EP1549766A1 - Genetische marker für die diagnose der ausprägung des phänotyps "spreizbeinigkeit" bei haus-, zucht- und nutztieren - Google Patents

Genetische marker für die diagnose der ausprägung des phänotyps "spreizbeinigkeit" bei haus-, zucht- und nutztieren

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Publication number
EP1549766A1
EP1549766A1 EP03769374A EP03769374A EP1549766A1 EP 1549766 A1 EP1549766 A1 EP 1549766A1 EP 03769374 A EP03769374 A EP 03769374A EP 03769374 A EP03769374 A EP 03769374A EP 1549766 A1 EP1549766 A1 EP 1549766A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
nucleotides
primers
animals
microsatellites
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03769374A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ernst c/o Inst. für Tierzucht u. Tierhaltung KALM
Norbert c/o FBN REINSCH
Sebastean Schwarz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev
Original Assignee
Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev filed Critical Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev
Priority to EP03769374A priority Critical patent/EP1549766A1/de
Publication of EP1549766A1 publication Critical patent/EP1549766A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to the use of a first nucleic acid for determining the predisposition to the expression or inheritance of the phenotype "spreading legs" in a mammal / poultry, the first nucleic acid having a length of at least 8 nucleotides and being identical or essentially identical to a second nucleic acid, which occurs on chromosome 5 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, namely in the area of the microsatellites Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974 , Swr426, Sw1094, Sw986 or Sw1982, or on chromosome 11 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, namely in the range of microsatellites S0182, S0071, Sw2008, Sw435, S0009, S0230 or Sw486 furthermore
  • the invention relates to a kit containing at least one pair of primers for the amplification of one of the above-mentioned second nucleic acids, one primer each binding to the + strand and another primer to the - strand of the nucleic acid, or a hybridization probe with a length of at least 8 nucleotides which binds to one of the second nucleic acids mentioned above, or a specific antibody or an antibody fragment which binds to the second nucleic acid disclosed above.
  • Hereditary anomalies represent an economic loss in the production of breeding pigs as well as in piglet production.
  • the economic damage of individual birth defects depends on the frequency of traits in the population as well as the treatment costs resulting from inheritance defects and smaller increases (STIGLER et al., 1991).
  • congenital digging out in the newborn piglet (hereinafter referred to as spreader syndrome) is described as the most frequently occurring dysfunction (PARTLOW et al :, 1993).
  • the anomaly manifests itself as a restricted mobility of the affected animals and a characteristic spread position mostly of the rear extremities, which means that the piglets can hardly reach the teats and escape reactions are delayed.
  • RFLPs restriction fragment length polymorphisms
  • microsatellites Jarne and Lagoda 1996; Montaldo and Herrera-Meza 1998.
  • Most RFLPs are diallelic and, according to Hui Liu (1998), have low PIC (Polymorphism Information Content) values compared to microsatellites.
  • PIC Polymorphism Information Content
  • Microsatellites are numerous and have high PIC values. Around 65,000 to 100,000 microsatellite loci are evenly distributed in the pig genome (Ellegren 1993; Schlötterer 1997; Dounavi 2000). The identification of microsatellites is carried out by various laboratories, the number of identified microsatellites is 1286 (as of March 5, 2001).
  • Genotyping or genome screening procedures determine whether the presence of certain polymorphic sections of DNA or more specific
  • Haplotypes with a phenotype can be used as a diagnostic or prognostic marker, which makes it possible to make statements about the probability of occurrence or about the inheritance of a phenotype. It should be borne in mind here that such prognostic or diagnostic Verification procedures are independent of identification of the phenotype-causing gene. This is important because establishing the molecular basis of a phenotype is often very difficult and time-consuming, especially in connection with multifactorial phenotypes. A small number of features of pigs and other mammals or poultry can be predicted using genetic markers. To date, however, there is no possibility of demonstrating a predisposition to inheritance or the expression of the "spread-legged" phenotype.
  • the present invention is therefore based on the object of providing methods and methods by means of which animals can be identified which are predisposed to the expression of the phenotype "spread-leggedness" or inherit such a predisposition. This object is achieved according to the invention by the provision of the information in the Characterized claims solved embodiments.
