EP1487975A2 - Serin hydroxymethyltransferase als target für herbizide - Google Patents

Serin hydroxymethyltransferase als target für herbizide

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Publication number
EP1487975A2
EP1487975A2 EP03717208A EP03717208A EP1487975A2 EP 1487975 A2 EP1487975 A2 EP 1487975A2 EP 03717208 A EP03717208 A EP 03717208A EP 03717208 A EP03717208 A EP 03717208A EP 1487975 A2 EP1487975 A2 EP 1487975A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
seq
acid sequence
plant
activity
Prior art date
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Ceased
Application number
EP03717208A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Uwe Sonnewald
Frederik BÖRNKE
Kirsten Deist
Marc Stitt Nigel
Wolfgang Lein
Thomas Ehrhardt
Andreas Reindl
Ralf-Michael Schmidt
Annette Freund
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1487975A2 publication Critical patent/EP1487975A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to serine hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1) as a new target for herbicides and nucleic acid sequences coding for a polypeptide with the biological activity of a serine hydroxymethyltransferase which, if not present, cause growth retardations and chlorotic leaves, comprising the nucleic acid sequence SEQ ID No: 3 and functional equivalents of the above-mentioned nucleic acid sequence or the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7 and functional equivalents of the above-mentioned nucleic acid sequence.
  • the present invention further relates to the use of the abovementioned nucleic acid sequences, of functional analogs of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 7 or of polypeptides encoded by one of the abovementioned nucleic acid sequences in a method for identifying compounds with her bicidal action, which inhibit serine hydroxymethyltransferases and the use of these compounds identified by the process as herbicides.
  • the object of the present invention is therefore to identify new targets which are essential for the growth of plants or whose inhibition for the plant lead to reduced growth, and to provide methods which are used to identify compounds with herbicidal Effect are suitable.
  • SHMT serine hydroxymethyltransferase
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequence which, owing to the degeneracy of the genetic code by back translation in SEQ ID NO: can be deduced amino acid sequence shown 8 ';
  • nucleic acid sequence or “comprising” based on nucleic acid or amino acid sequences means that the nucleic acid sequence according to the invention can contain additional nucleic acid sequences at the 3 'or 5' end, the length of the additional nucleic acid sequences being 2000 bp at the 5 'and 3' end of the nucleic acid sequences according to the invention, preferably does not exceed 1500 bp at the 5 'and 100 bp at the 3' end.
  • affinity tag denotes a peptide or polypeptide whose coding nucleic acid sequence can be fused with the nucleic acid sequence according to the invention directly or by means of a linker using common cloning techniques.
  • the affinity tag serves for the isolation, enrichment and / or targeted purification of the recombinant target protein by means of affinity chromatography from whole cell extracts.
  • the linker mentioned above can advantageously contain a protease interface (e.g. for thrombin or factor Xa), as a result of which the affinity tag can be cleaved from the target protein if necessary.
  • Examples of common affinity tags are the "His tag" e.g.
  • the affinity tag can be attached to the 5 'or 3' end of the coding nucleic acid sequence with the sequence coding for the target protein.
  • Antisense or cosuppression technique describes technologies for suppressing (reducing) gene expression, in which a gene coding for a part of a natural gene to be suppressed to be defined in the respective experiment in "sense” or “antisense” orientation under the control of a suitable promoter in a model plant is transformed.
  • the transgenic plants produced in this way generally have a different degree of suppression of the transcription of the natural gene, which can be detected using suitable methods. This technique thus allows the effects of a gene with reduced expression on an organism to be studied (for an overview, see Trends in Plant Science, 2000, 5 (9), 394-396).
  • Enzymatic activity / activity test The term enzymatic activity describes the ability of an enzyme; convert a substrate into a product. The enzymatic activity can be dependent in a so-called activity test on the increase in the product, the decrease in the substrate (or starting material) or the decrease in a specific cofactor or a combination of at least two of the above parameters within a defined period of time.
  • Biological activity of a serine hydroxymethyltransferase In the context of the present invention, this term describes that the presence of a serine hydroxymethyltransferase, preferably a glyoxysomal serine hydroxymethyltransferase, imparts growth and survivability. If the activity of a protein with the biological activity of a glyoxysomal serine hydroxymethyltransferase is inhibited, this leads to reduced growth, a growth arrest or a death of the plant.
  • An expression cassette contains a nucleic acid sequence according to the invention functionally linked with at least one genetic control element, such as a promoter, and advantageously with a further control element, such as a terminator.
  • the nucleic acid sequence of the expression cassette can for example be a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence as well as semisynthetic or fully synthetic analogues thereof. These sequences can be in linear or circular form, extra-chromosomal or integrated into the genome.
  • the corresponding nucleic acid sequences can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, and consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • Artificial nucleic acid sequences are also suitable here as long as they enable the expression of a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention with the biological activity of an SHMT in a cell or an organism.
  • synthetic nucleotide sequences can be generated which have been optimized with regard to the codon usage of the organisms to be transformed.
  • nucleotide sequences can be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, such as, for example, by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleotide building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoride method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • various DNA fragments can be manipulated so that a nucleotide sequence with the correct reading direction and correct reading frame is obtained.
  • the nucleic acid fragments are connected to one another using general cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sa brook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in TJ Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, FM et al. , "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994).
  • a functional or operative linkage means the sequential arrangement of regulatory sequences or genetic control elements in such a way that each of the regulatory sequences or each of the genetic control elements can perform its function as intended when expressing the coding sequence.
  • “Functional equivalents” here describe nucleic acid sequences which hybridize and react under standard conditions with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 or parts of SEQ ID NO: 3. are able to effect the expression of a polypeptide with the biological activity of an SHMT in a cell or an organism.
  • the term functional equivalents therefore also includes the nucleic acid sequences SEQ ID NO: 7 and nucleic acid sequences which hybridize with SEQ ID NO: 7 or parts of SEQ ID NO: 7 and are capable of expressing a polypeptide with the biological activity of an SHMT in one Cell or organism.
  • oligonucleotides For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides with a length of about 10-50 bp, preferably 15-40 bp, for example of the conserved or other areas, which can be determined by comparison with other related genes in a manner known to the person skilled in the art.
  • longer fragments of the nucleic acids according to the invention with a length of 100-500 bp or the complete sequences can also be used for the hybridization.
  • the length of the fragment or the complete sequence or depending on the type of nucleic acid, i.e. DNA or RNA used for hybridization vary these standard conditions. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • hybridization conditions for example, depending on the nucleic acid, temperatures between 42 and 58 ° C in an aqueous buffer solution with a concentration between 0.1 to 5 x SSC (1 X SSC - 0.15 M NaCl, 15 M sodium citrate, pH 7.2) or additionally in the presence of 50% formamide such as 42 ° C in 5 x SSC, 50% formamide.
  • DNA hybrids at 0.1 x SSC and temperatures between about 20 ° C to 65 ° C, preferably between about 30 ° C to 45 ° C.
  • the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between about 30 ° C. to 65 ° C., preferably between about 45 ° C.
  • a functional equivalent of SEQ ID NO: 3 is also understood to also include nucleic acid sequences which comprise a partial area which is homologous to SEQ ID NO: 3 to a defined percentage and also in particular natural or artificial mutations of the abovementioned nucleic acid sequences which encode a polypeptide with the biological activity of a serine hydroxymethyltransferase.
  • An example of a nucleic acid sequence that comprises a partial area that is identical to SEQ ID NO: 3 up to a defined percentage is SEQ ID NO: 7 and its functional equivalents as defined above.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modification of the nucleic acid sequences mentioned above.
  • modifications can be exemplified by techniques familiar to the person skilled in the art, such as “site directed mutagenesis”, “error prone PCR”, “DNA shuffling” (Nature 370, 1994, pp. 389-391) or “staged extension process” (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261).
  • the aim of such a modification can be, for example, the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of DNA to shorten the sequence, the exchange of nucleotides for codon optimization or the addition of further sequences. Proteins that have modified nucleic acid • sequences are encoded, must still have the desired functions despite a different nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent can also refer to the amino acid sequence encoded by the corresponding nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent describes a protein whose amino acid sequence comprises a partial region which is identical or homologous to a defined percentage of at least 91% with SEQ ID NO: 4.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. nucleic acid sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the use of codons, or the amino acid sequences derived therefrom.
  • Genetic control sequence The term “genetic control sequences” is to be seen as equivalent to the term “regulatory sequence”. It describes sequences that have an influence on the transcription and, if necessary, translation of the nucleic acids according to the invention in prokaryotic or eukaryotic organisms. Examples of this are promoters or so-called “enhancer” sequences. In addition to these control sequences or instead of these sequences, the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified such that the natural regulation has been switched off and the expression of the target gene has been modified, that is to say increased or decreased. The control sequence is selected depending on the host organism or starting organism.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the non-coding 3' region of genes. Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters, and sequences which influence the chromatin structure (for example matrix attachment regions (MAR's)) and which can modify the expression-controlling properties. By means of genetic control sequences, for example, tissue-specific expression can additionally depend on certain stress factors.
  • MAR's matrix attachment regions
  • Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131 -17135), cold and dry stress (Plant Cell 1994, (6): 251-264) and heat stress (Molecular & General Genetics, 1989, 217 (2-3): 246-53).
  • “Homology” between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the respective total sequence length, which is determined by comparison using the program algorithm BESTFIT (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG ), Madison, USA) by setting the following parameters for polypeptides
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2 Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2,003
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3 Average Match: 10,000 Average Mismatch: -9,000
  • “Mutations” of nucleic or amino acid sequences include substitutions , Addition (addition), deletions (deletion), inversion (changes) or insertions (insertions) of one or more nucleotide residues, whereby the corresponding amino acid sequence of the target protein can also be changed by substitution, insertion or deletion of one or more amino acids, however overall, the functional properties of the target protein are essentially retained.
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on the 5 'or 3' side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 100 bp, particularly preferably at least 500 bp, very particularly preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp ,
  • Plants in the sense of the invention are plant cells, tissues, organs or whole plants such as seeds, tubers, flowers, pollen, fruits, seedlings, roots, leaves, stems or other parts of plants.
  • propagation is material such as seeds, fruits, seedlings, cuttings, tubers, cuts or rhizomes.
  • Response time means the time it takes to complete an activity test to obtain significant information about an activity and depends both on the specific activity of the protein used in the test and on the method used and the sensitivity of the equipment used. The determination of the reaction times is known to the person skilled in the art. In methods based on photometric methods for identifying compounds with herbicidal activity, the reaction times are, for example, generally between> 0 to 120 minutes.
  • Recombinant DNA describes a combination of DNA sequences that can be produced by recombinant DNA technology.
  • Recombinant DNA technology generally known techniques for fusing DNA sequences (e.g. described in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
  • Replication origins ensure the multiplication of the expression cassettes or vectors according to the invention in microorganisms and yeasts m en as the pBR322 ori or the P15A ori in E. coli (Sambrook et al .: “Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and ARS1 ori in yeast (Nucleic Acids Research, 2000, 28 (10): 2060-2068).
  • Reporter genes code for easily quantifiable proteins. These genes can be used to assess the transformation efficiency or the location or time of expression by means of growth, fluorescence, chemo, bioluminescence or resistance assay or via photometric measurement (intrinsic color) or enzyme activity. Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996) are very particularly preferred ; 38 (1): 44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques.
  • GFP green fluorescence protein
  • Selection markers confer resistance to antibiotics or other toxic compounds: Examples include the neomycin phosphotransferase gene, which is resistant to the aminoglycoside antibiotics neomycin (G 418), kanamycin, paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), the 'hygro gene (Marsh JL et al., Gene. 1984; 32 (3): 481-485), the sul gene (Guerineau F et al., Plant Mol Biol 1990; 15 (1): 127-136), the hygromycin gene (Gen Bank Accession NO: K 01193) and the sheel gene which confers resistance to the bleomycin antibiotic Zeoin.
  • selection ark genes are genes which confer resistance to 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or phosphinotricin etc. or those which confer antimetabolite resistance, for example the dhfr gene (Reiss , Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149). Also suitable are genes such as trpB or hisD (Hartman SC and Mulley RC, Proc Natl Acad Sei US A. 85 (1988) 8047-8051).
  • Mannose phosphate isomerase WO 94/20627
  • ODC ornithine decarboxylase
  • the deaminase are also suitable from Aspergillus terreus (Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
  • Transformation describes a process for the introduction of heterologous DNA into a pro- or eukaryotic cell.
  • a transformed cell describes not only the product of the transformation process itself, but also all transgenic progeny of the transgenic organism produced by the transformation
  • Target / Target Protein a polypeptide encodes the nucleic acid sequence according to the invention, which can be an enzyme in the classical sense or e.g. a structural protein, development protein, regulatory proteins such as transcription factors, kinases, phosphatases, receptors, subunits of channels, transport proteins, regulatory subunits which give an enzyme complex substrate or activity regulation. All targets or target sites have in common that their functional presence is essential for survival or normal development and growth.
  • Transgene Based on a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing a nucleic acid sequence according to the invention or an organism transformed with the abovementioned nucleic acid sequence, expression cassette or vector, the expression transgenic describes all such constructions produced by genetic engineering methods in which either the nucleic acid sequence of the Target protein or one genetic control sequence functionally linked to the nucleic acid sequence of the target protein or a combination of the abovementioned possibilities are not in their natural genetic environment or have been modified by genetic engineering methods. The modification can be achieved here, for example, by mutating one or more nucleotide residues of the corresponding nucleic acid sequence.
  • polypeptides encoded by the nucleic acid sequences according to the invention show the biological activity of a pyridoxal phosphate-dependent serine hydroxymethyl transferase (SHMT;
  • SHMTs are found in almost all cell types.
  • the enzyme was first derived from rabbit liver (Schirch & Mason, JBC
  • SHMT from Euglena Gracilis can be inhibited by millimolar concentrations of various amino acids (e.g. glycine, serine, cysteine) (Sakamoto et al., Agricultural and Biological)
  • the amino acid analogue O-amino-D-serine has an inhibitory effect on SHMT from sheep in ⁇ M concentrations (Baskaran et al., Biochemistry, 1989, 28 (25), 9607-9612). It is also known that mimosine, a vegetable amino acid, can be bound to SHMT from CHO cells by photo-linking, but it does not inhibit it (Lin et al. JBC 271, pp. 2548-2556, 1996).
  • cytosolic and mitochondrial form of SHMT can be distinguished, which are involved in different metabolic pathways.
  • the existence of plastid SHMT is suspected (Douce et al. Trends in Plant Science 6, pp. 167-176, 2001).
  • the cytoscopic form of SHMT is involved in the provision of Cl units for purine and methionine metabolism by catalysing the reversible conversion of serine to glycine.
  • a cytosolic SHMT protein sequence from Schaaf that is 55.09% identical to SEQ ID NO: is available under Gen Bank Acc. No. Find P35623.
  • SHMl-5 Five genes for SHMT (SHMl-5) were found in Arabidopsis, two of which, SHM1 (Gen Bank Acc. No. AJ271726, identity to SEQ ID NO: 3 78.65%; Gen Bank Acc. No. Q 90M9, ' identity to SEQ ID N0: 4 83.71%) and SHM2 (Gen Bank Acc. No. Q04952; identity to SEQ ID NO: 4 83.62%) are presumably mitochondrial, while SHM3, SHM4 and SHM5 are cytosolic forms (McClung et al. Plant Physiol. 123, pp381-391, 2000). Mitochondrial SHMT from pea mitochondria (pisum sativum; Gen Bank Acc. No.
  • Arabidopsis thaliana mutants are described in the literature, in whose mitochondria no SHM activity could be detected biochemically (stm plants). It is in these mutants
  • SHM1 gene is probably not responsible for the phenotype of the mutants, since this is balanced by the second SHMT, SHM2. So far, no clear evidence has been provided that mitochondrial SHMT is essential in plants and therefore as
  • SHMT vegetable SHMT, hereinafter simply referred to as "SHMT” preferential 45 as mitochondrial SHMT, and their use as a novel target "for herbicides.
  • SHMT therefore preferably describes mitochondrial SHMT.
  • nucleic acid sequences zen claims that code for a polypeptide with the biological activity of an SHMT, the nucleic acids
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequence according to c) is SEQ ID NO: 7, which comprises a partial area with an identity of 100% to SEQ ID NO: 3.
  • nucleic acid sequences are also encoded which encode a polypeptide with the biological activity of an SHMT
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequences which code for a mitochondrial SHMT are also preferred here.
  • nucleic acid sequences are referred to below as “nucleic acid sequences according to the invention”.
  • Polypeptides which are encoded by a nucleic acid sequence according to the invention, cause growth retardations and chlorotic leaves in plants in a reduced amount.
  • a reduction in the polypeptide means that the amount of the polypeptide is reduced using genetic engineering methods.
  • a plant modified in this way is compared with a plant which ses polypeptide has no genetic modifications, but is otherwise identical to the genotype of the genetically manipulated plant, under identical growth conditions.
  • the gene products of the nucleic acids according to the invention are also the subject of the present invention and represent new targets for herbicides which are suitable for controlling unwanted plants.
  • undesirable plants are understood to mean all plants that grow up in places where they are undesirable, for example:
  • SEQ ID NO: 3 comprise a partial area which has an identity with SEQ ID No: 3 of at least 91%, preferably at least 92%, 93% and 94%, preferably at least 95% or 96%, particularly preferably at least 97% or 98%, very particularly preferably at least 99%.
  • SEQ ID NO: 4 comprise a partial area which has an identity with SEQ ID No: 3 of at least 91%, preferably at least 92%, 93% and 94%, preferably at least 95% or 96%, particularly preferably at least 97 or 98 %, very particularly preferably has at least 99%.
  • SEQ ID NO: 7 have an identity with SEQ ID No: 7 of at least 88%, 89%, 90%, preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, particularly preferably at least 96% , 97%, 98%, 99%.
  • SEQ ID NO: 3 or parts of SEQ ID NO: 3 can be used for the production of hybridization probes, via which the corresponding full-length genes can be isolated.
  • the SEQ ID NO: 7 or parts of the SEQ ID NO: 7 can be used. The manufacture of these probes and the conduct of the experiments are known.
