EP1525301A2 - Procede de preparation d une matrice extracellulaire et son utilisation pour la culture de cellules tumorales - Google Patents
Procede de preparation d une matrice extracellulaire et son utilisation pour la culture de cellules tumoralesInfo
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- EP1525301A2 EP1525301A2 EP03755644A EP03755644A EP1525301A2 EP 1525301 A2 EP1525301 A2 EP 1525301A2 EP 03755644 A EP03755644 A EP 03755644A EP 03755644 A EP03755644 A EP 03755644A EP 1525301 A2 EP1525301 A2 EP 1525301A2
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
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- C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
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- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Definitions
- the subject of the present invention is a method for preparing an isolated extracellular matrix (ECM) secreted by tumor cells, in particular epitheliomatous cells, methods for culturing tumor cells using such a matrix, the use of such a matrix for the establishment of tumor cell line as well as new tumor cell lines obtained by this method.
- the invention also relates to a method of selecting compounds capable of inhibiting the growth and / or proliferation of tumor cells, the use of such compounds as a medicament for the treatment of cancer as well as a method of diagnosis or prognosis in in vitro by chromosome analysis using such matrices.
- the present invention also relates to a reactor or a kit for cell culture comprising such MEC.
- Solid tumors epitheliomatous in particular, are difficult to culture and, if necessary, to be propagated in vitro in the form of lines.
- a solid cancer tumor has, in addition to its malignant epithelial contingent (cancer cells sensu stricto), a contingent of stromal cells (fibroblasts, endothelial cells of tumor vessels) without which the malignant cells cannot develop in vivo.
- epithelia or support cells all tissues organize and polarize from a basal lamina made up of extracellular matrix (ECM), a set of integrins, proteoglycan, laminin proteins and growth factor receptors.
- ECM extracellular matrix
- the composition and structure of this MEC are specific to a given tissue.
- the supportive connective tissue is formed by fibroblasts, macrophages, mast cells, and endothelial cells of the vessels nourishing this supportive tissue.
- Such a connective tissue synthesizes a very abundant ECM allowing it to respond to tensions, essentially mechanical.
- reagents used to improve adhesion to a support for cancer cells mention may be made, for example, of certain proteins constituting an extracellular matrix secreted by the basal lamina of an epithelium, such as laminin, collagen IV, or even gelatin. , marketed by many commercial laboratories. These reagents are applicable as a monolayer on the plastic of culture flasks.
- Matrigel® base-like membrane
- Sigma USA
- Mention may also be made of the extracellular matrices originating from umbilical cord cells and marketed by certain University Academic Laboratories. Mention may also be made of fetal calf serum, containing growth and adhesion factors, used in the cell culture medium which promotes the adhesion of carcinomatous cells.
- these reagents promote the adhesion of cancer cells, these do not make it possible to stimulate their proliferation or to stimulate their proliferation in a constant manner, this in particular due to variations in manufacturing batches and thus in their quality.
- such reagents can be advantageously used not only for the culture of tumor cells but also for the establishment of tumor cell lines originating from primary tumor. Such cultures or lines could be a tool of choice for studying their biological properties (nucleic acid, protein, enzymatic activities), or even for carrying out tests predictive of sensitivity to tumor treatments (chemotherapy and radiotherapy). It would also be desirable to be able to have such reagents for a given type of cancer allowing the proliferation of tumor cells originating from a sample of a tumor from a patient. Indeed the proliferation of such tumor cells or the establishment of a cell line from such cells would allow the short-term in vitro study of the malignant cells of this patient and the sensitivity of these malignant cells to the treatment envisaged before its administration. to the patient.
- the inventors have surprisingly demonstrated that isolated extracellular matrices secreted by mammalian tumor cells, in particular epitheliomatous cells, make it possible to adhere and proliferate tumor cells, and allow the establishment of tumor cell line established from cells.
- tumors originating from a sample of a primary and / or metastatic tumor, this in particular when these tumor cells which one seeks to cultivate or whose one seeks to establish a cell line were obtained from a tissue of the same embryonic origin as tumor cells secreting said matrix.
- the subject of the present invention is a process for the preparation of an isolated extracellular matrix, secreted by tumor cells of animal origin, including humans, characterized in that it comprises the following stages: a) culturing said tumor cells of animal origin on a support under conditions allowing said tumor cells of animal origin to proliferate and secrete said MEC; and b) recovering the MEC thus formed free of said tumor cells.
- the method for preparing an isolated extracellular matrix according to the present invention is characterized in that it further comprises between said step a) and said step b) the following step:
- the method for preparing an isolated extracellular matrix according to the present invention is characterized in that said tumor cells of animal origin are epitheliomatous cells.
- the method for preparing an isolated extracellular matrix according to the present invention is characterized in that that said tumor cells are cells of a tumor cell line previously established from a primary tumor and / or from a metastatic proliferation.
- the invention relates to a method for preparing an isolated extracellular matrix according to the present invention, characterized in that said tumor cell line has been established from tumor and / or metastatic cells originating from a mammary tumor or ovarian.
- the invention relates to a method for preparing an isolated extracellular matrix according to the present invention, characterized in that said tumor cells are cells originating from a tumor of human origin.
- the invention relates to a process for the preparation of an isolated extracellular matrix according to the present invention, characterized in that said tumor cells are cells originating from the tumor cell line IGR-OV1 as deposited in the conditions of the Budapest Treaty at the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, Paris, (France) under number I-2893 on June 20, 2002.
- CNCM National Collection of Culture of Microorganisms
- the tumor cell line IGR-OV1 is a line of epitheloid cells derived from a primary tumor of human ovarian cancer. These cancer cells develop in monolayers and in floating “clusters” in the environment. These cellular “clusters” are able to adhere to plastic. Conversely, adherent cells can proliferate in floating “clusters” and it is the adherent contingent which is propagated (Bénard, J. et al., Cancer Research, 45, 4970-4979, 1985).
- the subject of the invention is an isolated extracellular matrix (ECM) capable of being obtained by a process for the preparation of an isolated extracellular matrix according to the present invention.
- ECM isolated extracellular matrix
- the MEC isolated according to the present invention is packaged in a fluid form, frozen, dried or lyophilized and, where appropriate, sterilized.
- the invention relates to a cell culture reactor containing an isolated ECM according to the present invention.
- the subject of the invention is a method for culturing tumor cells according to the present invention, characterized in that it comprises a step in which said tumor cells are brought into contact with an isolated MEC according to the present invention, said tumor cells which it is desired to cultivate being different from those from which said MEC was secreted.
- the subject of the invention is a method for preparing a tumor cell line established from tumor cells originating from a sample of a primary and / or metastatic tumor of animal origin, including Man, characterized in that said method implements a step in which the tumor cells contained in said tumor sample and from which it is sought to obtain an established line are brought into contact with an isolated ECM according to the present invention, said tumor cells which one seeks to obtain an established line being different from those from which said MEC was secreted.