  • the invention thus relates to the use of a first nucleic acid for determining the predisposition to the expression or inheritance of the phenotype
  • Mammals / poultry in the area of microsatellites S0182, S0071, Sw2008, Sw435, S0009, S0230 or Sw486.
  • the second nucleic acid disclosed above is preferably genomic DNA or cDNA, but can also be an RNA transcript of this DNA.
  • Genomic DNA and cDNA are mostly double-stranded, but the use according to the invention also includes single-stranded DNA molecules.
  • the first nucleic acid is preferably an oligonucleotide, but can also be a polynucleotide in certain embodiments. It is preferably DNA, but can also be RNA or a DNA or RNA derivative such as PNA.
  • the first nucleic acid mentioned usually has a length of at least 8 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably at least 21 nucleotides, most preferably at least 25 nucleotides.
  • the first nucleic acid can also be up to 50 nucleotides, more preferably up to 100 nucleotides, even more preferably up to 1000 nucleotides and most preferably up to 5000 nucleotides long or longer.
  • the first or second nucleic acid comprises whole genes or even groups of genes. In these cases, the first or second nucleic acid has a length of up to 1000 nucleotides, preferably up to 5000 nucleotides, for example up to 25000 nucleotides, such as up to 150,000 nucleotides.
  • Hybridization probes are those nucleic acids that are used in a hybridization and bind to homologous nucleic acids.
  • the hybridization probe is preferably a radioactively labeled nucleic acid or it contains modified nucleotides.
  • the invention also includes such modifications of the nucleic acids claimed here,
  • Hybridization probes and primers that hybridize with the second nucleic acids preferably under stringent conditions.
  • higher or higher stringency hybridization conditions are understood to mean, for example, 0.2-0.5 ⁇ SSC (0.03 M NaCl, 0.003M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C.
  • the hybridization temperature is below 65 ° C., for example above 55 ° C., preferably above 50 ° C.
  • Stringent hybridization temperatures depend on the size or length of the nucleic acid and its nucleotide composition and are to be determined by a person skilled in the art by manual tests.
  • the solution used for hybridization contains a detergent such as SDS in a concentration of 0.1% to 0.5% and a collection of non-specific nucleic acids to saturate non-specific binding sites.
  • a detergent such as SDS
  • SDS a concentration of 0.1% to 0.5%
  • a collection of non-specific nucleic acids to saturate non-specific binding sites.
  • the basic principles of hybridization and the requirements for a hybridization probe are Well known to a person skilled in the art. For example, see Maniatis, et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982 or Harnes and Higgins, Nucleic acid hybridization: a practical approach, IRL Press, Oxford 1985.
  • predisposition refers to the presence of a hereditary disposition, which may be inheritance of the hereditary disposition and / or an expression of one
  • microsatellite SW1468 is located at position 97.5 cm, SW2 at position 78.7 cm at Sscr 5, SW1200 at position 114.3 cm at Sscr 5, SW2425 at position 72.3 cm at Sscr 5, SW 995 at Position 125.0 cM on Sscr 5 or IGF1 on position 118.7 cM on Sscr 5.
  • microsatellite loci located on chromosomes 5 and 11 were determined to expand the investigation; For this purpose, a combined length of the non-pseudoautosomal markers was determined using the CRI-MAP program (Green et al., 1990) for the genome under investigation.
  • the integrated positions (cM) of the newly examined marker loci along the combined maps are shown in Example 5 and column 3 of Table 11 and are as follows: S0005 at position 64.4 cm on Sscr 5, Sw963 at position 68.6 cm on Sscr 5 , Sw1987 at position 75.2cM on Sscr 5, S0018 at position 79.5cM on Sscr 5, Sw904 at position 81, 8cM on Sscr 5, Sw310 at position 83.3cM on Sscr 5, Swr1974 at position 83.9cM on Sscr 5, Swr426 at position 84.4cM on Sscr 5, Sw1094 at position 85.5cM on Sscr 5, Sw986 at position 105.3cM on Sscr 5 and Sw1982 at position 107, 1cM on Sscr 5.
  • microsatellite SW1468 on chromosome 5 of the pig denotes a position specific for a population on chromosome 5 and comprises DNA sections 5 cM upstream and / or downstream of the indicated position, preferably up to 10 cM upstream and / or downstream, more preferably up to 20cM upstream and / or downstream and most preferably up to 30cM upstream and / or downstream of the indicated position on the chromosome.
