EP1350101A2 - Morphometrisches gewebe- oder zellpräparat - Google Patents

Morphometrisches gewebe- oder zellpräparat

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Publication number
EP1350101A2
EP1350101A2 EP01985910A EP01985910A EP1350101A2 EP 1350101 A2 EP1350101 A2 EP 1350101A2 EP 01985910 A EP01985910 A EP 01985910A EP 01985910 A EP01985910 A EP 01985910A EP 1350101 A2 EP1350101 A2 EP 1350101A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
weight
cells
tissue
morphometric
cell preparation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01985910A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Carolin Schmidt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering AG filed Critical Schering AG
Publication of EP1350101A2 publication Critical patent/EP1350101A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • the invention relates to a morphometric tissue or cell preparation which can be obtained by carrying out the following process steps: a) cells or tissue are cultivated in a matrix for a defined time under defined conditions, b) after the defined time has elapsed, the cells or cells are cultured Tissue-containing matrix incubated with a staining solution.
  • the invention further relates to a manufacturing method for such a preparation and uses thereof.
  • the invention relates to a fixing and staining solution for use in such a method.
  • a morphometric tissue or cell preparation is treated in a manner that allows recognition of the
  • Form formation of cellular structures or of tissue structures allowed. It is essential here that shapes, for example shapes of cells and / or cell components and / or tissues, are made recognizable by means of contrast-forming methods. Detection can be carried out by observation using various optical methods, in the simplest case using normal light microscopy. Often, certain shape features are counted as part of the recognition, which are usually correlated with certain cellular processes. The detection can be carried out visually by the human eye, with a person viewing then, for example, identifying sought structures and possibly counting them using the
  • Pattern recognition system which can then automatically count.
  • a recording can be carried out photographically or electronically, for example using CCD elements.
  • the methodology is used to determine what influence the defined cultivation conditions have on morphogenesis.
  • the expression of the defined cultivation conditions therefore also includes, in particular, non-natural or non-standard conditions, which are characterized, for example, by adding one or more prospective active ingredients to a standard medium. It is understood that the
  • the coloring solution serves to highlight the shaping features of interest in contrast.
  • the average person skilled in the art can easily select the dye according to the forms of interest (for example, basic dyes bind to acidic cell structures, such as DNA in the nucleus or RNA in the ribosomes; acidic dyes preferably bind to basic ones
  • Dye then form the colored areas, while areas in which there are no or fewer binding sites for the dye are not or only weakly colored areas. Ultimately, this is the mechanism of contrast formation.
  • a method of the type mentioned at the outset is, for example, from the literature reference Leclere, P., Neuroscience: 82, 545-548, 1998.
  • ganglion cell explants were treated with a nerve growth factor or cultured in the presence thereof, and then this was induced
  • Neurite growth analyzed morphometrically. Staining was carried out using dye-labeled or dye-labeled antibodies. It is therefore an antigen-dependent staining method. specific
  • Stains of this type are only suitable for very thin matrices. However, it is often desirable to use distinctly three-dimensional matrices or cultures, in which case a sufficiently homogeneous antigen-dependent staining is difficult or impossible. In addition, antigen-dependent staining methods are time-consuming and expensive.
  • the invention teaches a morphometric tissue or
  • Cell preparation which can be obtained by carrying out the following process steps: a) cells or tissues are cultivated for a defined time under defined conditions in a three-dimensional matrix, b) after the defined time has elapsed, the matrix containing the cultivated cells or tissues is treated with a Fixing and staining solution containing an aldehyde and, optionally an alcohol, and an antigen-unspecific stain incubated. This can be followed by a washing process step, for example with water.
  • An antigen-nonspecific colorant is a dye that can bind non-specifically to molecules or molecular classes of a cell or a tissue solely because of its acidic or basic groups, but also through redox processes. Binding to virtually all structures of cells or tissue can also take place.
  • Antibodies are not used.
  • the aldehyde and possibly the alcohol brings about a reliable fixation of structures of the cells or of the tissue by a variety of immobilizing reactions with intrinsically mobile molecules of the cells or of the tissue, for example by Mannich reactions.
