EP1458890A2 - Sequenzierung über lochmembranen - Google Patents

Sequenzierung über lochmembranen

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Publication number
EP1458890A2
EP1458890A2 EP02793068A EP02793068A EP1458890A2 EP 1458890 A2 EP1458890 A2 EP 1458890A2 EP 02793068 A EP02793068 A EP 02793068A EP 02793068 A EP02793068 A EP 02793068A EP 1458890 A2 EP1458890 A2 EP 1458890A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecules
building blocks
membrane structure
channel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02793068A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rudolf Rigler
Horst Vogel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gnothis Holding SA
Original Assignee
Gnothis Holding SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gnothis Holding SA filed Critical Gnothis Holding SA
Publication of EP1458890A2 publication Critical patent/EP1458890A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for sequencing nucleic acid molecules over a perforated membrane.
  • the invention can be used for multiplex sequencing.
  • Another approach is single-molecule sequencing (Dörre et al., Bioimaging 5 (1 997), 1 39-1 52), in which the sequence of nucleic acids is achieved by the progressive enzymatic degradation of fluorescence-labeled single-stranded DNA molecules and detection of the sequentially released monomer molecules in one Microstructure channel takes place.
  • the advantage of this method is that only a single molecule of the target nucleic acid is sufficient to carry out a sequence determination.
  • the object underlying the present invention was therefore to provide a method for sequencing nucleic acids which represents a further improvement over the prior art and which enables parallel determination of individual nucleic acid molecules in a multiplex format.
  • nucleic acid molecule to be sequenced which contains a plurality of fluorescent labeling groups (b) providing a membrane structure through which at least one channel is passed, which has a diameter suitable for the passage of a single nucleic acid molecule, an enzyme, which catalyzes cleavage of individual nucleotide building blocks from a nucleic acid molecule on which the membrane structure is immobilized,
  • the method according to the invention is a carrier-based sequencing method in which a free nucleic acid molecule to be sequenced is passed into and preferably through a channel in a membrane structure, and is brought into contact with an enzyme during the passage through the channel or preferably during the exit from the channel which catalyzes the cleavage of individual nucleotide building blocks from the nucleic acid molecule.
  • the enzyme is immobilized on the membrane structure, preferably in the area of the outlet openings from the channel.
  • the membrane structure preferably contains a multiplicity of channels and can thus be used for the simultaneous determination of the base sequence of several nucleic acid molecules.
  • the membrane structure can be of any shape and composition, provided that it is suitable for immobilizing enzymes and for forming nanochannels for the passage of the nucleic acid molecules to be sequenced.
  • suitable materials are glass, plastic, metals or semimetals, such as silicon, metal oxides, such as silicon oxide, quartz, etc.
  • composite materials for example made of two or more of the aforementioned materials, are also suitable.
  • the enzyme molecules are immobilized on the membrane structure, in particular in the region of the outlet openings of the channels, by known methods.
  • the enzyme molecules can be bound to the membrane by covalent or non-covalent interactions.
  • the binding of the enzyme molecules to the membrane structure through high affinity interactions between the Partners of a specific binding pair, e.g. biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten antibodies, sugar / lectin etc.
  • biotinylated enzyme molecules can be coupled to streptavidin-coated membrane structures.
  • the enzyme molecules can also be bound to the membrane structure by adsorption.
  • enzyme molecules modified by incorporation of alkanethiol groups can bind to metallic supports, for example gold supports.
  • covalent immobilization where the binding of the enzyme molecules can be mediated using suitable (hetero) bifunctional coupling reagents.
  • the method according to the invention is preferably carried out as a multiplex method for sequencing a plurality of nucleic acid molecules.
  • a membrane structure that contains several channels is advantageously used for this purpose.
  • the average diameter of the channels is preferably in the range of 10-100 nm in order to allow the passage of individual nucleic acid molecules to be sequenced.
  • Preferably at least 10, more preferably at least 20, particularly preferably at least 100 and most preferably 1000 or more nucleic acid molecules are sequenced in parallel.
  • the nucleic acid molecules to be sequenced have a length of preferably at least 100 nucleotides, particularly preferably at least 200 nucleotides.
  • the nucleic acid molecules can have any length, for example several KB or even longer. The maximum length is only determined by the lifespan of the immobilized enzyme.
  • the nucleic acid molecules for example DNA molecules or RNA molecules, contain several fluorescent labeling groups, preferably at least 50%, particularly preferably at least 70% and most preferably essentially all, for example at least 90%, of the nucleotide building blocks of one base type carrying a fluorescent labeling group. so Labeled nucleic acids can by enzymatic primer extension on a nucleic acid template using a suitable polymerase, e.g. B.
