EP1432809A2

EP1432809A2 - Verfahren zur herstellung von vitamin b12

Info

Publication number: EP1432809A2
Application number: EP02796246A
Authority: EP
Inventors: Andreas KÜNKEL; Heiko Barg; Dieter Jahn; Jan-Henning Martens; Martin Warren
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2004-06-30
Also published as: CA2457662A1; CN1545556A; WO2003018825A3; US20040241809A1; JP2005500851A; WO2003018825A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium.

Description

Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12

Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B₁₂ indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L, 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531 , Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin B₁₂ erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin Bι₂, Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin Bι₂-Biosynthese sind 5^'- Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B₁₂) und Methylcobalamin (MeCbl), während Vitamin B₁₂ per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin B₁₂ einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle.

Die Spezies B. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von etwa 2x5 μm, einem G+C-Gehalt von ca. 38 % und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge an ß. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in ß. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an ß. megaterium (Priest F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus. J. Gen. Microbiol . 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporenbildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer-negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von ß. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z.B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann ß. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).

Die Vorteile der breiten Anwendung von ß. megaterium bei der industriellen Produktion verschiedenster Enzyme, Vitamine etc. sind vielfältig. Dazu gehört zum ersten sicherlich der Umstand, daß in ß. megaterium transformierte Plasmide sich als sehr stabil erweisen. Dies muß in direktem Zusammenhang gesehen werden mit der mittlerweile etablierten Möglichkeit, diese Spezies beispielsweise durch Polyethylenglykolbehandlung zu transformieren. Dies war bis vor wenigen Jahren noch ein Haupthindernis der Anwendung von B. megaterium als Produktionsstamm. Parallel hierzu ist auch der Vorteil einer relativ gut entwickelten Genetik zu sehen, die innerhalb des Bacillus-Gen s nur von ß. subtilis übertroffen wird. Zweitens weist ß. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß ß. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezemiert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und ß-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit ß. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, ^' bis eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels ß. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von ß. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß ß. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird ß. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von α- und ß-Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin Bi₂-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).

Aufgrund seiner vielfältigen Vorteile zum Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte ist der Einsatz von Bacillus megaterium wirtschaftlich sehr interessant. Die Optimierung der Fermentierungsbedingungen sowie molekulargenetischer Veränderungen von B. megaterium zur Herstellung von Vitamin B12 sind daher von hohem wirtschaftlichen Interesse.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Herstellung von Vitamin B 12 mit Bacillus megaterium zu optimieren.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B 12 mittels einer Kultur enthaltend Bacillus megaterium gelöst, bei welchem die Fermentierung unter aeroben Bedingungen in einem Medium enthaltend wenigstens Cobalt und/oder wenigstens Cobalt und 5- Aminolävulinsäure durchgeführt wird.

Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung alle üblichen B. megaterium-Stämme eingesetzt werden, die als Vitamin B12- Produktionsstämme geeignet sind.

Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Bacillus megaterium-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechsel weges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ 32 und DSMZ 509. In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Vitamin B12 wird Cobalt in Konzentrationen im Bereich von etwa 200 bis 750 μM, vorzugsweise von etwa 250 bis 500 μM zugesetzt.

In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahren wird 5- Aminolävulinsäure in Konzentrationen im Bereich von etwa 200 bis 400 μM, vorzugsweise von etwa 300 μM zugesetzt.

Erfindungsgemäß kann die Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium in vorteilhafter Weise auch durch den Zusatz von beispielsweise Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin einzeln oder in Kombinationen verbessert werden.

Erfindungsgemäß erfolgt die Fermentierung in Medium enthaltend Glukose als C-Quelle. In einer besonders vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Fermentierung in einem Medium enthaltend Glycerin als C-Quelle.

Bei der Fermentierung von Bacillus megaterium mit Glycerin als Kohlenstoffquelle wird generell eine höhere Zelldichte erreicht als mit Glucose. Interessanterweise führt dabei unter aeroben Fermentationsbedingungen die gemeinsame Zugabe von Cobalt und 5- Aminolävulinsäure zu einer höheren Vitamin B12 Produktion als in entsprechendem Medium ohne Zusätze.