  • the above-mentioned probes can be used for the detection and isolation of functional equivalents of SEQ ID NO: 3 (or SEQ ID NO: 7) from other plant species due to sequence identities.
  • part or all of the sequence of the corresponding SEQ ID NO: 3 (or SEQ ID NO: 7) is used as a probe for screening in a genomic or cDNA bank of the corresponding plant species or in a computer search for sequences of functional equivalents in electronic databases ,
  • Preferred plant species are the undesired plants already mentioned at the beginning.
  • the invention furthermore relates to expression cassettes containing
  • nucleic acid sequence from a) that has an identity with SEQ ID No: 3 of at least 60%, preferably at least 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70%, preferably at least 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% particularly preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 5 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% very particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, for the expression of an SHMT, which in -vitro test systems can be used.
  • 10 has at least 60%, therefore also include functional equivalents of SEQ ID NO: 7 with an identity of at least 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54% , 55%, 56%, 57%, 58%, 59% preferably at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% at least 71%, 72%, 73%,
  • an expression cassette according to the invention comprises a promoter at the 5 'end of the coding sequence and a transcription termination signal 25 at the 3' end and optionally further genetic control sequences which functionally link the nucleic acid sequence coding for an SHMT in between. are.
  • inventive expression cassettes also are analog loga 30 to understand which may be, for example, by a combination of ⁇ individual nucleic acid sequences on a polynucleotide (multi multiple constructs), on a plurality of polynucleotides into a cell (co-transformation) or by sequential transformation , 35
  • Advantageous genetic control sequences according to point a) for the expression cassettes according to the invention or for vectors containing expression cassettes according to the invention are, for example, promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, 40 T5, T3 -, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or ⁇ -PL promoter, which can be used to express SHMT in gram-negative bacterial strains.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, 40 T5, T3 -, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or ⁇ -PL promoter, which can be used to express SHMT in gram-negative bacterial strains.
  • SHMT can be used in gram-positive bacterial strains, as well as in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, Contain CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, AOX1 and GAP, which can be used to express SHMT in yeast strains.
  • genetic control sequences suitable for expression in insect cells include the polyhedrin promoter and the p10 promoter (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio / Techn. 6, 47-55).
  • Advantageous genetic control sequences for the expression of SHMT in cell culture are, in addition to polyadenylation sequences such as e.g. from Si ian Virus 40 eukaryotic promoters of viral origin such as e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomega-virus or Simian virus 40.
  • polyadenylation sequences such as e.g. from Si ian Virus 40 eukaryotic promoters of viral origin such as e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomega-virus or Simian virus 40.
  • Promoters of viral origin are particularly preferred, such as the promoter of the 35S transcript of the cauliflower mosaic virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812).
  • Further preferred constitutive promoters are, for example, the promoter of nopaline synthase from Agrobacterium, the TR double promoter, the OCS (octopine synthase) promoter from Agrobacterium, the ubiquitin promoter (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29: 637-649) , the promoters of the vacuolar ATPase subunits or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91/13991).
  • the expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter as a genetic control sequence, by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter as a genetic control sequence, by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • promoters e.g. the PRP1 promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a salicylic acid-inducible (WO 95/19443), and a benzenesulfonamide-inducible (EP-A-0388186) inducible by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,
  • an abscisic acid-inducible (EP-A 335528) or an ethanol or cyclohexanone-inducible (WO 93/21334) promoter can also be used.
  • promoters which have tissue- or organ-specific expression for example in anthers, ovaries, flowers and floral organs, leaves, guard cells, trichomes, stems, conductive tissues, Impart roots and seeds.
  • those promoters which ensure leaf-specific expression are also suitable.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potato WO 97/05900
  • the SSU promoter small subunit
  • the Rubisco ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase
  • ST-LSI promoter from potato
  • Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseoline (US-5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53), of the 2S albuming gene (Joseffson LG et al., J Biol Che 1987, 262: 12196-12201), the legumin (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989; 215 (2): 326-331), the USP (unknown seed protein; Baumlein H et al., Molecular & Ge - General Genetics 1991, 225 (3): 459-67) of the Napin gene (Stalberg K, et al., L.
  • phaseoline US-5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53
  • the 2S albuming gene Joseffson LG et al., J Biol Che 1987, 262: 12196-12201
  • the legumin
  • sucrose binding protein WO 00/26388
  • LeB4 promoter Bact al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090.
  • promoters suitable as genetic control sequences are, for example, specific promoters for tubers, storage roots or roots, such as, for example, the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato, the promoter of the starch synthase (GBSS1) or the spora min promoter, fruit-specific promoters, such as the fruit-specific promoter from tomato (EP-A 409625), fruit ripening-specific promoters, such as the fruit ripening-specific promoter from tomato (WO 94/21794), flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593) or specific plastid or chromoplast promoters such as the RNA polymerase promoter (WO 97 / 06250) or the promoter of the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Glycine ax (see
  • Additional functional elements b) are to be understood as examples, but not by way of limitation, of reporter genes, origins of replication, selection markers and so-called affinity tags, fused with the SHMT, directly or by means of a linker optionally containing a protease interface.
  • Other suitable additional functional elements are sequences which target in the apoplasts, in plastids, the vacuole, the mitochondrium, the peroxisome, the endoplasmic reticulum (ER) or, due to the lack of corresponding operative sequences, remain in the comparator. Ensure the time of emergence, the cytosol (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
  • Vectors according to the invention also contain at least one copy of the nucleic acid sequences according to the invention and / or the expression cassettes according to the invention.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phas ide, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally. A chro osomal replication is preferred.
  • the nucleic acid construct according to the invention can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid construct as a vector or the nucleic acid sequences used.
  • the expression cassette according to the invention and vectors derived therefrom can be used for the transformation of bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae and eukaryotic, non-human cells (eg insect cells) with the aim of recombinantly producing the SHMT, the production of a suitable one Expression cassette directed to the organism in which the gene is to be expressed.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention can also be introduced into an organism alone.
  • nucleic acid sequences in addition to the nucleic acid sequences, further genes are to be introduced into the organism, they can all be put together in a single vector or each individual gene in a vector in each Organism are introduced, wherein the different vectors can be introduced simultaneously or successively.
  • nucleic acid (s) according to the invention, the expression cassette or the vector can be introduced into the corresponding organisms (transformation) by all methods known to the person skilled in the art.
  • Suitable methods are the biolistic method or protoplast transformation (see, for example, Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds .), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cabridge), the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, the microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in:
  • the transformation by means of agrobacteria and the vectors to be used for the transformation are known to the person skilled in the art and are described in detail in the literature (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711.
  • the intermediate vectors can be based on sequences which are homologous to sequences in the T-DNA, are integrated by homologous recombination into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria, which also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tu efaciens by means of a helper plasmid (conjugation). Binary vectors can replicate in E.
  • coli as well as in Agrobacteria.
  • a selection marker gene and a linker or polylinker which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (; Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187), EP A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985) 277-287).
  • Agrobacteria transformed with a vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crop plants such as cereals, maize, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, Hemp, potato, tobacco, tomato, carrot, paprika, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species are used, for example by bathing wounded leaves or pieces of leaf in an agrobacterial solution - finally be cultivated in suitable media.
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by SD Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer.
  • transgenic organisms produced by transformation with one of the above-described embodiments of an expression cassette containing a nucleic acid sequence according to the invention or a vector containing the abovementioned expression cassette and the recombinant SHMT obtainable by expression from the transgenic organism are the subject of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of transgenic organisms containing an expression cassette according to the invention, e.g. for the provision of recombinant protein and / or the use of these organisms in in vivo test systems.
  • yeasts, mosses, algae and fungi preferred organisms for recombinant expression are also eukaryotic cell lines.
  • mosses are Physcomitrella patens or other mosses described in cryptogams, vol. 2, mosses, ferns, 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515).
  • bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes or Cyanobacteria, for example of the genus Synechocystis or Anabena are preferred.
  • yeasts are Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, or others in Indian Che Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995).
  • Preferred plants are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, corn, rice or oats, and sugar cane.
  • the transgenic plants according to the invention are selected in particular from dicotyledonous crop plants, such as, for example, Brassicaceae such as rapeseed, cress, Arabidopsis, cabbages or canola; Leguminosae such as soy, alfalfa, pea, bean crops or peanut solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika; Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula; Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, or flax, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, carrot, sugar beet or various tree, nut and wine specialties.
  • transgenic animals such as C. elegans are also suitable as host organisms.
  • vectors for use in yeast are pYep-Secl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 ( Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES derivatives, pGAPZ derivatives, pPICZ derivatives and the vectors of the "Pichia Expression Kit” (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors for use in filamentous fungi are described in: van den Honel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Eds., P. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf9, Sf21 or Hi5 cells, which are infected via recombinant BAculoviruses. These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al.
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found, as mentioned above, in Bekker, D., et al .. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 or in Bevan, MW (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Re ⁇ . 12: 8711-8721.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells.
  • Examples of corresponding expression vectors are pCDM ⁇ and pMT2PC mentioned in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 or Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • Promoters to be used are preferably of viral origin, e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytpmegalovirus or simian virus 40.
  • prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Further advantageous vectors are described in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000).
  • transgenic organism according to the invention All of the above-described embodiments of the transgenic organisms are summarized under the term “transgenic organism according to the invention”.
  • Another object of the present invention is the use of nucleic or amino acid sequences of SHMTs in a method for the identification of test compounds with herbicidal activity.
  • SHMT preferably includes mitochondrial SHMT. All methods for the identification of inhibitors with herbicidal activity are referred to below as methods according to the invention.
  • SHMT which comprises a nucleic acid sequence
  • nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 which comprises a partial region which has an identity with SEQ ID No: 3 of at least 60%, preferably at least 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77 %, 78%, 79%, 80% particularly preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% very particularly preferably at least 91%, 5 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%;
  • nucleic acid sequence from b) which comprise a partial region which has an identity with SEQ ID No: 3 of at least 60%, accordingly also include functional equivalents of SEQ ID NO: 7 with an identity of at least 46%, 47 %, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% preferably at least 60%, 61%, 62%, 63% , 64%, 65%, 66%, 15 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75% particularly preferably at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% very particularly preferably at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% on .
  • the nucleic acid sequence from b) code for a polypeptide with
  • the method according to the invention for identifying compounds with a herbicidal action comprises the following steps:
  • nucleic acid molecule coding for a polypeptide with the enzymatic, preferably biological, activity of a serine hydroxymethyltransferase, preferably a mitochondrial serine hydroxymethyltransferase or the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule with a serine hydroxymethyltransferase, preferably a mitochondrial serine hydroxymethyltransferase or the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule with a
  • test compound (s) to bind to the nucleic acid molecule or the polypeptide encoded by the nucleic acid
  • test compound reduces or blocks the transcription, translation or expression of the nucleic acid from i).
  • Preferred methods according to the invention for identifying compounds with a herbicidal action comprise the following steps:
  • nucleic acid molecule as defined above or the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule into contact with one or more test compounds under conditions which allow the binding of the test compound (s) to the nucleic acid molecule or the polypeptide which is encoded via the nucleic acid;
  • test compound Detection of whether the test compound reduces or blocks the activity of the polypeptide from i); or
  • test compound reduces or blocks the transcription, translation or expression of the nucleic acid from i).
  • the detection according to step (ii) of the above method can be carried out using techniques which show the interaction between protein and ligand.
  • Either the test compound or the enzyme may contain a detectable label, e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • a detectable label e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • enzymatic labels are horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or lucifierase.
  • the subsequent detection depends on the marking and is known to the person skilled in the art.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the average diffusion rate of a fluorescence molecule as a function of the mass in a small sample volume can be determined.
  • FCS can be used to determine protein-ligand interactions.
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound marked by a fluorescent molecule.
  • the method according to the invention can be so be designed so that a chemical reference compound marked by a fluorescent molecule is displaced by further test compounds ("displacement assay").
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • the fluorescence polarization uses the property of a quiescent fluorophore excited with polarized light also to emit polarized light again. However, if the fluorophore can rotate during the excited state, the polarization of the emitted fluorescent light is more or less lost. Under otherwise identical conditions (eg temperature, viscosity, solvent), the rotation is a function of the molecular size, with which one can make a statement about the size of the residue bound to the fluorophore via the measurement signal (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283- 300).
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound marked by a fluorescent molecule to the SHMT. Alternatively, the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1. The compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • Fluorescence resonance energy transfer is based on the radiation-free energy transfer between two spatially adjacent fluorescence molecules under suitable conditions. A prerequisite is the overlap of the emission spectrum of the donor molecule with the excitation spectrum of the acceptor molecule. By fluorescent labeling of the SHMT and the tet compound the binding can be measured by means of FRET (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179). Alternatively, the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • a particularly suitable embodiment of FRET technology is "Homogeneous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), as sold by Packard BioSeience, The compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • HTRF Homogeneous Time Resolved Fluorescence
  • SHMT Surface enhanced laser desorption / ionization
  • MALDI-TOF time of flight mass spectrometer
  • the SHMT is then immobilized on a suitable support and this is incubated with the test compound. After one or more suitable washing steps, the molecules of the test compound additionally bound to the SHMT can be removed using the above-mentioned Detect th methodology and thus select inhibitors.
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • the measurement of surface plasmon resonance is based on the change in the refractive index on a surface when a test compound binds to a protein immobilized on said surface. Since the change in the refractive index for a defined change in the mass concentration at the surface is virtually identical for all proteins and polypeptides, this method can in principle be applied to any protein (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). The measurement can be carried out, for example, with the aid of the automatic analyzers based on surface plasmon resonance, sold by Biacore (Freiburg), in a throughput of currently up to 384 samples per day.
  • Biacore Biacore
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound to the SHMT.
  • the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and ii), consists in that
  • an SHMT is expressed in a transgenic organism according to the invention or an organism which naturally contains an SHMT is cultivated; b) the SHMT from step a) is brought into contact with a test compound in the cell disruption of the transgenic or non-transgenic organism, in partially purified form or in a form purified to homogeneity; and
  • a compound is selected which reduces or blocks the activity of the SHMT, the activity of the SHMT incubated with the test compound being compared with the activity of an SHMT not incubated with a test compound.
  • the method can accordingly be characterized in that
  • a mitochondrial plant serine hydroxymethyltransferase which comprises a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; or a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or functional equivalents of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, comprising a partial area with an identity of at least 91% to the SEQ ID NO: 3, or by a nucleic acid sequence comprising a partial area with an identity of at least 60% to the SEQ ID
  • nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 is either encoded in a transgenic organism or an organism which naturally encodes a plant serine hydroxymethyltransferase by a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; or a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or functional equivalents of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, comprising a partial region with an identity of at least 91% to SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid sequence comprising a partial region with an identity of at least 60% to SEQ ID NO: 3 , contains, is cultivated;
  • step b) the serine hydroxymethyl transferase from step a) is brought into contact with a test compound in the cell disruption of the transgenic or non-transgenic organism, in partially purified form or in a form purified to homogeneity;
  • a test compound is selected which reduces or blocks the activity of the serine hydroxymethyltransferase from step a), the activity of the test compound cubed serine hydroxymethyltransferase is compared with the activity of a serine hydroxymethyltransferase not incubated with a test compound.
  • nucleic acid sequences from a which comprise a partial region which has an identity with SEQ ID No: 3 of at least 60%, also have a functional equivalent of SEQ ID NO: 7 with an identity of at least 46 % include.
  • the preferences given above apply to the functional equivalents.
  • the SHMT-containing solution can consist of the lysate of the original organism or of the transgenic organism transformed with an expression cassette according to the invention. If necessary, the SHMT can be partially or completely cleaned using standard methods.
  • a general overview of common techniques for protein purification can be found, for example, in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6.
  • the protein fused to an affinity tag can be purified using affinity chromatography known to those skilled in the art.
  • the SHMT required for in-vitro methods can thus be isolated either by heterologous expression from a transgenic organism according to the invention or from an organism which contains a polypeptide with SHMT activity, preferably from an unwanted plant, the term undesired plant being used for species mentioned at the outset are to be understood.
  • the SHMT is now incubated with a test compound. After a reaction time, the activity of the SHMT is determined according to one of the methods mentioned above in comparison to the activity of the uninhibited SHMT.
  • the polypeptide according to the invention is inhibited, a significant decrease in the activity compared to the activity of the non-inhibited polypeptide according to the invention is observed, a reduction of at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably by at least 50% up to 100% reduction (blocking) is achieved. At least 50% inhibition is preferred at concentrations of the test compound of 10 ⁇ 4 M, preferably at 10 -5 M, particularly preferably from 10 -6 M, based on the enzyme concentration in the micromolar range.
  • the enzymatic activity of SHMT can be determined, for example, using an activity test, i.e. by incubating the SHMT with a suitable substrate and cofactors, the implementation of the substrate or the cofactor being followed.
  • Suitable substrates are serine or glycine, and suitable cofactors tetrahydrofolate, Cl-tetrahydrofolate. If appropriate, derivatives of the abovementioned compounds which contain a detectable label, such as e.g. a fluorescent, radioisotope or chemiluminescent label.
  • the activity of SHMT can be measured using a radioactive method according to the invention (Bourguignon et al. Biochem. J. 255, pp. 169-178, 1988).
  • the enzymatic activity of SHMT can be determined by means of a chromatographic separation method based on the separation of tetrahydrofolate from Cl-tetrahydrofolate, followed by quantitative analysis of the amounts of tetrahydrofolate and Cl-tetrahydrofolate via integration of the peaks obtained by UV spectroscopic determination in the chromatography.
  • the chromatographic separation is preferably carried out via reversed phase chromatography (RPC) e.g. on an HPLC or FPLC system.
  • RPC reversed phase chromatography
  • the principle of this chromatography and the buffers and devices to be used for this are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Intfoduction to Modern Liquid Chromatography "by L.R. Snyder and J.J. Kirkland, 2nd Edition. John Wiley & Sons, 1979.
  • the amounts of substrate (e.g. serine) to be used for the activity test are between 1-50 mM and amounts of tetrahydrofolate between 1-lOmM based on 1-100 ⁇ g / ml enzyme.
  • the conversion of the substrate is monitored photometrically, based on a method described by Stover and Schirch (Anal. Biochem. 202, pp. 82-88), which is based on the coupling of the SHMT reaction to that by NAD -dependent methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (MTD) catalyzed reaction and photometric measurement based on 340 n.