  • the microsatellites If the microsatellite is remote, ie located at the end of the chromosome, in particular less than 30cM from End removed, the upstream or downstream area can also be shorter than 5 cm.
  • the comparative genome maps between different species are based on the mapping of one or more loci in the genome of the species in question.
  • “Homologous position” refers to nucleic acid segments in the genome of other mammals / poultry that have a sequence identity with the second nucleic acid disclosed above, at least preferred, over the entire sequence length or in specific genes located here or at one or more loci or parts thereof with at least 100 nucleotides in length 40%, more preferably at least 50%, even more preferably at least 75% and particularly preferably at least 95%, have sequence identity preferably determined by the FASTA, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) or Bestfit algorithms of the GCG sequence analysis program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Madison, Wl 53711).
  • the parameters are preferably set so that the percentage of identity is calculated over the entire length of the reference sequence and homology gaps of up to 5% of the total number of nucleotides are permitted.
  • the so-called optional parameters are preferably left at their preset values.
  • the term “essentially identical” means that, for example, 7 nucleotides are identical in a range of 8 nucleotides.
  • the invention also includes those embodiments in which 4, 5 or 6 of the 8 nucleotides have the corresponding sequence of the second nucleic acid are identical, and the first nucleic acid can be identical or essentially identical to the + strand or the - strand.
  • a first nucleic acid also includes the fact that more than one (first) nucleic acid can be used in the use according to the invention. These can be, for example, two, three or four nucleic acids.
  • second nucleic acid mean both the + strand and the - strand. If two first nucleic acids are identical or essentially identical to the second nucleic acid, the first nucleic acid can be identical or essentially identical to the + strand, while the other first nucleic acid can be identical or essentially identical to the - strand. In this case, it is preferred that the “alignment” of the first nucleic acid is in opposite directions, which enables PCR to be carried out.
  • nucleic acids are provided for the first time, which enable a targeted molecular-biological diagnosis of the predisposition for the expression of the Allow phenotype "spread legs".
  • the invention disclosed here allows the time of the selection to be shifted significantly forward so that there is no longer any need to wait for the phenotypic expression of the feature.
  • the introduction of molecular biological markers can bring about a significant increase in efficiency of the selection process.
  • This selection process includes the determination of the genotype of the subject / mammal at one or more loci in a region of the above-mentioned second nucleic acids, preferably in two regions, more preferably three, even more preferably four, more preferably five, most preferably in six regions and the assessment of an individual as suitable for breeding or not suitable, including information about the coupling phase between the genotyped marker locus and the genes responsible for the defect expression. For example, the genotypes of suitable and distinguish unsuitable mammals / poultry by a different number of copies of a repetitive nucleotide sequence within the microsatellite locus under consideration.
  • nucleic acid can be represented in a PCR reaction using suitable primers and is reflected in different PCR product sizes and / or different restriction fragment lengths.
  • the tests are usually performed on tissue samples from mammals or poultry, on egg cells, or on samples of body fluids such as sperm, urine, milk, blood, tear fluid and other secretions. These can be taken from the animal before diagnosis.
  • the syndrome spreader can be regarded as a prime example of a complex genetic disease. For this reason, a genome scan of piglets suffering from the syndrome spreader is described in the present patent application. Because of the calculated positions of known marker loci, the unknown disease loci were thus limited to the smallest possible chromosomal area. A number of molecular biological but especially statistical methods were used for this. As the inheritance is not yet known, a non-parametric evaluation was carried out for the statistical analysis, ie no assumptions were made about the inheritance of the characteristic. The aim of statistical methods is to demonstrate the co-segregation of a marker allele with the characteristic in a family. The methods used for this, which are used to map disease-correlated genes, can basically be divided into two categories:
  • Coupling analysis is the classic method for coupling analysis. In the original form, this method is based on observation and
  • the invention further encompasses preferred embodiments, the second nucleic acid disclosed above being a microsatellite or a sequence flanking these microsatellites.
  • the nucleic acid is in the range of microsatellites Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 or Sw1982; or on chromosome 11 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, in the region of the microsatellites S0182, S0071, Sw2008, Sw435, S0009, S0230 or Sw486.
