EP1346029A2 - Verwendung von acetyl-coa carboxylase zum identifizieren von insektizid wirksamen verbindungen - Google Patents

Verwendung von acetyl-coa carboxylase zum identifizieren von insektizid wirksamen verbindungen

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Publication number
EP1346029A2
EP1346029A2 EP01985351A EP01985351A EP1346029A2 EP 1346029 A2 EP1346029 A2 EP 1346029A2 EP 01985351 A EP01985351 A EP 01985351A EP 01985351 A EP01985351 A EP 01985351A EP 1346029 A2 EP1346029 A2 EP 1346029A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acetyl
insects
sequences
accase
coa carboxylase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01985351A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Reiner Fischer
Eva-Maria Franken
Ralf Nauen
Ute Teuschel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Bayer CropScience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer CropScience AG filed Critical Bayer CropScience AG
Publication of EP1346029A2 publication Critical patent/EP1346029A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the invention relates to the use of polypeptides and enzyme preparations with the biological activity of an acetyl-CoA carboxylase for the identification of new, insecticidally active compounds, and to methods for finding modulators of these polypeptides.
  • ACCase The acetyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2), hereinafter referred to as ACCase, catalyzes the biotin-dependent carboxylation of acetyl-CoA and provides the
  • the ACCase has three domains: biotin carboxyl carrier (BCC), biotin carboxylase (BCase) and carboxyl transferase (CTase).
  • BCC biotin carboxyl carrier
  • BCase biotin carboxylase
  • Case carboxyl transferase
  • the reaction catalyzed by the ACCase can be divided into two steps. In a first step, a ATP-cleavage by the BCase activity a CO 2 group from bicarbonate to a covalently to the
  • the homomeric ACCase consists of a polypeptide chain that contains all three domains and can be found in the cytosol of plants, animals and fungi (Ke J et al., 2000). In plants and vertebrates, the ACCase is activated by numerous mechanisms, e.g. Allosterically regulated by citrate, palmitoyl-CoA, by phosphorylation / dephosphorylation, by protein kinases and at the level of gene expression (Munday MR & Hemingway CJ 1999; Ke J et al. 2000). No information is available on the regulation of the enzyme from insects.
  • ACCase from Arabidopsis thaliana gene bank AAF 18638546 or for a patent registered (e.g. Haselkorn R & Gornicki P 1999; Somers DA 1999; Jenkins AR et al. 1992).
  • a patent registered e.g. Haselkorn R & Gornicki P 1999; Somers DA 1999; Jenkins AR et al. 1992.
  • an annotated sequence from insects assigned to the ACCase is not yet available.
  • Inhibitors of ACCase from plants and fungi known as herbicides or fungicides (Vahlensieck HF et al. 1994; Gronwald JW 1994).
  • Another document describes the fungicides Soraphen A and B, known as ACCase inhibitors, for controlling mites that do not belong to the order of the insects (Sutter M. et al., 1991).
  • the object of the present invention was therefore to make the ACCase from insects available, to test their suitability as a site of action for insecticides, and
  • crude extracts have now been obtained from various larval stages or adults of the peach aphid Myzus persicae by homogenization in suitable buffers. These crude extracts were pre-cleaned and the
  • the present invention further shows that, in particular, cyclic 1,3-dicarbonyl compounds and their enols of the formula (I)
  • Ar represents substituted aryl or hetaryl with at least one ortho substituent
  • R stands for H or for acyl radicals, preferably for the radicals COR 1 and CO2R 1 in which
  • R 1 represents optionally substituted alkyl, phenyl or hetaryl
  • A forms an optionally substituted 5- or 6-membered carbo- or heterocycle with the linked C atoms, N, O and / or S being suitable as hetero atoms, for example,
  • 1,3-dicarbonyl compounds can be used as inhibitors of ACCase in insects.
  • the present invention also relates to the use of the compounds of the formula (I) as inhibitors of ACCase in insects.
  • ACCase is a target protein of insecticidal substances in insects. This also shows for the first time that the ACCase is an enzyme vital for insects and is therefore particularly suitable as a target protein for the search for further and possibly improved insecticides
  • the ACCase from Drosophila melanogaster is further described for the first time on the basis of its nucleic acid sequence and thus made accessible.
  • the nucleic acid sequence of the Accession Number AAF59156 has been accessible for some time.
  • the meaning of the sequence or the polypeptide encoded by it and its biological function, however, were previously unknown, as was the coding region of this sequence section.
  • homologous polypeptides which are encoded by corresponding homologous nucleic acids, and further members of the gene family can also be used as molecular interaction partners (targets) for insecticidal active substances, in particular the compounds of the formula (I).
  • the homologous polypeptides are particularly preferably those which are used for
  • ACCase from Myzus persicae or Drosophila melanogaster have an identity of 60%, preferably 80%, particularly preferably 90% and particularly preferably 95%
  • Insecticides and / or acaricidal active ingredients which can possibly be found with the aid of the ACCases according to the invention, can accordingly also interact with ACCases from numerous other acarina or insect species, the interaction with the different ACCases occurring in the insects or acarina not always being equally strong got to. Among other things, this explains the observed selectivity of the substances active on this enzyme.
  • Particularly preferred ACCases or organisms of origin are listed by way of example and not exhaustively in Table 1 below:
  • ACCases are target proteins (targets) for insecticidal active substances and can be used to identify new, improved insecticidal active substances in suitable methods (assays).
  • the ACCases from Myzus persicae and Drosophila melanogaster are particularly suitable for identifying new insecticidal and possibly also acaricidal active ingredients.
  • the present invention therefore relates to the use of polypeptides from insects with the biological activity of an ACCase and to nucleic acids encoding them for identifying modulators of the ACCase in
  • Insects were isolated or encoded by nucleic acid sequences or fragments thereof from insects and obtained by in vivo or in vitro methods.
  • the polypeptides are particularly preferably those which form a ACCase from Myzus persicae or Drosophila melanogaster
  • the present invention particularly relates to the use of the ACCase from insects of the Aphididae and Diptera family.
  • the present invention particularly relates to the use of the ACCase from Myzus persicae and the ACCase from Drosophila melanogaster according to SEQ ID NO: 1
  • the present invention relates in particular to the use of the ACCase from Myzus persicae for identifying modulators of the ACCase
  • polypeptides according to the invention thus very particularly preferably comprise a sequence selected from
  • sequences which have an at least 60%, preferably an 80%, particularly preferably a 90% and very particularly preferably a 95% identity with the sequences mentioned under a) to d).
  • the degree of identity of the amino acid sequences is preferably determined using the GAP program from the GCG program package, version 10.0 under standard settings (Devereux et al. 1984).
  • the present use also relates to the use of for
  • ACCases encoding insect nucleic acids to identify ACCase modulators in insects and / or Akarina.
  • the present invention also relates in particular to the use of the nucleic acid coding for the ACCase from Myzus persicae and that for
  • ACCase from Drosophila melanogaster encoding nucleic acid according to SEQ ID NO: 1 for identifying ACCase modulators, as well as 60%, preferably 80%, particularly preferably 90% and particularly preferably 95% homologous nucleic acid sequences.
  • the nucleic acids according to the invention are in particular single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, which may contain introns, and cDNAs.
  • cDNA denotes a single- or double-stranded copy of an RNA molecule and is therefore intron-free as a copy of a biologically active RNA, i. H. all coding regions of a gene are contained in a coherent form.
  • identity refers to the number of sequence positions that are identical in an alignment. It is usually given as a percentage of the alignment length.
  • Sequence or a specific part of this sequence is defined as the percentage of nucleotides in the nucleic acid molecule examined which is identical to the nucleotides of the specified sequence or a specific part of this sequence when the sequences are compared with one another ("alignment") and, if necessary, so-called “gaps” are introduced by the maximum percentage to obtain identical sequences, with all parameters of the program used being set to "default".
  • similarity presupposes the definition of a similarity metric, that is, a measure of how similar one would like to assume a valine to a threonine or a leucine, for example.
  • percent (%) similarity corresponds to the term “percent (%) identity” described above, the conservative amino acid substitutions in addition to the identical amino acids being included in the calculation of the% number.
  • homologous proteins have developed from a common precursor sequence. The term does not necessarily have anything to do with identity or similarity, apart from the fact that homologous sequences are usually more similar (or have more identical positions in an alignment) than non-homologous sequences.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably DNA or DNA fragments which correspond to genomic DNA from insects, the
  • Nucleic acids preferably originate from Diptera, particularly preferably from Drosophilidae.
  • the nucleic acids according to the invention are particularly preferably DNA or DNA fragments, the genomic DNA from Myzus persicae or
  • nucleic acids according to the invention very particularly preferably comprise a sequence selected from
  • sequences which have an at least 60%, preferably an 80%, particularly preferably a 90% and very particularly a 95% identity with the sequences defined under a) and b),
  • a very particularly preferred embodiment of the nucleic acids to be used according to the invention is a cDNA molecule with the sequence coding for ACCase from Myzus persicae and the sequence coding for ACCase from Drosophila melanogaster according to SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid sequence coding for the ACCase from Myzus persicae can be derived on the basis of the genetic code from the amino acid sequence, which can be isolated as described in Example 3 and defined by sequencing.
  • nucleic acid sequence To use the nucleic acid sequence to check the nucleic acid sequence actually present in Myzus persicae and, if necessary, to correct the derived sequence, as far as this seems reasonable.
  • the isolation or verification of the genomic M. persicae sequence can e.g. by using primers derived from the derived nucleic acid sequence, which can be used in PCR reactions to amplify the target sequence according to methods known to the person skilled in the art.
  • the present invention also relates to the polypeptides which are encoded by the nucleic acids according to the invention.
  • hybridize as used herein describes the process in which a single-stranded nucleic acid molecule with a complementary strand undergoes base pairing.
  • DNA fragments from insects other than Drosophila melanogaster which code for ACCases that have the same or similar properties of one of the ACCases according to the invention, can be isolated, for example, from the sequence information mentioned or derived here.
  • Hybridization conditions are approximately calculated using the following formula:
  • Hybridization solution DIG Easy Hyb (Röche, ZZ) Hybridization temperature: 37 ° C to 50 ° C, preferably 42 ° C (DNA-DNA), 50 ° C (DNA-RNA).
  • 1st washing step 2x SSC, 0.1% SDS 2x5 min at room temperature;
  • 2nd washing step 1x SSC, 0.1% SDS 2x 15 min at 50 ° C; preferably 0.5x SSC, 0.1% SDS 2x 15 min at 65 ° C; particularly preferably 0.2x SSC, 2x15min at 68 ° C.
  • the degree of identity of the nucleic acids is preferably determined using the NCBI BLASTN version 2.0.4 program. (Altschul et al. 1997).
  • regulatory regions refers to untranslated regions of the gene in question, such as promoters, enhancers, repressor or activator binding sites or termination sequences that interact with cellular proteins, thereby controlling transcription.
  • the present invention also relates to DNA constructs which comprise a nucleic acid to be used according to the invention and a heterologous promoter.
  • the present invention furthermore relates to the use of such DNA constructs for identifying ACCase modulators.
  • heterologous promoter refers to a promoter which has different properties than the promoter which controls the expression of the gene in question in the original organism.
  • heterologous promoters depend on whether pro- or eukaryotic cells or cell-free systems are used for expression.
