EP1543151A2 - Verfahren zum nachweis und zur differenzierung von bakterien - Google Patents

Verfahren zum nachweis und zur differenzierung von bakterien

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Publication number
EP1543151A2
EP1543151A2 EP03750608A EP03750608A EP1543151A2 EP 1543151 A2 EP1543151 A2 EP 1543151A2 EP 03750608 A EP03750608 A EP 03750608A EP 03750608 A EP03750608 A EP 03750608A EP 1543151 A2 EP1543151 A2 EP 1543151A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequences
complementary
nucleic acid
fragment
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03750608A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Weizenegger
Michaela Bollen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hain Lifescience GmbH
Original Assignee
Hain Lifescience GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hain Lifescience GmbH filed Critical Hain Lifescience GmbH
Publication of EP1543151A2 publication Critical patent/EP1543151A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnostics of microorganisms, in particular the detection of bacteria which occur in clinically relevant samples.
  • the nucleic acids described here can preferably be used to identify bacteria in cultures, in particular in blood cultures.
  • the invention relates in particular to hybridization methods and amplification methods, as well as coupled amplification / hybridization methods with sequence-specific probes or primers.
  • the cultivation of the bacteria in liquid or solid media is a sensitive standard method for the detection of bacteria in the human primary sample.
  • the differentiation is usually carried out by microscopy of cultural or primary preparations, according to the morphology on surfaces of cultivated colonies, by growth tests under various conditions and by catabolic properties, e.g. the metabolism of sugar, the formation of acids, etc. Due to the necessary installation of secondary and / or tertiary cultures, several days can pass before the findings are made.
  • the object of the present invention was therefore to provide highly specific and highly sensitive ner methods for the detection of clinically important bacteria, the development of primers for carrying out an amplification method for bacterial genome fragments and / or their transcripts and the development of a detection system carrying many probes. These tests preferably run in the multiplex method.
  • a ner method for the detection of clinically relevant bacteria in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or is complementary to this, hybridizes to a sequence- and / or species-specific nucleic acid probe under stringent conditions and then the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected to the sequence-specific nucleic acid probe is detected, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or is complementary to these sequences, or a fragment represents or is complementary to this fragment, one contains these sequences or the complementary sequence or is a variant thereof.
  • nucleic acid and oligonucleotide refers to primers, samples, probes and oligomer fragments which are detected.
  • nucleic acid and oligonucleotide is also generic to polydeoxyribonucleotides (containing 2-deoxy-D-ribose) and polyribonucleotides (containing D-ribose) or to any other type of polynucleotide that is an N-glycoside of a purine base or a pyrimidine base, respectively a modified purine base or a modified pyrimidine base.
  • PNAs are also included according to the invention, i. H. Polyamides with purine / pyrimidine bases.
  • nucleic acid and oligonucleotide are not considered to be different within the meaning of the present invention; in particular, the use of the terms is not intended to mean any differentiation in terms of length. These terms include both double and single stranded DNA and double and single stranded RNA.
  • sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 19-54 and 174-176 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or one of these sequences or contains the complementary sequence.
  • probes which differ slightly from the probes according to the invention, but which can nevertheless be used according to the invention. It is also conceivable to use probes that have the sequences SEQ ID no. 1-176 or 19-54 and 174-176 at the 5 'and / or 3' end of the truncations by one, two or three nucleotides.
  • a nucleic acid probe which contains one of the SEQ ID No.:l-176 or a sequence complementary thereto preferably comprises nucleic acid probes which at the 5 'and or 3' ends 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 contains additional nucleotides, these 5 'and / or 3' flanking sequences preferably having homology to the respective natural 5 'and / or 3 'flanking sequences of SEQ ID No .: 1-176, more preferably 19-54 and 174-176 of at least about 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
  • flanking sequences are preferably chosen so that they do not significantly impair the hybridization of the nucleic acid probe. However, the specificity is preferably increased by the additional flanking nucleotides.
  • a variant of SEQ ID No .: 1-176, preferably SEQ ID No .: 19-54 and 174-176, which can be used according to the invention is a nucleic acid probe in which 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10 nucleotides compared to the one identified by SEQ ID No. 1-176 specific sequence have been changed. Preferably no more than 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, and most preferably only one nucleotide are changed. Such a nucleotide change is preferred if the specificity of the probe is not significantly changed thereby and / or the melting point of the probe is not significantly changed thereby. The specificity of a probe modified in this way can easily be checked by the person skilled in the art by routine experiments.
  • a variant in the sense of the invention is present when the probe is to be detected with respect to the particular one.
  • Nucleic acid at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% or more than 100% of the specificity of the unchanged nucleic acid probe according to SEQ ID No .: 1-176.
  • composition which contains the nucleic acid to be detected or a part thereof, with one, preferably at least two, three, four, five, six, seven, eight, new, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen or hybridized more different probes.
  • the nucleic acid to be detected it is possible to determine the nucleic acid to be detected and thus, for example, the bacterial species by hybridization with a single specific probe.
  • more than one probe preferably two, for the composition which contains the nucleic acid to be detected or a part thereof or three to hybridize. This increases the informative value of the process.
  • An exact profile is then obtained and the nucleic acid to be detected and thus, for example, the bacterial species can be determined with a high degree of certainty.
  • a preferred method for the differentiation of clinically relevant bacteria is therefore a multiplex method in which the bacterial genome sections necessary for the differentiation are enriched and hybridized in a common amplification and hybridization reaction.
  • the amplification of various gene fragments is necessary for this application.
  • the probe and primer for the detection of the bacterial species are complementary to 23 S ribosomal RNA genes and / or to the elongation factor TU, the probes and primers for differentiating the antibiotic resistance have the corresponding genomically coded resistance genes as the target sequence. Since the polymorphisms necessary for differentiation on the genome encompass many 1000 bases, a splitting into smaller fragments is also important for an effective amplification.
  • the variety of primers that can all interact with one another requires careful design.
  • a multiplex amplification method uses at least two different ones
  • Nuclear acid fragments amplified simultaneously Preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 or more different nucleic acid sequences are amplified simultaneously.
  • twice as many primers are used, ie at least 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 and more primers.
  • a multiplexed hybridization method preferably a reverse hybridization method, is preferably connected to the multiplex amplification method immediately or after further intermediate steps such as, for example, cleaning steps.
  • a hybridization matrix according to the invention has a corresponding one Number of different immobilized probes.
  • Another important aspect is a multiplexing method with a self-amplifying chip.
  • probes with different primary structures have to hybridize under the same conditions, whereby the specificity should be sufficient for the detection of single-base pockets. For this reason, salts such as betaine or tetramethylammomumchloid are preferred as modulators of the hydrogen bonds in the stringency washing.
  • Preferred polymerases are thermostable "hot start polymerases for the self-amplifying chip:
  • Preferred buffers are PCR buffers which contain modulating chemicals such as Preferred amplification primers are selected from SEQ ID No. 1-176, or complementary thereto, or a fragment thereof or contain one of these sequences, particularly preferred are SEQ ID No .: 55-170.
  • salts such as betaine or Tetramethylammomumchloid preferred, but also stabilizing proteins like BSA.
  • hybridization refers to the formation of duplex structures by two single-stranded nucleic acids due to complementary base pairing. Hybridization can take place between complementary strands of nucleic acid or between strands of nucleic acid which have small mismatch ranges.
  • the stability of the nucleic acid duplex is measured by the melting temperature T m .
  • the melting temperature T m is the temperature (at defined ionic strength and pH) at which 50% of the base pairs are dissociated.
  • Stringent hybridization conditions are known to the person skilled in the art (for example Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). In general, stringent conditions are selected so that the melting temperature is 5 ° C lower than the T m for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. If the hybridization is performed under less stringent conditions, then sequence mismatches are tolerated. The The extent of sequence mismatches can be controlled by changing the hybridization conditions.
  • Stringent in the sense of the present invention means that the detection method allows a clear distinction between a positive reaction and a negative reaction in the reaction field of the strip. This can be achieved through the following measures:
  • Structure of the probe by the length of the structure of the probe complementary to the target sequence; 15 to 20 mers are preferred.
  • Running buffer The stringency is influenced by the salinity.
  • the ionic strength is preferably between about 100-500 mM, more preferably between about 150-350 mM, more preferably between 200-300 mM and most preferably about 250 mM.
  • the stringency can be changed by adding one of the mildly denaturing substances (DMSO, formamide, urea) mentioned above to the running buffer.
  • DMSO mildly denaturing substances
  • the stringency is also influenced by the pH value of the running buffer.
  • all of the above-mentioned measures are measures which have an influence on the formation of hydrogen bonds.
  • solid phase or hybridization matrix encompasses any material that is able to form covalent or non-covalent bonds to nucleic acid probes such as, for example, glass, SiO 2 , plastics such as nylon and filter materials such as nitrocellulose.
  • the materials can also be chemically functionalized to form a bond to nucleic acid probes
  • the shape in particular the surface shape, is in no way limited and includes smooth and structured surfaces
  • Hybridization is preferably carried out on a nylon or nitrocellulose membrane, as described, for example, in (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). The principles mentioned therein can be transferred to further embodiments by the person skilled in the art.
  • the length of the target nucleic acid also plays an important role in the sensitivity of the hybridization. Nucleic acid strands with a length of 30-500 base pairs are preferred.
  • the double-stranded target nucleic acid is denatured before hybridization. This is usually done using basic chemicals or heating, whereby the hydrogen bonds responsible for the double-strand structure are melted.
  • a preferred basic chemical is NaOH in a concentration of about 0.1 to 0.5 M. A concentration of about 0.25 M NaOH is particularly preferred.
  • Single-strand structures can also be achieved by heating an aqueous nucleic acid solution to at least 95 ° C. and then rapidly cooling to 4 ° C.
  • Single-strand certificates, e.g. B. as products of the NASBA reaction should also be denatured before hybridization in order to resolve intramolecular structures. Due to the sensitivity of the RNA to high pH values, this can preferably be caused by mildly denaturing chemicals such as DMSO or formamide.
  • Aqueous buffers with a salt content of between 0.1 and 0.5 M and a pH of 7.5-8.0 are generally used as hybridization buffers.
