EP1226272A2 - Doppelstrang-nukleinsäure-sonden und deren verwendung - Google Patents

Doppelstrang-nukleinsäure-sonden und deren verwendung

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Publication number
EP1226272A2
EP1226272A2 EP00969512A EP00969512A EP1226272A2 EP 1226272 A2 EP1226272 A2 EP 1226272A2 EP 00969512 A EP00969512 A EP 00969512A EP 00969512 A EP00969512 A EP 00969512A EP 1226272 A2 EP1226272 A2 EP 1226272A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
double
stranded nucleic
stranded
acid probes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00969512A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jochen Muth
Norbert Windhab
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanogen Recognomics GmbH
Original Assignee
Nanogen Recognomics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanogen Recognomics GmbH filed Critical Nanogen Recognomics GmbH
Publication of EP1226272A2 publication Critical patent/EP1226272A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors

Definitions

  • the present invention relates to electronically readable double-stranded nucleic acid derivatives and their use for the quick and easy detection of interactions between double-stranded nucleic acids and factors which interact directly or indirectly with them, in particular with proteins, peptides, single-stranded or double-stranded nucleic acids or substances which damage nucleic acids.
  • Double-stranded nucleic acids play a crucial role in the living cell and also in many viruses, especially as carriers of the hereditary system. They are subject to natural systems such as B. a cell of various internal and external influences. Interactions between proteins and double-stranded DNA are of particular interest, since such interactions have a decisive influence on the transcription or repression of individual genes and thus on the phenotype of the corresponding organisms. But also the replication of the hereditary system in mitosis or meiosis, the restriction z. B. viral nucleic acids or the packing and unpacking of eukaryotic nucleic acids in the chromosomes are other important processes in living cells that are controlled by the complex interplay of proteins and nucleic acids.
  • nucleic acids themselves, whether single-stranded or double-stranded, can with their double-stranded relatives, e.g. B. in the recombination, insertion or transposition, interact.
  • the methods described are limited to the detection of hybridized single-stranded nucleic acids.
  • the detection is limited to the mere presence of a target sequence in the medium to be examined and, moreover, does not allow any statements about the biological activity of the interacting nucleic acids.
  • a radioactively labeled DNA sequence is an incomplete restriction degradation, eg. B. subjected to DNAse I. The sequence is protected from degradation at the corresponding site by a bound protein; the corresponding bands are missing in the electrophoretic fragment detection compared to the free sequence.
  • the object of the present invention is to provide novel probes for the detection and analysis of interactions of double-stranded nucleic acids as well as methods for the rapid and simple detection of such interactions.
  • the task is accomplished with the help of new, electronically readable double-strand
  • the probes contain at least partially double-stranded nucleic acids or single-stranded nucleic acids with self-recognizing domains which are attached to a conductive surface, preferably to an electrode, e.g. B. are bound to field effect transistors.
  • the nucleic acid section present as a duplex is linked to at least one electron donor unit or alternatively to at least one electron acceptor unit, with at least a portion of the nucleic acid region to be investigated between the electrode and the electron acceptor unit or electron donor unit lies. This sub-area forms the detection point.
  • the binding of the individual probe subunits can take place covalently or via stable supramolecular interactions, such as van der Waals interactions, dipole interactions, especially hydrogen bonds, or ionic interactions.
  • All single-stranded or double-stranded nucleic acids of any sequence can be used to construct the probe. It is irrelevant whether natural, synthetic or modified nucleic acid sequences are used.
  • the corresponding double strand can be formed simply by hybridization with a complementary single-stranded nucleic acid (e.g. McCarthy, BJ et al., "Specificity of Moiecular Hybridization Reaction” Annu. Rev. Biochem. (1970), 39 , 131-150), the formation of a double strand in the case of self-complementary single-stranded nucleic acids being caused by intramolecular refolding.
  • a complementary single-stranded nucleic acid e.g. McCarthy, BJ et al., “Specificity of Moiecular Hybridization Reaction” Annu. Rev. Biochem. (1970), 39 , 131-150
  • two domains with more complementary sequences are advantageously covalently linked via a bridge comprising at least one nucleotide, preferably one from 4 to A bridge consisting of 6 nucleotides, in particular of thymine nucleotides, or linked via an artificial, at least one atomic bridge, such as disulfide bridges (Hetian Gao et al., “Stabilization of double-stranded oligonucleotides using backbone-linked disulfide bridges ", Nucleic Acid Research, 1995, Vol. 23, No.
  • Modifier-CPG (GlenResearch), which is preferably built on a thiol support, or branched phosphoramidite bridges.
  • a great advantage of such nucleic acids containing self-complementary sequence segments lies in the simple, fully synthetic accessibility of the single-stranded nucleic acid and the simple manufacture of the double-stranded probe from a single molecular nucleic acid subunit.
  • Hybridization of the single-stranded self-complementary sequence segments containing nucleic acids is independent of the nucleic acid concentration. Another advantage of this process is that it can be produced enzyme-free. Another advantage is therefore that the double-stranded nucleic acid probes can also be prepared under denaturing conditions. A hairpin-forming single-stranded sequence with a free 3 ' OH end can also be obtained using a DNA or RNA polymerase, e.g. B. a Klenow or Taq polymerase to the corresponding nucleic acid duplex are completed.
  • a DNA or RNA polymerase e.g. B. a Klenow or Taq polymerase to the corresponding nucleic acid duplex are completed.
  • RNAs can be used.
  • modified derivatives include, in particular, nucleic acids which contain nucleotides modified on the sugar, such as 2 , O-methyl nucleotides or 2 ' O-allyl nucleotides.
  • a modification of the phosphate group such as. B. to phosphoramide, phosphorothioate or
  • Methylphosphonate is also possible. It is also possible to use nucleic acids which contain no sugar or a sugar which does not occur in natural nucleic acids, such as. B. the peptidyl nucleic acids or the pyranosyl nucleic acids. In addition to those modified on the sugar-phosphate backbone ⁇ > Nucleic acids can also be used as probe components that contain non-naturally occurring nucleotides such as xanthine, hypoxanthine or inosine.
  • Double-stranded DNA or RNA nucleic acid sequences are preferably incorporated into the probes.
  • Naturally occurring proteins or peptides binding DNA sequences in particular DNA sequences involved in gene regulation, such as. B. operator or promoter sequences.
  • DNA sequences involved in gene regulation such as. B. operator or promoter sequences.
  • consensus sequences or allele-specific or organism-specific sequences can be expedient.
  • the length of the nucleic acid sequence between the electrode and the electron donor units or electron acceptor units is preferably between 2 and 100 base pairs, particularly preferably between 5 and 50 base pairs.
  • the double-stranded area must extend to the nucleic acid electrode linker in order to ensure an electron flow.
  • Single-stranded areas can extend beyond the double-stranded detection region lying between the electrode and the electron donor units or electron acceptor units.
  • the double-stranded detection region can contain single-strand breaks in the sugar-phosphate backbone.
  • a double strand can by chemical modifications that lead to inter- or intramolecular bridge bonds, such as. B. disulfide bridges, or other non-natural strand subunits can be chemically stabilized.
  • Another possibility of stabilizing the nucleic acid duplex sections is the targeted introduction of thymine nucleotides at two opposite positions in the duplex and subsequent radiation-induced thymidine bridge formation.
  • azido nucleotides or psoralen derivatives can also be used for photoinduced bridging (Fabrega, C.
  • All molecules, parts of molecules or surfaces which are able to donate electrons from their ground state or from an excited state or to take up electrons in the ground state or in an activated state can act as electron donor units or electron acceptor units.
  • the excitation of an electron donor unit can e.g. B. done by exposure to light or ionization, the activation of an electron acceptor z. B. by ionization also by means of light or by chemical ionization.
  • Proven electron donors and acceptors are e.g. B. metal complexes or organic redox-active compounds, as described in patent application WO 96/40712 or naturally occurring or modified photo-inducible redox-active reaction centers such as z. B. can be used in the patent application DE 19901761 A1.
  • electrically conductive surfaces, in particular electrodes can also be used as donor or acceptor units.
  • the use of ferrocene or PQQ as electron donor units has proven itself experimentally.
  • the covalently bound electron donor units or electron acceptor units can be integrated in multimolecular electron transfer systems.
  • the electron donor unit (electron acceptor units) acting in the double-stranded nucleic acid probe can be dissolved electron donors such as e.g. Anions (cations) can be charged in a regenerable manner, with a closed circuit being built up using the double-stranded nucleic acid probes as a resistor.
  • anions cations
  • other redox-active electron transfer units may be associated with the covalently bound electron donor or acceptor unit.
  • Inducible and / or regenerative donor or acceptor units are preferred. Regenerative systems enable a continuous flow of electrons through the duplex nucleic acid, while in inducible systems the flow of electrons through the inductor can be controlled over time.
  • the electron flow can be induced analogously to the natural photosynthesis processes by exposure to light.
  • suitable electron donating dissolved substances such as. B. Fe (CN) 3 " or Fe (CN) ⁇ 4"
  • the reaction centers can be regenerated again.
  • Induction can also take place directly via chemical substances which transfer electrons to the electron donor units or withdraw electrons from the electron acceptor units.
  • connection of the nucleic acids to the electrode can e.g. via a thiol group (Chidsey, C.E.D., Sience, V. 251, p. 919, (1991)) or via phosphorothioates or phosphorodithioates on a gold surface.
  • a connection via highly conductive molecule linkers e.g. described by Kayyem et al. In WO 98/20162
  • linkers with conjugated double bond systems allows electron conduction along the linker structure to the electrode surface. This elegantly enables passivation of the free electrode surface.
  • the double-stranded nucleic acid probes can be connected to an unstructured, coherent electrode surface or to a structured, e.g. B. matrix-shaped electrode array surface.
  • the structuring takes place in such a way that the individual array positions of the electrode can be read independently of one another.
  • the individual array positions can be assigned nucleic acid probes with specific sequences, or the reaction space can be compartmentalized. A high degree of parallelization can thus be achieved in the electronic reading of the electrode.
  • the double-stranded nucleic acid probes according to the invention offer the possibility of detecting factors interacting with nucleic acid double-strands by changing the conductivity.
  • Interacting factors are chemical substances or radiation that interact with a nucleic acid duplex and trigger a change in the primary, secondary, tertiary or quaternary structure of the duplex. These structural changes lead to a significant change in the electrical resistance of the duplex structure and thus to a change in the electron flow along the double-stranded nucleic acid.
  • other effects such as B.
  • Changes in the electrical conductivity of double-stranded nucleic acids are e.g. B. by the binding of proteins or peptides such as antibodies, polymerases, transcription factors, enhancers or repressors, the activity of which in turn by indirectly acting substances such as. B. can be modulated via inductors or modifying enzymes.
  • Organic molecules such as some hormones can also be used directly or in conjunction with proteins or peptides such as e.g. B. hormone receptors, interact with double-stranded nucleic acids.
  • Single-stranded nucleic acid can also, for. B. interact with triplex formation with double-stranded nucleic acids. But also saline solutions, mimetics or substances intercalating into the nucleic acid duplex, including cytostatics like the anthracyclines, cause measurable changes in the structure of the double strand.
  • Topoisomerases cause single strand breaks and linkages. But also mimetics, nucleic acid-damaging substances and cytostatics that z. B. alkylating on nucleic acids or cross-linking, such as platinum complexes, for. B. cisplatin, methanesulfonates, e.g. B. busulfan, or n-nitroso compounds, for example Carmustine can attack their covalent bonds and / or new covalent ones
  • Radioactive and electromagnetic radiation such as. B. ⁇ -, ß-, ⁇ - or UV radiation can also lead to such structural changes and thus to a measurable change in the electron flow within the double-stranded nucleic acid.
  • the use of the double-stranded nucleic acid derivatives according to the invention as probes offers many advantages. All interactions to which a double-stranded nucleic acid probe is exposed and which have an effect on the electrical conductivity can be detected.
  • the measurement can be coulombmetric, impedometric, preferably frequency-dependent resistive or capacitive, voltammetric, potentiometric or amperometric.
  • the disruptive effect of ions directly discharged at the electrode from the reaction solution is surprisingly very low.
  • the electron flow can be frequency-modulated by the double-stranded nucleic acid probe. When using photo-inducible electron donor units, the modulation can take place via flashes of light.
  • Very small changes in conductivity can also be detected via the number of probes applied or by extending the measuring time.
  • the number of probes is preferably selected so that the current change resulting from the interaction between the double-stranded nucleic acid and the factors interacting with it is at least in the nA range. Due to the particularly high sensitivity, cyclovoltammetry, differential pulse voltammetry and square wave voltammetry have proven to be a particularly suitable measurement method.
  • Another advantage of the present probes is their high compatibility with a wide variety of reaction media.
  • the use of crude extracts as the reaction medium or the use of reaction media with a salt concentration corresponding to the natural conditions are of interest.
  • the kinetics of double-stranded nucleic acid interactions can be examined and equilibrium constants of double-stranded nucleic acids with interacting substances can be determined. That offers the Possibility to find antagonists and allosteric interactions with other factors and to determine their activity. Investigations can be carried out as a multi-step reaction in which individual factors are pipetted to the reaction solution in succession during the measuring process.
  • the probes according to the invention are particularly suitable for the investigation of gene regulation, in particular the transcription or repression of genes.
  • a large number of substances that directly interact with the double-stranded DNA play a role in gene regulation, such as RNA polymerases, transcription factors, repressors or enhancers or which only have an indirect effect, such as, for example, B. inducers, enzymes, such as phosphorylases, second messengers, such as cAMP or cGMP, receptors and their binding partners, such as hormones, play an important role.
  • the signal chains that lead to the transcription or repression of individual genes can be extremely complex.
  • the probes according to the invention can provide important insights in elucidating the interaction of the individual factors.
  • z. B known regulatory DNA sequences of a gene incorporated into the probes.
  • the probes are applied to an electrode surface so that the sum of the change in the electrical conductivity of the double-stranded DNA probes is measured.
  • the reference electron flow through the probes is determined in the presence of a reference solution.
  • the reference value can also be determined using a standard electrochemical cell / electrode.
  • the reference solution ideally contains all components of the reaction solution except the factors to be tested.
  • the reference electron flow is modulated by the gradual addition of the individual substances to be tested.
  • the change in the electron flow then provides information about a successful interaction between the test substance and the probe sequence, the strength of the change in the electron flow provides information the strength of the interaction and the equilibrium constant of the binding reaction.
  • the effect of other factors influencing the activity of these substances can be determined indirectly by changing the equilibrium constants of RNA polymerases, transcription factors or repressors.
  • reaction solutions containing different factors can be tested or the indirectly acting factors are successively introduced into the reaction solution.
  • Interactions between individual substances within the regulatory signal chains can be determined.
  • the lactose operon from Escherichia coli offers an example of such an induction mechanism.
  • the effect of the lac repressor is canceled by the presence of lactose, the repressor loses its affinity for the operator sequence and the electron flow will adjust to the reference value. If ⁇ -galactosidase, a lactose-degrading enzyme, is added to the reaction solution, the lac repressor is reactivated.
  • lexA repressor in E. coli, which regulates numerous genes that are involved in DNA repair. RecA proteins bound by single-strand DNA are proteolytically cleaved and thus from 23 associated operator replaced. The electron flow within the double-stranded DNA probe will consequently adjust to the reference value again.
  • the degree of alignment of the electron flow with the reference electron flow is a measure of the strength of the inductive effect.
  • concentration-dependent effects of the inductor on the repressor or a linear dependence of the induction on the inductor concentration can be determined.
  • the electron flow remains at the reference value.
  • a regulatory mechanism is e.g. B. in the tryptophan operon of E. coli.
  • the trp repressor is activated by the presence of tryptophan and the repressor tryptophan complex binds to the associated operator sequence. A deviation of the electron flow within the double-stranded DNA probes from the reference value can be determined.
  • probes can be used which contain a promoter sequence.
  • a reference value can then be determined, which is modulated by adding individual factors.
  • a change in the reference value indicates an interaction of the added substance.
  • the RNA polymerases and transcription factors that bind in the promoter area can then be identified.
  • the binding of the transcription factor Sp1 which specifically binds to this promoter can be determined.
  • second messenger or modifying enzymes such as. B. phosphorylases, or transcription Influencing molecules, like some antibiotics, their activating or inhibiting influence on the transcription factor-DNA binding is measurable.
  • transcription factor p53 the gene product of a tumor suppressor gene.
  • p53 can by adding a phosphorylase, in the presence of a suitable phosphate donor, such as. B. ATP, phosphorylated and thus activated.
  • a suitable phosphate donor such as. B. ATP
  • the electron flow changes continuously due to the binding of the phosphorylated p53 to the probe sequence up to a concentration-dependent saturation value.
  • information about the reaction rate can then be obtained from the slope of the electron flow-time curve. The greater the slope of the curve, the higher the reaction rate, in the example of the phosphorylation reaction.
  • the DNA sequence of the probes includes the operator and the promoter
  • competitive effects between RNA polymerases, promoter-binding transcription factors and repressors can also be measured.