  • heterologous promoters are the early or late promoter of SV40, adenovirus or cytomegalovirus, the lac system, the trp system, the main operator and promoter regions of phage lambda, the control regions of the fd coat protein, the promoter of 3-phosphoglycerate kinase, the promoter of acids
  • Phosphatase the baculovirus immediate early promoter and the promoter of the yeast ⁇ -mating factor.
  • the invention furthermore relates to vectors which contain a nucleic acid according to the invention or a DNA construct according to the invention. All plasmids, phasmids, cosmids, YACs or artificial chromosomes used in molecular biological laboratories can be used as vectors.
  • the present invention furthermore relates to the use of vectors which contain a nucleic acid to be used according to the invention or a DNA construct to be used according to the invention in methods for identifying ACCase modulators.
  • phages All phages, plasmids, phagmids, phasmids, cosmids, YACs, BACs, artificial ones used in molecular biological laboratories can be used as vectors
  • Chromosomes or particles that are suitable for particle bombardment are used.
  • the present invention also relates to host cells which contain a nucleic acid to be used according to the invention, a DNA
  • Contain construct or a vector to be used according to the invention Contain construct or a vector to be used according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of such host cells for identifying ACCase modulators.
  • host cell refers to cells which do not naturally contain the nucleic acids to be used according to the invention.
  • Suitable host cells are both prokaryotic cells, such as bacteria of the genera Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, preferably E. coli, and eukaryotic cells, such as yeast, mammalian, amphibian, insect or plant cells.
  • Preferred eukaryotic host cells are HEK-293, Schneider S2, Spodoptera Sf9, Kc, CHO, COS1, COS7, HeLa, C127, 3T3 or BHK cells and in particular Xenopus oocytes.
  • polypeptides refers to both short amino acid chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides, or oligomers, and longer amino acid chains, commonly referred to as proteins. It encompasses amino acid chains that are either natural Liehe processes, such as posttranslational processing, or by chemical methods, ⁇ the state of the art, may be modified. Such modifications can occur at various locations and multiple times in a polypeptide, such as, for example, on the peptide backbone, on the amino acid side chain, on the amino and / or on the carboxy terminus. They include, for example, acetylations, acylations, ADP ribosylations, amidations, covalent linkages with
  • the polypeptides according to the invention can be in the form of "mature" proteins or as parts of larger proteins, for example as fusion proteins.
  • proteins according to the invention can also be present as they are naturally present in their organism of origin, from which they can be obtained directly, for example.
  • ACCase which is coded from a complete coding region of a transcription unit, starting with the ATG start codon and comprising all information-bearing exon regions of the gene encoding the ACCase present in the organism of origin, as well as signals necessary for correct termination of the transcription.
  • gene as used herein is the designation for a section from the genome of a cell that is responsible for the synthesis of a polypeptide chain.
  • polypeptides according to the invention need not be complete ACCases, but can only be fragments thereof, as long as they have at least the biological activity of the complete ACCase.
  • Polypeptides from insects which have the same biological activity as an ACCase from Myzus persicae or Drosophila melanogaster are still considered to be according to the invention.
  • polypeptides according to the invention need not completely correspond to the ACCases from Myzus persicae or Drosophila melanogaster in terms of their sequence or catalytic activity.
  • Polypeptides which are homologous to the ACCase, for example of the following insects or to fragments thereof which can still exert the biological activity of the ACCase, are also considered as polypeptides according to the invention: From the order of the Isopoda, for example Oniscus asellus, Armadillidium vulgare, Porcellio scaber.
  • Thysanura e.g. Lepisma saccharina.
  • Orthoptera e.g. Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratorioides, Melanoplus spp., Schistocerca gregaria.
  • Phthiraptera e.g. Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp., Trichodectes spp., Damalinia spp ..
  • Thysanoptera for example Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci, Thrips palmi, Frankliniella accidentalis.
  • Heteroptera for example Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.
  • Homoptera e.g. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Aphis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Phylloxera vastatrix, Pemphigus sppe, Phros
  • Sitophilus spp. Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Psususylbole, Ptinuslopp.
  • Tribolium spp. Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica, Lissorhoptrus oryzoph ⁇ lus.
  • Hymenoptera e.g. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Nespa spp.
  • polypeptides according to the invention may have deletions or amino acid substitutions in comparison to the corresponding regions of naturally occurring ACCases, as long as they still have at least one biological activity of the complete ACCases.
  • Conservative substitutions are preferred. Such conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Trp.
  • the present invention therefore also relates to polypeptides which exercise at least the biological activity of an ACCase and which comprise an amino acid sequence which has at least 60% identity, preferably 80%, particularly preferably 90% identity and very particularly preferably 95% identity with the sequence from Myzus persiace or the sequence from Drosophila melanogaster encoded by the nucleic acid according to SEQ ID NO: 1, and their use for the identification of modulators of the ACCase.
  • biological activity of an ACCase means the ability to do the biotin-dependent carboxylation of acetyl-CoA catalyze. This can include all three enzyme functions, ie the ATP-dependent removal of a CO 2 group from bicarbonate, the biotin carrier function and the carboxylation of acetyl-CoA, but also only one or two of these reactions.
  • the nucleic acids according to the invention can be produced in the usual way.
  • the nucleic acid molecules can be completely chemically synthesized. It is also possible to chemically synthesize short pieces of the nucleic acids according to the invention and to label such oligonucleotides radioactively or with a fluorescent dye.
  • the labeled oligonucleotides can also be used to search cDNA libraries made from insect mRNA. Clones to which the labeled oligonucleotides hybridize are selected for the isolation of the relevant DNA fragments. After characterizing the isolated DNA, the nucleic acids according to the invention are obtained in a simple manner.
  • nucleic acids according to the invention can also be produced by means of PCR methods using chemically synthesized oligonucleotides.
  • oligonucleotide (s) as used herein means DNA-
  • Molecules consisting of 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides. They are chemically synthesized and can be used as probes.
  • polypeptides according to the invention in particular of the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1, can also be carried out
  • Host cells containing nucleic acids according to the invention are cultivated under suitable conditions.
  • the desired polypeptides can then be isolated from the cells or the culture medium in a conventional manner.
  • the polypeptides can also be produced in in vitro systems.
  • To produce the ACCase from Myzus persicae according to the invention for example, larvae or adults are homogenized in a mortar. For this purpose, they can be snap frozen beforehand, for example in liquid nitrogen. The homogenate is taken up in a suitable buffer.
  • An example of the preparation of a polypeptide according to the invention is given under Example 3.
  • One possible ACCase purification method is based on preparative electrophoresis, FPLC, HPLC (e.g. using gel filtration, reverse phase or slightly hydrophobic columns), gel filtration, differential precipitation, ion exchange chromatography or affinity chromatography.
  • a rapid method for isolating the polypeptides according to the invention begins with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be easily affinity-purified.
  • the fusion partner can be, for example, glutatbion S-transferase.
  • the fusion protein can then be purified on a glutathione affinity column.
  • the fusion partner can be separated by partial proteolytic cleavage, for example on the linker between the fusion partner and the polypeptide according to the invention to be purified.
  • the linker can be designed to include target amino acids, such as arginine and lysine residues, which define sites for trypsin cleavage. Standard cloning techniques using oligonucleotides can be used to create such linkers.
  • Electrophoresis FPLC, HPLC (e.g. using gel filtration, reverse phase or slightly hydrophobic columns), gel filtration, differential precipitation, ion exchange chromatography and affinity chromatography.
  • composition containing the polypeptides according to the invention is preferably enriched at least 10-fold and particularly preferably at least 100-fold with respect to the protein content compared to a preparation from the host cells.
  • polypeptides according to the invention can also be affinity-purified without a fusion partner using antibodies which bind to the polypeptides.
  • the present invention also relates to methods of finding chemical compounds which bind to the ACCase and / or change its properties. Due to the important function of the ACCase, modulators which influence the activity represent new insecticidal and / or possibly acaricidal active ingredients. Modulators can be agonists or antagonists or inhibitors or activators.
  • the cyclic 1,3-dicarbonyl compounds of the formula (I) and their enols mentioned can also be used as optionally marked competitors in methods for finding ACCase inhibitors from insects which do not have to belong to this group of connections.
  • agonist refers to a molecule that accelerates or enhances the activity of the ACCase.
  • modulator as used herein represents the generic term for agonist or antagonist. Modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies that bind to the polypeptides according to the invention and / or their properties, for example their enzymatic Activity, change.
  • modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which in turn binds to the polypeptides according to the invention and / or influences their biological activity.
  • Modulators can be natural substrates and ligands or structural or functional mimetics thereof.
  • the modulators are preferably small organic chemical compounds.
  • Compounds or modulators that act on the ACCase can change the cellular processes in a way that leads to the death of the insects treated with them.
  • the present invention therefore also relates to modulators of
  • the present invention comprises methods for finding chemical compounds which change the expression of the polypeptides according to the invention.
  • expression modulators can also represent new insecticidal active ingredients.
  • Expression modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies that bind to the regulatory regions of the nucleic acids coding for the polypeptides according to the invention.
  • Expression modulators can also be small organic chemical molecules, peptides or Be antibodies that bind to a molecule, which in turn binds to regulatory regions of the nucleic acids coding for the polypeptides according to the invention, and thereby influences their expression.
  • Expression modulators can also be antisense molecules.
  • the present invention also relates to the use of modulators of the polypeptides according to the invention or of expression modulators as insecticides or acaracides.
  • the present invention also relates to expression modulators of
  • the methods of the invention include high throughput screening (HTS) and ultra high throughput screening (UHTS). Both host cells and cell-free preparations containing the nucleic acids according to the invention and / or the polypeptides according to the invention can be used for this.
  • HTS high throughput screening
  • UHTS ultra high throughput screening
  • a synthetic reaction mix e.g. products of in vitro transcription
  • a cellular component such as a membrane, a compartment or any other preparation which contains the polypeptides according to the invention, together with a labeled substrate or ligand of the polypeptides in the presence and In the absence of a candidate molecule, which can be an agonist or an antagonist.
  • Candidate molecule to increase or inhibit the activity of the polypeptides according to the invention is recognizable by an increased or decreased binding of the labeled ligand or by an increased or decreased conversion of the labeled substrate.
  • Molecules that bind well and lead to an increased activity of the polypeptides according to the invention are agonists.
  • Molecules that bind well and inhibit the biological activity of the polypeptides according to the invention are good antagonists. These can also be inhibitors of the above-mentioned class of insecticides, but completely new classes of substances can also have this modulatory activity.
  • Reduce expression of ACCase-encoding mRNA and / or polypeptides by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% are suitable to be used as insecticides or to be developed into such.
  • candidate molecules are then used in further tests for toxicity to vertebrate species, e.g. Mammals and checked for bioavailability.
  • the detection of the biological activity of the polypeptides according to the invention can be improved by a so-called reporter system. Reporter systems in this
  • aspects include, but are not limited to, colorimetric or radioactively labeled substrates that are converted to a product, or a reporter gene that responds to changes in the activity or expression of the polypeptides of the invention, or other known binding assays.
  • the activity of many, e.g. B. membrane-bound proteins can be advantageously measured in a further way.
  • the functional heterologous expression of such proteins in E. coli is often difficult or impossible.
  • the catalytically active part of the protein can be separated off by suitable cloning (for example using suitable PCR strategies), so that the gene product is a (better) soluble protein and can be easily purified.
  • suitable cloning for example using suitable PCR strategies
  • a wide repertoire of measurement options is available for measuring the activity of soluble proteins.