  • Detergents are used to ensure good wetting of the probe-carrying phase.
  • Sodium lauryl sulfate (SDS) is preferred in a concentration of 0.1-7%. In the particularly preferred high concentration of 7%, SDS improves the signal / background ratio by suppressing non-specific bindings, for example of an enzyme complex coupled to the nucleic acid to be detected.
  • the desired stringency of the hybridization is determined by the composition of the hybridization and stringency washing buffer. After hybridization, incubation with a stringency wash buffer is preferred. This destabilizes the double strand through a lower ionic strength. This means that hybrids that are not 100% complementary are separated again.
  • Chemicals e.g. tetramethylammonium chloride
  • the extent of the hybridization is determined after the hybridization. This is usually done by determining the amount of label that is bound to a solid phase.
  • detection reactions and detection methods are known per se to the person skilled in the art.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the nucleic acid to be detected is an amplification product, the amplification being carried out with sequence-specific amplification primers.
  • the nucleic acid to be detected is an amplification product, at least one amplification primer being selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-173, in particular SEQ ID No. 1-18 and 171-173, or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • At least one amplification primer is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-18 and 55-170 and 171-173 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • the amplification primers should be selected so that the amplification product has good steric ratios in combination with the immobilized probe. Pallindrome structures that lead to intramolecular folds can be avoided by selecting suitable primers.
  • the spatial arrangement of the hapten e.g. biotin
  • the hapten should be easily accessible to the antibody-enzyme complex.
  • An embodiment of the method is characterized in that the nucleic acid probes are immobilized. In this case it is advantageous if the nucleic acid to be detected is marked. In another form of the method, the nucleic acid probes are labeled. In this case it is advantageous if the nucleic acid to be detected is immobilized.
  • the invention further relates to a method for the detection of clinically associated bacteria
  • a nucleic acid to be detected which is a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or is complementary to it, is amplified, the amplification being carried out with primers, at least one of which has a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected .
  • the sequence of this primer is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof or is complementary to is this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • This embodiment of the invention is briefly called the amplification method below.
  • the term amplification method includes all preferred embodiments.
  • primers can also be designed which differ slightly from the primers according to the invention, but can nevertheless be used according to the invention. It is also conceivable to use primers which have the sequences SEQ ID no. 1-18 or 55-170 and 170-173 at the 5 'and / or 3' end of the truncations by one, two or three nucleotides.
  • flanking sequences are preferably chosen so that they do not significantly impair the hybridization of the nucleic acid primer. However, the specificity is preferably increased by the additional flanking nucleotides.
  • a variant of SEQ ID No .: 1-176, preferably SEQ ID No .: 19-54 and 174-176, which can be used according to the invention is a nucleic acid probe in which 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10 nucleotides compared to the one identified by SEQ ID No. 1-176 specific sequence have been changed. Preferably no more than 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, and most preferably only one nucleotide are changed. Such a nucleotide change is preferred if the specificity of the probe is not significantly changed thereby and / or the melting point of the probe is not significantly changed thereby. The specificity of a probe modified in this way can easily be checked by the person skilled in the art by means of routine experiments.
  • a variant within the meaning of the invention is present when the probe has at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 with regard to the particular nucleic acid to be detected %, 100% or more than 100% of the specificity of the unchanged nucleic acid probe according to SEQ ID No .: 1-176.
  • the last-mentioned method is most preferred if at least two primers have a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these Sequences are or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • the primer (s) have a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the Sequences of these primers are selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-18 and 171-173 and SEQ ID No .: 55-170 or are complementary to these sequences, or represent a fragment thereof or are complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • primers are marked.
  • PCR polymerase chain reaction
  • TMA transcriptase mediated amplification
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • SDA single strand displacement amplification
  • the amplificate is specifically cut, for example by digestion with a restriction enzyme, and the resulting ethidium bromide-stained fragments are analyzed on an agarose gel.
  • Hybridization systems are also widespread. Hybridization usually takes place in such a way that either the composition which contains the amplification product or a part thereof or the probe is immobilized on a solid phase and brought into contact with the other hybridization partner in each case.
  • materials are conceivable as solid phases, for example nylon, nitrocellulose, polystyrene, silicate materials etc. It is also conceivable that a microtiter plate is used as the solid phase.
  • the target sequence can also hybridize with a capture probe beforehand in solution and then the capture probe is bound to a solid phase.
  • at least one probe or at least one primer is labeled during the amplification of the nucleic acid to be detected.
  • labels are conceivable, such as fluorescent dyes, biotin or digoxigenin.
  • Known fluorescent labels are fluorescein, cyanine dyes, etc.
  • the labels are usually covalently linked to the oligonucleotides. While fluorescent labeling can be detected directly, biotin and digoxigenin labeling can be detected after incubation with suitable binding molecules.
  • a biotin-labeled oligonucleotide can be detected by contacting it with a solution that contains streptavidin coupled to an enzyme, the enzyme, for example peroxidase or alkaline phosphatase, converting a substrate that produces a dye or leads to chemical luminescence ,
  • the enzyme for example peroxidase or alkaline phosphatase, converting a substrate that produces a dye or leads to chemical luminescence
  • the nucleic acid probes are immobilized on the solid phase, and then this solid phase is brought into contact with the composition which contains the labeled nucleic acids to be detected or a part thereof.
  • the composition which contains the labeled nucleic acids to be detected or a part thereof Preferably at least two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen or more different probes are immobilized on the solid phase, more preferably at least five different probes, more preferably at least ten different probes. Different probes can be immobilized in different zones.
  • the solid phase is therefore preferably a microarray of immobilized probes on a solid phase.
  • the solid phases which are suitable for DNA chips preferably consist of silicate materials such as glass etc.
  • the marking of the primers is preferably a fluorescent marking.
  • the DNA chip After incubation with the amplification product or the sample, the DNA chip can contain the nucleic acid to be detected or a part thereof can be quickly analyzed by a scanning device. Such devices are known to the person skilled in the art. McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics gives an overview of the chip technology. Clin Chem 47 (3), 393-402.
  • the nucleic acid to be detected is marked.
  • labels such as fluorescent dyes, biotin or digoxigenin.
  • Known fluorescent labels include fluorescein, FITC, cyanine dyes, rhodamines, rhodamine 6 ooR-phycoerythrin, Texas Red etc.
  • radioactive labeling such as 125 I, 35 S, 32 P, 35 P.
  • Particle labeling is also possible like with latex. Such particles are usually dry, in the micron range and uniform.
  • the labels can be covalently or non-covalently and directly or indirectly connected to the oligonucleotides and are usually linked covalently.
  • a direct link exists if a covalent or non-covalent chemical bond between.
  • a fluorescent label can be detected directly, for example, biotin and digoxigenin labels can be detected after incubation with suitable binding molecules or conjugate partners.
  • Other binding partners than, for example, biotm / streptavidin are antigen / antibody systems, hapten / anti-hapten systems, biotin / avidin, folic acid / folate-binding proteins, complementary nucleic acids, proteins A, G and immunoglobulin etc. (MN Bobrov, et al J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).
  • a biotin-labeled oligonucleotide can be detected by contacting it with a solution that contains streptavidin coupled to an enzyme, the enzyme, for example peroxidase or alkaline phosphatase, converting a substrate that produces a dye or leads to chemical luminescence .
  • the enzyme for this purpose are hydrolases, lyases, oxido reductases, transferases, isomerases and ligases.
  • Other examples are peroxidases, glucose oxidases, phosphatases, esterases, and glycosidases. Such methods are known per se to the person skilled in the art (Wetmur JG.
  • Another preferred conjugate comprises an enzyme which is coupled to an antibody (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984).
  • nucleic acid to be detected with a gold steptavidin conjugate, in which case a biotin-labeled Oligonucleotide can be detected, but conceivable are also binding partners that form covalent bonds with one another, such as sulfhydryl-reactive groups such as maleimides and haloacetyl derivatives and amine-reactive groups such as isothiocyanates, succinimidyl esters and sulfonyl halides.
  • sulfhydryl-reactive groups such as maleimides and haloacetyl derivatives
  • amine-reactive groups such as isothiocyanates, succinimidyl esters and sulfonyl halides.
  • nucleic acids to be detected are labeled, the probes are usually not labeled.
  • the nucleic acids to be detected are thus essentially labeled using the methods described in the prior art (see also US Pat. No. 6,037,127).
  • the labeling can be introduced into the nucleic acid to be detected by chemical or enzymatic methods, or by direct incorporation of labeled bases into the nucleic acid to be detected.
  • sequences to be detected which have labeled markers are produced by labeled bases or labeled primers during the PCR.
  • Labeled primers can be made by chemical synthesis e.g. using the phosphoramidite method by substituting bases of the primer with labeled phosphoramidite bases during the primer synthesis.
  • primes can be prepared with modified bases to which labels are chemically bound after the primer synthesis.
  • ribosomal RNA species can hybridize specifically with a DNA probe and can be detected as an RNA / DNA hybrid with an RNA / DNA-specific antibody.
  • T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme Another possibility is the introduction of labels using the T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme.
  • the introduction of radioactive or fluorescent labels (Sambrook et. Al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).
  • Markers can be introduced into one or both ends of the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be detected. Markers can also be introduced within the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be detected. Several markings can be introduced into a nucleic acid to be detected.
  • At least one of the probes has a marking.
  • the composition containing the amplification product or a part thereof is then immobilized on a solid phase and brought into contact with a composition which contains at least one probe.
  • several solid phases can be provided on which the amplification product or the sample containing the nucleic acid to be detected is immobilized.
  • the present invention furthermore relates to a device for the detection of clinically relevant bacteria comprising a solid phase on which one or more sequence- and / or species-specific nucleic acid probes are immobilized, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-176 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 19-54 and 174-176 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or one of these Contains sequences or the complementary sequence. If several oligonucleotides are immobilized, they are spatially separated from one another on the solid phase.
  • the solid phase is preferably designed as a DNA chip.
  • the solid phase is a self-amplifying DNA chip that has at least two or more oligonucleotides immobilized at its 5 'ends in each application unit (“spot”). These act as amplification primers.
