EP1086220A2 - Gdnf-kodierende dna, teile davon und gdnf-varianten - Google Patents

Gdnf-kodierende dna, teile davon und gdnf-varianten

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EP1086220A2
EP1086220A2 EP99927658A EP99927658A EP1086220A2 EP 1086220 A2 EP1086220 A2 EP 1086220A2 EP 99927658 A EP99927658 A EP 99927658A EP 99927658 A EP99927658 A EP 99927658A EP 1086220 A2 EP1086220 A2 EP 1086220A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
gdnf
sequence
exon
sequences
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99927658A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Meitinger
Lena Grimm
Elke Holinski-Feder
Marius Ueffing
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1086220A2 publication Critical patent/EP1086220A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • GDNF-encoding DNA parts thereof and GDNF variants
  • the present invention relates to a GDNF-encoding DNA, parts thereof and GDNF variants and antibodies directed against them.
  • the invention further relates to the use of the GDNF-encoding DNA, parts thereof and the GDNF variants.
  • Neurotrophic factors are proteins that are present in the nervous system or in tissues innervated by the nervous system. Your task is to supply glial and nerve cells. They also promote the differentiation of neurons.
  • a neurotrophic factor derived from glial cells is GDNF ("glial cell line-derived neurotrophic factor"). This belongs to TGF-ß ("transforming g rowth f acto r-ß") Su perf ami l ie.
  • G D N F is a 30 kd differentiation factor for a wide variety of neurons. These are e.g. dopaminergic neurons of the midbrain, spinal-motor, cranial-sensory and sympathetic neurons as well as noradrenergic neurons of the hindbrain. GDNF also promotes midbrain uptake of dopamine. Experiments with Parkinson's rhesus monkeys have further shown that intracerebral administration of GDNF can bring about functional restoration.
  • Parkinson's, amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer's can be intervened. Such intervention could take place on several levels, e.g. at the level of the expression of the GDNF gene and the processing of GDNF. So far, however, there is insufficient knowledge about this level.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which the regulation of GDNF is investigated at the molecular level and if necessary, ways can be shown with which one can intervene in this regulation.
  • the present invention thus relates to means with which coding and regulatory regions of a genomic GDNF-DNA and their mutual influences can be examined. Furthermore, there are means by which the expression, in particular various forms of expression, of such
  • DNA can be determined. Furthermore, there are means that can enable targeted intervention in the regulation of this DNA.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant about the structure and the transcriptional regulation of a genomic GDNF-DNA.
  • Applicant has identified such a DNA in the human genome at the gene locus 5p 1 2-p1 3.1. He isolated and characterized this DNA on the PAC clone 24B 1 2 (cf. FIG. 1). He also clarified the sequence for the coding regions of the GDNF-DNA, which are important for the transcriptional regulation (cf. FIG. 2). The DNA contains three exons that code for a 3.6 kb cDNA, as well as large 5'- and 3'-untranslated regions (UTRs).
  • the 3'-UTR contains a polymorphic AGG "repeat" which, however, is not present in a clinically relevant cluster in patients with neurodegenerative diseases such as Parkinson's, idiopathic Parkinson's syndrome, ALS, Alzheimer's, spinocerebellar ataxia or dopa-responsive dystonia.
  • neurodegenerative diseases such as Parkinson's, idiopathic Parkinson's syndrome, ALS, Alzheimer's, spinocerebellar ataxia or dopa-responsive dystonia.
  • GDNF-DNA is caused by a promoter containing a TATA box, which is located before exon 1.
  • a second promoter is located in front of exon 2.
  • the first promoter can be enhanced in its promoter activity by various substances. Such substances are e.g. the inflammation mediator tetradecanoyl-1 2-phorbol acetate (TPA), the fibroblast growth factor 2
  • FGF2bFGFf cAMP
  • RA retinoic acid
  • the applicant's knowledge is used to provide a GDNF-encoding DNA, comprising the sequence of FIG. 2 or a sequence different therefrom by one or more base pairs, the latter sequence hybridizing with the DNA of FIG. 2 and not being a GDNF cDNA .
  • the DNA of FIG. 2 was deposited as E.coli 24B1 2 with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) on March 20, 998 under DSM 1 2063.