  • the flanking sequence lies outside of the repetitive sequences typical of the microsatellite and preferably comprises a range of 1 kB upstream or downstream of the repetitive sequences.
  • the detection of at least one allele takes place, the detection of at least one allele with a length of 153 bp in the range of SW1468 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 5 and 6; 154 bp in the range of SW1200 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 7 and 8; 141 bp in the range of S0182 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 23 and 24; 184 bp in the range of S0071 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 15 and 16; 300 bp in the range of S0230 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 19 and 20; or 311 bp in the range of S0230 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 19 and 20; in pigs of the German Landrace indicates a risk of developing and / or inheriting the phenotype "spread legs".
  • allele is understood by the person skilled in the art to mean a series of two and more variants of a specific chromosomal gene segment.
  • a further preferred embodiment relates to the use of the nucleic acids mentioned above, two or more alleles being detected.
  • the detection can also be carried out with one or more Primer pairs from SEQ ID 25/26, SEQ ID 27/28, SEQ ID 29/30, SEQ ID 31/32, SEQ ID 33/34, SEQ ID 35/36, SEQ ID 37/38, SEQ ID 39/40, SEQ ID 41/42, SEQ ID 43/44, SEQ ID 45/46, SEQ ID 47/48.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to the use of two primers, the primers being oriented in opposite directions with respect to the complementary DNA region and thus, for example, enabling PCR amplification.
  • the second nucleic acid is a specific gene or part of a gene. Preferred here the genes selected from the group consisting of IGF1, MYF5, MYF6, MYOD1,.
  • genes of this type can also be surrounded by flanking sequences, which preferably comprise a region of 1 kB upstream or downstream of the genes.
  • the first nucleic acid has a length of at least 8 nucleotides and is identical or essentially identical to a second nucleic acid.
  • the second nucleic acid corresponds to a section of chromosome 5 or
  • nucleic acid mentioned is located on chromosome 5 in the range of microsatellites SW1468 or SW1200 and
  • chromosome 5 of the pig was examined in the
  • alleles from the microsatellite S0182 were identified in the examined population. These alleles are characterized by their specific lengths of 119, 132, 134, 139 and 141 bp. Detection of the allele at 141 correlates with a risk of developing and / or inheriting the phenotype "spread leg". Furthermore, 4 alleles from the microsatellite S0071 were identified in the examined population. These alleles are characterized by their specific lengths of 184, 186, 188 and 191 bp. A detection of the allele with 184 bp correlates with a risk of the expression and / or inheritance of the phenotype "spread leg".
  • At least one allele with a length of 153 bp in the range of SW1468 is detected using primers with the sequences of SEQ ID NO: 5 and 6; 154 bp in the range of SW1200 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 7 and 8; 141 bp in the range of S0182 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 23 and 24; 184 bp in the range of S0071 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 15 and 16; 300bp in the range of S0230 below Use of primers with the sequences of SEQ ID NO: 19 and 20; or 311bp in the range of S0230 using primers with the sequences of SEQ ID NO: 19 and 20 and indicates in pigs of the German Landrace a risk of the expression and / or inheritance of the phenotype "spread leg".
  • two, preferably three, more preferably four, even more preferably five and most preferably six, alleles are detected.
  • the detection can take place in separate reactions or in so-called multiplex reactions, which include the simultaneous detection of alleles.
  • use according to the invention relates to the detection of the disclosed first or second nucleic acids for the selection of domestic, breeding or farm animals with the missing feature “spreading legs”.
  • the domestic, breeding or Farm animals cattle, dog, cat, rabbit, buffalo, camel, alpaca, mink, pig, chicken, duck, goose, turkey, ostrich, goat, sheep, horse, donkey, rat or mouse.
  • the length specifications given above refer to animals of the examined pure breeding line of the German Landrace.
  • the microsatellites can have other alleles that are either shorter or longer.
  • the locus which correlates with the inheritance and / or expression of the characteristic "spread-leggedness” By specifying the locus which correlates with the inheritance and / or expression of the characteristic "spread-leggedness", however, the person skilled in the art has the possibility without unreasonable effort to identify the alleles of the microsatellite markers disclosed in a population.