  • DNA polymerase such as Taq polymerase, a thermostable DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1 999), 3600-3605) or a mutated Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-51 00) using fluorescence-labeled nucleotide building blocks.
  • the labeled nucleic acid molecules can also be amplified by e.g. PCR. In the case of an asymmetrical PCR, this results in amplification products in which only one strand contains fluorescent labels. Such asymmetrical amplification products can be sequenced in double-stranded form. Nucleic acid fragments in which both strands are fluorescence-labeled are produced by symmetrical PCR. These two fluorescence-labeled strands can be introduced into the sequencing device separately and separately in single-strand form, so that the sequence of one or both complementary strands can be determined separately. Alternatively, one of the two strands at the 3 'end can be modified in this way, e.g. by installing a PNA clamp, so that it is no longer possible to split off monomer components. In this case, double-strand sequencing is possible.
  • nucleotide building blocks of at least two base types for example two, three or four base types, carry a fluorescent label, each base type advantageously carrying a different fluorescent label group.
  • the sequence can still be determined completely by parallel sequencing of several molecules.
  • the nucleic acid template, the sequence of which is to be determined can be selected, for example, from DNA templates, such as genomic DNA fragments, cDNA molecules, plasmids, etc., but also from RNA templates, such as mRNA molecules.
  • the fluorescent labeling groups can be from known for labeling Biopo l y m e r e n, z.
  • Fluorescent labeling groups such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof, etc., can be selected.
  • the method according to the invention is preferably based on the fact that fluorescent labeling groups built into nucleic acid strands interact with neighboring groups, for example with chemical groups of the nucleic acids, in particular nucleobases such as G, and / or neighboring fluorescent labeling groups, which lead to a change in the fluorescence, in particular the fluorescence intensity, compared to that Lead fluorescent labeling groups in "isolated" form due to quenching and / or energy transfer processes.
  • the cleavage of individual nucleotide building blocks changes the total fluorescence, for example the fluorescence intensity of a nucleic acid strand, depending on the cleavage of individual nucleotide building blocks, ie depending on the time.
  • This temporal change in fluorescence can be recorded in parallel for a large number of nucleic acid molecules and correlated with the base sequence of the individual nucleic acid strands.
  • those fluorescent labeling groups are used which, when incorporated into the nucleic acid strand, are at least partially quenched, so that after the nucleotide building block containing the labeling group or an adjacent building block which causes quenching has been cleaved off, the fluorescence intensity is increased.
  • the sequencing reaction of the method according to the invention comprises the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the nucleic acid molecules passed through the channel by immobilized enzymes.
  • An enzymatic cleavage is preferably carried out using an exonuclease, single-strand or double-strand exonucleases which degrade in the 5 ' ⁇ 3' direction or 3 ' ⁇ 5' direction - depending on the type of immobilization of the nucleic acid strands on the support can be.
  • T7 DNA polymerase, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III are particularly preferably used as exonucleases.
  • a change in the fluorescence intensity of the immobilized nucleic acid strand and / or of the cleaved nucleotide building block can be measured due to quenching or energy transfer processes.
  • This change in the fluorescence intensity over time depends on the base sequence of the nucleic acid strand under investigation and can therefore be correlated with the sequence.
  • a plurality of nucleic acid strands labeled on different bases for example A, G, C and T or combinations of two different bases, are preferably generated by enzymatic primer extension, as described above, and successively through a channel or / and passed through different channels of the membrane structure.
  • a "sequence identifier" ie a labeled nucleic acid of a known sequence
  • a "sequence identifier" ie a labeled nucleic acid of a known sequence
  • ligase or / and terminal transferase can be added to the nucleic acid strand to be examined, for example by enzymatic reaction with ligase or / and terminal transferase, so that at the beginning of the sequencing a known fluorescence pattern first and only then that of the unknown fluorescence pattern corresponding to the sequence to be investigated is obtained.
  • the nucleic acid molecules to be sequenced can, for example, be passed through the channels of the membrane structure by means of a hydrodynamic and / or electroosmotic flow. It is particularly preferred to conduct the nucleic acid molecules to be sequenced by applying an electric field across the membrane, with a migration from - to + taking place under physiological conditions due to the negative charge of the nucleic acid molecules.
  • Detection preferably comprises multi-point fluorescence excitation by laser, e.g. a dot matrix of laser dots generated by one
  • Diffraction optics or a quantum well laser Diffraction optics or a quantum well laser.
  • the fluorescence emission of several nucleic acid strands generated by excitation can be generated by a detector matrix, for example an electronic one
  • Detector matrix e.g. a CCD camera or an avalanche photodiode matrix.
  • the detection can be carried out in such a way that
  • Nucleic acid strands are carried out in parallel. Alternatively, several can
  • Submatrix of laser points and detectors preferably using a high speed scanner procedure.