- the method of culturing tumor cells according to the present invention or the method of preparing a tumor cell line according to the present invention is characterized in that the first tumor tissue from which the tumor cells are derived from from which said MEC was obtained and the second tumor tissue containing the tumor cells which one seeks to cultivate or which one seeks to establish a cell line are of the same animal species, including humans.
- the method for culturing tumor cells according to the present invention or the method for preparing a tumor cell line according to the present invention is characterized in that said first tumor tissue and said second tumor tissue are derived independently of each other from the group of malignant or benign tumors, in particular originating from ovarian, breast, prostate or thyroid tumors. More preferably, the method for culturing tumor cells according to the present invention or the method for preparing a tumor cell line according to the present invention is characterized in that said first tumor tissue is a tissue originating from a breast tumor, in particular from the tumor cell line IGR-OV1 and said second tumor tissue comes from malignant or benign tumors of the ovary, of the breast, of the prostate or of the thyroid.
- the method of culturing tumor cells according to the present invention or the method of preparing a tumor cell line according to the present invention is characterized in that said first tumor tissue and said second tumor tissue are of same embryonic origin.
- standard embryonic origin for a tumor tissue is meant in the present description tumor tissues derived from the same primitive embryonic tissues (endoderm, ectoderm or mesoderm).
- epitheliomatous ovarian and mammary tumors will be considered to derive from the same embryonic origin since epithelial ovarian and mammary tissues are derived from the endoderm.
- the method of culturing tumor cells according to the present invention or the method of preparing a tumor cell line according to the present invention is characterized in that said first tumor tissue and said second tumor tissue are d different embryonic origin, preferably derived from the endoderm and the ectoderm, or vice versa.
- the method of culturing tumor cells according to the present invention or the method of preparing a tumor cell line according to the present invention is characterized in that said first tumor tissue and said second tumor tissue are independently one of the other of mammary or ovarian type.
- the method for culturing tumor cells according to the present invention or the method for preparing a tumor cell line according to the present invention characterized in that said first tumor tissue is of ovarian type and said second tumor tissue is breast or ovarian.
- the subject of the invention is a method for culturing tumor cells according to the present invention or a method for preparing a tumor cell line according to the present invention, characterized in that said first tumor tissue and said second tumor tissue are of human origin.
- the subject of the invention is the use of an ECM isolated according to the present invention, as an element of a culture medium for the cell culture of tumor cells or for the establishment of a cell line of tumor cells originating from a primary tumor and / or from a metastatic proliferation, said tumor cells being different from those from which said MEC was secreted.
- the invention relates to an established tumor cell line obtained by a process for the preparation of a tumor cell line according to the present invention.
- the established tumor cell lines which can be obtained by a process for the preparation of a tumor cell line according to the present invention, very particularly preferred is the tumor cell line called IGR-OV-22-AS as deposited under the conditions of the treaty of Budapest at the CNCM under number 1-2894 on June 20, 2002 or the tumor cell line called IGR-BR-11- NS as deposited under the conditions of the Budapest Treaty at the CNCM under number I-2895 on June 20, 2002 .
- the tumor cell line called IGR-OV-22-AS was established from epitheliomatous cells contained in a carcinomatous peritoneal ascites sample of a human ovarian epithelial adenocarcinoma and on a genetic background predisposed to breast cancer syndrome and / or ovary, the ovarian epithelial cancer having developed in a patient constitutionally heterozygous for the BRCA2 gene (mutation of an allele of the gene). These epitheliomatous cancer cells develop in a monolayer. Human breast cancer, epitheliomatous cells from a nodule.
- the tumor cell line called IGR-BR-11-NS was newly established on the genetic background of predisposition to breast / ovarian cancer syndrome, in a heterozygous patient BRCA1 (mutated for an allele of the gene).
- epitheliomatous cancer cells also develop in monolayers.
- the subject of the invention is a method of selecting a compound capable of inhibiting the growth and / or proliferation of tumor cells, characterized in that it comprises the following steps: a) culturing said cells tumor cells comprising at least one culture step on an MEC isolated according to the present invention, said tumor cells being different from those from which said MEC was secreted; b) bringing said compound into contact with the tumor cells obtained in step a) under conditions normally allowing their growth and / or proliferation; and c) selecting said compound if the latter is capable of inhibiting the growth and / or proliferation of said tumor cells.
- the method for selecting a compound according to the present invention is characterized in that said MEC isolated in step a) is the MEC secreted by the tumor cell line IGR-OV1 as deposited in the CNCM under number 1-2893 on June 20, 2002.
- the invention relates to a method of selecting a compound capable of inhibiting the growth and / or proliferation of tumor cells, in particular tumor cells of an ovarian tumor, preferably human.
- tumor cells of the same embryonic origin as an ovarian cell characterized in that it comprises the following stages: a) bringing said compound into contact with a culture of cells derived from the tumor cell line IGR-OV-22 -AS as filed with the CNCM under number 1-2894 on June 20, 2002; and b) the selection of said compound if it is capable of inhibiting the growth and / or proliferation of said tumor cells.
- the invention relates to a method for selecting a compound capable of inhibiting the growth and / or proliferation of tumor cells, in particular tumor cells of a mammary tumor, preferably human, or of tumor cells of the same embryonic origin as a mammary cell, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing said compound into contact with a culture of cells derived from the tumor cell line of human origin IGR-BR-11-NS as filed with the CNCM under number I-2895 on June 20, 2002; and b) the selection of said compound if it is capable of inhibiting the growth and / or proliferation of said tumor cells.
- the invention relates to a method of selecting a compound capable of inhibiting the growth and / or proliferation of tumor cells of a patient suffering from a tumor from a sample of tumor cells previously taken from said patient, characterized in that it comprises the following steps: a) the establishment of a tumor cell line from said tumor cells taken from the patient by a process for the preparation of a tumor cell line established by a method according to the present invention; b) bringing said compound into contact with a sample of the tumor cell line obtained in step a) under conditions normally allowing their growth and / or proliferation; and c) selecting said compound if it is capable of inhibiting the growth and / or proliferation of cells of the tumor cell line.
- the invention relates to the use of a compound for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancer characterized in that said compound is selected by a selection process according to the present invention.
- the invention relates to the use of a compound according to the present invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment of breast or ovarian cancer.
- the invention relates to a method of diagnosis or prognosis in vitro by chromosomal analysis, in particular by cytogenetics and interphasic FISH, of tumor cells previously removed from a patient, characterized in that it comprises a step in which said previously removed tumor cells which it is desired to test are cultured on an isolated MEC according to the present invention, said tumor cells being different from those from which said MEC was secreted.