  • the specificity of these immobilized primers is special due to their structure biologically defined in the region of the 3 'region.
  • This DNA chip is therefore not a hybridization chip, but a nucleic acid amplification chip.
  • This is analogous to multiplex amplification, which contains more than two primers in one approach and thus delivers more than one amplification product
  • the amplification reaction taking place in the reaction vessel is severely limited in its multiplexing ability. 30 to 60 amplification products in one reaction currently represent a technical maximum.
  • the multiplexing ability of the nucleic acid amplification chip is only limited by the chip area n some 10,000 spots per cm 2 are applied here. This results in the possibility of using primers in a reaction complementary to any positions of a complete genome as the target molecule.
  • the present invention thus relates to a DNA chip which has immobilized amplification primers.
  • Preferred amplification primers are selected from SEQ ID No. 1-176 or complementary to these sequences, or a fragment thereof or complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence, SEQ ID No .: 55-170 are particularly preferred for this object of the invention.
  • the solid phase of the device according to the invention can be a chromatographic material. Since the analyte is mainly hydrophilic in nature, hydrophilic properties of the chromatographic material of the test strip are important for carrying out the method according to the invention.
  • the chromatographic material may include inorganic powders such as silicate materials, magnesium sulfate and aluminum, may further comprise synthetic or modified naturally occurring polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose, polyvinyl chloride or acetate, polyacrylamide, nylon, cross-linked dextran, agarose, polyacrylate, etc. may further include coated materials such as ceramic materials and glass. Most preferred is the use of nitrocellulose as the chromatographic material.
  • the introduction of positively charged ion groups in eg nitrocellulose or nylon membranes can improve the hydrophilic properties of the chromatographic material.
  • the chromatographic material can be mounted in a housing or the like.
  • This housing is usually water-insoluble, rigid and can consist of a variety of organic and inorganic materials. It is important that the housing does not interfere with the capillary properties of the chromatographic material, that the housing does not bind test components non-specifically, and that the housing does not interfere with the detection system.
  • a coated glass carrier is preferably used as the solid phase for the self-amplifying chip.
  • Such glass supports are known to the person skilled in the art.
  • the device according to the invention is preferred if the sequence- and / or species-specific nucleic acid probes are bound to the solid phase of the device via a linker.
  • the linker acts as a spacer between the probe and the membrane. In the present case, these are mostly polymers which extend the part of the probe which is complementary to the target sequence at the 5 'or 3' end, but are not themselves coding. These can be base sequences of a non-coding nucleic acid structure or other polymer units such as polyether, polyester etc.
  • the linker must be such that it does not affect the hybridization properties of the probe or only weakly. This can be avoided by the fact that there are no self-complementary structures. The chemical prerequisites for the irreversible coupling of the probe to the carrier material must also be met.
  • Probe oligonucleotides can, for example, be bound to the membrane surface via proteins.
  • the proteins loaded with the probe can then be bound to the porous membrane by standard methods. Standard methods are, for example, coupling via homobifunctional coupling reagents or heterobifunctional coupling reagents.
  • the reactive groups are the same. Typically these are amines and / or thiols. Thiols can be synthetically coupled directly to oligonucleotides and react under oxidative conditions with cysteine residues to form disulfide bridges.
  • amines as homobifunctional coupling reagents can be directly synthetically coupled to oligonucleotides and bound to the surface or the protein via imido esters or succinimide esters. With heterobi-functional coupling reagents, the reactive groups are different and allow the coupling of different functional groups. The formation of amino-thiol couplings is preferred.
  • Thiolated oligonucleotides can be coupled with a heterobifunctional coupling reagent which contains both a succimmide ester maleimide or iodoacetimide.
  • Another important coupling agent are the carbodiimides, which couple carbonyl residues to amines. The most important representative here is 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC).
  • EDAC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • amino modified oligonucleotides can be coupled to membranes with carbonyl residues. With this chemistry, the coupling reagent is not incorporated into the compound.
  • the hybridization of the probes can also be carried out “in solution” as a homogeneous method.
  • the probes can be modified such that they are labeled with dyes (eg rhodamines, fluoresces and their derivatives) in combination with light-suppressing (“quenchers”) molecules are distinguishable in their hybridized and free states.
  • dyes eg rhodamines, fluoresces and their derivatives
  • quenchers light-suppressing
  • a nucleic acid is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof, or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
  • the present invention furthermore relates to a composition or a kit for the detection of clinically relevant bacteria containing one or more of the nucleic acids according to the invention.
  • the subject of the present invention is a kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which is one or more fragments from the genome of a clinically relevant bacterium or complementary thereto, containing one or more of the nucleic acids according to the invention.
  • the kit contains all necessary for the amplification of the target sequence
  • Components such as primers, buffer systems and enzymes and the immobilized probes for the detection and specification of the amplificate with the necessary buffer systems.
  • kits for the amplification of a nucleic acid to be detected which is a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or complementary to it, containing one or more nucleic acids selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-18, 171 - 173 and 55-170 or complementary to these sequences, or a fragment thereof, or complementary to this fragment or containing one of these sequences or the complementary sequence.
  • the invention also relates to the use of the device according to the invention for the detection of clinically relevant bacteria.
  • the invention further relates to the use of the nucleic acid according to the invention or the kit according to the invention for the detection of clinically relevant bacteria.
  • the nucleic acid to be detected can be in any composition that is suspected of containing bacteria, in particular clinically relevant bacteria. It can be primary material such as secretions, sulcus fluid, smears and blood etc. Or Cultures of microorganisms that have already been grown in liquid or solid media.
  • HIN Haemophilus influencae
  • PMI Proteus mirabilis
  • Seq ID No. 20 Serratia marcescens (SMA) Seq ID No. 21, Escherichia coli (ECO) Seq ID No. 22, Pseudomonas pudica (PPU) Seq ID No. 24, Pseudomonas fluorescens (PFL) Seq ID No. 25, Acinoetobacter baumanii (ABA) Seq ID No. 26, Klebsieila oxytoca (KOX) Seq ID No. 27, Klebsieila pneumoniae (KPN) Seq ID No. 28, Enterobacter aerogenes
  • EAE Seq ID No. 29
  • Pseudomonas aerogenosa Seq ID No. 30
  • PVU Proteus vulgaris
  • BCE Burgholderia cepacia
  • Seq ID No. 34 Staphylococcus capitis (SCA) Seq ID No. 35, Enterococcus faecalis (EFA) Seq ID No. 36, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 37, Staphylococcal Group F (SGF) Seq ID No. 38, Enterococcus faecium (EFC) Seq ID No. 39, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 40, Streptococcus pyogenes (SPY) Seq ID No. 41, Streptococcus sciuni (SCI) Seq ID No. 42
  • Streptococcus oralis Seq ID No. 43, Staphylococcus saprophyticus (PVU) Seq ID No. 44, Staphylococcus cohaii (SCO) Seq ID No. 45, Staphylococcus lugdunensis / haemolyticus / hominis (SLHH) Seq ID No. 46, Staphylococcus warneri (SWA) Seq ID No. 47, Staphylococcus epidermidis (SEP) Seq ID No. 48, Staphylococcus lyticans (SLY) Seq ID No. 49, Staphylococcus grinding (SOR) Seq ID No. 50;
  • Positive band strip 1 hybridizes with amplified DNA from Staphylococcus aureus: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 33
  • Positive band strip 2 hybridizes with amplified DNA from Staphylococcus epidermidis: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 48
  • Positive band strips 3 hybridized with amplified Enterococcus faecium DNA biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 39
  • Positive band strips 5 hybridized with amplified Enterococcus faecalis DNA biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 36
  • Positive band strip 6 hybridizes with amplified DNA from Streptococcus pyogenes: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 41
  • Positive band strip 7 hybridizes with amplified DNA from Enterococcus gallinarum: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 34
  • Positive band strips 8 hybridized with amplified Enterococcus casseliflavus DNA biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 56
  • Positive band strips 9 hybridize with amplified Enterococcus durans DNA: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 40
  • Positive band strips 10 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus saprophyticus biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 44
  • Positive band strip 11 hybridizes with amplified DNA from Staphylococcus cohnii: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 45
  • Positive band strip 12 hybridizes with amplified DNA from Staphylococcus warneri: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 47
  • Positive band strips 13 hybridize with amplified DNA from Staphylococcus lyticans: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 49
  • Positive band strips 14 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus loops: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 50
  • Positive band strips 15 hybridize with amplified DNA from Enterococcus casseliflavus: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 56, SEQ ID No .: 54 positive band strips 16 hybridize with amplified DNA from Enterococcus faecalis: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 36, SEQ ID No .: 51 Positive band strips 17 hybridized with amplified Enterococcus gallinarum DNA: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 34, SEQ ID No .: 53 positive bands strip 18 hybridized with amplified Enterococcus faecium DNA: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 39, SEQ ID No .: 52
  • FIG. 4 Analysis example of a self-amplifying chip.
  • the glass carrier was coated with the following prime pairs:
  • the corresponding bacteria can be identified and differentiated either from primary material (e.g. smears, blood, etc.) or from bacterial liquid or solid media.
  • Bacterial nucleic acid was obtained either from solid nutrient media, liquid media or from primary material after appropriate pretreatment.
  • bacterial material was removed from solid media with a sterile inoculation loop and suspended in 300 ⁇ l lOmM Tris / HCl pH 7.5. 1 ml was removed from liquid cultures, centrifuged for 5 min at 13,000 ⁇ m in a table centrifuge, the supernatant was discarded and resuspended in 300 ⁇ l lOmM Tris / HCl pH 7.5. The bacterial suspension was incubated for 15 minutes at 95 ° C.
  • thermomixer Eppendorf, Hamburg, Germany
  • sonicated for 15 minutes in an ultrasonic bath Bandelin, Berlin,
  • centrifuged for 10 minutes at 13,000 ⁇ m in a table centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany
  • 5 ⁇ l of the supernatant were used in the amplification reaction.
  • the PCR approach contained 1 x Taq buffer (Qiagen, Hilden, Germany), each 1 ⁇ M primer, 200 ⁇ M dNTP (Röche, Mannheim, Germany) and 1U Hotstar Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany).