  • Stover and Schirch Anal. Biochem. 202, pp. 82-88
  • MTD NAD -dependent methylene tetrahydrofolate dehydrogenase
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and iii), consists of the following steps:
  • test compounds which cause a reduced growth or limited survivability of the non-transgenic organism compared to. cause the growth of the transgenic organism.
  • the growth difference in step c) for the selection of an inhibitor with a herbicidal action is at least 10%, preferably 20%, preferably 30%, particularly preferably 40% and very particularly preferably 50%.
  • the transgenic organism is a bacterium, a yeast, a fungus, a plant or a eukaryotic cell line, preferably plants, bacteria or yeasts, which can be easily transformed using common techniques, such as Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum, Saccharomyces cerevisiae or E. coli, in which the sequence coding for a polypeptide according to the invention was incorporated via transformation. These transgenic organisms therefore have an increased tolerance to compounds which inhibit the polypeptide according to the invention.
  • E.coli and Saccharomyces cerevisiae are particularly useful here because their genomes are fully sequenced and they can easily be used to produce "knock-out" mutants (e.g. Methods in Yeast Genetics, Kaiser, Michaelis, Mitchell (eds.) CSHL Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994: 73-85).
  • the above-mentioned method can, however, also be used for the identification of substances with a growth regulatory effect.
  • a plant is used as a transgenic organism.
  • test connections selected genes that cause an altered growth of the non-transgenic organism compared to the growth of the transgenic organism.
  • Modified growth is understood to mean an inhibition of the vegetative growth of the plants, which can manifest itself in particular in a reduction in the growth in length.
  • the treated plants accordingly have a compact stature; a darker leaf coloration can also be observed.
  • test compounds can also be used in one method according to the invention. If the target is influenced by a group of test compounds, then it is either possible to isolate the individual test compounds directly or to divide the group of test compounds into different subgroups, e.g. if it consists of a large number of different components, so as to reduce the number of different test compounds in the method according to the invention.
  • the process according to the invention is then repeated with the individual test compound or the corresponding subgroup of test compounds.
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the subgroup identified according to the method according to the invention comprises only a small number of test compounds or only one test compound.
  • All of the compounds identified by the method according to the invention can then be checked for their herbicidal activity in vivo.
  • One way to test the compounds for herbicidal activity is to use the Lemna minor duckweed in microtiter plates. Changes in chlorophyll content and photosynthesis performance can be measured as parameters. It is also possible to apply the compound directly to undesired plants, the herbicidal action being able to be determined, for example, via restricted growth.
  • the method according to the invention can also advantageously be carried out in high-throughput screening (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • HTS enables a multitude of different connections to be tested in parallel.
  • the carrier used can be solid or liquid, is preferably solid, particularly preferably a microtiter plate.
  • the above-mentioned carriers are also the subject of the present invention. According to the most widespread technique, 96-well, 384-well and 1536-well microtiter plates are used, which can usually contain volumes of 200 ⁇ l.
  • the other components of a HTS system to match the corresponding microtiter plates such as many instruments, materials, automatic pipetting devices, robots, automated plate readers and plate washers, are commercially available.
  • the invention further relates to compounds that can be identified by the method according to the invention. These compounds are referred to below as "selected compounds". They have a molecular weight of less than 1000 g / mol, advantageously less than 500 g / mol, preferably less than 400 g / mol, particularly preferably less than 300 g / mol. Compounds with herbicidal activity have a Ki value of less than 1 mM, preferably less than 1 ⁇ M, particularly preferably less than 0.1 ⁇ M, very particularly preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the compounds identified via the methods according to the invention can of course also be present in the form of their agriculturally useful salts. Agriculturally useful salts include, in particular, the salts of those cations or the acid addition salts of those acids whose cations or anions do not adversely affect the herbicidal activity of the herbicidally active compounds identified by the process of the invention.
  • the selected compounds contain asymmetrically substituted ⁇ -carbon atoms, they can be present either as racemates, mixtures of enantiomers, pure enantiomers or, if they have chiral substituents, also as diastereomer mixtures.
  • the selected compounds can be chemically synthesized or microbiologically produced substances and can occur, for example, in cell extracts from, for example, plants, animals or microorganisms.
  • the reaction mixture can be a cell-free extract or can comprise a cell or cell culture. Suitable methods are known in the art and are generally described in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), for example, Chapter 17th example
  • test compounds can be expression libraries such as cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs , Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein).
  • the selected compounds can be used to control undesired plant growth, and under certain circumstances also for defoliation, for example of potatoes, or desiccation, for example of cotton, and as growth regulators.
  • Herbicidal compositions which contain the selected compounds, control plant growth very well on non-cultivated areas. In crops such as wheat, rice, corn, soybeans and cotton, they act against weeds and grass weeds without significantly damaging the crop plants. This effect occurs above all with low application rates.
  • the selected compounds can be used to control the harmful plants already mentioned above.
  • selected compounds or herbicidal compositions containing them can advantageously also be used in a further number of crops. plants can be used to eliminate unwanted plants.
  • crops are considered, for example:
  • the selected compounds can also be used in crops which are tolerant to the action of herbicides by breeding, including genetic engineering methods. The preparation of these cultures is described below.
  • the invention further relates to a process for the preparation of a herbicidal composition, characterized in that selected compounds are formulated with suitable auxiliaries to give crop protection agents.
  • the present invention also relates to a process for producing a growth-regulatory composition, characterized in that selected compounds are formulated with suitable auxiliaries to give crop protection agents.
  • the selected compounds can be formulated here, for example, in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, also high-strength aqueous, oily or other suspensions or suspoemulsions or dispersions, emulsifiable concentrates, emulsions, oil dispersions, pastes, dusts, sprinkling agents or granules and applied by spraying, atomizing, dusting, scattering or pouring.
  • the application forms depend on the purposes and the The nature of the selected connections and should ensure the finest possible distribution of the selected connections in any case.
  • the herbicidal composition contains a herbicidally effective amount of at least one selected compound and auxiliaries customary for the formulation of herbicidal compositions.
  • the selected compounds can be dissolved or dispersed in a solvent or a solvent, with further formulation auxiliaries being added for homogenization.
  • liquid or solid concentrates which are suitable for dilution with water can also be prepared from selected compound, if appropriate solvents or oil and optionally further auxiliaries.
  • EC, EW emulsifiable concentrates
  • SC suspensions
  • SL soluble concentrates
  • DC dispersible concentrates
  • pastes pastilles, wettable powders or granules, whereby the solid formulations are either soluble in water ( soluble) or dispersible (wettable).
  • corresponding powders or granules or tablets can also be provided with a solid coating ("coating") which prevents abrasion or premature release of the active ingredient.
  • auxiliary means the following classes of compounds: anti-foaming agents, thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • anti-foaming agents thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • SLs, EWs and ECs can be produced by simply mixing the corresponding ingredients, powder by mixing or grinding in special mill types (e.g. hammer mills).
  • DC, SCs and SEs are usually produced by wet milling, it being possible to produce an SE from a SC by adding an organic phase, which may contain further auxiliaries or selected compounds.
  • the manufacture is known.
  • Powders, materials for spreading and dusts can advantageously be prepared by mixing or grinding the active substances together with a solid carrier.
  • Granules for example coated granules, impregnated granules and homogeneous granules, can be prepared by binding the selected compounds to solid carriers. Further details of the production are known to the person skilled in the art, and e.g.
  • liquid additives such as mineral oil fractions of medium to high boiling point, such as kerosene or diesel oil, also coal tar oils and oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons, e.g. Paraffin, tetrahydronaphthalene, alkylated naphtha line or their derivatives, alkylated benzenes or their derivatives, alcohols such as methanol, ethanol, propanol, butanol, cyclohexanol, ketones such as cyclohexanone or strongly polar solvents, e.g. Amines such as N-methylpyrrolidone or water.
  • mineral oil fractions of medium to high boiling point such as kerosene or diesel oil
  • coal tar oils and oils of vegetable or animal origin aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons, e.g. Paraffin, tetrahydronaphthalene, alkylated naphtha line or their derivatives, alkyl
  • Solid carriers are, for example, mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate , Urea and vegetable products such as cereal flour, tree bark, wood and nutshell flour, cellulose powder or other solid carriers.
  • mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate , Urea and vegetable products such as cereal flour, tree bark, wood and nut
  • a large number of surface-active substances (surfactants) suitable for the formulations according to the invention are known to the person skilled in the art, such as, for example.
  • Alkali, alkaline earth, ammonium salts of aromatic sulfonic acids for example lignin, phenol, naphthalene and dibutylnaphthalenesulfonic acid, and of fatty acids, alkyl and alkylarylsulfonates, alkyl, lauryl ether and fatty alcohol sulfates, and salts of sulfated hexa-, Hepta- and octadecanols as well as fatty talc glycol glycol ether, condensation products of sulfonated naphthalene and its derivatives with formaldehyde, condensation products of naphthalene or naphthalene sulfonic acids with phenol and formaldehyde, polyoxyethylene octylphenol ether, ethoxyl
  • the herbicidal compositions or the selected compounds can be applied pre- or post-emergence. If the selected compounds are less compatible with certain crop plants, application techniques can be used in which the selected compounds are sprayed with the aid of sprayers so that the leaves of the sensitive crop plants are not hit, if possible, while the selected compounds are applied to the leaves underneath growing unwanted plants or the uncovered floor area (post-directed, lay-by).
  • the application rates of selected compounds are 0.001 to 3.0, preferably 0.01 to 1.0 kg / ha, depending on the control objective, the season, the target plants and the growth stage.
  • the provision of the herbicidal target further enables a method for identifying a protein with the biological activity of an SHMT which is not or only to a limited extent by a herbicide which has the SHMT as the site of action, e.g. the herbicidal selected compounds is inhibited.
  • a protein that differs from the SHMT is referred to as an SHMT variant.
  • SHMT also preferably denotes mitochondrial SHMT.
  • the above-mentioned method for generating variants of nucleic acid sequences consists comprehensively
  • nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID • NO: 8 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or
  • nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7 iii. functional equivalents of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7, with an identity of at least 46%, 47%, 48%, 49%, 50%,
  • the sequences selected according to the method described above are advantageously introduced into an organism.
  • Another object of the invention is therefore an organism produced by this method.
  • the organism is preferably a plant, particularly preferably one of the crop plants defined above, very particularly preferably in potato, tobacco, linseed, rape, soybean, barley, corn, cotton, wheat, pineapple, papaya or pea.
  • Modified proteins and / or nucleic acids which can impart resistance to the selected compounds in plants, can also be produced from the above-mentioned nucleic acid sequences via the so-called "site directed mutagenesis".
  • This mutagenesis can, for example, improve the stability and / or activity of the target protein or the properties like bond of the above-mentioned inhibitors according to the invention can be improved or changed in a very targeted manner.
  • Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555-558) describes a "site directed mutagenesis" method in plants which can be used advantageously.
  • EP-A-0 909 821 describes a method for modifying proteins using the microorganism E. coli XL-1 Red. During replication, this microorganism generates mutations in the introduced nucleic acids and thus leads to a change in the genetic information. By isolating the modified nucleic acids or the modified proteins and testing for resistance, it is easy to identify advantageous nucleic acids and the proteins encoded by them. After introduction into plants, these can then express resistance there and thus lead to resistance to the herbicides.
  • mutagenesis and selection are, for example, methods such as the in vivo mutagenesis of seeds or pollen and selection of resistant alleles in the presence of the inhibitors according to the invention, followed by genetic and molecular identification of the modified, resistant allele. Furthermore, mutagenesis and selection of resistances in cell culture by multiplying the culture in the presence of successively increasing concentrations of the inhibitors according to the invention. The increase in the spontaneous mutation rate can be exploited by chemical / physical mutagenic treatment. As described above, it is also possible to use microorganisms which have an endogenous or recombinant activity which is the Processed nucleic acids encoded proteins, and which are sensitive to the inhibitors identified according to the invention, isolate modified genes. The cultivation of the microorganisms on media with an increasing concentration of inhibitors according to the invention allows the selection and evolution of resistant variants of the targets according to the invention. The frequency of the mutations can in turn be increased by mutagenic treatments.
  • Another subject of the invention is therefore a method for creating nucleotide sequences which code for gene products which have a changed biological activity, the biological activity being changed in contrast to the fact that there is increased activity.
  • Increased activity is to be understood as an activity which is at least 10%, preferably at least 30%, particularly preferably at least 50%, very particularly preferably at least 100% higher than that of the starting organism or of the starting gene product.
  • the biological activity may have been changed so that the substances and / or agents according to the invention no longer or no longer bind correctly to the nucleic acid sequences and / or the gene products encoded by them.
  • no longer or no longer correctly means that the substances have been modified by at least 30%, preferably at least -50%, particularly preferably by at least 70%, very particularly preferably by at least 80% or not at all Bind nucleic acids and / or gene products in comparison to the starting gene product or the starting nucleic acids.
  • Yet another aspect of the invention therefore relates to a transgenic plant genetically modified by the method according to the invention described above.
  • transgenic plants which are resistant to the substances and / or agents containing these substances found by the method according to the invention can also be generated by overexpression of the nucleic acid sequences used in the above-mentioned methods according to the invention for identifying herbicides. Therefore, another object of the invention is stood a process for the production of transgenic plants which are resistant to substances which were found by a process according to the invention, characterized in that these plants comprise nucleic acids
  • nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7 with an identity of at least 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57 %, 58%, 59% preferably at least 60%, 61%, 62%, -63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%. Particularly preferably at least 76%, 77%, 78%, 79%,.
  • the method of producing resistant plants described above, according to the invention enable the development of new herbicides which have the broadest possible plant species independent effect (so-called. Total herbicides), in combination with the development of opposite de 'total herbicide resistant crops.
  • Useful plants resistant to total herbicides have already been described in various ways. There are several principles for achieving resistance:
  • the present invention therefore further includes the use of plants, the genes hit by the T-DNA insertion with the above-mentioned nucleic acid sequences SEQ ID NO: 7 and their functional equivalents for the development of new herbicides.
  • Alternative methods for identifying the homologous nucleic acids, for example in other plants with similar sequences, such as, for example, using transposons, are known to the person skilled in the art.
  • This invention therefore also relates to the use of alternative insertion mutagenesis methods for inserting foreign nucleic acid into the nucleic acid sequences SEQ ID NO: 7, in sequences derived from these sequences on the basis of the genetic code and / or their derivatives in other plants.
  • transgenic plants are produced using one of the above-described embodiments of the expression cassette according to the invention using common transformation methods also described above.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed SHMT can be determined, for example, in vitro by proliferation or by a germination test.
  • a change in the type and level of expression of the SHMT gene and its effect on the resistance to inhibitors of SHMT on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • Cloning processes such as restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, cultivation of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as with Sambrook al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) and Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Inter ⁇ cience (1994); ISBN 0-87969-309-6.
  • the bacterial strains used below (E. coli DH5, XL-1 blue, BL21DE (3)) were obtained from Stratagene, BRL Gibco or Invitrogen, Carlsberg, CA.
  • Example 1 Generation of a cDNA library in the plant transformation vector
  • cDNA bank a cDNA library (hereinafter referred to as "binary cDNA bank") in a vector which can be used directly for the transformation of plants
  • mRNA was isolated from various plant tissues and analyzed using the TimeSaver cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) rewritten into double-stranded cDNA.
  • the cDNA first strand synthesis was carried out with T ⁇ 2 _i 8 oligonucleotides according to the manufacturer's instructions. After size fractionation and ligation of EcoRI-Notl adapters according to the manufacturer's instructions and filling in the overhangs with Pfu DNA polymerase (Stratagene), the cDNA population was normalized. For this, the method according to Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776 was used, the cDNA being amplified by PCR with the oligonucleotide N1 under the conditions listed in Table 1.
  • the PCR product obtained was bound to the column matrix of the PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) and eluted with 300 mM NaP buffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS.
  • the DNA was denatured in a boiling water bath for 5 minutes and then renatured at 60 ° C. for 24 hours. 50 ⁇ l of the DNA were applied to a hydroxylapatite column and this was washed 3 times with 1 ml of 10 mM NaP buffer, pH 6.8.
  • the bound single-stranded DNA was eluted with 130 mM NaP buffer, pH 6.8, precipitated with ethanol and dissolved in 40 ⁇ l water. Of these, 20 ⁇ l were used for a further PCR amplification as described above. After further enrichment of ssDNA, a third PCR amplification was carried out as described above.
  • the production of the plant transformation vector for uptake - the cDNA population prepared as described above was carried out by restriction enzyme digestion of the vector pUC18 with Sbfl and BamHI, purification of the vector fragment followed by filling in the overhangs with Pfu DNA polymerase and religation with T4 DNA Liga ⁇ e (Stratagene).
  • the construct thus produced is referred to below as pUCl ⁇ Sbfl-.
  • the vector pBinAR was first cleaved with Notl, religated after filling in the ends, cleaved with Sbfl, religated after filling in the ends and then cleaved with EcoRI and HindIII.
  • the resulting fragment was ligated into a derivative of the bihear plant transformation vector pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25: 989-994), which enables plants to be transformed using Agrobacterium and Kanamycin resistance mediated in transgenic plants.
  • the construct generated here is referred to below as pSunl2 / 35S.
  • pUCl ⁇ Sbfl- was used as a template for a polymerase chain reaction (PCR) with oligonucleotides VI and V2 (see Table 2) and Pfu DNA polymerase.
  • the resulting fragment was ligated into the Smal digested pSunl2 / 35S, thereby generating pSunblues2.
  • pSunblues2 was ligated to the normalized and also NotL-cleaved cDNA population. After transformation into E.
  • the binary cDNA library contains cDNAs in "sense” and in “antisense” orientation under the control of the cauliflower mosaic virus 35s promoter, which can accordingly lead to “co-suppressions” and “antisene” effects after the transformation in tobacco plants ,
  • Leaf disks of sterile plants were incubated in a petri dish with the agrobacterial dilution for 5-10 minutes, followed by a 2-day incubation in the dark at 25 ° C. on Murashige-Skoog medium (Physiol. Plant. 15 (1962), 473) with 2 % Sucrose (2MS medium) with 0 ⁇ 8% Bacto agar, the cultivation was started after 2 days with 16
  • the integration of the cDNA of the clones into the genome of the transgenic lines was verified by PCR with the oligonucleotides Gl and G2 (see Table 2) and genomic DNA which was prepared from the corresponding transgenic lines.