  • a particularly sensitive measurement can be carried out, for example, using a fluorescence-labeled ligand or substrate using fluorescence polarization.
  • Another example of a method with which modulators of the polypeptides according to the invention can be found is a displacement test, in which, under suitable conditions, the polypeptides according to the invention and a potential modulator with a molecule which is known to bind to the polypeptides according to the invention, such as a natural one Substrate or
  • Ligand or a substrate or ligand mimetic An example of this are the compounds of formula (I) mentioned above.
  • the polypeptides of the invention themselves can be labeled, e.g. radioactive or colorimetric so that the number of polypeptides that are bound to a ligand or that have undergone a reaction can be determined exactly.
  • Potentially insecticidal compounds which are found in one of the methods according to the invention with the aid of the nucleic acids and / or polypeptides according to the invention can be supplied to the insects in various ways, e.g. orally (see also Example 4), topically or by injection.
  • Insecticides are often hydrophobic molecules and then usually have to be dissolved in organic solvents that can also evaporate (e.g. methanol or acetone) or that are added in low concentrations to facilitate absorption
  • the first step in experiments with insects is usually to determine the MLD (minimal lethal dose) after chronic insect exposure.
  • the compounds are usually diluted and added to the feed of embryos and larvae aged 0-48 hours.
  • the proportion of eggs from which larvae still hatch is determined, as is the behavior of the larvae (movement, feed intake), the number of larvae still pupating and the resulting adults.
  • the larvae can still be examined for morphological defects.
  • the acute and chronic dose can be determined.
  • the compounds are added to the food of embryos, larvae or adults and the insects are checked after 2 hours and after an overnight incubation. In the case of embryos, the number of embroyos with defects in development and the proportion which lasts until
  • Larvae are e.g. Behavioral disorders, movements during movement or molting checked. Defects in the amount or activity of enzymes as well as behavioral and / or fertility disorders are observed in adult animals.
  • the adults are e.g. placed in trays containing the compound in question for 48 hours, then transferred to a clean container and observed the fertility of the animals or the amount of activity of a particular enzyme or the death of the insects.
  • the following examples show that the ACCase is surprisingly an essential enzyme in insects, and also show that the enzyme is a suitable target protein for the identification of insecticides in methods of
  • Identification of insecticidally active compounds can be used and that the modulators of the ACCase identified in corresponding methods can be used as insecticides.
  • the extraction of this enzyme from Myzus persicae is described by way of example and finally the applicability of the present invention for the
  • Example 1 Preparation of an ACCase enzyme preparation from Myzus persicae
  • the following buffer is preferably used as the extraction buffer: 0.25 M sucrose,
  • the ACCase enzyme preparation was used to find modulators of the ACCase in a biochemical test as follows: First, an aliquot of the enzyme preparation from Example 1 was mixed with the reaction buffer and the radioactively labeled substrate and incubated. To demonstrate the incorporation of CO 2 , smoking HC1 was pipetted in, an aliquot of the reaction mixture on Watman
  • reaction buffer 50 mM Tris / HCl pH 7.4, 15 mM MgCl 2 , 2.5 mM ATP, 1 ⁇ g / ⁇ l bovine serum albumin, 10 mM potassium citrate, 84 mM sodium bicarbonate (all from Sigma, St. Louis) were used as reaction buffer.
  • a sub-step of the ACCase-catalyzed reaction is the fixation of the carbonate group to the co-factor biotin. This fixation takes place under ATP
  • Homogenization buffer 250 mM sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EDTA, 10 mM Na citrate, proteinase inhibitor mix (SIGMA P-8340) crushed (e.g. by mortar or using a homogenizing stick). The homogenized material is then centrifuged for clarification. The supernatant containing the ACCase is then removed using a 4 PD-10 column (Pharmacia Corporation, Peapack,
  • ACCase solution Fractions are tested for their ACCase activity as described under (b). The fractions with the highest specific ACCase activities are pooled and represent the starting material for the inhibitor measurements described under (c) (hereinafter referred to as ACCase solution).
  • reaction buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM MgCl 2 , 1 mg / ml bovine serum albumin, 20 mM Na citrate, 5 mM NaHCO 3 , 1 mM ATP, 200 ⁇ M Acetyl-CoA
  • reaction buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM MgCl 2 , 1 mg / ml bovine serum albumin, 20 mM Na citrate, 5 mM NaHCO 3 , 1 mM ATP, 200 ⁇ M Acetyl-CoA
  • 2 vol of the staining reagent BiomolGreen (Biomol Research Laboratories Inc., Plymouth Meeting, PA, USA), prepared as described by the manufacturer
  • reaction batches are also measured in the absence of the substrate acetyl-CoA and deducted accordingly when calculating the specific ACCase activity.
  • aliquots of the ACCase solution from (a) are mixed with the reaction buffer and the inhibitors to be tested and incubated at physiological temperatures (24 ° C to 37 ° C). After the desired reaction time, the detection reaction is carried out as described under (b). A control measurement without the addition of inhibitor is carried out in parallel. The inhibition of the ACCase is then calculated in comparison to this control.
  • Larvae or adults of the peach aphid Myzus persicae were fed by the sachet method (Nauen et al. 1996) with nutrient solutions with and without one of the identified inhibitors of ACCase for two days.
  • the animals were then collected and homogenized in organic solvent using a mortar.
  • the organic phase was cleaned of water-soluble constituents by repeated shaking with aqueous solution and then the solvent was evaporated.
  • the remaining pellet was taken up in a little solvent and separated by means of thin layer chromatography (TLC).
  • TLC thin layer chromatography
  • the separated lipids were stained with amido black.
  • 14 C acetate incorporated in lipids was detected by autoradiography after 2-3 days of exposure. To quantify the 14 C incorporation in lipids, the corresponding bands were scraped out after the staining, dissolved and the activity determined in the scintillation counter.
  • Figure la shows the lipid status after acetate feeding without (lanes 1-3) and with the active ingredient of the formula (IA) (lanes 4-6) using a separated lipid extract from the peach aphid Myzus persicae. There are no significant differences in lipid composition and lipid content.
  • Figure lb shows the autoradiography of the same DC plate. While in tracks 1-3 the blackening shows those lipids into which radioactively labeled acetate was incorporated in the control aphids during de novo synthesis, no labeled lipids are present in the active ingredient-treated peach aphids. Thus no de novo lipid synthesis from acetate has taken place.
  • Figure 1c shows again schematically how much acetate was present in the presence of an ACCase inhibitor (0.01 ppm to 100 ppm) in the de novo synthesis compared to the control without ACCase inhibitor. It can clearly be seen that de novo lipid biosynthesis comes to a standstill as the concentration of the inhibitor increases.
  • N-Hexane diethyl ether: glacial acetic acid (60: 45: 1) was used as the eluent for TLC chromatography.
  • Lanes 1-3 are recognizable from the blackening of those lipids into which radioactively labeled acetate was incorporated in the control aphids during the de novo synthesis, no labeled lipids are present in the active ingredient-treated peach aphids.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Polypeptide aus Insekten mit der biologischen Aktivität von Acetyl-CoA Carboxylasen kodieren, die davon kodierten Polypeptide und deren Verwendung zum Identifizieren von neuen, insektizid wirksamen Verbindungen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Auffinden von Modulatoren dieser Polypeptide sowie die Verwendung dieser Verbindungen als Inhibitoren der ACCase aus Insekten.

Description

Nerwendung von Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von insektizid wirksamen Verbindungen
Die Erfindung betrifft die Nerwendung von Polypeptiden und Enzympräparationen mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von neuen, insektizid wirksamen Verbindungen, sowie Verfahren zum Auffinden von Modulatoren dieser Polypeptide.
Die Acetyl-CoA Carboxylase (EC 6.4.1.2), im Folgenden als ACCase bezeichnet, katalysiert die Biotin-abhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA und stellt den
Schrittmacher der de novo Fettsäurebiosynthese dar. Die ACCase besitzt drei Domänen: Biotin-Carboxyl-Carrier (BCC), Biotin-Carboxylase (BCase) und Carboxyltransferase (CTase). Die durch die ACCase katalysierte Reaktion kann in zwei Schritte unterteilt werden. In einem ersten Schritt wird unter ATP-Spaltung durch die BCase- Aktivität eine CO2-Gruppe aus Bicarbonat auf ein kovalent an den
BCC gebundenes Biotin übertragen. Im nächsten Schritt wird die so aktivierte Carboxylgruppe durch die CTase auf Acetyl-CoA übertragen und damit Malonyl- CoA gebildet (Knowles JR, 1989). Es gibt zwei physiologisch verschiedene ACCase Formen. Bei der heteromeren Form, die in Bakterien und den Chloroplasten von Pflanzen vorkommt, werden die drei Domänen durch drei separate, dissoziierbare
Proteine gebildet. Die homomere ACCase besteht aus einer Polypeptidkette, welche alle drei Domänen enthält und im Cytosol von Pflanzen, Tieren und Pilzen zu finden ist (Ke J et al., 2000). Bei Pflanzen und Vertebraten wird die ACCase durch zahlreiche Mechanismen, z.B. allosterisch durch Citrat, Palmitoyl-CoA, durch Phosphorylierung / Dephosphorylierung, durch Proteinkinasen sowie auf der Ebene der Genexpression reguliert (Munday MR & Hemingway CJ 1999; Ke J et al. 2000). Über die Regulation des Enzyms aus Insekten liegen keine Informationen vor.
Zahlreiche Gene von ACCasen aus Pflanzen, Pilzen und Vertebraten wurden bereits kloniert (z.B. Abu-Elheiga L et al. 1994; Bailey A et al. 1995; Goffeau A et al. 1996;
ACCase aus Arabidopsis thaliana Genbank AAF 18638546) oder zum Patent angemeldet (z.B. Haselkorn R & Gornicki P 1999; Somers DA 1999; Jenkins AR et al. 1992). Eine annotierte, also der ACCase zugeordnete Sequenz aus Insekten liegt jedoch noch nicht vor.
Aus einer großen Zahl biochemischen Arbeiten an Pflanzen und Pilzen sind
Inhibitoren der ACCase aus Pflanzen und Pilzen als Herbizide bzw. Fungizide bekannt (Vahlensieck HF et al. 1994; Gronwald JW 1994). Ein weiteres Dokument beschreibt die als ACCase-Hemmer bekannten Fungizide Soraphen A und B zur Bekämpfung von Milben, die nicht zur Ordnung der Insekten gehören (Sutter M. et al., 1991).
Die Wirkung von Hemmern der humanen ACCase auf Insekten wurde in einer Veröffentlichung untersucht (Pophain, HJR et al. (1996): Effect of a hypolipidemic agent on the growth and development of the southwestern com borer, Diatraea grandiosella. Comp. Biochem. Physiol., C: Pharmacol., Toxicol. Endocrinol. (1996),
115 (3), 247-249), allerdings werden hier in erster Linie physiologische Fragen beleuchtet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, die ACCase aus Insekten verfügbar zu machen, deren Eignung als Wirkort für Insektizide zu prüfen, und
Verfahren zur Verfügung zu stellen, um insektizide Wirkstoffe zu identifizieren.