  • the present invention shows which Ways of identifying marker alleles which correlate with the expression or inheritance of the "spread-legged" phenotype are identified. These can then be used in studies of animals from other populations as markers of the phenotype.
  • sequence analysis programs can be used to identify those nucleic acid segments in the genome of other animal populations which contain a nucleic acid segment which is homologous to the above-mentioned second nucleic acid.
  • the homologous locus identified in this way can then serve as the basis for further examinations are used, with the help of which specific alleles located at this locus can then be identified which associate with the phenotype "spread-leggedness", ie are inherited coupled to this phenotype.
  • a genome screen is carried out on several mammals / poultry of a population.
  • the term "multiple mammals / poultry" includes at least two animals in a population, preferably at least 5 animals, more preferably at least 10 animals, even more preferably at least 20 animals, more preferably at least 50 animals, even more preferably at least 250 animals, most preferably at least 1500 animals.
  • the genome screen examines whether a nucleic acid of up to 5000 nucleotides in length, preferably up to 1000 nucleotides, more preferably up to 350 nucleotides, even more preferably up to 50 nucleotides, most preferably at least 8 nucleotides in length together with the characteristic "spread leg" is inherited.
  • markers are microsatellites on chromosome 5 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, in the region of the microsatellites Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310 , Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 or Sw1982; or on chromosome 11 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, in the region of the microsatellites S0182, S0071, Sw2008, Sw435, S0009, S0230 or
  • nucleic acid sequences can also be used as markers, provided that they are identical or essentially identical in the sense of the invention to the second nucleic acid disclosed in the invention or are in one of the above-mentioned nucleic acid regions.
  • the person skilled in the art can use detection methods for determining the predisposition to expression of the "spreading legs" phenotype without any problems.
  • the invention also discloses methods for determining the predisposition to express the "spreading legs" phenotype in domestic, breeding or farm animals, comprising the animals, their fertilized or unfertilized egg cells, their sperm , Tissue samples or samples of body fluids, such as milk and urine, for the presence, expression or nature of one of the above-mentioned second nucleic acid.
  • test methods are preferably in vitro test methods.
  • Different "forms or textures” of nucleic acids can be caused, for example, by insertions, duplications, deletions, substitutions or translocations. Inserts or deletions, for example, result in a changed nucleic acid length.
  • Duplications are a phenomenon usually observed in the generation of microsatellites. This length polymorphism can, for example are represented in a PCR reaction and is reflected when using suitable flanking primers, for example in the case of insertion in a longer PCR product.
  • the different "expression or nature” can also be, for example, a closely related gene variant, which in extreme cases is only distinguished from the related gene sequence by a single nucleotide exchange.
  • Such different “forms or qualities” of the nucleic acid can optionally be carried out with the aid of RFLP analyzes (restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) or through
  • the domestic, breeding or farm animals are cattle, dog, cat, rabbit, buffalo, camel, alpaca, mink, pig, chicken, duck, goose, turkey, ostrich, goat, sheep, horse , Donkey, rat or mouse.
  • the methods according to the invention also relate to other mammals, in particular humans.
  • a PCR amplification with complementary primers with a length of at least 8 nucleotides is carried out, one primer on the + strand and another primer in the opposite orientation on the - strand of the second Nucleic acid binds, or a hybridization is carried out, a hybridization probe with a length of at least 8 nucleotides binding to the second nucleic acid, or sequencing of the second nucleic acid is carried out, or a detection with a specific antibody or antibody fragment or antibody derivative or an aptamer, the antibody or the antibody fragment or the antibody derivative or the aptamer being specifically directed against the second nucleic acid.
  • an antibody is used, for example, which is directed against a specific, first nucleic acid sequence, a second nucleic acid sequence which differs from the first only by at least one mutation but does not bind.
  • the specific, first nucleic acid can therefore be detected with the aid of this antibody, for example after transfer to a nitrocellulose membrane, either by labeling this antibody itself or by making it visible on the membrane with the aid of a second, labeled antibody. A lack of binding to the membrane would indicate the absence of the first nucleic acid sequence.
  • the reaction mixture also contains an excess of deoxynucleoside triphosphates and a DNA polymerase, for example Taq polymerase.
  • a DNA polymerase for example Taq polymerase.
  • the primers bind to the nucleic acid and the DNA polymerase extends the primers based on the nucleotide sequence specified in the nucleic acid.