  • this includes preparations whose spatial extent in all three spatial directions is a multiple of the spatial extent of the cultivated cells, for example equal to or more than 2 times, preferably more than 10 times, up to more than 100 times , It is achieved with the invention that this is pronounced three-dimensional line or tissue preparations are stable and permanently fixed and at the same time very high-contrast images are obtained using the simplest methods, for example simple light microscopy. Only one treatment with the fixing and staining solution is necessary, ie it is a "one-step” method. In addition, pronounced three-dimensional specimens can be fixed and stained easily, while specific staining of such specimens using antibody-based methods is hardly possible, if at all. Pronounced three-dimensional preparations are those that do not only have a minimal thickness (cuts), but rather can have thicknesses from 0.2 ⁇ m to 20 mm, in particular 0.2 mm to 20 mm.
  • the fixing and staining solution contains water, optionally a water-miscible organic solvent, and
  • the aqueous saline solution reliably prevents changes in the shape of cells or tissue, for example due to osmosis, in the course of fixation and staining.
  • the fixing and staining solution can contain the following components: A) 0.5-35% by weight, preferably 1-2% by weight, aldehyde, B) 0.01 to 10% by weight, preferably 0 , 3 - 0.6% by weight, colorant, C) 0 - 90% by weight, preferably 30 - 50% by weight, of one or more water-miscible organic solvents,
  • E 0-5% by weight, preferably 0.1-1% by weight, of common salt, the sum of the proportions of components A) to E) always giving 100% by weight, and the ratio of the proportions by weight of Components E: D are in the range from 1: 1000 to 1: 100, preferably corresponds to the ratio by weight of a physiological saline solution.
  • the invention also relates independently to such a fixing and staining solution.
  • the duration of the incubation in stage b) can be in the range from 0.5 to 24 h, preferably in the range from 1 to 10 min.
  • the incubation in stage b) can be carried out at a temperature from 0 ° C. to 60 ° C., preferably from 0 ° C. to 40 ° C.
  • the water-miscible organic solvent can be selected from the group consisting of "Cl-10 alkanols with 1-3 OH groups, Cl-10 alicyclic alcohols with 1-3 OH groups, Cl to C10 aromatic alcohols, and mixtures of such substances ". Ethanol is preferred.
  • the colorant can be selected from the group consisting of "crystal violet, amido black, cresyl violet, and mixtures of such substances”.
  • the matrix can be selected from the group consisting of "extracted natural extracellular matrices of various origins, in particular from rat tails or pig skin, their main components, in particular collagen, laminin, fibronectin, and mixtures of these substances".
  • the aldehyde can be selected from the group consisting of "Cl to C10 alkanaldehydes, Cl to C10 alicyclic aldehydes, aromatic Cl to C10 aldehydes, and mixtures of such aldehydes". Formaldehyde and paraformaldehyde are preferred.
  • the individual cells or complex tissues of the preparation can be or consist of, for example, tumor cells, nerve cells, glial cells, muscle cells, blood cells. In the area of drug binding, the cells are optimally (but not necessarily) human cells.
  • the invention further teaches a method of manufacture of a morphometric tissue or cell preparation, the following process steps being carried out: a) cells or tissues are cultivated over a defined time under defined conditions in a pronounced three-dimensional matrix, b) after the defined time has elapsed, the matrix containing the cultivated cells or tissue is included a fixing and staining solution containing an aldehyde and an antigen-unspecific stain.
  • a) cells or tissues are cultivated over a defined time under defined conditions in a pronounced three-dimensional matrix
  • the matrix containing the cultivated cells or tissue is included a fixing and staining solution containing an aldehyde and an antigen-unspecific stain.
  • the invention furthermore teaches the use of a morphometric tissue or cell preparation according to the invention for the morphometric analysis of cellular processes caused by cultivation conditions.
  • defined conditions are set from which a certain morphogenetic effect is expected. This is then evaluated and correlated with the defined conditions, if necessary semi-quantitative or quantitative.
  • This also includes the use of a morphometric tissue or cell preparation according to the invention in a process for finding active substances, the active substance being used in step a), with the cells or tissue being subsequently recorded in step b) by means of, for example, an optical microscope, wherein the image obtained is preferably evaluated by means of an image recognition system, the result of the evaluation being assigned to the active substance, and where appropriate the method being repeated for different active substances and the results of the evaluation obtained for different active substances being compared with one another.