In der vorliegenden Erfindung wurden nun aus verschiedenen Larvenstadien oder Adulten der Pfirsichblattlaus Myzus persicae durch Homogeniserung in geeigneten Puffern Rohextrakte gewonnen. Diese Rohextrakte wurden vorgereinigt und die
ACCase Aktivität in einem radioaktiven Enzymtest bestimmt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte nun erstmalig gezeigt werden, dass
Verbindungen existieren, die im Enzymtest die Aktivität der ACCase aus Insekten z. B. aus Myzus persicae, hemmen. Der Befund, dass bestimmte Verbindungen die ACCase hemmen, zeigt, dass die ACCase der rnteraktionspartner (das Target) dieser Wirkstoffe ist und ein Zielprotein insektizid wirksamer Verbindungen darstellt.
In der vorliegenden Erfindung wird weiter gezeigt, dass insbesondere cyclische 1,3- Dicarbonylverbindungen sowie deren Enole der Formel (I)
woπn
Ar für substituiertes Aryl oder Hetaryl mit mindestens einem ortho-Substituenten steht,
R für H oder für Acylreste steht, bevorzugt für die Reste COR1 und CO2R1 worin
R1 für gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Phenyl oder Hetaryl steht, und
A mit den verknüpften C-Atomen einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6- gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bildet, wobei als Heteroatome beispiels- weise N, O und/oder S in Frage kommen,
Inhibitoren der ACCase darstellen. Solche cyclische 1,3-Dicarbonylverbindungen sind aus den folgenden Dokumenten bekannt, die explizit Teil dieser Anmeldung sein sollen:
EP-A-355 599, EP-A-377 893, EP-A-415 211, EP-A-442 077, EP-A-442 073, EP-A- 497 127, EP-A-501 129, EP-A-615 950, EP-A-521 334, EP-A-596 298, EP-A-613 884, EP-A-613 885, EP-A-706 527, EP-A-643 159, EP-A-741700, EP-A-668 267, EP-A-754 175, EP-A-792 272, EP-A-809 629, EP-A-825 982, EP-A-835 243, EP-A- 837 847, EP-A-891 330, EP-A-912 547, EP-A-915 846, EP-A-918 775, EP-A-944 633, EP-A-1 017 674, EP-A-1 028 963, EP-A-1 056 717, WO-A-99/48869, WO-A- 99/55673, EP-A-528 156, EP-A-647 637, EP-A-792 272, EP-A-799 228, EP-A-944 633, EP-A-1 017 674, EP-A-588 137, EP-A-799 228, EP-A-751 942, EP-A-588 137,
EP-A-879 232, EP-A-865 438, WO-A-00/15632, WO-A-00/21946, WO-A- 00/24729, EP-A-675 882, EP-A-769 001, EP-A-987 246, EP-A-773 920, EP-A-854 852, EP-A-966 420, EP-A-508 126.
Damit wird in der vorliegenden Anmeldung gezeigt, dass die genannten cyclischen
1,3-Dicarbonylverbindungen als Inhibitoren der ACCase in Insekten verwendet werden können. Die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) als Inhibitoren der ACCase in Insekten ist auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In der vorliegenden Erfindung wird weiter gezeigt, dass die Hemmung der ACCase zum Absterben von behandelten Insekten führt. Bislang war nicht bekannt, dass die ACCase in Insekten ein Zielprotein insektizid wirksamer Substanzen ist. Damit wird hier auch zum ersten Mal gezeigt, dass die ACCase ein für Insekten lebenswichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Maße dazu geeignet ist, als Zielprotein für die Suche nach weiteren und möglicherweise verbesserten insektiziden
Wirkstoffen verwendet zu werden.
In der vorliegenden Erfindung wird weiterhin zum ersten Mal die ACCase aus Drosophila melanogaster anhand ihrer Nukleinsäuresequenz beschrieben und damit zugänglich gemacht. Die Nukleinsäuresequenz der Accession Number AAF59156 ist bereits seit geraumer Zeit zugänglich. Die Bedeutung der Sequenz bzw. das davon kodierte Polypeptid und dessen biologische Funktion waren jedoch bislang unbekannt, ebenso wie kodierende Region dieses Sequenzabschnitts.
Bedeutung, Funktion und die kodierende Region sowie das von dieser Nukleinsäure kodierte Polypeptid werden nun im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals zugänglich gemacht. So wird die für die ACCase aus Drosophila melanogaster kodierende cDNA gemäß SEQ ID NO:l und das davon kodierte Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 in der vorliegenden Anmeldung angegeben sowie deren Verwendung zum Identifizieren von insektizid und gegebenenfalls auch akarizid wirksamen Substanzen beschrieben. Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l und das davon kodierte Polypeptid gemäß SEQ ID NO:2 sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Da die ACCasen, im Besonderen auch die hier vorliegende ACCase aus Myzus persicae sowie Drosophila melanogaster und anderen Insekten beträchtliche
Homolgien zueinander aufweisen, können auch homologe Polypeptide, die von entsprechenden homologen Nukleinsäuren kodiert werden, sowie weitere Mitglieder der Genfamilie als molekulare Interaktionspartner (Targets) insektizider Wirkstoffe, insbesondere der Verbindungen der Formel (I), verwendet werden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den homologen Polypeptiden um solche, die zur
ACCase aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster eine Identität von 60%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90% und besonders bevorzugt 95% über eine
Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über die Gesamtlänge aufweisen.
Insektizide und/oder akarizide Wirkstoffe, die gegebenenfalls mit Hilfe der erfindungsgemäßen ACCasen gefunden werden können, können demnach auch mit ACCasen aus zahlreichen anderen Akarina- oder Insektenspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in den Insekten oder Akarina vorkommenden ACCasen nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen Substanzen. Besonders bevorzugte ACCasen bzw. Herkunftsorganismen sind beispielhaft und nicht abschließend in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt:
Tabelle 1
In der vorliegenden Anmeldung wird zum ersten Mal am Beispiel der ACCase aus der Pfirsichblattlaus Myzus persicae gezeigt, dass ACCasen Zielproteine (Targets) für insektizide Wirkstoffe sind und zur Identifizierung neuer, verbesserter insektizider Wirkstoffe in dafür geeigneten Verfahren (Assays) eingesetzt werden können.
Besonders sind dabei die ACCase aus Myzus persicae und Drosophila melanogaster zur Identifizierung neuer insektizider und gegebenenfalls auch akarizider Wirkstoffe geeignet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Verwendung von Poly- peptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer ACCase sowie diese kodierende Nukleinsäuren zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase in
Insekten und/oder Akarina, insbesondere von solchen Polypeptiden, die direkt aus
Insekten isoliert wurden oder die von aus Insekten stammenden Nukleinsäure- sequenzen oder Fragmenten davon kodiert und durch in vivo oder in vitro Verfahren gewonnen werden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Polypeptiden um solche, die zur ACCase aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster eine
Identität von 60%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90% und besonders bevorzugt von 95% über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens
25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über die Gesamtlänge aufweisen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist besonders die Verwendung der ACCase aus Insekten der Familie der Aphididae und der Dipteren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist besonders die Verwendung der ACCase aus Myzus persicae und der ACCase aus Drosophila melanogaster gemäß SEQ ID
NO: 2 sowie dazu homologer Polypeptide zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase aus Insekten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist im Besonderen die Verwendung der ACCase aus Myzus persicae zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase aus
Insekten.
Ganz besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide damit eine Sequenz ausgewählt aus
a) der Sequenz isoliert aus Mycus persicae,
b) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2,
c) der Sequenz kodiert von der Nukleinsäure gemäß Accession Number
^AAF59156,
d) Teilsequenzen der unter a) bis c) genannten Sequenzen, die noch die biologische Aktivität einer ACCase besitzen,
e) Sequenzen, welche eine zumindest 60 %ige, bevorzugt eine 80 %ige, besonders bevorzugt eine 90 %ige und ganz besonders bevorzugt eine 95% Identität mit den unter a) bis d) genannten Sequenzen aufweisen. Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 10.0 unter Standardeinstellungen (Devereux et al. 1984).
Gegenstand der vorliegenden Verwendung ist ebenfalls die Verwendung von für
ACCasen kodierend Nukleinsäuren aus Insekten zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase in Insekten und/oder Akarina.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere auch die Verwendung der für die ACCase aus Myzus persicae kodierenden Nukleinsäure sowie der für die
ACCase aus Drosophila melanogaster kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase, sowie dazu zu 60%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und besonders bevorzugt zu 95% homologer Nukleinsäuresequenzen.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausfuhrungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.
Der Aμsdruck "cDNA" wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine einzel- oder doppelsträngige Kopie eines RNA-Moleküls und ist deshalb als Kopie einer biologisch aktiven RNA intronfrei, d. h. alle kodierenden Regionen eines Gens sind in zusammenhängender Form enthalten.
Der Begriff "Identität", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Zahl von Sequenzpositionen die in einem Alignment identisch sind. Sie wird meist in Prozent der Alignment Länge angegeben.
Der Begriff "Prozent (%) Identität", wie er hierin in Bezug auf eine bestimmte
Sequenz oder einen bestimmten Teil dieser Sequenz verwendet wird, ist definiert als der Prozentanteil von Nukleotiden im untersuchten Nukleinsäuremolekül, der mit den Nukleotiden der genannten bestimmten Sequenz oder eines bestimmten Teils dieser Sequenz identisch ist, wenn man die Sequenzen miteinander vergleicht ("Alignment") und wenn nötig so genannte "Gaps" einführt, um den maximalen Prozentsatz an identischen Sequenzen zu erhalten, wobei alle Parameter des verwendeten Programms auf "default" gesetzt sind.
Der Begriff "Ähnlichkeit", wie er hierin verwendet wird, setzt dagegen die Definition einer Ähnlichkeitsmetrik voraus, also eines Maßes dafür, als wie ähnlich man beispielsweise ein Valin zu einem Threonin oder zu einem Leucin annehmen möchte.
Der Begriff „Prozent (%) Ähnlichkeit", wie er hierin verwendet wird, entspricht dem vorstehend beschriebenen Begriff „Prozent (%) Identität", wobei hier für die Berechnung der %-Zahl die konservativen Aminosäuresubstitutionen zusätzlich zu den identischen Aminosäuren mit einbezogen werden.
Der Begriff "Homologie", wie er hierin verwendet wird, bedeutet wiederum evolutionäre Verwandtschaft. Zwei homologe Proteine haben sich aus einer gemeinsamen Vorläufersequenz entwickelt. Der Begriff hat nicht unbedingt etwas mit Identität oder Ähnlichkeit zu zun, abgesehen davon, dass homologe Sequenzen meist ähnlicher sind (oder in einem Alignment mehr identische Positionen besitzen) als nicht-homologe Sequenzen.
Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA oder DNA-Fragmente, die genomischer DNA aus Insekten entsprechen, wobei die
Nukleinsäuren bevorzugt aus Dipteren, besonders bevorzugt aus Drosophilidae stammen.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA oder DNA-Fragmente, die genomischer DNA von Myzus persicae oder
Drosophila melanogaster entsprechen. Ganz besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz ausgewählt aus
a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
b) der Sequenz gemäß Accession Number AAF59156,
c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter a) oder b) de- fmierten S equenzen,
d) Sequenzen, welche bei einer Hybridisierungstemperatur von 37°C bis 50°C an die unter a) oder b) definierten Sequenzen hybridisieren,
e) Sequenzen, welche eine zumindest 60 %ige, bevorzugt eine 80 %ige, besonders bevorzugt eine 90 %ige und ganz besonders eine 95%ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen,
f) Sequenzen, welche zu den unter a) bis e) definierten Sequenzen komple- mentär sind, und
g) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz codieren wie die unter a) bis e) definierten Sequenzen.
Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuren stellt ein cDNA-Molekül mit der für ACCase aus Myzus persicae kodierenden Sequenz sowie der für ACCase aus Drosophila melanogaster kodierenden Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 dar. Die für die ACCase aus Myzus persicae kodierende Nukleinsäuresequenz kann auf Basis des genetischen Codes von der Aminosäuresequenz abgeleitet werden, die wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert und durch Sequenzierung definiert werden kann.
Auf Grund der Degenerierheit des genetischen Codes ist es wichtig, die abgeleitete
Nukleinsäuresequenz zu nutzen, um die tatsächlich in Myzus persicae vorliegende Nukleinsäuresequenz zu überprüfen und gegebenenfalls die abgeleitete Sequenz zu korrigieren, soweit dies sinnvoll erscheint.
Die Isolierung bzw. Überprüfung der genomischen M. persicae Sequenz kann z.B. durch die Verwendung von aus der abgeleiteten Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Primern erfolgen, die in PCR-Reaktionen zur Amplifikation der Zielsequenz nach dem Fachmann bekannten Methoden genutzt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden.
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin genannten oder ableitbaren Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Insekten als Drosophila melanogaster isoliert werden, welche für ACCasen kodieren, welche dieselben oder ähnliche Eigenschaften einer der erfindungsgemäßen ACCasen aufweisen.
Hybridisierungsbedingungen werden nach folgender Formel näherungsweise berechnet:
Schmelztemperatur Tm = 81,5°C + 16,6 (log[c(Na+)]) + 0,41 (% G + C) - 500/n (Lottspeich & Zorbas 1998). Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenzabschnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz >100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionenstärke von 15 mM Na+ (entspricht 0.1 x SSC) gewaschen. Wird eine RNA- Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15°C höher.
Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben:
Hybridisierungslösung: DIG Easy Hyb (Röche, ZZ) Hybridisierungstemperatur: 37°C bis 50°C, bevorzugt 42°C (DNA-DNA), 50°C (DNA-RNA).
1. Waschschritt: 2x SSC, 0,1 % SDS 2x5 min bei Raumtemperatur;
2. Waschschritt: lx SSC, 0,1 % SDS 2x 15 min bei 50°C; bevorzugt 0,5x SSC, 0,1 % SDS 2x 15 min bei 65°C; besonders bevorzugt 0,2x SSC, 2x15min bei 68°C.
Der Grad der Identität der Nukleinsäuren wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms NCBI BLASTN Version 2.0.4. (Altschul et al. 1997).
Der Ausdruck "regulatorische Regionen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf nicht-translatierte Regionen des betreffenden Gens, wie Promotoren, Enhancer, Repressor- oder Aktivator-Bindungsstellen oder Terminationssequenzen, die mit zellulären Proteinen interagieren, wodurch die Transkription gesteuert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls DNA Konstrukte, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure und einen heterologen Promotor umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Verwendung solcher DNA- Konstrukten zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase. Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System, die Haupt- Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd- Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase, der Promotor der Sauren
Phosphatase, der Baculovirus immediate early Promoter und der Promotor des α- Mating-Faktors der Hefe.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide, Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung von Vektoren, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure, oder ein erfindungsgemäß zu verwendendes DNA-Konstrukt enthalten, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase.
Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche
Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch Wirtszellen, die eine erfindungs- gemäß zu verwendende Nukleinsäure, ein erfindungsgemäß zu verwendendes DNA-
Konstrukt oder einen erfindungsgemäß zu verwendenden Vektor enthalten. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung solcher Wirtszellen zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase.
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuren nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Hefen, Säuger-, Amphibien-, Insekten- oder Pflanzenzellen. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind HEK-293-, Schneider S2-, Spodoptera Sf9-, Kc-, CHO-, COS1-, COS7-, HeLa-, C127-, 3T3- oder BHK-Zellen und insbesondere Xenopus-Oocyten.
Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natür- liehe Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren,^ die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit
Flavinen, Häm- Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid- Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, De- methylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Gly- cosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezeraierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine ein- fache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen. Die erfindungsgemäßen Proteine können ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können.
Der Begriff "vollständige ACCase" wie er hierin verwendet wird, beschreibt eine
ACCase, die kodiert wird von einer vollständigen kodierenden Region einer Transkriptionseinheit beginnend mit dem ATG-Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für die ACCase kodierenden Gens, sowie für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.
Der Ausdruck "Gen" wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, die für die Synthese einer Polypeptidkette verantwortlich ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide müssen nicht vollständige ACCasen darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest die biologische Aktivität der vollständigen ACCase aufweisen. Polypeptide aus Insekten, die eine gleichartige biologische Aktivität wie eine ACCase aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet.
Dabei müssen die erfindungsgemäßen Polypeptide den ACCasen aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster hinsichtlich ihrer Sequenz oder katalytischen Aktivität nicht völlig entsprechen. Als erfindungsgemäße Polypeptide werden auch Polypeptide betrachtet, die zur ACCase beispielsweise der folgenden Insekten oder zu Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität der ACCase ausüben können, homolog sind: Aus der Ordnung der Isopoda z.B. Oniscus asellus, Armadillidium vulgäre, Porcellio scaber.
Aus der Ordnung der Diplopoda z.B. Blaniulus guttulatus.
Aus der Ordnung der Chilopoda z.B. Geophilus carpophagus, Scutigera spp..
Aus der Ordnung der Symphyla z.B. Scutigerella Immaculata.
Aus der Ordnung der Thysanura z.B. Lepisma saccharina.
Aus der Ordnung der Collembola z.B. Onychiurus armatus.
Aus der Ordnung der Orthoptera z.B. Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratorioides, Melanoplus spp., Schistocerca gregaria.
Aus der Ordnung der Blattaria z.B. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Leucophaea maderae, Blattella germanica.
Aus der Ordnung der Dermaptera z.B. Forflcula auricularia.
Aus der Ordnung der Isoptera z.B. Reticulitermes spp..
Aus der Ordnung der Phthiraptera z.B. Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp., Trichodectes spp., Damalinia spp..
Aus der Ordnung der Thysanoptera z.B. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci, Thrips palmi, Frankliniella accidentalis. Aus der Ordnung der Heteroptera z.B. Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.
Aus der Ordnung der Homoptera z.B. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Aphis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Macrosiphum avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidieϊla aurantii, Aspidiotus heder ae, Pseudococcus spp., Psylla spp.
Aus der Ordnung der Lepidoptera z.B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Lithocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp., Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp.,
Earias insulana, Heliothis spp., Mamestra brassicae, Panolis flammea, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana, Cnaphalocerus spp., Oulema oryzae.
Aus der Ordnung der Coleoptera z.B. Anobium punctatum, Rhizopertha dominica, Bruchidius obtectus, Acanthoscelides obtectus, Hylotrupes hajulus, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gϊbbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica, Lissorhoptrus oryzophϊlus.
Aus der Ordnung der Hymenoptera z.B. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Nespa spp.
Aus der Ordnung der Diptera z.B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., Bibio hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pegomyia hyoscyami, Ceratitis capitata, Dacus oleae, Tipula paludosa, Hylemyia spp., Liriomyza spp..
Aus der Ordnung der Siphonaptera z.B. Xenopsylla cheopis, Ceratophyllus spp..
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Nergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommenden ACCasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen ACCasen ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly; 2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb ebenfalls Polypeptide, welche zumindest die biologische Aktivität einer ACCase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 60 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige, besonders bevorzugt 90 %ige Identität und ganz besonders bevorzugt eine 95% ige Identität mit der Sequenz aus Myzus persiace oder der von der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 kodierten Sequenz aus Drosophila melanogaster aufweisen, sowie deren Verwendung zur Identifizierung von Modulatoren der ACCase.
Der Ausdruck "biologische Aktivität einer ACCase", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit, die Biotin-abhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA zu katalysieren. Davon können alle drei Enzymfunktionen, d.h. die ATP-abhängige Abspaltung einer CO2-Gruppe aus Bicarbonat, die Biotin-Carrier-Funktion sowie die Carboxylierung von Acetyl-CoA, aber auch nur eine oder zwei dieser Reaktionen umfasst sein.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch kurze Stücke der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können auch verwendet werden, um ausgehend von Insekten-mRNA hergestellte cDNA- Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA-Fragmente ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungs- gemäßen Nukleinsäuren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch mittels PCR- Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.
Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA-
Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere des von der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 kodierten Polypeptids, können außerdem
Wirtszellen, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in vitro -Systemen hergestellt werden. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen ACCase aus Myzus persicae werden z.B. Larven oder Adulte im Mörser homogenisiert. Hierzu können sie vorher z.B. in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden. Das Homogenat wird in einem geeigneten Puffer aufgenommen. Ein Beispiel für die Herstellung eines erfindungs- gemäßen Polypeptids ist unter Beispiel 3 angegeben.
Ein mögliches Reinigungsverfahren der ACCase basiert auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasenoder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionen- austausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie.
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutatbion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkem zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer
Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie.
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10- fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, die an die ACCase binden und/oder deren Eigenschaften verändern. Aufgrund der wichtigen Funktion der ACCase stellen Modulatoren, die die Aktivität beeinflussen, neue insektizide und/oder gegebenenfalls akarizide Wirkstoffe dar. Modulatoren können Agonisten oder Antagonisten bzw. Inhibitoren oder Aktivatoren sein.
Auf Grund der Eigenschaft, als Inhibitoren der ACCase aus Insekten zu wirken, können die genannten cyclischen 1,3-Dicarbonylverbindungen der Formel (I) sowie ihre Enole auch als gegebenenfalls markierte Kompetitoren in Verfahren zum Auffinden von Inhibitoren der ACCase aus Insekten verwendet werden, die nicht dieser Gruppe von Verbindungen angehören müssen.
Der Ausdruck "Kompetitor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigenschaft der Verbindungen, mit anderen, gegebenenfalls noch zu identifizierenden Verbindungen um die Bindung an der ACCase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser verdrängt zu werden.
Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Aktivität der ACCase beschleunigt oder verstärkt.
Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein
Molekül, das die Aktivität der ACCase verlangsamt oder verhindert. Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden und/oder deren Eigenschaften, z.B. deren enzymatische Aktivität, verändern.
Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und/oder deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktioneile Mimetika davon.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.
hn Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte erstmals gezeigt werden, dass
Verbindungen bzw. Modulatoren, die an der ACCase wirken, die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern können, die zum Absterben der damit behandelten Insekten fuhrt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch Modulatoren von
ACCasen aus Insekten, die mit Hilfe eines der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahrens zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase gefunden werden.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, welche die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verändern. Auch solche "Expressionsmodulatoren" können neue insektizide Wirkstoffe darstellen. Expressionsmodulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die regulatorischen Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden Nukleinsäuren binden. Weiterhin können Expressionsmodulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an regulatorische Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden Nukleinsäuren bindet, und dadurch deren Expression beeinflusst. Expressionsmodulatoren können auch Antisense-Moleküle sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide oder von Expressionsmodulatoren als Insektizide oder Akarazide.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Expressionsmodulatoren von
ACCasen, die mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens zum Auffinden von Expressionsmodulatoren gefunden werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screening (high throughput screening; HTS) und Ultra-Hochdurchsatz-Screening (UHTS) ein. Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Präparationen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.
Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z.B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgendeine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zusammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des
Kandidatenmoleküls, die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu erhöhen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder verringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder verringerten Umsetzung des markierten Substrates. Moleküle, die gut binden und zu einer erhöhten Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide führen, sind Agonisten. Moleküle, die gut binden, und die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide hemmen, sind gute Antagonisten. Es kann sich dabei auch um Hemmstoffe der oben genannten insektiziden Stoff klasse handeln, jedoch können auch völlige neue Stoffklassen diese modulatorische Aktivität aufweisen.
Modulatoren, die die Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder die
Expression erfindungsgemäßer ACCase kodierender mRNA und/oder Polypeptide um mindestens 10 %, mindestens 20 %, mindestens 30 %, mindestens 40 %, mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 % oder mindestens 95 % reduzieren, sind geeignet, um als Insektizide verwendet zu werden, oder zu solchen weiterentwickelt zu werden. Solche Kandidatenmoleküle werden dann in weiteren Tests auf Toxizität gegenüber Vertebratenspezies, wie z.B. Säuger und auf ihre Bioverfügbarkeit hin überprüft.
Die Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch ein so genanntes Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme in dieser
Hinsicht umfassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch oder radioaktiv markierte Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Aktivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.
Die Aktivität vieler, z. B. membranständiger Proteine kann auf eine weitere Weise vorteilhaft gemessen werden. Die funktionelle heterologe Expression solcher Proteine in E. coli ist oft schwierig oder unmöglich. In diesem Fall kann durch geeignete Klonierung (z.B. unter Nutzung geeigneter PCR Strategien) der katalytisch aktive Teil des Proteins abgetrennt werden, so dass das Genprodukt ein (besser) lösliches Protein darstellt und leicht gereinigt werden kann. Zur Messung der Aktivität löslicher Proteine steht ein breites Repertoire von Meßmöglichkeiten zur Verfügung. Eine besonders empfindliche Messung kann z.B. unter Einsatz eines fluoreszenzmarkierten Liganden oder Substrates mittels Fluoreszenzpolarisation er- folgen. Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder
Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Ein Beispiel dafür sind die vorstehend genannten Verbindungen der Formel (I). Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z.B. radioaktiv oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann.
Auf diese Weise lässt sich die Effektivität eines Agonisten oder Antagonisten ermessen.
Potentiell insektizide Verbindungen, die in einem der erfindungsgemäßen Verfahren mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren- und/oder Polypetide gefunden werden, können den Insekten auf verschiedenem Wege zugeführt werden, z.B. oral (siehe auch Beispiel 4), topisch oder durch Injektion. Insektizide sind häufig hydrophobe Moleküle und müssen dann gewöhlich in organischen Lösungsmitteln gelöst werden, die auch verdampfen können (z.B. Methanol oder Aceton) oder die in geringen Konzentrationen zugesetzt werden, um die Aufnahme zu erleichtem
(Ethanol, Dimethylsulfoxid).
Der erste Schritt bei Versuchen mit Insekten ist in der Regel die Bestimmung der MLD (minimal lethal dose) nach einer chronischen Exposition der Insekten. Die Verbindungen werden gewöhnlich verdünnt und dem Futter von 0 - 48 h Stunden alten Embryos und Larven zugesetzt. Zusätzlich zur MLD wird so auch der Anteil der Eier bestimmt, aus denen noch Larven schlüpfen, ebenso das Verhalten der Larven (Bewegung, Futteraufhahme), die Anzahl der sich noch verpuppenden Larven und der daraus hervorgehenden Adulten. Die Larven können weiterhin auf morphologische Defekte untersucht werden. Nach Bestimmung der MLD können die akute und chronische Dosis bestimmt werden. In einem typischen akuten Test werden die Verbindungen der Nahrung von Embryos, Larven oder Adulten zugesetzt und die Insekten nach 2 Stunden und nach einer Übernachtinkubation überprüft. Bei Embryos wird die Zahl der Embroyos bestimmt, die Defekte in der Entwicklung aufweisen und der Anteil bestimmt, der bis zum
Erwachsenenstadium überlebt.
Bei Larven werden z.B. Verhaltensstörungen, Stömngen bei Bewegungsabläufen oder der Häutung geprüft. Bei erwachsenen Tieren werden Defekte bei der Menge oder der Aktivität von Enzymen sowie Verhaltens- und/oder Fertilitätsstörungen beobachtet.
Für Tests zur Bestimmung der chronischen Toxität werden die Adulten z.B. für 48 Stunden in Schalen gesetzt, die die betreffende Verbindung enthalten, dann in einem sauberen Behälter transferiert und die Fruchtbarkeit der Tiere bzw. die Menge der Aktivität eines bestimmten Enzyms oder das Absterben der Insekten beobachtet.
Die folgenden Beispiele zeigen, dass die ACCase überraschenderweise ein essentielles Enzym in Insekten ist, und zeigen außerdem, dass das Enzym ein geeignetes Zielprotein für die Identifizierung von Insektiziden ist, in Verfahren zum
Identifizieren von insektizid wirksamen Verbindungen verwendet werden kann und dass die in entsprechenden Verfahren identifizierten Modulatoren der ACCase als Insektizide verwendet werden können. Um die Verwendung der ACCase zu ermöglichen, wird beispielhaft die Gewinnung dieses Enzyms aus Myzus persicae beschrieben und schließlich die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung für die
Suche nach insektizid wirksamen Verbindungen demonstriert. Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer ACCase Enyzympräparation aus Myzus persicae
Larven oder Adulte von Myzus persicae werden gewogen und mit der dreifachen
Menge an Extraktionspuffer im Mörser homgenisiert. Anschließend wird der Extrakt zweimal je 10 min mit 10 000 g zentrifiigiert. Der Überstand enthält die ACCase und wird für den Enzymtest zum Identifizieren von Inhibitoren verwendet.
Als Extrationspuffer wird bevorzugt der folgende Puffer verwendet: 0,25 M Sucrose,
15 mM Tris/HCl pH 7,4, 4 mM EDTA, 10 mM Kaliumeitrat (alle Chemikalien von Sigma, St. Louis).
Beispiel 2: Verfahren zum Auffinden von Modulatoren
Die ACCase Enzympräparation wurde zur Auffindung von Modulatoren der ACCase in einem biochemischen Test wie folgt verwendet: Zunächst wurde ein Aliquot der Enzympräparation aus Beispiel 1 mit dem Reaktionspuffer und dem radioaktiv markierten Substrat gemischt und inkubiert. Zum Nachweis des Einbaus von CO2 wurde rauchende HC1 zupipettiert, ein Aliquot des Reaktionsansatzes auf Watman-
Filterpäpier aufgetropft und getrocknet. Das getrocknete Filterpapier wurde mit Szintillationsflüssigkeit in Szintillationsröhrchen überführt. Die Messung erfolgte in einem Szintillationszähler (Beckman Instruments, Fullerton, USA). Zum Screening auf Modulatoren wurden die zu testenden Verbindungen in DMSO gelöst und vor dem ersten Inkubationsschritt zusammen mit der Enzympräparation zum Reaktionsansatz hinzugegeben. Die Wirkung der Modulatoren wurde im Vergleich zur ACCase Aktivität in einem Reaktionsansatz mit Lösungsmittel aber ohne Modulator bestimmt. Abbildung 2a zeigt die Hemmung der ACCase aus Myzus persicae bei unterschiedlichen Wirkstoff-Konzentrationen. Abbildung 2b zeigt die Hemmung der Myzus persicae ACCase durch unterschiedliche Wirkstoffe. Als Reaktionspuffer wurde 50 mM Tris/HCl pH 7,4, 15 mM MgCl2, 2,5 mM ATP, 1 μg/μl Rinderserumalbumin, 10 mM Kaliumeitrat, 84 mM Natriumbicarbonat (alles von Sigma, St. Louis) verwendet.
Als radioaktiv markiertes Substrat wurde 4 mM 14C Natriumbicarbonat verwendet.
Beispiel 3:
Messung der ACCase- Aktivität zum Auffinden von Inhibitoren der ACCase
Einen Teilschritt der durch ACCase katalysierten Reaktion stellt die Fixierung der Carbonatgruppe an den Co-Faktor Biotin dar. Diese Fixierung geschieht unter ATP-
Spaltung: ACCase-Biotin + HCO3 " + ATP - ACCase-Biotin-CO2 " + ADP + P;. Für die Bestimmung der ACCase-Aktivität wird das freiwerdende Phosphat mit dem kommerziell erhältlichen Malachitgrün-Reagenz nachgewiesen. Da es sich somit um einen generellen (unspezifischen) Phosphatnachweis handelt, müssen alle ver- wendeten Materialien und Reagenzien frei von Phosphat sein. Die ACCase muß für die Nachweisreaktion von anderen ATP-spaltenden Enzymen abgetrennt werden.
(a) Präparation der ACCase
Ganze Insekten oder aus diesen gewonnene Gewebe/Organe werden im
Homogenisationspuffer (250 mM Sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM EDTA, 10 mM NaCitrat, Proteinaseinhibitoren-Mix (SIGMA P-8340)) zerkleinert (z.B. durch Zermörsern oder mittels eines Homogenisierstabs). Das homogenisierte Material wird dann zur Klärung abzentrifugiert. Der Überstand, der die ACCase enthält, wird danach mittels einer 4 PD-10 Säule (Pharmacia Corporation, Peapack,
New Jersey, USA) mit dem Laufpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.02% NaN3, 10% Glycerol) für die weiteren Schritte umgepuffert. Dann folgt eine Auftrennung des Rohextraktes über eine Sephacryl 26/60 S-300 Säule (Pharmacia Corporation, Peapack, New Jersey, USA) mittels FPLC (Pharmacia Corporation, Peapack, New Jersey, USA). Die gewonnenen
Fraktionen werden wie unter (b) beschrieben auf ihre ACCase-Aktivität hin getestet. Die Fraktionen mit den höchsten spezifischen ACCase- Aktivitäten werden vereinigt und stellen das Ausgangsmaterial für die unter (c) beschriebenen Inhibitor- Messungen dar (im folgenden als ACCase-Lösung bezeichnet).
(b) Aktivitätstest
Ein Aliquot der unter (a) beschriebenen ACCase-Lösung wird mit dem Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 20 mM MgCl2, lmg/ml Rinderserumalbumin, 20 mM NaCitrat, 5 mM NaHCO3, 1 mM ATP, 200μM Acetyl-CoA) vermischt und bei physiologischen Temperaturen (24°C bis 37°C) inkubiert. Nach Ablauf der gewünschten Reaktionszeit werden 2 Vol des Färbereagenzes (BiomolGreen (Biomol Research Laboratories Inc., Plymouth Meeting, PA, USA), angesetzt wie vom Hersteller beschrieben) hinzugefügt und wie vom Hersteller beschrieben bis zur Ausprägung der Nachweisreaktion weiter inkubiert. Zur Bestimmung der unspezi- fischen Hintergrundaktivität werden Reaktionsansätze bei Abwesenheit des Substrates Acetyl-CoA mitgemessen und bei der Berechnung der spezifischen ACCase- Aktivität entsprechend abgezogen.
(c) Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der ACCase
Zur Bestimmung der Hemmung der ACCase durch Testsubstanzen werden Aliquots der ACCase-Lösung aus(a) mit dem Reaktionspuffer und den zu testenden Inhibitoren vermischt und bei physiologischen Temperaturen (24°C bis 37°C) inkubiert. Nach der gewünschten Reaktionszeit erfolgt die Nachweisreaktion wie unter (b) beschrieben. Eine Kontrollmessung ohne Zugabe von Inhibitor wird parallel durchgeführt. Die Hemmung der ACCase berechnet sich dann im Vergleich zu dieser Kontrolle.