- the method of diagnosis or prognosis in vitro by chromosomal analysis of tumor cells previously removed from a patient is characterized in that it comprises the following steps: a) establishment of a tumor cell line from said tumor cells by a method of preparing a tumor cell line established by a method according to the present invention; and b) chromosomal analysis of a sample of cells of said line obtained in step a) under conditions allowing their growth and / or their proliferation; and c) revealing a genetic alteration of one or more chromosomes by a technique making it possible to detect such alterations, in particular by karyotypic analysis or by the technique known as interphasic FISH.
- the genome of tumor cells is characterized by a set of genetic alterations: gain and / or loss of chromosomal regions.
- the cytogeneticist routinely reveals these alterations using in particular two techniques: karyotypic analysis and analysis by FISH (“Fluorescent In Situ Hybridization”), techniques well known to those skilled in the art, of which we Let us recall here that certain steps in order to note the importance of being able to have tumor cells having a proliferative capacity.
- FISH Fluorescent In Situ Hybridization
- the cells which have adhered to the plastic and which have started to proliferate will find themselves blocked in mitosis, thus revealing their chromosomes.
- the yield of mitoses under these conditions is very variable depending on the type of tumor and the proliferative capacity of the tumor tissue.
- the affixing of a tumor fragment on a cytological observation slide allows the deposition of malignant cells and, after fixation, an analysis by fluorescent hybridization in situ. This analysis does not require cells in mitosis but applies to all cells, the majority being in interphase, a small minority being in mitosis makes it possible to visualize the chromosomes.
- the epitheliomatous tumor cells in the presence of an extracellular matrix according to the invention in particular from the IGR-OV1 line, will adhere, differentiate and proliferate.
- the extracellular matrix of the invention provides the following improvements.
- the presence of the extracellular matrix according to the invention affixed to the slide allows increased adhesion of cancer cells.
- the tumor imprints made on the matrix will be richer in cells and will reduce the analysis time.
- the subject of the invention is a kit for the culture of tumor cells, in particular derived from mammary or ovarian tumor, or for the establishment of cell line derived from said tumor cells, comprising an ECM according to the invention.
- the present invention further relates to a solid support, in particular a glass slide, on which is affixed an extracellular matrix according to the present invention and its use for the chromosomal analysis of tumor cells.
- Example 1 Preparation of an extracellular matrix obtained from the IGR-OV1 line
- the IGR-OV1 cells (doubling time approximately 25 h) are cultured between passages 170 and 210 corresponding to approximately 500 generations, number of generations guaranteeing the stability of the line. Once the confluence is reached, the
- the culture medium surmounting the confluent cells is eliminated and replaced by PBS buffer (phosphate buffered saline) devoid of calcium and magnesium and preincubated at 37 ° C. This operation is repeated 3 times, it makes it possible to eliminate the proteins from the culture medium, the presence of which would alter the reproducibility of cell lysis.
- the volumes of the 3 successive buffers are as follows: - 1 ml per well of a 24-well plate,
- the same volume of 0.02 M NH4OH preheated to 37 ° C. is poured onto the walls of the flask before being applied to the confluent cells.
- the incubation is carried out in the CO2 incubator at 37 ° C for 6 minutes. If after this incubation time the lysis is not complete, it is continued in 30 second increments. When all the cell bodies have disappeared, the stop is then made by decantation of the ammonia solution which is very viscous (genomic DNA released by the cells).
- the washing of the matrix is carried out by the addition-decantation cycle 3 times with the same volume of PBS as the lysis volume. The first wash can still be viscous. Washes must be effective but gentle enough not to damage the matrix.
- the flasks and the culture plates containing the matrix are stored in heat-sealed bags in the ⁇ ⁇ of the culture volume of a PBS medium containing antibiotics, all at 4 ° C.
- the matrix thus prepared can be used between the
- the medium thus reconstituted is buffered with 10 mM final of HEPES.
- PBS PBS for “Phosphate Buffer Salts” without Gibco calcium or magnesium
- Matrix preservation medium PBS without calcium or magnesium Gibco in the presence of antibiotics and at the final concentration indicated above.
- Example 2 Obtaining two epitheliomatous lines: IGR-OV-22 and IGR-BR-11 A) Establishment of the epitheliomatous line IGR-OV-22
- Ovarian epithelium cancer develops in the form of a solid loco-regional ovarian tumor and peritoneal ascites containing epitheliomatous cells.
- the primary tumor (PT) and ascites (Asc) previously removed from a patient with a familial background of susceptibility to breast and / or ovarian cancer, a patient constitutionally heterozygous for the BRCA2 gene, were received by the laboratory. 'pathology. 1) Preparation of the tumor
- the cell suspension thus prepared is seeded in the 12 wells of a culture plate presenting the extracellular matrix secreted by the line IGR-OV1 previously prepared (matrix prepared for 17 days).
- 5 2 seeding density is important, about 3 x 10 cells / 4.5 cm.
- the cells were trypsinized using 0.025% trypsin-EDTA, taken up in RPMI 1640 medium - 10% fetal calf serum and reseeded on a matrix at the same initial seeding densities.
- the epitheliomatous cells are able to propagate directly on plastic.
- the tumor cells TP and Asc having undergone 20 passages, the sub-lines IGR-OV22-Asc and IGR-OV22-TP are considered to be established with a similar and typically epitheliomatous tumor phenotype.
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire (MEC) isolée, sécrétée par des cellules tumorales, notamment des cellules épithéliomateuses, des procédés de culture de cellules tumorales mettant en oeuvre une telle matrice, l'utilisation d'une telle matrice pour l'établissement de lignée cellulaire tumorale ainsi que de nouvelles lignées cellulaires tumorales obtenues par ce procédé. L'invention concerne également une méthode de sélection de composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, l'utilisation de tels composés comme médicament pour le traitement du cancer ainsi qu'une méthode de diagnostic ou de pronostic in vitro par analyse chromosomique mettant en oeuvre de telles matrices. La présente invention a aussi pour objet un réacteur ou un kit pour la culture cellulaire comprenant de telle MEC.
Description
PROCEDE DE PREPARATION D'UNE MATRICE EXTRACELLULAIRE ET SON UTILISATION POUR LA CULTURE DE CELLULES TUMORALES
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire (MEC) isolée, sécrétée par des cellules tumorales, notamment des cellules épithéliomateuses, des procédés de culture de cellules tumorales mettant en œuvre une telle matrice, l'utilisation d'une telle matrice pour l'établissement de lignée cellulaire tumorale ainsi que de nouvelles lignées cellulaires tumorales obtenues par ce procédé. L'invention concerne également une méthode de sélection de composés capables d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, l'utilisation de tels composés comme médicament pour le traitement du cancer ainsi qu'une méthode de diagnostic ou de pronostic in vitro par analyse chromosomique mettant en œuvre de telles matrices. La présente invention a aussi pour objet un réacteur ou un kit pour la culture cellulaire comprenant de telle MEC. Les tumeurs solides, épithéliomateuses en particulier, sont difficiles à mettre en culture et, le cas échéant, à être propagées in vitro sous forme de lignées. Une tumeur solide cancéreuse présente, outre son contingent épithélial malin (cellules cancéreuses sensu stricto), un contingent de cellules stromales (fibroblastes, cellules endothéliales des vaisseaux tumoraux) sans lequel les cellules malignes ne peuvent se développer in vivo.