Diese verbesserte Vitamin B12 Produktion kann erfindungsgemäß noch weiter gesteigert werden, indem die fermentierten Bacillus megaterium- Zellen von aeroben Wachstumsbedingungen zu anaeroben überführt werden. Auch hierbei hat sich erfindungsgemäß die Verwendung eines Kulturmediums enthaltend Glycerin, Cobalt und 5-Aminolävulinsäure als besonders vorteilhaft erwiesen. Bevorzugt erfolgt die Fermentierung unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von etwa 250 μM Cobalt; unter anaeroben Bedingungen ist ein Zusatz von etwa 500 μM Cobalt vorteilhaft.

Durch das Transferieren der Kulturen von aeroben zu anaeroben Wachstumsbedingungen ist eine Kombination von hohen Vitamin B 12- Gehalten mit hohen Zelldichten möglich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren, bei dem die Fermentierung in einem ersten Schritt unter aeroben und in einem zweiten Schritt unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird.

In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen. Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren dar, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung in der Mitte oder am Ende, bevorzugt am Ende, der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen erfolgt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei ein Verfahren, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte, wenigstens jedoch eine optische Dichte von etwa 2 bis 3 erreicht hat.

Unter anaeroben Bedingungen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. D. h., die Bakterien verbrauchen den in den Anaerobierflaschen vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semi-anaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt. Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi-anaerobe Bedingungen einstellen. In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden.

Erfindungsgemäß enthält das Fermentationsmedium als Kohlenstoffquelle Glukose. Eine vorteilhafte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Fermentierung von B. megaterium auf Medium enthaltend Glycerin. Weitere vorteilhafte Varianten beziehen sich auf ein Fermentationsmedium enthaltend Glukose oder Glycerin als C-Quelle und wenigstens Cobalt und/oder Cobalt und 5-Aminolävulinsäure als Zusatz. Durch das zweistufige Verfahren im Vergleich zur Produktion unter vollständig aeroben Bedingungen wird die Vitamin B12 Produktion um den Faktor von wenigstens 2,6 gesteigert wird. Enthält das Medium Glucose, Cobalt und 5-Aminolävulinsäure kann durch die zweistufige Fermentation die Vitamin B12 Produktion um den Faktor von wenigstens 2,2 gegenüber der Produktion unter vollständig aeroben Bedingungen gesteigert werden.

Um die Produktion von Vitamin B 12 darüber hinaus noch weiter zu steigern, können erfindungsgemäß auch gentechnisch veränderte Bacillus megaterium-Stämme eingesetzt werden. Solche genetisch veränderten Bakterienstämme können durch klassische Mutagenese oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u.a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin Bi₂-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechesflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z.B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc.. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt. Erfindungsgemäß umfaßt sind in diesem Zusammenhang auch Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.

Ferner sind entsprechende Polypeptide Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Aminosäuresequenz derart verändert sind, daß sie gegenüber regulatorisch wirkenden Verbindungen, beispielsweise die sie in ihrer Aktivität regulierenden Stoffwechsel-Endprodukte desensitiv sind (feedback-desensitiv).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B 12, bei dem ein Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen cobA-Gen verstärkt exprimiert wird und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegt. Hierdurch kann eine Steigerung um einen Faktor von wenigstens 2 erreicht werden.

Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die

Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die

Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise können Expressionskassetten wirken, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern.

Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Genstruktur enthaltend eine Nukleotidsequenz des Gens cobA aus B. megaterium kodierend für eine unter aeroben Bedingungen exprimierte S-Adenosylmethionin- Uroporphyrionogen Ill-Methyltransferase (SUMT) oder Teile davon, sowie operativ damit verknüpfte Nukleotidsequenzen mit regulatorischer Funktion.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier das ß-Galaktosidase- oder Arabinose-System genannt.

Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind.

Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Vektor enthaltend die Nukleotidsequenz des cobA-Gens oder Teile davon oder eine Genstruktur der zuvor genannten Art, sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, Replikation in der Wirtszelle und/oder Integration in das Wirtszellgenom. Geeignete Systeme für die Transformationen und Überexpressionen interessanter Gene in B. megaterium sind beispielsweise die Plasmide pWH1510 und pWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm ß. megaterium WH320, die bei Rygus, T. et al. (1991 , Inducible High-Level Expression of heterologous Genes in Bacillus megaterium Using the Regulatory Elements of the Xylose-Utilization Operon, Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 594-599) beschrieben sind. Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ferner der B. megaterium Stamm DSMZ509. Die genannten Systeme sind jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm zum Einsatz in ein Verfahren der zuvor genannten Art, der sich dadurch auszeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl der Nukleotidsequenz des Gens cobA kodierend für eine S-Adenosylmethionin-Uroporphyrionogen III- Methyltransferase aufweist.