  • the invention furthermore relates to a carrier for sequencing nucleic acids, comprising a membrane structure through which at least one channel passes, an enzyme which catalyzes the cleavage of individual nucleotide building blocks from a nucleic acid molecule being immobilized on the membrane structure in the region of the channel or channels ,
  • the diameter of the channel is such that individual nucleic acid molecules can pass through.
  • the diameter is preferably between 10 to 100 nm.
  • the membrane structure preferably contains a plurality of channels for the parallel sequencing of a plurality of identical or / and different nucleic acid molecules.
  • Another object of the invention is a device for sequencing nucleic acids comprising:
  • (c) Means for the simultaneous determination of the base sequence of a plurality of nucleic acid molecules on the basis of the time-dependent change in the fluorescence of the nucleic acid molecules or / and of the split off nucleotide building blocks caused by the cleavage of nucleotide building blocks.
  • the method according to the invention can be used, for example, for the analysis of genomes and transcriptomes or for differential analyzes, e.g. Studies on the difference in the genome or transcriptome of individual species or organisms within a species can be used.
  • FIG. 1 shows the schematic representation of an embodiment of the method according to the invention.
  • a membrane structure (2) contains a nanochannel (4) for the passage of individual N u kl one-acid mole coolers (6).
  • the direction of the nucleic acid molecules through the channel is indicated by an arrow (A).
  • A an electric field can be created across the membrane.
  • exonuclease molecules (8) immobilized on the membrane structure (2).
  • the exonuclease molecules (8) are arranged in particular in the region of the channel openings.
  • the exonuclease molecules (8) cleave those that pass through the channel (4) Nucleic acid molecules (6), splitting pieces (for example 10) being formed.
  • the fluorescence of the nucleic acid molecules (6) and / or the split pieces (1 0) is detected by fluorescence excitation (represented by arrow B, for example) and measurement of the emitted fluorescence light.
  • FIG. 2 shows a preferred embodiment of the method according to the invention for multiplex sequencing.
  • the membrane structure (1 2) contains a multiplicity of channels (14 a, 14 b, 1 4 c) which can serve for the parallel sequencing of identical or different nucleic acid molecules (1 6 a, 1 6 b, 1 6 c).
  • Exonuclease molecules (1 8 a, 1 8 b, 1 8 c) are immobilized at the channel openings. Sequencing can be performed using a light source matrix, e.g. several laser beams or a laser beam split by a diffraction element, and / or a detector matrix.
  • FIG. 3 shows a plan view of a membrane structure (22) suitable for multiplex sequencing and having a plurality of channels (24 a, 24 b, 24c). At least in the area of the channel openings, exonuclease molecules (28 a, 28 b, 28 c) are immobilized on the membrane structure (22). When the nucleic acid molecules to be sequenced (not shown) pass through the channel openings, fluorescence-labeled nucleotide units are split off. The release of the nucleotide building blocks increases the fluorescence intensity due to the decrease in the quenching, so that a characteristic photon flow arises for each base, which is characterized by a specific wavelength ⁇ or / and a lifetime r and can be registered by a detector matrix.
  • a multi-layer carrier comprises a membrane structure composed of a plurality of layers (32, 34), comprising a first layer (32) with a first channel (36), one for the passage of several nucleic acid molecules has a sufficient diameter of, for example, 500 to 2000 and in particular approximately 1000 nm.
  • the second layer (34) which is designed as a cover membrane over the first layer and has one or more second channels (38 a, 38 b), one for passage individual nucleic acid molecules have a suitable diameter of, for example, 10 to 100 nm.
  • first channel (36) several identical or different nucleic acid molecules to be sequenced can be passed simultaneously onto the second layer (34) of the membrane structure and individually into the second channels (38 a, 38 b) and then - as explained above - by splitting off individual nucleotide building blocks be sequenced.
  • sequencing can also be carried out using an evanescence-based method. That from an excitation light source, e.g. A laser-derived excitation light is radiated into an optically transparent layer of the membrane, which serves as a carrier for the evanescent wave. In the area of the channels, photons are scattered, which can excite the resulting fission products to fluoresce. The detection is carried out by the fluorescence emission light radiated essentially perpendicularly from the carrier.
  • an excitation light source e.g.
  • a laser-derived excitation light is radiated into an optically transparent layer of the membrane, which serves as a carrier for the evanescent wave.
  • photons are scattered, which can excite the resulting fission products to fluoresce.
  • the detection is carried out by the fluorescence emission light radiated essentially perpendicularly from the carrier.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen über eine Lochmembran. Insbesondere kann die Erfindung zur Multiplex-Sequenzierung eingesetzt werden.