  • TAKARA Taq-DNA polymerase according to the manufacturer's instructions (MoBiTec, Göttingen) was preferably used.
  • the cDNA clone of the binary cDNA bank used for the transformation served as a positive control as a template for a PCR reaction.
  • PCR products of identical size or possibly the same cleavage pattern, which were obtained after cleavage with different restriction enzymes, served as evidence of the integration of the corresponding cDNA.
  • the insert of the clone nt002001035r was thus detected in the transgenic plants with the above-mentioned phenotypes.
  • Northern hybridization was also used to demonstrate the repression of a mRNA of approx. 1.7 kb hybridizing with the cDNA of clone nt002001035r under stringent conditions in leaf tissues of the transgenic plants compared to control plants (Nicotiana tabacum, variety Samsun NN).
  • a probe of the insert from nt002001035r was marked using the high prime DNA labeling kit (Röche, Mannheim). The probe was used to hybridize total RNA or mRNA from tissues of the corresponding transgenic plants and control plants, which had been separated by standard methods and transferred to nitrocellulose membranes (Schleicher and Schull, Dassel, Germany).
  • transgenic plants of the line P_0000000315 had similar phenotypes.
  • Line 18/75 also had hardly any roots and was ultimately so badly damaged that it died after about 6 weeks.
  • Part of the chimeric cDNA from clone nt002001035r (SEQ ID N0: 1) of the cDNA (nucleotides 506-652) codes for a peptide fragment (SEQ ID NO: 2) with a high degree of identity to plant SHMTs.
  • Sequence comparisons with the aid of the BLAST algorithm Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol. 215, pp. 403-410) against a tobacco EST database yielded further clones which correspond to the section of SEQ ID N0: 1 to > 99% are identical and have a high identity with mitochondrial SHMTs.
  • clone nt006100023 SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 The portion of SEQ ID NO: 3 coding for a mitochondrial SHMT peptide of 180 A inoic acids (SEQ ID N0: 2) contains the region of SEQ ID NO: 378 bp coding for a mitochondrial SHMT peptide fragment: l.
  • Another, non-chimeric clone (clone nt006043063, SEQ ID NO: 5), which is identical to the partial region of SEQ ID: 01 coding for the SHMT except for the nucleotide positions 11, 262 and 333, was also transformed into tobacco plants.
  • the transgenic plants obtained had the same phenotypes as the plants of the line P_0000000315.
  • SEQ ID NO: 7 The sequence in the overlap area (from nucleotide 1288 to 1760) with the exception of one nucleotide (position 81) is identical to SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 7 is 1835 nt long and contains an open reading frame of 1554 bp which is suitable for a Polypeptide encoded with a length of 518 amino acids (from nucleotide 56 to 1609, SEQ ID NO: 8). That prolongs s te identity is found between SEQ ID. NO: 7 and a mitochondrial SHMT from potato (86.8% identical to Genbank # Z25863).
  • the coding region of AJ271726 was amplified according to standard techniques by means of PCR from cDNA banks and ligated into the vector pCR 2.1 TOPO (constructs SHMT1 and SHMT2, Table 8). The constructs generated were then amplified by means of special oligonucleotides by PCR and fragments obtained were ligated into the expression vectors pCR T7 / CT TOPO and pCR T7 / NT-TOP0 (Invitrogen) (constructs SHMT 3-6, Table 7). In this way fusion proteins were generated with C-terminal or N-terminal hexahitidine tags.
  • shortened versions of the SHMT were generated using the oligonucleotides shown in Table 8 in order to exclude the mitochondrial transit sequence which could hinder functional expression. Since the mitochondrial trasite sequence of the SHMT is not clearly known, various N-terminally shortened versions were generated. To narrow down the range to be delta, references could be found in the literature (Turner et al. JBC 19, pp.13528-13534, 1992).
  • the PCR was carried out according to standard conditions (for example according to Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press) in 36 cycles, the annealing temperatures being between 44 and 55 ° C and the polymerization time was 60 seconds per 100Obp.
  • the templates and the primers and annealing temperatures used for the respective templates are listed in Table 7.
  • the products obtained in the PCR were ligated into the vectors shown in Table 7 and transformed into E. coli.
  • the expression was in E. coli BL21 (DE3) strains such as BL21 (DE3) pLysS or BL21 (DE3) pLysE (Invitrogen), BL21-CodonPlu ⁇ (DE3) or BL21-CodonPlus (DE3) RIL (Stratagene) performed after induction with IPTG. Standard protocols (Invitrogen) were used.
  • the SHMT6 and SHMT7 expression products were purified by affinity chromatography over Ni agarose. This was done according to the manufacturer's instructions (Qiagen).
  • SHMT can be isolated from plant mitochondria and measured using a radioactive method according to the invention (Bourguignon et al. Biochem. J. 255, pp. 169-178, 1988).
  • the activity of the SHMT protein recombinantly expressed and optionally purified in Example 4 was also determined using this method according to the invention.
  • the SHMT reaction was tested by means of an HPLC-based separation process which is based on the separation of tetrahydrofolate from Cl-tetrahydrofolate.
  • the enzyme-containing aqueous test solution 0.4 5mM 2-mercaptoethanol, 2mM tetrahydrofolate, 20mM serine, 56mM KH 2 P0 4 pH 7.4 containing l-100 ⁇ g mitochondrial SHMT was incubated for 30 min with shaking, with 0.1 ml 0.36M HC1 per 100ml test solution denatured and precipitated by centrifugation for 5 minutes at a high g number (10000g).
  • the 'analytical separation was carried out by applying a gradient of 0-100% buffer B (water) over a period of 6 min.
  • the enzymatic activity was determined in analogy to the method described by Stover and Schirch (Anal. Biochem. 202, pp. 82-88).
  • This method according to the invention is based on coupling the SHMT reaction to the reaction catalyzed by NAD-dependent methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (MTD) and photometric measurement at 340 nm.
  • MTD NAD-dependent methylene tetrahydrofolate dehydrogenase
  • photometric measurement at 340 nm.
  • the quantities of the auxiliary enzyme MTD required for this were obtained by recombinant expression of the MTD from Saccharomyces cerevisiae in E.
  • coli as follows: After isolation of the nucleic acid fragment coding for the MTD from genomic DNA as described by Appling and West (Methods in Enzymology 281, pp 178-188) it was cloned into the vector pCR 2.1 TOPO. The construct thus obtained was over the oligonucleotides 5 '-TTTTTCTTTAGACAGTTCTACGTTC-3' and 5 '-ATGTCGAAGCCTGGTCGTA-3' amplified by PCR. The PCR was carried out according to standard conditions (for example according to Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press). carried out in 36 cycles, the annealing temperature being 55 ° C.
  • the products obtained in the PCR were ligated into the expression vector pCR T7 / CT-TOP0 (construct MTD) and in E. coli BL21 (DE3) strains such as BL21 (DE3) pLy ⁇ S or BL21 (DE3) pLy ⁇ E (Invitrogen), BL21-CodonPlu ⁇ (DE3) or BL21-CodonPlus (DE3) RIL (Stratagene) expressed. Standard protocols (Invitrogen) were used.
  • the expression product of the MTD construct was purified on Ni-agarose by affinity chromatography, following the manufacturer's instructions (Qiagen).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Serin Hydroxymethyltransferase (E.C. 2.1.2.1) als neues Target für Herbizide und Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Serin Hydroxymethyltransferase, welche bei nicht Anwesenheit Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter bedingt, umfassend die Nukleinsäuresequenz SEQ ID No:3 sowie funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz oder die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7 sowie funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen, von funktionellen Analoga der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO: 7 oder von Polypeptiden codiert durch eine der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung, welche Serin Hydroxymethyltransferasen inhibieren sowie die Verwendung dieser über das Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide.

Description

Serin Hydroxymethyltransferase als Target für Herbizide
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Serin Hydroxymethyltransferase (E.C. 2.1.2.1) als neues Target für Herbizide und Nukleinsauresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Serin Hydroxymethyltransferase, welche bei nicht Anwe- senheit Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter bedingen, umfassend die Nukleinsauresequenz SEQ ID No:3 sowie funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsauresequenz oder die Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 sowie funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsauresequenz. Des wei- teren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen, von funktionellen Analoga der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7 oder von Polypeptiden codiert durch eine der vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit her- bizider Wirkung, welche Serin Hydroxymethyltransferasen inhibieren sowie die Verwendung dieser über das Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide.
Das grundlegende Prinzip, Herbizide über Inhibierung eines defi- nierten Targets zu identifizieren ist bekannt (z.Bsp. US
5,187071, WO 98/33925, WO 00/77185). Generell besteht ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Herbizide darstellen könnten. Gründe hierfür sind auftretende Resistenzproblematiken von an bereits bekannten Targets wirkenden herbiziden Wirkstoffen und das ständige Bemühen neue herbizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Verträglichkeit und/oder geringe Aufwandmengen auszeichnen.
Die Detektion von neuen Targets ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines StoffWechselweges ist, häufig das Wachstum der Pflanze nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass die Pfanze auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Exi- stenz nicht bekannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechselweg ist. Ferner zeichnen sich pflanzliche Genome durch eine große funktionelle Redundanz aus. Im Genom von Arabidopsis thaliana liegen funktional äquivalente Enzyme im Vergleich zu Insekten oder Säugern häufiger in Genfami- lien vor (Nature, 2000, 408 (6814 ) :796-815) . Diese Annahme wird experimentell bestätigt durch die Tatsache, dass grosse Gen- Knock-out-Programme durch T-DNA- oder Transposoninsertion in Ära- bidopsis bisher weniger ausgeprägte Ph notypen lieferten als erwartet (Curr. Op. Plant Biol. 4, 2001, pp.111-117).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, neue Targets zu identifizieren, die für das Wachstum von Pflanzen es- se'ntiell sind bzw. deren Inhibierung für die Pflanze zu einem verminderten Wachstum führen, sowie Verfahren bereitzustellen, welche zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung geeignet sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch die Bereitstellung von Serin Hydroxymethyltransferase (SHMT) als neues Target für Herbizide sowie durch die Bereitstellung von Nukleinsauresequenzen kodierend für ein Polypetid mit der biologischen Aktivität einer SHMT um- fassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleins uresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 3, umfassend einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 91% zu der SEQ ID NO: 3;
sowie von Nukleinsauresequenzen umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten' läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 88% zu der SEQ ID NO: 7.
Der Begriff "umfassend" oder "umfassen" bezogen auf Nuklein- oder Aminosäuresequenzen meint, daß die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz am 3 ' oder am 5 ' Ende zusätzliche Nukleinsauresequenzen enthalten kann, wobei die Länge der zusätzlichen Nukleinsauresequenzen 2000 bp am 5' und 3' Ende der erfindungsgemäßen Nuklein-, Säuresequenzen, vorzugsweise 1500 bp am 5 ' und 100 bp am 3 ' Ende nicht überschreitet. An dieser Stelle werden nun weitere der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.
"Affinitäts-Tag": Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen kodierende Nukleinsauresequenz mit der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klo- nierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient zur Isolierung, Anreicherung und/oder gezielten Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts-Chromato- graphie aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann vorteilhaft eine Protease-Schnittstelle (z.B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespalten werden kann. Beispiele für gängige Affinitäts-Tags sind das "His-Tag" z.B. von Quiagen-, Hilden, "Strep- Tag", das "Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Biolabs, das Maltose-bindende Protein (pMal) von New England Biolabs und das sogenannte CBD-Tag von Novagen. Der Affinitäts-Tag kann dabei am 5'- oder 3 '-Ende der kodierenden Nukleinsäurese- quenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz angebracht sein.
"Antisense- oder Cosuppressions-Technik" beschreibt Technologien zur Suppression (Verringerung) der Genexpression, worin ein Gen kodierend für einen im jeweiligen Experiment zu definierenden Teil eines zu supprimierenden natürlichen Gens in "sense" oder "antisense" Orientierung unter Kontrolle eines geeigneten Promotors in eine Modellpflanze transformiert wird. Die auf diese Weise erzeugten transgenen Pflanzen weisen in der Regel eine un- terschiedlich stark ausgeprägte Suppression der Transkription des natürlichen Gens auf, die mit geeigneten Methoden nachgewiesen werden kann. Diese Technik erlaubt somit, die Auswirkungen eines in seiner Expression reduzierten Gens auf einen Organismus zu studieren (zur Übersicht siehe Trends in Plant Science, 2000, 5(9), 394-396).
"Enzymatische Aktivität / Aktivitätstest": Der Begriff enzymati- sche Aktivität beschreibt die Fähigkeit eines Enzyms; ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln.. Die enzymatische Aktivität kann in einem sogenannten Ak ivitätstest über die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) oder die Abnahme eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden. "Biologische Aktivität einer Serin Hydroxymethyltransferase": Dieser Begriff beschreibt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß durch die Präsenz einer Serin Hydroxymethyltransferasem vorzugsweise einer glyoxysomalen Serin Hydroxymethyltransferase Wachstums- und Überlebensfähigkeit vermittelt wird. Wird die Aktivität eines Proteins mit der biologischen Aktivität einer glyoxysomalen Serin Hydroxymethyltransferase gehemmt, so führt dies zu einem verminderten Wachstum, einem Wachstumsstillstand oder einem Absterben der Pflanze.
"Expressionskassette": Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz funktioneil verknüpft mit mindestens einem genetischen Kontrollelement, wie einem Promotor, sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement, wie einem Terminator. Die Nukleinsauresequenz der Expressionskasette kann beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extra-chromosomal oder integriert in das Genom vor- liegen. Die entsprechenden Nukleinsauresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Auch artifizielle Nukleinsauresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expression eines durch eine erfindungsgemäße Nu- kleinsäuesequenz kodierten Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer SHMT in einer Zelle oder einem Organismus ermögli- chen. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon-Nutzung der zu transformierenden Organismen optimiert wurden.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich be- kannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbaustei- nen wie beispielsweise durch Fragment-Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise in bekannter Weise nach der Phosphoa iditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleo- tid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente unter- einander erfolgt über allgemeine Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sa brook, "Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.
"Funktionelle Verknüpfung" : Unter einer f nktionellen oder operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung regula- tiver Sequenzen bzw. genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulativen Sequenzen bzw. jedes der genetischer Kontrollelemente ihre Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsauresequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 3 oder Teilen der SEQ ID NO: 3 hybridisieren und befä- . higt sind, die Expression eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer SHMT in einer Zelle oder einem Organismus zu be- wirken. Der Begriff funktionelle Äquivalente umfasst demnach auch die Nukleinsauresequenzen SEQ ID NO: 7 sowie Nukleinsauresequenzen, welche mit der SEQ ID NO: 7 oder Teile der SEQ ID NO: 7 hybridisieren und befähigt sind, die Expression eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität einer SHMT in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.
Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10-50 bp, vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/Oli- gonukleotid, der Länge des Fragmentes oder der vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybri- den gleicher Länge.
Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC - 0,15 M NaCl, 15 M Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwi- sehen etwa 30°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäu- re mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedin- gungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen': Aus- ubel et al. (eds), 1985, "Current Protocols in Molecular Bio- logy", John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Es- sential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem funktionellen Äquivalent der SEQ ID NO: 3 versteht man weiterhin auch Nukleinsauresequenzen, die einen Teilbereich umfassen, der mit der SEQ ID NO:3 bis zu einem definierten Prozentsatz homolog ist und ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Serin Hydroxymethyltransferase kodieren. Ein Beispiel für ein Nukleinsauresequenzen, die einen Teilbereich umfassen, der mit der SEQ ID NO: 3 bis zu einem definierten Prozentsatz identisch ist, ist die SEQ ID NO: 7 sowie deren wie oben definierten funktionellen Äquivalente.
Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläu- fige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp.389-391) oder "Stag- gered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon-Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäurese- • quenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsauresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents kann sich auch auf das durch die entsprechende Nukleinsauresequenz kodierte Aminosäuresequenz beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktio- nelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz einen Teilbereich umfaßt, der mit der SEQ ID NO: 4 bis zu einem definierten Prozentsatz von mindestens 91% identisch bzw. homolog ist.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adap- tierte Nukleinsauresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
"Genetische Kontrollsequenz": Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist äquivalent zu sehen mit dem Begriff "regulato- rische Sequenz". Er beschreibt Sequenzen, die einen Einfluss auf die- Transkription und gegebenenfalls Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in prokaryotischen oder eukaryontischen Organismen haben. Beispiele hierfür sind Promotoren oder sogenannte "enhancer" Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde. Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Ausgangsorganismus. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5 '-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodie- rende 3 '-Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Inser- tion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Genetische Kontrollεequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, sowie die Chromatinstruktur beeinflussende Sequenzen (z.B. Matrix attachment regions (MAR's)) die die expressionssteu- ernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Absci- sinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135), Kälte- und Trockenstress (Plant Cell 1994, (6): 251-264) und Hitzestress (Molecular & General Genetics, 1989, 217 ( 2-3 ) : 246-53) beschrieben.
"Homologie" zwischen zwei Nukleinsauresequenzen oder Polypeptid- Sequenzen wird durch die Identität der Nukleinsauresequenz/Poly- peptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus BESTFIT (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung fol- gender Parameter für Polypeptide
Gap Weight: 8 Length Weight: 2 Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003
und folgender Parameter für Nukleinsäuren
Gap Weight: 50 Length Weight: 3 Average Match: 10.000 Average Mismatch: -9.000
berechnet wird.
Anstelle des Begriff "homolog" oder "Homologie" wird im Folgenden auch gleichbedeutend der Begriff Identität verwendet.
"Mutationen" von Nuklein- oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen , Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substi- tution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften des Zielproteins im wesentlichen beibehalten werden.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromoso- malen Locus in dem Herkunftsorganismus. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsauresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsauresequenz zumindest an 5 ' - oder 3 '-Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevor- zugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp.
"Pflanzen" im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsma- terial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.