Hierbei ist auch ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm erfindungsgemäß umfaßt, der in replizierender Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor genannten Art enthaltend das cobA-Gen kodierend für eine unter aeroben Bedingungen exprimierte S- Adenosylmethionin-Uroporphyrionogen Ill-Methyltransferase aus B. megaterium aufweist. Die Expression des cobA-Gens enthaltend in dem Genkonstrukt oder Vektor der zuvor genannten Art kann dabei sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen erfolgen.

Eingeschlossen sind erfindungsgemäß alle zur Vitamin B12 Produktion geeigneten B. megaterium Stämme. Dies können auch genetisch veränderte Bakterienstämme sein, die durch klassische Mutagenese oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt wurden oder werden.

Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u.a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B-12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin Bι₂-Produktion gesteuert werden kann.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist ein transformierter B. megaterium Stamm umfaßt, der sich dadurch auszeichnet, daß er erfindungsgemäß bei Fermentation unter aeroben Bedingungen gegenüber einem nicht-transformierten Stamm, d.h. einem Stamm, der nicht mit dem cobA-Gen, einem Genkonstrukt oder Vektor der zuvor genannten Art ausgestattet ist, eine gesteigerte Vitamin B12 Produktion aufweist.

Bevorzugt erfolgt bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens die Fermentierung des transformierten Bacillus megaterium Stamms in einem Medium enthaltend Glukose. Besonders bevorzugt ist ein Medium, das als C-Quelle Glycerin enthält. Eine weitere vorteilhafte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Fermentierung in Medium, das neben Glukose oder Glycerin zusätzlich wenigstens Cobalt und/oder Cobalt und 5-Aminolävulinsäure enthält. Erfindungsgemäß vorteilhaft für die Herstellung von Vitamin B12 ist auch hier die zweistufige Fermentierung eines transformierten B. megaterium Stammes.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der Nukleotidsequenz des Gens cobA kodierend für eine S- Adenosylmethionin-Uroporphyrionogen Ill-Methyltransferase aus B. megaterium zur Herstellung eines transformierten Bacillus megaterium- Stammes der zuvor genannten Art. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch die Verwendung eines transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor genannten Art zur Herstellung von Vitamin B12.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung und wirken sich nicht limitierend auf die Erfindung aus:

1. Bakterienstämme und Plasmide

Alle in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt.

2. Puffer und Lösunqen

2.2. Minimalmedien

Mopso-Minimalmedium

Mopso (pH 7.0) 50.0 mM

Tricin (pH 7.0) 5.0 mM

MgCI₂ 520.0 μM

K₂SO₄ 276.0 μM

FeSO₄ 50.0 μM

CaCI₂ 1.0 mM

MnCI₂ 100.0 μM

NaCI 50.0 mM

KCI 10.0 mM mM (NH₄)₆Mo₇O₂₄ 30.0 pM H₃BO₃ 4.0 nM C0CI₂ 300.0 pM CuSO₄ 100.0 pM

ZnSO₄ 100.0 pM D-Glucose 20.2 mM NH₄CI 37.4 mM Titrationsreagenz war KOH-Lösung.

Salmonella typhimurium-Minimalmedium

NaCI 8.6 mM

Na₂HPO₄ 33.7 mM KH₂PO₄ 22.0 mM NH CI 18.7 mM D-Glucose 20.2 mM MgSO₄ 2.0 mM CaCI₂ 0.1 mM Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt.

2.2. Lösunqen zur Protoplastentransformation von Bacillus megaterium SMMP-Puffer

Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g/ι

Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCI₂ 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.

PEG-P-Lösuno

PEG 6000 40.0

% (w/v) Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCI₂ 20.0 mM

Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. cR5 Top-Agar

Saccharose 300.0 mM Mops (pH 7.3) 31.1 mM NaOH 15.0 mM L-Prolin 52.1 mM

D-Glucose 50.5 mM K₂SO₄ 1.3 mM MgCI₂ x 6 H₂O 45.3 mM μM CaCI₂ 13.8 mM

Agar-Agar 4.0

% (w/v) Casaminoacids 0.2 % (w/v) Hefe-Extrakt 10.0 % (w/v)

Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. 2.3. Lösunqen zur Präparation von chromosomaler Bacillus megaterium DNA

Saline EDTA (S-EDTA)

EDTA 80.0 mM

NaCI 150.0 mM

0.1 x SSC-Lösung tri-Natriumcitrat Dihydrat 1.5 mM NaCI 15.0 mM mit HCI auf pH 7.0 einstellen.

