GTCTACGACC CGAACGACCC TCATGCCAGC 480
CTCTACGACG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CTGACTGGTA CCATACCGCT 540
GCCAAGCTTG GGCCGGCCTT CCCTCCTGGC TCTGATGCGA CGTTGATCAA TGGGCTCGGA 600 CGTACAGCGG CCACCCCCAA CGCGGATCTC GCTGTCATTA GTGTCACGCA CGGCAAGCGG 660
TACCGTTTCC GCCTGGTGTC GATGTCCTGC GACCCCGCGT ACACGTTCAG CATCGACGAC 720
CACTCGATGA CCATCATCGA GGCGGACTCA GTCAACACAA AGCCGCTCGA GGTCGACTCG 780
ATCCAGATCT TCGCCGGCCA GCGCTACTCG TTCGTGCTGG AGGCAAACCA GGACGTCGGC
840
AACTATTGGG TCCGCGCGGA CCCGCTGTTT GGCACGACGG GCTTCGATGG GGGTATCAAC
900
TCTGCGATCC TCCGGTACGA CACCGCGTCG CCGACCGAGC CGACCACGAC GCAGGCCACC 960
TCTACGAAGC CGTTGAAGGA GACGGACCTT GAGCCTCTCG CGTCGATGCC GGTGCCTGGC 1020
TCTGCTGTCT CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CAACGGGTCC 1080
AACTTCTTCA TCAACGGCGC GACCTTCCAG CCGCCCACCA CTCCCGTTCT GCTGCAGATC
1140
ATGAGCGGTG CCCAGGCTGC TAGCGACCTC CTCCCGTCCG GTGACGTCTA CGCCCTGCCG 1200
TCGGACTCGA CCATCGAGCT CTCGTTCCCC GCGACTACTG GTGCTCCCGG TGCCCCCCAC
1260
CCCTTCCACT TGCACGGTCA CACCTTCGCC GTTGTGCGCA GCGCGGGCAG CGCTGAGTAC 1320
AACTACGACA ACCCCATCTG GCGCGACGTC GTCAGCACTG GTACCCCTGC AGCGGGCGAT 1380 AACGTCACCA TTCGCTTCAG GACTGACAAC CCTGGCCCGT GGTTCCTCCA CTGCCACATC 1440
GACTTCCACT TGGAGGCCGG CTTCGCCGTG GTCATGGCTG AAGACATCCC CGACACCAAG 1500
GCCGACAACC CTGTTCCTCA GGCGTGGTCA GACCTTTGCC CCATCTACGA CGCCCTCGAC 1560
GCTGACGACC AG 1572
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK^: (A) LÄNGE: 1572 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Trametes versicolor
(B) STAMM: TV-1
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON: plac56
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
ATGACTGGGC TGCGTCTTCT TCCTTCCTTC GCGGCGTTGG CCGTGACCGT GTCGCTCGCG 60 CTCAACGCGT TGGCCGGGAT CGGGCCCGTG CTCGACCTTA CGATCTCCAA TGCGGTTGTT 120
TCGCCCGATG GCTTCTCTCG CGCGGCGGTC GTCGCGAACG ACCAGGCTCC CGGGCCTCTC 180
ATCACGGGCC AGATGGGCGA CCGCTTCCAG ATCAATGTGG TCAACAAGCT GTCGAACCAC 240
ACCATGCTTA AATCGACCAG CATCCACTGG CACGGCTTCT TCCAGAAGGG CACGAACTGG
300
GCGGACGGCC CTGCGTTCGT GAACCAATGC CCGATTGCGA CGGGCCACTC GTTCCTTTAC 360
GACTTCCAGG TCCCGGACCA GGCCGGGACG TTCTGGTACC ACAGCCATCT GTCTACTCAG 420
TACTGCGATG GCTTGAGGGG TCCGTTCGTC GTCTACGACC CGAATGACCC TCATGCCAGT 480
CTCTACGATG TGGACAACGA TGACACCGTC ATCACCCTCG CCGATTGGTA CCATACTGCT
540
GCCAAGCTTG GGCCGGCCTT CCCTCCTGGC TCTGATGCGA CGTTGATCAA TGGGCTCGGA 600
CGTACAGCGG CCACCCCCAA CGCGGACCTC GCTGTCATCA GCGTCACGCA CGGCAAGCGG 660
TACCGTTTCC GCCTGGTGTC GATGTCCTGC GACCCCGCGT ACACCTTCAG CATCGACGAC 720
CACTCGATGA CCATCATCGA GGCGGACTCG GTCAACACGA AGCCGCTCGA GGTCGACTCG 780
ATCCAGATCT TCGCCGGCCA GCGCTACTCG TTCGTGCTGG AGGCAAACCA GGACGTCGGC 840 AACTATTGGG TCCGCGCGGA CCCGCTGTTT GGCACGACGG GCTTCGATGG GGGTATCAAC 900
TCTGCGATCC TCCGGTACGA CACCGCGTCG CCGACCGAGC CGACCACGAC GCAGGCCACC 960
TCTACGAAGC CGTTGAAGGA GACGGACCTT GAGCCTCTCG CGTCGATGCC GGTGCCTGGC 1020
TCTGCTGTGT CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CAACGGGTCC
1080
AACTTCTTCA TCAACGGCGC GACCTTCCAG CCGCCCACCA CTCCCGTTCT GCTGCAGATC 1140
ATGAGCGGTG CCCAGGCTGC TAGCGACCTC CTCCCGTCCG GTGACGTCTA CGCCCTGCCG 1200
TCGGACTCGA CCATCGAGCT CTCGTTCCCC GCGACTACTG GTGCTCCCGG TGCCCCCCAC 1260