  • Ousted z. B. a repressor an already bound transcription factor the electron flow changes accordingly. The measured electron flows lie between the values for the reaction solutions containing only one RNA polymerase and / or the transcription factor and only the repressor. So z. B. the direct influence of the lac, trp or lexA repressor on the RNA polymerase binding to the promoter can be investigated.
  • a particular advantage of the method described here is the possibility of investigating allele-specific interactions between regulatory active substances and the associated DNA regulation sequences.
  • the different activity of DNA sequences and DNA-binding proteins or peptides of the wild type and mutated DNA sequences, proteins or peptides can be carried out in separate batches independently of phenotypically recognizable changes to be examined.
  • the study of recessive characteristics is possible.
  • Heterozygous organisms with regard to the transcription factor result in an electron flow through the double-stranded nucleic acid probe which lies between the two extracts from the homozygous organisms, in this case extracts with a certain concentration have to be used.
  • the method is not limited to the identification of substances that participate in gene regulation.
  • B. also bind histones, helicases, topoisomerases or ligases to double-stranded DNA. While helicases, topoisomerases and chromatin remodulating enzymes (e.g. nucleosomal ATPase ISWI) can generally reduce the flow of electrons through the probes if double-stranded nucleic acid probes are used which contain one or more bond breaks in the sugar-phosphate backbone that are ligated also lead to an electron flux increase.
  • nucleosomal ATPase ISWI nucleosomal ATPase ISWI
  • RNAsen recognize and break down the RNA parts within a double strand.
  • the loss of the RNA building blocks generates a single strand that can now be detected due to the loss of conductivity. Not all of the RNA has to be broken down, even the loss of one or two Ribonucleotides between the electron donor units or electron acceptor units and the electrode result in a drastic decrease in the conductivity in the double strand.
  • DNAse can be detected with double-stranded DNA probes.
  • restriction enzymes such as. B. Hind IM which catalyzes a smooth double-strand break or EcoR I or PST I which produces an offset double-strand break, provided a suitable restriction site is present in the double-strand sequence.
  • Nucleic acid strands between the electron donor units or electron acceptor units and the electrode completely stop the flow of electrons through the double strand.
  • the binding sequences of individual nucleic acid-binding substances can also be determined with the aid of the double-stranded nucleic acid probes according to the invention.
  • Electrode arrays are advantageously used for this purpose, in which each field is connected to a group of double-stranded nucleic acids of a precisely defined sequence. In the ideal case, all possible 4 ⁇ sequences, where n is the number of base pairs, can be read out electronically on the electrode in 4 n
  • Double-stranded nucleic acid binding factors modulate the conductivity of the array positions that contain a sequence that is recognized by the factor.
  • the associated recognized sequence is determined via the corresponding array position.
  • Hybridization methods the associated genes can be identified. With this method, modified nucleic acid sequences or transcription factors produced by site-specific mutagenesis can also be evaluated. A strong nucleic acid transcription factor / RNA polymerase binding is an indication of a highly active transcription-promoting complex. The selection of highly active promoter sequences and the associated highly active transcription factors is thus possible. Such promoter / transcription factor complexes can be used to construct novel expression vectors. Extracts of regulatory fragments of DNA fragments of not exactly specified sequences of a specific gene can also be incorporated into the double-stranded nucleic acid probes. Known factors of certain concentration binding to these sequences can then be used to determine whether homozygous binding sequences, homozygous non-binding sequences or heterozygous sequence mixtures are present in the probes.
  • nucleic acid fragment extract can be added directly to a double-stranded nucleic acid probe / probe-binding protein. The competitive effect of the nucleic acid fragment extract on the measuring system is then measured.
  • single- or double-stranded nucleic acids can also interact with the probe sequences.
  • the at least partial separation of the nucleic acid double strand of the probe due to the hybridization of the single-stranded nucleic acids competing as binding partners with a complementary probe sequence leads to triplex structures or to a dissolution of the probe duplex by re-hybridization. This will interrupt or change the conductivity of the probe. Hybridization events can thus be detected with this method. If a destabilized double-stranded nucleic acid sequence is used in the probe, hybridization with a single-stranded nucleic acid in solution is facilitated. A destabilization against a DNA double strand can e.g. B. can be achieved through the use of DNA / RNA hybrids. The DNA / RNA hybrid pairing can additionally be weakened by modifying the DNA strand to form the phosphorothioate nucleic acid.
  • the facilitated hybridization with a single strand in solution can also be achieved by a single strand end overhanging from the double strand probe.
  • the hybridization then takes place with the single strand end and parts of the double strand structure. Is in the recognized double strand structure ⁇
  • the newly formed hybrid can even detach completely from the probe and interrupt the flow of electrons within the probes.
  • recombination events can also be detected and factors involved in the recombination, in particular enzymes, can be identified.
  • factors involved in the recombination in particular enzymes, can be identified.
  • the reaction solution is set recombination-promoting factors such. B. the recA protein from E. coli, then a faster decrease in electron flow or increased decrease in total electron flow can be measured.
  • transposition events can also be determined. Since the strength of the electron flow in the double strand of the probe decreases with increasing distance, that is to say with increasing number of base pairs, between the electron donor unit or electron acceptor unit and the electrode, the electron flow also decreases when a transposon is integrated into the probe sequence , A corresponding increase in the electron flow can be demonstrated when the back reaction proceeds.
  • the use of the double-stranded nucleic acid probes is also suitable for the detection of nucleic acid-damaging substances or for the detection of the nucleic acid-damaging effect of chemical substances.
  • the damage to a double-stranded nucleic acid can be caused in different ways. Some substances, especially aromatic substances such as ethidium bromide or acridine, can intercalate into the nucleic acid dupiex structure.
  • nucleic acids e.g. B. strong bases that hydrolyze the nucleic acids, benzopyrines that add to the nucleic acids or peroxides that easily form radicals and trigger radical chain reactions within the nucleic acid.
  • B. strong bases that hydrolyze the nucleic acids benzopyrines that add to the nucleic acids or peroxides that easily form radicals and trigger radical chain reactions within the nucleic acid.
  • benzopyrines that add to the nucleic acids or peroxides that easily form radicals and trigger radical chain reactions within the nucleic acid.
  • the change in the nucleic acid structure these substances cause a change in the conductivity of the double-stranded nucleic acid probes.
  • Such a test can be carried out in a compartmented reaction vessel in which the bottom surface is formed by the electrode in the form of an array.
  • the probes are applied in a uniform density to the individual array positions.
  • Each reaction compartment can be mixed with a reaction solution containing a different test substance.
  • Reaction solutions can also be prepared which contain the same test substance in different concentrations. In this way, a simple test for identifying DNA-damaging and thus carcinogenic substances can be created.
  • Double-stranded nucleic acids also interact with substances dissolved in the reaction medium, in particular with destabilizing ionic compounds. Interactions with the solvent itself can also affect the conductivity of the probes. For example, the dehydration of the DNA double helix of the B type changes to the A type. This transition can be measured using the novel probes.
  • the reaction media or solutions can contain any solvents and additives.
  • Aqueous, ionic buffer solutions which can contain chemical substances which interact with double-stranded nucleic acids are preferably used as reaction solutions.
  • the direct use of raw extracts as a reaction medium is also possible.
  • the detection of the interaction between the double-stranded nucleic acid probe sequences and the substances interacting therewith preferably takes place under physiological conditions in 10 to 200 mM aqueous, saline solutions at pH 7-9.
  • a phosphate buffer is preferably used as the buffer.
  • the measuring temperature is preferably between 4 and 40 ° C. A deviation from these measurement conditions can, however, be appropriate in individual cases. For example, an elevated measuring temperature can be used to find proteins with temperature-stable activity, such as the Taq polymerase used for the PCR. ⁇ & 0 this results in a variety of replaceability of the double-stranded nucleic acid
  • Probes for the analysis of active factors interacting with nucleic acid or active double-stranded nucleic acid sequences are provided.
  • the double-stranded nucleic acid probes according to the invention can be used in analytical devices with classic separation methods, such as. B. the chromatography can be combined. By separating cell extracts or substance libraries, active components that bind to a double-stranded nucleic acid can be quickly detected. The process can be operated continuously in an "online" measuring process.
  • Suitable double-stranded nucleic acid probes can be produced using methods known to those skilled in the art. For this purpose, thiol groups are introduced into the nucleotide sequences that are to be incorporated into the probe for connection to a gold electrode and amino groups for connection to the electron donor units.
  • oligonucleotides used if not commercially available, for. B. with a DNA synthesis method, the so-called phosphoramidite method (Beaucage, S. L .; Caruthers, M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites.
  • phosphoramidite method eaucage, S. L .; Caruthers, M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites.
  • the desired synthesis building blocks are made on a 1 ⁇ mol scale in a predetermined order on a solid CPG carrier material with the aid of a o2l Expedite Synthesizer of the type Expedite 8909 from PerSeptive Biosystems. To do this, the 0.1 M solutions of corresponding
  • Phosphoramidite building blocks and 0.5 M tetrazole solution used Due to their sensitivity, the building blocks are dissolved in dry acetonitrile (water content ⁇ 30 ppm).
  • the desired sequence is built up on the 3 'end of the oligonucleotide on thiol-CPG carrier material (Chemgenes) on a scale of 1 ⁇ mol.
  • thiol-CPG carrier material Chevron Phillips Chemical Company
  • a 0.02M iodine solution is used during the DNA synthesis (Kumar, A. et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 4561).
  • the amino group can be removed using a 0.2 M solution AminoModifier II (Clontech) or 0.1 M solution Amino Modifier C6 dT (Glen Research) in dry acetonitrile (water ⁇ 30 ppm) at selected positions that are not on the electrode side of the double strand Structure, be introduced in a targeted manner.
  • the modified oligonucleotides are worked up after completion of the syntheses.
  • the oligomers are split off from the CPG support with aqueous ammonia solution (25-32%) and incubated at 55 ° C. for several hours.
  • DTT is added up to a concentration of 50mM. The solution is then concentrated and the
  • the sequence with phosphoamidite nucleotide building blocks is built up in the desired sequence on a 3 ' phosphate CPG, as described above.
  • An AminoModifier II (Clontech) can be used as an amino-modified component.
  • the oligonucleotide is esterified with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to give PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH to introduce the required thiol function ,
  • the nucleic acid in a concentration of 1-2X10 "4 M in application buffer (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.5 with the addition of 0.7 molar TEATFB) with 10 ⁇ -IO ' 1 molar Put 2-hydroxymercaptoethanol on the cleaned electrode gold surface and incubate for 2-24 hours.
  • the metal surface is then cleaned with a 30% H 2 O 2 /70% H 2 SO solution and then immersed in ethanol for 20 minutes.
  • the surface is covered with bidest. Water rinsed one last time.
  • the preparation of commercially available precious metal electrodes can alternatively be carried out by polishing the electrode surface and subsequent rinsing.
  • the subsequent electrochemical cleaning of the electrodes can, for. B. cyclic voltammetry in sodium hydroxide solution using a potentiostat, the electrodes several times in the potential range from -2.0 to +1, 2V against an Ag / Ag - Reference electrode (3M NaCI solution).
  • As a counter electrode z. B. serve a platinum rod.
  • connection of SH-modified oligonucleotides takes place e.g. B. by incubation of the cleaned Au electrodes with a solution of the corresponding oligonucleotide in phosphate buffer by dripping onto the gold disk and incubation for several hours in a water-saturated atmosphere.
  • connection of an electron donor or acceptor unit such as. B. pyrroloquinolinequinone, methoxatin, PQQ or ferrocene can be carried out on the monolayer-bound or in solution oligonucleotides.
  • the linkage of the redox units (PQQ, Sigma-Aldrich, Steinheim, D) to the primary amino group of the modified T-building block (aminomodifier dT) in the hairpin on monolayer-bound oligonucleotides is achieved by activating the PQQ carboxylate groups in buffer with a soluble carbodiimide and subsequent amide formation ,
  • the second method of obtaining oligonucleotide monolayers on gold containing redox units is to modify the oligonucleotides with redox-active electron donor or acceptor units, such as. B. PQQ and ferrocene-acetic acid in solution and subsequent immobilization on the gold surface.
  • a redox unit is linked by activating the carboxylate functions and then binding them to the primary amino group of the modified T building block (amino modifier dT) in the oligonucleotide.
  • PQQ is dissolved in water and mixed with N-hydroxysuccinimide and water-soluble carbodiimide.
  • the activation solution is mixed with water and triethylammonium hydrogen carbonate solution.
  • the synthesis of the ferrocenacetic acid-modified oligonucleotides is carried out by activating the ferrocenacetic acid (e.g. with o- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ⁇ N > - tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU)) and subsequent coupling with the free one Amino group of the oligonucleotide.
  • the activated ferrocene acetic acid is added to a solution of the modifying oligonucleotide in the presence of a base. After a reaction time of several hours, the oligonucleotide is cleaned up.
  • the covalent attachment of a Zn bacteriochlorophyll electron donor unit can take place after attachment of the nucleic acid to the electrode gold surface and a further washing step with water.
  • the modified nucleic acid substrate with a solution of 3x10 "3 molar quinone 2- (CH 2 -CH 2 - CO 2 H-UQ-50), 10 " 2 molar EDC (3 ' -dimethylaminopropyl) -N-carbodiimide and 10 " 2 molar N-hydroxysulfsuccinimide in 0.1 M HEPES buffer (2- (4-2-hydroxyethyl) -1-piperazino) -ethanesulfonic acid, pH 7.5)
  • the quinone used is obtained by cleaving a methoxy group by HBr (ether cleavage) as standard
  • the resulting free hydroxyl group is reacted with an equimolar amount of CI-CH 2 -CH 2 -CO 2 H and then purified
  • the modified substrate is washed with bidist.
  • Water again with an aqueous solution of 3x 10 "3 molar Zn bacteriochlorophyll (as free acid), 1, 5x 10 " 1 molar (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 2, 5x10 "3 molar hydrazine monohydrate and 1x10 " 1 molar imidazole incubated for 16 hours at 23 ° C.
  • the Zn bacteriochlorophyll as free acid is produced by incubation with trifluoroacetic acid.
  • the hybridization or refolding of the nucleic acids to the double-stranded probes can take place before or after application of the modified nucleic acid on the electrode gold surface.
  • the hybridization can e.g. B. according to Methods known to those skilled in the art are carried out in a buffered solution.
  • Hybridized nucleic acid duplexes are preferably used in the manufacture of the probes.
  • the hybridization takes place under controlled conditions with slow cooling in order to avoid mismatches as far as possible. Short-term heating to 95 ° C and slow cooling down to room temperature in a water bath have proven to be effective.
  • Applied single-stranded 5 * -phosphorylated (phosphate-on-phosphoramidite building blocks (Hörn, T. and Urdea, M., Tetrahedron Letter, 1986, 27, 4705)) and nucleic acids esterified to the thiol, which only have a short hairpin with free 3 ' OH end, can be built up enzymatically with the help of a DNA polymerase to a double strand.
  • z. B. incubated a DNA structure with a mixture of the four nucleotide triphosphates with Klenow fragment of DNA I polymerase. The desired nucleic acid duplexes are obtained.
  • the coating, preferably a monomolecular coating, of the free electrode surface has proven to be advantageous.
  • the surface of a gold electrode can e.g. B. with alkyl disulfides, alkyl thiols or hydroxyalkyl thiols after application of the double-stranded nucleic acid probes.
  • a double-stranded DNA structure (11) with a restriction site and a light-inducible electron donor unit (12) is covalently bound to a gold electrode (13) as described in the previous examples.
  • the DNA double strand (11) of the probe is in a restriction enzyme z. B. Pst1 (14) containing reaction solution cut into two fragments (17, 18). The activity is measured over time under the influence of light (15) using an evaluation device (16).
  • ligation of DNA-Zn bacteriochlorophyll degradation products e.g. B. from the reaction solution generated above, after the solution has been freed from the restriction enzyme by RP-HPLC, enzymatically linked again.
  • the fragment can be ligated in excess of a ligase in a DNA ligase buffer, the efficiency is detected amperometrically by generating an electron flow through the double-stranded DNA.
  • the addition of the transcription factor (21), e.g. B. Oct2A, TATA or Sp1 is carried out in a buffered solution on a template consisting of a gold electrode (22) which has double-stranded nucleic acid probes (23) with the respective binding site specific for the transcription factor.
  • the double-stranded DNA probe sequences (23) are with a covalently bound light-inducible electron donor unit (24), for. B. Zn bacteriochlorophyll provided.
  • the reading is carried out under light irradiation (25) with an evaluation unit (26).
  • B. DNA fragments (27) not bound to the electrode surface of the respective transcription factor are carried in excess as a competitor.
  • a self-complementary DNA (31) with a covalently bound light-inducible electron donor unit (34) is applied to the gold electrode (32) according to the examples listed above.
  • a range of nucleotides is conceptually present at the 3 ' end as a single strand.
  • a longer oligomer e.g. B. a 38 oligomer (33), which has a complementarity over a region of the other nucleic acid strand
  • the single strand structure is specifically filled.