"Reaktionszeit" bezeichnet die Zeit, die man für die Durchführung eines Aktivitätstests bis zum Erhalt einer signifikanten Aussage über eine Aktivität benötigt und hängt sowohl vonder spezifischen Aktivität des im Test eingesetzten Proteins als auch von der verwendeten Methode und der Empfindlichkeit der verwendeten Geräte ab. Dem Fachmann ist die Ermittlung der Reaktionszeiten bekannt. Bei auf photometrischen Methoden basierenden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung liegen die Reaktionszeiten beispielsweise im allgemeinen zwischen > 0 bis 120 Minuten.
"Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen herstellbar durch rekombinante DNA-Technologie.
"Rekombinate DNA-Technologie": allgemein bekannte Techniken zur Fusionierung von DNA-Sequenzen (z.B. beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press) .
"Replikationsursprünge" gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganis- men und Hefen z.B. der pBR322 ori oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und der ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068).
"Reportergene" kodieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Re- sistenzassay oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes vorgenommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(l):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 38 (1) :44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechni- ques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sei 1996, 116:59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178:121; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414), sowie Luziferasegene, im allgemeinen die ß-Galactosi- dase oder die ß-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das Ura3-Gen. "Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika, oder andere toxische Verbindungen: Beispielhaft zu nennen seien hier das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycosid-Antibiotika Neomycin (G 418), Kanamycin, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), das ' hygro Gen (Marsh JL et al., Gene. 1984; 32 (3) :481-485) , das sul Gen (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15 ( 1) : 127-136 ) , das Hygromycin-Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das she- ble Gen, das eine Resistenz gegen das Bleomycin Antibiotikum Zeo- ein verleiht. Weitere Beispiele für Selektions arker-Gene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eine Antimetaboliten-Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr- Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv. ) 13 (1994) 142-149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mul- ligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 8047-8051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithin-Decarboxylase) Gen (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Har- bor Laboratory, Hrsg. ) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K etal., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung hetero- loger DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus
"Target/Target Protein": ein Polypeptid codiert über die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz, welches ein Enzym im klassischen Sinne sein kann oder z.B. ein Strukturprotein, Entwicklungsprotein, Regulationsproteine wie Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren, Untereinheiten von Kanälen, Transport- proteine, regulatorische Untereinheiten die einem Enzymkomplex eine substrat- oder Aktivitätsregulation verleihen. Allen Targets oder Wirkorten gemein ist dabei, dass deren funktionale Anwesenheit essentiell für das Überleben oder die normale Entwicklung und das Wachstum sind.
"Transgen": Bezogen auf eine Nukleinsauresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder einen Organismus transformiert mit der vorstehend genannten Nukleinsauresequenz, Expressionskassette oder Vektor beschreibt der Ausdruck transgen alle solche durch gentechnische Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder die Nukleinsauresequenz des Zielproteins oder eine mit der Nukleinsauresequenz des Zielproteins funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Me- thoden modifiziert wurden. Die Modifikation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der entsprechenden Nukleinsauresequenz erreicht werden.
Die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen codierten Polypeptide zeigen die biologische Aktivität einer Pyridoxal- phosphat abhängigen Serin Hydroxymethyltransferase (SHMT;
E.C. 2.1.2.1). SHMTs werden in nahezu allen Zelltypen gefunden.
Das Enzym wurde erstmals aus Kaninchenleber (Schirch & Mason, JBC
238, pp. 1032-1037, 1963) und seit dem aus vielen Organismen wie z.B. Pflanzen isoliert.
Inhibitoren für pflanzliche SHMTs wurden bisher nicht beschrieben. SHMT aus Euglena Gracilis kann durch millimolare Konzentrationen verschiedener Aminosäuren inhibiert werden (z.B. Glycin, Serin, Cystein) (Sakamoto et al., Agricultural and Biological
Che istry, 1991, 55(9), 2243-2249). Das Aminosäureanalog O-Amino- D-Serine wirkt in μM Konzentrationen inhibierend auf SHMT aus Schaf (Baskaran et al., Biochemistry, 1989, 28(25), 9607-9612). Weiterhin bekannt ist, daß Mimosine, eine pflanzliche Aminosäure, an SHMT aus CHO Zellen durch Photo-Verknüpfung zwar gebunden werden kann, diese jedoch nicht inhibiert (Lin et al. JBC 271, pp. 2548-2556, 1996).
In Pflanzen können eine cytosolisehe und eine mitochondriale Form der SHMT unterschieden werden, die an unterschiedlichen Stoff- wechselwegen beteiligt sind. Darüber-hinaus wird noch die Existenz einer plastidäre SHMT vermutet (Douce et al. Trends in Plant Science 6, pp. 167-176, 2001). Die cytolosiche Form der SHMT ist an der Bereitstellung von Cl-Einheiten für den Purin- und Methionin Metabolismus durch Katalyse der reversiblen Umsetzung von Serin zu Glycin beteiligt. Eine cytosolisehe SHMT Proteinsequenz aus Schaaf, die mit der SEQ ID NO: zu 55.09% identisch ist, ist unter der Gen Bank Acc. No. P35623 zu finden.
In Arabidopsis wurden fünf Gene für SHMT (SHMl-5) gefunden, von denen zwei, SHM1 (Gen Bank Acc. No. AJ271726, Identität zur SEQ ID NO: 3 78.65%; Gen Bank Acc. No. Q 90M9,' Identität zur SEQ ID N0:4 83.71%)und SHM2 (Gen Bank Acc. No. Q04952; Identität zur SEQ ID NO: 4 83.62%) vermutlich mitochondrial lokalisiert sind, wäh- rend SHM3, SHM4 und SHM5 cytosolisehe Formen darstellen (McClung et al. Plant Physiol. 123, pp381-391, 2000). Weiterhin beschrieben wurde eine mitochondriale SHMT aus Erbsenmitochondrien (Pisum sativum; Gen Bank Acc. No. P34899, Identität zur SEQ ID NO: 4 83.52%; Turner et al. JBC 267, pp. 13528-13534, 1992). Sequenzen kodierend für mitochondriale SHMT sind auch aus Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No. Z25863 Identität zur SEQ ID NO: 3 90.62%, Iden- 5 tität zur SEQ ID NO: 4 90.45%; Identität zur SEQ ID NO: 7 86.8%) sowie aus Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. P49358, Identität zur SEQ ID NO: 4 86.44%) bekannt. Des weiteren findet sich noch eine EST-Nukleinsäuresequenz aus Lycopersicon esculentum, welche vermutlich ebenfalls für eine mitochondriale SHMT kodiert (Gen 10 Bank Acc. No. AW040079, Identität zur SEQ ID N0:3 90.056%).
In der Literatur sind Arabidopsis thaliana Mutanten beschrieben, in deren Mitochondrien biochemisch keine SHM -Aktivität nachgewiesen werden konnte (stm-Pflanzen) . In diesen Mutanten ist die
15 Photosynthese unter ambienten C02-Konzentrationen inhibiert und die Pflanzen sind nicht lebensfähig. Während die st Pflanzen nur unter erhöhten C0-Konzentrationen voll lebensfähig sind, weisen sie nach Transfer in ambiente C02-Konzentrationen Chlorosen auf und sterben zum Teil (So erville und Somerville, Plant Physiol.
20 67, 1981, pp.666-671; Somerveille und Somerville, J. Exp. Bot. 34, 1983, 415-424). Welches der mitochondrialen SHM-Gene der stm- Pflanzen die Mutation aufweist, ist nicht bekannt. SHMl-Trans- kriptgroßen und -mengen sind in stm Mutanten gegenüber dem Wildtyp unverändert. Nach Beckmann et al. (Planta 202, pp. 379-386,
25 1997) ist eine mögliche "loss of function" - Mutation des
SHMl-Gens für den Phänotyp der Mutanten wahrscheinlich nicht verantwortlich, da dieser durch die zweite SHMT, SHM2, ausgeglichen wird. Somit ist bislang kein eindeutiger Nachweis erbracht, dass die mitochondriale SHMT essenziell in Pflanzen ist und damit als
30 Target für Herbizide geeignet sein könnte.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass sich Genprodukte, welche über Nukleinsäuren kodiert werden, welche die SEQ ID NO: 3 umfassen, als Targets für
35 Herbizide eignen. Der Nachweis wurde jeweils durch gezielte Verringerung der Expression des entsprechenden Targetproteins in Ni- cotiana tabacum erbracht. Diese Pflanzen wiesen Phänotypen auf, die mit durch Herbizdidapplikation erzeugten Phänotypen vergleichbar sind. Beobachtet wurden Wachstumsretardierungen und
40 chlorotische Blätter sowie in einigen Fällen das Absterben ganzer Pflanzen oder von Pflanzenteilen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pflanzliche SHMT, im folgenden der Einfachheit halber als "SHMT" bezeichnet, vorzugs- 45 weise mitochondriale SHMT, und deren Verwendung als neues Target' für Herbizide. Der Begriff "SHMT" beschreibt demnach vorzugsweise mitochondriale SHMT. In diesem Rahmen werden Nukleinsäuresequen- zen beansprucht, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer SHMT kodieren, wobei die Nukleinsäuren
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 3, umfassend einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 1% zu der SEQ ID NO: 3
umfassen. Hierbei sind Nukleinsauresequenzen bevorzugt, die für eine mitochondriale SHMT kodieren.
Ein Beispiel für eine Nukleinsauresequenz gemäß c) ist die SEQ ID NO: 7, welche einen Teilbereich mit einer Identität von 100% zu der SEQ ID NO: 3 umfasst. Somit werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Nukleinsauresequenzen beansprucht, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer SHMT kodieren, umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 88% zu der SEQ ID NO: 7.
Wie aus der Definition des Begriffes SHMT hervorgeht, sind auch hierbei sind Nukleinsauresequenzen bevorzugt, die für eine mitochondriale SHMT kodieren.
Die vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen werden im folgen- den als "erfindungsgemäße Nukleinsauresequenzen" bezeichnet.
Polypeptide, die durch eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz kodiert werden, verursachen in reduzierter Menge Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter in Pflanzen-. Eine Reduktion des Polypeptides bedeutet, daß die Menge des Polypeptides über gentechnische Methoden reduziert wird. Verglichen wird eine derartig modifizierte Pflanze mit einer Pflanze, die bezüglich die- ses Polypeptides keine genetischen Modifikationen aufweist, ansonsten aber mit dem Genotyp der genetisch manipulierten Pflanze identisch ist, unter identischen Wachstumsbedingungen.
Die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung und stellen neue Targets für Herbizide dar, welche zur Bekämpfung unerwünschter Pflanzen geeignet sind.
Unter unerwünschten Pflanzen sind im weitesten Sinne alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind, zum Beispiel:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen: Sinapis , Lepidium, Galiu , Stellaria , Matricaria, Anthemis, Galinεoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus , Portulaca, Xanthium, Convolvul ε, Ipomoea, Polygonum, Sesbania , Ambrosia, Cirsium, ' Carduus, Sonchus, Sola- num, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon , Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea , Trifolium, Ranunculus , Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen: Echinochloa; Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleuεine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Mo- nochoria, Fimbriεtysliε , Sagittarxa, Eleochariε , Scirpuε, Paspa- lum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium , Agroεtiε , Alopecurus, Apera .
Die funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 3 umfassen einen Teilbereich, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von mindestens 91% vorzugsweise mindestens 92%, 93% und 94% bevorzugt mindestens 95% oder 96% besonders bevorzugt mindestens 97% oder 98%, ganz besonders bevorzugt mindestens 99% aufweist.
Die funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 4 umfassen einen Teilbereich, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von mindestens 91% vorzugsweise mindestens 92%, 93% und 94% bevorzugt mindestens 95% oder 96% besonders bevorzugt mindestens 97 oder 98%, ganz besonders bevorzugt mindestens 99% aufweist.
Die funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 7 weisen eine Identität mit der SEQ ID No:7 von mindestens 88%, 89%, 90% bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95% besonders bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% auf. Die SEQ ID NO: 3 oder Teile der SEQ ID NO: 3 können für die Herstellung von Hybridisierungssonden verwendet werden, über welche die entsprechenden Vollängengene isoliert werden können. Gleichermaßen können die SEQ ID NO: 7 oder Teile der SEQ ID NO: 7 ver- wendet werden. Die Herstellung dieser Sonden sowie die Durchführung der Experimente ist bekannt. Sie kann zum Beispiel über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nicht radioaktiver Sonden mittels PCR und der Verwendung von entsprechend markierten Oligo- nukleotiden mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfol- gen. Die hierfür erforderlichen Technologien sind beispielsweise in T. Maniatis, E.F. F itsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) aufgeführt. Die entsprechenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. random Mu- tagenesis) so modifiziert werden, dass sie für weitere Zwecke eingesetzt werden können, z.B. als Sonde., die spezifisch zu RNA sowie den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert zwecks Analyse der entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen.
Des weiteren können die oben genannten Sonden für die Detektion und Isolation von funktionellen Äquivalenten der SEQ ID NO:3 (oder SEQ ID NO: 7) aus anderen Pflanzenspezies aufgrund von Sequenzidentitäten verwendet werden. Hierbei wird ein Teil oder die gesamte Sequenz der entsprechenden SEQ ID NO: 3 (oder SEQ ID NO: 7) als Sonde zum Screening in einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Pflanzenspezies oder in einer Computer-Recherche nach Sequenzen funktioneller Äquivalente in elektronischen Datenbanken verwendet.
Bevorzugte Pflanzenspezies sind hierbei die bereits eingangs erwähnten unerwünschten Pflanzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Expressionskassetten enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz; und
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b) .
Weiterer Gegenstand ist die Verwendung der oben dargestellten Ex- pressionskassette sowie die Verwendung von Expressionskasetten enthaltend die vorstehend genannten Komponenten a) und b) oder c), worin die Nukleinsauresequenz aus a) einen Teilbereich um- fasst, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von mindestens 60% vorzugsweise mindestens 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% besonders bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 5 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aufweist, zur Expression einer SHMT, die in-vitro Testsystemen verwendet werden kann. Die vorstehend genannten Nukleinsauresequenz aus a), welche einen Teilbereich umfassen, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von
10 mindestens 60% aufweist, umfassen demnach auch funktionelle Äquivalent der SEQ ID NO : 7 mit einer Identität von mindestens von mindestens 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%,
15 74%, 75% besonders bevorzugt mindestens '76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Beide Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Ex- pressionskasetten werden im folgenden als erfindungsgemäße Ex-
20 pressionskassette bezeichnet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3 '-Ende ein Transkriptions-Terminations-Signal 25 und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche mit der dazwischenliegenden für eine SHMT kodierenden Nukleinsauresequenz funktioneil verknüpft . sind.
Unter den erfindungsgemäßen Expressionskassetten sind auch Ana- 30 loga zu verstehen, die zum Beispiel durch eine Kombination der ■ einzelnen Nukleinsauresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehr- fachkonstrukte) , auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Ko- transformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können. 35
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen nach Punkt a) für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder für Vektoren enthaltend erfindungsgemäße Expressionskasetten sind beispielsweise Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, Ipp- , lac-, laclq-, T7-, 40 T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotor, die zur Expression der SHMT in gram-negativen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen sind beispiels- 45 weise in den Promotoren amy und SP02, die zur Expression der
SHMT in gram-positiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, AOX1 und GAP enthalten, die zur Expression der SHMT in Hefestämmen verwendet werden können.
Als zur Expression in Insektenzellen geeignete genetische Kon- trollsequenzen sind exemplarisch der Polyhedrin-Promotor sowie der plO-Promotor (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/ Techn. 6, 47-55) zu nennen.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der SHMT in Zellkultur sind sind neben PolyadenylierungsSequenzen wie z.B. aus Si ian Virus 40 eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomega- lovirus oder Simian Virus 40.
Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der SHMT in Pflanzen sind in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S' [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Pro otor enthalten, vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt sind Promotoren viralen Ursprungs wie der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812). Weitere bevorzugte konstitutive Promotoren sind zum Beispiel der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991).
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor als genetische Kontrollsequenz enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer (EP-A-0388186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,
397404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können ebenfalls verwendet werden.
Geeignet sind ferner Promotoren die eine gewebe- oder organspezifische Expression z.B. in Antheren, Ovarien, Blüten und Blütenorganen, Blättern, Schließzellen, Trichomen, Stengel, Leitgeweben, Wurzeln und Samen vermitteln. Ebenfalls geeignet sind hier neben den oben genannten konstitutiven Promotoren, insbesondere solche Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartof- fei (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-l,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245). Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US- 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1(9 ) : 839-53 ) , des 2S Albumingens (Joseffson LG et al., J Biol Che 1987, 262:12196-12201), des Le- gumins (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2 ) :326-331) , des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & Ge- neral Genetics 1991, 225(3) :459-67 ) des Napin Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090).
Weitere als genetische Kontrollsequenzen geeignete Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kar- toffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSSl) oder der Spora- min Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruch- treifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruch- treifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blüten- spezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor .des P-rr Gens (WO 98/22593) oder spezifische Piastiden- oder Chromoplasten-Promoto- ren, wie beispielsweise der RNA-Polymerase Promotor (WO 97/06250) oder auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotrans- ferase aus Glycine ax (siehe auch Genbank Accession Nr U87999) oder ein anderer Nodien-spezifischer Promotor wie in EP-A 249676.
Unter zusätzlichen Funktionselementen b) sind beispielhaft aber nicht einschränkend Reportergene, Replikationsursprünge, Selek- tionsmarker und sogenannte Affinitäts-Tags, fusioniert mit der SHMT direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine Protease-Schnittstelle zu verstehen. Weitere geeignete zusätzliche Funktionselemente sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das Pe- roxisom, das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompar- timent des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons , IS-Elemente, Phas ide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chro osomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsauresequenzen bestehen.
Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., "Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual." 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontischen, nicht humanen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombinan- ten Herstellung der SHMT eingesetzt werden, wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organismus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsauresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsauresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Hierbei kann das Einbringen der erfindungsgemäßen Nuklein- säure(n), der Expressionskassette oder des Vektors in die entsprechenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.
Für dikotyle Pflanzen können die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden. Geeignete Methoden sind das biolistische Verfahrens oder Protoplastentransformation (vergl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Compre- hensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cabridge) , die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA- haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispiels- weise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in:
Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben.