Description

Sequenzierung über Lochmembranen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen über eine Lochmembran. Insbesondere kann die Erfindung zur Multiplex-Sequenzierung eingesetzt werden.
Die Sequenzierung des aus ca. 3 x 109 Basen bestehenden humanen Genoms oder des Genoms anderer Organismen sowie die Bestimmung und der Vergleich individueller Sequenzvarianten erfordert die Bereitstellung von Sequenziermethoden, die einerseits schnell sind und andererseits routinemäßig und mit geringen Kosten eingesetzt werden können. Es wurden in den letzten Jahren große Anstrengungen unternommen, um gängige Sequenziermethoden, z.B. die enzymatische Kettenabbruch- methode nach Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 ( 1 977) 5463), zu beschleunigen, insbesondere durch Automatisierung (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1 994), New York, Academic Press) . Derzeit können maximal bis zu 500 000 Basen pro Tag mit einem Sequenziergerät bestimmt werden. Dennoch sind konventionelle Sequenzierverfahren für bestimmte Anwendungen nicht oder nur sehr bedingt geeignet.
Während der letzten Jahre sind neue Ansätze zur Überwindung der Beschränkungen konventioneller Sequenzierverfahren entwickelt worden, u.a. die Sequenzierung durch Rastertunnelmikroskopie (Lindsay und Phillip, Gen. Anal. Tech. Appl. 8 (1991 ), 8-1 3), durch hochparallelisierte Kapillarelektrophorese (Huang et al., Anal. Chem. 64 ( 1 992), 2149-21 54; Kambara und Takahashi, Nature 361 ( 1 993), 565-566), durch Oligonukleotidhybridisierung (Drmanac et al., Genomics 4 (1 989), 1 14- 1 28; Khrapko et al., FEBS Let. 256 ( 1 989), 1 1 8-1 22; Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 20 ( 1 992), 1 675-1 678 und 1 679-1 684) sowie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs- Massenspektroskopie (Hillenkamp et al., Anal. Chem. 63 ( 1 991 ), 1 1 93A- 1 203A) .
Ein weiterer Ansatz ist die Einzelmolekülsequenzierung (Dörre et al., Bioimaging 5 (1 997), 1 39-1 52), bei der die Sequenz von Nukleinsäuren durch fortschreitenden enzymatischen Abbau von fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und Nachweis der sequenziell freigesetzten Monomermoleküle in einem Mikrostrukturkanal erfolgt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass nur ein einziges Mokekül der Zielnukleinsäure für die Durchführung einer Sequenzbestimmung ausreicht.
Obwohl durch Anwendung der oben genannten Methoden bereits erhebliche Fortschritte erzielt wurden, besteht ein großes Bedürfnis nach weiteren Verbesserungen. Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das eine weitere Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellt und das eine parallele Bestimmung einzelner Nukleinsäuremoleküle in einem Multiplexformat ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Sequenzierung von
Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls, das mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen enthält, (b) Bereitstellen einer Membranstruktur, durch die mindestens ein Kanal h i nd urchfüh rt, der ei nen zum D urchtritt ei nzel n er Nukleinsäuremoleküle geeigneter Durchmesser aufweist, wobei ein Enzym, das ein Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von einem Nukleinsäuremolekül katalysiert, auf der Membranstruktur immobilisiert ist,
(c) Leiten des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls in bzw. durch den Kanal unter Bedingungen, dass ein fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem Nukleinsäuremolekül erfolgt und (d) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls durch Fluoreszenzmessung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine trägergestützte Sequenziermethode, bei der ein freies, zu sequenzierendes Nukleinsäuremolekül in und vorzugsweise durch einen Kanal in einer Membranstruktur geleitet wird, und während des Leitens durch den Kanal bzw. vorzugsweise während des Austritts aus dem Kanal mit einem Enzym in Kontakt gebracht wird, welches das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem Nukleinsäuremolekül katalysiert. Das Enzym ist auf der Membranstruktur, vorzugsweise im Bereich der Austrittsöffnungen aus dem Kanal immobilisiert. Bevorzugt enthält die Membranstruktur eine Vielzahl von Kanälen und kann somit zur gleichzeitigen Bestimmung der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle verwendet werden.
Die Membranstruktur kann von beliebiger Gestalt und Zusammensetzung sein, sofern sie zur Immobilisierung von Enzymen und zur Ausbildung von Nanokanälen zum Durchtritt der zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle geeignet ist. Beispiele für geeignete Materialien sind Glas, Kunststoff, Metalle oder Halbmetalle, wie etwa Silicium, Metalloxide, wie Siliciumoxid, Quarz etc. Desweiteren sind auch Verbundmaterialien, beispielsweise aus zwei oder mehr der zuvor genannten Materialien, geeignet.