Bezugsquellen: alle Chemikalien, wenn nicht besonders aufgeführt, sind von Sigma- Aldrich Co., St. Louis, USA. Beispiel 4: Beeinträchtigung der Lipidneogenese durch Inhibitoren der ACCase
Larven oder Adulte der Pfirsichblattlaus Myzus persicae wurden durch die Sachet- Methode (Nauen et al. 1996) für zwei Tage mit Nährlösungen mit und ohne einen der identifizierten Inhibitoren der ACCase gefüttert.
Beispielhaft wurde in diesem Versuch die Verbindung der nachfolgenden Formel
(I-A)
verwendet, die als 4-hydroxy-8-methoxy-3-(2,3,4,6-tetramethylphenyl)-l-azaspiro-
[4,5]dec-32-en-2-one bezeichnet werden kann.
Danach wurden die Tiere abgesammelt und mittels eines Mörsers in organischem Lösungsmittel homogenisiert. Durch mehrfaches Ausschütteln mit wässeriger Lösung wurde die organische Phase von wasserlöslichen Bestandteilen gereinigt und dann das Lösungsmittel abgedampft. Das verbleibende Pellet wurde in wenig Lösungsmittel aufgenommen und mittels Dünnschichtchromatographie (DC) aufgetrennt. Die aufgetrennten Lipide wurden mit Amidoschwarz angefärbt. In Lipide eingebautes 14C Acetat wurde mittels Autoradiographie nach 2-3 Tagen Expositionszeit nachgewiesen. Zur Quantifizierung des 14C Einbaus in Lipide wurden nach der Färbung die entsprechenden Banden ausgekratzt, gelöst und die Aktivität im Szintillationszähler bestimmt. Abbildung la zeigt anhand eines aufgetrennten Lipidextraktes aus der Pfirsichblattlaus Myzus persicae den Lipid- Status nach Acetat-Fütterung ohne (Spuren 1-3) und mit dem Wirkstoff der Formel (I-A) (Spuren 4-6). Es sind keine signifikanten Unterschiede in Lipidkomposition und Lipidgehalt zu erkennen. Abbildung lb zeigt die Autoradiographie der selben DC Platte. Während in den Spuren 1-3 anhand der Schwärzung diejenigen Lipide erkennbar sind, in die in den Kontroll-Blattläusen radioaktiv markiertes Acetat bei der de novo Synthese eingebaut wurde, sind in den Wirkstoff-behandelten Pfirsichblattläusen keine markierten Lipide vorhanden. Somit hat keine de novo Lipid-Synthese aus Acetat stattgefunden. Abbildung lc zeigt schematisch noch einmal, wieviel Acetat bei Anwesenheit eines Inhibitors der ACCase (0.01 ppm bis 100 ppm) noch bei der de novo Synthese im Vergleich zur Kontrolle ohne ACCase- Inhibitor eingebaut wurde. Es ist deutlich zu erkennen, dass bei zunehmender Konzentration des Inhibitors die de novo Lipid-Biosynthese zum Erliegen kommt.
Als Laufmittel für die DC Chromatographie wurde n-Hexan : Diethylether : Eisessig (60 : 45 : 1) verwendet.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung la)
Aufgetrennter Lipidextrakt aus der Pfirsichblattlaus Myzus persicae nach Acetat- Fütterung ohne (Spuren 1-3) und mit einem Inhibitor der ACCase (Spuren 4-6). Die aufgetrennten Lipide wurden mittels Amidoschwarz angefärbt.
Abbildung lb)
Autoradiographie der unter Abbildung la) gezeigten DC Platte. 14C Acetat wurde mittels eines Images nach 2-3 Tagen Expositionszeit nachgewiesen. Während in den
Spuren 1-3 anhand der Schwärzung diejenigen Lipide erkennbar sind, in die in den Kontroll-Blattläusen radioaktiv markiertes Acetat bei der de novo Synthese eingebaut wurde, sind in den Wirkstoff-behandelten Pfirsichblattläusen keine markierten Lipide vorhanden.
Abbildung lc)
Einbau von 14C Acetat bei An- und Abwesenheit von Inhibitoren der ACCase (0.01 ppm bis 100 ppm) bei der de novo Synthese von Lipiden im Vergleich.
Abbildung 2a)
Hemmung der ACCase aus Myzus persicae bei unterschiedlichen Wirkstoff- Konzentrationen. Lsngm = Lösungsmittel (Kontrolle). Vbdg = Verbindung (Wirkstoff).
Abbildung 2b)
Hemmung der Myzus persicae ACCase durch unterschiedliche Wirkstoffe. Verbg = Verbindung. Abbildung 3)
Hemmung der ACCase aus der Pfirsich-Blattlaus Myzus persicae durch zwei unterschiedliche Substanzen A und B. Die Abbildung zeigt die jeweilige ACCase- Aktivität bei unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen im Vergleich zur Kontrolle (Ansatz ohne Inhibitor, nicht gezeigt).
Literatur
Abu-Elheiga L. et al. (1994): Human acetyl-CoA carboxylase: characterization, molecular cloning, and evidence for two isoforms. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92 (9), 4011-4015.
Altschul SF et al. (1997): Gapped BLAST und PSI-BLAST generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
Bailey A et al. (1995): The ACC1 gene, encoding acetyl-CoA carboxylase, is essential for growth in Ustilago maydis. Mol. Gen. Genet. 249 (2), 191-201.
Devereux J et al. (1984): A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 12: 387-395.
Goffeau A et al. (1996): Life with 6000 genes. Science 274 (5287).
Gronwald JW (1994): Herbicides inhibiting acetyl-CoA carboxylase. Biochem. Soc. Trans. 22 (3): 616-621).
Haselkorn R & Gornicki P (1999): Cyanobacterial and plant acetyl-CoA carboxylase, US 5972644.
Jenkins AR et al. (1992): Maize Acetyl CoA Carboxylase encoding DNA clones, WO 93/11243 AI. Ke J et al. (2000): Coordinate Regulation of the Nuclear and Plastidic Genes Coding for the Subunits of the Heteromeric Acetyl-Coenzyme A Carboxylase. Plant Physiology 122: 1057-1071.
Knowles JR (1989): The mechanism of biotin-dependent enzymes. Annu. Rev.
Biochem. 58: 195-221.
Lottspeich, F., Zorbas H. (Hrsg.). 1998. Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin.Martinez-Zapater J.M. und Salina J. , 1998 Humana Press ISBN 0-89603-391-0.
Mumberg D et al. (1995): Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156, 119-122.
Munday MR & Hemingway C J (1999): The regulation of acetyl-CoA carboxylase - a
Potential for the action of hypolipidemic agents. Adv. Enzyme Regul. 39: 205-234.
Nauen R et al. (1996) Aphicidal activity of imidacloprid against a tobacco feeding strain of Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) from Japan closely related to Myzus nicotinae and highly resistant to carbamates and organophosphates. Bull. Ent.
Res. 86: 165-171
Puissant C & Houdebine LM (1990) : An improvement of the single-step method of the RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. BioTechniques 8: 148-149.
Somers DA (1999): DNA encoding oat acetyl CoA carboxylase, WO 99/67367 AI. Sutter M. et al. (1991): Acaricides containing soraphen A or soraphen B , EP-A-412 937.
Vahlensieck HF et al. (1994): Identification of the yeast ACCl gene product (acetyl- CoA carboxylase) as the target of the polyketide fungicide soraphen A. Curr. Genet. 25 (2): 95-100.

Claims

Patentansprflche
1. Nukleinsäure umfassend eine Sequenz ausgewählt aus
(a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
(b) der Sequenz gemäß Accession Number AAF59156,
(c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter (a) und (b) definierten Sequenzen,
(d) Sequenzen, welche aus Insekten stammen oder von solchen abgeleitet sind und die bei einer Hybridisierungstemperatur von 37°C bis 50°C an die unter (a) und (b) definierten Sequenzen hybridisieren,
(e) Sequenzen, welche aus Insekten stammen oder von solchen abgeleitet sind und die eine zumindest 60 %ige Identität zu den unter (a) und (b) definierten Sequenzen aufweisen,
(f) Sequenzen, welche zu den unter (a) bis (e) definierten Sequenz komplementär sind und
(g) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie die unter (a) bis (e) definierten Sequenzen.
2. Vektor umfassend zumindest eine Nukleinsäure gemäß Ansprach 1.
3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure- molekül funktioneil mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.
4. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einen Vektor gemäß Ansprach 2 oder 3.
5. Wirtszelle gemäß Ansprach 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine pro- oder eukaryotische Zelle handelt.
6. Wirtszelle gemäß Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, daß die prokaryotische Zelle E.coli ist.
7. Wirtszelle gemäß Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotische
Zelle eine Säuger- oder Insektenzelle ist.
8. Polypeptid mit einer Sequenz ausgewählt aus
a) der Sequenz mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase isoliert aus Myzus persicae,
b) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2,
c) der Sequenz kodiert von einer Nukleinsäure gemäß Accession Number w AAF59156,
d) Teilsequenzen der unter a) bis c) genannten Sequenzen, die noch die biologische Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase besitzen,
e) Sequenzen, welche aus Insekten stammen oder von solchen abgeleitet sind und die eine zumindest 60 %ige Identität mit den unter a) bis d) genannten Sequenzen aufweisen.
. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids gemäß Anspruch 8, umfassend
(a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 unter Bedingungen, die die Expression einer Nukleinsäure gemäß Ansprach 1 gewährleisten, und
(b) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle oder dem Kulturmedium.
10. Antikörper, welcher spezifisch mit einem Polypeptid gemäß Ansprach 8 reagiert.
11. Verwendung eines Polypeptids aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von insektizid und/oder akarizid wirksamen Verbindungen.
12. Verwendung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Polypeptide gemäß Anspruch 8 handelt.
13. Nerwendung von Nukleinsäuren, die für Polypeptide aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase kodieren, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren dieser Polypeptide.
14. Verwendung von Nukleinsäuren, die für Polypeptide aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase kodieren, zum Identifizieren von Substanzen, welche die Expression der von ihnen kodierten Polypeptide verändern.
15. Verwendung gemäß Ansprach 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder um cDNA handelt.
16. Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die an ein Polypeptid aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase bindet, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen eines Polypetids aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase oder einer Wirtszelle enthaltend ein solches Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedin- gungen, die die Interaktion einer dieser chemischen Verbindungen mit dem Polypeptid erlauben, und
(b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezifisch an das Polypeptid bindet.
17. Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die die Aktivität von Acetyl- CoA Carboxylase aus Insekten und/oder Akarina modulieren, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Testsubstanz unter solchen Bedingungen mit Acetyl-CoA
Carboxylase in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Testsubstanz mit der Acetyl-CoA Carboxylase gestatten,
b) die erfolgte Interaktion der Testsubstanz detektiert, indem man die Fähigkeit der Acetyl-CoA Carboxylase zur Biotin-abhängigen Carboxylierung von Acetyl-CoA bestimmt, und
c) die Fähigkeit der Acetyl-CoA Carboxylase zur Biotin-abhängigen Carboxylierung von Acetyl-CoA bei Anwesenheit der Testsubstanz mit ihrer Fähigkeit zur Biotin-abhängigen Carboxylierung von Acetyl-
CoA bei Abwesenheit einer Testsubstanz vergleicht.