  • the annealing temperature of a primer is influenced by its adenine + tymine and cytosine + guanine content. 2 ° C are calculated for each adenine and tymin, while 4 ° C is calculated for each cytosine and guanine.
  • the quality of a PCR reaction depends on the primer concentration, the changing amount of dNTP in the PCR mix and the quality of the Taq DNA polymerase.
  • a typical reaction mixture of 12.5 ⁇ l is composed as follows: 0.20 ⁇ M primer, 200 ⁇ M dNTPs, 0.50 U Taq polymerase, 1, 25 ⁇ l 10 x buffer, 1.50 ⁇ l DNA (50ng / ⁇ l) and with H 2 0 to 12.5 ⁇ l.
  • the reaction conditions listed in the method part of this application are preferably selected.
  • Primers are those nucleic acids that are at least 8 nucleotides in length and bind to one of the second nucleic acids disclosed above.
  • Preferred primers have a length of at least 8 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, more preferably at least 20 nucleotides, even more preferably a length of at least 30 nucleotides, most preferably a length of at least 50 nucleotides.
  • the nucleotide sequences of the primers can be combined as desired from the second nucleic acid sequences disclosed above, provided that they have at least 8 consecutive nucleotides.
  • primers with the target sequence within the second nucleic acid can also lead to base mismatches, provided that hybridization occurs under the chosen reaction conditions, which can lead to an elongation reaction.
  • a primer should have 7 identical nucleotides within 8 neighboring nucleotides.
  • the invention also includes those embodiments in which 4, 5 or 6 of the 8 nucleotides are identical to the corresponding sequence of the second nucleic acid.
  • the basic principles of the PCR methodology must be observed, the process steps and reaction conditions of which are state of the art. In detail, however, the method steps may nevertheless require adjustment by a person skilled in the art.
  • Amplification methods have been developed in recent years, further amplification methods, which are also preferred embodiments of the invention.
  • Further amplification methods are, for example, the “Ligase Chain Reaction” (LCR, EP-A 320308), “Cyclic Probe Reaction” (CPR,), “Strand Displacement Amplification” (SDA, Walker et al., Nucleic Acids Res. 1992 (7) : 1691-6.) Or “Transciption-based amplification systems” (TAS, Kwoh et al Proc. Nat. Acad Sei. USA 86: 1173 (1989), Gingeras et al., PCT Application WO 88/10315).
  • hybridization probe is understood to mean a nucleic acid with a length of up to 50 nucleotides, more preferably up to 100 nucleotides, even more preferably up to 200, 300, 400, 500 or 1000 nucleotides, and most preferably up to 5000 nucleotides, which bind to one of the second nucleic acids disclosed above, whereby the specificity of the detection must be tested in preliminary tests, which is a common practice for the person skilled in the art.
  • the first nucleic acid is preferably provided with a detectable label, such as a radioactive or fluorescent label, examples of hybridization methods being dot blot, northern blot, reverse northern blot, in situ hybridization or southern blot (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A. Laboratory M tract, Cold Spring Harbor and all subsequent editions).
  • a detectable label such as a radioactive or fluorescent label
  • Another preferred detection method for determining the predisposition to the expression of the phenotype "spread-leggedness" is the sequencing of one of the second nucleic acids disclosed above. Sequencing methods are known from the prior art and require no further explanation for the person skilled in the art. For example, here Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (and all subsequent editions are referenced), which describes the methods, ⁇ ach Sanger and Maxam / Gilbert.
  • nucleic acids that are at least a length are understood according to the invention 8 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably at least 21 nucleotides, most preferably a length of at least 25 nucleotides.
  • the properties shown for the PCR primers apply accordingly to sequencing primers.
  • primers or hybridization probes which are derived from the second nucleic acids mentioned above, are suitable for special detection methods, for example PCR methods, sequencing or hybridization methods, and which are not, or less are suitable.
  • the primers or hybridization probes for use in the invention can also be present, for example, in larger DNA or RNA sequences, for example flanked by restriction sites.
  • nucleic acids, hybridization probes and primers can also be constructed from base derivatives. A number of modifications change the chemistry of the phosphodiester backbone of DNA or RNA, sugars or heterocyclic bases.