Die Enzymmoleküle werden nach bekannten Methoden auf der Membranstruktur, insbesondere im Bereich der Austrittsöffnungen der Kanäle immobilisiert. Die Bindung der Enzymmoleküle an die Membran kann durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Enzymmoleküle an die Membranstruktur durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc. vermittelt werden. So können biotinylierte Enzymmoleküle an Streptavidin- beschichtete Membranstrukturen gekoppelt werden. Alternativ können die Enzymmoleküle auch adsorptiv an die Membranstruktur gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen- modifizierten Enzymmolekülen an metallische Träger, z.B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Enzymmoleküle über geeignete (hetero)- bifunktionelle Kopplungsreagenzien vermittelt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise als Multiplex- Verfahren zur Sequenzierung mehrerer Nukleinsäuremoleküle durchgeführt. Dazu wird günstigerweise eine Membranstruktur verwendet, die mehrere Kanäle enthält. Der mittlere Durchmesser der Kanäle liegt vorzugsweise im Bereich von 10-100 nm, um den Durchtritt von jeweils einzelnen zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekülen zu ermöglichen. Bevorzugt werden mindestens 10, mehr bevorzugt mindestens 20, besonders bevorzugt mindestens 1 00 und am meisten bevorzugt 1 000 oder mehr Nukleinsäuremoleküle parallel sequenziert.
Die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle haben eine Länge von vorzugsweise mindestens 1 00 Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 200 Nu kleotiden . Grundsätzlich können die Nukleinsäuremolekle eine beliebige Länge aufweisen, z.B. mehrere KB oder sogar noch länger. Die maximale Länge wird lediglich durch die Le bensd auer des immo bi lisierten Enzyms bestimmt. Die Nukleinsäuremoleküle, z.B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, enthalten mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wobei vorzugsweise mindestens 50 %, besonders bevorzugt mindestens 70 % und am meisten bevorzugt im Wesentlichen alle, z.B. mindestens 90 %, der Nukleotidbausteine von einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nukleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z. B. einer DNA-Polymerase wie etwa Taq-Polymerase, einer thermostabilen DNA-Polymerase von Thermococcus gorgonarius oder anderen thermostabilen Organismen (Hopfner et al., PNAS USA 96 ( 1 999), 3600- 3605) oder einer mutierten Taq-Polymerase (Patel und Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-51 00) unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine erzeugt werden.
Die markierten Nukleinsäuremoleküle können auch durch Amplifikationsreaktionen, z.B. PCR, hergestellt werden. So entstehen bei einer asymmetrischen PCR Amplifikationsprodukte, bei denen nur einziger Strang Fluroeszenzmarkierungen enthält. Derartige asymmetrische Amplifikationsprodukte können in doppelsträngiger Form sequenziert werden. Durch symmetrische PCR werden Nukleinsäurefragmente hergestellt, bei denen beide Stränge fluoreszenzmarkiert sind. Diese beiden fluoreszenzmarkierten Stränge können separiert und getrennt in einzelsträngiger Form in die Sequenziervorrichtung eingebracht werden, so dass die Sequenz eines oder beider Komplementärstränge separat bestimmt werden kann. Alternativ kann einer der beiden Stränge am 3'-Ende derart modifiziert werden, z.B. durch Einbau einer PNA-Klammer, sodass eine Abspaltung von Monomerbausteinen nicht mehr möglich ist. In diesem Fall ist eine Doppelstrangsequenzierung möglich.
Vorzugsweise tragen im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen, beispielsweise zwei, drei oder vier Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe trägt. Wenn die Nukleinsäuremoleküle nicht vollständig markiert sind, so kann durch parallele Sequenzierung von mehreren Molekülen dennoch die Sequenz vollständig bestimmt werden. Die Nukleinsäurematrize, deren Sequenz bestimmt werden soll, kann beispielsweise aus DNA-Matrizen, wie genomischen DNA-Fragmenten, cDNA-Molekülen, Plasmiden etc., aber auch aus RNA-Matrizen, wie mRNA- Molekülen, ausgewählt werden.
Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus bekannten zur Markierung v o n B i o p o l y m e r e n , z . B . N u k l e i n s ä u re n , v e r we n d et e n Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc., ausgewählt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht vorzugsweise darauf, dass in Nukleinsäurestränge eingebaute Fluoreszenzmarkierungsgruppen Wechselwirkungen mit benachbarten Gruppen, beispielsweise mit chemischen Gruppen der Nukleinsäuren, insbesondere Nukleobasen wie etwa G, oder/und benachbarten Fluoreszenzmarkierungsgruppen, eingehen, die zu einer Änderung der Fluoreszenz, insbesondere der Fluoreszenzintensität gegenüber den Fluoreszenzmarkierungsgruppen in "isolierter" Form aufgrund von Quench- oder/und Energietransfer- Vorgängen führen. Durch das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine verändert sich die Gesamtfluoreszenz, z.B. die Fluoreszenzintensität eines Nukleinsäurestranges abhängig von der Abspaltung einzelner Nukleotidbausteine, d.h. abhängig von der Zeit. Diese zeitliche Änderung der Fluoreszenz kann parallel für eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen erfasst und mit der Basenfolge der einzelnen Nukleinsäurestränge korreliert werden. Vorzugsweise werden solche Fluoreszenzmarkierungsgruppen verwendet, die, wenn sie in den Nukleinsäurestrang eingebaut sind, zumindest teilweise gequencht sind, so dass nach Abspaltung des die Markierungsgruppe enthaltenden Nukleotidbausteins oder eines benachbarten Bausteins, der ein Quenchen verursacht, die Fluoreszenzintensität erhöht wird. Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den durch den Kanal geleiteten Nukleinsäuremolekülen durch immobilisierte Enzyme. Vorzugsweise erfolgt eine enzymatische Abspaltung unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→3'-Richtung oder 3'→5'-Richtung abbauen - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäurestränge auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7 DNA- Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet.
Während der fortschreitenden Abspaltung einzelner Nukleotidbausteine kann eine Änderung der Fluoreszenzintensität des immobilisierten Nukleinsäurestrangs oder/und des abgespaltenen Nukleotidbausteins aufgrund von Quench- oder Energietransfervorgängen gemessen werden. Diese zeitliche Änderung der Fluoreszenzintensität ist von der Basenfolge des untersuchten Nukleinsäurestrangs abhängig und kann daher mit der Sequenz korreliert werden. Zur vollständigen Sequenzbestimmung eines Nukleinsäurestrangs werden üblicherweise mehrere - an unterschiedlichen Basen, z.B. A, G, C und T bzw. Kombinationen von zwei verschiedenen Basen, - markierte Nukleinsäurestränge vorzugsweise durch enzymatische Primerextension, wie zuvor beschrieben, erzeugt und nacheinander durch einen Kanal oder/und durch unterschiedliche Kanäle der Membranstruktur geleitet. Gegebenenfalls kann an den zu untersuchenden Nukleinsäurestrang noch ein "Sequenzidentifikator", d.h. eine markierte Nukleinsäure bekannter Sequenz, angefügt werden, z.B. durch enzymatische Reaktion mit Ligase oder/und Terminaler Transferase, so dass zu Beginn der Sequenzierung zunächst ein bekanntes Fluoreszenzmuster und anschließend erst das der unbekannten, zu untersuchenden Sequenz entsprechende Fluoreszenzmuster erhalten wird. Insgesamt können auf einem Träger vorzugsweise mindestens 10 und bis zu mehr als 1 000 Nukleinsäurestränge parallel sequenziert werden. Die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise durch einen hydrodynamischen oder/und elektroosmotischen Fluss durch die Kanäle der Membranstruktur geleitet werden. Besonders bevorzugt umfasst das Leiten der zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle das Anlegen eines elektrischen Feldes über die Membran, wobei aufgrund der negativen Ladung der Nukleinsäuremoleküle unter physiologischen Bedingungen eine Wanderung von - nach + erfolgt.
Die Detektion umfasst vorzugsweise eine Mehrpunkt-Fluoreszenzanregung durch Laser, z.B. eine Punktmatrix von Laserpunkten, erzeugt durch eine
Diffraktionsoptik oder einen Quanten-Well-Laser. Die durch Anregung erzeugte Fluoreszenzemission mehrerer Nukleinsäurestränge kann durch eine Detektormatrix erzeugt werden, die beispielsweise eine elektronische
Detektormatrix, z.B. eine CCD-Kamera oder eine Avalanche- Fotodiodenmatrix, umfasst. Die Detektion kann derart erfolgen, dass
Fluoreszenzanregung und Detektion an allen untersuchten
Nukleinsäuresträngen parallel erfolgt. Alternativ dazu kann in mehreren
Schritten jeweils ein Teil der Nukleinsäurestränge unter Verwendung einer
Submatrix von Laserpunkten und Detektoren, vorzugsweise unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitsscannerprozedur, untersucht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Träger zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend eine Membranstruktur, durch die mindestens ein Kanal hindurchführt, wobei ein Enzym, das ein Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von einem Nukleinsäuremolekül katalysiert, auf der Membranstruktur im Bereich des Kanals oder der Kanäle immobilisiert ist. Der Durchmesser des Kanals ist derart, dass ein Durchtritt einzelner Nukleinsäuremoleküle erfolgen kann. Vorzugsweise ist der Durchmesser zwischen 10 bis 100 nm. Vorzugsweise enthält die Membranstruktur mehrere Kanäle zur parallelen Sequenzierung von mehreren gleichen oder/und unterschiedlichen Nukleinsäuremolekülen. Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren umfassend:
(a) einen Träger, wie zuvor spezifiziert,
(b) Mittel zum Leiten von zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekülen durch die Kanäle des Trägers und
(c) Mittel zum gleichzeitigen Bestimmen der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise für die Analyse von Genomen und Transkriptomen bzw. für differenzielle Analysen, z.B. Untersuchungen bezüglich des Unterschieds im Genom bzw. Transkriptom einzelner Spezies oder Organismen innerhalb einer Spezies, eingesetzt werden.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden.