2.3. Lösunqen und Marker zur Aqarose-Gelelektrophorese

TAE-Puffer

Tris-Acetat (pH = 8.0) 40.0 mM EDTA 1.0 mM

Probenpuffer

Bromphenolblau 350 μM

Xylen Cyanol FF 450 μM Orange G 0.25

% (w/v) Saccharose in Wasser 115.0 mM Ethidiumbromidlösung

Ethidiumbromid in Wasser 0.1

% (w/v)

GeneRuler DNA Ladder Mix

Der Marker enthält die folgenden Fragmente (in Basenpaaren, bp): 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1200, 1031 , 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100

Lambda DNA/Eco91l (BstEII) Marker

Komplett mit Eco911 verdaute λ-DNA in Wasser. Der Marker enthält die folgenden Fragmente (in Basenpaaren, bp): 8453, 7242, 6369, 5687, 4822, 4324, 3675, 2323, 1929, 1371 , 1264, 702, 224, 117

2.4. Lösunqen und Marker zur SDS-Polvacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Acrylamid-Stammlösung

Acrylamid 39.0

% (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid 1.0

% (w/v) Lösungsmittel war Wasser.

Sammelgelpuffer

SDS 0.4

% (w/v) Tris-HCI (pH 6.8) 1.5

% (w/v) Lösungsmittel war Wasser.

Trenngelpuffer

SDS 0.4 % (w/v)

Tris-HCI (pH 8.8) 1.5

% (w/v) Lösungsmittel war Wasser.

APS-Lösung

Ammoniumperoxodisulfat (APS) 10.0

% (w/v) Lösungsmittel war Wasser.

Sammelgel [6%ig (w/v), für 5 Minigele]

Acrylamid-Stammlösung 1.5 ml Sammelgelpuffer 2.5 ml deion. Wasser 6.0 ml TEMED 10.0 μl APS-Lösung 100.0 μl

Trenngel [12%ig (w/v), für 5 Minigele]

Acrylamid-Stammlösung 6.0 ml Trenngelpuffer 5.0 ml deion. Wasser 9.0 ml TEMED 20.0 μl APS-Lösung 200.0 μl

Elektrophoresepuffer

Glycin 385.0 mM

SDS 0.1 %

(w/v)

Tris-HCI (pH 8.8) 50.0 mM Lösungsmittel war Wasser.

Probenpuffer

Glycerin 40.0 %

(w/v) ß-Mercaptoethanol 2.0 mM SDS 110.0 mM Bromphenolblau 3.0 mM

Tris-HCI (pH 6.8) 100.0 mM

Färbelösung Essigsäure 10.0 %

(v/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 1.0 g/ι

Lösungsmittel war Wasser.

Entfärbelösung

Ethanol 30.0

% (v/v)

Eisessig 10.0

% (v/v)

Lösungsmittel war Wasser.

Dalton Mark VII

(angegeben ist jeweils die relative molare Masse M_r) α-Lactalbumin 14200

Trypsin Inhibitor 20100

Trypsinogen 24000

Carboanhydrase 29000

Glyceraldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase 36000

Ovalbumin 45000

Rinderserumalbumin 66000

2.5. Lösunqen für Proteinexpressionsexperimente

Aufschlußpuffer

EDTA (pH 6.5) 20.0 mM

Na₃PO₄ 100.0 mM

Lysozym 5 mg/ml

Titrationsreagenz war H₃PO₄-Lösung. 2.6. Lösunqen zur Southern Blot-Analyse Denaturierungslösung

NaOH 500.0 mM

NaCI 1.5

M

Neutralisierungslösung Tris-HCI (pH 7.2) 400.0 mM NaCI 1.5

M

20 x SSC-Lösung tri-Natriumcitrat Dihydrat 300.0 mM NaCI 3.0

M mit HCI auf pH 7.0 einstellen.

10 % Blocking-Reagenz

Milchpulver in Puffer 1 100

Puffer-1 (Maleinsäurepuffer)

Maleinsäure (pH 7.5) 100.0 mM NaCI 150.0 mM NaOH 200.0 mM mit HCI auf pH 7.0 einstellen.