Qu'il s'agisse des épithélia ou des cellules de soutien, tous les tissus s'organisent et se polarisent à partir d'une lame basale constituée de matrice extracellulaire (MEC), ensemble d'intégrines, de protéoglycane, de protéines laminines et de récepteurs de facteurs de croissance. La composition et la structure de cette MEC sont spécifiques d'un tissu donné.
Sous la lame basale, et dans le cas d'un épithélium, le tissu conjonctif de soutien est formé de fibroblastes, de macrophages, de mastocytes, et de cellules endothéliales des vaisseaux nourrissant ce tissu de soutien. Un tel tissu conjonctif synthétise une MEC très abondante lui permettant de répondre aux tensions, essentiellement mécaniques.
Quant à la MEC des épithélia, elle a un triple rôle :
- maintien des gènes dans leur contexte tissulaire,
- induction de la morphogénèse après adhésion cellulaire,
- prévention de l'apoptose et de l'invasion tumorale (pour corollaire, invasion si phénomène de dégradation).
La composition précise de la MEC des cellules épithéliales et des cellules conjonctives n'est pas connue à l'heure actuelle.
Parmi les réactifs utilisés pour améliorer l'adhésion sur un support de cellules cancéreuses, on peut citer par exemple certaines protéines constitutives de matrice extracellulaire sécrétée par la lame basale d'un épithélium, telles que la laminine, le collagène IV, ou encore la gélatine, commercialisés par de nombreux laboratoires commerciaux. Ces réactifs sont applicables en monocouche sur le plastique des flacons de culture.
On peut également citer les complexes multiprotéiques tels que Matrigel® (« membrane basale-like ») proposés par le Société Sigma (USA). Ces complexes sont de composition inconnue sont extraits généralement à partir de tumeurs expérimentales après une étape de Iyse cellulaire.
On peut encore citer les matrices extracellulaires issues de cellules de cordon ombilical et commercialisées par certains Laboratoires Académiques Universitaires. On peut en outre citer le sérum de veau fœtal, contenant des facteurs de croissance et d'adhérence, utilisé dans le milieu de culture de cellules qui favorise l'adhésion des cellules carcinomateuses.
En général, si ces réactifs favorisent l'adhésion des cellules cancéreuses, ceux- ci ne permettent pas de stimuler leur prolifération ou de stimuler leur prolifération de manière constante, ceci du notamment aux variations des lots de fabrication et ainsi de leur qualité.
On peut enfin citer la technique de fabrication d'une matrice extracellulaire proposée par Gospodarowitcz et al. (Endocrine Reviews, 1 (3):201-227, 1980), à partir de cellules endothéliales de cornée de bœuf utilisé pour la culture de cellules tumorales, cette matrice présentant une faible stabilité.
Ainsi, il reste de pouvoir disposer d'un réactif biologique constant pour la culture de cellules malignes tumorales permettant d'obtenir à la fois leur adhésion, notamment sur un support plastique, et leur prolifération.
En effet, de tels réactifs pourront être avantageusement utilisés non seulement pour la culture de cellules tumorales mais également pour l'établissement de lignées cellulaires tumorales issues de tumeur primaire. De telles cultures ou lignées pourront être un outil de choix pour étudier leurs propriétés biologiques (acide nucléique, protéine, activités enzymatiques), ou encore pour réaliser des tests prédictifs de sensibilité aux traitements de tumeurs (chimiothérapie et radiothérapie).
Il serait également souhaitable de pouvoir disposer de tels réactifs pour un type de cancer donné permettant la prolifération de cellules tumorales issues d'un prélèvement d'une tumeur chez un patient. En effet la prolifération de telles cellules tumorales ou l'établissement d'une lignée cellulaire à partir de telles cellules permettraient l'étude in vitro à court terme des cellules malignes de ce patient et la sensibilité de ces cellules malignes au traitement envisagé avant son administration au patient.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante que des matrices extracellulaires isolées, sécrétées par des cellules tumorales de mammifère, notamment épithéliomateuses, permettaient de faire adhérer et proliférer des cellules tumorales, et permettaient l'établissement de lignée cellulaire tumorale établie à partir de cellules tumorales issues d'un échantillon d'une tumeur primaire et/ou métastasique, ceci en particulier lorsque ces cellules tumorales que l'on cherche à cultiver ou dont on cherche à établir une lignée cellulaire étaient issues d'un tissu de même origine embryonnaire que les cellules tumorales sécrétant ladite matrice.
Ainsi sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée, sécrétée par des cellules tumorales d'origine animale, y compris l'Homme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en culture desdites cellules tumorales d'origine animale sur un support dans des conditions permettant auxdites cellules tumorales d'origine animale de proliférer et de sécréter ladite MEC ; et b) la récupération de la MEC ainsi formée débarrassée desdites cellules tumorales.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre entre ladite étape a) et ladite étape b) l'étape suivante :
- la lyse desdites cellules tumorales. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention est caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales d'origine animale sont des cellules épithéliomateuses.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention est caractérisé en ce
que lesdites cellules tumorales sont des cellules d'une lignée cellulaire tumorale préalablement établie à partir d'une tumeur primaire et/ou d'une prolifération métastasique.
De manière également préférée, l'invention concerne un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire tumorale a été établie à partir de cellules tumorales et/ou métastasique issues d'une tumeur mammaire ou ovarienne.
De manière encore plus préférée, l'invention concerne un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales sont des cellules issues d'une tumeur d'origine humaine.
Sous un aspect particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales sont des cellules issues de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 telle que déposée dans les conditions du traité de Budapest à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, (France) sous le numéro I-2893 le 20 juin 2002.
La lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 est une lignée de cellules épithéloïdes dérivées d'une tumeur primitive d'un cancer ovarien humain. Ces cellules cancéreuses se développent en monocouche et en « grappes » flottantes dans le milieu. Ces « grappes » cellulaires sont capables d'adhérer au plastique. Réciproquement, les cellules adhérentes peuvent proliférer en « grappes » flottantes et c'est le contingent adhérent qui est propagé (Bénard, J. et al., Cancer Research, 45, 4970-4979, 1985).
Sous un deuxième aspect, l'invention a pour objet une matrice extracellulaire (MEC) isolée susceptible d'être obtenue par un procédé de préparation d'une matrice extracellulaire isolée selon la présente invention.