18. Verfahren zum Auffinden einer Verbindung, welche die Expression von Polypeptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase verändert, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle enthaltend eine für ein Polypeptid aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase kodierende Nukleinsäure mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen,
(b) Bestimmen der Polypeptidkonzentration, und
(c) Bestimmen der Verbindung, welche die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst.
19. Verwendung von Verbindungen der Formel (I)
worin
Ar für substituiertes Aryl oder Hetaryl mit mindestens einem ortho- Substituenten steht,
R für H oder für Acylreste steht, und A mit den verknüpften C-Atomen einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6- gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bildet, wobei als Heteroatome beispielsweise N, O und/oder S in Frage kommen,
als Inhibitoren der Acetyl-CoA Carboxylase aus Insekten.
21. Verwendung von Verbindungen der Formel (I) gemäß Ansprach 20 in Verfahren gemäß Anspruch 17 und 18.
22. Modulatoren der Acetyl-CoA Carboxylase aus Insekten und/oder Akarina, die mittels eines Verfahrens gemäß Ansprach 16 oder 17 gefunden werden.
23. Insektizid und/oder akarizid wirksame Substanzen, die mittels eines Verfahrens gemäß Ansprach 16 oder 17 gefunden werden.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60326640D1 (de) 2002-08-05 2009-04-23 Cropsolution Inc Rekombinante biotincarboxylasedomänen zur identifizierung von acetyl-coa-carboxylase-inhibitoren
US20060195938A1 (en) * 2004-06-15 2006-08-31 Eva-Maria Franken Polynucleotides encoding insect acetyl coenzyme-A carboxylase and uses thereof
DE102005003076A1 (de) * 2005-01-22 2006-07-27 Bayer Cropscience Ag Verwendung von Tetramsäurederivaten zur Bekämpfung von Insekten aus der Gattung der Pflanzenläuse (Sternorrhyncha)
DE102006022821A1 (de) * 2006-05-12 2007-11-15 Bayer Cropscience Ag Verwendung von Tetramsäurederivaten zur Bekämpfung von Insekten aus der Ordnung der Käfer (Coleoptera), Thrips (Tysanoptera), Wanzen (Hemiptera), Fliegen (Diptera) und Zikaden (Auchenorrhynchae)
DE102011080406A1 (de) * 2011-08-04 2013-02-07 Bayer Pharma AG Substituierte 3-(Biphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro8[4.5]dec-3-en-2-one
CN110607378B (zh) * 2019-10-31 2022-11-29 贵州省烟草科学研究院 检测烟蚜对吡虫啉抗药性的引物对及检测方法

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5142065A (en) * 1988-08-20 1992-08-25 Bayer Aktiengesellschaft 3-aryl-pyrrolidine-2,4-diones
US4985063A (en) * 1988-08-20 1991-01-15 Bayer Aktiengesellschaft 3-aryl-pyrrolidine-2,4-diones
DE3913682A1 (de) * 1989-04-26 1990-10-31 Bayer Ag 3-aryl-pyrrolidin-2,4-dione
ES2063108T3 (es) * 1989-01-07 1995-01-01 Bayer Ag Derivados de 3-aril-pirrolidin-2,4-diona.
US5186737A (en) * 1989-01-07 1993-02-16 Bayer Aktiengesellschaft Pesticidal 3-aryl-pyrrolidine-2,4-diones
EP0412937A1 (de) * 1989-08-10 1991-02-13 Ciba-Geigy Ag Pflanzenakarizide
DE3929087A1 (de) * 1989-09-01 1991-03-07 Bayer Ag 3-aryl-pyrrolidin-2,4-dion-derivate
DE4032090A1 (de) * 1990-02-13 1991-08-14 Bayer Ag Polycyclische 3-aryl-pyrrolidin-2,4-dion-derivate
DE4102339A1 (de) * 1991-01-26 1992-07-30 Bayer Ag Substituierte 3-phenyl-4-hydroxy-(delta)(pfeil hoch)3(pfeil hoch)-pyrrolin-2-one
US5585384A (en) * 1991-01-31 1996-12-17 Bayer Aktiengesellschaft Substituted bicyclic 3-aryl-pyrrolidine-2,4-dione derivatives
DE4102778A1 (de) * 1991-01-31 1992-08-06 Bayer Ag Substituierte bicyclische 3-aryl-pyrrolidin-2,4-dion-derivate
DE4109208A1 (de) * 1991-03-21 1992-09-24 Bayer Ag 3-hydroxy-4-aryl-5-oxo-pyrazolin-derivate
US5358924A (en) * 1991-03-21 1994-10-25 Bayer Aktiengesellschaft 3-hydroxy-4-aryl-5-oxo-pyrozoline derivatives, compositions and use
DE4121365A1 (de) * 1991-06-28 1993-01-14 Bayer Ag Substituierte 1-h-3-aryl-pyrrolidin-2,4-dion-derivate
DE4216814A1 (de) * 1991-07-16 1993-01-21 Bayer Ag 3-aryl-4-hydroxy-(delta)(pfeil hoch)3(pfeil hoch)-dihydrofuranon- und 3-aryl-4-hydroxy-(delta)(pfeil hoch)3(pfeil hoch)-dihydrothiophenon-derivate
GB9125330D0 (en) * 1991-11-28 1992-01-29 Commw Scient Ind Res Org Novel dna clones and uses thereof
DE4308451A1 (de) * 1992-09-10 1994-04-14 Bayer Ag 3-Aryl-pyron-Derivate
US5539092A (en) * 1992-10-02 1996-07-23 Arch Development Corporation Cyanobacterial and plant acetyl-CoA carboxylase
AU666040B2 (en) * 1992-10-28 1996-01-25 Bayer Aktiengesellschaft Substituted 1-H-3-aryl-pyrrolidine-2,4-dione derivatives
DE4243818A1 (de) * 1992-12-23 1994-06-30 Bayer Ag 5-Aryl-1,3-thiazin-Derivate
DE4306259A1 (de) * 1993-03-01 1994-09-08 Bayer Ag Dialkyl-1-H-3-(2,4-dimethylphenyl)-pyrrolidin-2,4-dione, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE4306257A1 (de) * 1993-03-01 1994-09-08 Bayer Ag Substituierte 1-H-3-Phenyl-5-cycloalkylpyrrolidin-2,4-dione, ihre Herstellung und ihre Verwendung
EP0706527B1 (de) * 1993-07-02 2001-11-14 Bayer Ag Substituierte spiroheterocyclische 1h-3-aryl-pyrrolidin-2,4-dion-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als schädlingsbekämpfungsmittel
EP0647637B1 (de) * 1993-09-17 1999-01-27 Bayer Ag 3-Aryl-4-hydroxy-3-dihydrofuranon-Derivate
DE4425617A1 (de) * 1994-01-28 1995-08-03 Bayer Ag 1-H-3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate
DE4431730A1 (de) * 1994-02-09 1995-08-10 Bayer Ag Substituierte 1H-3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate
DE4410420A1 (de) * 1994-03-25 1995-09-28 Bayer Ag 3-Aryl-4-hydroxy- DELTA·3·-dihydrothiophenon-Derivate
AU2072695A (en) * 1994-04-05 1995-10-23 Bayer Aktiengesellschaft Alkoxy-alkyl-substituted 1-h-3-aryl-pyrrolidine-2,4-diones used as herbicides and pesticides
AU2925195A (en) * 1994-07-07 1996-02-09 Bayer Aktiengesellschaft 2-aryl cyclopentane-1,3-dione derivatives
BR9509793A (pt) * 1994-11-17 1997-09-30 Bayer Ag Derivados de tiofeneno
US6153374A (en) * 1994-12-13 2000-11-28 Novartis Finance Corporation Method for identifying inhibitors of soraphen A resistant acetyl-coenzyme a carboxylase
CN1079798C (zh) * 1994-12-23 2002-02-27 拜尔公司 3－芳基－季酮酸衍生物、其生产和作为杀虫剂的应用和中间体
AU4715896A (en) * 1995-02-13 1996-09-04 Bayer Aktiengesellschaft 2-phenyl-substituted heterocyclic 1,3-ketonols as herbicides and pesticides
AU5762696A (en) * 1995-05-09 1996-11-29 Bayer Aktiengesellschaft Alkyl dihalogenated phenyl-substituted ketoenols useful as p esticides and herbicides
JP4082724B2 (ja) * 1995-06-28 2008-04-30 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 有害生物防除剤及び除草剤として使用される２，４，５−三置換されたフェニルケト−エノール
EP0835243B1 (de) * 1995-06-30 2003-01-29 Bayer CropScience AG Dialkyl-halogenphenylsubstituierte ketoenole zur verwendung als herbizide und pestizide
DE19540080A1 (de) * 1995-10-27 1997-04-30 Bayer Ag 3-Aryl-5-halogen-pyron-Derivate
DE19544457A1 (de) * 1995-11-29 1997-06-05 Bayer Ag Oxymethoxy-3-aryl-pyron-Derivate
BR9708425B1 (pt) * 1996-04-02 2012-02-22 fenilcetoenóis substituìdos, processo para preparação e uso dos mesmos, bem como pesticidas ou herbicidas e método para controle de pragas e ervas daninhas.
JP4306799B2 (ja) * 1996-05-10 2009-08-05 バイエル アクチェンゲゼルシャフト 新規な置換ピリジルケトエノール
JP4202423B2 (ja) * 1996-08-05 2008-12-24 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト ２―および２，５―置換フェニルケトエノール
DE19632126A1 (de) * 1996-08-09 1998-02-12 Bayer Ag Phenylsubstituierte cyclische Ketoenole
US6391912B1 (en) * 1996-12-12 2002-05-21 Bayer Aktiengesellschaft Substituted phenylketoenols
DE19651686A1 (de) * 1996-12-12 1998-06-18 Bayer Ag Neue substituierte Phenylketoenole
AU9307098A (en) * 1997-09-08 1999-03-29 Arqule, Inc. Spiro{pyrrolidine-2,3'-oxindole} compounds and methods of use
DE19742492A1 (de) * 1997-09-26 1999-04-01 Bayer Ag Spirocyclische Phenylketoenole
DE19749720A1 (de) * 1997-11-11 1999-05-12 Bayer Ag Neue substituierte Phenylketoenole
DE19808261A1 (de) * 1998-02-27 1999-10-28 Bayer Ag Arylphenylsubstituierte cyclische Ketoenole
DE19813354A1 (de) * 1998-03-26 1999-09-30 Bayer Ag Arylphenylsubstituierte cyclische Ketoenole
DE19818732A1 (de) * 1998-04-27 1999-10-28 Bayer Ag Arylphenylsubstituierte cyclische Ketoenole
DE19846517A1 (de) * 1998-10-09 2000-04-20 Bayer Ag 3-Phenyl-pyrone
DE19939395A1 (de) * 1998-10-23 2000-04-27 Bayer Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
US20030100572A1 (en) * 2001-06-21 2003-05-29 Ariad Pharmaceuticals,Inc. Novel pyridopyrimidones and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0248321A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002234537A1 (en) 2002-06-24
DE10062422A1 (de) 2002-06-20
US20040161757A1 (en) 2004-08-19
WO2002048321A3 (de) 2003-02-13
JP2005500810A (ja) 2005-01-13
WO2002048321A2 (de) 2002-06-20

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