  • z. B. an excess of buffered oligomer (33) is added to the bound probes and the mixture is then incubated. The excess of non-hybridized oligonucleotides is then washed out.
  • a second buffered solution containing complementary oligomeric single-stranded nucleic acids this can be done in the present case e.g. B. a 38-oligomer (35) complementary to the oligomer (33), the re-hybridization under the influence of light (36) to form a hybrid (37) formed from the oligomers (33) and (35) with the aid of an evaluation unit ( 38) measured.
  • Fig. 4 describes an assay to investigate the intercalation of chemical substances in double-stranded DNA.
  • double-stranded nucleic acid probes (41) with a covalently bound light-inducible electron donor unit (46) are applied to a matrix-shaped gold electrode array surface (42) at the individual array positions (47).
  • the bound DNA probes (41) are mixed with differently concentrated solutions of substances A, e.g. B. propidium iodide (43), B, e.g. B. ethidium bromide (44) and C, e.g. B. Syber ® green (45) incubated.
  • substances A e.g. B. propidium iodide (43)
  • B e.g. B. ethidium bromide
  • C e.g. B. Syber ® green
  • Evaluation unit (49) tracked.
  • the separately readable array positions deliver substance and concentration-dependent signals (50).
  • FIGS. 5 to 13 show the measurement curves determined by means of differential pulse voltammetry in accordance with the following exemplary embodiments.
  • the Au electrodes are cleaned by polishing the electrode surface with an 3.3 ⁇ m alumina suspension (LECO, St. Joseph, USA) and subsequent rinsing with Millipore water (10 M ⁇ cm).
  • the subsequent electrochemical cleaning of the electrodes is carried out in 0.2M NaOH using cyclic voltammetry (potentiostat: EG&G PAR 273A, GB), the electrodes first 5 times between potentials of -0.5 and -1.8V (against Ag / AgCI reference electrode ( 3M NaCI) and then 3 times between -0.8 and 1.0 V (feed rate 50 mV sec "1 ).
  • a platinum rod serves as the counter electrode.
  • Example 2 Methods for modifying Au electrodes with redox-labeled oligonucleotides
  • Double-stranded nucleic acids were used for the modification.
  • the hybridization takes place in the stock solution (1 mmol / l solution of the self-complementary single-stranded nucleic acids in water), which were heated to 95 ° C. in a water bath and slowly cooled to room temperature within 2 to 4 hours.
  • Method A Modification of oligonucleotide monolayers with a redox label
  • Steinheim, D supports the connection "* v9on ferrocene modified oligonucleotides) by spotting 5 ul of this solution onto the gold disc and 4-5 hours of incubation at 4 C C in a water-saturated atmosphere.
  • the resulting oligonucleotide monolayers are characterized by blocking the diffusion-controlled Fe (II / III) redox reaction in aqueous K 3 / K 4 Fe (CN) 6 solution (salts from Merck, Darmstadt, D) (20 mM in 20 mM phosphate buffer pH 7) checked by means of cyclic voltammetry (CV).
  • the linkage of the redox label (PQQ, Sigma-Aldrich, Steinheim, D) to the primary amino group of the modified T building block (aminomodifier dT) in the hairpin is activated by activating the PQQ carboxylate groups with a water-soluble
  • the second method of obtaining redox-labeled oligonucleotide monolayers on gold is to modify the oligonucleotides with redox-active groups (PQQ and ferrocene-acetic acid) in solution and then immobilize them on the gold surface.
  • redox-active groups PQQ and ferrocene-acetic acid
  • the PQQ redox functions are linked by activation of the carboxylate functions and their subsequent binding to the primary amino group of the modified T building block (amino modifier dT) in the oligonucleotide.
  • the precipitate was dissolved again by adding 50 ⁇ l of DMF. After a further 15 minutes, the solution is diluted with a further 145 ⁇ l of DMF.
  • 120 ⁇ l of the activation solution are mixed with 3.7 ⁇ l of Millipore water and 3.2 ⁇ l of triethylammonium hydrogen carbonate solution (TEK buffer, 1 M, Fluka, Buchs, CH). After adding 10 OD of the amino-modified oligonucleotide, the solution is left to stand at room temperature for 24 hours. The reaction mixture is worked up by size exclusion chromatography on a Sephadex G25 M column (Amersham-Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden).
  • the yields of oligonucleotide are usually between 70 and 90%.
  • the oligonucleotides labeled with ferrocene acetic acid are synthesized by activating the ferrocene acetic acid with TBTU (Fluka) and subsequent coupling with the free amino group of the oligonucleotide.
  • TBTU Frluka
  • 4.9 ⁇ g of ferrocene acetic acid (Strem Chemicals, Kehl, D) are dissolved in 100 ⁇ l DMF in the first step.
  • 75 ⁇ l of this solution are then added to a solution of 6 mg TBTU in 75 ⁇ l DMF and activated for 1 hour at room temperature.
  • 10 ⁇ l of the oligonucleotide to be modified are mixed with 3.2 ⁇ l of TEK buffer. Then 25 ⁇ l of the activated are added
  • the oligonucleotide is purified as described above.
  • the electrodes are modified with the redox-labeled oligonucleotides in accordance with the instructions for the unmodified 5 ' thiol-amino-modified oligonucleotides.
  • Example 3 Electrochemical experiments The electrochemical characterization of the redox-modified oligonucleotide monolayers takes place by means of cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) in 20 mM phosphate buffer pH 7.
  • CV cyclic voltammetry
  • DUV differential pulse voltammetry
  • a signal of the reversible redox reaction occurs in one Potential of approx. -100 mV (against Ag / AgCI). This shows that the PQQ redox units are covalently bound via the nucleic acid oligomers on the modified electrode.
  • the redox signals for ferrocenacetic acid-modified oligonucleotide monolayers occur at potentials of approx. +200 mV (against Ag / AgCI) and are generally broader and less intense than the corresponding PQQ signals.
  • Curve (51) in FIG. 5 shows the DPV measurement result of a Zi6-PQQ electrode in 20 mM phosphate buffer at pH6.6, (reductive scan, 10 mV / s, step width 500 ms, pulse width 20 ms, pulse height 25 mV) the incubation with Hoechst 33258 curve (52) shows the DPV measurement result after incubation in 10 ⁇ M Hoechst 33258 in 1 M phosphate buffer for 20 min at RT.
  • Examples 4 and 5 show sequence-unspecific interactions between proteins and DNA.
  • sequence-specific interactions between redox-labeled DNA oligonucleotides and transcription factors are investigated.
  • the oligonucleotide sequences used are listed in Table 1 together with their specific binding transcription factors (TKF).
  • the SP1 transcription factor (as an extract from E-coli) was kindly provided by Prof. Suske (University of Marburg), the Oct2a-TKF was purchased from Röche as a kit with buffer solutions (DIG Gelshift Kit).
  • HeLa-Scribe Nuclear Extract (Gel Shift Assay Grade, with SP1-TKF as a component), also as a kit (Gel Shift Assay Systems), and TATA binding protein were obtained from Promega.
  • Incubation of a PQQ-Zi-3 oligonucleotide electrode containing an oligomer Seq. ID No. 1 in an Oct2a-TCF solution did not result in a change in the DPV redox signal after 60 minutes at room temperature (FIG. 7).
  • curve (122) shows the redox signal after 30 minutes of incubation with a HeLa cell extract solution) and not to a reduction in the redox signal.
  • TATA binding protein TATA binding protein
  • a cleaned gold electrode was treated with 10O ⁇ M Zi-4-ferrocene acetic acid in 0.9M phosphate buffer (+ 1mM DTT), incubation time: 4 hours at 4 ° C.
  • the monolayer gaps are passivated with mercaptohexanol (1 mM solution in H 2 O) for 1 hour at RT.
  • the measurement is carried out in an electrolyte solution (20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0) using the DPV (pulse height 25mV, feed rate 10mV / s, pulse duration 20ms, step size 500ms, potential against Ag / AgCI (3M NaCI)).
  • curve (137) shows the effect of a 20 minute incubation of the electrode in 5 ⁇ l TFIID + 90 ⁇ l binding buffer on the reduction signal
  • curve (138) shows the corresponding signal after 20 minutes incubation in 10 ⁇ l TFIID + 90 ⁇ l binding buffer)
  • X represents a commercially available aminomodifier dT building block (formula I), the nucleotide building block located at the 5 ' end of the oligomer is modified on the C6 thiol (available from Interactiva).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft elektronisch auslesbare Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden und deren Verwendung zum schnellen und einfachen Nachweis von Wechselwirkungen zwischen doppelsträngigen Nukleinsäuren und mit ihnen unmittelbar oder mittelbar interagierenden Faktoren, sowie Verfahren zur Herstellung der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden.

Description

Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden und deren Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft elektronisch auslesbare Doppelstrang- Nukleinsäure-Derivate und deren Verwendung zum schnellen und einfachen Nachweis von Wechselwirkungen zwischen doppelstrangigen Nukleinsäuren und mit ihnen unmittelbar oder mittelbar interagierenden Faktoren, insbesondere mit Proteinen, Peptiden, einzelsträngigen oder doppelstrangigen Nukleinsäuren oder nukleinsäureschädigenden Substanzen.
Doppelsträngige Nukleinsäuren spielen in der lebenden Zelle und auch in vielen Viren, insbesondere als Träger der Erbanlagen, eine entscheidende Rolle. Dabei unterliegen sie in natürlichen Systemen, wie z. B. einer Zelle vielfältiger innerer und äußerer Einflüsse. Insbesondere Wechselwirkungen zwischen Proteinen und doppelsträngiger DNA sind von großem Interesse, da solche Wechselwirkungen entscheidenden Einfluß auf die Transkription oder Repression einzelner Gene und damit auf den Phänotyp der entsprechenden Organismen haben. Aber auch die Replikation der Erbanlagen bei der Mitose oder Meiose, die Restriktion z. B. viraler Nukleinsäuren oder die Packung und Entpackung eukaryontischer Nukleinsäuren in den Chromosomen sind weitere wichtige Vorgänge in lebenden Zellen, die durch das komplexe Zusammenspiel von Proteinen und Nukleinsäuren gesteuert werden. Darüber hinaus können auch andere chemische Substanzen mit doppelstrangigen Nukleinsäuren in Wechselwirkung treten, stellvertretend sei hier nur die Klasse der karzinogen wirkenden interkalierenden oder nukleinsäureschädigenden Stoffe aufgeführt. Auch Nukleinsäuren selbst, ob einzelsträngig oder doppelsträngig, können mit ihren doppelstrangigen Verwandten, z. B. bei der Rekombination, Insertion oder Transposition, in Wechselwirkung treten.
Bei der Untersuchung solcher Prozesse, egal ob es um die Identifizierung der einzelnen biologisch aktiven Bausteine oder um die Aufklärung der Mechanismen, also dem Zusammenspiel dieser Bausteine, geht, spielt die Kenntnis von Molekül- Molekül-Wechselwirkungen eine zentrale Rolle. Die Entwicklung neuer effizienter S
Nachweisverfahren für solche Wechselwirkungen stehen folglich im Mittelpunkt des Interesses.
In Napier, M. E. et al. „Probing Biomolecule Recognition with Electron Transfer: Electrochemical Sensors for DNA Hybridization" Bioconjugate Chem. (1997), 8(6), 906-913 sind bereits Messanordnungen beschrieben, die es erlauben Hybridisierungsereignisse direkt an Einzelstrang Nukleinsäuren messtechnisch zu erfassen. Diese Nachweismethode basiert darauf, daß Guanosin-gebundene DNA über Rutheniumkomplexe oxidiert wird und sich dieser Vorgang mittels Cyclovoltammetrie nachweisen läßt.
In den Druckschriften WO 95/15971 , WO 96/40712 und DE 19901761 A1 werden Verfahren beschrieben, welche die elektrische Leitfähigkeit doppelsträngiger Nukleinsäure-Hybride gegenüber einzelsträngigen Nukleinsäuren ausnutzen. Beide wenden ihr Verfahren an, um ausschließlich Einzelstrang-Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen. Dazu werden zum Nachweis des Vorhandenseins einzelsträngiger Nukleinsäure-Zielsequenzen komplementäre einzelsträngige Nukleinsäure-Sonden eingesetzt, die kovalent gebunden wenigstens eine Elektronen-Donor-Einheit und wenigstens eine Elektronen-Akzeptor-Einheit, bevorzugt als Elektrode ausgestaltet, enthalten. Im elektrisch leitfähigen Sonden-Zielsequenz-Hybrid wird thermisch oder über ein strominduzierendes Signal, wie z. B. Licht, ein nachweisbarer Elektronenfluß erzeugt.
Die geschilderten Methoden sind auf den Nachweis von hybridisierten einzelsträngigen Nukleinsäuren limitiert. Der Nachweis beschränkt sich auf das bloße Vorhandensein einer Zielsequenz im zu untersuchenden Medium und läßt darüber hinaus keine Aussagen über die biologische Aktivität der interagierenden Nukleinsäuren zu.
Sollen Wechselwirkungen doppelsträngiger Nukleinsäuresequenzen untersucht werden, muß auf andere Methoden, z. B. auf gelelektrophoretische Verfahren zurückgegriffen werden. J
Bei der Gel-Shift-Methode (Fried, M. & Crothers, D. M. „Equilibrium and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis" (1981 ) Nucleic Acid Res. 9, 6505-6525; Garner, M. M. & Revzin, A. „A gel elecrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory System" (1981 ) Nucleic Acid Res. 9, 3047-3060) wird ein radioaktives DNA-Fragment mit einem zu untersuchenden Proteinextrakt inkubiert. Enthält das Proteinextrakt ein DNA- Fragment bindendes Protein sind gelelektrophoretisch zwei Banden nachweisbar, eine repräsentiert das freie DNA-Fragment, die zweite, verschobene Bande enthält den DNA-Fragment-Protein-Komplex.
Eine weitere in vitro Methode zum Nachweis von DNA-Protein-Bindungen bildet die Footprint-Technik (Watson, J. D. et al, Rekombinierte DNA, 2. Auflage 1993, S. 143- 146, Spektrum Akademischer Verlag). Dabei wird eine radioaktiv markierte DNA- Sequenz einem unvollständigen Restriktionsabbau, z. B. mit DNAse I unterworfen. Durch ein gebundenes Protein wird die Sequenz an der entsprechenden Stelle vor dem Abbau geschützt, gegenüber der freien Sequenz fehlen beim elektrophoretischen Fragmentnachweis die entsprechenden Banden.
Diese Methoden beinhalten die Präparierung der DNA-Fragmente und der Proteinextrakte, die Markierung der DNA-Fragmente, die Bildung eines Reaktionsansatzes und die gelelektrophoretische Trennung. Die Durchführung dieser unerläßlichen Nachweisschritte ist in der Anwendung sehr arbeitsaufwendig und zeitintensiv. Darüber hinaus kann der Nachweis nicht durchgängig unter nativen Bedingungen durchgeführt werden und eine Verwendung gelelektrophoretisch aufgetrennter Reaktionsgemischbestandteile für weitere Untersuchungen gestaltet sich schwierig.
Davon ausgehend liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde neuartige Sonden zum Nachweis und zur Untersuchung von Interaktionen doppelsträngiger Nukleinsäuren sowie Verfahren zum schnellen und einfachen Nachweis solcher Interaktionen zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wird mit Hilfe neuartiger elektronisch auslesbarer Doppelstrang-
Nukleinsäure-Sonden gelöst.
Die Sonden enthalten zumindest teilweise doppelsträngig vorliegende Nukleinsäuren oder einzelsträngige Nukleinsäuren mit selbsterkennenden Domänen, die an eine leitfähige Oberfläche, bevorzugt an eine Elektrode, z. B. an Feldeffekttransistoren, gebunden sind. Der als Duplex vorliegende Nukleinsäureabschnitt ist mit mindestens einer Elektronen-Donor-Einheit oder alternativ mit mindestens einer Elektonen- Akzeptor-Einheit verknüpft, wobei zumindest ein Teilbereich der zu untersuchenden Nukleinsäureregion zwischen der Elektrode und der Elektronen-Akzeptor-Einheit oder Elektronen-Donor-Einheit liegt. Dieser Teilbereich bildet die Detektionsstelle. Die Bindung der einzelnen Sondenuntereinheiten kann kovalent oder über stabile supramolekulare Wechselwirkungen, wie van der Waals Wechselwirkungen, Dipol- Wechselwirkungen, insbesondere Wasserstoffbrückenbindungen, oder ionische Wechselwirkungen erfolgen.