  • the PCR amplification was carried out on a PE 9600 thermocycler (ABI, Rothstadt, Germany) at 15 minutes at 95 ° C., 30 cycles at 20 seconds at 95 ° C. and 30 seconds at 60 ° C. Detection of the amplificates by probe hybridization:
  • probes were biotinylated at the 5 'end in order to be able to detect target sequence / probe hybrids via reporter enzymes coupled to steptavidin. Oligonucleotides with the sequences Table 1 SEQ ID NO 19-22, 24-50 are used as probes.
  • Absorbent paper (blotting paper GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and a nylon membrane (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) were cut to the size of the blot apparatus (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and cut with 10 x SSC soaked. 250 ⁇ l of denaturing solution (50 mM NaOH; 1.5 M NaCl) were placed in the openings of the assembled apparatus and 20 ⁇ l of amplificate were pipetted in. After applying a vacuum, it was waited until all the liquid had been sucked through completely. It was then rinsed with 10 ⁇ SSC buffer. After it had dried completely, the membrane was fixed in a UV crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) at 1200 joules / cm 2 and washed with distilled water and dried.
  • UV crosslinker UV crosslinker
  • the hybrids were autoradiographically detected by a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate by adding NBT / BCIP or by spraying on chemiluminescent substrate (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon, England). Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate was added and incubated at 37 ° C for 30 min. The membrane was then washed twice with substrate buffer for 15 min. The membrane was then removed, Lumi-Phos reagent was sprayed on, followed by 2 h exposure to an X-ray film. Alternatively, substrate buffer with NBT / BCIP was added and the color development awaited. Solutions used:
  • 10 x SSC solution (standard saline citrate): 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate;
  • TMCL tetramethylammonium chloride
  • NBT 75 mg / ml nitroblue tetrazolium salt in 70% dimethylformamide
  • the autoradiograms were evaluated densitometrically.
  • the amplificate dot of the species from which the probe sequence was derived was used as the 100% value.
  • a sample that was added to water instead of nucleic acid solution and a sample with 100 ng of isolated human DNA were always carried as dots on the membrane.
  • the results of Example 1 are shown in Figures 1 and 2.
  • The% values of the densitometric evaluation are given.
  • the value of the probe homologous to the species was set to 100%.
  • Blot apparatus cut and impregnated with 10 x SSC 250 ⁇ l of a 1 ⁇ M probe solution, as described in FIG. 3, were placed in the openings of the assembled apparatus in 10 ⁇ SSC in slot-like openings in the blot apparatus. After applying a vacuum, it was waited until all the liquid had been sucked through completely. It was then rinsed with 10 ⁇ SSC buffer. After it had dried completely, the membrane was fixed in a UV crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) at 1200 joules / cm 2 and washed with distilled water, dried and cut into strips about 4 mm wide.
  • UV crosslinker UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA
  • the hybrids were colorimetrically detected by a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate with the addition of NBT / BCIP. Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate was added and incubated at 37 ° C for 30 min. The membrane was then washed twice with substrate buffer for 15 min. The membrane was incubated in substrate buffer with NBT / BCIP 10min and color development stopped by washing with H 2 Obide st (See Fig. 3).
  • Example 3 Self-amplifying chip
  • the species-specific amino-modified ohgonucleotide pairs (Interactiva, Ulm, Germany) are diluted in Na-phosphate buffer 20 ⁇ M and pipetted into a plate with 384 wells.
  • the ohgonucleotide pairs are applied with a volume of lnl in round fields ("spots") with a diameter of 200 ⁇ m each side by side on the glass support (75 x 25 mm).
  • spots lnl in round fields
  • the pair of ohgonucleotides are always immobilized in duplicate side by side (duplicate spots).
  • the amino-modified oligonucleotide pairs (Interactiva, Ulm, Germany) are immobilized on the surface-modified glass supports in all cases by “contact-p ⁇ ' ⁇ t g” with the help of the OMNI-GRJD (GeneMachines, San Carlos, USA) spotters.
  • the species-specific oligonucleotides are removed from the wells of the microtitre plate by a robot arm provided with a series of precision tips and placed on precisely defined positions on the glass slides.
  • the "Motorola Activated slides" chip blanks (Motorola, Schaumburg, Illinois USA) have reactive groups on their surface that can covalently bind amino-modified oligonucleotides to the surface (no further information from the manufacturer).
  • the spotted glass slides are incubated overnight in a humid chamber with saturated sodium chloride solution at room temperature.
  • the glass supports 15 Incubated for minutes at 50 ° C in blocking reagent and washed 2 x 5 minutes at room temperature in deionized water. This is followed by a 15 minute incubation at 50 ° C in the Motorola washing buffer and again the glass slides are washed in deionized water for 2 minutes at room temperature.
  • the glass slides are dried by centrifugation at 10000 m for 5 minutes.
  • the glass slides are removed from the thermal cycler and the cover slip is carefully removed.
  • the glass slides are washed for 15 minutes at 68 ° C. in wash buffer 1, 5 minutes at room temperature in wash buffer 2 and 5 minutes at room temperature in wash buffer 3. They are then dried using compressed air.
  • the glass slides are then scanned with the aid of a confocal laser scanner (Scan Array 4000, DSS Imagetech, New Delhi, India) and the result is the visual representation of the fluorescence signal on the glass slide.
  • a confocal laser scanner Scan Array 4000, DSS Imagetech, New Delhi, India.
  • the more intense the fluorescence signal on the glass substrate the whiter the respective spot appears and, conversely, the weaker the signal, the blacker the respective spot appears.
  • the colors red-green-blue appear on the intensity scale between the white and black spots.
  • the fluorescence signals were integrated into numerical values using the ImaGene software (ImaGene Standard edition; Biodiscovery, Marina del Ray, USA) (see Figure 4).
  • the primers SEQ ID No. 55-170 are designed as species-specific amplification primers for the self-amplifying chip.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren, sowie gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.

Description

Verfahren zum Nachweis und zur Differenzierung von Bakterien
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien, die in klinisch relevanten Proben vorkommen. Bevorzugt können die hier beschriebenen Nukleinsäuren zur Identifizierung von Bakterien in Kulturen insbesondere in Blutkulturen benützt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren, sowie gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.
Der Nachweis von Bakterien und ihre genaue Identifizierung spielen eine sehr wichtige Rolle in der medizinischen Mikrobiologie, damit eine entsprechende adäquate Behandlung eingeleitet werden kann. Die Anzucht der Bakterien in flüssigen oder festen Medien ist eine sensitive Standardmethode zum Nachweis von Bakterien in der humanen Primärprobe. Die Differenzierung erfolgt meist durch Mikroskopie kultureller oder primärer Präparate, nach der Morphologie auf Oberflächen kultivierter Kolonien, durch Wachstumstests bei verschiedenen Bedingungen und durch katabolische Eigenschaften, wie z.B. die Nerstoffwechslung von Zucker, die Bildung von Säuren u.a. durch die dazu notwendige Anlage von Sekundär- und/oder Tertiärkulturen kann bis zur Befundstellung mehrere Tage vergehen.
Werden Flüssigkulturen eingesetzt, ist eine erste Analyse aufgrund der Koloniemorphologie nicht möglich. Hier müssen immer Sekundärkulturen und mikroskopische Präparate angelegt werden. Besonders wichtig ist hier die Diagnostik bakterieller Infektionen des Blutes. In diesem Fall werden einige Milliliter Blut in ein Νährmedium injiziert und dieses bebrühtet. Bei positivem Wachstum erfolgt die Differenzierung des Keims und eine Prüfung die Empfindlichkeit gegenüber antibakterieller Substanzen. Ungefähr acht bakterielle Spezies finden sich in ca. 65°/o aller Blutkulturisolaten. Typischerweise sind dies Escherichia coli (ca.20%), Staphylococcus aureus (ca.20%), Pseudomonas aerogenosa (ca.7%), Enterococcus spp.(ca.4%), Proteus spp. und Pneumokokken (ca.3%). Zusätzlich werden Koagulase negative Staphylokokken häufig von Patienten mit intravaskulären Implantaten isoliert die aber klinisch unauffällig sind. Die verbleibenden 35% der Blutkulturisolate erstreckt sich auf über 50 verschiedene Spezies.
In den letzten Jahren sind wichtige Erfindungen gemacht worden, um mit sehr speziesspezifischen Primern in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion Organismen nachzuweisen. Die Detektion erfolgt dabei meist über Gelelektrophorese oder analog der ELISA-Technik über immobilisierte Sonden in Mikrotiterplatten. Allerdings eignen sich diese Methoden nicht, wenn es darum geht aus vielen möglichen pathogenen Organismen einen oder mehrere nachzuweisen.
Gerade bei der Diagnostik aus Blutkulturen ist eine schnelle Diagnostik von großer Bedeutung. Revolutionierend sind hier nukleinsäurebasierende Nerfahren, die sich durch hohe Spezifität und Sensitivität auszeichnen. Bisher gibt es kommerziell Sondentests, die durch eine spezifische Hybridisierung an das bakterielle Genom die Spezies identifizieren können. Dies sind aber Einzelsondenteste, die entweder nach ersten Differenzierungshinweisen oder nach Häufigkeitswahrscheinlichkeiten ausgewählt werden müssen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung hoch spezifischer und hoch sensitiver Nerfahren zum Nachweis klinisch wichtiger Bakterien, die Entwicklung von Primern zur Durchführung eines Amplifikationsverfahren bakterieller Genomfragmente und/oder deren Transkripte und die Entwicklung eines viele Sonden tragenden Detektionssystems. Bevorzugt laufen diese Tests im Multiplexverfahren.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Nerfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist, an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist, eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält oder eine Variante davon ist.
Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyrimidinbase. Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin-/Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel- beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.
Erfindungsgemäß ist insbesondere bevorzugt, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19-54 und 174 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden abweichen, aber dennoch erfindungsgemäß verwendbar sind. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1- 176 beziehungsweise 19-54 und 174 - 176 am 5 '-und/oder 3 '-Ende der Verkürzungen um ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen.