  • a quantitative, or at least semi-quantitative, statement is obtained regarding the orphogenetic effect caused by the investigated active substances.
  • the cells can, for example, ganglion cells, especially dorsal Schuwurzelganglien, be, the evaluation then z. B. includes the detection of newly formed neurites.
  • the cells can also be tumor cells, the evaluation then comprising, for example, the detection of emigrated cells.
  • the cultivation was then carried out for several hours in a culture medium containing nerve growth factor.
  • the cultivation was ended by aspirating the culture medium from the gel and by the following staining and fixing step.
  • Example 1 The gel obtained in Example 1 was then treated with a filtered fixing and staining solution. This contained: 2.42 g crystal violet, 162 ml ethanol (100%), 323 ml distilled water, 16 ml formaldehyde (35%, balance water), and 0.8 g NaCl. The treatment was carried out for 5 min. at 20 ° C. Then it was washed with water.
  • the washed gel was then placed on a light microscope (Zeiss Axiovert, bright field, magnification of the objective lOx) and a detailed picture was taken, as shown in FIG. 1.
  • a light microscope Zeiss Axiovert, bright field, magnification of the objective lOx
  • FIG. 1 In the figure 1 below is the edge of the

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat welches erhältlich ist, indem die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden: a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer dreidimensionalen Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier- und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert.

Description

Morphometrisc es Gewebe- oder Zellpräparat
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein morphometrisches Gewebeoder Zellpräparat, welches erhältlich ist, indem die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden: a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Färbelösung inkubiert. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Herstellungsverfahren für ein solches Präparat sowie Verwendungen desselben. Die Erfindung betrifft schließlich eine Fixier- und Färbelösung zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
Ein morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat ist in einer Weise behandelt, die eine Erkennung der
Formbildung (Morphogenese) zellulärer Strukturen bzw. von Gewebestrukturen erlaubt. Hierbei ist es wesentlich, daß Formen, beispielsweise Formen von Zellen und/oder Zellbestandteilen und/oder Geweben, mittels kontrastbildender Methoden erkennbar gemacht werden. Eine Erkennung kann dabei durch Betrachtung unter Verwendung diverser optischer Methoden, im einfachsten Falle mittels normaler Lichtmikroskopie, erfolgen. Oft erfolgt im Rahmen der Erkennung eine Zählung von bestimmten Formmerkmalen, welche meist mit bestimmten zellulären Prozessen korreliert sind. Die Erkennung kann visuell durch das menschliche Auge erfolgen, wobei dann eine betrachtende Person beispielsweise die Identifizierung gesuchter Strukturen und ggf. deren Zählung anhand der
Betrachtung des Präparats, ggf. durch ein Mikroskop, oder durch Betrachtung einer entsprechenden Aufnahme durchführt. Einfacher und sicherer ist es jedoch, die Erkennung zu automatisieren, beispielsweise durch Aufnahme des (Mikroskop-) Bildes und Auswertung mittels eines computergesteuerten
Mustererkennungssystems, welches dann auch automatisch eine Zählung durchführen kann. Eine Aufnahme kann photographisch oder elektronisch, beispielsweise mittels CCD Elementen, durchgeführt werden. Die Methodik dient dazu festzustellen, welchen Einfluß die definierten Kultivierungsbedingungen auf die Morphogenese haben. Der Ausdruck der definierten Kultivierungsbedingungen umfaßt daher insbesondere auch nicht-natürliche bzw. nicht-Standard-Bedingungen, welche beispielsweise durch Zugabe eines oder mehrerer prospektiver Wirkstoffe zu einem Standardmedium charakterisiert sind. Es versteht sich, daß die
Bedingungen in jedem Fall so zu wählen sind, daß nicht praktisch sofortige Apoptose aller Zellen des Präparats insgesamt induziert wird. Die Färbelösung dient dazu, die Formgebungsmerkmale von Interesse im Kontrast hervorzuheben. Den Farbstoff kann der Durchschnittsfachmann unschwer nach Maßgabe der interessierenden Formen auswählen (beispielsweise basische Farbstoffe binden an saure Zellstrukturen, wie DNA im Kern oder RNA in den Ribosomen; saure Farbstoffe binden bevorzugt an basische
Plasmaproteine) . Wesentlich bei der Färbung ist, daß der Farbstoff an (bestimmte) zelluläre Strukturen so fest gebunden wird, daß eventuelle subseguente Waschverfahrenstufen den Farbstoff nicht mehr abzulösen vermögen. Die Bindungsstellen des
Farbstoffes bilden dann die gefärbten Bereiche, während Bereiche, in welchen keine oder weniger Bindungsstellen für den Farbstoff vorliegen, nicht oder nur schwach gefärbte Bereiche darstellen. Dies ist letztendlich der Mechanismus der Kontrastbildung.
Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist beispielsweise aus der Literaturstelle Leclere, P., Neuroscience:82, 545-548, 1998, bekannt. Bei dem insofern bekannten Verfahren wurden Ganglienzellenexplantate mit Nervenwachstumsfaktor behandelt bzw. in dessen Gegenwart kultiviert und anschließend wurde das dadurch induzierte
Neuritenwachstum morphometrisch analysiert. Dabei wurde eine Färbung unter Einsatz von farbstoffmarkierbaren bzw. farbstoffmarkierten Antikörpern durchgeführt. Es handelt sich folglich um eine Antigen-abhängige Färbemethode. Spezifische
Färbungen dieser Art sind jedoch nur für recht dünne Matrices geeignet. Oft ist es jedoch wünschenswert, ausgeprägt dreidimensionale Matrices bzw. Kulturen zu verwenden, wobei dann eine ausreichend homogene Antigen-abhängige Färbung nur schwer oder gar nicht gelingt. Zudem sind Antigen-abhängige Färbemethoden zeitaufwendig und kostspielig.
Aus den Literaturstellen Hayakawa, K. , et al . , Neurosci Lett.:274, 103-106, 1999, und Carreau, A. ,
Neuropharmacology:36, 1755-1762, 1997, ist es bekannt, morphometrische Analysen mittels der
Phasenkontrastmikroskopie in-situ, i.e. in unfixiertem Zustand, durchzuführen. Die Aufnahmen sind jedoch sehr kontrastarm, was insbesondere eine automatische Mustererkennung erschwert, wenn nicht unmöglich macht. Zudem können die Kulturen dabei sehr schnell degenerieren. Im Falle der erstgenannten Literaturstelle ist das Auswandern von Zellen aus komplexen Geweben, wie z. B. bei der Metastasierung von Tumoren untersucht. Die zweitgenannte Literaturstelle beschreibt den Einfluß von Nervenwachstumsfaktoren auf das Neuritenwachstum.
Demgegenüber liegt der Erfindung das technische
Problem zugrunde, ein morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat anzugeben, welches eine stabile und dauerhafte morphogenetische Momentaufnahme darstellt und gleichzeitig einfach herstellbar ist bei sehr guter Kontrastbildung.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein morphometrisches Gewebe- oder
Zellpräparat, welches erhältlich ist, indem die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden: a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer dreidimensionalen Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier- und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd und, optional einen Alkohol, sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert. Hieran kann sich eine Waschverfahrensstufe, beispielsweise mit Wasser, anschließen. Ein antigenunspezifisches Färbemittel ist ein Farbstoff, welcher allein aufgrund seiner sauren oder basischen Gruppen, aber auch durch Redox-Prozesse, unspezifisch an Moleküle bzw. Molekülklassen einer Zelle oder eines Gewebes binden kann. Es kann auch eine Bindung an praktisch alle Strukturen von Zellen oder eines Gewebes stattfinden. Ein Einsatz von Antikörpern findet nicht statt . Das Aldehyd und ggf . der Alkohol bewirken eine zuverlässige Fixierung von Strukturen der Zellen oder des Gewebes durch eine Vielfalt von immobilisierenden Reaktionen mit an sich mobilen Molekülen der Zellen oder des Gewebes, beispielsweise im Wege von Mannich Reaktionen. In einer dreidimensionalen Matrix erfolgt Zellwachstum bzw.