Zum Aufbau der Sonde können alle einzelsträngigen oder doppelstrangigen Nukleinsäuren beliebiger Sequenz verwendet werden. Dabei ist es unerheblich ob natürliche, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden. Bei der Anbindung einzelsträngiger Nukleinsäure kann der entsprechende Doppelstrang einfach durch Hybridisierung mit einer komplementären Einzelstrang- Nukleinsäure gebildet werden (z. B. McCarthy, B. J. et al., „Specificity of moiecular hybridization reaction" Annu. Rev. Biochem. (1970), 39, 131-150), wobei die Ausbildung eines Doppelstrangs im Falle selbstkomplementären Einzelstrang- Nukleinsäuren durch intramolekulare Rückfaltungen hervorgerufen wird. Bei der Synthese solcher einzelsträngiger Nukleinsäuren werden vorteilhaft zwei Domänen mit komplementeren Sequenzen kovalent über eine mindestens ein Nukleotid umfassende Brücke, bevorzugt eine aus 4 bis 6 Nukleotiden bestehende Brücke, insbesondere aus Thymin-Nukleotiden, oder über eine artifizielle, mindestens einatomige Brücke verknüpft. Solche artifiziellen Brücken sind z. B. Disulfid-Brücken (Hetian Gao et al., „Stabilization of double-stranded oligonucleotides using backbone-linked disulfide bridges", Nucleic Acid Research, 1995, Vol. 23, No. 2, „85- 292), Stilbendicarboxyamid-Brücken (Lewis, F. D. et al., „Distance-depending electron transfer in DNA Hairpins" Book of abstract 215th ACS National Meeting, Dallas, Bd. 29, S. Physik 255, 1988), Ru-Komplex-Brücken (Lewis, F. D. et al.,
„Synthesis and spectroscopy of Ru(ll)-bridged DNA hairpins", Chem. Commun.. Bd.
4, S. 327, 1999), Hexaethylenglycolbrücken (Durand, M. et al., „Circular dichroism
Studies of an Oligonucleiotide containing Hairpin Loop made of a Hexaethylen Glycol Chain: Conformation and Stability.", (1990) Nucl. Acids Res. 18, 6353-6359), aromatische Terephthalimid-Brücken (Salunkhe, M. S. et al., (1992), Control of
Folding and Binding of Oligonucleotides by Use of a Non-Nucleotide Linker", J. Am.
Chem. Soc. 114, 8768-8772), unverzweigte oder verzweigte Diol-Brücken, 3'-Amino-
Modifier-CPG (GlenResearch), der bevorzugt auf einem Thiolträger aufgebaut wird, oder verzweigte Phosphoramidit-Brücken. Ein großer Vorteil solcher, selbstkomplementäre Sequenzabschnitte enthaltenden, Nukleinsäuren liegt in der einfachen vollsynthetischen Zugänglichkeit der einzelsträngigen Nukleinsäure und der einfachen Herstellbarkeit der doppelstrangigen Sonde aus einer einzigen molekularen Nukleinsäureuntereinheit. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß bei der Herstellung der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden die intramolekulare
Hybridisierung der einzelsträngigen selbstkomplementäre Sequenzabschnitte enthaltenden Nukleinsäuren von der Nukleinsäurekonzentration unabhängig erfolgt. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß die Herstellung enzymfrei erfolgen kann. Ein weiterer Vorteil ist somit, daß die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden auch unter denaturierenden Bedingungen präpariert werden können. Eine Hairpin bildende einzelsträngige Sequenz mit freiem 3'OH-Ende kann auch mit Hilfe einer DNA- oder RNA-Polymerase, z. B. einer Klenow- oder Taq-Polymerase, zu der entsprechenden Nukleinsäure-Duplex vervollständigt werden.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Sonden können z. B. natürliche oder synthetische DNAs, cDNAs oder RNAs verwendet werden. Ebenso verwendbar sind deren Hybride und deren modifizierte Derivate. Zu den modifizierten Derivaten gehören insbesondere Nukleinsäuren die am Zucker veränderte Nukleotide, wie 2,O-Methyl-Nukleotide oder 2'O-Allyl-Nukleotide, enthalten. Eine Modifizierung der Phosphat-Gruppe, wie z. B. zum Phosphoramid, Phosphorthioat oder
Methylphosphonat, ist ebenfalls möglich. Es können auch Nukleinsäuren verwendet werden die keinen oder einen nicht in natürlichen Nukleinsäuren vorkommenden Zucker enthalten, wie z. B. die Peptidyl-Nukleinsäuren oder die Pyranosyl- Nukleinsäuren. Neben den am Zucker-Phosphat-Rückgrat veränderten έ> Nukleinsäuren können auch Nukleinsäuren als Sondenbestandteil eingesetzt werden die nicht natürlich vorkommende Nukleotide, wie Xanthin, Hypoxanthin oder Inosin, enthalten.
Bevorzugt werden doppelsträngige DNA oder RNA Nukleinsäuresequenzen in die Sonden eingebaut. Von besonderem Interesse sind natürlich vorkommende Proteine oder Peptide bindende DNA-Sequenzen, insbesondere bei der Genregulation beteiligte DNA-Sequenzen, wie z. B. Operator- oder Promotorsequenzen. Je nach Anwendungsproblem kann der Einsatz von Consensus-Sequenzen bzw. Allel spezifischer oder Organismus spezifischer Sequenzen, zweckmäßig sein.
Die Länge der Nukleinsäure-Sequenz zwischen der Elektrode und den Elektronen- Donor-Einheiten bzw. Elektronen-Akzeptor-Einheiten liegt vorzugsweise zwischen 2 und 100 Basenpaaren, besonders bevorzugt zwischen 5 und 50 Basenpaaren. Der doppelsträngige Bereich muß bis zum Nukleinsäure-Elektroden Linker reichen, um einen Elektronenfluß zu gewährleisten. Einzelsträngige Bereiche können über die doppelsträngige, zwischen der Elektrode und den Elektronen-Donor-Einheiten bzw. Elektronen-Akzeptor-Einheiten liegenden Detektionsregion hinaus reichen. Die doppelsträngige Detektionsregion kann Einzelstrangbrüche im Zucker-Phosphat- Rückgrat enthalten.
Die Ausbildung eines Doppelstranges kann durch chemische Modifikationen, die zu inter- oder intramolekularen Brückenbindungen führen, wie z. B. Disulfidbrücken, oder andere nicht natürliche Stranguntereinheiten chemisch stabilisiert werden. Eine weitere Möglichkeit der Stabilisierung der Nukleinsäureduplexabschnitte bietet die gezielte Einführung von Thymin-Nukleotiden auf zwei gegenüberliegende Positionen in der Duplex und anschließender strahlungsinduzierte Thymidinbrückenbildung. Analog können auch Azidonukleotide bzw. Psoralen-Derivate zur photoinduzierten Brückenbildung herangezogen werden (Fabrega, C. et al., „Studies on the Synthesis of Oligonudeotides Containing Photoreactive Nucleosides: 2-Azido-2'-Deoxyinosine and 8-Azido-2'-Deoxyadenosine", Biol. Chem., Vol. 379, 527-433, 1998; Pieles, U. et al., Nucleic Acid Research 1989, 17, 285). So kann beispielsweise der Abbau der Nukleinsäure-Duplex durch Exonukleasen verhindert werden. Die Empfindlichkeit der doppelstrangigen Nukleinsäuren gegenüber unerwünschten, ? verfahrensbedingten Einflüssen wie der Temperatur des zu untersuchenden Mediums wird ebenfalls gesenkt.
Als Elektronen-Donor-Einheiten oder Elektronen-Akzeptor-Einheiten können alle Moleküle, Molekülteile oder Oberflächen wirken, die in der Lage sind aus ihrem Grundzustand oder aus einem angeregten Zustand Elektronen abzugeben bzw. im Grundzustand oder in einem aktivierten Zustand Elektronen aufzunehmen. Die Anregung einer Elektronen-Donor-Einheit kann z. B. durch Lichteinstrahlung oder Ionisierung erfolgen, die Aktivierung eines Elektronenakzeptors kann z. B. durch Ionisierung ebenfalls mittels Licht oder mittels chemischer Ionisation erfolgen. Bewährte Elektronen-Donoren und -Akzeptoren sind z. B. Metallkomplexe oder organische redoxaktive Verbindungen, wie sie in der Patentanmeldung WO 96/40712 beschrieben sind oder natürlich vorkommende oder modifizierte photoinduzierbare redoxaktive Reaktionszentren wie sie z. B. in der Patentanmeldung DE 19901761 A1 verwendet werden. Aber auch elektrisch leitende Oberflächen, insbesondere Elektroden, können als Donor- oder Akzeptoreinheit genutzt werden. Insbesondere der Einsatz von Ferrocen oder PQQ als Elektronen- Donor-Einheiten hat sich experimentell bewährt.
Die kovalent gebundenen Elektronen-Donor-Einheiten oder Elektronen-Akzeptor- Einheiten können in multimolekulare Elektronen-Transfer-Systemen eingebunden sein. Zum einen kann die in der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonde wirkende Elektronen-Donor-Einheit (Elektronen-Akzeptor-Einheiten) über gelöste Elektronenspender wie z.B. Anionen (Kationen) regenerierbar aufgeladen werden, wobei ein geschlossener Stromkreis mit den Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden als Widerstand aufgebaut wird. Zum anderen können, analog zu den natürlich vorkommenden Reaktionszentren, wie z. B. dem Chlorophyll, auch weitere redoxaktive Elektronentransfer-Einheiten mit der kovalent gebundenen Elektronen- Donor- oder -Akzeptor-Einheit assoziiert sein.
Bevorzugt sind induzierbare und/oder regenerative Donor- oder Akzeptor-Einheiten. Regenerative Systeme ermöglichen einen kontinuierlichen Elektronenfluß durch die Nukleinsäure Duplex, während bei induzierbaren Systemen der Elektronenfluß durch den Induktor zeitlich kontrollierbar ist. 3
Werden z. B. Chlorophyll, Bakteriochlorophyll oder dessen modifizierte Derivate als Elektronen-Donor-Systeme eingesetzt läßt sich der Elektronenfluß analog zu den natürlichen Photosynthese-Prozessen durch Lichteinstrahlung induzieren. Über geeignete Elektronen spendende gelöste Substanzen, wie z. B. Fe(CN) 3" oder Fe(CN)β4" können die Reaktionszentren wieder regeneriert werden. Die Induktion kann auch direkt über chemische Substanzen erfolgen die Elektronen auf die Elektronen-Donor-Einheiten übertragen oder Elektronen den Elektronen-Akzeptor- Einheiten entziehen.
Die Anbindung der Nukleinsäuren an die Elektrode kann z.B. über eine Thiolgruppe (Chidsey, C.E.D., Sience, V. 251 , S. 919, (1991 )) bzw. über Phosphorothioate oder Phosphorodithioate an eine Goldoberfläche erfolgen. Aber auch eine Anbindung über gut leitende Molekül-Linker (z. B. beschrieben von Kayyem et al. in WO 98/20162), die bevorzugt konjugierte Doppelbindungssysteme enthalten und eine höhere Leitfähigkeit als die angebundenen Nukleinsäure besitzen, ist möglich. Die Verwendung von Linkern mit konjugierten Doppelbindungssystemen erlaubt eine Elektronenleitung entlang der Linkerstruktur auf die Elektrodenoberfläche. Das ermöglicht auf elegante weise eine Passivierung der freibleibenden Elektrodenoberfläche. Die Anbindung der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden kann an eine unstrukturierte, zusammenhängende Elektrodenoberfläche oder an einer strukturierten, z. B. matrizenförmigen Elektroden-Array-Oberfläche erfolgen. Die Strukturierung erfolgt so, daß die einzelnen Arraypositionen der Elektrode unabhängig voneinander ausgelesen werden können. Den einzelnen Arraypositionen können Nukleinsäure-Sonden mit spezifischen Sequenzen zugewiesen werden oder es kann eine Kompartimentierung des Reaktionsraumes erfolgen. So ist bei der elektronischen Auslesung der Elektrode ein hoher Grad an Parallelisierung zu erreichen.
Es hat sich überraschend gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Doppelstrang- Nukleinsäure-Sonden die Möglichkeit bieten mit Nukleinsäure-Doppelsträngen interagierende Faktoren über eine Änderung der Leitfähigkeit zu detektieren. Interagierende Faktoren sind chemische Substanzen oder Strahlungen, die mit einem Nukleinsäuredoppelstrang in Wechselwirkung treten und eine Änderung in der Primär-, Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur des Doppelstranges auslösen. Diese strukturellen Änderungen führen zu einer signifikanten Änderung des elektrischen Widerstandes der Duplexstruktur und damit zu einer Änderung des Elektronenflusses entlang der doppelstrangigen Nukleinsäure. Vermutlich haben neben den strukturellen Änderungen der doppelstrangigen Nukleinsäuren durch interagierende Faktoren weitere Effekte wie z. B. die isolierende Wirkung von an Nukleinsäuren gebundenen Proteinen oder Peptiden oder die direkte Teilnahme von interkalierenden Substanzen, wie z. B aromatischen Molekülen, an der Elektronenleitung durch den Nukleinsäuredoppelstrang ebenfalls einen Einfluß auf den resultierenden Elektronenfluß. In der Regel erfolgt zwischen den Sonden und den interagierenden Substanzen eine Aggregatbildung, wobei die Aggregate über zwischenmolekulare Kräfte oder sogar über kovalente Bindungen stabilisiert werden.
Änderungen in der elektrischen Leitfähigkeit von doppelstrangigen Nukleinsäuren werden z. B. durch die Bindung von Proteinen oder Peptiden, wie Antikörpern, Polymerasen, Transkriptionsfaktoren, Enhancern oder Repressoren, deren Aktivität wiederum durch mittelbar wirkende Substanzen wie z. B. über Induktoren oder modifizierend wirkende Enzyme, moduliert werden kann, hervorgerufen. Organische Moleküle wie einige Hormone können ebenfalls direkt oder in Verbindung mit Proteinen oder Peptiden, wie z. B. Hormonrezeptoren, mit doppelstrangigen Nukleinsäuren interagieren. Einzelsträngige Nukleinsäure kann ebenfalls z. B. unter Triplexbildung mit doppelstrangigen Nukleinsäuren interagieren. Aber auch salzhaltige Lösungen, Mimetika oder in die Nukleinsäure-Duplex interkalierende Substanzen, darunter Cytostatika wie die Anthracycline rufen meßbare Änderungen in der Struktur des Doppelstranges hervor.
Die bisher beschriebenen Effekte lassen die kovalenten Bindungen im Doppelstrang intakt. Andere Proteine oder Nukleinsäure schädigenden Substanzen greifen direkt die Primärstruktur der Nukleinsäuren an. Endonukleasen spalten Nukleinsäuren, Exonukleasen bauen Nukleinsäuren von einem freien Strangende her ab, Ligasen knüpfen kovalente Bindungen zwischen endständigen Nukleotiden, während
Topoisomerasen Einzelstrangbrüche und -Verknüpfungen hervorrufen. Aber auch Mimetika, Nukleinsäure schädigende Substanzen und Cytostatika, die z. B. auf Nukleinsäuren alkylierend oder quervernetzend wirken, wie Platin-Komplexe, z. B. Cisplatin, Methansulfonate, z. B. Busulfan, oder n-Nitroso-Verbindungen, z.B. Carmustin können deren kovalente Bindungen angreifen und/oder neue kovalente
Bindungen knüpfen. Radioaktive und elektromagnetische Strahlung, wie z. B. α-, ß-, γ- oder UV-Strahlung, kann ebenfalls zu solchen strukturellen Änderungen und damit zu einer meßbaren Änderung des Elektronenflusses innerhalb der doppelstrangigen Nukleinsäure führen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen doppelstrangigen Nukleinsäurederivate als Sonden bietet vielfältige Vorteile. Alle Wechselwirkungen denen eine Doppelstrang- Nukleinsäure-Sonde ausgesetzt ist und die einen Effekt auf die elektrische Leitfähigkeit haben sind detektierbar. Die Messung kann coulombmetrisch, impedometrisch, bevorzugt frequenzabhängig resistiv oder kapazitiv, voltammetrisch, potentiometrisch oder amperometrisch erfolgen. Der störende Effekt von an der Elektrode unmittelbar entladenen Ionen aus der Reaktionslösung ist überraschender weise sehr gering. Um die Meßempfindlichkeit weiter zu steigern kann der Elektronenfluß durch die doppelsträngige Nukleinsäure- Sonde frequenzmoduliert werden. Die Modulation kann bei Verwendung von photoinduzierbaren Elektronen-Donor-Einheiten über Lichtblitze erfolgen. Über die Anzahl der aufgebrachten Sonden oder über die Verlängerung der Meßdauer können auch sehr geringe Leitfähigkeitsänderungen detektiert werden. Bevorzugt wird die Anzahl der Sonden so gewählt, daß die durch die Interaktion zwischen der doppelstrangigen Nukleinsäure und der mit ihr Wechsel wirkenden Faktoren resultierende Stromänderung mindestens im nA-Bereich liegt. Aufgrund der besonders hohen Sensitivität haben sich als besonders geeignete Meßmethode die Cyclovoltammetrie, Differenz-Puls-Voltammetrie und Square- Wave-Voltammetrie erwiesen.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Sonden liegt in der hohen Kompatibilität mit den unterschiedlichsten Reaktionsmedien. Insbesondere die Verwendung von Rohextrakten als Reaktionsmedium oder die Verwendung von Reaktionsmedien mit einer den natürlichen Bedingungen entsprechenden Salzkonzentration sind von Interesse. Weiterhin kann die Kinetik von Doppelstrang-Nukleinsäure Wechselwirkungen untersucht und Gleichgewichtskonstanten von doppelstrangigen Nukleinsäuren mit interagierenden Substanzen bestimmt werden. Das bietet die Möglichkeit Antagonisten und allosterische Wechselwirkungen mit anderen Faktoren aufzufinden und deren Aktivität zu bestimmen. Es können dabei Untersuchungen als Mehrschritt-Reaktion durchgeführt werden, bei denen einzelne Faktoren während des Meßvorganges nacheinander zu der Reaktionslösung pipettiert werden.