Eine Nukleinsäuresonde, die einer der SEQ ID No.:l-176 oder eine dazu komplementär Sequenz enthält umfaßt vorzugsweise Nukleinsäuresonden die am 5 '-und oder 3 '-Ende 1- 50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 zusätzliche Nukleotide enthält, wobei diese 5'- und/oder 3 '-flankierenden Sequenzen bevorzugt eine Homologie zu den jeweiligen natürlichen 5'- und/oder 3 '-flankierenden Sequenzen der SEQ ID No.: 1-176, bevorzugter 19-54 und 174-176 von mindestens etwa 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 99% oder 100% aufweisen. Die flankierenden Sequenzen werden vorzugsweise so gewählt, daß sie die Hybridisierung der Nukleinsäuresonde nicht wesentlich verschlechtern. Vorzugsweise wird die Spezifität durch die zusätzlichen flankierenden Nukleotide j edoch erhöht.
Eine Variante der SEQ ID No.: 1-176, vorzugsweise der SEQ ID No.: 19-54 und 174-176 die erfindungsgemäß verwendet werden kann ist eine Nukleinsäuresonde in der 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10 Nukleotide im Vergleich zu der durch die SEQ ID No. 1-176 bestimmten Sequenz verändert worden sind. Vorzugsweise sind nicht mehr als 1 bis 4, 1 bis 3, 1 bis 2 und am meisten bevorzugt nur ein Nukleotid verändert. Eine solche Nukleotidveränderung ist bevorzugt, wenn die Spezifität der Sonde dadurch nicht wesentlich verändert wird und/oder der Schmelzpunkt der Sonde dadurch nicht wesentlich verändert wird. Die Spezifität einer so veränderten Sonde läßt sich vom Fachmann ohne weiteres durch Routineexperimente übeφrüfen. Eine Variante im Sinne der Erfindung liegt dann vor, wenn die Sonde im Hinblick auf die jeweilige zu detektierende. Nukleinsäure mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% oder mehr als 100% der Spezifität der unveränderten Nukleinsäuresonde gemäß SEQ ID No.: 1-176 aufweist. Die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde kann durch die G ( =4°C) + C ( =2°C) Regel ermittelt werden und sollte nicht wesentlich von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweichen. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit einer, vorzugsweise mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neuen, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn oder mehr verschiedenen Sonden hybridisiert.
Prinzipiell ist es möglich, durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde, vorzugsweise zwei oder drei, zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.
Ein bevorzugtes Verfahren für die Differenzierung klinisch relevanter Bakterien ist daher ein Multiplexverfahren, bei dem die für die Differenzierung notwendigen bakteriellen Genomabschnitte in einer gemeinsamen Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion angereichert und hybridisiert werden. Für diese Anwendung ist die Amplifikation verschiedener Genfragmente notwendig. Die Sonde und Primer zur Detektion der bakteriellen Spezies sind komplementär zu 23 S ribosomalen RNS-Gen und/oder zu dem Elongationsfaktor TU, die Sonden und Primer zur Unterscheidung der Antibiotikaresistenzen haben als Zielsequenz die entsprechenden genomisch kodierten Resistenzgene. Da die zur Differenzierung notwendigen Polymorphismen auf dem Genom viele 1000 Basen umfassen ist zudem eine Aufsplittung in kleinere Fragmente für eine effektive Amplifikation wichtig. Die Vielzahl von Primern, die alle miteinander agieren können, erfordert ein sorgfältiges Design.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist das Multiplexamplifikationsverfahren. Bei einem Multiplexamplifikationsverfahren werden mindestens zwei verschiede
Nuklemsäurefragmente gleichzeitig amplifiziert. Vorzugsweise werden gleichzeitig 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder mehr verschiedene Nukleinsäuresequenzen amplifiziert. Dabei werden in der Regel eine jeweils doppelt so große Anzahl von Primern eingesetzt, d.h. mindestens 4, 6, 8, 10, 12, 14 ,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und mehr Primer. Es ist jedoch auch möglich zwei verschiedene Nuklemsäurefragmente mit lediglich drei verschiedenen Primern zu amplifizieren. Bevorzugt wird an das Multiplexamplifikationsverfahren unmittelbar oder nach weiteren Zwischenschritten wie bspw. Reinigungsschritten, ein multigeplextes Hybridisierungsverfahren, vorzugsweise ein reverses Hybridisierungsverfahren angeschlossen. Bei einem erfindungsgemäßen Hybridisierungsverfahren werden vorzugsweise gleichzeitig 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder mehr verschiedene Nukleinsäuren nachgewiesen, so daß eine erfindungsgemäße Hybridisierungsmatrix über eine entsprechende Anzahl verschiedener immoblisierter Sonden verfügt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist ein Multiplexverfahren mit einem selbstamplifizierenden Chip. Beim Hybridisierungsverfahren müssen Sonden mit unterschiedlicher Primärstruktur unter gleichen Bedingungen hybridisieren, wobei die Spezifität ausreichend zur Erkennung von Einzelbasenaustaschen sein sollte. Deshalb sind bei der Stringenzwaschung Salze wie Betain oder Tetramethylammomumchloid als Modulatoren der Wasserstoffbrückenbindungen bevorzugt.
Für den selbstamplifizierenden Chip sind Eigenschaften der Polymerase (z.B. „Hot Start"- Eigenschaften, das Design der Amplifikationsprimer und die Pufferzusammensetzung wichtig. Bevorzugte Polymerasen sind thermostabile "Hotstart-Polymerasen für den selbstamplifizierenden Chip: Bevorzugte Puffer sind PCR-Puffer, die modulierende Chemikalien wie Glycerin enthalten. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind ausgewählt aus SEQ ID No. 1-176, beziehungsweise komplementär dazu, beziehungsweise davon ein Fragment oder enthalten eine dieser Sequenzen, insbesondere bevorzugt sind SEQ ID No.: 55-170. Auch hier sind zusätzlich Salze wie Betain oder Tetramethylammomumchloid bevorzugt, aber auch stabilisierende Proteine wie BSA.
Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Die Hybridisierung kann zwischen komplementären Nuklemsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleine Fehlpaarungsbereiche aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäuren-Duplexes wird durch die Schmelztemperatur Tm gemessen. Die Schmelztemperatur Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.
Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt ( z.B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
Die Durchfuhrung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist für das erfindungsgemäße Verfahren besonders wichtig. Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zulässt. Dies kann durch folgende Maßnahmen erzielt werden:
Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.
Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflusst. Die Ionenstärke liegt bevorzugt zwischen etwa 100-500 mM, bevorzugter zwischen etwa 150-350 mM, noch bevorzugter zwischen 200-300 mM und am meisten bevorzugt bei etwa 250 mM.
Weiterhin kann durch Hinzufügen einer der oben erwähnten mild denaturierenden Substanzen (DMSO, Formamid, Harnstoff) zum Laufpuffer die Stringenz verändert werden. Dies ermöglicht insbesondere eine im Hinblick auf die jeweilig verwendeten Sonden individuell Einstellung und Optimierung der Hybridiseirungsbedingungen. Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt. Alle der oben genannten Maßnahmen sind letztlich Maßnahmen, die Einfluß auf die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen haben.
Die Durchführung eines Hybridisierungsverfahrens ist dem Fachmann an sich bekannt. So werden üblicherweise die festen Phasen nach Inkubation mit der Lösung, die den Hybridisierungspartner enthalten kann, stringenten Bedingungen ausgesetzt, um unspezifisch gebundene Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Der Begriff „feste Phase" oder Hybridisierungsmatrix umfaßt jedes beliebige Material, daß dazu in der Lage ist kovalente oder nicht-kovalente Bindungen zu Nukleinsäuresonden auszubilden wie bspw. Glas, SiO2, Kunststoffe, wie Nylon und Filtermaterialien wie Nitrocellulose. Gegebenfalls können die Materialen auch chemisch funktionalisiert sein, um eine Bindung zu Nukleinsäuresonden auszubilden. Die Form, insbesondere die Oberflächenform ist dabei in keiner Weise beschränkt und umfaßt glatte und strukturierte Oberflächen. Die Hybridisierung wird bevorzugt auf einer Nylon- oder Nitrocellulosemembran durchgeführt, wie bspw. in (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschrieben. Die darin genannten Prinzipien lassen sich vom Fachmann auf weitere Ausführungsformen übertragen.
Auch die Länge der Zielnukleinsäure spielt eine wichtige Rolle für die Sensitivität der Hybridisierung. Bevorzugt sind Nukleinsäurenstränge mit einer Länge von 30 - 500 Basenpaaren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Doppelstrang-Zielnukleinsäure vor der Hybridisierung denaturiert. Dies geschieht in der Regel durch basische Chemikalien oder Erwärmung, wobei die für die Doppelstrangstruktur verantwortlichen Wasserstoffbrückenbindungen aufgeschmolzen werden. Eine bevorzugte basische Chemikalie ist NaOH in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 0,5 M. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von etwa 0,25 M NaOH. Durch Erhitzen einer wässrigen Nukleinsäurelösung auf mindestens 95 °C und anschließendes rasches Abkühlen auf 4°C können ebenfalls Einzelstrangstrukturen erreicht werden. Einzelstrangamplifikate z. B. als Produkte der NASBA-Reaktion sollten vor der Hybridisierung ebenfalls denaturiert werden, um intramolekulare Strukturen aufzulösen. Die kann wegen der Empfindlichkeit der RNS gegenüber hohen pH-Werten bevorzugt durch mild denaturierende Chemikalien wie z.B. DMSO oder Formamid erfolgen.