  • sequence different by one or more base pairs encompasses any sequence coding for GDNF that matches the DNA of FIG.
  • the sequence can differ from the DNA of FIG. 2 by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more bases.
  • hybridization indicates hybridization under normal conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the sequence.
  • No GDNF cDNA indicates that the sequence includes elements that are missing from a cDNA. Such elements are e.g. Intron- or transcriptional regulatory sequences.
  • Another object of the present invention is a DNA with promoter
  • Activity comprising the sequence indicated as promoter fragment 1 in FIG. 2 or a sequence different therefrom by one or more base pairs, the latter sequence hybridizing with the former.
  • a sequence different by one or more base pairs encompasses any sequence which hybridizes with the sequence indicated as a promoter fragment in FIG. 2 and has a promoter activity.
  • Sequence can differ from the sequence indicated as a promoter fragment in FIG. 2 by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more base pairs.
  • hybridization reference is made accordingly to the above statements.
  • promoter activity indicates that conventional methods of
  • Detection of promoter activity can be used.
  • a reporter gene e.g. a luciferase gene to which the 3 'end of the sequence to be tested for its promoter activity is ligated.
  • the DNA molecule obtained can be transfected into cells and the expression of the luciferase gene determined, whereby the promoter activity is detected.
  • Another object of the present invention is a DNA which is suitable for the detection of GDNF sequences.
  • the DNA is suitable as a primer or pair of primers for a PCR method.
  • Such DNA comprises one of the sequences shown in Fig. 4 or one of them by one or more
  • sequence different from one or more bases includes any sequence that hybridizes to the complementary sequence of the DNA shown in FIG. 4.
  • the sequence can differ from the DNA of FIG. 4 by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more bases.
  • hybridization reference is made accordingly to the above statements.
  • nucleic acid which codes for a GDNF variant.
  • the nucleic acid can be an RNA or a DNA, eg a cDNA.
  • a DNA is preferred which comprises the following:
  • a DNA different by one or more base pairs encompasses any GDNF-encoding DNA that hybridizes to the DNA of FIG. 3 and has exon 1 and / or exon 2 sequences from GDNF.
  • the DNA can differ from the DNA of FIG. 3 by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more base pairs.
  • hybridization reference is made accordingly to the above statements.
  • a GDNF variant Such comprises amino acids encoded by exon 2 and exon 3.
  • a GDNF variant according to the invention comprises the amino acid sequence of FIG. 3 (a) or (b) or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids, the DNA sequence of the latter amino acid sequence having the DNA of FIG. 3 (a) or (b) hybridizes and has exon 2 and exon 3 sequences.
  • an amino acid sequence different from one or more amino acids encompasses any GDNF amino acid sequence whose DNA sequence hybridizes with the DNA of FIG. 3 (a) or (b) and has exon 2 and exon 3 sequences.
  • the DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 3 (a) or (b) by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more base pairs.
  • Hybridization is referred to the above explanations accordingly.
  • Another object of the present invention is a combination of a GDNF variant and a receptor to which the GDNF variant binds.
  • the term "GDNF variant” includes a GDNF variant above. It also includes a GDNF variant that has no amino acids encoded by exon 2.
  • a DNA according to the invention can be present as such or in combination with any other DNA.
  • an inventive one is provided.
  • Pro m oto r activity with a D N A in a combination with a DNA to be transcribed e.g. a reporter gene or a structural gene.
  • a DNA to be transcribed e.g. a reporter gene or a structural gene.
  • a combination can be done in conventional vectors.
  • a reporter gene e.g. a luciferase gene
  • vectors such as pXP1 and pAH 1409 are available. These can then be used to transfect
  • Cells such as NIH3T3 and 293 cells can be used.
  • a DNA according to the invention having a promoter activity and a reporter gene it is possible to test the promoter activity under the most varied of conditions. In this way, substances can be found with which the promoter activity and thus the regulation of the expression of a GDNF-DNA can be influenced. Such substances can activate or. be inhibitory.
  • a DNA according to the invention coding for a GDNF variant can be present in an expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • an expression vector for E. coli these are, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • yeast for example, pY100 and Ycpad 1 should be mentioned, while for expression in animal cells, for example, pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, pBC140 and Rep 7 must be specified.