Parmi les MEC isolées selon la présente invention, on préfère tout particulièrement la MEC isolée sécrétée par la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2893 le 20 juin 2002. De préférence, la MEC isolée selon la présente invention est conditionnée sous une forme fluide, congelée, séchée ou lyophilisée et, le cas échéant, stérilisée.
Sous un troisième aspect, l'invention a pour objet un réacteur pour culture cellulaire contenant une MEC isolée selon la présente invention.
Sous un quatrième aspect, l'invention a pour objet un procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend une
étape dans laquelle lesdites cellules tumorales sont mises en contact avec une MEC isolée selon la présente invention, lesdites cellules tumorales que l'on désire cultiver étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
Sous un cinquième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale établie à partir de cellules tumorales issues d'un échantillon d'une tumeur primaire et/ou métastasique d'origine animale, y compris l'Homme, caractérisé en ce que ledit procédé met en œuvre une étape dans laquelle les cellules tumorales contenues dans ledit échantillon de la tumeur et dont on cherche à obtenir une lignée établie sont mises en contact avec une MEC isolée selon la présente invention, lesdites cellules tumorales dont on cherche à obtenir une lignée établie étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention est caractérisé en ce que le premier tissu tumoral dont sont issues les cellules tumorales à partir desquelles ladite MEC a été obtenue et le deuxième tissu tumoral contenant les cellules tumorales que l'on cherche à cultiver ou dont on cherche à établir une lignée cellulaire sont de même espèce animale, y compris l'Homme.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention est caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont issus indépendamment l'un de l'autre du groupe de tumeurs malignes ou bénignes, notamment issus de tumeurs de l'ovaire, du sein, de la prostate ou de la thyroïde. De préférence encore, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention est caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral est un tissu issu d'une tumeur de sein, notamment de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 et ledit deuxième tissu tumoral est issu de tumeurs malignes ou bénignes de l'ovaire, du sein, de la prostate ou de la thyroïde.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention est caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont de même origine embryonnaire.
Par « même origine embryonnaire » pour un tissu tumoral, on entend désigner dans la présente description des tissus tumoraux dérivant des mêmes tissus primitifs embryonnaires (endoderme, ectoderme ou mésoderme). Par exemple, des tumeurs épithéliomateuses ovarienne et mammaires seront considérées comme dérivant d'une même origine embryonnaire puisque les tissus épithéliaux ovariens et mammaires dérivent de l'endoderme.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention est caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont d'origine embryonnaire différente, de préférence dérivé de l'endoderme et de l'ectoderme, ou inversement.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention est caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont indépendamment l'un de l'autre de type mammaire ou ovarien.
Dans un mode de réalisation plus préféré, le procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou le procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral est de type ovarien et ledit deuxième tissu tumoral est de type mammaire ou ovarien.
Sous un aspect particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de culture de cellules tumorales selon la présente invention ou un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont d'origine humaine.
Sous un sixième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une MEC isolée selon la présente invention, comme élément d'un milieu de culture pour la culture cellulaire de cellules tumorales ou pour l'établissement d'une lignée cellulaire de cellules tumorales issues d'une tumeur primaire et/ou d'une prolifération métastasique, lesdites cellules tumorales étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
Sous un septième aspect, l'invention a pour objet une lignée cellulaire tumorale établie obtenue par un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention.
Parmi les lignées cellulaires tumorales établies pouvant être obtenues par un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale selon la présente invention, on préfère tout particulièrement la lignée cellulaire tumorale dénommée IGR-OV-22-AS telle que déposée dans les conditions du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro 1-2894 le 20 juin 2002 ou la lignée cellulaire tumorale dénommée IGR-BR-11- NS telle que déposée dans les conditions du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I-2895 le 20 juin 2002.
La lignée cellulaire tumorale dénommée IGR-OV-22-AS a été établie à partir de cellules épithéliomateuses contenues dans un prélèvement d'ascite péritonéale carcinomateuse d'un adénocarcinome épithélial ovarien humain et sur un contexte génétique de prédisposition au syndrome de cancer du sein et/ou ovaire, le cancer épithélial ovarien s'étant développé chez une patiente constitutionnellement hétérozygote pour le gène BRCA2 (mutation d'un allèle du gène). Ces cellules cancéreuses épithéliomateuses se développent en monocouche. Cancer humain de sein, cellules épithéliomateuses issues d'un nodule.
La lignée cellulaire tumorale dénommée IGR-BR-11-NS a été nouvellement établie sur contexte génétique de prédisposition au syndrome cancer sein/ovaire, chez une patiente hétérozygote BRCA1 (mutée pour un allèle du gène).
Ces cellules cancéreuses épithéliomateuses se développent également en monocouche.
Sous un huitième aspect, l'invention a pour objet une méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la culture desdites cellules tumorales comprenant au moins une étape de culture sur une MEC isolée selon la présente invention, lesdites cellules tumorales étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée ; b) la mise en contact dudit composé avec les cellules tumorales obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant normalement leur croissance et/ou leur prolifération ; et c) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de sélection d'un composé selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite MEC isolée à l'étape a) est la MEC sécrétée par la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 telle que déposée à la CNCM sous le numéro 1-2893 le 20 juin 2002.
Dans un mode de réalisation plus préféré, l'invention a pour objet une méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, notamment de cellules tumorales d'une tumeur ovarienne, de préférence humaine, ou de cellules tumorales de même origine embryonnaire qu'une cellule ovarienne, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé avec une culture de cellules issue de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV-22-AS telle que déposée à la CNCM sous le numéro 1-2894 le 20 juin 2002 ; et b) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales.
Dans un mode de réalisation également plus préféré, l'invention a pour objet une méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, notamment de cellules tumorales d'une tumeur mammaire, de préférence humaine, ou de cellules tumorales de même origine embryonnaire qu'une cellule mammaire, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé avec une culture de cellules issue de la lignée cellulaire tumorale d'origine humaine IGR-BR-11-NS telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2895 le 20 juin 2002 ; et b) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales.
Dans un mode de réalisation également plus préféré, l'invention a pour objet une méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales d'un patient atteint d'une tumeur à partir d'un échantillon de cellules tumorales prélevées préalablement chez ledit patient, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'établissement d'une lignée cellulaire tumorale à partir desdites cellules tumorales prélevées chez le patient par un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale établie par un procédé selon la présente invention ; b) la mise en contact dudit composé avec un échantillon de la lignée cellulaire tumorale obtenue à l'étape a) dans des conditions permettant normalement leur croissance et/ou leur prolifération ; et c) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération des cellules de la lignée cellulaire tumorale.
Sous un neuvième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un composé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'un cancer caractérisée en ce que ledit composé est sélectionné par un procédé de sélection selon la présente invention. De manière préférée, l'invention concerne l'utilisation d'un composé selon la présente invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer du sein ou des ovaires.