Figur 1 zeigt die schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine Membranstruktur (2) enthält einen Nanokanal (4) zum Durchtritt einzelner zu sequenzierender N u kl e i n s äu re mo l e kü l e ( 6) . D i e Wa nd e ru n gs ri chtu n g d e r Nukleinsäuremoleküle durch den Kanal ist mit einem Pfeil (A) angezeigt. Zur Unterstützung der Wanderung kann über die Membran ein elektrisches Feld angelegt werden . Beim Durchtritt der zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle (6) durch den Kanal (4) kommen sie mit auf der Membranstruktur (2) immobilisierten Exonukleasemolekülen (8) in Kontakt. Die Exonukleasemoleküle (8) sind insbesondere im Bereich der Kanalöffnungen angeordnet. Durch die Exonukleasemoleküle (8) erfolgt eine Spaltung der durch den Kanal (4) hindurchtretenden Nukleinsäuremoleküle (6), wobei Spaltstücke (z.B. 10) entstehen. Die Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle (6) oder/und der Spaltstücke (1 0) wird durch Fluoreszenzanregung (z.B. durch den Pfeil B dargestellt) und Messung des emittierten Fluoreszenzlichts nachgewiesen.
Figur 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Multiplexsequenzierung. Die Membranstruktur (1 2) enthält eine Vielzahl von Kanälen (14 a, 14 b, 1 4 c), die zur parallelen Sequenzierung gleicher oder unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle ( 1 6 a, 1 6 b, 1 6 c) dienen können. An den Kanalöffnungen sind jeweils Exonukleasemoleküle ( 1 8 a, 1 8 b, 1 8 c) immobilisiert. Die Sequenzierung kann unter Verwendung einer Lichtquellenmatrix, z.B. mehrerer Laserstrahlen oder eines durch ein Diffraktionselement aufgespaltenen Laserstrahls, oder/und einer Detektormatrix erfolgen.
Figur 3 zeigt eine Aufsicht auf eine zur Multiplex-Sequenzierung geeignete Membranstruktur (22) mit mehreren Kanälen (24 a, 24 b, 24c). Zumindest im Bereich der Kanalöffnungen sind auf der Membranstruktur (22) Exonukleasemoleküle (28 a, 28 b, 28 c) immobilisiert. Bei Durchtritt der zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle (nicht gezeigt) durch die Kanalöffnungen erfolgt eine Abspaltung von fluoreszenzmarkierten Nukleotidbausteinen. Durch die Freisetzung der Nukleotidbausteine erhöht sich aufgrund der Abnahme der Quenchung die Fluoreszenzintensität, so dass ein für jede Base charakteristischer Photonenfluss entsteht, der durch eine bestimmte Wellenlänge λ oder/und eine Lebenszeit r charakterisiert ist und von einer Detektormatrix registriert werden kann.
Bei der in Figur 4 gezeigten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein mehrschichtiger Träger verwendet. Dieser Träger umfasst eine aus mehreren Schichten (32, 34) aufgebaute Membranstruktur, umfassend eine erste Schicht (32) mit einem ersten Kanal (36), der einen zum Durchtritt mehrerer Nukleinsäurenmoleküle ausreichenden Durchmesser von z.B. 500 bis 2000 und insbesondere ca. 1000 nm aufweist. Nach Durchtritt durch den ersten Kanal (36) gelangen die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle an die zweite Schicht (34), die als Deckmembran über der ersten Schicht ausgebildet ist und einen oder mehrere zweite Kanäle (38 a, 38 b) aufweist, die einen zum Durchtritt einzelner Nukleinsäuremoleküle geeigneten Durchmesser von z.B. 10 bis 1 00 nm aufweisen. Durch den ersten Kanal (36) können gleichzeitig mehrere gleiche oder unterschiedliche zu sequenzierende Nukleinsäuremoleküle auf die zweite Schicht (34) der Membranstruktur und einzeln in die zweiten Kanäle (38 a, 38 b) geleitet und dann - wie zuvor erläutert - durch Abspaltung einzelner Nukleotidbausteine sequenziert werden.