Weitere Erfindungsgegenstände sind Verfahren zur Detektion von Wechselwirkungen zwischen doppelstrangigen Nukleinsäuren und mit ihnen interagierenden Faktoren und die Verwendung der erfindungsgemäßen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden dafür.
Besonders geeignet sind die erfindungsgemäßen Sonden für die Untersuchung der Genregulation, insbesondere der Transkription oder Repression von Genen. Bei der Genregulation spielen eine Vielzahl von Substanzen die unmittelbar mit der doppelstrangigen DNA interagieren, wie RNA-Polymerasen, Transkriptionsfaktoren, Repressoren oder Enhancer oder die nur mittelbare Wirkung entfalten, wie z. B. Induktoren, Enzyme, wie Phosphorylasen, second messenger, wie cAMP oder cGMP, Rezeptoren und deren Bindungspartner, wie Hormone eine wichtige Rolle. Die Signalketten, die zu einer Transkription oder Repression einzelner Gene führen können dabei äußerst komplex sein. Die erfindungsgemäßen Sonden können bei der Aufklärung des Zusammenspiels der einzelnen Faktoren wichtige Erkenntnisse liefern.
Dazu werden z. B. bekannte regulatorische DNA-Sequenzen eines Gens in die Sonden eingebaut. Die Sonden sind auf einer Elektrodenoberfläche aufgebracht, so daß die Summe der Änderung der elektrischen Leitfähigkeit der Doppelstrang-DNA- Sonden gemessen wird. Im freien, nicht assoziierten Zustand wird der Referenzelektronenfluß durch die Sonden in Gegenwart einer Referenzlösung ermittelt. Alternativ kann der Referenzwert auch über eine elektrochemische Standardzelle/Elektrode bestimmt werden. Die Referenzlösung enthält idealerweise alle Komponenten der Reaktionslösung außer den zu testenden Faktoren. Durch das sukzessive Zusetzen der einzelnen zu testenden Substanzen wird der Referenzelektronenfluß moduliert. Die Änderung des Elektronenflusses gibt dann Auskunft über eine erfolgte Wechselwirkung zwischen der Testsubstanz und der Sondensequenz, die Stärke der Änderung des Elektronenflusses gibt Auskunft über die Stärke der Wechselwirkung und über die Gleichgewichtskonstante der Bindungsreaktion. So sind alle unmittelbaren Wechselwirkungen der DNA mit den direkt interagierenden Substanzen, wie Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Repressoren meßbar. Eine Identifikation direkt mit der DNA-Duplex interagierender Substanzen ist damit möglich. Folglich wird auch eine neue Möglichkeit zum schnellen Auffinden von Transkriptionsfaktoren mit gewebespezifischer Aktivität über die Verwendung von Sonden die bekannte gewebespezifische Promotorsequenzen enthalten eröffnet.
Der Effekt von weiteren, die Aktivität dieser Substanzen beeinflussenden, also mittelbar wirkenden Faktoren, kann über die Änderung der Gleichgewichtskonstanten von RNA-Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Repressoren indirekt ermittelt werden. Dazu können entweder unterschiedliche Faktoren enthaltende Reaktionslösungen getestet werden oder die indirekt wirkenden Faktoren werden zu der Reaktionslösung sukzessive eingebracht. Dadurch werden auch
Wechselwirkungen zwischen einzelnen Substanzen innerhalb der regulatorisch wirkenden Signalketten ermittelbar.
Wird beispielsweise zu einem Operator-Repressor Komplex ein auf den Repressor wirkender starker Induktor zur Reaktionslösung zugesetzt, geht die
Gleichgewichtskonstante gegen Null und der gemessene Elektronenfluß gleicht sich dem Referenzelektronenfluß an.
Ein Beispiel für einen solchen Induktionsmechansimus bietet das Lactose-Operon aus Escherichia coli. Die Wirkung des lac-Repressor wird durch die Anwesenheit von Lactose aufgehoben, der Repressor verliert seine Affinität zur Operatorsequenz und der Elektronenfluß wird sich dem Referenzwert angleichen. Wird zur Reaktionslösung ß-Galactosidase, ein Lactose abbauendes Enzym gegeben, wird der lac-Repressor reaktiviert.
Ein weiteres Beispiel bildet der lexA-Repressor in E. coli, der zahlreiche Gene reguliert, die an der DNA-Reperatur beteiligt sind. Durch Einzelstrang-DNA gebundene recA-Proteine wird lexA proteolytisch gespalten und damit vom 23 zugehörigen Operator abgelöst. Der Elektronenfluß innerhalb der Doppelstrang- DNA-Sonde wird sich folglich dem Referenzwert wieder angleichen.
Bei gegebener Induktorkonzentration ist der Grad der Angleichung des Elektronenflusses an den Referenzelektronenfluß ein Maß für die Stärke der induktiven Wirkung. Durch die Variation der Induktorkonzentration können demgegenüber konzentrationsabhängige Effekte des Induktors auf den Repressor oder eine lineare Abhängigkeit der Induktion von der Induktorkonzentration, ermittelt werden.
Ist im Reaktionsansatz der Repressor inaktiv bleibt der Elektronenfluß auf dem Referenzwert. Durch Zusatz von weiteren Substanzen kann deren repressions- aktivierende Wirkung auf den Repressor getestet werden. Ein solcher Regulationsmechanismus liegt z. B. im Tryptophan-Operon von E. coli vor. Der trp- Repressor wird durch die Gegenwart von Tryptophan aktiviert und der Repressor- Tryptophan-Komplex bindet an die zugehörige Operatorsequenz. Eine Abweichung des Elektronenflusses innerhalb der Doppelstrang-DNA-Sonden vom Referenzwert ist feststellbar.
Analog besteht die Möglichkeit die Gleichgewichtskonstante der Bindung von RNA- Polymerasen oder Transkriptionsfaktoren an DNA-Promotoren und die Wirkung von deren Cofaktoren und deren Modifikationen zu bestimmen. Dazu können Sonden verwendet werden die eine Promotorsequenz beinhalten. Es kann dann ein Referenzwert bestimmt werden der durch die Zugabe von einzelnen Faktoren moduliert wird. Eine Änderung des Referenzwertes zeigt eine Wechselwirkung der zugesetzten Substanz an. Darüber kann dann die Identifikation der im Promotorbereich bindenden RNA-Polymerasen und Transkriptionsfaktoren erfolgen.
Verwendet man z. B. den SV 40 Promotor zur Herstellung der Doppelstrang- Nukleinsäure-Sonden kann die Bindung des spezifisch an diesen Promotor bindenden Transkriptionsfaktors Sp1 ermittelt werden.
Durch Zusatz weiterer Protein- oder Peptid-Cofaktoren, second messenger oder modifizierend wirkender Enzyme, wie z. B. Phosphorylasen, oder die Transkription beeinflussender Moleküle, wie einige Antibiotika, wird deren aktivierender oder inhibierender Einfluß auf die Transkriptionsfaktor-DNA-Bindung meßbar.
Im Falle des Transkriptionsfaktors Sp1 wird z. B. dessen Bindung an den SV 40 Promotor durch das Antibiotikum Actinomycin D inhibiert.
Ein weiteres Beispiel bildet der Transkriptionsfaktor p53, das Genprodukt eines Tumorsuppressorgens. p53 kann durch die Zugabe einer Phosphorylase, unter Anwesenheit eines geeigneten Phosphat-Spenders, wie z. B. ATP, phosphoryliert und damit aktiviert werden. Der Elektronenfluß ändert sich durch die Bindung des phosphorylierten p53 an die Sondensequenz stetig, bis zu einem konzentrationsabhängigen Sättigungswert. Aus der Steigung der Elektronenfluß-Zeit-Kurve können dann, neben dem reinen Wechselwirkungszusammenhang, Informationen über die Reaktionsgeschwindigkeit erhalten werden. Je größer die Steigung der Kurve ist desto höher ist die Reaktionsgeschwindigkeit, im Beispielfall der Phosphorylierungsreaktion.
Falls die DNA-Sequenz der Sonden den Operator und den Promotor umfassen, können auch kompetitive Effekte zwischen RNA-Polymerasen, promotorbindenden Transkriptionsfaktoren und Repressoren gemessen werden. Verdrängt z. B. ein Repressor einen bereits gebundenen Transkriptionsfaktor ändert sich der Elektronenfluß entsprechend. Die gemessenen Elektronenflüsse liegen zwischen den Werten für die nur eine RNA-Polymerase und/oder den Transkriptionsfaktor und nur den Repressor enthaltenden Reaktionslösungen. So kann z. B. der unmittelbare Einfluß des lac-, trp- oder lexA-Repressors auf die RNA-Polymerasen-Bindung an den Promotor untersucht werden.
Ein besonderer Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist die Möglichkeit zur Untersuchung von allelspezifischen Wechselwirkungen zwischen regulatorisch aktiven Substanzen und den zugehörigen DNA-Regulationssequenzen. So kann die unterschiedliche Aktivität von DNA-Sequenzen und DNA bindenden Proteinen oder Peptiden des Wildtyps und mutierten DNA-Sequenzen, Proteinen oder Peptiden in getrennten Ansätzen unabhängig von phänotypisch erkennbaren Veränderungen untersucht werden. Insbesondere die Untersuchung von rezessiv ausgeprägten Merkmalen wird möglich.
Darüber hinaus können Genproduktmischungen unterschiedlicher Allele eines Gens, die unmittelbar oder mittelbar mit doppelsträngiger DNA wechselwirken untersucht werden. Bindet z. B. ein Wildtyp-Transkriptionsfaktor an einen Promotor und nicht an dessen Mutante ergibt ein Extrakt eines Transkriptionsfaktors aus einem homozygoten Wildtyp-Organismus die größte Elektronenflußänderung durch die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonde, ein Transkriptionsfaktorextrakt aus einem homozygot Mutanten-Organismus ergibt keine Änderung der Leitfähigkeit der
Sonde. Heterozygte Organismen bezüglich des Transkriptionsfaktors ergeben eine Elektronenfluß durch die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonde die zwischen den beiden Extrakten aus den homozygoten Organismen liegt, in diesem Fall müssen Extrakte mit bestimmter Konzentration eingesetzt werden.
Das Verfahren ist nicht auf die Identifikation von Substanzen, die an der Genregulation teilhaben beschränkt, so können z. B. auch Histone, Helicasen, Topoisomerasen oder Ligasen an doppelsträngige DNA binden. Während Helicasen, Topoisomerasen und Chromatin-remodulierende Enzyme (z. B. Nukleosomale ATPase ISWI) den Elektronenfluß durch die Sonden in der Regel mindern kann, wenn Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden eingesetzt werden, die ein oder mehrere Bindungsbrüche im Zucker-Phosphat-Rückgrat enthalten, die ligiert werden, auch zu einer Elektronenflußerhöhung führen.
Der Verlust der Leitfähigkeit wird bei Nukleasen beobachtet, die Doppelstrangstrukturen erkennen und abbauen. Der Elektronenfluß durch die Sonden fällt stetig und geht, bei genügend langer Reaktionsdauer gegen null. Durch Zugabe von Nukleasen blockierenden Stoffen ist ein solcher Effekt nicht zu beobachten.
Mit Hilfe gebundener RNA-DNA-Hybrid-Sonden besteht die Möglichkeit z. B.
RNAsen zu untersuchen, die RNA-Teile innerhalb eines Doppelstranges erkennen und abbauen. Der Verlust der RNA-Bausteine generiert einen verbleibenden Einzelstrang, der nun durch den Verlust der Leitfähigkeit nachweisbar ist. Dazu muß nicht die gesamte RNA abgebaut werden, schon der Verlust von ein bis zwei Ribonukleotiden zwischen den Elektronen-Donor-Einheiten bzw. Elektronen- Akzeptor-Einheiten und der Elektrode hat ein drastisches Absinken der Leitfähigkeit im Doppelstrang zur Folge. Analog können mit DNA-Doppelstrang Sonden DNAsen nachgewiesen werden.
Den signifikantesten Effekt auf die Leitfähigkeit von Doppelstrang-Nukleinsäure- Sonden haben Restriktionsenzyme, wie z. B. Hind IM das einen glatten Doppelstrangbruch katalysiert oder EcoR I oder PST I das einen versetzten Doppelstrangbruch erzeugt, sofern eine geeignete Restriktionsstelle in der Doppelstrangsequenz vorhanden ist. Durch das Zertrennen beider
Nukleinsäurestränge zwischen den Elektronen-Donor-Einheiten bzw. Elektronen- Akzeptor-Einheiten und der Elektrode kommt der Elektronenfluß durch den Doppelstrang vollständig zum erliegen.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden können auch die Bindungssequenzen einzelner Nukleinsäure bindender Substanzen ermittelt werden. Dazu nutzt man vorteilhafter weise Elektroden-Arrays, bei denen jedes Feld mit einer Gruppe von Doppelstrang-Nukleinsäuren genau definierter Sequenz verbunden sind. Im Idealfall sind alle möglichen 4π Sequenzen, wobei n die Anzahl der Basenpaare ist, auf der Elektrode in 4n getrennt elektronisch auslesbaren
Feldern aufgebracht. Doppelsträngige Nukleinsäuren bindende Faktoren modulieren die Leitfähigkeit der Arraypositionen, die eine Sequenz enthalten, die von dem Faktor erkannt wird. Über die entsprechenden Arrayposition ist die zugehörige erkannte Sequenz bestimmt. Mit Hilfe der gewonnenen Sequenzen können Sonden hergestellt werden, mit denen wiederum über herkömmliche
Hybridisierungsmethoden die zugehörigen Gene identifiziert werden können. Mit dieser Methode können aber auch durch ortsspezifische Mutagenese hergestellte modifizierte Nukleinsäuresequenzen oder Transkriptionsfaktoren bewertet werden. Eine starke Nukleinsäure-Transkriptionsfaktor/RNA-Polymerase- Bindung ist ein Indiz für einen hoch aktiven transkriptionsfördernden Komplex. Die Selektion von hoch aktiven Promotorsequenzen und den zugehörigen hoch aktiven Transkriptionsfaktoren ist somit möglich. Solche Promotor/Transkriptionsfaktor- Komplexe können zur Konstruktion neuartiger Expressionsvektoren verwendet werden. Es können auch Extrakte von regulatorisch wirkenden DNA-Fragmenten nicht genau spezifizierter Sequenzen eines bestimmten Gens in die doppelstrangigen Nukleinsäure-Sonden eingebaut werden. Mit bekannten an diese Sequenzen bindende Faktoren bestimmter Konzentration kann dann festgestellt werden, ob homozygot bindende Sequenzen, homozygot nicht bindende Sequenzen oder heterozygote Sequenzmischungen in den Sonden vorliegen.
Alternativ kann ein Nukleinsäurefragment-Extrakt direkt zu einem Doppelstrang- Nukleinsäure-Sonden / sondenbindendes Protein zugesetzt werden. Gemessen wird dann die kompetitive Wirkung des Nukleinsäurefragment-Extraktes auf das Meßsystem.
Neben den bisher erwähnten doppelsträngige Nukleinsäure erkennenden Substanzklassen können auch einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren mit den Sonden-Sequenzen interagieren.
Die zumindest teilweise Trennung des Nukleinsäure Doppelstranges der Sonde aufgrund der Hybrisierung der als Bindungspartner konkurrierenden einzelsträngigen Nukleinsäuren mit einer komplementären Sondensequenz führt zu Triplexstrukturen oder zu einer Auflösung der Sonden-Duplex durch Umhybridisierung. Die Leitfähigkeit der Sonde wird damit unterbrochen bzw. geändert. Mit dieser Methode können folglich Hybridisierungsereignisse detektiert werden. Wird in der Sonde eine destabilisierte Doppelstrang-Nukleinsäure-Sequenz verwendet wird die Hybridisierung mit einer in Lösung befindlichen einzelsträngigen Nukleinsäure erleichtert. Eine Destabilisierung gegenüber einem DNA-Doppelstrang kann z. B. durch den Einsatz von DNA/RNA-Hybriden erreicht werden. Die DNA/RNA-Hybrid-Paarung kann zusätzlich durch eine Modifizierung des DNA- Stranges zur Phosphorthioat-Nukleinsäure geschwächt werden.