Puffer-2

10%ige Blockingisg. in Puffer-1 100 g/ι

Puffer-3 (Detektionspuffer) Tris-HCI (pH 9.5) 77.0 mM NaCI 100.0 mM

Wasch-Puffer

Tween20 in Puffer 1 3 ml/l

Prähybridisierungslösung 20 x SSC 250 ml/l N-Lauroylsarcosin 3.7 mM 10%ig SDS 2 ml/l

20%ige Blockinglösung 100 ml/l

Hvbridisierungslösung 20 x SSC 250 ml/l N-Lauroylsarcosin 3.7 mM 10%ig SDS 2 ml/l 20%ige Blockinglösung 100 ml/l Sondenlösung 5 ml/l

3. Medien und Medienzusätze 3.1. Medien

Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook J. et. al (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, gearbeitet. Für feste Medien wurden zusätzlich 15 g Agar pro Liter zugesetzt.

3.2. Zusätze

Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren, Antibiotika oder Salze wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen mit diesen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50 °C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende: ALA 298 μM Ampicillin 296 μM Casaminoacids 0.025

% (w/v) C0CI₂ (in aeroben Kulturen) 250 μM C0CI2 (in anaeroben Kulturen) 500 μM

Cystein 285 μM Glucose 22 mM Glycerin 217 mM Lysozym 1 mg/ml Methionin 335 μM

Tetracyclin (in festen Medien) 23 μM Tetracyclin (in flüssigen Medien) 68 μM Xylose 33 mM 4. Mikrobiologische Techniken

4.1. Sterilisation

Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für 20 min bei 120 °C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert

(Porendurchmesser des Filters 0.2 μm), Glaswaren mindestens 3 h bei 180 °C hitzesterilisiert.

4.2. Allgemeine Wachstumsbedin unqen für Bakterien-Flüssiqkulturen Mit einer sterilen Impföse wurden von einer LB-Agar-Platte oder aus einer Glycerinkultur Bakterien entnommen und in das Nährmedium gegeben, welches bei Bedarf ein Antibiotikum enthielt.

Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37 °C und einer Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert.

4.3. Wachstumsbedinqunqen für Bacillus megaterium

Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 150 ml in 150 ml Anaerobenflaschen bei 37

°C und 100 rpm kultiviert. In beiden Fällen wurde auf eine Animpfung im

Verhältnis 1:100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet. Um höhere Ausbeuten an Zellmasse unter anaeroben Bedingungen zu erzielen, wurden ß. megaterium Kulturen aerob vorinkubiert und bei einer

Wunschdichte auf anaerobe Wachstumsbedingungen umgestellt, ß. megaterium wurde dazu zunächst in Shikanekolben bei 250 rpm und 37

°C inkubiert. In der Mitte des exponentiellen Wachstums bzw. zum Anfang der stationären Phase wurde die gesamte Kultur in eine 150 ml Anaerobenflasche überführt und weiterhin bei 37 °C und 100 rpm kultiviert.

4.4. Plattenkulturen von Bakterien Mit einer sterilen Impföse wurden aus einer Glycerinkultur Bakterien entnommen und auf einer LB-Agar-Platte, die bei Bedarf mit einem entsprechenden Antibiotikum versetzt war, fraktioniert ausgestrichen, so dass nach einer Inkubation bei 37 °C über Nacht einzelne Kolonien auf der Platte zu sehen waren. Wenn Bakterien aus einer Flüssigkultur verwendet wurden, so wurden diese auf der LB-Agar-Platte mit einem Drygalski-Spatel ausgestrichen und anschließend über Nacht bei 37 °C inkubiert.

4.5. Bestimmung der Zelldichte

Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, dass einer OD₅ e von eins eine Zellzahl von 1x10⁹ Zellen entspricht.

4.6. Lagerung von Bakterien

Zur längerfristigen Aufbewahrung von Bakterien wurden sogenannte Glycerinkulturen hergestellt. Dazu wurden 850 μl einer Bakterien- Übernachtkultur mit 150 μl sterilem 85%igem Glycerin gründlich vermischt und danach bei -80 °C gelagert.

5. Molekularbiologische Methoden

Die Isolierung von DNA sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung, Sequenzierung, PCR etc. sind gängige Laborpraxis und in dem Standardwerk für molekularbiologische Methoden von Sambrook J. er al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben.