Bei einer aus mehreren Schichten bestehenden Membranstuktur kann die Sequenzierung auch über ein Evaneszenz-basierendes Verfahren erfolgen. Das aus einer Anregungslichtquelle, z.B. einem Laser, stammende Anregungslicht wird in eine optisch transparente Schicht der Membran eingestrahlt, die als Träger der evaneszenten Welle dient. Im Bereich der Kanäle werden Photonen ausgestreut, die die dort entstehenden Spaltprodukte zur Fluoreszenz anregen können. Die Detektion erfolgt durch das im Wesentlichen senkrecht vom Träger abgestrahlte Fluoreszenzemissionslicht.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls, das mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen enthält,
(b) Bereitstellen einer Membranstruktur, durch die mindestens ein Kanal hindurchführt, der einen zum Durchtritt einzelnder Nukleinsäuremoleküle geeigneten Durchmesser aufweist, wobei ein Enzym, das ein Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von einem Nukleinsäuremolekül katalysiert, auf der Membranstruktur immobilisiert ist,
(c) Leiten des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls in bzw. durch den Kanal unter Bedingungen, dass ein fortschreitendes
Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem Nukleinsäuremolekül erfolgt und
(d) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls durch Fluoreszenzmessung.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül in einzelsträngiger Form vorliegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül in doppelsträngiger Form vorliegt, wobei markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuremoleküle derart markiert sind, dass mindestens 50 % aller Nukleotidbausteine von einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Membranstruktur verwendet, die aus Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden, Glas, Quarz, Kunststoffen oder
Verbundmaterialien besteht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal einen Durchmesser von 1 0-100 nm aufweist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aus mehreren Schichten aufgebaute Membranstruktur verwendet, umfassend eine erste Schicht mit einem ersten Kanal, der einen zum Durchtritt mehrerer Nukleinsäuremoleküle ausreichenden Durchmesser aufweist, und eine zweite Schicht mit einem zweiten Kanal, der einen zum Durchtritt einzelner Nukleinsäuremoleküle geeigneten Durchmesser aufweist.
. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Exonuklease als Enzym verwendet.
1 0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease IM verwendet wird.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Leiten des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls einen hydrodynamischen oder/und einen elektroosmotischen Fluss durch den Kanal umfasst.
1 2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Leiten des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls das Anlegen eines elektrischen Feldes über die Membran umfasst.
1 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym im Bereich der Austrittsöffnung des Kanals auf der Membranstruktur immobilisiert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen der Basenfolge aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz des Nukleinsäuremoleküls oder/und der abgespaltenen Nukleotidbausteine erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere zu sequenzierende Nukleinsäuremoleküle in jeweils separate Kanäle der Membranstruktur geleitet werden und ein gleichzeitiges Bestimmen der Basenfolge dieser mehreren
Nukleinsäuremoleküle erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass das gleichzeitige Bestimmen der Basenfolge mehrerer
Nukleinsäuremoleküle eine Mehrpunkt-Fluoreszenzanregung durch Laser umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 1 5 oder 1 6 dadurch gekennzeichnet, dass das gleichzeitige Bestimmen der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle eine Detektion der Fluoreszenzemission mehrerer Nukleinsäurestränge durch eine Detektionsmatrix umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine CCD-Kamera oder eine Avalanche-Fotodiodenmatrix verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fluoreszenzanregung und -detektion an allen untersuchten Nukleinsäuresträngen parallel erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fluoreszenzanregung und -detektion in mehreren Schritten jeweils an einen Teil der untersuchten Nukleinsäurestränge unter Verwendung einer Submatrix von Laserpunkten und Detektoren erfolgt.
21 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wenn sie in die
Nukleinsäurestränge eingebaut sind, zumindest teilweise gequencht sind, und dass nach Abspaltung die Fluoreszenzintensität erhöht wird.
22. Träger zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend eine Membranstruktur, durch die ein Kanal hindurchführt, der einen zum Durchtritt einzelner Nukleinsäuremoleküle geeigneten Durchmesser aufweist, wobei ein Enzym, das ein Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von einem Nukleinsäuremolekül katalysiert, auf der Membranstruktur immobilisiert ist.
23. Träger nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal einen Durchmesser von 10-1 00 nm aufweist.
24. Träger nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranstruktur mehrere Kanäle zur parallelen Sequenzierung von mehreren Nukleinsäuren aufweist.
25. Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend
(a) einen Träger nach einem der Ansprüche 22 bis 24,
(b) Mittel zum Leiten von zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekülen durch die Kanäle des Trägers und
(c) Mittel zum gleichzeitigen Bestimmen der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
26. Verwendung des Trägers nach einem der Ansprüche 22 bis 24 oder der Vorrichtung nach Anspruch 25 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
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