CCCTTCCACT TGCACGGTCA CACCTTCGCC GTTGTGCGCA GCGCGGGCAG CGCTGAGTAC
1320
AACTACGACA ACCCCATCTG GCGCGACGTC GTCAGCACTG GTACCCCTGC AGCGGGCGAT
1380
AACGTCACCA TTCGCTTCAG GACTGACAAC CCTGGCCCGT GGTTCCTCCA CTGCCACATC 1440
GACTTCCACT TGGAGGCCGG CTTCGCCGTG GTCATGGCTG AAGACATCCC CGACACCAAG 1500
GCCGACAACC CTGTTCCTCA GGCGTGGTCA GACCTTTGCC CCATCTACGA CGCCCTCGAC 1560
GCTGACGACC AG 1572
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 524 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Trametes versicolor
(B) STAMM: TV-1
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein (B) LAGE: 1..524
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Met Thr Gly Leu Arg Leu Leu Pro Ser Phe Ala Ala Leu Ala Val Thr
1 5 10 15
Val Ser Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ala Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp 20 25 30
Leu Thr Ile Ser Asn Ala Val Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Ala 35 40 45
Ala Val Val Ala Asn Asp Gin Ala Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Gin 50 55 60
Met Gly Asp Arg Phe Gin Ile Asn Val Val Asn Lys Leu Ser Asn His 65 70 75 80
Thr Met Leu Lys Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gin Lys 85 90 95
Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Pro Ala Phe Val Asn Gin Cys Pro Ile 100 105 110 Ala Thr Gly His Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gin Val Pro Asp Gin Ala 115 120 125
Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gin Tyr Cys Asp Gly 130 135 140
Leu Arg Gly Pro Phe Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp Pro His Ala Ser 145 150 155 160
Leu Tyr Asp Val Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp 165 170 175
Tyr His Thr Ala Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro Pro Gly Ser Asp 180 185 190
Ala Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Thr Ala Ala Thr Pro Asn Ala 195 200 205
Asp Leu Ala Val Ile Ser Val Thr His Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg 210 215 220
Leu Val Ser Met Ser Cys Asp Pro Ala Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Asp 225 230 235 240
His Ser Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp Ser Val Asn Thr Lys Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Ser Ile Gin Ile Phe Ala Gly Gin Arg Tyr Ser Phe Val 260 265 270
Leu Glu Ala Asn Gin Asp Val Gly Asn Tyr Trp Val Arg Ala Asp Pro 275 280 285
Leu Phe Gly Thr Thr Gly Phe Asp Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu 290 295 300
Arg Tyr Asp Thr Ala Ser Pro Thr Glu Pro Thr Thr Thr Gin Ala Thr 305 310 315 320 Ser Thr Lys Pro Leu Lys Glu Thr Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ser Met 325 330 335
Pro Val Pro Gly Ser Ala Val Ser Gly Gly Val Asp Lys Ala Ile Asn 340 345 350
Phe Ala Phe Ser Phe Asn Gly Ser Asn Phe Phe Ile Asn Gly Ala Thr 355 360 365
Phe Gin Pro Pro Thr Thr Pro Val Leu Leu Gin Ile Met Ser Gly Ala 370 375 380
Gin Ala Ala Ser Asp Leu Leu Pro Ser Gly Asp Val Tyr Ala Leu Pro 385 390 395 400
Ser Asp Ser Thr Ile Glu Leu Ser Phe Pro Ala Thr Thr Gly Ala Pro
405 410 415
Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His Thr Phe Ala Val Val 420 425 430
Arg Ser Ala Gly Ser Ala Glu Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Trp Arg 435 440 445