5.1. Klonierung von cobA in PWH1520 Als Klonierungs- und Expressionsvektor fungierte pWH1520 (Rygus et al., 1991). Das pBR322-Derivat weist eine Tetracyclin- und eine Ampicillinresistenz, sowie die für die Replikation in E. coli und Bacillus ssp. wichtigen Elemente auf. Somit ist dieses System zugänglich für alle in E. coli etablierten Klonierungs-Techniken und kann gleichzeitig zur Genexpression in B. megaterium genutzt werden. Der Vektor enthält die ß. megaterium xylA- und xy/f?-Gene des xyl Operons mit den zugehörigen regulatorischen Sequenzen (Rygus et al., 1991). Das xylA-Gen codiert für die Xyloseisomerase, während xylR für ein Regulatorprotein codiert, das eine starke transkriptioneile Kontrolle auf den xylA Promotor ausübt. Das xylA-Gen wird in Abwesenheit von Xylose durch XylR reprimiert. Bei einer Xylose-Zugabe kommt es zu einer ca. 200-fachen Induktion durch Derepression von xylA. Ein Polylinker des Plasmid im xyM-Leseraster ermöglicht eine Fusion von Ziel-Genen mit xylA, die dann ebenfalls unter der starken transkriptioneilen Kontrolle von XylR stehen. Dabei kann man zwischen den Alternativen zur Bildung einer Transkriptions- oder Translationsfusion wählen, da das xyΛA-Leseraster stromaufwärts des Polylinkers noch vollkommen intakt ist.

Zur Konstruktion eines coM-Überexpressionsklons wurde die bekannte Sequenz (Robin et al., 1991) dem ß. megaterium Genom entnommen. Es wurden daraus PCR-Primer abgeleitet, die eine Translationsfusion von CobA mit der Xyloseisomerase erlauben. Damit wird die Ribosomen- Bindesequenz des xyM-Gens innerhalb des Expressionsvektors pWH1520 genutzt. Es wurden eine Spei- und eine BamH\- Schnittstelle in die PCR-Primer integriert und die gewünschte coM-Sequenz aus genomischer ß. megaterium DNA per PCR amplifiziert. Sowohl die amplifizierte Gensequenz, als auch der Überexpressionsvektor pWH1520 wurden daraufhin jeweils mit Spei und BamH\ geschnitten und die so entstandenen kohäsiven Enden ligiert. Es konnten Klone isoliert werden, die nach Verdau mit Spei und BamH\ Inserts der gewünschten Größe aufwiesen. Die Integrität der klonierten DNA wurde durch komplette DNA- Sequenzbestimmung überprüft. Die Klonierungsstrategie ist in Figur 5 schematisch dargestellt.

5.2. Herstellung kompetenter Zellen

Zur Herstellung von kompetenten E. coli- sowie ß. megaterium-ZeWen wurden 500 ml Flüssigkulturen mit LB-Medium bis zu einer OD₅₇₈ von 0.5- 1 kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (4000 x g; 15 min; 4 °C). Das Zellsediment wurde in sterilem, deionisiertem Wasser gut resuspendiert, abzentrifugiert (4000 x g; 8 min; 4 °C), erneut mit sterilem, deionisiertem Wasser gewaschen und wieder zentrifugiert (4000 x g; 8 min; 4 °C). Nach Waschen des Sediments mit 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung wurde abzentrifugiert (4000 x g; 8 min; 4 °C) und das Sediment in so wenig wie möglich 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung resuspendiert. Die kompetenten E. coli- sowie ß. megaterium-ZeWen wurden sofort für die Transformation verwendet.

5.3. Transformation von Bakterien durch Elektroporation

Die Transformation erfolgte durch Elektroporation mit Hilfe eines Gene Pulsers mit angeschlossenem Pulse Controller (BioRad). Dazu wurden je 40 μl kompetente E. coli- bzw. ß. megater/um-Zellen und 1 μg Plasmid- DNA in eine Transformationsküvette überführt und im Gene Pulser einer Feldstärke von 12 kV/cm bei 25 μF und einem parallelen Widerstand von 200 Ω ausgesetzt.

Zur anschließenden Regeneration wurden die transformierten Zellen sofort nach der Transformation in 1 ml LB-Medium eine halbe, im Falle von ß. megaterium eine Stunde bei 37 °C auf dem Thermoschüttler inkubiert. Von den Ansätzen wurden anschließend verschiedene Volumina auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

5.4. Protoplastentransformation von Bacillus megaterium Protoplastenpräparation

50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von ß. megaterium angeimpft und bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD_{5 8} von 1 wurden die Zellen abzentrifugiert (10000 x g; 15 min; 4 °C) und in 5 ml frisch hergestellten SMMP-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37 °C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation (3000 x g; 8 min; Rt) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10 % (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80 °C eingefroren werden.