Als Hybridisierungspuffer werden in der Regel wässrige Puffer mit einem Salzgehalt zwischen 0,1 und 0,5 M, und einem pH- Wert von 7,5 - 8,0 verwendet. Für eine gute Benetzung der sondentragenden Phase werden Detergenzien verwendet. Bevorzugt ist Natriumlaurylsultat (SDS) in einer Konzentration von 0,1 - 7%. In der besonders bevorzugten hohen Konzentration von 7% verbessert SDS das Signal- /Hintergrundverhältnisse, in dem unspezifische Bindungen bspw. eines an die nachzuweisende Nukleinsäure gekoppelten Enzymkomplexes unterdrückt werden. Die gewünschte Stringenz der Hybridisierung wird neben der Struktur von Zielsequenz und Sonde durch die Zusammensetzung von Hybridisierungs- und Stringenzwaschpuffer bestimmt. Bevorzugt wird nach erfolgter Hybridisierung mit einem Stringenzwaschpuffer inkubiert. Dieser destabilisiert durch eine geringere Ionenstärke den Doppelstrang. So werden nicht 100% komplementäre Hybride wieder getrennt. Durch Zusätze von Chemikalien (z.B. Tetramethylammoniumchlorid), welche die
Wasserstoffbrückenbindungen des Hybrids beeinflussen, lassen sich die Bindungsstärke von G/C und A/T Paarungen angleichen, was bei Multiplexsondensysteme vorteilhaft sein kann.
Erfindungsgemäß wird nach der Hybridisierung das Ausmaß der Hybridisierung bestimmt. Das erfolgt üblicherweise dadurch, dass die Menge der Markierung bestimmt wird, die an eine feste Phase gebunden ist. Derartige Nachweisreaktionen und Detektionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifϊkationsprimern durchgeführt wird. Insbesondere ist bevorzugt, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-173, insbesondere SEQ ID No. 1-18 und 171 - 173, beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Am meisten bevorzugt ist, dass wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18 und 55-170 und 171 - 173 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Die Amplifikationsprimer sollten so ausgewählt sein, daß das Amplifikationsprodukt gute sterische Verhältnisse in Kombination mit der immobilisierten Sonde aufweist. Pallindromstrukturen, die zu intramolekularen Faltungen fuhren, können durch geeignete Primerauswahl vermieden werden. Im Falle der Markierung mit Hapten ist die räumliche Anordnung des Haptens (z.B. Biotin) im Hybrid Sonde/Zielnukleinsäure wichtig. Das Hapten sollte für den Antikörper-Enzymkomplex gut zugänglich sein.
Eine Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist. In einer anderen Form des Verfahrens sind die Nukleinsäuresonden markiert. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zum Nachweis klinisch assoziierter Bakterien,
- bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgeführt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt,
- und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Diese Ausfuhrungsform der Erfindung wird im folgenden kurz Amplifikationsverfahren genannt. Der Begriff Amplifikationsverfahren schließt alle bevorzugten Ausführungsformen ein.
Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Primer entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Primern abweichen, aber dennoch erfindungsgemäß verwendbar sind. So sind auch Primer denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Primern mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-18 beziehungsweise 55-170 und 170-173 am 5'-und/oder 3'-Ende der Verkürzungen um ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen.
Ein Nukleinsäuresprimer, der eine der SEQ ID No.: 1-176, bevorzugter der SEQ ID No. 1- 18, 55-170 und 170-173, oder eine dazu komplementär Sequenz enthält umfaßt, vorzugsweise Nukleinsäuresprimer der am 5 '-und/oder 3 '-Ende 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1- 30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 zusätzliche Nukleotide enthält, wobei diese 5'- und/oder 3'- flankierenden Sequenzen bevorzugt eine Homologie zu den jeweiligen natürlichen 5'- und/oder 3 '-flankierenden Sequenzen der SEQ ID No.: 1-176, bevorzugter der SEQ ID No. 1-18, 55-170 und 170-173 von mindestens etwa 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% oder 100% aufweisen. Die flankierenden Sequenzen werden vorzugsweise so gewählt, daß sie die Hybridisierung des Nukleinsäuresprimers nicht wesentlich verschlechtern. Vorzugsweise wird die Spezifität durch die zusätzlichen flankierenden Nukleotide jedoch erhöht.
Eine Variante der SEQ ID No.: 1-176, vorzugsweise der SEQ ID No.: 19-54 und 174-176 die erfindungsgemäß verwendet werden kann ist eine Nukleinsäuresonde in der 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10 Nukleotide im Vergleich zu der durch die SEQ ID No. 1-176 bestimmten Sequenz verändert worden sind. Vorzugsweise sind nicht mehr als 1 bis 4, 1 bis 3, 1 bis 2 und am meisten bevorzugt nur ein Nukleotid verändert. Eine solche Nukleotidveränderung ist bevorzugt, wenn die Spezifität der Sonde dadurch nicht wesentlich verändert wird und/oder der Schmelzpunkt der Sonde dadurch nicht wesentlich verändert wird. Die Spezifität einer so veränderten Sonde läßt sich vom Fachmann ohne weiteres durch Routineexperimente überprüfen. Eine Variante im Sinne der Erfindung liegt dann vor, wenn die Sonde im Hinblick auf die jeweilige zu detektierende Nukleinsäure mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% oder mehr als 100% der Spezifität der unveränderten Nukleinsäuresonde gemäß SEQ ID No.: 1-176 aufweist. Die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde kann durch die G ( =4°C) + C ( =2°C) Regel ermittelt werden und sollte nicht wesentlich von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweichen. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.
Am meisten bevorzugt ist das letztgenannte Verfahren, wenn mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Insbesondere bevorzugt ist, dass der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -18 und 171 - 173 und SEQ ID No.: 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist daß die Primer markiert sind.
Die folgenden Ausführungen gelten sowohl für das erfindungsgemäße Hybridisierungsverfahren als auch für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren als auch für das gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren. Gerade für die Identifizierung und Differenzierung von Bakterien ist dieser sogenannte „Multiplexansatz" von großem Nutzen.
Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind "nucleic acid strand-based amplification" (NASBA), "transcriptase mediated amplification" (TMA), "reverse transcriptase polymerase chain reaction" (RT-PCR), "Q-ß replicase amplification" (ß-Q-Replicase) und die "single Strand displacement amplification" (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.
In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird das Amplifikat z.B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstandenen Ethidiumbromid-gefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß entweder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybridisierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiteφlatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden. In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, Cyaninfarbstoffe usw. Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nukleinsäuresonden auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn oder mehr verschiedene Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf verschiedene Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn verschiedene Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein. Durch Inkubation des Amplifikationsprodukts beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon mit einer derart vorbereiteten festen Phase mit immobilisierten Sonden kann durch einen einzigen Hybridisierungsschritt eine Aussage über die Hybridisierung des Amplifikationsprodukts mit allen immobilisierten Sonden gewonnen werden. Die feste Phase ist daher bevorzugt ein Mikroarray von immobilisierten Sonden auf einer festen Phase. Derartige "DNA-Chips" erlauben es, daß auf einem kleinen Bereich eine hohe Anzahl verschiedener Oligonukleotide immobilisiert werden. Die festen Phasen, die für DNA-Chips geeignet sind, bestehen vorzugsweise aus silikatischen Materialien wie Glas usw. Die Markierung der Primer ist in dieser Aus-ührungsform vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung. Der DNA-Chip kann nach Inkubation mit dem Amplifikationsprodukt beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon durch eine Scanvorrichtung rasch analysiert werden. Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht über die Chip-Technologie gibt McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin Chem 47(3), 393-402.
In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die nachzuweisende Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen umfassen Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine, Rhodamin6ooR-phycoerythrin, Texas Red usw. Eine weitere Möglichkeit stellt eine radioaktive Markierung, wie z.B. 125I, 35S, 32P, 35P dar. Gleichermaßen möglich ist auch eine Partikelmarkierung wie z.B. mit Latex. Solche Partikel sind üblicherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.
Die Markierungen können kovalent oder nicht-kovalent und direkt oder indirekt mit den Oligonukleotiden verbunden und sind üblicherweise kovalent verknüpft. Eine direkte Verknüpfung liegt vor, wenn eine kovalente oder nicht-kovalente chemische Bindung zwischen Während eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Bindungspartner als beispielsweise Biotm/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Biotin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M. N. Bobrov, et al. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).
Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991 ; (3-4) : 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun;5(3):223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P.H. van Knippenberg (1998). Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antiköφer gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin ist üblich die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Stteptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z.B. Sulfhydryl-reaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin- reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.
Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt somit im wesentlichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (siehe auch US 6,037,127).
Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkoφoration von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkoφoriert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der PCR hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z.B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer-Synthese. Alternativ dazu können Primel hergestellt werden mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden.
Denkbar sind auch Verfahren ohne, dass die zu detektierende Nukleinsäure amplifiziert oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS- spezifischen Antiköφer als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.
Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleotide-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).
Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. In eine nachzuweisende Nukleinsäure können mehrere Markierungen eingebracht werden.
In einer anderen Ausfuhrungsform weist wenigstens eine der Sonden eine Markierung auf. Üblicherweise wird dann die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, auf einer festen Phasen immobilisiert und mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die wenigstens eine Sonde enthält. Auch in dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, eine Hybridisierung mit mehr als einer Sonde durchzuführen. Dazu können mehrere feste Phasen bereitgestellt werden, auf denen das Amplifikationsprodukt beziehungsweise die Probe enthaltend die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist. Es ist aber auch möglich, auf einer festen Phase an mehreren räumlich voneinander getrennten Bereichen kleine Mengen des Amplifikationsprodukts zu immobilisieren. Diese verschiedenen Spots werden dann mit jeweils verschiedenen Sonden in Kontakt gebracht (Hybridisierung).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Besonders bevorzugt ist diese Vorrichtung, wenn die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19 -54 und 174 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Wenn mehrere Oligonukleotide immobilisiert sind, sind diese auf der festen Phase räumlich voneinander getrennt. Vorzugsweise ist die feste Phase als DNA-Chip ausgebildet.