Sous un dixième aspect, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic ou de pronostic in vitro par analyse chromosomique, notamment par cytogénétique et FISH interphasique, de cellules tumorales préalablement prélevées chez un patient, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape dans laquelle lesdites cellules tumorales préalablement prélevées que l'on désire tester sont mises en culture sur une MEC isolée selon la présente invention, lesdites cellules tumorales étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de diagnostic ou de pronostic in vitro par analyse chromosomique de cellules tumorales préalablement prélevées chez un patient est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'établissement d'une lignée cellulaire tumorale à partir desdites cellules tumorales par un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale établie par un procédé selon la présente invention ; et b) l'analyse chromosomique d'un échantillon de cellules de ladite lignée obtenue à l'étape a) dans des conditions permettant leur croissance et/ou leur prolifération ; et c) la mise en évidence d'une altération génétique d'un ou plusieurs chromosomes par une technique permettant de détecter de telles altérations, notamment par l'analyse karyotypique ou par la technique dite de FISH interphasique. Le génome des cellules tumorales se caractérise par un ensemble d'altérations génétiques : gain et/ou perte de régions chromosomiques. Le cytogénéticien révèle, en routine, ces altérations à l'aide notamment de deux techniques : l'analyse karyotypique et l'analyse par FISH (« Fluorescent In Situ Hybridization »), techniques bien connues de l'homme de l'art dont nous rappelons ici que certaines étapes afin de noter l'importance de pouvoir disposer de cellules tumorales possédant une capacité proliférative. - Analyse karyotypique après culture in vitro des cellules tumorales
Vingt-quatre heures après ensemencement des cellules tumorales, une solution de colchicine est ajoutée au milieu de culture. Les cellules qui ont adhéré au plastique et qui ont engagé une prolifération, vont se trouver bloquées en mitose révélant ainsi leurs chromosomes. Le rendement des mitoses dans ces conditions est très variable selon le type de tumeur et la capacité proliférative du tissu tumoral.
- Analyse par FISH interphasique sur appositions cellulaires
L'apposition d'un fragment tumoral sur une lame d'observation cytologique permet le dépôt de cellules malignes et, après fixation, une analyse par hybridation fluorescente in situ. Cette analyse ne nécessite pas de cellules en mitose mais s'applique à toutes les cellules, la majorité étant en interphase, une petite minorité étant en mitose permet de visualiser les chromosomes.
Les cellules tumorales épithéliomateuses en présence de matrice extracellulaire selon l'invention, notamment issue de la lignée IGR-OV1 vont adhérer, se différencier et proliférer. Ainsi, selon la technique mise en œuvre par le cytogeneticien pour mettre en évidence les altérations génétiques de cellules tumorales, la matrice extracellulaire de l'invention apporte les améliorations suivantes.
- Pour l'analyse karyotypique
L'analyse karyotypique nécessitant une culture cellulaire préalable pour recruter des cellules en mitoses. Ces cultures sont réalisées habituellement sur un support plastique, ce qui ne favorise pas en particulier l'adhésion et la prolifération des cellules cancéreuses épithéliomateuses. Le rendement de l'analyse est très faible, du fait d'un nombre limité de mitoses. La culture en présence de matrice extracellulaire selon l'invention favorisant l'adhésion spécifique aux cellules tumorales et leur prolifération, le nombre de mitoses de cellules tumorales recrutées par la matrice sera beaucoup plus importante.
- Pour l'analyse FISH
Sur une lame présentant la matrice extracellulaire préalablement préparée, la présence de la matrice extracellulaire selon l'invention apposée sur la lame permet une adhésion accrue des cellules cancéreuses. Les empreintes tumorales réalisées sur la matrice seront plus riche en cellules et réduiront le temps d'analyse.
Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet un kit pour la culture de cellules tumorales, notamment issues de tumeur mammaire ou ovarienne, ou pour l'établissement de lignée cellulaire issue desdites cellules tumorales, comprenant une MEC selon l'invention.
La présente invention concerne en outre un support solide, notamment une lame de verre, sur laquelle est apposée une matrice extracellulaire selon la présente invention et son utilisation pour l'analyse chromosomique de cellules tumorales.
Les exemples suivants ont été choisis pour fournir à l'homme de l'art une description complète afin de pouvoir réaliser et utiliser la présente invention. Ces exemples ne sont pas destinés à limiter la portée de ce que les inventeurs considèrent comme leur invention, ni destinées à montrer que seules les expériences ci-après ont été effectuées.
Exemples
Exemple 1 : Préparation d'une matrice extracellulaire obtenue à partir de la lignée IGR- OV1
1) Mise en culture des cellules IGR-OV1
Les cellules IGR-OV1 (temps de doublement 25h environ) sont cultivées entre les passages 170 et 210 correspondant à environ 500 générations, nombre de générations garantissant la stabilité de la lignée. Une fois la confluence atteinte, les
2 cellules sont passées au 1/3 dans des flacons de culture de 25 cm , cultivées dans 5 ml de RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum fœtal de veau. Après 3 jours de culture en incubateur, à 37°C en présence de 5 % de CO2, la confluence des cellules épithéliomateuses est atteinte.
2) Préparation de la matrice
Le milieu de culture surmontant les cellules confluentes est éliminé et remplacé par du tampon PBS (tampon phosphate salin) dépourvue de calcium et de magnésium et préincubé à 37°C. Cette opération est renouvelée 3 fois, elle permet d'éliminer les protéines du milieu de culture dont la présence altérerait la reproductibilité de la lyse cellulaire. Les volumes des 3 tampons successifs sont les suivants : - 1 ml par puits d'une plaque de 24 puits,
- 2 ml par puits d'une plaque de 6 puits,
2
- 5 ml pour un flacon de culture de 25 cm ,
2 - 10 ml pour un flacon de culture de 75 cm .
Après la troisième décantation du PBS, le même volume de NH4OH 0,02 M préchauffé à 37°C est versé sur les parois du flacon avant d'être appliqué aux cellules confluentes. L'incubation est faite dans l'incubateur à CO2 à 37°C pendant 6 minutes.
Si à l'issue de ce temps d'incubation la lyse n'est pas totale, elle est poursuivie par tranches de 30 secondes. Lorsque tous les corps cellulaires ont disparu, l'arrêt se fait alors par décantation de la solution ammoniaquée qui est très visqueuse (ADN génomique libéré par les cellules). Le lavage de la matrice se fait par le cycle addition- décantation à 3 reprises du même volume de PBS que le volume de lyse. Le premier lavage peut encore être visqueux. Les lavages doivent être efficaces mais suffisamment doux pour ne pas endommager la matrice.
3) Conservation de la matrice
Les flacons et les plaques de culture contenant la matrice sont conservés sous sacs thermo-soudés dans le Λλ du volume du culture d'un milieu PBS contenant des antibiotiques, l'ensemble à 4°C. La matrice ainsi préparée peut être utilisée entre le
3eme et le 21e jour suivant sa préparation sans dégradation.