  • the bacculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • suitable cells in order to express the DNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH 1, x1 776, JM 101, JM 1 09, BL21 and SG 1 3009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa and HEK293 as well as the
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in conjunction with a DNA coding for another protein or peptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion protein.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against a protruding protein or fusion protein.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits, chickens or rats for a polyclonal and mice or rats for a monoclonal antibody, with an above (fusion) protein or fragments thereof. Further "boosters" of the animals can be carried out with the same (fusion) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • kits Such comprises one or more of the following components: (a) a DNA according to the invention,
  • auxiliaries such as carriers, buffers, solvents, controls, etc.
  • a GDNF variant can be detected with an antibody according to the invention.
  • a relationship of the GDNF variant to tissues and / or functions can be established.
  • an autoantibody directed against this protein can be detected with a GDNF variant according to the invention. Both detections can be carried out by conventional methods, in particular a Western blot, an ELISA, immunoprecipitation or by immunofluorescence.
  • the organization and expression of the gene coding for GDNF can be demonstrated with a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA and primers derived therefrom. This evidence can be found in more common
  • the present invention is suitable for taking measures for and against the presence of GDNF in people.
  • a GDNF variant can be inhibited by antibodies.
  • a GDNF variant according to the invention in particular after coupling to a protein that is not considered foreign by the body, for example transferrin or BSA, the amount of the GDNF variant can be increased in people.
  • a nucleic acid according to the invention in particular a DNA, which is placed under the control of a promoter which can be induced in certain tissues, for example the brain, and after its expression Providing a GDNF variant in these tissues leads.
  • a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA can also be used to inhibit GDNF.
  • the nucleic acid is used, for example as the basis for the creation of anti-sense oligonucleotides for the expression inhibition of the gene coding for GDNF.
  • the present invention is a means to better diagnose neurodegenerative diseases such as Parkinson's, amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer's and to intervene therapeutically.
  • Promoter fragments 1 the AGG “repeat” and the poly A sequences specified.
  • the variant at the DNA level comprises exons 1, 2 and 3, in FIG. 3 (b) exons 1, 2 and 3, wherein exon 2 has a 78 bp deletion, and in FIG. 3 (c) exons 1 and 3.
  • the GDNF variant does not include the region encoded by exon 1.
  • Fig. 4 shows pairs of primers which are suitable for a PCR reaction for the detection of GDNF sequences.
  • Fig. 5 shows the expression of a GDNF variant, which by the
  • FIG. 6 shows the promoter activity of promoter fragment 1 from FIG. 2 and its enhancement by substances.
  • Example 1 Expression of a DNA coding for a GDNF variant
  • a DNA according to the invention which codes for a GDNF variant and which comprises exons 1, 2 and 3 is expressed.
  • total RNA is isolated from 293 cells and subjected to an RT-PCR method.
  • the following primers which have an Xhol restriction site are used as the primer pair for the PCR method:
  • GDL.f 3'-ATGGCCGCCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3 '
  • GDX.r 5'-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACC-3 '
  • the cDNA obtained is subjected to Xhol cleavage and inserted into the expression vector pBC140 or Rep 7 opened with Xhol.
  • the expression plasmid pBC1 40-GDNF or Rep 7-GDNF is obtained.
  • the cells are cultivated in conditioned medium.
  • the cells are harvested 24 hours and 48 hours after transfection and the medium is collected.
  • the cells are subjected to an ultrasound treatment, whereby cell lysates are obtained.
  • These are combined with the medium and GDNF control of a 1 2 % polyacrylamide gel electrophoresis, which is then followed by a blot process.
  • the nitrocellulose membrane is incubated overnight at 4 ° C. with a rabbit antibody (Sta.Cruz) which recognizes the region of GDNF encoded by exon 3.
  • the antibody binding is then incubated for 2 hours at 4 ° C with a labeled goat anti-rabbit.
  • a DNA according to the invention which codes for a GDNF variant can be expressed. It is also clear that a GDNF DNA comprising exons 1, 2 and 3 codes for a GDNF variant which is secreted by the cell.
  • the vector pAH 1409 is used. This contains a reporter gene, namely a luciferase gene. At the 5 'end of the luciferase gene there is a polylinker into which the 1.1 kb EcoRI / PstI fragment (promoter fragment 1 from FIG. 2) is inserted. The expression plasmid pAH 1 409-GDNF is obtained.