  • phosphorothioates Phosphorodithioates, in which both oxygen atoms not involved in hydrogen bonding are replaced by sulfur, phosphoramides, alkylphosphotriesters and / or boranophosphates.
  • Achiral phosphate derivatives include S'-O'- ⁇ '-S phosphorothioates, 3'-S-5'-0-phosphorothioates, 3'-CH2-5'-0-phosphonates and 3'-NH-5'- 0 phosphoroamidates.
  • peptide nucleic acids the entire backbone of the phosphodiester can be replaced by peptide bonds.
  • Sugar modifications are used to change stability or affinity.
  • the A anomer of deoxyribose can be used with the base inverted with respect to the natural B anomer.
  • the 2'-OH group of the ribose can be changed to the corresponding 2'-0-methyl or 2'-0-allyl sugar, whereby a gain in stability is achieved without impairing the binding affinity.
  • Some other useful substitutions include deoxyuridine instead of deoxythymidine; 5-methyl-2 ' ⁇ deoxycytidine and 5-bromo-2'-deoxycytidine instead of deoxycytidine.
  • 5-propyyl-2'-deoxyuridine and 5-Propyyl-2'-deoxycytidine can replace deoxythymidine and deoxycytidine and thus increase affinity and biological activity.
  • the nucleic acids can have a label for detection. Examples of this are radioactive labeling, for example with 35 S, 32 P or 3 H, fluorescent labeling, biotin labeling, digoxigenin labeling, peroxidase labeling or labeling with an alkaline phosphatase.
  • the nucleic acids used in the hybridization or amplification reaction can furthermore be provided with various suitable markers. Suitable markers include fluorochromes, e.g.
  • fluorescein isothiocyanate FITC
  • rhodamine Texas Red
  • phycoerythrin allophycocyanin
  • 6-carboxyfluorescein 6-FAM
  • JOE 6-carboxy-X-rhodamine
  • ROX 6-carboxy-X-rhodamine
  • HEX ⁇ -carboxy ⁇ ''' ⁇ -hexachlorofluorescein
  • 5-carboxyfluorescein 5-FAM) or N, N, N', N'-tetramethyl-6 -Carboxyrhodamine (TAMRA).
  • the label can also be part of a multi-stage system, the nucleic acid being conjugated with biotin, or with a hapten or a similar substance that has a high-affinity binding partner, for example avidin, specific antibodies, etc., in which case the binding partner with a detectable compound is conjugated.
  • the label can be conjugated with a primer and / or the nucleotides in the pool of the amplification reaction can be provided with a suitable label, so that the label is incorporated into the newly formed amplification product.
  • double strands that have arisen in a hybridization reaction can also be detected by DNA double strand specific antibodies. Said antibodies are characterized in that they only bind to double-stranded DNA, but not to single-stranded DNA.
  • Another preferred detection method is the detection of the first or second nucleic acid with a specific antibody or antibody fragment or antibody derivative or an aptamer.
  • This method generates specific antibodies that recognize the first or second nucleic acids.
  • Fragments of antibodies are, for example, Fv, Fab or F (ab ') 2 - fragments derivatives include scFvs, chimeric or humanized antibodies.
  • Aptamers are nucleic acids that are specific to one due to their three-dimensional structure Bind target molecule. Methods for generating specific antibodies are known from the prior art. The specificity of the binding to the genomic nucleic acid can be tested, for example, by competition experiments with radioactively labeled desired target nucleic acid and unwanted, for example randomly selected, nucleic acid.
  • antibodies specifically bind the first or second nucleic acids.
  • the antibody binding can be made visible, for example, by labeling the primary antibodies or is detected with the aid of antibody-binding second antibodies, which in turn are then labeled.
  • the antibodies can be modified, for example, with fluorescent substances, by radioactive labeling or by enzymatic labeling.
  • Immunological detection methods using specific antibodies, as well as the generation of antibodies and fragments or derivatives thereof are, as already mentioned, known from the prior art. Examples include Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press and all subsequent editions.
  • a genome screen is carried out on several mammals and / or poultry of a population.
  • the term several mammals / poultry "comprises at least two animals of a population, preferably at least 5 animals, more preferably at least 10 animals, even more strongly preferably at least 20 animals, more preferably at least 50 animals, even more preferably at least 250 animals, most preferably at least 1500 animals.