Transformation 500 μl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 μg DNA in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension zentrifugiert (3000 x g; 5 min; Rt). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 μl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50 - 200 μl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach eintägiger Inkubation bei 37 °C sichtbar. 5.5. Quantitative Vitamin Bι?-Analvse

Zur quantitativen Vitamin Bi₂-Bestimmung wurden in verschiedenen Wachstumsphasen Proben von B. genommen. Nach Bestimmung der OD₅₇₈ wurden die Zellen durch Zentrifugieren (4000 x g; 15 min; 4 °C) vom Medium abgetrennt. Nach Waschen mit 40 ml isotonischer NaCI-Lösung wurde erneut zentrifugiert (4000 x g; 15 min; 4 °C). Die erhaltenen Zellsedimente sowie die abgenommenen Medien wurden anschließend gefriergetrocknet. S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37 °C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer NaCI-Lösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48 °C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt.

10 μl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten ß. megaterium-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37 °C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellen Kolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin B₁₂ der aufgetragenen ß. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01 , 0.1 , 1 , 10 und 40 pmol Vitamin B-ι₂, wurde auf den Gehalt an Vitamin B₁₂ in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B₁₂- Mengen in biologischen Materialien.

5.6. Präparation chromosomaler Bacillus megaterium DNA

Zur Gewinnung von chromosomaler DNA wurden 150 ml LB-Medium mit ß. megaterium angeimpft und über Nacht bei 37 °C und 250 rpm inkubiert. Die Kultur wurde zentrifugiert (4000 x g; 10 min; 4 °C) und das Bakterien- Sediment in 13 ml S-EDTA resuspendiert. Zur Suspension wurde eine Spatelspitze Lysozym, die zuvor in 1 ml S-EDTA gelöst worden war, hinzugegeben. Zur Lösung wurde weiterhin 800 μl 25%ige SDS-Lösung gegeben und 30 min bei 37 °C im Thermoschüttler inkubiert. Nach einer Stunde bei 65 °C wurde die Lösung mit 3.2 μl 5 M Natriumperchlorat und 20 ml Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (24:1) versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei 0 °C geschüttelt und anschließend zentrifugiert (12000 x g; 10 min; 4 °C). Die obere DNA-haltige Phase wurde vorsichtig abgenommen, in einen 50 ml Meßzylinder überführt und langsam mit 30 ml Ethanol überschichtet. Die an der Phasengrenze ausfallende chromosomale DNA wurde durch rotierende Bewegung auf einen Glasstab aufgewickelt und in 5 ml 0.1 x SSC-Lösung abgewickelt.

6. Proteinexpression

6.1. Überexpression von S-Adenosyl-L-Methionin-Uroporphyrinogen III- Methyltransferase (SUMT) in Bacillus megaterium

150 ml LB-Medium wurden mit 1.5 ml einer ß. megaterium Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C aerob inkubiert. Expressionsplasmid pWH1520-cobA enthaltende Bakterien wurden durch Tetracyclinzugabe selektioniert. Nach Erreichen einer OD_{5 8} von 0.3 wurde der xy/-Promotor des Expressionsplasmides durch Zugabe von 0.5 % (w/v) Xylose induziert. Vor der Induktion, sowie stündlich nach der Induktion, wurde jeweils eine Probe von 2 ODs ₈-Äquivalenten abgenommen. Die entnommenen Proben wurden zentrifugiert (12000 x g; 3 min; Rt) und die sedimentierten Zellen in 40 μl Aufschlußpuffer resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension 30 min bei 37 °C inkubiert. 20 μl des Aufschlusses wurden mit 5 μl SDS-PAGE- Probenpuffer versetzt und nach 15 minütigem Kochen im Wasserbad 30 min bei 15000 rpm zentrifugiert (8000 x g; 10 min; Rt). Der Überstand wurde durch eine SDS-PAGE analysiert. Legende zu den Figuren

Es wurden Bakterienstämme und Plasmide gemäß den Tabellen 1 und 2 eingesetzt. Tabelle 1 : Verwendete Bakterienstämme Tabelle 2: Verwendete Plasmide

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert.

Figur 1 zeigt die Vitamin Bi₂-Produktion von ß. megaterium DSM509 unter aeroben Wachstumsbedingungen in Mopso-Minimalmedium. Es ist der Gehalt an Vitamin B-ι₂ in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben für Glucose ohne Zusätze (1), Glucose unter Zugabe von 250 μM C0CI₂ (2), Glucose unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM C0CI₂ (3), Glycerin ohne Zusätze (4), Glycerin unter Zugabe von 250 μM C0CI₂ (5), Glycerin unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM C0CI2 (6).