Die erleichterte Hybridisierung mit einem in Lösung befindlichen Einzelstrang kann ebenfalls durch ein aus der Doppelstrang-Sonde überhängendes Einzelstrangende erreicht werden. Die Hybridisierung findet dann mit dem Einzelstrangende und Teilen der Doppelstrangstruktur statt. Ist in der erkannten Doppelstrangstruktur ein δ
Bruch im Nukleinsäure-Rückgrat eingeführt dann kann sich das neugebildete Hybrid von der Sonde sogar vollständig lösen und den Elektronenfluß innerhalb der Sonden unterbrechen.
Darüber hinaus können auch Rekombinationsereignisse detektiert und an der Rekombination beteiligte Faktoren, insbesondere Enzyme identifiziert werden. Bei der vollständigen Rekombination einer doppelstrangigen Nukleinsäure mit der Sondensequenz können die Elektronen-Donor- bzw. Elektronen-Akzeptor-Einheiten von der Elektrode getrennt werden. Es kann kein Elektronenfluß mehr durch die Sonde stattfinden. Das Rekombinationsereignis muß allerdings nicht vollständig abgeschlossen sein, die Bildung einer Triplexstruktur, die die Doppelstrang- Sondenstruktur beeinflußt reicht aus, um ein Verringerung der elektrischen Leitfähigkeit zu messen. Setzt man der Reaktionslösung rekombinationsfördende Faktoren, wie z. B. das recA-Protein aus E. coli zu, dann ist eine schnellere Elektronenflußabnahme bzw. erhöhte Gesamtelektronenflußabnahme meßbar.
Enthalten die Sonden Integrationsstellen für transponierbare Elemente können auch Transpositionsereignisse bestimmt werden. Da die Stärke des Elektronenflusses im Doppelstrang der Sonde mit steigendem Abstand, also steigender Zahl der Basenpaare, zwischen der Elektronen-Donor-Einheit bzw. Elektronen-Akzeptor- Einheit und der Elektrode abnimmt, nimmt auch der Elektronenfluß bei Integration eines Transposons in die Sondensequenz ab. Beim Ablauf der Rückreaktion ist eine entsprechende Zunahme des Elektronenflusses nachweisbar.
Die Verwendung der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden ist auch zum Nachweis von Nukleinsäure schädigenden Substanzen bzw. zum Nachweis der Nukleinsäure schädigenden Wirkung von chemischen Substanzen geeignet. Die Schädigung einer doppelstrangigen Nukleinsäure kann auf unterschiedliche Weise hervorgerufen werden. So können einige Substanzen, vor allem aromatische Stoffe wie Ethidiumbromid oder Acridin in die Nukleinsäure-Dupiex-Struktur interkalieren.
Andere Substanzen können mit Nukleinsäuren reagieren, so z. B. starke Basen, die die Nukleinsäuren Hydrolysieren, Benzpyrine, die sich an die Nukleinsäuren addieren oder Peroxide, die leicht Radikale bilden und radikalische Kettenreaktionen innerhalb der Nukleinsäure auslösen. Die Veränderung der Nukleinsäurestruktur durch diese Substanzen bewirkt eine Änderung der Leitfähigkeit der Doppelstrang- Nukleinsäure-Sonden.
Ein solcher Test kann in einem kompartimentierten Reaktionsgefäß durchgeführt werden bei dem die Bodenfläche durch die Elektrode in Array-Form gebildet wird. Die Sonden sind in gleichmäßiger Dichte auf den einzelnen Arraypositionen aufgebracht. Jedes Reaktionskompartiment kann mit einer, eine andere Testsubstanz enthaltende Reaktionslösung versetzt werden. Es können auch Reaktionslösungen angesetzt werden, die dieselbe Testsubstanz in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten. So kann ein einfacher Test zur Identifikation DNA schädigender und damit karzinogen wirkender Substanzen geschaffen werden.
Doppelsträngige Nukleinsäuren stehen auch in Wechselwirkung mit im Reaktionsmedium gelösten Stoffen, insbesondere mit destabilisierend wirkenden ionischen Verbindungen. Aber auch Wechselwirkungen mit dem Lösemittel selbst können die Leitfähigkeit der Sonden beeinflussen. So geht zum Beispiel bei der Dehydratisierung der DNA-Doppelhelix des B-Typs in den A-Typ über. Dieser Übergang kann mit Hilfe der neuartigen Sonden gemessen werden.
Die Reaktionsmedien oder -lösungen können beliebige Lösemittel und Zusatzstoffe enthalten. Bevorzugt werden als Reaktionslösungen wäßrig, ionische Pufferlösungen, die mit doppelstrangigen Nukleinsäuren interagierende chemische Substanzen enthalten können eingesetzt. Der direkte Einsatz von Rohextrakten als Reaktionsmedium ist ebenfalls möglich. Die Detektion der Wechselwirkung zwischen den doppelstrangigen Nukleinsäure-Sondensequenzen und den damit interagierenden Substanzen findet bevorzugt unter physiologischen Bedingungen also in 10 bis 200 mM wässrigen, salzhaltigen Lösungen bei pH 7-9 statt. Als Puffer wird bevorzugt ein Phosphat-Puffer eingesetzt. Die Meßtemperatur liegt bevorzugt zwischen 4 und 40°C. Eine Abweichung von diesen Meßbedingungen kann allerdings im Einzellfall angebracht sein. Z. B. kann eine erhöhte Meßtemperatur zum Auffinden von Proteinen mit temperaturstabiler Aktivität, wie der für die PCR eingesetzte Taq-Polymerase, dienen. <&0 Daraus ergibt sich eine vielfältige Ersetzbarkeit der Doppelstrang-Nukleinsäure-
Sonden zur Analyse aktiver mit Nukleinsäure interagierender Faktoren bzw. aktiver doppelsträngiger Nukleinsäuresequenzen.
Die erfindungsgemäßen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden können in analytischen Vorrichtungen mit klassischen Trennverfahren, wie z. B. der Chromatographie kombiniert werden. Über eine Auftrennung von Zellextrakten oder Substanz- Bibliotheken können schnell aktive an eine doppelsträngige Nukleinsäure bindenden Bestandteile aufgespürt werden. Der Vorgang kann kontinuierlich in einem „online"- Meßverfahren betrieben werden.
Im folgenden werden zur Verdeutlichung der Erfindung exemplarisch mögliche Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden und einzelne Verfahren zur Messung von Interaktionen zwischen Doppelstrangnukleinsäure und mit ihnen wechselwirkenden Faktoren beschrieben.
Die Herstellung geeigneter Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden kann über dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen. Dazu wird in die Nukleotidsequenzen, die in die Sonde eingebaut werden sollen, zur Anbindung an eine Goldelektrode Thiolgruppen und zur Anbindung der Elektronen-Donor-Einheiten Aminogruppen eingebracht.
Die eingesetzten Oligonukleotide können, sofern nicht käuflich erhältlich, z. B. mit einer DNA-Synthesemethode, der sogenannten Phosphoramiditmethode dargestellt werden (Beaucage, S. L.; Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites. A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett.
(1981), 22(20), 1859-62).
Es handelt sich hier um eine Methode, mit der sowohl unmodifizierte als auch modifizierte Nukleinsäuren, z.B RNA's Phosphorthioate und PNAs in hoher Reinheit und Ausbeute gezielt dargestellt werden können und heute routinemäßig zum
Einsatz kommt.
Zur Synthese werden die gewünschten Synthesebausteine im 1 μmol Maßstab in einer vorgegebenen Reihenfolge auf festem CPG-Trägermaterial mit Hilfe eines o2l Expedite Synthesizer vom Typ Expedite 8909 der Firma PerSeptive Biosystems aufgebaut. Dazu werden die 0.1 M Lösungen von entsprechenden
Phosphoramiditbausteinen und 0.5 M Tetrazol-Lösung verwendet. Die Bausteine werden aufgrund ihrer Empfindlichkeit in trockenem Acetonitril ( Wassergehalt < 30 ppm) gelöst.
Die notwendigen Modifizierungen werden mit Hilfe von Amino- SH-bzw. Phosphat-
On-Phosphoramidit-Bausteine (Eurogentec, Clontech) und Trägermaterialien („SH-
CPG"-Chemgenes, Glen Research, 3'-Phosphate CPG Glen Research) aufgebaut.
Zur Einführung der Thiolmodifikation wird am 3' Ende des Oligonukleotides die gewünschte Sequenz auf Thiol-CPG-Trägermaterial (Chemgenes) im Maßstab 1 μMol aufgebaut. Zur Vermeidung der Aufoxidation des Schwefels wird während der DNA-Synthese eine 0,02M lodlösung benutzt (Kumar, A. et al., Nucleic Acids Research 1991 , 19, 4561 ).
Die Aminogruppe kann mit Hilfe einer 0.2 M Lösung AminoModifier II (Clontech) bzw. 0.1 M Lösung Amino-Modifier C6 dT (Glen Research) in trockenem Acetonitril (Wasser < 30 ppm) an ausgewählten Positionen, die sich nicht an der Elektrodenseite der Doppelstrang-Struktur befinden, gezielt eingeführt werden.
Die Aufarbeitung der modifizierten Oligonukleotide erfolgt nach Abschluß der Synthesen, dazu werden die Oligomere mit wässriger Ammoniaklösung-(25-32 %) basisch vom CPG-Träger abgespalten und über mehrere Stunden bei 55 °C inkubiert. Bei Anwesenheit von Thiolgruppen erfolgt Zugabe von DTT bis zu einer Konzentration von 50mM. Im Anschluß wird die Lösung eingeengt und vom
Ammoniak befreit und mehrfach mit Wasser koevaporiert. Oligonukleotide, die eine modifizierten Thymidinbaustein enthalten sollen werden werden länger gekuppelt. Nach Bestimmung der Absorption bei 260 nm werden die Rohprodukte mit Hilfe RP- HPLC (Lichrochart 100 RP-C18) von Abbruchprodukten und abgespalteten Schutzgruppen befreit. Als mobile Phase wird ein Gradient von Acetonitril in 0.1 Triethylammoniumacetat-Puffer.von 0-60 % in 60 Minuten benutzt. Der Hauptpeak wird isoliert, spektrometrisch bei 260 nm quantifiziert und lyophilisiert und in 500 μl 50mM DTT gelöst. Die Lösung wird für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und im Anschluß mit Hilfe einer PD-10 Säule nach Herstellerangaben (Pharmacia) entsalzt und zur kovalenten Anbindung an die Elektrode auf die Goldoberfläche pipettiert. Die eingesetzten Pufferlösungen werden zuvor mit Argon gesättigt.
Bei einem alternativen Verfahren zur Modifikation der Oligonukleotide mit einer Thiolgruppe Auf einem 3'-Phosphate CPG werden, wie oben beschrieben die Sequenz mit Phosphoamidit-Nukleotid-Bausteine in der gewünschten Reihenfolge aufgebaut. Als Amino-modifizierter Baustein kann ein AminoModifier II (Clontech) verwendet werden. Nach Abspaltung des Amino modifizierten 3'-phoshorylierten Oligonukleotides wird zur Einführung der benötigten Thiolfunktion das Oligonukleotid mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-SS-(CH2)2-OH verestert. Nach Veresterung des 3'-Endes des Oligonukleotide, wird die Nukleinsäure in einer Konzentration von 1-2X10"4 M in Auftragspuffer (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.5 mit Zusatz von 0.7 molarem TEATFB) mit lO^-IO'1 molar 2-Hydroxymercaptoethanol auf die gereinigte Elektroden-Goldoberfläche gegeben und für 2-24 Stunden inkubiert.
Zur Präparation der Elektroden-Goldoberfläche können z. B. frisch gespaltene Mica (Muskovit-Plättchen) in einer elektrischen Entladungskammer mit einem Argon- lonenplasma gereinigt und anschließend durch elektrische Entladung Gold (99,99 %) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht werden (Ron, Hannoch; Matlis, Sophie; Rubinstein, Israel. Self-Assembled Monolayers on Oxidized Metals. 2. Gold Surface Oxidative Pretreatment, Monolayer Properties, and Depression Formation. Langmuir (1998), 14(5), 1116-1121 ; Golan, Yuval; Margulis, Lev; Rubinstein, Israel. Vacuum-deposited gold films. I. Factors affecting the film morphology. Surf. Sei. (1992), 264(3), 312-26.)
Die Metalloberfläche wird dann mit einer 30 %H2O2/ 70 % igen-H2SO -Lösung gereinigt und anschließend in Ethanol für 20 Minuten getaucht. Die Oberfläche wird mit bidest. Wasser ein letztes Mal gespült.
Die Präparation käuflicher Edelmetall-Elektroden kann alternativ durch Polieren der Elektrodenoberfläche und nachfolgendem Spülen durchgeführt werden. Die anschließende elektrochemische Reinigung der Elektroden kann z. B. cyclovoltammetrisch in Natronlauge mittels eines Potentiostat erfolgen, wobei die Elektroden mehrmals im Potentialbereich von -2,0 bis +1 ,2V gegen eine Ag/Ag - Referenzelektrode (3M NaCI-Lösung). Als Gegenelektrode kann z. B. ein Platin-Stab dienen.
Die Anbindung SH-modifizierter Oligonukleotide erfolgt z. B. durch Inkubation der gereinigten Au-Elektroden mit einer Lösung des entsprechenden Oligonukleotids in Phosphatpuffer durch Auftropfen auf die Goldscheibe und mehrstündiger Inkubation in einer Wasser-gesättigten Atmosphäre.
Die Anbindung einer Elektronen-Donor- oder -Akzeptor-Einheit, wie z. B. Pyrrolochinolinchinon, Methoxatin, PQQ oder Ferrocen kann an die monoschichtgebundenen oder in Lösung befindlichen Oligonukleotide erfolgen.
Die Anknüpfung der Redoxeinheiten (PQQ, Sigma-Aldrich, Steinheim, D) an die primäre Aminogruppe des modifizierten T-Bausteins (Aminomodifier dT) im Hairpin an monoschichtgebundenen Oligonukleotiden wird durch Aktivierung der PQQ- Carboxylatgruppen in Puffer mit einem löslichen Carbodiimid und anschließender Amidbildung erreicht.
Die zweite Methode, Redoxeinheiten enthaltende Oligonukleotidmonoschichten auf Gold zu erhalten, ist die Modifizierung der Oligonukleotide mit redoxaktiven Elektronen-Donor- oder -Akzeptor-Einheiten, wie z. B. PQQ und Ferrocen- Essigsäure in Lösung und anschließender Immobilisierung auf der Goldoberfläche.
Die Anbindung einer Redoxeinheit erfolgt durch Aktivierung der Car- boxylatfunktionen und deren anschließender Bindung an die primäre Aminogruppe des modifizierten T-Bausteins ( Amino-Modifier dT) im Oligonukleotid.
Hierzu wird PQQ in Wasser gelöst und mit N-Hydroxysuccinimid und wasserlöslichem Carbodiimids versetzt. Für die Modifizierung des Oligonukleotids wird die Aktivierungslösung mit Wasser und Triethylammoniumhydogencarbonat- Lösung versetzt. Nach Zugabe des amino-modifizierten Oligonukleotids wird die
Lösung stehen gelassen. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung kann durch
Größenausschlußchromatographie erfolgen. Die Synthese der Ferrocenessigsäure-modifizierten Oligonukleotide erfolgt durch Aktivierung der Ferrocenessigsäure (z. B. mit o-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N\N>- tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU)) und anschließender Kupplung mit der freien Aminogruppe des Oligonukleotids. Die aktivierte Ferrocenessigsäure wird zu einer Lösung des modifizierende Oligonukleotid in Anwesenheit einer Base gegeben. Nach einer Reaktionszeit von mehreren Stunden wird das Oligonukleotid auf gerein igt.
Die kovalente Anbindung einer Zn-Bakteriochlorophyll-Elektronen-Donor-Einheit kann nach Anbindung der Nukleinsäure an die Elektroden-Goldoberfläche und einem weiteren Waschschritt mit Wasser erfolgen. Dazu wird das modifizierte Nukleinsäuresubstrat mit einer Lösung von 3x10"3 molarem Chinon 2-(CH2-CH2- CO2H-UQ-50), 10"2 molaren EDC (3'-Dimethylaminopropyl)-N-carbodiimid und 10"2 molarem N-Hydroxysulfsuccinimid in 0.1 M HEPES-Puffer ( 2-(4-2-Hydroxyethyl)-1- piperazino)-ethansulfonäure, pH 7.5) benetzt. Das eingesetzt Chinon wird erhalten indem man standardmäßig eine Methoxygruppe durch HBr (Etherspaltung) spaltet, die entstehende freie Hydroxygruppe wird mit äquimolaren Menge CI-CH2-CH2- CO2H umgesetzt und im Anschluß chromatographisch gereinigt (Moore; H. B. and Folkers, K, Journal of American Chemical Society, 1966, 88, 5919-23; Daves, G. et al. Journal of American Chemical Society, 1968, 90, 4487-4493).