Die Transformation mittels Agrobakterien sowie die für die Transformation zu verwendenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711. Die intermediären Vektoren können auf- grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helfer- plasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tu efa- ciens übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthal- ten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (; Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187) , EP A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Off- setdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobacterium basierender Vektoren wurde beschrieben ( Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11,(199.2) 76-80; May et al; Bio- . technology 13.(1995) 486-492; Conner und Domi-sse; Int. J. Plant Sei. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al; Bioteehnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631) die Protoplastentransformation, die Elektro- poration von partiell permeabilisierten Zellen ; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B.
WO 95/06128; EP 051384.9 AI; EP 0465875 AI; EP 0292435 AI; Fromm et al, Bioteehnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al, Bioteehnology 11(1993) 194-200; Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z.B. für Gerste ( Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al, s.o.; Weizen ( Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297).
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baum- wolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und an- schließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Die durch Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausfüh- rungsformen einer Expressionskassette, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder einem Vektor, enthaltend die vorstehend genannte Expressionskassette, hergestellten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante SHMT sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von transgenen Organismen enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionskassette z.B. für die Bereitstellung rekombinanten Proteins und/oder die Verwendung dieser Organismen in in vivo Testsystemen.
Bevorzugte Organismen für die rekombinante Expression sind neben Bakterien, Hefen, Moose, Algen, Pilze auch eukaryontische Zelli- nien.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella patens oder weitere in Kryp- togamen, Bd.2, Moose, Farne, 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515), beschriebene Moose.
Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis oder Anabena bevorzugt.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces , Schizosaccheromy- ces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neuros- pora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Che Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
Bevorzugte Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner, sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Brassicaceae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola; Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewäch- sen oder Erdnuss Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika; Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula; Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, oder Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe oder verschiedene Baum-, Nuss- und Weinspecieε.
Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geei- gnet wie beispielsweise C. elegans .
Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsystemen und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältich sind.
Zur Verwendung in E. coli Bakterien sind die typischen vorteilhaften, kommerziell erhältlichen Fusions- und Expressionsvektoreπ pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc- Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) der "pKK233-2" von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET"-, und die "pBAD"-Vek- tor-Serien von Stratagene, La Jolla zu nennen.
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep- Secl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ-Deri- vate, pPICZ-Derivate sowie die Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hon- del, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressions- vektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf9, Sf21 oder Hi5 Zellen, welche über rekombinante BAculoviren infiziert wer- - en. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al.
(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" und "Insect Select System" von Invitrogen, Carlsbad oder "BacPAK Baculovirus Expressionssystem" von CLONTECH, Palo Alto, CA. Insektenzellen eignen sich in besonderer Weise zur Überexpression eukaryonti- scher Proteine, da sie posttranslationale Modifikationen der Proteine durchführen, die in Bakterien und Hefen nicht möglich sind. Die Handhabung von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infek- tion zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und können in Analogie zu bekannten Methoden erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6, 1988, pp.47-55; Glover and Harnes (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich wie obenstehend erwähnt in Bek- ker, D. , et al.. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Reε. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiele für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDMδ und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytpmegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Sätmliche, oben beschriebenen Ausführungsformen der transgenen Organismen werden unter dem Begriff "erfindungsgemäßer transgener Organismus" zusammengefaßt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nuklein- oder Aminosäuresquenzen von SHMTs in einem Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen mit herbizider Wirkung. Wie bereits weiter oben erwähnt, umfasst der Begriff "SHMT" vorzugsweise mitochondriale SHMT. Sämtliche Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren mit herbizider Wirkung werden im folgenden als erfindungsgemäße Verfahren bezeichnet.
Die in den nun im folgenden beschriebenen Ausführungsformen er- findungsgemäßer Verfahren basieren bevorzugt auf der Verwendung von SHMT, die über eine Nukleinsauresequenz umfassend
a) eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz; oder
b) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 3, das einen Teilbereich umfasst, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von mindestens 60% vorzugsweise mindestens 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% besonders bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 5 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aufweist;
kodiert werden.
Die vorstehend genannten Nukleinsauresequenz aus b), welche einen 10 Teilbereich umfassen, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von mindestens 60% aufweist, umfassen demnach auch funktionelle Äquivalent der SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 15 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75% besonders bevorzugt mindestens 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.. Die Nukleinsauresequenz aus b) kodieren für ein Polypeptid mit der 20 enzymatischen vorzugsweise biologischen Aktvität einer SHMT.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung umfasst die folgenden Schritte:
25 i. Inkontaktbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen vorzugsweise biologischen Aktvität einer Serin Hydroxymethyltransferase, vorzugsweise einer mitochondrialen Serin Hydroxymethyltransferase oder des durch das Nukleinsäuremolekül kodierten Polypeptides mit ei-
30 ner oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, das über die Nukleinsäure kodiert wird, erlauben; und
35 ii. Nachweis, ob die Testverbindung an das Polypeptid aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Teεtverbindung die Aktivität des Polypeptids aus i) reduziert oder blockiert; oder
40 iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der Nukleinsäure aus i) reduziert oder blockiert.
45 Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung umfassen die folgenden Schritte :
i. Inkontaktbringen des wie oben definierten Nukleinsäuremole- küls oder des durch das Nukleinsäuremolekül kodierten Polypeptides mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, das über die Nuklein- säure kodiert wird, erlauben; und
ii. Nachweis, ob die Teεtverbindung an daε Polypeptid aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität des Polypeptids aus i) reduziert oder blockiert; oder
iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der Nukleinsäure aus i) reduziert oder blockiert.
Der Nachweis gemäß Schritt (ii) des oben stehenden Verfahrens kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, erfolgen. Hierbei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope, chemilumi- neszierende oder enzymatische Markierung. Beispiele für enzymatische Markierungen sind Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosp- hatase oder Luzifierase. Die anschließende Detektion richtet sich nach der Markierung und ist dem Fachmann bekannt.
Hierbei sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch für Hochdurchsatzmethoden (High Trough Put Screening, HTS) geei- gnet sind:
1. Über Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) (Proc.
Natl. Acad. Sei. USA (1994) 11753-11575) laßt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Fluoreszenzmoleküls in Ab- hängigkeit zur Masεe in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an die SHMT läßt sich FCS zur Bestimmung von Pro- tein-Ligand-Wechεelwirkungen einsetzten. Ein erfindungsgemä- ßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren so konzipiert sein, dass eine durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch weitere Testverbindungen verdrängt wird ( "Verdrändungsassay") . Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
2. Die Fluoreszenzpolarisation nutzt die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emittieren. Kann der Fluorophor allerdings während des angeregten Zustands rotieren, so geht die Polarisation des emittierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Viskoεität, Löεungεmittel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das Messsignal eine Aussage über die Größe des am Fluorophor gebundenen Rests treffen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300). Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt 'zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung an die SHMT aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschrie- benen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
3. Fluoreszenz-Resonanz Energie Tranfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich be- nachbarten Fluoreszenzmolekülen unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls. Durch Fluoreszenzmarkierung der SHMT und der Tetsverbindung kann mittels FRET die Bindung gemessen werden (Cyto- metry 34, 1998, pp. 159-179). Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Ver- drängungsaεsays" konzipiert sein. Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die "Homogenous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), wie sie von Packard BioSeience vertrieben wird. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
4. Surface Enhanced-Laser Desorption/Ionisation (SELDI) in Kombination mit einem Time of Flight Massenspektro eter (MALDI- TOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein-Ligand Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Biochem. 70:750-756). In einer bevorzugten Ausführungεform immobilisiert man nun die SHMT auf einem geeigneten Träger und inku- biert diesen mit der Testverbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten kann die an die SHMT zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähn- ten Methodik detektieren und somit Inhibitoren selektieren. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
5, Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des Brechnungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Brechungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). Die Messung kann beipielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) ver- triebenen auf Oberflächen-Plasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchεatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungεgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer Testverbindung an die SHMT aufgebaut werden. Alternativ kann das erfin- dungεgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Sub- stanzen können anschließend in einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ihre, herbizide Wirkung überprüft werden.
Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensiona- len Struktur der SHMT mittels Röntgenstrukturanalyse weitere potentielle herbizide Wirkstoffe mittels "Molecular Modelling" zu detektieren. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen dieser Messungen, die Detektion einer Bindungstelle im Protein sowie die Vorhersage möglicher Inhibitorstrukturen sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen möglich.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und ii) basiert, besteht darin, daß
a) eine SHMT in einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß eine SHMT enthält, kultiviert wird; b) die SHMT aus Schritt a) im Zellaufschlusε des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
c) eine Verbindung selektiert wird, welche die Aktivität der SHMT reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten SHMT mit der Aktitivtät einer nicht mit einer Teεtverbindung inkubierten SHMT verglichen wird.
Unter Bezugnahme auf die oben genannten Nukleinsauresequenzen kann demnach das Verfahren dadurch gekennzeichnet sein, dass
a) eine mitochondriale pflanzliche Serinhydroxymethyltransferase, die durch eine Nukleinsauresequenz umfassend eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nu- kleinεäureεequenz; oder eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rück- Übersetzung aus den in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 3, umfassend einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 91% zu der SEQ ID NO: 3, oder durch eine Nukleinsauresequenz, umfassend einen Teilbe- reich mit einer Identität von mindestens 60% zu der SEQ ID
NO: 3 codiert wird entweder in einem transgenen Organismus ex- primiert wird oder ein Organismus , der naturgemäß eine pflanzliche Serinhydroxymethyltransferase codiert durch eine Nukleinsäureεequenz umfassend eine Nukleinsäureεequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 3, umfassend einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 91% zu der SEQ ID NO: 3 oder eine Nukleinsauresequenz, die einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 60% zu der SEQ ID NO:3 umfaßt, enthält, kultiviert wird;
b) die Serinhydroxymethyltransferase aus Schritt a) im Zellauf- schluss deε transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
c) eine Testverbindung selektiert wird, welche die Aktivität der Serinhydroxymethyltransferase aus Schritt a) reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung in- kubierten Serin Hydroxymethyltransferase mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten Serin Hydroxymethyltransferase verglichen wird.
Auch hier ist klar, dass die vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen aus a) , welche einen Teilbereich umfassen, der eine Identität mit der SEQ ID No:3 von mindestens 60% aufweist, auch funktionelle Äquivalent der SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 46% umfasεen. Hierbei gelten bei den funktionellen Äqui- valenten die oben angegebenen Bevorzugungen.
Die SHMT enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen, mit einer erfindungsgemäßen Ex- preεsionskaεette transformierten Organismuε bestehen. Falls er- forderlich kann die SHMT partiell oder vollständig über gängige Methoden aufgereinigen werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reinigung von Proteinen sind beispielsweise in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publiεhing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über nach dem Fachmann bekannten Affinitätschromoatographie erfolgen. Bei den erfindungsgemäßen in-vitro Verfahren ist darauf zu achten, dasε der essentielle Cofaktor der SHMT, Pyridoxal- phosphat in ausreichender Menge, d.h. in der Regel im Bereich von 50-600μM, bevorzugt 80-500μM pro mol Enzym vorhanden ist.
Die für in-vitro Verfahren benötigte SHMT kann somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus oder aus einem Organismus, der ein Polypeptid mit SHMT Aktivität enthält, isoliert werden, vorzugsweise aus einer unerwünschten Pflanze, wobei unter dem Begriff der unerwünschten Pflanze die eingangs erwähnten Spezies zu verstehen sind.
Zur Identifizierung von herbiziden Verbindungen wird nun die SHMT mit einer Testverbindung inkubiert. Nach einer Reaktionszeit wird die Aktivität der SHMT nach einer der oben genannte Methoden im Vergleich zur Aktivität der nicht gehemmten SHMT ermittelt. Bei Inhibition des erfindungsgemäßen Polypeptides beobachtet man eine signifikante Abnahme der Aktivität im Vergleich zur Aktivität des nicht inhibierten erfindungsgemäßen Polypeptides, wobei eine Reduktion von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% bis hin zu einer 100% Reduktion (Blockierung) erzielt wird. Bevorzugt ist mindestens 50% Hemmung bei Konzentrationen der Testverbindung von 10~4 M, bevorzugt bei 10-5 M, besonders bevorzugt von 10-6 M bezogen auf Enzymkonzentration im mikromolaren Bereich.
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der SHMT kann bei- spielsweise über einen Aktivitätstest erfolgen, d.h. durch Inkubation der SHMT mit einem geeigneten Substrat und Cofaktoren, wobei die Umsetzung des Substrates oder des Cofaktors verfolgt wird.
Beispiele für geeignete Substrate sind Serin oder Gylcin, und für geeignete Cofaktoren Tetrahydrofolat, Cl-Tetrahydrofolat. Gegebenenfalls können auch Derivate der vorstehend genannten Verbindungen verwendet werden, die eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope oder chemilumi- neszierende Markierung.
Beispielsweise kann die Aktivität der SHMT mit einem radioaktiven erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden (Bourguignon et al. Biochem. J. 255, pp. 169-178, 1988).
Alternativ kann die enzymatische Aktivität der SHMT mittels eines chromatographischen Trennverfahrens basierend auf der Trennung von Tetrahydrofolat von Cl-Tetrahydrofolat bestimmt werden, gefolgt von quantitativer Analyse der Mengen an Tetrahydrofolat und Cl-Tetrahydrofolat über Integration der über UV spektroskopische Bestimmung bei der Chromatographie erhaltenen Peaks . Hierbei erfolgt die chromatographische Trennung bevorzugt über Reversed Phase Chromatographie (RPC) z.B. an einer HPLC- oder FPLC-Anlage. Das Prinzip dieser Chromatographie sowie die hierfür zu verwen- dende Puffer und Geräte sind dem Fachmann bekannt, und beispielsweise in Intfoduction to Modern Liquid Chromatography" by L.R. Snyder and J.J. Kirkland, 2nd Edition. John Wiley & Sons, 1979 beschrieben.
In der Regel verwendet man die für die RPC üblichen, dem Fachmann bekannten Laufmittel.
Die für den Aktivitätstest einzusetzenden Mengen an Substrat (z.B. Serin) liegen zwischen 1-50 mM und Mengen an Tetrahydrofo- lat zwischen 1-lOmM bezogen auf 1-100 μg/ml Enzym.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Umsatz des Substrates photometrisch verfolgt, angelehnt an ein von Sto- ver und Schirch (Anal. Biochem. 202, pp. 82-88) beschriebenes Verfahren, welches auf der Kopplung der SHMT-Reaktion an die durch NAD-abhängige Methylentetrahydrofolat Dehydrogenase (MTD) katalysierte Reaktion und photometrische Messung bei 340 n basiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und iii) basiert, besteht aus den folgenden Schritten:
a) Herstellung eines erfindungsgemäßen transgenen Organismus;
b) Aufbringen einer Testverbindung auf den transgenen Organismus nach a) und auf einen nicht-transgenen Organismus der gleichen Sorte;
c) Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testverbindung; und
d) Selektion von Testverbindungen, die ein vermindertes Wachstum oder eingeschränkte Überlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit. dem Wachstum des transgenen Organismus bewirken.
Hierbei beträgt der Wachstumsunterschied in Schritt c) zur Selektion eines Inhibitors mit herbizider Wirkung mindestens 10%, vor- zugsweise 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%.
Der transgene Organismus ist hierbei ein Bakterium, eine Hefe, ein Pilz, eine Pflanze oder eine eukaryontische Zellinie, bevor- zugt Pflanzen, Bakterien oder Hefen, die sich mittels gängiger Techniken leicht transformieren lassen, wie Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum, Saccharomyces cerevisiae oder E. coli, in welchen die für ein erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Sequenz über Transformation inkorporiert wurde. Diese transgenen Organismen weisen daher eine erhöhte Toleranz gegen Verbindungen auf, welche das erfindungsgemäße Polypeptid inhibieren. E.coli und Saccharomyces cerevisiae bieten sich hier insbesondere an, weil ihre Genome vollständig sequenziert sind und sie leicht zur Herstellung von "knock-out"-Mutanten verwendet werden können (z.B. Methods in Yeast Genetics, Kaiser, Michaelis, Mitchell (eds.) CSHL Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994: 73-85).
Das vorstehend genannten Verfahren kann jedoch auch zur Identifi- zierung von Substanzen, mit wachstumsregulatorischer Wirkung verwendet werden. Hierbei wird als transgener Organismus eine Pflanze eingesetzt. Weiterhin werden in Schritt d) Testverbindun- gen selektiert, die ein verändertes Wachstum des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organmismus bewirken. Unter verändertem Wachstum ist hierbei eine Hemmung des vegetativen Wachstums der Pflanzen zu verstehen, was sich insbesondere in einer Reduzierung des Längenwachstums äußeren kann. Die behandelten Pflanzen weisen demgemäß einen gedrungenen Wuchs auf; außerdem ist eine dunklere Blattfärbung zu beobachten. Weiterhin ist unter verändertem Wachstum auch eine zeitliche Veränderung des Reifeverlaufs, eine Heummung oder Ver- mehrungen seitlicher Verzweigungen der Pflanzen, eine Verkürzung bzw. Verlängerung der Entwicklungsstadien, eine Erhöhung der Standfestigkeit, das Wachstum größerer Mengen an Knospen, Blüten, Blättern, Früchten, Samenkörnern, Wurzeln und Knollen, eine Erhöhung des Zuckergehaltes in Pflanzen wie Zuckerrüben, Zuckerrohr sowie Zitrusfruchten, des Proteingehaltes in Pflanzen wie Getreide oder Soja oder eine Stimulierung des Latexfluß an Gummibäumen zu verstehen. Die Detektion dieses veränderten Wachstums ist dem Fachmann bekannt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des Targets erfolgt, dann ist es entweder möglich, die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe von Testver- bindungen in verschiedene Untergruppen teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Testverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt man dann mit der einzelnen Testverbindung oder der entsprechenden Untergruppe von Testverbindungen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder nur noch eine Testverbindung umfaßt.
Sämtliche, über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen können anschließend auf ihre herbizide Wirkung in vivo überprüft werden. Eine Möglichkeit zur Prüfung der Verbindungen auf herbizide Wirkung ist die Verwendung der Wasserlinse Lemna minor in Mikrotiterplatten. Als Parameter können Veränderungen des Chlorophyllgehalts und die Photosyntheseleistung gemessen werden. Es ist auch möglich, die Verbindung auf unerwünschte Pflanzen direkt zu applizieren, wobei die herbizide Wirkung z.B. über eingeschränktes Wachstum festgestellt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorteilhaft in Hochdurchsatzverfahren, sog. High Through Put Screening (HTS) durchgeführt werden.