  • pAH1409-GDNF This is used for the transfection of animal cells, 2 ⁇ g of pAH1409-GDNF 1, 5 ⁇ 10 6 cells being added. Furthermore, a DNA construct is codotransfected in a ratio of 1: 5, which codes for GFP ("Green Fluorescent Protein").
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • pAH 1 409 is transfected in parallel experiments. The cells are untreated or with TPA (100 ng / ml), 8-bromocAMP (1 mM), retinoic acid (RA 10 // M), bFGF (10 ng / ml) or IFNg (1000 enzyme units) treated. The cells are harvested 44-48 hours after transfection and luciferase detection is carried out (cf. FIG. 6).
  • Example 3 Production and purification of a GDNF variant according to the invention
  • the amplified DNA from Example 1 is digested with Xhol and inserted into the Xhol-digested expression vector pQE-8 (Qiagen).
  • the expression plasmid pQ / GDNF is obtained.
  • pQ / GDNF is used to transform E.coli SG 1 3009 (cf. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 1 48, (1 981), 265-273).
  • the bacteria are in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampiciliin and
  • the bound fusion protein is eluted in a pH 3.5 buffer. After neutralization, the fusion protein is subjected to 1 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (see Thomas, J.O. and Kornberg, R.D., J. Mol.Biol. 149 (1 975), 709-733).
  • a fusion protein according to the invention from Example 3 is subjected to 1 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 30 kD band is cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. Pieces of gel are sedimented before the protein concentration of the supernatant is determined by an SDS-polyacrylamide
  • the rabbit's serum is tested in an immunoblot.
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 1 0, (1 984), 203-209) .
  • the nitrocellulose filter cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 1 0, (1 984), 203-209 .
  • Antibody is a goat anti-rabbit IgG (Dianova) monoclonal antibody coupled to alkaline phosphatase (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, there are several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M. 5 'Bromo-4-chloro-3-indolyiphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris
  • Antibodies are extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention are detected.
  • a DNA according to the invention has a promoter activity and this can be enhanced by substances.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten sowie gegen sie gerichtete Antikörper. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der GDNF-kodierenden DNA, Teile davon und der GDNF-Varianten.

Description

GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten
Die vorliegende Erfindung betrifft eine GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten sowie gegen sie gerichtete Antikörper. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der GDNF-kodierenden DNA, Teile davon und der GDNF-Varianten.
Neurotrophe Faktoren sind Proteine, die im Nervensystem oder in durch das Nervensystem innervierten Geweben vorliegen. Ihre Aufgabe liegt in der Versorgung von Glia- und Nervenzellen. Ferner fördern sie die Differenzierung von Neuronen. Ein von Gliazellen stammender neurotropher Faktor ist GDNF ("glial cell line- derived neurotrophic factor") . Dieser gehört zur TGF-ß ("transforming g rowth f acto r-ß " ) Su perf ami l ie . G D N F i st ei n etw a 30 kd gro ßer Differenzierungs-Faktor für die verschiedensten Neuronen. Dies sind z.B. dopaminerge Neuronen des Mittel hirns, spinal-motorische, kranial-sensorische und sympathische Neuronen wie auch noradrenerge Neuronen des Hinterhirns. Ferner fördert GDNF die Aufnahme von Dopamin durch das Mittelhirn. Des weiteren haben Versuche mit Parkinson aufweisenden Rhesusaffen gezeigt, daß eine intrazerebrale Verabreichung von GDNF eine funktionelle Wiederherstellung bewirken kann.