Bevorzugt ist als feste Phase ein selbstamplifizierender DNS-Chip, der in jeder Auftragseinheit („Spot") minderstens zwei oder mehr Oligonukleotide an ihren 5 '-Enden immobilisiert hat. Diese fungieren hier als Amplifikationsprimer. Die Spezifität diese immobilisierten Primer ist durch ihre Stniktur besonders im Bereich der 3 '-Region biologisch definiert. Damit ist dieser DNS-Chip kein Hybridisierungschip, sondern ein Nukleinsäureamplifikationschip. Dies ist analog einer Multiplex-Amplifikation, die in einem Ansatz mehr als zwei Primer enthält und damit mehr als ein Amplifikationsprodukt liefert. Eine solche im Reaktionsgefäß ablaufende Amplifikationsreaktion ist stark in ihrer Multiplexfähigkeit limitiert. 30- bis 60 Amplifikationsprodukte in einer Reaktion stellen zurzeit ein technisches Maximum dar. Im Unterschied zum Hybridisierungschip ist beim Nukleinsäureamplifikationschip die Multiplexfähikeit nur durch die Chipfläche begrenzt. Je nach verwendeter Spotgröße können hier einige 10.000 Spots pro cm2 aufgebracht werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit in einer Reaktion Primer komplementär zu beliebigen Positionen eines kompletten Genoms als Zielmolekül zu benützen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Chip, welcher immobilisierte Amplifikationsprimer aufweist. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind ausgewählt aus den SEQ ID No. 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment oder enthält eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz, besonders bevorzugt für diesen Gegenstand der Erfindung sind die SEQ ID No.: 55-170.
Die feste Phase der erfmdungsgemäßen Vorrichtung kann ein chromatographisches Material sein. Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat u.s.w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrocellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionengruppen in z.B. Nitrocellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.
Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigide und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, dass das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, dass das Gehäuse nicht Testkomponenten unspezifisch bindet, und dass das Gehäuse nicht mit dem Detektionssystem interferiert.
Bevorzugt wird als feste Phase für den selbstamplifizierenden Chip ein beschichteter Glasträger verwendet. Dem Fachmann sind solche Glasträger bekannt.
Die erfmdungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt, wenn die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären Teil der Sonde am 5'- oder 3 '-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder andere Polymereinheiten wie z.B. Polyether, Polyester u.a. Der Linker muss so beschaffen sein, dass er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflusst wird. Dies kann dadurch vermieden werden, dass keine selbstkomplementären Strukturen vorhanden sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten _mmobilisierungstechniken eine irreversible Bindung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u.a. sein. Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide können beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an die poröse Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifiinktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktionellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole. Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z.B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin-Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifiinktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktionellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem heterobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succimmidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagenz sind die Carbodiimide, die Carbonylreste an Amine koppeln. Wichtigster Vertreter ist hier das 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC). Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminomodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut.
Die Hybridisierung der Sonden kann auch „in Lösung" als homogenes Verfahren durchgeführt werden. Dazu können die Sonden so modifiziert werden, dass sie nach Markierung mit Farbstoffen (z.B. Rhodaminen, Floureszinen und ihren Derivaten) in Kombination mit lichtunterdrückenden („Quencher")-Molekülen in ihren hybridisierten und freien Zuständen unterscheidbar sind. Dies kann durch intramolekulare, selbsthybridisierende Strukturen der Sonde wie bei der „molcular beacon"-Technik oder durch den Einsatz von mindestens 2 Sonden wie bei „Light cycler" (Röche) oder dem „Smart cycler" (Cepheid) geschehen. Auch „Minisequencing"-Systeme wie „Pyrosequencing" (Pyrosequencing) sind für dafür geeignet. Grundsätzlich eigen sich aber auch Ansätze, die Hybride aufgrund ihrer geänderten Therodynamik oder Kinetik von einzelsträngigen Formen unterscheiden können. Gegenstand der vorliegenden Erfindung des weiteren ist eine Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Zusammensetzung beziehungsweise ein Kit zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein oder mehrere Fragmente aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Zusätzlich enthält der Kit alle für die Amplifikation der Zielsequenz notwendigen
Komponenten, wie Primer, Puffersysteme und Enzyme und die immobilisierten Sonden für Nachweis und Spezifizierung des Amplifikats mit den dazu notwendigen Puffersystemen.
Am meisten bevorzugt ist ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171 -173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beziehungsweise des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.
Die nachzuweisende Nukleinsäure kann sich in jeder Zusammensetzung befinden, die im Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, insbesondere klinisch relevante Bakterien. Es kann sich um Primärmaterial, z.B. Sekrete, Sulkusflüssigkeit, Abstriche und Blut usw. Oder um Kulturen von Mikroorganismen, die bereits in Flüssig- oder Festmedien angezogen wurden.
Abbildungsbeschreibungen:
Abbildung 1
.Densitometrisches Auswertungsbeispiel einer Dorblothybridisierung mit biotinilierten
Sonden.
Legende: Haemophilus influencae (HIN) Seq ID No. 19, Proteus mirabilis (PMI)
Seq ID No. 20, Serratia marcescens (SMA) Seq ID No. 21, Escherichia coli (ECO) Seq ID No. 22, Pseudomonas pudica (PPU) Seq ID No. 24, Pseudomonas fluorescens (PFL) Seq ID No. 25, Acinoetobacter baumanii (ABA) Seq ID No. 26, Klebsieila oxytoca (KOX) Seq ID No. 27, Klebsieila pneumoniae (KPN) Seq ID No. 28, Enterobacter aerogenes
(EAE) Seq ID No. 29, Pseudomonas aerogenosa (PAE) Seq ID No. 30, Proteus vulgaris (PVU) Seq ID No. 31, Burgholderia cepacia (BCE) Seq ID No 32.
Abbildung 2
Densitometrisches Auswertungsbeispiel einer Dorblothybridisierung mit biotinilierten Sonden.
Legende Staphylococcusaureus (SAU) Seq ID No. 33, Enterococcus gallinarum (EGA)
Seq ID No. 34, Staphylococcus capitis (SCA) Seq ID No. 35, Enterococcus faecalis (EFA) Seq ID No. 36, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 37, Staphylokokken Gruppe F (SGF) Seq ID No. 38, Enterococcus faecium (EFC) Seq ID No. 39, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 40, Streptococcus pyogenes (SPY) Seq ID No. 41, Streptococcus sciuni (SCI) Seq ID No. 42,
Streptococcus oralis (SOR) Seq ID No. 43, Staphylococcus saprophyticus (PVU) Seq ID No. 44, Staphylococcus cohaii (SCO) Seq ID No. 45, Staphylococcus lugdunensis/haemolyticus/hominis (SLHH) Seq ID No. 46, Staphylococcus warneri (SWA) Seq ID No. 47, Staphylococcus epidermidis (SEP) Seq ID No. 48, Staphylococcus lyticans (SLY) Seq ID No. 49, Staphylococcus schleifen (SOR) Seq ID No. 50;
Abbildung 3 Hybridisierungsbeispiel: Bakterielle DNS wurde mit den Primern SEQ ID No.: 5, 6, 9 - 16 und 19 - 21 amplifiziert
Positive Banden Streifen 1 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus aureus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 33 Positive Banden Streifen 2 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus epidermidis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 48
Positive Banden Streifen 3 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecium: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 39
Positive Banden Streifen 4 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Streptococcus oralis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 43
Positive Banden Streifen 5 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecalis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 36
Positive Banden Streifen 6 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Streptococcus pyogenes: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 41 Positive Banden Streifen 7 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus gallinarum: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 34
Positive Banden Streifen 8 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus casseliflavus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 56
Positive Banden Streifen 9 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus durans: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 40
Positive Banden Streifen 10 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus saprophyticus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 44
Positive Banden Streifen 11 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus cohnii: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 45 Positive Banden Streifen 12 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus warneri: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 47
Positive Banden Streifen 13 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus lyticans: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 49 Positive Banden Streifen 14 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus schleifen: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 50
Positive Banden Streifen 15 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus casseliflavus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 54 Positive Banden Streifen 16 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecalis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 51 Positive Banden Streifen 17 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus gallinarum: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 53 Positive Banden Streifen 18 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecium: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 39, SEQ ID No.: 52
Abbildung 4 Analysebeispiel eines selbstamplifizierender Chip Der Glasträger wurde mit folgenden Primeφaaren beschichtet:
Staphylococcus lyticans Seq ID No. 126/127, Staphylococcus aureus Seq ID No. 122/123, Enterococcus gallinarum Seq ID No. 120/121, Moraxella catarrhalis Seq ID No. 69/70, Escherichia coli Seq ID No.67/68, Salmonella typhimurium Seq ID No. 55/56, Enterobacter aerogenes Seq ID No. 63/64, Burgholderia cepacia Seq ID No. 100/101, Alcaligines faecalis Seq ID No. 102/103, Proteus vulgaris Seq ID No. 57/58, Stenotrophomonas maltophilia Seq ID No. 55/56. Pufferkontrolle: Primerauftragepuffer ohne Oligonukleotid;
Beispiele
Mit den hier beschriebenen Methoden können die entsprechenden Bakterien entweder aus Primärmaterial (z.B. Abstrichen, Blut u.a.) oder aus bakteriellen Flüssig- oder Festmedien identifiziert und differenziert werden.
DNA/RNA-Isolierung:
Bakterielle Nukleinsäure wurde entweder von Festnährmedien, Flüssigmedien oder aus Primärmaterial nach entsprechender Vorbehandlung gewonnen.
Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bakterielles Material entnommen und in 300μl lOmM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1ml entnommen, 5min bei 13.000φm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 300μl lOmM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Die bakterielle Suspension wurde 15min bei 95°C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert, 15min in einem Ultraschallbad (Bandelin, Berlin,) beschallt und 10min bei 13.000φm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5μl in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.
Beispiel 1 Dotblothybridisierung
Amplifikation:
Alle Primer und Sonden wurden kommerziell synthetisiert.(Interactiva, Ulm, Deutschland). Als Primer zur Amplifikation von Zielsequenzen der oben angegebenen Organismen wurden die Seq ID No. 1 - 6 verwendet.
Der PCR- Ansatz enthielt 1 x Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je lμM Primer, 200μM dNTP (Röche, Mannheim, Deutschland) und 1U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Deutschland) mit 15min 95°C, 30 Zyklen mit 20sek 95°C und 30sek 60°C durchgeführt. Detektion der Amplifikate durch Sondenhybridisierung:
Alle Sonden wurden am 5 '-Ende biotiniliert, um Zielsequenz/Sonden-Hybride über an Stteptavidin gekoppelte Reporterenzyme nachweisen zu können. Als Sonden werden Oligonukleotide mit den Sequenzen Tabelle 1 SEQ ID NO 19 - 22, 24 - 50 eingesetzt.