HTS ermöglicht das parallele Testen einer Vielzahl verschiedener Verbindungen.
Im HTS bietet sich für die praktische Durchführung die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nu- kleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfingungsgemäße Nukleinsauresequenz enthaltenden Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, welche mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen enthalten oder eines oder mehrere (Poly)peptide codiert über die erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenzen enthalten. Der verwendete Träger kann fest oder flüssig sein, ist bevorzugt fest, besonders bevorzugt eine Mikrotiter- platte. Die vorstehend genannten Träger sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gemäß der am weit verbreitesten Technik werden 96-well, 384-well und 1536 well Mikrotiterplatten ver- wendet, die in der Regel Volumina von 200μl umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS-Systems passend zu den entsprechenden Mikrotiterplatten wie viele Instrumente, Materialien, automatische Pipettiervorichtun- gen, Robotoren, automatisierte Plattenleser sowie Plattenwascher kommerziell erhältlich.
Neben den auf Mikrotiterplatten basierenden HTS-Verfahren können auch sogenannte "free format assays" oder Testsysteme, die zwischen den Proben keine physischen Barrieren aufweisen, verwendet werden wie z.B. in Jayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sei
U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky., "Strategies for Screening Com- binatorial Libaries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5,976,813.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen identifizierbar nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Verbindungen werden im folgenden "selektierte Verbindungen" genannt. Sie wei- sen ein Molekulargewicht von kleiner als 1000 g/mol, vorteilhaft kleiner 500 g/mol, bevorzugt kleiner 400 g/mol, besonders bevorzugt kleiner 300 g/mol. Verbindungen mit herbizider Wirkung weisen einem Ki-Wert kleiner 1 mM, bevorzugt kleiner 1 μM, besonders bevorzugt kleiner 0,1 μM ganz besonders bevorzugt kleiner 0,01 μM auf. Die über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen können natürlich auch in Form ihrer landwirtschaft brauchbaren Salze vorliegen. Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die herbizide Wirkung der über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen mit herbizider Wirkung nicht negativ beeinträchtigen.
Ferner können die selektierte Verbindungen sofern sie asymmetrisch substituierte α-Kohlenstoffatome enthalten, entweder als Ra- ce ate, Enantiomerengemische, reine Enantiomere oder, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch als Diastereomerenge ische vorliegen.
Die selektierten Verbindungen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17.
Mögliche Testverbindungen können Expressionsbibliotheken wie z.B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen) .
Die selektierte Verbindungen können zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs, unter Umständen auch zur Defoliation, beispielsweise von Kartoffeln, oder Desikkation, beispielsweise von Baumwolle, sowie als Wachstumsregulatoren verwendet werden. Herbizide Zusammensetzungen, welche die selektierten Verbindungen enthalten, bekämpfen Pflanzenwuchs auf Nichtkulturflächen sehr gut. In Kulturen wie Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle wirken sie gegen Unkräuter und Schadgräser, ohne die Kulturpflanzen nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt tritt vor allem bei nie- drigen Aufwandmengen auf . Die selektierten Verbindungen können zur Bekämpfung der oben bereits erwähnten Schadpflanzen verwendet werden.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können se- lektierten Verbindungen bzw. diese enthaltende herbizide Zusammensetzungen vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kultur- pflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napo- brassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucuε carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium) , Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgäre, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linu usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec, Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec, Nicotiana tabacum (N.rustica) , Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec, Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgäre), Theobroma cacao, Tri- folium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays .
Darüber hinaus können die selektierten Verbindungen auch in Kulturen, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind, verwandt werden. Die Herstellung dieser Kulturen wird weiter unten beschrieben.
Weiter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer herbiziden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man selektierten Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln formuliert.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer wachstumsregulatorischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man selektierten Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln formuliert.
Die selektierten Verbindungen können hierbei z.B. in Form von direkt versprühbaren wassrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäύbemitteln, Streumit- teln oder Granulaten formuliert werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur der selektierten Verbindungen und sollte in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der selektierten Verbindungen gewährleisten. Die herbiziden Zusammensetzung enthalten eine herbi- zid wirksame Menge mindestens einer selektierten Verbindung und für die Formulierung von herbiziden Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.
Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wässrigen oder ölhaltigen Formulierungen sowie dispergierbaren Konzentraten (DC) kön- nen die selektierten Verbindungen in einem einem 01 oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulie- rungshilfsstoffe zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus selektierter Verbindung, gegebenenfalls Lösungsmitteln oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln beste- hende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind emul- gierbare Konzentrate (EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), dispergierbaren Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granulaten, wobei die festen Formulie- rungen entweder in Wasser löslich (soluble) oder dispergierbar (wettable) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffreisetzung verhinderenden Überzug ("coating") versehen werden.
Prinzipiell sind unter dem Begriff "Hilfsmittel" folgende Verbindungsklassen zu verstehen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netz- mittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann bekannt.
SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder Vermählen in speziellen Mühlentypen (z.Bsp. Hammermühlen). DC, SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet mill- ing") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase, die weitere Hilfsmittel oder selektierte Verbindungen enthalten kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Pulver-, Streu- und Stäubemittel können vor- teilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermählen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden. Granulate, z.B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der selektierten Verbindungen an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Weitere Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z.Bsp. in folgenden Schriften aufgeführt: US 3,060,084, EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw- Hill, New York, 1963, pages 8-57 und ff. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A. , Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Fed- eral Republic of Germany) , 2001.
Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fach an in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktioneή von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Napht a- line oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser.
Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.
Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaph- thalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsul- fonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fet- talkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooc- tyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyg- lykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fet- talkoholethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Poly- oxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalko- holpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose .
Die Applikation der herbiziden Zusammensetzungen bzw. der selek- tierten Verbindungen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufver- fahren erfolgen. Sind die selektierten Verbindungen für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechni- ken angewandt werden, bei welchen die selektierten Verbindungen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, daß die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die selektierten Verbindungen auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by) .
Die Aufwandmengen an selektierten Verbindungen betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und WachstumsStadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten.
Die Bereitstellung des herbiziden Targets ermöglicht weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines Proteins mit der biologi- sehen Aktivität einer SHMT, welches nicht oder nur eingeschränkt durch ein Herbizid, welches als Wirkort die SHMT hat, z.B. die herbizid wirkenden selektierten Verbindungen, gehemmt wird. Im folgenden wird ein sich derart von der SHMT unterscheidendes Protein als SHMT-Variante bezeichnet. In Analogie zu den obigen Aus- führungen bezeichnet auch hier der Begriff SHMT vorzugsweise mitochondriale SHMT.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das oben genannte Verfahren zur Erzeugung von Varianten von Nukleinsauresequenzen umfassend
i. eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
ü. eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID •NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
iii. funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7, mi einer Identität von mindestens 46%, 47%, 48%, 49%, 50%,
51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75% besonders bevorzugt mindestens 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu der SEQ ID NO: 7.
aus folgenden Schritten:
a) Expression der von den oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem zellfreien
System;
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure;
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid;
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen;
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides;
f) Auswahl der Nukleinsauresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen werden vorteilhaft in einen Organismus eingebracht. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus. Bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze, besonders bevorzugt eine der oben definierten Kulturpflanzen, ganz besonders bevorzugt in Kartoffel, Tabak, Lein, Raps, Soya, Gerste, Mais, Baumwolle, weizen, Ananas, Papaya oder Erbse.
Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resistenz gegenüber der selektierten Verbindung in intakten Pflanzen.
Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen die selektierten Verbindungen vermitteln können, können aus den oben genannten Nukleinsauresequenzen auch Über die sogenannte "site directed mutagenesis" hergestellt werden, durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder Aktivität des Target Proteins oder die Eigenschaften wie Bindung der oben genannten erfindungsgemäßen Inhibitoren sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden.
Beispielsweise wurde von Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555 - 558) eine "site directed mutagenesis"-Methode in Pflanzen beschrieben, die vorteilhaft verwendet werden kann.
Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777- 78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994 : 270-277) weiter verbessert Methode.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Pro- teine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschriebene "in-vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Bioteehnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode .
Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-0 909 821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutantionen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie kodierten Proteine identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.
Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und molekularer Identifizie- rung des veränderten, resistenten Allels. Weiterhin die Mutagenese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanten Mutationsrate durch chemische/physikali- sehe mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend beschrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorganismen auf Medien mit steigenden Konzentration von erfin- dungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagene Behandlungen erhöht werde .
Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfügung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 96, 8768 - 8773 und Beethem et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol 96, 8774 - 8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktioneil analoge Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Erstellung von Nukleotidsequenzen welche für Genprodukte kodieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, daß eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10% , bevorzugt um mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, daß die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsauresequenzen und/oder die durch sie kodierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß die Substanzen um mindestens 30%, bevorzugt mindestens -50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80% oder gar nicht mehr an die veränderten Nuk- leinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren genetisch ver- änderte transgene Pflanze.
Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Überexpression der in den oben erwähnten erfindungsgemäße Verfahren zur Identifzierung von Herbiziden verwendeten Nukleinsauresequenzen erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegen- stand ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsäuren umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsauresequenz ; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID
NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, -63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75% .besonders bevorzugt mindestens 76%, 77%, 78%, 79%,.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ganz besonders bevorzugt minde- stens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% zu der SEQ ID NO: 7.
überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75 - 83 be- schrieben.«
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber de 'Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:
a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechnische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und daß das neu eingeführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß ein neues Protein/ eine neue RNA eingeführt wird welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure wie der RNA oder der DNA so verändert wird, daß durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, daß heißt die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) das die Funktion des Targets durch ein neues in die Pflanze eingebrachtes Gen ersetzt wird, und so ein sogenannter "al- ternativer Pathway" geschaffen wird.
e) Das die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt daher weiterhin die Verwendung von Pflanzen, die durch die T-DNA Insertion getroffene Gene mit den oben genannten Nukleinsauresequenzen SEQ ID NO: 7 sowie deren funktioneller Äquivalente zur Entwicklung von neuen Herbiziden. Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizie- rung von den homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzenwie beispielsweise unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutagenese- verfahren zur Insertion von fremder Nukleinsäurein die Nuklein- säuresequenzen SEQ ID NO: 7, in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate in anderen Pflanzen.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt mit einer der oben beschrieben Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Expressionskassette nach ebenfalls oben beschriebenen gängigen Transformationsmethoden.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten SHMT kann beispielsweise in-vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des SHMT Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der SHMT an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Allgemeine DNA-Manipulations- und Klonierungsverfahren Klonierungsverfahren wie z.B. ReεtriktionsSpaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nu- kleinεäuren auf Nitrozelluloεe und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Tranεformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) und Ausubel, F.M. et al., Current Pro- tocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interεcience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Pflanzenmolekularbiologische Standardverfahren sowie Pflanzen- tranεformationεverfahren sind beschrieben in Schultz ,et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998), Reither et al., Methods in Arabidopsiε Reεearch, World svcientific press (1992) und Arabidopεis: A Laboratory Manual (2001), ISBN 0-87969-573-0.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli DH5 , XL-1 blue, BL21DE(3)) wurden von Stratagene, BRL Gibco oder Invitro- gen, Carlsberg, CA bezogen. Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR T7CT TOPO, pCR T7/NT TOPO und pCR 2.1 TOPO der Firma Invitrogen und pUC 19 der Firma Amersham Pharmacia (Freiburg) und der Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 1990, 221-230) verwendet.
Beiεpiel 1: Erzeugung einer cDNA-Bibliothek im Pflanzentransformationsvektor
Zur Erzeugung einer cDNA-Bibliothek ( im folgenden "binäre cDNA- Bank" genannt) in einem Vektor, der direkt für die Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, wurde mRNA aus verschiedenen Pflanzengeweben isoliert und mit dem TimeSaver cDNA Synthese Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in doppelεträngige cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Erstεtrangsynthese wurde mit Tχ2_i8 Oligo- nucleotiden nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Größenfrak- tionierung und Ligation von EcoRI-Notl-Adaptern nach Herstellerangaben und Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase (Stratagene) wurde die cDNA-Population normalisiert. Hierzu wurde die Methode nach Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776 vor- gegangen, wobei die cDNA durch PCR mit dem Oligonukleotid Nl unter den in Tabelle 1 aufgeführten Bedingungen amplifiziert wurde.
Tabelle 1
Das erhaltene PCR-Produkt wurde an die Säulenmatrix deε PCR-Puri- fication Kits (Qiagen, Hilden) gebunden und mit 300 mM NaP-Puffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS eluiert. Die DNA wurde 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend 24 Stunden bei 60°C renaturiert. 50μl der DNA wurden auf eine Hydro- xylapatitsäule aufgetragen und diese 3 Mal mit 1 ml 10 mM NaP- Puffer, pH 6.8 gewaschen. Die gebundene Einzelstrang-DNA wurde mit 130 mM NaP-Puffer, pH 6.8 eluiert, mit Ethanol gefällt und in 40μl Wasser gelöst. Hiervon wurden 20μl für eine weitere PCR-Am- plifikation wie oben beschrieben verwendet. Nach einer weiteren Anreicherung von ssDNA wurde eine dritte PCR-Amplifikation wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Herstellung des Pflanzentransformationsvektors zur Aufnahme - der wie oben beschrieben hergestellten cDNA-Population erfolgte über Restriktionsenzym-Verdau des Vektor pUC18 mit Sbfl und BamHI, Reinigung des Vektorfragment gefolgt von Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase und Religation mit T4 DNA Ligaεe (Stratagene). .Daε εo hergestellte Konstrukt wird im folgenden als pUClδSbfl- bezeichnet.
Der Vektor pBinAR wurde zunächst mit Notl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert, mit Sbfl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert und im Anschluß mit EcoRI und Hindlll geεpalten. Das resultierende Fragment wurde in ein Derivat deε bihären Pflanzentransformationεvektors pPZP (Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Ma- liga, P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994) ligiert, der eine Transformation von Pflanzen mittels Agrobakterium ermöglich und eine Kanamycinresistenz in transgenen Pflanzen vermittelt. Das hierbei erzeugte Konstrukt wird im folgenden als pSunl2/35S bezeichnet. pUClδSbfl- wurde alε Template für eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) mit den Oligonucleotiden VI und V2 (siehe Tabelle 2) und Pfu DNA Polymerase eingesetzt. Das resultierende Fragment wurde in den mit Smal gespalten pSunl2/35S ligiert, wodurch pSunblues2 erzeugt wurde. Nach Spaltung mit Notl, Dephoεphorylierung mit Shrimp Alkaliεcher Phoεphatase (Röche Diagnostics, Mannheim) und Aufreinigung deε Vektorfragmentes wurde pSunblues2 mit der normalisierten und ebenfalls mit Notl gespaltenen cDNA Population ligiert. Nach Transformation in E.coli Xl-lblue (Stratagene) wurden die so erzeugte Klone in Mikrotiterplatten abgelegt. Die binäre cDNA-Bank enthält cDNAs in "Sense"- und in "Antisense"-Orientie- rung unter Kontrolle des Blumenkohlmoεaikvirus 35s Promotors, die dementsprechend nach der Transformation in Tabakpflanzen zu "Co- suppressions"- und "Antisene"-Effekten führen können.
Tabelle 2 : Verwendete Oligonukleotide
Beipiel 2: Transformation und Analyεe von Tabakpflanzen
Ausgewählte Klone der binären cDNA-Bank wurden in Agrobacterium tumefaciens C58Cl:pGV2260 transformiert (Deblaere et al., Nucl. Acids. Reε. 13(1984), 4777-4788) und unter Streptomycin/Spectino- mycin-Selektion inkubiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN mit den binären Klonen nt002001035r und nt002001036r wurde eine in YEB-Medium auf OD600 = 0.8-1.6 verdünnte Übernachtkultur einer poεitiv transformierten Agrobakterienkolonie benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit der Agrobakterien- verdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf Murashige-Skoog Medium (Phy- εiol. Plant. 15(1962), 473) mit 2% Saccharose (2MS-Medium) mit 0^8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16
Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmuε auf MS-Medium mit 500mg/l Claforan (Cefotaxime- Natrium) , 50mg/l Kanamycin, lmg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0,2mg/l Naphtyleεεigεäure und l,6g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosεen wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharoεe, 250 mg/1 Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Regenerierte Sproεεen wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten. Auf diese Weise wurden transgene Pflanzen der Linie P_0000000315 erzeugt.
Die Integration der cDNA der Klone in das Genom der transgenen Linien wurde über PCR mit den Oligonukleotiden Gl und G2 (εiehe Tabelle 2 ) und genomischer DNA, die auε den entsprechenden transgenen Linien präpariert wurde nachgewiesen. Hierzu wurde vorzugsweise TAKARA Taq-DNA Polymerase nach Herstellerangaben (MoBiTec, Göttingen) eingestzt. Als Positivkontrolle diente der jeweilε zur Transformation verwendete cDNA-Klon der binären cDNA-Bank als Template für eine PCR-Reaktion. PCR Produkte identischer Größe oder ggf. gleicher Spaltungsmuεter, die nach Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, dienten als Nachweis der Integration der entsprechenden cDNA. Das Insert des Klons nt002001035r wurde auf diese Weise in den transgenen Pflanzen mit den oben genannten Phänotypen nachgewiesen. Ferner wurde durch Northern-Hybridisierung die Repression einer mit der cDNA des Klons nt002001035r unter stringenten Bedingungen hybridisierenden mRNA von ca. 1,7 kb in Blattgeweben der transge- nen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen (Nicotiana tabac- cum, Varietät Samsun NN) nachgewiesen. Hierzu wurde eine Sonde des Inserts von nt002001035r mit Hilfe des High prime DNA labe- ling kitε (Röche, Mannheim) markiert. Die Sonde wurde zur Hybridisierung von nach Standardmethoden separierter und auf Nitrozel- lulosemembranen (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) transferierter Gesamt-RNA oder mRNA aus Geweben der entsprechenden transgenen Pflanzen und Kontrollpflanzen eingesetzt.