Dies läßt vermuten, daß über GDNF in neurodegenerative Erkrankungen, wie
Parkinson, amyotrophische Lateralsklerose und Alzheimer, eingegriffen werden kann. Ein solches Eingreifen könnte auf mehreren Ebenen, z.B. auf der Ebene der Expression des GDNF-Gens und der Prozessierung von GDNF, erfolgen. Bisher liegen allerdings über diese Ebene keine ausreichenden Erkenntnisse vor.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Regulation von GDNF auf molekularer Ebene untersucht und ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in diese Regulation eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Mittel, mit denen kodierende und regulatorische Bereiche einer genomischen GDNF-DNA und ihre gegenseitigen Einflüsse untersucht werden können. Ferner sind es Mittel, mit denen die Expression, insbesondere verschiedene Expressionsformen, einer solchen
DNA, bestimmt werden können. Desweiteren sind es Mittel, die ein gezieltes Eingreifen in die Regulation dieser DNA ermöglichen können.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders über die Struktur und die transkriptioneile Regulation einer genomischen GDNF-DNA. Der
Anmelder hat eine solche DNA im humanen Genom am Genlocus 5p 1 2-p1 3.1 identifiziert. Er hat diese DNA auf dem PAC Klon 24B 1 2 isoliert und charakterisiert (vgl. Fig. 1 ). Ferner hat er die Sequenz für die kodierenden und für die transkriptioneile Regulation wichtigen Bereiche der GDNF-DNA aufgeklärt (vgl. Fig. 2) . Die DNA enthält drei Exons, die für eine 3.6 kb große cDNA kodieren, sowie große 5'- und 3'-untranslatierte Regionen (UTRs) . Die 3'-UTR enthält ein polymorphes AGG-" repeat" , das allerdings in Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson, idiopathisches Parkinson- Syndrom, ALS, Alzheimer, spinozerebellare Ataxie oder dopa-responsive Dystonie, nicht in klinisch relevanter Häufung vorliegt. Die Transkription der
GDNF-DNA wird durch einen eine TATA-Box enthaltenden Promotor bewirkt, der vor Exon 1 liegt. Ein zweiter Promotor befindet sich vor Exon 2. Der erste Promotor kann durch verschiedene Substanzen in seiner Promotoraktivität verstärkt werden. Solche Substanzen sind z.B. der Entzündungsmediator Tetradecanoyl- 1 2-phorbol-acetat (TPA) , der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2
(FGF2bFGFf), cAMP wie auch das Differenzierungsmittel Retinoesäure (RA). Diese Substanzen spielen eine wichtige Rolle in Entwicklungsprozessen der Zelle wie auch in anti-apoptotischen, durch Verletzungen induzierten Signalwegen. Des weiteren hat der Anmelder DNAs gefunden, die für GDNF-Varianten kodieren. Eine dieser DNAs umfaßt die Exons 1 , 2 und 3. Eine andere DNA umfaßt die Exons 1 , 2 und 3, wobei Exon 2 eine 78 bp große Deletion aufweist. Eine weitere DNA umfaßt die Exons 1 und 3. Die Sequenzen dieser DNAs und der entsprechenden GDNF-Varianten sind in Fig. 3 angegeben. Der Anmelder hat erkannt, daß Exon 2 für eine sekretierbare Form von GDNF notwendig ist, während Exon 3 für eine intrazelluläre Form ausreicht. Auch hat er erkannt, daß Exon 1 nicht translatiert wird.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, eine GDNF- kodierende DNA bereitzustellen, umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und keine GDNF-cDNA ist. Die DNA von Fig. 2 wurde als E.coli 24B1 2 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 20. März 1 998 unter DSM 1 2063 hinterlegt.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Se- quenz" umfaßt jegliche für GDNF-kodierende Sequenz, die mit der DNA von Fig.