Wachstum von Zellteilen in allen drei Raumrichtungen. Insbesondere sind hierunter Präparate zu verstehen, deren räumliche Ausdehnung in allen drei Raumrichtungen ein Mehrfaches der räumlichen Ausdehnung der kultivierten Zellen ist, beispielsweise gleich oder mehr als das 2-fache, vorzugsweise mehr als das 10-fache, bis zu mehr als das 100-fache. Mit der Erfindung wird erreicht, daß das ausgeprägt dreidimensionale Zeil- oder Gewebepräparate stabil und dauerhaft fixiert sind und zugleich mittels einfachster Methoden, beispielsweise einfacher Lichtmikroskopie, sehr kontrastreiche Aufnahmen erhalten werden. Dabei ist nur eine einzige Behandlung mit der Fixier- und Färbelösung notwendig, i.e. es handelt sich um eine "one-step"-Methode. Zudem lassen sich ausgeprägt dreidimensionale Präparate gut fixieren und färben, während eine spezifische Färbung solcher Präparate mit Antikörper-basierenden Methoden kaum, wenn überhaupt, gelingt. Ausgeprägt dreidimensionale Präparate sind solche, die nicht ledigliche eine minimale Dicke aufweisen (Schnitte) , sondern Dicken von durchaus 0,2 μm bis hin zu 20 mm, insbesondere 0,2 mm bis 20 mm, aufweisen können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, welche von selbstständiger Bedeutung ist, enthält die Fixier- und Färbelösung Wasser, optional ein mit Wasser mischbares organisches Lösemittel, und
Kochsalz. Die wäßrige Kochsalzlösung, insbesondere im Falle einer physiologischen Kochsalzlösung, verhindert zuverlässig Formänderungen von Zellen oder Gewebe, beispielsweise osmosebedingt, im Zuge der Fixierung und Färbung.
Im Einzelnen kann die Fixier- und Färbelösung die folgenden Komponenten enthalten: A) 0,5 - 35 Gew.-%, vorzugsweise 1 - 2 Gew.-%, Aldehyd, B) 0,01 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,3 - 0,6 Gew.-%, Färbemittel, C) 0 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 30 - 50 Gew.-%, eines oder mehrerer mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel,
D) 0 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 50 - 70 Gew.-%, Wasser,
E) 0 - 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 - 1 Gew.-%, Kochsalz, wobei die Summe der Anteile der Komponenten A) bis E) stets 100 Gew.-% ergibt, und wobei das Verhältnis der Gewichtsanteile der Komponenten E : D in dem Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 100 liegt, vorzugsweise dem Verhältnis der Gewichtsanteile einer physiologischen Kochsalzlösung entspricht. Die Erfindung betrifft auch selbstständig eine solche Fixier- und Färbelösung.
Die Dauer der Inkubation in Stufe b) kann im Bereich von 0,5 bis 24 h, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10 min., betragen. Die Inkubation in Stufe b) kann bei einer Temperatur von 0 °C bis 60 °C, vorzugsweise von 0 °C bis 40 °C, durchgeführt werden.
Das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Cl-10 Alkanole mit 1 - 3 OH-Gruppen, Cl-10 alizyklische Alkohole mit 1 - 3 OH-Gruppen, Cl bis C10 aromatische Alkohole, und Mischungen solcher Stoffe". Bevorzugt ist Ethanol . Das Färbemittel kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Kristallviolett, Amidoschwarz , Kresylviolett, und Mischungen solcher Stoffe" . Die Matrix kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "extrahierten natürlichen extrscellulären Matrices verschiedenen Ursprungs, insbesondere aus Rattenschwänzen oder Schweinehaut, deren Hauptbestandteile, insbesondere Collagen, Laminin, Fibronektin, und Mischungen dieser Stoffe" . Das Aldehyd kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Cl bis C10 Alkanaldehyde, Cl bis C10 alizyklische Aldehyde, aromatische Cl bis C10 Aldehyde, und Mischungen solcher Aldehyde" . Bevorzugt sind Formaldehyd und Paraformaldehyd.
Die einzelnen Zellen oder komplexen Gewebe des Präparats können beispielsweise aus Tumorzellen, Nervenzellen, Gliazellen, Muskelzellen, Blutzellen sein bzw. daraus bestehen. Im Bereich der Wirkstoffindung sind die Zellen optimalerweise (aber nicht zwingend) humane Zellen.
Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines morphometrisehen Gewebe- oder Zellpräparat wobei die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden: a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer ausgeprägt dreidimensionalen Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier- und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert. Bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten die vorstehenden Anmerkungen zum Präparat analog.
Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen morphometrischen Gewebe- oder Zellpräparats zur morphometrischen Analyse von kultivierungs- bedingungsbedingten zellulären Prozessen. Mit anderen Worten ausgedrückt, in Stufe a) werden definierte Bedingungen eingestellt, von denen ein bestimmter morphogenetischer Effekt erwartet wird. Dieser wird dann ausgewertet und mit den definierten Bedingungen korreliert, ggf. halbquantitativ oder quantitativ.
Hierunter fällt auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen morphometrischen Gewebe- oder Zellpräparats in einem Verfahren zur Findung von Wirkstoffen, wobei der Wirkstoff in Stufe a) eingesetzt wird, wobei anschließend an Stufe b) eine Aufnahme der Zellen oder des Gewebes mittels beispielsweise eines Lichtmikroskops durchgeführt wird, wobei die erhaltene Aufnahme vorzugsweise mittels eines Bilderkennungssystems ausgewertet wird, wobei das Ergebnis der Auswertung dem Wirkstoff zugeordnet wird und wobei ggf. das Verfahren für verschiedene Wirkstoffe wiederholt wird und die erhaltenen Ergebnisse der Auswertung für verschiedene Wirkstoffe miteinander verglichen werden. Man erhält letztendlich eine quantitative, zumindest jedoch halbquantitative Aussage bezüglich des orphogenetischen Effekts, der von den untersuchten Wirkstoffen hervorgerufen wird. Die Zellen können beispielsweise Ganglienzellen, insbesondere dorsale Hinterwurzelganglien, sein, wobei die Auswertung dann z. B. die Erfassung neugebildeter Neuriten umfaßt. Die Zellen können auch Tumorzellen sein, wobei die Auswertung dann z.B. die Erfassung ausgewanderter Zellen umfaßt.
Im folgenden wird die Erfindung anhand eines nicht limitierenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel 1
Es wurde eine Explantatkultur aus dorsalen Hinterwurzelganglien der früh postnatalen Ratte angelegt in einem ausgeprägt dreidimensionalen Collagengel (Maße:
Durchmesser 13 mm, Höhe 8 mm) . Die Kultivierung erfolgte dann für mehrere Stunden in einem Kulturmedium enthaltend Nervenwachstumsfaktor. Die Kultivierung wurde durch Absaugung des Kulturmediums von dem Gel und durch den folgenden Färbe- und Fixierungsschritt beendet.
Beispiel 2
Das in Beispiel 1 erhaltene Gel wurde dann mit einer filtrierten Fixier- und Färbelösung behandelt. Diese enthielt: 2,42 g Kristallviolett, 162 ml Ethanol (100%ig) , 323 ml destilliertes Wasser, 16 ml Formaldehyd (35%ig, Rest Wasser), und 0,8 g NaCl . Die Behandlung erfolgte für 5 min. bei 20 °C . Dann wurde mit Wasser gewaschen.
Das gewaschene Gel wurde dann auf einem Lichtmikroskop (Zeiss Axiovert, Hellfeld, Vergrößerung des Objektivs lOx) plaziert und eine Detailaufnahme, wie in Figur 1 gezeigt, angefertigt. In der Figur 1 unten ist der Rand des
Explantatkerns erkennbar. Weiterhin erkennt man die daraus aufgrund der Kultivierung mit Nervenwachstumfaktor ausgewachsenen Neuriten. Es fällt auf, daß eine extrem kontrastreiche Abbildung erhalten wird, die einfach und sicher quantitativ auswertbar ist.

Claims

Patentansprüc e:
1. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat erhältlich, indem die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden:
a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer dreidimensionalen Matrix kultiviert,
b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier- und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert.
2. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach Anspruch 1, wobei die Fixier- und Färbelösung Wasser, optional ein mit Wasser mischbares organisches Lösemittel, und Kochsalz enthält.
3. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Fixier- und
Färbelösung die folgenden Komponenten enthält:
A) 0,5 - 35 Gew.-%, vorzugsweise 1 - 2 Gew.-%, Aldehyd,
B) 0,01 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,3 - 0,6 Gew. %, Färbemittel,
C) 0 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 30 - 50 Gew.-%, eines oder mehrerer mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel,
D) 0 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 50 - 70 Gew.-%, Wasser,
E) 0 - 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 - 1 Gew.-%, Kochsalz,
wobei die Summe der Anteile der Komponenten A) bis E) stets 100 Gew.-% ergibt, und
wobei das Verhältnis der Gewichtsanteile der Komponenten E : D in dem Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 100 liegt, vorzugsweise dem Verhältnis der Gewichtsanteile einer physiologischen Kochsalzlösung entspricht .
Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Dauer der Inkubation in Stufe b) im Bereich von 0,5 bis 24 h, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10 min., beträgt.
5. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Inkubation in Stufe b) bei einer Temperatur von 0 °C bis 60 °C, vorzugsweise von 0 °C bis 40 °C, durchgeführt wird.
6. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Cl-10 Alkanole mit 1 - 3 OH-Gruppen, Cl-10 alizyklische Alkohole mit 1 bis 3 OH-Gruppen, Cl bis C10 aromatische Alkohole, und Mischungen solcher Stoffe".
7. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Färbemittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Kristallviolett, Amidoschwarz, Kresylviolett, und Mischungen solcher Stoffe".
8. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "natürliche extracelluläre Matrices verschiedenen Ursprungs, insbesondere aus Rattenschwanz oder Schweinehaut, Hauptbestanteile solcher Matrices, insbesondere Collagen, Laminin, Fibronektin, und Mischungen dieser Stoffe" .
9. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Aldehyd ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Cl bis C10 Alkanaldehyde, Cl bis C10 alizyklische
Aldehyde, aromatische Cl bis C10 Aldehyde, und Mischungen solcher Aldehyde"
10. Morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zellen oder das Gewebe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus "Tumorzellen, Nervenzellen, Gliazellen, Muskelzellen, Blutzellen, Gewebe enthaltend solche Zellen, und Mischungen solcher Zellen", vorzugsweise humanen Ursprungs sind.
11. Verfahren zur Herstellung eines morphometrischen Gewebe- und/oder Zellpräparats wobei die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden:
a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer ausgeprägt dreidimensionalen Matrix kultiviert,
b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier- und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert.
12. Verwendung eines morphometrischen Gewebe- und/oder Zellpräparats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur morphometrischen Analyse von kultivierungsbedingungs- bedingten zellulären Prozessen.
13. Verwendung eines morphometrischen Gewebe- und/oder Zellpräparats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Verfahren zur Findung von Wirkstoffen, wobei der Wirkstoff in Stufe a) eingesetzt wird, wobei anschließend an Stufe b) eine Aufnahme der Zellen oder des Gewebes mittels eines Lichtmikroskops durchgeführt wird, wobei die erhaltene Aufnahme vorzugsweise mittels eines BilderkennungsSystems ausgewertet wird, wobei das Ergebnis der Auswertung dem Wirkstoff zugeordnet wird und wobei ggf . das Verfahren für verschiedene Wirkstoffe wiederholt wird und die erhaltenen Ergebnisse der Auswertung für verschiedene Wirkstoffe miteinander verglichen werden.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zellen Neurone, insbesondere aus dorsalen Hinterwurzelganglien, sind und wobei die Auswertung die Erfassung neugebildeter Neuriten umfaßt.
15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zellen Tumorzellen sind und wobei die Auswertung die Erfassung ausgewanderter Zellen umfaßt.
16. Fixier- und Färbelösung zur Herstellung von morphometrischen Zeil- und/oder Gewebepräparaten, welche die folgenden Komponenten enthält:
A) 0,5 - 35 Gew.-%, vorzugsweise 1 - 2 Gew.-%, Aldehyd,
B) 0,01 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,3 - 0,6 Gew.- %, Färbemittel,
C) 0 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 30 - 50 Gew.-%, eines oder mehrerer mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel,
D) 0 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 50 - 70 Gew.-%, Wasser,
E) 0 - 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 - 1 Gew.-%, Kochsalz,
wobei die Summe der Anteile der Komponenten A) bis E) stets 100 Gew.-% ergibt, und wobei das Verhältnis der Gewichtsanteile der Komponenten E : D in dem Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 100 liegt, vor- zugsweise dem Verhältnis der Gewichtsanteile einer physiologischen Kochsalzlösung entspricht.
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