Nach Transfer der Sprosse in Erde wurden die Pflanzen für 2-20 Wochen im Gewächshauε auf die Ausprägung von Phänotypen beobachtet. Dabei stellte sich heraus, dasε tranεgene Pflanzen der Linie P_0000000315 ähnliche Phänotypen aufwieεen. Vier Pflanzen der Linie P_0000000315 (18/8, 18/32, 18/75 und 18/77), welche daε In- εert von nt002001035r aufwieεen, zeigten nach 2 Wochen deutliche Wachstumsretardierungen, sowie chlorotische Blätter und vereinzelt Nekrosen. Linie 18/75 bildete zudem kaum Wurzeln aus und war schließlich εo εtark geschädigt, dasε sie nach ca. 6 Wochen einging.
Beispiel 3 : Sequenzanalyse des Klone
Ein Teil der Chimären cDNA von Klon nt002001035r (SEQ ID N0:1) der cDNA (Nucleotide 506-652) codiert für ein Peptidfragment (SEQ ID NO: 2) mit hohem Identitätsgrad zu pflanzlichen SHMTs. Sequenz- vergleiche mit Hilfe des BLAST-Algorithmus (Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol. 215, pp. 403-410) gegen eine Tabak EST-Datenbank ergaben weitere Klone, die mit dem Teilbereich der SEQ ID N0:1 zu >99% identisch sind, und die eine hohe Identität mit mitochon- drialen SHMTs aufweisen. Einer dieser Klone (Klon nt006100023, SEQ ID NO: 3) wurde sequenziert und ist chimär. Der für ein mito- chondrialeε SHMT-Peptid von 180 A inoεäuren (SEQ ID N0:2) codie- rende Teilbereich der SEQ ID NO: 3 enthält den für ein mitochon- drialeε SHMT Peptidfragment kodierenden, 378 bp umfassenden Bereich der SEQ ID NO:l. Ein weiterer, nicht chimärer Klon (Klon nt006043063, SEQ ID NO:5), der mit dem für die SHMT codierenden Teilbereich der SEQ ID:01 bis auf die Nukleotidpoεitionen 11, 262 und 333 identiεch ist, wurde ebenfalls in Tabakpflanzen transformiert. Die erhaltenen transgenen Pflanzen wiesen die gleichen Phänotypen auf wie die Pflanzen der Linie P_0000000315.
Hiermit wurde erstmalig und überraschend gezeigt, dasε die natür- liehe Expreεsion von für SHMT codierenden Sequenzen essenziell für Pflanzen ist und eine verringerte Expression zu Schädigungen entsprechend den unter Beispiel 2 aufgeführten Phänotypen führt.
Somit konnte gezeigt werden, dass sich SHMT als Herbizidtarget eignet.
Auf Basiε der Sequenz von nt006043063r wurde eine 5'-RACE mit Ta- bak cDNA nach Herεtellerangaben (SMART- Kit, Clontech) durchgeführt. Die Sequenz der auf dieεe Weise erhaltenen volle länge cDNA für SHMT wurde bestimmt (SEQ ID NO: 7). Die Sequenz ist im Überlappungsbereich (von Nukleotid 1288 bis 1760) mit Ausnahme eines Nukleotides (Poεition 81) identiεch mit SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 7 ist 1835 nt lang und enthält einen open reading frame von 1554 bp, der für ein Polypeptid mit einer Länge von 518 Aminosäuren codiert (von Nukleotid 56 bis 1609, SEQ ID NO: 8). Die höch- ste Identität findet sich zwischen SEQ ID. NO: 7 und einer mito- chondrialen SHMT aus Kartoffel (86,8% identisch mit Genbank# Z25863) .
Beispiel 4: Expresεion in E.coli
Zur Erzeugung aktiven Proteinε mit pflanzlicher SHMT-Aktivität wurde eine cDNA auε Arabidopεis codierend für eine mitochondriale SHMT (ΞHM1, Genbank Accession Nummer: AJ271726) in E. coli Bakterien überexprimiert.
Hierfür wurde die Kodierregion von AJ271726 nach Standardtechniken mittels PCR aus cDNA-Banken amplifiziert und in den Vector pCR 2.1 TOPO ligiert (Konstrukte SHMT1 und SHMT2 , Tabelle 8). Die erzeugten Konstrukte wurden anschließend mittels spezieller Oli- gonukleotide per PCR amplifiziert und erhaltene Fragmente in die Expresεionεvektoren pCR T7/CT TOPO und pCR T7/NT-TOP0 (Invitrogen) ligiert (Konεtrukte SHMT 3-6, Tabelle 7). Auf diese Weise wurden Fusionsproteine mit C-terminalen bzw. N-terminalen Hexahi- εtidin-tagε erzeugt. Bei der Klonierung wurden durch die Verwendung der in Tabelle 8 angegebenen Oligonucleotide N-terminal verkürzte Versionen der SHMT erzeugt, um die mitochondriale Transit- sequenz, die einer funktionellen Expression entgegenstehen könnte auszuschließen. Da die mitochondriale Trasitsequenz der SHMT ist nicht eindeutig bekannt ist, wurden verschiedene N-terminal verkürzte Versionen erzeugt. Zur Eingrenzung des zu deltierenden Bereichs konnten Hinweise aus der Literatur entnommen werden (Tur- ner et al. JBC 19, pp.13528-13534, 1992).
Die PCR wurde nach Standardbedingungen (z.B. nach Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press) in 36 Zyklen durchgeführt, wobei die An- nealingtemperaturen zwischen 44 und 55°C lagen und die Polymeriεa- tionszeit je 60sec pro 100Obp betrug. Die Template sowie die für die jeweiligen Template verwendeten Primer sowie Annealingtempe- raturen sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7
* ) verwendeter Vektor : pCR 2.1 TOPO **) verwendeter Vektor: pCR T7/CT-T0P0 ***) verwendeter Vektor: pCR T7/NT-T0P0
1) Templat: Arabidopsis thaliana cDNA-Bank
2) Templat: SHMTl
Die in der PCR erhaltenen Produkte wurden in die in Tabelle 7 angegebenen Vektoren ligiert und in E. coli transformiert. Die Expression wurde in E. coli BL21(DE3) Stämmen wie BL21(DE3 )pLysS oder BL21(DE3)pLysE (Invitrogen), BL21-CodonPluε (DE3) oder BL21-CodonPlus(DE3)RIL (Stratagene) nach Induktion mit IPTG durchgeführt. Dazu wurde nach Standardprotokollen (Invitrogen) vorgegangen.
Die Expreεεionεprodukte von SHMT6 und SHMT7 wurden über Ni-Aga- roεe affinitätschromatographisch aufgereinigt . Hierzu wurde nach Herstellerangaben (Qiagen) vorgegangen.
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Beispiel 5 : in-vitro Testsysteme
SHMT kann wie beschrieben aus Pflanzenmitochondrien isoliert und mittels eines radioaktiven erfindungsgemäßen Verfahrens gemesεen werden (Bourguignon et al. Biochem. J. 255, pp. 169-178, 1988). Auch die Aktivität des in Beispiel 4 rekombinant exprimierten und ggf. gereinigten SHMT Proteins wurde mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden.
Alternativ wurde die SHMT-Reaktion vermittels eines HPLC-geεtütz- ten Trennverfahrenε geteεtet, das auf der Trennung von Tetrahy- drofolat von Cl-Tetrahydrofolat beruht. Nach diesem Verfahren wurde die Enzym enthaltende wässrige Testlösung (0.4 5mM 2-Mer- captoethanol, 2mM Tetrahydrofolat, 20mM Serin, 56mM KH2P04 pH 7.4) enthaltend l-100μg mitochondriale SHMT 30min unter Schütteln in-' kubiert, mit 0,1 ml 0.36M HC1 pro 100ml Testlöεung denaturiert und von Ausfällungen durch 5minütiges Zentrifugieren bei hoher g- Zahl (10000g) befreit.
Die HPLC-Läufe mit einer Symmetry C18 -Säule (3,5 μm 4,6 xlO mm; Probentemperatur 10°C, Säulentemperatur 25°C; Flußrate: lml/min; λ = 288nm) durchgeführt, wobei nach Probenauftrag 0,5min mit 95% Puffer A (5 vol-% Acetonitril in Wasser) gespült wurde. Die' analytische Auftrennung erfolgte durch Anlegen eines Gradienten von 0-100% Puffer B (Wasser) über einen Zeitraum von 6 min.
Weiterhin wurde die enzymatische Aktivität in Analogie zur von Stover und Schirch (Anal. Biochem. 202, pp. 82-88) beschriebenen Methode bestimmt. Dieses erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Kopplung der SHMT-Reaktion an die durch NAD-akbhängige Methy- lentetrahydrofolat Dehydrogenase (MTD) katalysierte Reaktion und photometrische Messung bei 340nm. Die hierfür eforderlichen Mengen des Hilfsenzyms MTD wurden über rekombinante Expression der MTD aus Saccharomyces cerevisiae in E. coli wie folgt erhalten: Nach Isolation des für die MTD kodierenden Nukleinsäurefragment aus genomischer DNA gemäß der Beschreibung von Appling und West erhalten (Methods in Enzymology 281, pp. 178-188) wurde es in den Vektor pCR 2.1 TOPO kloniert . Das so erhaltene Konstrukt wurde über die Oligonukleotide 5 ' -TTTTTCTTTAGACAGTTCTACGTTC-3 ' und 5 ' -ATGTCGAAGCCTGGTCGTA-3 ' über PCR amplifiziert. Die PCR wurde < nach Standardbedingungen (z.B. nach Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press). in 36 Zyklen durchgeführt, wobei die Annealing- temperatur bei 55°C läge und die Polymerisationεzeit je 60sec pro lOOObp betrug. Die in der PCR erhaltenen Produkte wurden in den Expressionεvektor pCR T7/CT-TOP0 ligiert (Konεtrukt MTD) und in E. coli BL21(DE3) Stämmen wie BL21(DE3 )pLyεS oder BL21 (DE3 )pLyεE (Invitrogen), BL21-CodonPluε(DE3) oder BL21-CodonPlus(DE3)RIL (Stratagene) exprimiert. Dazu wurde nach Standardprotokollen (Invitrogen) vorgegangen. Das Expressionsprodukt deε Konstrukts MTD wurde über Ni-Agarose äffinitätschromatographiεch aufgereinigt, wobei nach Herstellerangaben (Qiagen) vorgegangen wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Pflanzliche Nukleinsauresequenzen als Targets für Herbizide kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Serin Hydroxymethyltransferase umfasεend:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsauresequenz ; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:3, umfassend einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 91% zu der SEQ ID NO: 3.
d) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
e) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
f) funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 88% zu der SEQ ID NO: 7.
2. Nukleinsauresequenz nach Anspruch 1 kodierend für eine pflanzliche mitochondriale Serin Hydroxymethyltransferase.
3. Polypeptid kodiert von einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2.
4. Verfahren zur Detektion funktioneller Analoga der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO:7
a) durch Herstellung einer Sonde gefolgt von anschließenden Durchεuchen einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Spezies; oder
b) durch eine Computer-Recherche nach analogen Sequenzen in elektronischen Datenbanken.
5. Expressionskasεette umfaεεend
a) genetiεche Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 ; oder
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b) .
6. Vektor umfasεend eine Expressionskassette nach Anspruch 5.
7. Nicht humaner transgener Organismus umfassend mindestens eine Nukleinsäureεequenz gemäß Anεpruch 1 oder 2, eine Expres- sionεkaεsette gemäß Anspruch 5 oder einen Vektor gemäß Anspruch 6 ausgewählt aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen oder pflanzlichen Zellen.
8. Verwendung von Nukleinsauresequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder von Nukleinsauresequenzen umfassend einen Teilbereich, der mit der SEQ ID NO: 3 zu mindestens 60% identisch ist, oder oder von funktionellen Äquivalenten der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 46% zu der SEQ ID NO: 7 codierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Serin Hydroxymethyltransferaεe oder von Poly- peptiden codiert durch eine der vorstehend genannten Nukleins uresequenzen in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
9. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung umfassend die folgenden- Schritte:
i. Inkontaktbringen eines Nukleinsäuremolekülε kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen vorzugsweise biolo- gischen Aktvität einer Serin Hydroxymethyltransferaεe oder des durch das Nukleinsäuremolekül kodierten Polypeptides mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, das über die Nu- kleinsäure kodiert wird, erlauben; und
ii. Nachweis, ob die Testverbindung an das Polypeptid aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität des Polypeptids aus i) reduziert oder blockiert; oder iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription,
Translation oder Expresεion der Nukleinεäure aus i) reduziert oder blockiert.
10. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung nach Anspruch 9 umfassend die folgenden Schritte:
i.. Inkontaktbringen eines Nukleinεäuremolekülε gemäß An- εpruch 1 oder 2 oder eines Nukleinsäuremoleküls, das ei- nen Teilbereich enthält, der mit der SEQ ID NO: 3 zu mindestens 60% identisch ist, oder eines Polypeptides codiert durch eine der vorstehend genannten Nukleinsauresequenzen mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an daε Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid erlauben; und
ii. Nachweis, ob die Testverbindung an das Polypeptid aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität des Polypeptids aus i) reduziert oder blockiert; oder
iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription,
Translation oder Expression der Nukleinsäure aus i) redu- ziert oder blockiert.
11._ Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dasε
a) eine pflanzliche Serinhydroxymethyltranεferaεe, die durch eine Nukleinεäureεequenz gemäß Anεpruch 1 oder 2 oder durch eine Nukleinεäureεequenz, umfassend einen Teilbereich mit einer Identität von mindestenε 60% zu der SEQ ID NO: 3, codiert wird, entweder in einem transgenen Orga- nismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß eine pflanzliche Serinhydroxymethyltransferase codiert welche durch eine Nukleinsauresequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eine Nukleinsauresequenz, die einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 60% zu der SEQ ID NO: 3 umfaßt, kodiert wird enthält, kultiviert wird;
b) die Serinhydroxymethyltransferase aus Schritt a) im Zel- laufεchluss deε tranεgenen bzw. nicht tranεgenen Organis- mus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
c) eine Testverbindung selektiert wird, welche die Aktivität der Serinhydroxymethyltransferaεe auε Schritt a) reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Teεtverbindung inkubierten Serin Hydroxymethyltransferase mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten Serin Hydroxymethyltransferase verglichen ■ wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) die Aktivität der Serin Hydroxymethyltransferase durch die chromatographische Trennung und Quantifizierung von Tetrahydrofolat und Cl-Tetrahydrofolat ermittelt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasεt:
a) Herεtellung eines transgenen Organismus nach Anspruch 7 oder eines transgenen Organismuε enthaltend eine Nukleinsauresequenz, die einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 60% zu der SEQ ID NO: 3 umfasst;
b) Aufbringen einer Testsubstanz auf den transgenen Organismus nach a) und auf einen nicht-transgenen Organismus der gleichen Sorte;
c) Bestimmen des Wachstumε oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der
Aufbringung der Testsubstanz; und
d) Selektion von Testsubεtanzen, die ein verminderteε Wachstum oder eine eingeschränkte Überlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pflanzlichen Organismuε oder einer Hefe durchgeführt wird.
15. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfaεst: a) Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine Nukleinsauresequenz, die einen Teilbereich mit einer Identität von mindestens 60% zu der SEQ ID NO: 3 umfasst;
b) Aufbringen einer Testsubεtanz auf die tranεgene Pflanze nach a) und auf eine nicht-transgene Pflanze der gleichen Sorte;
c) Bestimmen des Wachstumε oder der Überlebenεfähigkeit der tranεgenen und der nicht tranεgenen Pflanze nach der Aufbringung der Teεtsubstanz; und
d) Selektion von Testsubεtanzen, die ein verändertes Wachstum der nicht-transgenen Pflanze bewirken verglichen mit dem Wachstum der transgenen Pflanze.
16. Träger, der eines oder mehrere der Nukleinsäuremoleküle nach einem der Anεprüche 1 bis 2, oder eine oder mehrere Expres- sionεkassetten nach Anspruch 5, einen oder mehrere Vektoren nach Anspruch 6, einen oder mehrere Organismen nach Anspruch 7 oder eines oder mehrere (Poly)peptide nach Anspruch 3 aufweist.
17. Verfahren nach einem der Anεprüche 9 biε 15, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem
High-Throughput-Screening durchgeführt wird.
18. Verbindungen mit herbizider Wirkung identifiziert über eins der Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 14 oder 17.
19. Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung identifiziert über das Verfahren nach Anspruch 14 oder 17.
20. Verfahren zur Herstellung einer agrochemischen Zusammenset- zung, dadurch gekennzeichnet dass man
a) eine Verbindung mit herbizider Wirkung über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 14 oder 17 oder eine Verbindung mit wachstumsregulatoriεcher Wirkung nach An- Spruch 15 oder 17 identifiziert; und
b) diese Verbindung zusammen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln mit herbizider oder wachεtumsregu- latoriεcher Wirkung formuliert.
21. Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/ oder zur Regulation des Wachstums von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung nach Anspruch 18 oder 19 oder eine Zusammensetzung erhältlich über das in Anspruch 20 genannte Verfahren auf Pflanzen, deren Lebensraum und/oder auf Samen einwirken läßt.
22. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 18 oder 19 oder einer agrochemischen Formulierung erhältlich über das in An- spruch 20 genannte Verfahren in einem Verfahren nach Anspruch 19 zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/ oder zur Regulation des Wachstums von Pflanzen.
23. Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von Va- rianten der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 7 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß es "folgende Prozessschritte umfaßt:
a) Expresεion des von SEQ ID NO: 7 kodierten Proteins in einem heterologen System oder in einem Zellfreienεystem;
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure;
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid;
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine ge- ringere Interaktion aufweisen;
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation deε Herbizides; und
f) Auεwahl der Nukleinεäureεequenzen, die eine veränderte biologiεche Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Anspruch 23 f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.
25. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen gefunden nach einem Verfahren gemäß Ansprüchen 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 17 resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsauresequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 2 oder funktionelle Äquivalente der Nuklein- säuresequenz SEQ ID NO: 7 mit einer Identität von mindestens 88% zu der SEQ ID NO: 7 überexprimiert werden.
26. Organismus hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24.
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