Asp Val Val Ser Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile 450 455 460
Arg Phe Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile 465 470 475 480
Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Val Val Met Ala Glu Asp Ile 485 490 495
Pro Asp Thr Lys Ala Asp Asn Pro Val Pro Gin Ala Trp Ser Asp Leu 500 505 510
Cys Pro Ile Tyr Asp Ala Leu Asp Ala Asp Asp Gin
515 520
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
TGGCAYGGNT TYTTYCA 17
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 14 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
TCDATRTGRC ARTG 14
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
ATTCAGGGAT CCTGGTAYCA YWSNCAY 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
ATACGAGGAT CCRTGNCCRT GNARRTG 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 3284 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Trametes versicolor (B) STAMM: TV-1
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: plac56chr
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
TTGGAATGGG CCCGCCGGTG TCGATCGCAA ACAGGTGAGT TCAGTACTAG CCCATCAGCG 60
CAGCAGCATT TGCGGCGAAG AAGTGTCCGC CCCACGCTCA TCACCCAGCG CCCTTCTCGA
120
CATCGGAACC GCCGCAACAC AGGGAAGAGG CCATTTCGCC CATCCAAGGC TCGGGGATCT
180
TCTCACGACG CGAGGGCATT TCGCGCGAGC GTCGCAGCCG GTGCGCCGAG GCTGCATGAT 240
CTGTGCGGCT CCTGCGCGTA TGCCGCTCGG GTCGCCGAGA CACAGCGAGA CATCTGCAGC 300
CGGGGCGGCG CGCAACCAGC TCGGCTGTTT GGAGTGCGTC GATGCAACGC GTCGACGTCC 360 ATCGGGGACG GCGCGTGGCT TGGCACGCGT AGCACCGACG CGCACTATAA AGGCGATGCG 420
GCAGAGAAGA GGCGGAGCAC CACGTTCAGT CCCTTCCTTG GATTCCGGGC AGCTTACTCC 480
TTCTCGCCTC TCTCTGCCTC CTTTCCTTCG GGCTTCTACT CTTCTTTTCT ATTTCGCTTC 540
TGTTCGAGGG TAGAACACAG AACACTATGA CTGGGCTGCG TCTTCTTCCT TCCTTCGCGG
600
CGTTGGCCGT GACCGTGTCG CTCGCGCTCA ACGCGTTGGC CGGGATCGGG CCCGTGCTCG
660
ACCTTACGAT CTCCAATGCG GTTGTTTCGC CCGATGGCTT CTCTCGCGCG GCGGTCGTCG 720
CGAACGACCA GGCTCCCGGG CCTCTCATCA CGGGCCAGAT GGGCGACCGC TTCCAGATCA 780
ATGTGGTCAA CAAGCTGTCG AACCACACCA TGCTTAAATC GACCAGCATC GTGAGTATTC 840
AATCTGGGCG TGGGGGTACG GGCTGCACTG ACGCAAGTAC ACGCTTCGCA GCACTGGCAC
900
GGCTTCTTCC AGAAGGGCAC GAACTGGGCG GACGGCCCTG CGTTCGTGAA CCAATGCCCG 960
ATTGCGACGG GCCACTCGTT CCTTTACGAC TTCCAGGTCC CGGACCAGGC CGGTATGTGA 1020
TCACGGAAGG TGTGCACGAA CCCAGCACTG ACGGTCATGT AGGGACGTTC TGGTACCACA 1080
GCCATCTGTC TACTCAGTAC TGCGATGGCT TGAGGGGTCC GTTCGTCGTC TACGACCCGA 1140 ATGACCCTCA TGCCAGTCTC TACGATGTGG ACAACGGTAA GCAGTTCAGA TTGCGAATCC 1200
TTGGCGGTCT ATTGACATCC CGGCCAGATG ACACCGTCAT CACCCTCGCC GATTGGTACC 1260
ATACTGCTGC CAAGCTTGGG CCGGCCTTCC CGTAAGTTGG ATTGTCAGTC TGTCTGTTCT 1320
CTACTTACTA ATCACGGGCT GCAGTCCTGG CTCTGATGCG ACGTTGATCA ATGGGCTCGG
1380
ACGTACAGCG GCCACCCCCA ACGCGGACCT CGCTGTCATC AGCGTCACGC ACGGCAAGCG 1440
GTAAGAGCGG CTGTACCTTC CTCTTGCTCG CAGCTGCTCA AACTTTATGG TTTATAGGTA 1500
CCGTTTCCGC CTGGTGTCGA TGTCCTGCGA CCCCGCGTAC ACCTTCAGCA TCGACGACCA 1560
CTCGATGACC ATCATCGAGG CGGACTCGGT CAACACGAAG CCGCTCGAGG TCGACTCGAT
1620
CCAGATCTTC GCCGGCCAGC GCTACTCGTT CGTGCTGGAG GCAAACCAGG ACGTCGGCAA
1680
CTATTGGGTC CGCGCGGACC CGCTGTTTGG CACGACGGGC TTCGATGGGG GTATCAACTC 1740