2 hybridisiert und keine GDNF-cDNA ist. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 2 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen vo n ei n od er m e h rere n Basen paa ren u nterscheid e n . Der Ausd ruc k "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz hin. Der Ausdruck
"keine GDNF-cDNA" weist darauf hin, daß die Sequenz Elemente umfaßt, die in einer cDNA fehlen. Solche Elemente sind z.B. Intron- oder transkriptioneile Regulations-Sequenzen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA mit Promotor-
Aktivität, umfassend die in Fig. 2 als Promotorfragment 1 angegebene Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der ersteren hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz" umfaßt jegliche Sequenz, die mit der in Fig. 2 als Promotorfragment angegebenen Sequenz hybridisiert und eine Promotor-Aktivität aufweist. Die
Sequenz kann sich von der in Fig. 2 als Promotorfragment angegebenen Sequenz durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung " wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen. Der Ausdruck "Promotor-Aktivität" weist darauf hin, daß übliche Verfahren zum
Nachweis einer Promotor-Aktivität verwendet werden können. Beispielsweise kann ein Reporter-Gen, z.B. ein Luciferase-Gen, an das 3'-Ende der auf ihre Promotor-Aktivität hin zu testenden Sequenz ligiert werden. Das erhaltene DNA- Molekül kann in Zellen transfiziert und die Expression des Luciferase-Gens bestimmt werden, wodurch die Promotor-Aktivität nachgewiesen wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die sich zum Nachweis von GDNF-Sequenzen eignet. Insbesondere eignet sich die DNA als Primer bzw. Primer-Paar für ein PCR-Verfahren. Eine solche DNA umfaßt eine der in Fig. 4 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere
Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementären Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz" umfaßt jegliche Sequenz, die mit der komplementären Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 4 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basen unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine GDNF-Variante kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z.B. eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon- 1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für GDNF-kodierende DNA, die mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon- 1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist. Die DNA kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden . Hinsichtlich des Ausdrucks " Hybrid isierung " wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine GDNF-Variante. Eine solche umfaßt durch Exon 2 und Exon 3 kodierte Aminosäuren. Insbesondere umfaßt eine erfindungsgemäße GDNF-Variante die Aminosäuresequenz von Fig. 3 (a) bzw. (b) oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2- und Exon 3-Sequenzen aufweist.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche GDNF-Aminosäuresequenz, deren DNA- Sequenz mit der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2 und Exon 3-Sequenzen aufweist. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung " wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination aus einer GDNF-Variante und einem Rezeptor, an den die GDNF-Variante bindet. Der Ausdruck "GDNF-Variante" umfaßt eine vorstehende GDNF-Variante. Ferner umfaßt er eine GDNF-Variante, die keine durch Exon 2 kodierten Aminosäuren aufweist.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße, eine
Pro m oto r-Aktivität auf weisend e D N A i n Ko m bi n atio n m it ei ne r zu transkribierenden DNA, z.B. einem Reporter-Gen oder einem Struktur-Gen, vorliegen. Eine solche Kombination kann in üblichen Vektoren erfolgen. Für eine Kombination mit einem Reporter-Gen, z.B. einem Luciferase-Gen, bieten sich Vektoren, wie pXP1 und pAH 1409, an. Diese können dann zur Transfektion von
Zellen, wie NIH3T3 und 293-Zellen, verwendet werden. Mit der Kombination aus einer erfindungsgemäßen, eine Promotor-Aktivität aufweisenden DNA und einem Reporter-Gen ist es möglich, die Promotor-Aktivität unter den verschiedensten Bedingungen zu testen. Damit können Substanzen gefunden werden, mit denen die Promotor-Aktivität und somit die Regulation der Expression einer GDNF-DNA beeinflußt werden können. Solche Substanzen können aktivierend bzw . inhibierend sein.
Ferner kann eine erfindungsgemäße, für eine GDNF-Variante kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpad l zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, pBC140 und Rep 7 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressions- vektor pAcSGHisNT-A. Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH 1 , x1 776, JM 101 , JM 1 09, BL21 und SG 1 3009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3 , FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa und HEK293 sowie die
Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans- fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen- des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen, Hühner oder Ratten für einen polyklonalen und Mäuse oder Ratten für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten: (a) eine erfindungsgemäße DNA,
(b) eine erfindungsgemäße GDNF-Variante,
(c) ein erfindungsgemäßer Antikörper, sowie
(d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.
Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen . Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Regulation von GDNF auf molekularer Ebene zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann eine GDNF-Variante nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung der GDNF-Variante zu Geweben und/oder Funktionen hergestellt werden. Ferner kann mit einer erfindungsgemäßen GDNF-Variante ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für GDNF kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher
Weise, insbesondere in einem Southern Blot oder über "in situ" Hybridisierung, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen für und gegen das Vorliegen von GDNF in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen
Antikörper kann eine GDNF-Variante inhibiert werden. Andererseits kann mit einer erfindungsgemäßen GDNF-Variante, insbesondere nach Kopplung an ein vom Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z.B. Transferrin oder BSA, die Menge der GDNF-Variante in Personen erhöht werden. Entsprechendes kann auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, erreicht werden, die unter die Kontrolle eines in bestimmten Geweben, z.B. Gehirn, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur Bereitstellung einer GDNF-Variante in diesen Geweben führt. Darüberhinaus kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, auch zur Inhibierung von GDNF genutzt werden. Hierzu wird die Nukleinsäure, z.B. als Basis für die Erstellung von Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expressions- Inhibierung des für GDNF kodierenden Gens verwendet. Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, neurodegenerative Erkrankungen, wie Parkinson, amyotrophische Lateralsklerose und Alzheimer, besser zu diagnostizieren und therapeutisch eingreifen können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt die Organisation einer genomischen GDNF-DNA, wobei in A) eine grobe und in B) eine detaillierte Restriktionskarte angegeben ist. Exons sind als Boxen angegeben, wobei ausgefüllte Teile dieser kodierende Bereiche und nicht-ausgefüllte Teile UTRs sind. Ferner ist die Lage des AGG-"repeat" und der Poly A-Sequenzen angegeben.