4) Matériel et milieux nécessaires Matériel : - plaques de culture Costar (boîte de 6, 24 et 96 puits) ;
2
- flacons de culture Nunc de 25 et 75 cm . Milieux de culture :
• RPM1 1640 Gibco BRL supplémenté en :
- 2 mM glutamine, - en antibiotiques : vancomycine (12 μg/ml), gentamycine (10 μg/ml) et fungizone (2 μg/ml).
Le milieu ainsi reconstitué est tamponné par 10 mM final d'HEPES.
• Sérum fœtal de veau d'origine canadienne, Sté Biomédia ;
• PBS (PBS pour « Phosphate Buffer Salts ») sans calcium ni magnésium Gibco ; • Milieu de conservation de la matrice : PBS sans calcium ni magnésium Gibco en présence des antibiotiques et à la concentration finale indiquée ci-dessus.
Exemple 2 : Obtention de deux lignées épithéliomateuses : IGR-OV-22 et IGR-BR-11 A) Etablissement de la lignée épithéliomateuse IGR-OV-22
Le cancer de Pépithélium ovarien se développe sous la forme d'une tumeur solide ovarienne loco-régionale et d'une ascite péritonéale contenant des cellules épithéliomateuses.
La tumeur primitive (TP) et l'ascite (Asc) préalablement prélevés chez une patiente à contexte familial de susceptibilité du cancer du sein et/ou de l'ovaire, patiente constitutionnellement hétérozygote pour le gène BRCA2, ont été réceptionnés par le laboratoire d'anatomo-pathologie. 1) Préparation de la tumeur
Il a été pratiqué dans la tumeur des ponctions à l'aide d'une aiguille (22 gauges) et d'une seringue d'1 ml (type insuline) préalablement héparinée. Le contenu de la seringue est repris dans un grand volume de RPM1 1640 - 10 % sérum fœtal de veau, puis centrifugé. Les hématies contaminant le culot cellulaire sont éliminées par un choc hypotonique à l'aide d'eau distillée stérile. La suspension cellulaire est de nouveau centrifugée et enfin reprise dans 4 ml de RPMI 1640 - 10 % sérum fœtal de veau ce qui a permis d'obtenir une suspension de cellules épithéliomateuses à 7,5 x
5
10 cellules/ml. La suspension cellulaire ainsi préparée est ensemencée dans les 12 puits d'une plaque de culture présentant la matrice extracellulaire sécrétée par la lignée IGR-OV1 préalablement préparée (matrice préparée depuis 17 jours). La
5 2 densité d'ensemencement est importante, environ 3 x 10 cellules / 4,5 cm .
2) Préparation de l'ascite
Un grand volume d'ascite prélevé a été centrifugé en présence de RPM1 1640 - 10 % sérum fœtal de veau. Le culot de population cellulaire obtenu a été ensuite traité dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites pour la tumeur. Les cellules épithéliomateuses ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits présentant la matrice extracellulaire sécrétée par la lignée IGR-OV1 et en utilisant les mêmes concentrations cellulaires indiquées ci dessus.
3) Culture in vitro des cellules épithéliomateuses de la tumeur et de l'ascite L'observation tous les quatre jours des cultures a permis d'objectiver des cellules épithéliomateuses adhérant au substrat, se différenciant (au vu de leur morphologie) et proliférant.
Lorsque la confluence a été observée, les cellules ont été trypsinées à l'aide de trypsine-EDTA 0,025 %, reprises par le milieu RPMI 1640 - 10 % sérum fœtal de veau et réensemencées sur matrice aux mêmes densités d'ensemencement initial.
Après amplification des deux populations cellulaires, TP et Asc, dans des boîtes de culture à 12 puits pendant 5 passages, les 5 passages suivants ont été
2 réalisés dans des flacons de culture de plus grande surface de culture, soit 25 cm , présentant à nouveau la matrice extracellulaire.
A l'issue de ces 10 passages sur matrice extracellulaire, les cellules épithéliomateuses sont capables de se propager directement sur plastique. Les cellules tumorales TP et Asc ayant subi 20 passages, les sous-lignées IGR-OV22-Asc et IGR-OV22-TP sont considérées comme établies présentant un phénotype tumoral similaire et typiquement épithéliomateux. B) Etablissement de la lignée IGR-BR-11
La tumeur primitive (TP) d'un cancer mammaire préalablement prélevée chez une patiente à contexte familial de susceptibilité du cancer du sein et/ou de l'ovaire, patiente constitutionnellement hétérozygote pour le gène BRCA1 , a été réceptionnée par le laboratoire d'anatomo-pathologie.
Le protocole indiqué pour l'établissement de la lignée IGR-0V-22 (TP), en particulier les concentrations initiales d'ensemencement, a été strictement identique pour l'établissement de cette lignée IGR-BR-11. A l'issue de 10 passages en présence de matrice extracellulaire, les cellules épithéliomateuses ont été cultivées à raison de 30 passages sur plastique en l'absence de matrice extracellulaire. La lignée IGR-BR- 11 a été ainsi établie.
Exemple 3 : Culture de cellules épithéliales tumorales de différents types histologiques et de malignité variable à partir de la MEC issue de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1
Des mises en primoculture (PO) initiées sur la MEC issue de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 , suivies de passages successifs (P1 , P2, ...) ont été réalisées avec succès avec des cellules issues de : A) Tumeurs malignes 1 ) Tumeurs cancéreuses du sein (n=8) Résultats :
- Deux PO suivies chacune de P1 ; et
- Une lignée établie (P40).
Soit un score de réussite de 3/8 (35 %). 2) Tumeurs cancéreuses de l'ovaire (n=5) Résultats :
- Trois PO ; et
- Une PO suivie de P1, P2, P3 et P4. Soit un score de réussite de 4/5 (80 %). 3) Tumeurs cancéreuses de la prostate (n=2)
- Une PO suivie de P1 et P2. Soit un score de réussite de 1/2 (50 %). 4) Cancers papillaires de la thyroïde (n=2)
- Deux PO suivies chacune de P1 Soit un score de réussite de 2/2 (100 %).
B) Tumeurs à la limite de la malignité et tumeurs bénignes
1) Tumeur « Border-line » de l'ovaire (n=7)
- Trois PO suivies de P1 ; et - Deux PO.
Soit un score de réussite de 5/7 (70 %).
2) Goitre thyroïdien (n=1)
-Un PO. Soit un score de réussite de 1/1 (100 %). Ainsi, des primocultures de cellules épithéliales cancéreuses ont été pratiquées avec succès sur MEC non seulement pour les différentes tumeurs malignes suivantes : sein, 3/8 (35 %), ovaires 4/5 (80 %), prostate 1/2 (50 %), thyroïde 2/2 (100 %) ; mais aussi sur des tumeurs ovariennes à la limite de la malignité 5/7 (70 %) et tumeurs bénigne thyroïdienne, 1/1 (100%). Ces résultats indiquent dont l'intérêt des MEC selon la présente invention la matrice IGR-XC pour la culture de tumeurs épithéliales de différents types histologiques et de malignité variables (16/25 soit 65 %) ainsi que pour l'établissement de nouvelles lignées cellulaires.