TGCGATCCTC CGGTACGACA CCGCGTCGCC GACCGAGCCG ACCACGACGC AGGCCACCTC 1800
TACGAAGCCG TTGAAGGAGA CGGACCTTGA GCCTCTCGCG TCGATGCCGG TGGTAAGTCT 1860
GACTAGCACT TCATCTTTGA TGGTATGCTC ATGCAACTCT CCAGCCTGGC TCTGCTGTGT 1920 CGGGTGGTGT GGACAAGGCG ATTAACTTCG CTTTCAGCTT CGTACGTCCA ACTCACGATT 1980
TCCCCCTTGA GATTTATATT GATGGCTCCA TTGACGGCTC CTCATAGAAC GGGTCCAACT 2040
TCTTCATCAA CGGCGCGACC TTCCAGCCGC CCACCACTCC CGTTCTGCTG CAGATCATGA 2100
GCGGTGCCCA GGCTGCTÄGC GACCTCCTCC CGTCCGGTGA CGTCTACGCC CTGCCGTCGG
2160
ACTCGACCAT CGAGCTCTCG TTCCCCGCGA CTACTGGTGC TCCCGGTGCC CCCCACCCCT 2220
TCCACTTGCA CGGTGTAAGT TGTCATCTCA ATGTTCCGTT TGGGCCCCGA TACTAACGGC 2280
TAGATAGCAC ACCTTCGCCG TTGTGCGCAG CGCGGGCAGC GCTGAGTACA ACTACGACAA 2340
CCCCATCTGG CGCGACGTCG TCAGCACTGG TACCCCTGCA GCGGGCGATA ACGTCACCAT
2400
TCGCTTCAGG GTGAGTTGCT ATCATTATCC CCTCCTGTGT AATCGGTCGC TGACAGTCCT
2460
GCAGACTGAC AACCCTGGCC CGTGGTTCCT CCACTGCCAC ATCGACTTCC ACTTGGAGGC 2520
CGGCTTCGCC GTGGTCATGG CTGAAGACAT CCCCGACACC AAGGCCGACA ACCCTGTTCC 2580
TCGTGAGTAT TACCCCCCAA TCCCGTCAAG GCGCGCACTA ACAGGGTATT GCTGCAGAGG 2640
CGTGGTCAGA CCTTTGCCCC ATCTACGACG CCCTCGACGC TGACGACCAG TGAACACGCC 2700 TCACGAGATC GTCAACCATT TCCTCAATCA TTGACTTACC GACTTGCTAT TTCTAACACG 2760
CTATTTGCGA ACCCCCGCTC TCCCCTCTCT CACACTACGG TCCCTTCGTG AACATGGACT 2820
TGCATGGACT TTGGATTGTA GAAAGTTTAC ACAGCTGTAT AGTCGAATTA TCCCCGTAAT 2880
GCATGGTAGT GCCGCTGGCC TTTACCTCAA TCATTGTTAT CATGATATGG CCATCATAAA
2940
CATCACTGAC ATCTACTAAT CTGCTGTTAG TTTTGGGACC TCAAGAAGAT AAACGCCCGT 3000
CTACCACGAT GTGACGCGCG CGATACGTGA ATGTGACTGA TCGCGTTCCA TTATTCAAAA 3060
CGCGTCGGCT GGCGGCCAGG CCAAGTTGCT CCTCTCTCTC CGACGACGAC CACCCCTGGC 3120
TCTCTTACCC ACCTTCTCTG CACCATGACG GCAGACTACA GACTACAGTC TCTCGACGAT
3180
CCGACGGCGG TCATCCAAGA GCTCTACCGC GCCCATCCAG ACCCGAACGG TTTCCCCCGC
3240
CTCGTTGCTG AGCACTTCCA AAAGCTCTTC GAGAACCGAA CATG 3284
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA (iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
CCGGAATTCA TGACTGGGCT GCGTCTCCTT CCTTCCTTC 39
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GAGAGGCCCG GGAGCCTGG 19
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11 :
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA (iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11 :
GCTGAATTCG AAGACATCCC CGACACCAAG G 31
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
TGCTCTAGAA AGCTTAAGTT CACTGGTCGT CAGCGTCGAG GG 42
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA (iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
CCGGAATTCG ATATCCAAGC GCGGGATCGG GCCTGTGCTC GAC 43
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14: 0
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear 5
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: JA
o (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Aspergillus niger
5
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Ile Ser Lys Arg 1
° (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure 5 (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: JA
(v) ART DES FRAGMENTS: inneres
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Saccharomyces cerevisiae
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
ACTCGAGAAT TCACCATGAC TGGGCTGCGT CTTCTTCC 38