Fig.2 zeigt die Sequenzen der Exons 1, 2 und 3 einer genomischen GDNF-DNA. Ferner sind Sequenzen der Introns, des
Promotorfragments 1, des AGG-"repeat" und der Poly A- Sequenzen angegeben.
Fig.3 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen für GDNF- Varianten, In Fig. 3(a) umfaßt die Variante auf der DNA-Ebene die Exons 1, 2 und 3, in Fig.3(b) die Exons 1, 2 und 3, wobei Exon 2 eine 78 bp große Deletion aufweist, und in Fig.3(c) die Exons 1 und 3. Auf der Proteinebene umfaßt die GDNF-Variante jeweils nicht den durch Exon 1 kodierten Bereich.
Fig.4 zeigt Primer-Paare, die sich für eine PCR-Reaktion zum Nachweis von GDNF-Sequenzen eignen. Fig. 5 zeigt die Expression einer GDNF-Variante, welche die durch die
Exon 2 und 3 kodierten Bereiche umfaßt. Die GDNF-Variante wird in das Medium sekretiert.
Fig. 6 zeigt die Promotor-Aktivität des Promotorfragments 1 von Fig. 2 und ihre Verstärkung durch Substanzen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Expression einer für eine GDNF-Variante kodierenden DNA
Es wird eine erfindungsgemäße für eine GDNF-Variante kodierende DNA exprimiert, welche die Exons 1 , 2 und 3 umfaßt. Hierzu wird aus 293-Zellen Gesamt-RNA isoliert und einem RT-PCR-Verfahren unterzogen. Als Primer-Paar für das PCR-Verfahren werden die nachstehenden Primer verwendet, die eine Xhol-Restriktionsstelle aufweisen:
GDL.f: 3'-ATGGCCGCCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3'
GDX.r: 5'-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACC-3'
Die erhaltene cDNA wird einer Xhol-Spaltung unterzogen und in den mit Xhol- geöffneten Expressionsvektor pBC140 bzw. Rep 7 inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pBC1 40-GDNF bzw. Rep 7-GDNF erhalten.
Dieses wird zur Transfektion von tierischen Zellen verwendet, wobei 2 μg des Expressionsplasmids 1 , 5 x 1 06 Zellen zugegeben werden. Die Zellen werden in konditioniertem Medium kultiviert. 24 Stunden bzw. 48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen geerntet und das Medium gesammelt. Die Zellen werden einer Ultraschall-Behandlung unterzogen, wodurch Zellysate gewonnen werden. Diese werden zusammen mit dem Medium und GDNF-Kontrolle einer 1 2 %igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, der anschließend ein Blot- Verfahren folgt. Nach diesem wird die Nitrocellulosemembran über Nacht bei 4°C mit einem Kaninchen-Antikörper (Sta.Cruz) inkubiert, der den durch Exon 3 kodierten Bereich von GDNF erkennt. Die Antikörperbindung wird dann durch 2stündige Inkubation bei 4°C mit einem markierten Ziege-anti-Kaninchen-
Antikörper (Tropix) sichtbar gemacht (vgl. Fig. 5) .
Es zeigt sich, daß eine erfindungsgemäße, für eine GDNF-Variante kodierende DNA exprimiert werden kann. Ferner wird deutlich, daß eine die Exons 1 , 2 und 3 umfassende GDNF-DNA für eine GDNF-Variante kodiert, die von der Zelle sekretiert wird.