Claims
REVENDICATIONS
1/ Procédé de préparation d'une matrice extracellulaire (MEC) isolée, sécrétée par des cellules tumorales d'origine animale, y compris l'Homme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en culture desdites cellules tumorales d'origine animale sur un support dans des conditions permettant auxdites cellules tumorales d'origine animale de proliférer et de sécréter ladite MEC ; et b) la récupération de la MEC ainsi formée débarrassée desdites cellules tumorales.
2/ Procédé de préparation d'une MEC isolée selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre entre ladite étape a) et ladite étape b) l'étape suivante :
- la lyse desdites cellules tumorales. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales d'origine animale sont des cellules épithéliomateuses.
4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales sont des cellules d'une lignée cellulaire tumorale préalablement établie à partir d'une tumeur primaire et/ou d'une prolifération métastasique.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire tumorale a été établie à partir de cellules tumorales et/ou metastasiques issues d'une tumeur mammaire ou ovarienne.
6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales sont des cellules issues d'une tumeur d'origine humaine.
Il Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales sont des cellules issues de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2893 le 20 juin 2002.
8/ MEC isolée obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 7.
9/ MEC isolée selon la revendication 8, sécrétée par la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2893 le 20 juin 2002.
10/ MEC isolée selon la revendication 8 ou 9, conditionnée sous une forme fluide, congelée, séchée ou lyophilisée et, le cas échéant, stérilisée.
11/ Procédé de culture de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle lesdites cellules tumorales sont mises en contact avec une MEC isolée selon l'une des revendications 8 à 10, lesdites cellules tumorales que l'on désire cultiver étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
12/ Procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale établie à partir de cellules tumorales issues d'un échantillon d'une tumeur primaire et/ou métastasique d'origine animale, y compris l'Homme, caractérisé en ce que ledit procédé met en œuvre une étape dans laquelle les cellules tumorales contenues dans ledit échantillon de la tumeur et dont on cherche à obtenir une lignée établie sont mises en contact avec une MEC isolée selon l'une des revendications 8 à10, lesdites cellules tumorales dont on cherche à obtenir une lignée établie étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
13/ Procédé selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que le premier tissu tumoral dont sont issues les cellules tumorales à partir desquelles ladite MEC a été obtenue et le deuxième tissu tumoral contenant les cellules tumorales que l'on cherche à cultiver ou dont on cherche à établir une lignée cellulaire sont de même espèce animale, y compris l'Homme.
14/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont de même origine embryonnaire.
15/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont d'origine embryonnaire différente. 16/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont indépendamment l'un de l'autre de type mammaire ou ovarien.
17/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral est de type ovarien et ledit deuxième tissu tumoral est de type mammaire ou ovarien.
18/ Procédé selon l'une des revendications 11 à 17, caractérisé en ce que ledit premier tissu tumoral et ledit deuxième tissu tumoral sont d'origine humaine.
19/ Utilisation d'une MEC isolée selon l'une des revendications 8 à 10, comme élément d'un milieu de culture pour la culture cellulaire de cellules tumorales ou pour l'établissement d'une lignée cellulaire de cellules tumorales issues d'une
tumeur primaire, lesdites cellules tumorales étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
20/ Lignée cellulaire tumorale établie obtenue par un procédé selon l'une des revendications 12 à 18. 21/ Lignée cellulaire tumorale selon la revendication 20, dénommée IGR-
OV-22-AS telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2894 le 20 juin 2002.
22/ Lignée cellulaire tumorale selon la revendication 20, dénommée IGR- BR-11-NS telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2895 le 20 juin 2002.
23/ Méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la culture desdites cellules tumorales comprenant au moins une étape de culture sur une MEC isolée selon l'une des revendications 8 à 10, lesdites cellules tumorales étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée ; b) la mise en contact dudit composé avec les cellules tumorales obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant normalement leur croissance et/ou leur prolifération ; et c) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales. 24/ Méthode de sélection d'un composé selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite MEC isolée à l'étape a) est la MEC sécrétée par la lignée cellulaire tumorale IGR-OV1 telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2893 le 20 juin 2002.
25/ Méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé avec une culture de cellules issue de la lignée cellulaire tumorale IGR-OV-22-AS telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2894 le 20 juin 2002 ou de la lignée cellulaire tumorale d'origine humaine IGR-BR-11- NS telle que déposée à la CNCM sous le numéro I-2895 le 20 juin 2002 ; et b) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales.
26/ Méthode de sélection d'un composé capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales d'un patient atteint d'une tumeur à partir
d'un échantillon de cellules tumorales prélevées préalablement chez ledit patient, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'établissement d'une lignée cellulaire tumorale à partir desdites cellules tumorales prélevées chez le patient par un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale établie selon l'une des revendications 12 à 18 ; b) la mise en contact dudit composé avec un échantillon de la lignée cellulaire tumorale obtenue à l'étape a) dans des conditions permettant normalement leur croissance et/ou leur prolifération ; et c) la sélection dudit composé si celui-ci est capable d'inhiber la croissance et/ou la prolifération des cellules de la lignée cellulaire tumorale.
27/ Méthode de diagnostic ou de pronostic in vitro par analyse chromosomique, notamment par cytogénétique et FISH interphasique de cellules tumorales préalablement prélevées chez un patient, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape dans laquelle lesdites cellules tumorales préalablement prélevées que l'on désire tester sont mises en culture sur une MEC isolée selon l'une des revendications 8 à 10, lesdites cellules tumorales étant différentes de celles à partir desquelles ladite MEC a été sécrétée.
28/ Méthode de diagnostic ou de pronostic in vitro par analyse cytogénétique de cellules tumorales préalablement prélevées chez un patient, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'établissement d'une lignée cellulaire tumorale à partir desdites cellules tumorales par un procédé de préparation d'une lignée cellulaire tumorale établie selon l'une des revendications 12 à 18 ; et b) l'analyse cytogénétique d'un échantillon de cellules de ladite lignée obtenue à l'étape a) dans des conditions permettant leur croissance et/ou leur prolifération.
29/ Kit pour la culture de cellules tumorales, notamment issues de tumeur mammaire ou ovarienne, ou pour l'établissement de lignée cellulaire issue desdites cellules tumorales, comprenant une MEC selon l'une des revendications 8 à 10.
30/ Réacteur pour culture cellulaire contenant une MEC isolée selon l'une des revendications 8 à 10.
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