Figur 2 zeigt den Vergleich der Vitamin B-ι₂-Produktion von ß. megaterium DSM509 unter aeroben sowie zum anaeroben transferierten Wachstumsbedingungen jeweils mit Zusatz von 298 μM ALA und 250 μM C0CI₂ (aerob) bzw. 500 μM C0CI₂ (anaerob). Es ist der Gehalt an Vitamin B₁₂ in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben für Kulturen mit Glucose unter aeroben Bedingungen (1), Glucose zur Mitte der exponentiellen Phase transferiert (OD₅₇₈ = 3.0) (2), Glucose am Ende der exponentiellen Phase transferiert (OD₅₇₈ = 5.9) (3), Glycerin unter aeroben Bedingungen (4), Glycerin zur Mitte der exponentiellen Phase transferiert (OD₅₇₈ = 4.7) (5), Glycerin am Ende der exponentiellen Phase transferiert (OD₅₇₈ = 12.0) (6). Figur 3 zeigt die Vitamin Bι₂-Produktion des transformierten ß. megater/ι/m-Stammes DSM509 pWH1520-co in Vergleich mit ß. megaterium DSM509 unter aeroben Wachstumsbedingungen in LB- Medium. Es ist der Gehalt an Vitamin B₁₂ in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben für:

DSM509: ohne Zusätze (1), unter Zugabe von 250 μM CoCI₂ (2), unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI₂ (3).

DSM509-pWH1520-cooA ohne Zusätze (4), unter Zugabe von 250 μM CoCI₂ (5), unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCI₂ (6).

Figur 4 zeigt den Vergleich der Vitamin B₁₂-Produktion von ß. megaterium DSM509 pWH1520-coM in LB-Medium unter aeroben (1), anaeroben (2), sowie zum anaeroben transferierten Wachstumsbedingungen (3). Der Transfer erfolgte am Ende der exponentiellen Phase bei einer OD₅₇₈ von 6.9. Es ist der Gehalt an Vitamin B₁₂ in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben. Alle Kulturen enthielten einen Zusatz von 298 μM ALA und 250 μM CoCI₂.

Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung der Klonierung des cobA- Gens aus B. megaterium in den Überexpressionsvektor pWH1520. Das durch PCR amplifizierte Gen und der Vektor wurden jeweils mit Spei und BamHI geschnitten und die entstandenen kohäsiven Enden zu einer xylA- cobA-Translationsfusion innerhalb des neu entstandenen Überexpressionsvektors pWH1520-cobA ligiert.

Claims

Ansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend Bacillus megaterium, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung unter aeroben Bedingungen in einem Medium enthaltend wenigstens Cobalt und/oder wenigstens Cobalt und 5- Aminolävulinsäure durchgeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cobalt in Konzentrationen im Bereich von etwa 200 bis 750 μM, vorzugsweise von etwa 250 bis 500 μM zugesetzt wird.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß 5-Aminolävulinsäure in Konzentrationen im Bereich von etwa 200 bis 400 μM, vorzugsweise von etwa 300 μM zugesetzt wird.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung in einem Medium enthaltend Glycerin als C-Quelle durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung in einem ersten Schritt unter aeroben und in einem zweiten Schritt unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen erfolgt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung in der Mitte oder am Ende, bevorzugt am Ende der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen erfolgt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte oder wenigstens eine optische Dichte im Bereich von etwa 3 bis

12 erreicht hat.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bacillus megaterium-Stamm, dessen cobA- Gen verstärkt exprimiert wird und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegt, fermentiert wird.

10. Transformierter Bacillus megaterium-Stamm zum Einsatz in ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte

Kopienzahl der Nukleotidsequenz des Gens cobA kodierend für eine S-Adenosylmethionin-Uroporphyrionogen Ill-Methyltransferase aus B. megaterium aufweist.

1 1.Verwendung der Nukleotidsequenz des Gens cobA kodierend für eine unter aeroben Bedingungen exprimierte S-Adenosylmethionin- Uroporphyrionogen Ill-Methyltransferase aus B. megaterium zur Herstellung eines transformierten Bacillus megaterium-Stammes gemäß Anspruch 10.

2. Verwendung des transformierten Bacillus megaterium-Stammes gemäß Anspruch 10 zur Herstellung von Vitamin B12.