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK: (A) LÄNGE: 41 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
ACTAGAGCGG CCGCCTATCA CTGGTCGTCA GCGTCGAGGG C 41
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
ACTCGAGAAT TCGGGATCGG GCCTGTGCTC GACCTCACG 39
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK: (A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
Gly Ile Gly Pro Val Leu Asp Leu Thr Ile Ser Arg Ala Val 1 5 10

Claims

Patentansprüche
1. DNS-Sequenz, die für ein Protein mit Laccaseaktivität kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie die DNS-Sequenz SEQ ID N0:1 ab Position 76 bis einschließlich Position 1572 oder SEQ ID NO: 2 ab Position 76 bis einschließlich Position 1572 oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 80 % zu den genannten DNS-Sequenzen umfasst.
2. Expressionsvektor, der eine DNS-Sequenz gemäß Anspruch 1 enthält .
3. Expressionsvektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich enthält: einen Promotor, der die Expression des Laccasegens in einem Wirtsorganismus vermittelt sowie für den Wirtsorganismus passende Signale für die Transkrip- tionstermination, die funktioneil mit dem 3 ' -Ende der DNS-Sequenz gemäß Anspruch 1 verknüpft sind.
4.Expressionsvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe tac-Promotor, Subtilisin-Promotor, GAL-Promotor, TAKA-Amylase-Promotor, Polyhedrin-Promotor, Glucoamylase Promotor, GAPDH-Promotor und Alkoholoxidase-Promotor.
5. Expressionsvektor nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine N-terminale Signalsequenz enthält .
6. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die N-terminale Signalsequenz die natürliche im Laccasegen enthaltene Signalsequenz ist oder ausgewählt ist aus der Gruppe der Signalsequenzen der folgenden sekretierten Proteine: alpha-Cyclodextrin-Glucosyltransferase aus Klebsieila oxytoca, Subtilisin aus Bacillus subtilis, alpha-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae, saure Phosphatase aus Pichia pastoris, alpha- Amylase aus Aspergillus niger oder Glucoamylase aus Aspergillus niger bzw. aus Aspergillus awamori.
7. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gen für ein sekretiertes Protein, bzw. ein Genabschnitt für sekretiertes Fragment eines Proteins, funktioneil mit dem Laccasegen verknüpft ist .
8. Mikroorganismenstamm, der eine DNS-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder einen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7 enthält .
9. Protein umfassend die Proteinsequenz SEQ ID NO : 3
10. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 9 für die Deligni- fizierung von Zellstoff, die Depolymerisierung hochmolekularer Aggregate, das Deinking von Altpapier, die Polymerisierung aromatischer Verbindungen in Abwässern, vor allem von ligninhaltigen Abwässern aus der Zellstoffbleiche, die Oxidation von Farbstoffen, bzw. die Aktivierung von Farbstoffen zur Pigmentbildung, die Verwendung in der organischen Synthese bei Kopp- lungsreaktionen von aromatischen Verbindungen oder der Oxidation aromatischer Seitenketten.
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