Beispiel 2: Nachweis von Promotor-Aktivität einer erfindungsgemäßen DNA
Es wird der Vektor pAH 1409 verwendet. Dieser enthält ein Reporter-Gen, nämlich ein Luciferase-Gen. Am 5'-Ende des Luciferase-Gens befindet sich ein Polylinker, in den das 1 , 1 kb große EcoRI/Pstl-Fragment (Promotorfragment 1 von Fig. 2) inseriert wird. Es wird das Expressionsplasmid pAH 1 409-GDNF erhalten.
Dieses wird zur Transfektion von tierischen Zellen verwendet, wobei 2 μg von pAH1409-GDNF 1 ,5 x 106 Zellen zugegeben werden. Ferner wird in einem Verhältnis von 1 :5 ein DNA-Konstrukt cotransfiziert, das für GFP ("Green Fluorescent Protein") kodiert. Als Kontrolle wird pAH 1 409 in Parallelversuchen transfiziert. Die Zellen werden unbehandelt bzw. mit TPA ( 1 00 ng/ml) , 8-Brom- cAMP ( 1 mM), Retinoesäure (RA 1 0//M), bFGF ( 1 0 ng/ml) oder IFNg ( 1000 Enzymeinheiten) behandelt. 44-48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen geerntet und es wird ein Luciferase-Nachweis durchgeführt (vgl. Fig. 6) .
Es zeigt sich, daß eine erfindungsgemäße, das Promotorfragment 1 von Fig. 2 umfassende DNA eine Promotor-Aktivität aufweist und diese durch Substanzen verstärkt werden kann. Beispiel 3: Herstellung und Reinigung einer erfindungsgemäßen GDNF-Variante
Die amplifizierte DNA von Beispiel 1 wird mit Xhol gespalten und in den mit Xhol gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expres- sionsplasmid pQ/GDNF erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen GDNF von Fig. 3 (a) (C-Terminuspartner) . pQ/GDNF wird zur Transformation von E.coli SG 1 3009(vgl. Gottesman, S. et al. , J. Bacteriol. 1 48, ( 1 981 ), 265-273) verwen- det. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100μg/ml Ampiciliin und
25 yg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyra- nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt.
Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 1 8 % SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 ( 1 975), 709-733) .
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 4: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 3 wird einer 1 8 % SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 30 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert: Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 35 μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt. Tag O: 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J. , J. Biochem. Biophys. Meth. 1 0, (1 984), 203-209). Die
Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, ( 1 994), 21 5-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens ( 1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser
Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova) ( 1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM . 5' Bromo-4-chloro-3-indolyiphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium, 100mM Tris-
HCI, pH 9.5, 1 00 mM NaCI, 5 mM MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können. Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung werden 40μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus bzw. Ratte
Pro Immunisierung werden 1 2μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84: 4. Immunisierung (PBS) Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.
Es zeigt sich, daß eine erfindungsgemäße DNA eine Promotor-Aktivität aufweist und diese durch Substanzen verstärkt werden kann.

Claims

Patentansprüche
1 . GDNF-kodierende DNA, umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und keine GDNF-cDNA ist.
2. DNA mit Promotor-Aktivität, umfassend die in Fig. 2 als Promotorfragment 1 angegebene Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der ersteren hybridisiert.
3. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA in Kombination mit einer zu transkribierenden DNA vorliegt.
4. DNA nach Anspruch 3, wobei die zu transkribierende DNA ein Reporter- Gen ist.
5. DNA, geeignet zum Nachweis von GDNF-Sequenzen, umfassend eine der in Fig. 4 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementä- ren Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert.
6. DNA, kodierend für eine GDNF-Variante, umfassend:
(a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von
GDNF aufweist, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
7. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 6.
8. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 7.
9. GDNF-Variante, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 3 (a) bzw. (b) oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2- und Exon 3-Sequenzen aufweist.
10. Antikörper, gerichtet gegen die GDNF-Variante nach Anspruch 9.
1 1 . Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 -6 oder der GDNF- Variante nach Anspruch 9 zur Untersuchung der Regulation von GDNF.
12. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 -6 oder der GDNF- Variante nach Anspruch 9 zur Diagnose und/oder Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
1 3. Verwendung nach Anspruch 1 2, wobei die neurodegenerativen Erkrankungen Parkinson, amyothrophische Lateralsklerose und Alzheimer umfassen.
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