Das modifizierte Substrat wird nach Waschung mit bidest. Wasser, erneut mit einer wässrigen Lösung aus 3x 10"3 molarem Zn-Bakteriochlorophyll (als freie Säure), 1 ,5x 10"1 molarem (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid, 2, 5x10"3 molarem Hydrazin- Monohydrat und 1x10"1 molarem Imidazol für 16 Stunden bei 23 °C inkubiert. Das Zn-Bakteriochlorophyll als freie Säure wird durch Inkubation mit Trifluoressigsäure hergestellt.
(Hartwich, Gerhard; Fiedor, Leszek; Simonin, Ingrid; Cmiel, Edmund; Schaefer, Wolfgang; Noy, Dror; Scherz, Avigdor; Scheer, Hugo. Metal-Substituted Bacteriochlorophylls. 1. Preparation and Influence of Metal and Coordination on Spectra. J. Am. Chem. Soc. (1998), 120(15), 3675-3683).
Die Hybridisierung oder Rückfaltung der Nukleinsäuren zu den doppelstrangigen Sonden kann vor oder nach Aufbringung der modifizierten Nukleinsäure auf der Elektroden-Goldoberfläche erfolgen. Die Hybridisierung kann z. B. gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren in gepufferter Lösung erfolgen. Bevorzugt werden bei der Herstellung der Sonden bereits hybridisierte Nukleinsäure-Duplexe verwendet. Die Hybridisierung erfolgt dabei unter kontrollierten Bedingungen unter langsamer Abkühlung, um Fehlpaarungen möglichst zu vermeiden. Bewährt hat sich kurzzeitiges erhitzen auf 95°C und langsames abkühlen bis auf Raumtemperatur im Wasserbad.
Aufgebrachte einzelsträngige 5*-phosphorylierte (Phosphat-On-Phosphoramidit- Bausteine (Hörn, T. and Urdea, M., Tetrahedron Letter, 1986, 27, 4705)) und zum Thiol veresterte Nukleinsäuren, die nur einen kurzen Hairpin mit freiem 3'OH-Ende aufwiesen, können mit Hilfe einer DNA-Polymerase enzymatisch zu einem Doppelstrang aufgebaut werden. Dazu wird z. B. eine DNA Struktur mit einem Gemisch der vier Nukleotidtriphosphate mit Klenow Fragment der DNA I Polymerase inkubiert. Es werden die gewünschten Nukleinsäure-Duplexe erhalten.
Als vorteilhaft hat sich die Beschichtung, bevorzugt eine monomolekulare Beschichtung, der freien Elektrodenoberfläche erwiesen. Die Oberflöche einer Goldelektrode kann, z. B. mit Alkyldisulfiden, Alkylthiolen oder Hydroxyalkylthiolen nach Aufbringung der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden gesättigt werden.
Im folgenden werden anhand der Figuren beispielhaft einzelne Assays beschrieben, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden durchgeführt werden können.
Fig. 1 beschreibt einen Assay zur Untersuchnung von Restriktionsenzymen oder Exonukleasen.
Eine Doppelstrang-DNA-Struktur (11), mit einer Restriktionsschnittstelle und einer lichtinduzierbaren Elektronen-Donor-Einheit (12) wird, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben kovalent auf einer Goldelektrode (13) gebunden. Der DNA- Doppelstrang (11) der Sonde wird in einer Restriktionsenzyme z. B. Pst1 (14) enthaltenden Reaktionslösung in zwei Fragmente (17, 18) geschnitten. Die Aktivität wird über die Zeit unter Lichteinstrahlung (15) mit einer Auswertevorrichtung (16) gemessen. In Umkehrung dazu kann durch Ligation von DNA-Zn-Bakteriochlorophyll- Abbauprodukte, z. B. aus der oben erzeugten Reaktionslösung, nachdem die Lösung über RP-HPLC präparativ vom Restriktionsenzym befreit wurde, wieder enzymatisch verknüpft werden. Dazu kann das Fragment im Überschuß einer Ligase in einem DNA-Ligase-Puffer ligiert werden, die Effizienz wird durch die Erzeugung eines Elektronenflusses durch die aufgebaute doppelsträngige DNA amperometrisch detektiert.
In Fig. 2 wird ein Assay zur Untersuchung der Bindung eines Transkriptionsfakor gezeigt.
Die Zugabe des Transkriptionsfaktors (21), z. B. Oct2A, TATA oder Sp1 erfolgt in gepufferter Lösung auf eine Vorlage, bestehend aus einer Goldelektrode (22), die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden (23) mit der jeweiligen, für den Transkriptionsfaktor spezifische Bindungstelle besitzt. Die Doppel strang-DNA- Sondensequenzen (23) sind mit einer kovalent gebundenen lichtinduzierbare Elektronen-Donor-Einheit (24), z. B. Zn-Bakteriochlorophyll, versehen. Nach Inkubation mit dem jeweiligen Transkriptionsfaktor (21) erfolgt die Auslesung unter Lichteinstrahlung (25) mit einer Auswerteeinheit (26), parallel können zur Kontrolle Versuchsansätze analysiert werden, bei denen z. B. nicht an der Elektrodenoberfläche gebundene Bindungsstellen des jeweiligen Transkriptionsfaktors enthaltende DNA-Fragmente (27) im Überschuß als Kompetitor mitgeführt werden.
In einem etwas abgewandelten Verfahren kann z. B. durch Zugabe des sp1 Kompetitors Actinomycin D vor und nach Zugabe von Sp1 die DNA-Protein Wechselwirkung und die hervorgerufene Änderung der Leitfähigkeit gemessen werden.
Fig. 3 beschreibt einen Assay zum Nachweis einer DNA-DNA-Wechselwirkung. «Ä?
Eine selbstkomplementäre DNA (31) mit einer kovalent gebundenen lichtinduzierbaren Elektronen-Donor-Einheit (34) wird auf der Goldelektrode (32) gemäß den oben aufgeführten Beispielen aufgebracht. Ein Bereich von Nukleotiden liegt konzeptionell bedingt am 3'-Ende als Einzelstrang vor. Durch Hybridisierung mit einem längeren Oligomer, z. B. ein 38er-Oligomer (33), das über einen Bereich des anderen Nukleinsäurestranges eine Komplementarität aufweist, wird die Einzelstrangstruktur gezielt aufgefüllt. Dazu wird z. B. ein gepuffertes Oligomer (33) im Überschuß zu den gebundenen Sonden zugesetzt und das Gemisch wird dann inkubiert. Der Überschuß an nichthybridisierten Oligonukleotiden wird im Anschluß ausgewaschen. Nach Zugabe einer zweiten komplementäre oligomere Einzelstrangnukleinsäuren enthaltenden gepufferten Lösung, dies kann im vorliegenden Fall z. B. ein zum Oligomer (33) komplementäres 38-Oligomer (35) sein, wird unter Lichteinstrahlung (36) die Umhybridisierung unter Ausbildung eines Hybrids (37), gebildet aus den Oligomeren (33) und (35), mit Hilfe einer Auswerteeinheit (38) gemessen.
Fig. 4 beschreibt einen Assay zur Untersuchung der Interkalation von chemischen Substanzen in doppelsträngige DNA.
In einem solchen Assay werden Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden (41) mit einer kovalent gebundenen lichtinduzierbaren Elektronen-Donor-Einheit (46) auf eine matritzenförmigen Goldelektroden-Array-Oberfläche (42) auf den einzelnen Arraypositionen (47) aufgebracht. Die gebundenen DNA-Sonden (41) werden mit unterschiedlich konzentrierten Lösungen der Substanzen A, z. B. Propidiumiodid (43), B, z. B. Ethidiumbromid (44) und C, z. B. Syber®green (45) inkubiert. (Die zweite Dimension der Arrayoberfläche wird in Fig. 4 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt). Nach Lichteinstrahlung (48) wird die Wirkung der Substanzen A bis C (43) - (45) auf die Doppelstrang-Struktur über eine
Auswerteeinheit (49) verfolgt. Die getrennt auslesbaren Arraypositionen liefern stoff- und konzentrationsabhängige Signale (50). lδ Die Figuren 5 bis 13 zeigen die mittels Differenz-Puls-Voltammetrie gemäß den folgenden Ausführungsbeispielen ermittelten Meßkurven.
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1 : Vorbehandlung der Goldelektroden
Die Reinigung der Au-Elektroden erfolgt durch Polieren der Elektrodenoberfläche mit einer O,3μm-Tonerde-Suspension (LECO, St. Joseph, USA) und nachfolgendem Spülen mit Millipore-Wasser (10 MΩ cm). Die anschließende elektrochemische Reinigung der Elektroden erfolgt in 0,2M NaOH mittels Cyclovoltammetrie (Potentiostat: EG&G PAR 273A, GB), wobei die Elektroden zuerst 5 mal zwischen Potentialen von -0,5 und -1 ,8V (gegen Ag/AgCI-Referenzelektrode (3M NaCI) und anschließend 3 mal zwischen -0,8 und 1 ,0V (Vorschubgeschwindigkeit 50 mV sec"1) zyklisiert werden. Als Gegenelektrode dient ein Platin-Stab.
Beispiel 2:Methoden zur Modifizierung von Au-Elektroden mit redoxmarkierten Oligonukleotiden
Zur Modifikation wurden Doppelstrangnukleinsäuren verwendet. Die Hybridisierung erfolgt in der Stammlösung (1mmol/l Lösung der selbstkomplementären Einzelstrangnukleinsäuren in Wasser), die im Wasserbad auf 95°C erhitzt und innerhalb von 2 bis 4 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurden.
Methode A: Modifizierung von Oligonukleotid-Monoschichten mit einem Redoxlabel
Anbindung von 5'-SH-Oligos auf Gold Die Anbindung der 5'-SH-modifizierten Oligonukleotide (Interactiva, Ulm, D)
(Sequenzen siehe Tabelle 1 ) erfolgt durch Inkubation der gereinigten Au-Elektroden mit einer 100 μM Lösung des entsprechenden Oligonukleotids in 1M Phosphatpuffer (pH 6,6, Calbiochem; Zusatz von 0,5mM Dithiothreitol, (DTT, Sigma-Aldrich, WO 01(31057 PCT/EPOO/1020.
Steinheim, D) unterstützt die Anbindung «* v9on Ferrocen- modifizierten Oligonukleotiden) durch Auftropfen von 5 μl dieser Lösung auf die Goldscheibe und 4-5 stündiger Inkubation bei 4CC in einer Wasser-gesättigten Atmosphäre. Die Charakterisierung der so entstandenenen Oligonukleotid-Monoschichten wird durch die Blockierung der diffusionskontrollierten Fe(ll/III)-Redoxreaktion in wäßriger K3/K4Fe(CN)6-Lösung (Salze von Merck, Darmstadt, D) (20 mM in 20 mM Phosphatpuffer pH 7) mittels Cyclischer Voltammetrie (CV) überprüft.
Verfüllen der Monoschicht-Lücken mit 1 ,6-Mercaptohexanol Das Verfüllen der aus sterischen Gründen bedingten Lücken zwischen den einzelnen Oligonukleotid-Molekülen auf der Monoschicht geschieht durch Inkubation der Elektroden in einer 1 mM Lösung von 6-Mercaptohexanol (Aldrich, USA) in Millipore-Wasser (entgast) für 60-90 Minuten bei Raumtemperatur.
Anbindung eines Redoxiabels (Pyrrolochinolinchinon, Methoxatin, PQQ) an die monoschichtgebundenen Oligonukleotide
Die Anknüpfung des Redoxiabels (PQQ, Sigma-Aldrich, Steinheim, D) an die primäre Aminogruppe des modifizierten T-Bausteins (Aminomodifier dT) im Hairpin wird durch Aktivierung der PQQ-Carboxylatgruppen mit einem wasserlöslichen
Carbodiimid (EDAC, Sigma-Aldrich) und anschließender Amidbildung erreicht. Diese Reaktion geschieht in einer PQQ-Lösung (ca. 1 mg/ml in 10 mM HEPES-Puffer (pH 8) unter Zugabe von 50 mM EDAC für 30 - 60 Minuten bei Raumtemperatur.
Methode B: Synthese von redox-modifizierten Oligonukleotiden
Die zweite Methode, redoxgelabelte Oligonukleotidmonoschichten auf Gold zu erhalten, ist die Modifizierung der Oligonukleotide mit redoxaktiven Gruppen (PQQ und Ferrocen-Essigsäure) in Lösung und anschließender Immobilisierung auf der Goldoberfläche.
Anbindung von PQQ: Die Anknüpfung der PQQ-Redoxfunktionen erfolgt durch Aktivierung der Car- boxylatfunktionen und deren anschließender Bindung an die primäre Aminogruppe des modifizierten T-Bausteins ( Amino-Modifier dT) im Oligonukleotid.
Hierzu werden 1 ,65 mg PQQ (Sigma-Aldrich, Steinheim, D) in 25μl Millipore-Wasser (0,2M) gelöst und mit 1 ,15 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS, 0,25M, Sigma-Aldrich) und 6 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids, Ethyldiaminopropylcarbodiimid
(EDAC, 0,5M) versetzt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird der entstehende
Niederschlag durch Zugabe von 50 μl DMF wieder gelöst. Nach weiteren 15 Minuten wird die Lösung mit weiteren 145 μl DMF verdünnt. Für die Modifizierung des Oligonukleotids werden 120 μl der Aktivierungslösung mit 3,7 μl Millipore-Wasser und 3,2 μl Triethylammoniumhydogencarbonat-Lösung (TEK-Puffer, 1 M, Fluka, Buchs, CH) versetzt. Nach Zugabe von 10 OD des amino- modifizierten Oligonukleotids wird die Lösung über 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung erfolgt durch Größenausschlußchromatographie über eine Sephadex G25 M-Säule (Amersham- Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden).
Die Ausbeuten an Oligonukleotid liegen dabei in der Regel zwischen 70 und 90 %. Die Synthese der Ferrocenessigsäure-gelabelten Oligonukleotide erfolgt durch Aktivierung der Ferrocenessigsäure mit TBTU (Fluka) und anschließender Kupplung mit der freien Aminogruppe des Oligonukleotids. Hierzu werden im ersten Schritt 4,9 μg der Ferrocenessigsäure (Strem Chemicals, Kehl, D) in 100 μl DMF gelöst. 75 μl dieser Lösung werden dann zu einer Lösung von 6 mg TBTU in 75μl DMF gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur aktiviert. 10 OD des zu modifizierenden Oligonukleotids (als 1 mM wäßrige Lösung) werden mit 3,2 μl TEK- Puffer versetzt. Anschließend erfolgt die Zugabe von 25 μl der aktivierten
Ferrocenessigsäure und 95 μl DMF. Nach einer Reaktionszeit von 20 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur wird das Oligonukleotid wie oben beschrieben aufgereinigt.
Die Modifizierung der Elektroden mit den redoxgelabelten Oligonukleotiden erfolgt entsprechend der Vorschrift für die unmodifizierten 5'-Thiol-aminomodifizierten Oligonukleotide.
Beispiel 3: Elektrochemische Experimente Die elektrochemische Charakterisierung der redox-modifizierten Oligonukleotid- Monoschichten erfolgt mittels Cyclovoltammetrie (CV) und Differenz-Puls- Voltammetrie (DPV) in 20 mM Phosphatpuffer pH 7. Im Falle von an einer Goldelektrode gebundenen PQQ modifizierten Nukleinsäureoligomeren tritt ein Signal der reversiblen Redoxreaktion bei einem Potential von ca. -100 mV (gegen Ag/AgCI) auf. Dies zeigt, daß die PQQ-Redoxeinheiten kovalent über die Nukleinsäureoligomere auf der modifizierten Elektrode gebunden sind. Die Redoxsignale für Ferrocenessigsäure- modifizierte Oligonukleotid-Monoschichten treten bei Potentialen von ca. +200 mV (gegen Ag/AgCI) auf und sind in der Regel breiter und weniger intensiv als die entsprechenden PQQ-Signale.
Beispiel 4: Experimente mit Interkalatoren:
Inkubation von PQQ-Oligoelektroden (hergestellt nach Beispiel 2 Methode A) in Interkalator-Lösungen:
Die Inkubation wurde für eine PQQ-Zi6-Oligonukleotidelektrode Seq.lD No. 4 (Tabelle 1 ) in Interkalator-Lösung (10 μM Hoechst 33258 (Bisbenzimid) (Fluka) in 1M Phosphatpuffer (pH 6.6) für 20 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.
Kurve (51) in Fig. 5 zeigt das DPV-Meßergebnis einer Zi6-PQQ-Elektrode in 20 mM Phosphatpuffer bei pH6.6, (reduktiver Scan, 10 mV/s, Schrittweite 500 ms, Pulsweite 20 ms, Pulshöhe 25 mV) vor der Inkubation mit Hoechst 33258 Kurve (52) zeigt das DPV-Meßergebnis nach Inkubation in 10μM Hoechst 33258 in 1 M Phosphatpuffer für 20 min bei RT.