Saugfähiges Papier (Blotting Papier GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland), und eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der Blotapparatur (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) geschnitten und mit 10 x SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250μl Denaturierungslösung (50 mM NaOH; 1,5 M NaCl) vorgelegt und 20 μl Amplifikat zupipettiert. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 x SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm2 fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Alle Hybridisierungen wurden bei 45°C in einem Hybridisierungsofen (Hybaid Mini Oven Mkll, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) in Glasröhren durchgeführt. Die mit DNA/RNA-Amplifikat beschichtete Membran wurde in trockenem Zustand eingerollt und in eine Glasröhre gegeben. Anschließend wurde die Membran unter ständiger Rotation 5min mit vorgewärmten Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 2 pmol biotinilierter Sonde erfolgte für eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundene Sonde wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 45°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C weiterinkubiert. Die Hybride wurden durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat durch Zugabe von NBT/BCIP kolorimetrisch oder durch Aufsprühen von Chemielumineszenzsubstrat (Lumi- Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon, England) autoradiographisch detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde dann entnommen, Lumi-Phos-Reagens wurde aufgesprüht, gefolgt von 2h Exposition eines Röntgenfilms. Alternativ dazu wurde Substratpuffer mit NBT/BCIP zugegeben und die Farbentwicklung abgewartet. Verwendete Lösungen:
10 x SSC-Lösung (Standard-Saline-Citrat): 1 ,5M NaCl, 0, 15M Trinatriumcitrat;
Hybridisierungspuffer:
7% SDS (Na-dodecylsulfat), 0,25M Phosphatpuffer pH 7,5;
Stringentwaschlösung (Stringent-Puffer):
3M TMCL (Tetramethylammoniumchlorid), 50mM Tris/Cl, 2mM EDTA, 0,1% SDS;
Lösung zur Absättigung der Membranbindungsstellen:
5g/l Blockingreagenz (Röche) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (4,13g NaCl und 5,53g Maleinsäure in 500ml Wasser, pH mit 5M NaOH auf 7,5 eingestellt);
Substratpuffer:
274mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na3Citrat, 200mM NaCl, 27,4 mM MgCl2 * 6 H2O;
BCIP:
50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100% Dimethylformamid;
NBT: 75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid;
Die Autoradiogramme wurden densitometrisch ausgewertet. Als 100%-Wert wurde der Amplifikatdot der Spezies, aus der die Sondensequenz abgeleitet wurde, zugrundegelegt. Als Kontrollen wurden immer eine Probe, der statt Nukleinsäurelösung Wasser zugegeben wurde und eine Probe mit lOOng isolierter humaner DNS als Dots auf der Membran mitgeführt. In Abbildung 1 und 2 sind die Ergebnisse von Beispiel 1 dargestellt. Angegeben sind die %-Werte der densitometrischen Auswertung. Der Wert der für die Spezies homologen Sonde wurde 100% gesetzt.
Beispiel 2 Reverse Hybridisierungsstreifen
Herstellung des Hybridisierungsstreifens mit immobolisierten Sonden:
Eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der
Blotapparatur geschnitten und mit 10 x SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250 μl einer 1 μM Sondenlösung wie in Abbildung 3 beschrieben in 10 x SSC in schlitzförmigen Öffnungen der Blotapparatur vorgelegt. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 x SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm2 fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und in ca.4mm breite Streifen geschnitten.
Alle Hybridisierungen wurden bei 50°C in einem Wasserbad (Thermolab, GFL, Burgwedel, Deutschland) durchgeführt. Die mit Sonden beschichtete Membran wurde in Streifen geschnitten und in einer Inkubationswanne (Corning costar, Bodenheim, Deutschland) mit vorgewärmtem Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 20μl in 0,4M NaOH denaturiertem Amplifikat erfolgte für eine Stunde die Hybπdisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundenes Amplifikat wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 50°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blockmg-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C inkubiert. Die Hybride wurden kolorimetrisch durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat mit Zugabe von NBT/BCIP detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde in Substratpuffer mit NBT/BCIP 10min inkubiert und die Farbentwicklung durch Waschen mit H2Obidest gestoppt (s. Abbildung 3). Beispiel 3: Selbstamplifizierender Chip
Isolierung bakterieller genomischer DNS:
1,5 ml einer positiven Bakterienulture wurden in ein 2ml Reaktionsgefäß gefüllt und bei 8000g 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde dekantiert und das Sediment wird zweimal in 500 μl deionisiertem Wasser gewaschen. Daraufhin erfolgte eine 30minütige
Inkubation bei 95 C in einem Heizblock (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und eine 15minütige Ultraschallbehandlung (Bandelin, Berlin, Deutschland) . Nach lOminütiger Zentrifugation bei 14.000g werden 400 μl des Überstandes abgenommen und in eine neues Reaktionsgefäß transferiert.
Immobilisierung der spezies-spezifischen Oligonukleotide
Die spezies-spezifischen aminomodifizierten Ohgonukleotidpaare (Interactiva, Ulm, Deutschland) werden in Na-Phosphatpuffer 20μM verdünnt und in eine Platte mit 384 Vertiefungen pipettiert. Die Ohgonukleotidpaare werden mit einem Volumen von lnl in runden Feldern (- 'spots") mit einem Durchmesser von je 200 μm einzeln nebeneinander auf dem Glasträger (75 x 25 mm) aufgetragen. Die Ohgonukleotidpaare werden immer in doppelter Ausführung nebeneinander immobilisiert (Duplikatspots). Die Immobilisierung der aminomodifizierten Oligonukleotidpaare (Interactiva, Ulm, Deutschland) auf die oberflächenmodifizierten Glasträger erfolgt in allen Fällen durch „Kontakt-pπ'πt g" mit Hilfe des OMNI-GRJD (GeneMachines, San Carlos, USA) spotters. Von den Vertiefungen der Mikrotiteφlatte werden von einem mit einer Reihe von Präzisionsspitzen versehenen Roboterarm die spezies-spezifischen Oligonukleotide und setzt sie an genau definierten Stellen auf den Glas-Objekträgern ab.
Die verwendeten Chiprohlinge „Motorola Activated slides" (Motorola, Schaumburg, Illinois USA) besitzen reaktive Gruppen auf ihrer Oberfläche, die aminomodifizierte Oligonukleotide an der Oberfläche kovalent binden können (keine weiteren Angaben des Herstellers).
Prozessierung der gespotteten Arrays:
Die gespotteten Glasträger werden über Nacht in einer Feuchtkammer mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf werden die Glasträger 15 Minuten bei 50°C in Blockierungs-Reagenz inkubiert und 2 x 5 Minuten bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gewaschen. Darauf erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei 50°C im Waschpuffer Motorola und wiederum werden die Glasträger 2 5 Minuten bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gewaschen. Die Glasträger werden durch 5minütiges Zentrifügieren bei lOOOφm getrocknet.
Festphasen-PCR
Verwendete Materialien Geräte
Materialstoffe
Geräte
Alle Komponenten werden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vermischt und zunächst 15 Minuten bei 95°C inkubiert. Der komplette PCR-Reaktionsansatz wird direkt auf das Reaktionsfeld der Glasträger pipettiert, auf dem die Oligonukleotide immobilisiert sind. Die PCR-Reaktion wird mit einem Deckglas bedeckt und der Glasträger in den in-situ- Aufsatz (Twin Towers block) des Thermocyclers gelegt. Während der ersten Inkubationsphasen bei 95°C verschließt das „self-seal"-Reagenz den Raum zwischen den Rändern des Deckglases und dem darunter befindlichen Glasträger; dies verhindert zum einen eine Evaporation des PCR-Reaktionsansatzes während der Hitzeschritte der PCR und zum anderen wird dadurch eine luftdichte Reaktionskammer für die PCR-Reaktion ausgebildet. PCR-Programm:
Zyklenanzahl Temperatur (°C) Zeit
40 95 15 sec 58 45 sec
Waschprotokoll nach erfolgter Festphasen-PCR
Nach der Festphasen-PCR werden die Glasträger aus dem Thermocycler entnommen und das Deckglas wird vorsichtig entfernt. Die Glasträger werden 15 Minuten bei 68°C in Waschpuffer 1, 5 Minuten bei Raumtemperatur in Waschpuffer 2 und 5 Minuten bei Raumtemperatur in Waschpuffer 3 gewaschen. Darauf werden sie mit Hilfe von Druckluft getrocknet.
Darauf werden die Glasträger mit Hilfe eines konfokalen Laserscanners (Scan Array 4000, DSS Imagetech, New Dehli, Indien) gescannt und es resultiert die bildliche Darstellung des Fluoreszenz-Signals auf dem Glasträger. Je intensiver das Fluoreszenzsignal auf dem Glasträger ist, desto weißer erscheint der jeweilige Spot und umgekehrt desto schwächer das Signal ist, desto schwärzer erscheint der jeweilige Spot. Zwischen weißem und schwarzem Spot erscheinen in der Intensitätsskala die Farben rot-grün-blau.
Die Integration der Fluoreszenzsignale in Zahlenwerte erfolgte durch die ImaGene Software (ImaGene Standard edition; Biodiscovery, Marina del Ray, USA) (s. Abbildung 4).
Tabelle 1
Tabelle 2:
Tabelle 3
Die Primer SEQ ID No. 55- 170 sind als speziespezifische Amplifikationsprimer für den selbstamplifizierenden Chip konstruiert.
Tabelle 4
Tabelle 5

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanter Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19-54 und 174-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wurde.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171-173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonden markiert sind.
9. Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, - bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem
Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgeführt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, - und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den
Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ DD No.: 1-18, 171 - 173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mit der Polymerase-Ketten-Reaktion erfolgt.
13. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 9 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß die Primer markiert sind.
14. Vorrichtung zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID NO.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19 -54 und 174 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist.
17. Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
18. Kit zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.
19. Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.
20. Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171 - 173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
21. Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.
22. Verwendung der Nukleinsäure gemäß Anspruch 17 beziehungsweise des Kits gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.
23. DNA-Array umfassend eine feste Phase auf der Nukleinsäuren immobilisiert sind, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -
176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
24. DNA-Array gemäß Anspruch 23, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.
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