Der elektrochemische Vergleich der Elektrode zeigt eine deutliche Abnahme des PQQ-Oxidationssignals auf maximal 20 % (Verhältnis der Peakhöhen) des Ausgangswertes nach Inkubation in der Interkalatoriösung (Fig. 5). Die Struktur des Oligonukleotids wird durch Interkalatoren folglich in einer Weise verändert, daß der Elektronentransfer stark gehemmt wird. Beispiel 5: Experimente mit DNAse I:
Die Inkubation einer PQQ-modifizierten Oligonukleotid-Elektrode (nach Beispiel 2, Methode A hergestellt) in einer DNAse I-Lösung (2U in 100 μl 1x T7-Transkriptions- Puffer, als Kit von Promega, Madison, USA) für 15 (Fig. 6 Kurve (62)), bzw. 30 Minuten (Fig. 6 Kurve (63)) bei 37 °C ergibt bei anschließender elektrochemischer Charakterisierung mit CV und DPV eine fast vollständige Unterdrückung der PQQ- Redoxsignale. Die Vergleichsmessung, gezeigt in Fig. 6 Kurve, (61) wurde vor der Inkubation mit DNAse I durchgeführt. Der Effekt zeigt deutlich, daß die PQQ-modifizierten Oligonukleotid-Stränge durch das Protein geschnitten werden, der zeitliche Verlauf der Reaktion ist verfolgbar, nach 30 Minuten hat das Redoxsignal auf 15-20 %, nach 60 Minuten auf 5-7 % des Referenzsignals abgenommen.
Beispiel 6: Experimente mit Transkriptionsfaktoren:
Die Beispiele 4 und 5 zeigen sequenzunspezifische Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA, im vorliegenden Beispiel 6 werden demgegenüber sequenzspezifische Wechselwirkungen zwischen redoxmarkierten DNA- Oligonukleotiden und Transkriptionsfaktoren untersucht. Die verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind in Tabelle 1 zusammen mit ihren spezifisch anbindenden Transkriptionsfaktoren (TKF) aufgeführt. Der SP1 -Transkriptionsfaktor (als Extrakt aus E-coli) wurde freundlicherweise von Herrn Prof. Suske (Universität Marburg) zur Verfügung gestellt, der Oct2a-TKF wurde von der Firma Röche als Kit mit Puffer-Lösungen ( DIG Gelshift Kit) erworben. HeLa-Scribe Nuclear Extract (Gel Shift Assay Grade, mit SP1-TKF als Bestandteil), ebenfalls als Kit (Gel Shift Assay Systems), und TATA-Binding-Protein wurden von Promega bezogen. Die Inkubation einer PQQ-Zi-3-Oligonukleotidelektrode, enthaltend ein Oligomer Seq. ID No. 1 in einer Oct2a-TKF-Lösung (mit 5 μl Oct2a/90 μl Puffer; Zusammensetzung nach Herstellerangabe) ergab nach 60 Minuten bei Raumtemperatur noch keine Änderung des DPV-Redoxsignals (Fig. 7). Kurve (71) in Fig. 7 gibt die Messung vor Zugabe von Oct-Il wieder, Kurve (72) zeigt eine Messung 30 Minuten nach Oct-Il Zugabe, Kurve (73) 60 Minuten nach Oct-Il Zugabe, ohne wesentliche Änderung der Signalhöhe. Somit können unspezifische Wechselwirkungen ausgeschlossen werden. Die Inkubation der selben Elektrode in einer SP1-TKF-Lösung (10% Suske-SP1 -Extrakt (10μl) in Roche-Kit-Binding Buffer 90 μl)) ergab nach bereits 30 Minuten Inkubationszeit eine signifikante Verringerung des Redoxsignals (Fig. 8 Kurve (81) Oxidationssignal vor Inkubation mit SP1 , Kurve (82) Oxidationssignal nach 30 Minuten Inkubation der Elektrode mit SP1 -Lösung), welches nach weiteren 90 Minuten Inkubation weiter deutlich abnahm (Fig. 8 Kurve (83)). Eine quantitative Betrachtung der Peakhöhen- und Flächenverhältnisse ergab eine Verringerung des Signals auf 50 % nach der ersten Inkubation und einer weitere Verringerung auf 30-35 % nach der zweiten Inkubationsphase. Während Oct2a keine Änderung des Redoxverhaltens der SP1 -spezifischen Oligonukleotid-Monoschichtelektrode hervorruft, wird der Stromfluß bei der Inkubation mit SP1 -Transkriptionsfaktor deutlich verringert. Somit ist die spezifische Wechselwirkung zwischen dem SP1-TKF und den Oligonukleotidsträngen (Zi-3 Seq. ID No. 1 hat eine SP1 -spezifische Erkennungssequenz, alternativ wurde Zi-5 Seq. ID No. 3 verwendet) nachgewiesen.
Zusätzlich wurden Experimente mit Ferrocenessigsäure modifzierten DNA-Sonden durchgeführt. Die DNA-Elektroden wurden nach Beispiel 2 Methode B hergestellt und auf die Goldelektrode aufgebracht. Die SP1 spezifische Probe (Zi-3 Seq. ID No. 1) wurde mit HeLa-Scribe Nuclear Extract (5,5 mg/ml Gel Shift Assay Grade, Promega) analog der Promegavorschrift (60 μl Wasser 20 μl 5x Gel Shift Binding Buffer, 20 μl Nuclearextract ) für 90 Minuten inkubiert. Infolge dessen wurde eine deutliche Abnahme (Größenordnung 45-50 %) des Redoxsignals (Fig. 9 Kurve (92)) im Vergleich zur Referenzmessung vor der Inkubation (Fig. 9 Kurve (91) detektiert.
Analog wurde das Experiment mit TATA-Binding-Protein (10 fpu, Promega 10μl)) durchgeführt. Bei Verwendung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden mit der Sequenz Zi-3 (Tabelle 1, Seq. ID No. 1) wurde eine geringe unspezifische Abnahme des Redoxpeaks (Fig. 10, Kurve (102)) gegenüber der Referenzmessung vor der Inkubation (Fig. 10, Kurve (101)) festgestellt. Wurde eine TATA-spezifische Sequenz (Zi-4 Seq. ID No. 2, Tabelle 1) mit dem TATA-Binding-Protein (10 fpu) für 40 und 70 Minuten inkubiert, war eine deutliche Abnahme auf 75 % bzw. 60 % des 3c, Ausgangssignals zu beobachten (Fig. 11 Kurve (112) nach 40-minütiger Inkubation,
Kurve (113) nach 70-minütiger Inkubation, Kurve (111) Referenzmessung vor
Inkubation mit TATA-Binding-Protein). Das Kontrollexperiment mit Nuclearextract und einer TATA- spezifischen DNA-Probe (Zi-4 Seq. ID No. 2 (Tabelle 1)) führte nur zu einer Änderung der Peakform (Fig. 12, Kurve (121) zeigt das Redoxsignal vor der
Inkubation, Kurve (122) zeigt das Redoxsignal nach 30-minütiger Inkubation mit einer HeLa-Zellextrakt-Lösung) und nicht zu einer Verminderung des Redoxsignals.
In einem weiteren Experiment wurde der Einfluß von TATA-Binding-Protein (TFIID) auf den Elektronentransfer in immobilisierten Oligonukleotiden mit spezifischer Erkennungssequenz (Zi-4 Seq. ID No. 2) untersucht.
Dazu wurde eine gereinigte Goldelektrode mit 10OμM Zi-4-Ferrocenessigsäure in 0,9M Phosphatpuffer (+ 1mM DTT), Inkubationszeit: 4 Stunden bei 4°C behandelt. Die Monoschicht-Lücken werden mit Mercaptohexanol (1mM Lösung in H2O), 1 Stunde bei RT passiviert.
Die Messung erfolgt in einer Elektrolytlösung (20 mM Kalium-Phosphatpuffer pH 7,0) mit Hilfe der DPV (Pulshöhe 25mV, Vorschubgeschwindigkeit 10mV/s, Pulsdauer 20ms, Schrittweite 500ms, Potential gegen Ag/AgCI (3M NaCI)).
Die Inkubation der Elektrode in reinem GelShift-Binding-Buffer (Promega) dient zur Ausführung von Kontrollmessungen, der Anteil an TFIID-Protein in der Inkubationslösung wird variiert (von 1μl TFIID + 90μl Binding Buffer bis 10μl TFIID + 90μl Binding Buffer) und die entsprechende Änderung des elektrochemischen Signals bestimmt.)
Der Einfluß des reinen Binding Buffers auf die Höhe der DPV-Redoxpeaks ist vernachlässigbar. (Fig. 13, Kurve (131) zeigt das Ferrocen-Reduktionssignal aus der Referenzmesung (nach 30 Minuten Inkubation mit Binding Buffer) und Kurve (132) das Redoxsignal der Elektrode nach weiteren 20 Minuten Inkubation mit Binding- Buffer), die Abnahme der Signalhöhen ist sehr gering. Nach 20-minütiger Inkubation der Elektrode in TF II D-Proteinlösung (1 μl TFIID+90μl Binding Buffer) ergibt sich eine signifikante Abnahme der Signalhöhen im DPV (Fig. 13, Kurve (133)), welche auf spezifische Wechselwirkungen zwischen dem Restriktionsenzym und der Bindungsstelle des Oligonukleotidstranges zurückzuführen ist. Eine Erhöhung der Enzymkonzentration hat eine stärkere Abnahme des Signals bei gleicher Inkubationszeit zur Folge. Fig. 13, Kurve (137) zeigt den Effekt einer 20- minütigen Inkubation der Elektrode in 5μl TFIID + 90μl Binding Buffer auf das Reduktionssignal, Kurve (138) zeigt das entsprechende Signal nach 20-minütiger Inkubation in 10μl TFIID + 90μl Binding Buffer).
Neben dem Konzentrationseffekt des Transkriptionsfaktors konnte auch die zeitliche Abhängigkeit der Anbindung des Transkriptionsfaktors TFIID an die Doppelstrang- Nukleinsäure-Sonden gemessen werden. So sinkt das Reduktionssignal einer Lösung aus 1 μl TFIID + 90μl Binding Buffer nach 40-minütiger Inkubation weiter ab (Fig. 13, Kurve (134) danach hat sich unter den gegebenen Reaktionsbedingungen ein Gleichgewicht eingestellt, die Signalhöhe ändert sich im zeitlichen Verlauf nicht weiter (Fig. 13, Kurve (136) zeigt das Reduktionssignal einer Lösung aus 1 μl TFIID + 90μl Binding Buffer nach 70-minütiger Inkubation, Kurve (135) nach 160-minütiger Inkubation). Fig. 13, Kurve (139) zeigt die Zunahme der Bindungsereignisse aus einer Lösung aus 10μl TFIID + 90μl Binding Buffer nach insgesamt 40-minütiger Inkubation gegenüber der 20-minütigen Inkubation der gleich konzentrierten Lösung (Kurve (138)).
O 01/31057
36
Tabelle 1 Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide (Interactiva, Ulm, D)
In den Oligomersequenzen in Tabelle 1 steht X für einen käuflich erhältlichen Aminomodifier dT-Baustein (Formel I), der am 5 '-Ende des Oligomers liegende Nukleotidbaustein ist am C6-Thiol-modifiziert (erhältlich von der Firma Interactiva).
Formel I

Claims

O 01/31057Patentansprüche : •3?
1. Nukleinsäure-Sonden enthaltend eine an, eine leitfähige Oberfläche gebundene, zumindest teilweise doppelsträngige Nukleinsäuresequenz an die mindestens eine Elektronen-Donor-Einheit oder mindestens eine Elektronen-Akzeptor-
Einheit gebunden ist.
2. Nukleinsäure-Sonden nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die angebundenen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden aus zwei komplementären Nukleinsäuremolekülen zusammengesetzt sind.
3. Nukleinsäure nach Ansprüche 1 dadurch gekennzeichnet, daß die angebundenen Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden aus Nukleinsäuresequenzen bestehen, die selbsterkennende Domänen enthalten.
4. Nukleinsäure-Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangigen Nukleinsäure-Sonden die gleiche Nukleinsäuresequenz besitzen.
5. Nukleinsäure-Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangigen Nukleinsäure-Sonden unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen besitzen.
6. Nukleinsäure-Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangigen Nukleinsäure-Sonden auf einer leitfähigen Array-Oberfläche aufgebracht sind.
7. Nukleinsäure-Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangigen Nukleinsäure-Sonden auf einer unstrukturierten leitfähigen Oberfläche aufgebracht sind.
8. Nukleinsäure-Sonden nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden durch Brückenbindungen stabilisiert sind. 3<3
9. Nukleinsäure-Sonden nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden durch Disulfidbrücken stabilisiert sind.
10. Nukleinsäure-Sonden nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die doppelsträngige Nukleinsäure-Sonden Doppelstrang- DNAs, Doppelstrang-RNAs oder DNA-RNA-Hybride enthalten.
11. Nukleinsäure-Sonden nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß regenerierbare und/oder induzierbare Elektronen-Donor- oder Elektronen-Akzeptor-Einheiten an der Nukleinsäure kovalent angebunden sind.
12. Aggregate enthaltend Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden gemäß einem der vorherigen Ansprüchen 1 bis 11 und Substanzen, die aus der Gruppe der mit doppelstrangigen Nukleinsäuren unmittelbar interagierenden Substanzen ausgewählt sind.
13. Aggregate nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, daß die unmittelbar interagierende Substanz ein Protein und/oder ein Peptid und/oder eine einzelsträngige und/oder eine doppelsträngige Nukleinsäure und/oder ein Mimetika und/oder ein interkalierende und/oder eine nukleinsäureschädigende Substanz und/oder ein Cytostatika ist.
14. Aggregate nach Anspruch 12 oder 13 dadurch gekennzeichnet, daß das Aggregat weitere mittelbar interagierende Substanzen enthält.
15. Verfahren zur Detektion von Wechselwirkungen zwischen doppelstrangigen Nukleinsäuren und damit interagierenden Substanzen dadurch gekennzeichnet, daß a) Sonden gemäß der Ansprüche 1 bis 11 einem Reaktionsmedium ausgesetzt werden und b) die erzeugte Elektronenflußänderung durch die Sonden gemessen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium eine Lösung ist, die mindestens eine interagierende Substanzen enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium eine Lösung ist, die mindestens eine interagierende Polymerasen, Transkriptionsfaktoren, Repressoren, Enzyme und/oder deren Inhibitoren und/oder Aktivatoren und/oder Mimetika und/oder interkalierende und/oder nukleinsäureschädigende Substanzen und/oder Cytostatika enthält.
18. Verfahren nach Anspruch 15 bis 17 dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium einzel- und/oder doppelsträngige Nukleinsäuren enthält.
19. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß das
Reaktionsmedium DNA-schädigende oder karzinogene Substanzen enthält.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19 dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium eine wässrige, salzhaltige Lösung ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionslösung gepuffert ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21 dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion bei einer Temperatur zwischen 4 und 40 °C stattfindet.
23. Verwendung der Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Detektion von Wechselwirkungen, von Gleichgewichtskonstanten, von kompetitiven Effekten oder Reaktionsgeschwindigkeiten, zwischen doppelstrangigen Nukleinsäuren und mit ihnen unmittelbar und/oder mittelbar interagierenden Substanzen. O 01/31057
24. Analytikum enthaltend Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Identifikation von unmittelbar und mittelbar auf die Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonde einwirkenden Faktoren.
25. Analytikum enthaltend Doppelstrang-Nukleinsäure-Sonden gemäß den
Ansprüchen 1 bis 11 zur Identifikation von Nukleinsäure-Sequenzen die mit unmittelbar oder mittelbar interagierenden Substanzen wechselwirken.
26. Verfahren zur Herstellung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Detektoren umfassend: a) die Synthese einer einzelsträngigen Nukleinsäure, b) die intermolekulare Hybridisierung mit einer eine komplementäre Domäne enthaltende Nukleinsäure, c) die kovalente Anbindung der Elektronen-Donor-Einheiten oder Elektronen- Akzeptor-Einheiten an die Nukleinsäure und d) die kovalente Anbindung der Nukleinsäure an eine leitfähige Oberfläche.
27. Verfahren zur Herstellung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Detektoren umfassend: e) die Synthese einer einzelsträngigen, über eine Brücke getrennten selbsterkennende Domänen enthaltenden Nukleinsäure, f) die intramolekulare Hybridisierung der selbsterkennden Domänen der einzelsträngigen Nukleinsäure, g) die kovalente Anbindung der Elektronen-Donor-Einheiten oder Elektronen- Akzeptor-Einheiten an die Nukleinsäure und h) die kovalente Anbindung der Nukleinsäure an eine leitfähige Oberfläche.
28. Verfahren zur Herstellung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Detektoren gemäß Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß die Brücke aus mindestens einem Nukleotid besteht.
29. Verfahren zur Herstellung von Doppelstrang-Nukleinsäuren gemäß Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß eine artifizielle mindestens einatomige Brücke eine Disulfid-, Stilbendicarboxyamid-, Ruthenium-Komplex-, Hexaethylenglycol-, Terephthalimid-, verzweigte oder unverzweigte Diol-, S'-Amino Modifier-CPG oder verzweigte Phosphoramidit-Brücke eingeführt wird.
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