  • the genome screen examines whether a nucleic acid of up to 5000 nucleotides in length, preferably up to 1000 nucleotides, more preferably up to 350 nucleotides, even more preferably up to 1000 nucleotides, most preferably up to 50 nucleotides in length, together with the feature “ Spread leg is inherited.
  • nucleic acid amplification methods or hybridization methods which marker allele is inherited together with the characteristic "spread leg".
  • a common inheritance of nucleic acids with the phenotypic expression of the "spread leg” implies a genetic one Coupling of the nucleic acid to the gene controlling the characteristic and also identifies which marker allele is located on the same chromosome as the allele involved in the phenotypic expression of the "spread-leggedness" of the defect gene, ie in which coupling phase there are marker locus and defect locus.
  • markers are microsattelites on Chromosome 5 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, specifically in the area of the microsatellites Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 or Sw1982; or on chromosome 11 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals / poultry, namely in the range of microsatellites S0182, S0071, Sw2008, Sw435, S0009, S0230 or Sw486:
  • you can also other nucleic acid sequences can be used as markers, provided that they are identical or essentially in the sense of the invention are identical with the second nucleic acid disclosed in the invention or in one of the above-mentioned nucleic acid regions.
  • the invention further relates to a kit containing at least one pair of primers for the amplification of the second nucleic acid, one primer each binding to the + strand and another primer to the - strand of this nucleic acid; or a hybridization probe with a length of at least 8 nucleotides that binds to the second nucleic acid; or an antibody or an antibody fragment or an antibody derivative or an aptamer that specifically binds the first or second nucleic acid.
  • PCR-based kits contain a pair of primers for the amplification of one of the above-mentioned second nucleic acids.
  • Primers are those nucleic acids that are at least 8 nucleotides in length and bind to one of the second nucleic acids disclosed above.
  • Preferred primers have a length of at least 8 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, more preferably at least 20 nucleotides, even more preferably a length of at least 30 nucleotides, most preferably a length of at least 50 nucleotides.
  • the nucleotide sequences of the primers can be combined as desired from the second nucleic acid sequences disclosed above, provided that they have at least 8 consecutive nucleotides.
  • a primer should have at least 7 nucleotides identical to the target sequence within 8 neighboring nucleotides.
  • the invention also includes those embodiments in which 4, 5 or 6 of the 8 nucleotides are identical to the corresponding sequence of the second nucleic acid.
  • Kits based on hybridization methods contain a hybridization probe.
  • the hybridization probe can be up to 50 nucleotides long, more preferably up to 100 nucleotides, even more preferably up to 1000 nucleotides, and most preferably up to 5000 nucleotides or longer.
  • the hybridization probe is preferably a radioactively labeled nucleic acid or it contains modified nucleotides.
  • Kits for the detection of nucleic acids on ELISA, RIA, RIPA or similar basis contain a specific antibody or an antibody fragment or an antibody derivative or an aptamer. Antibodies or antibody fragments or antibody derivatives or aptamers are specifically directed against the first or second nucleic acid. Common detection methods in which the kits are used are e.g. ELISA or RIPA but also immunofluorescence and other detection methods. Immunological detection methods and methods for generating specific antibodies are known from the prior art.
  • the components of the kit can be packaged in containers such as Vials, optionally also in buffers and / or solutions. Optionally, one or more of the components can be packaged in the same container. Additionally or alternatively, one or more components can be absorbed onto a solid support, e.g. on nitrocellulose filters, nylon membranes, or on the well of a microtiter plate.
  • Figure 1 Female, combined and male coupling map of chromosome 3. The distances between the loci are given in cM (Kosambi).
  • FIG. 2 Female, combined and male coupling map of chromosome 5. The distances between the loci are given in cM (Kosambi).
  • FIG. 3 Female, combined and male coupling map of chromosome 11. The distances between the loci are given in cM (Kosambi).
  • Figure 4 Information content of the marker loci on chromosome Sscr 3.
  • Figure 5 Information content of the marker loci on chromosome Sscr 5.
  • Figure 7 Course of the test statistics (% 2) and the probability of error ( ⁇ - comparisonwise) along the positions in cM (Kosambi) of the chromosome Sscr 3.
  • Figure 10 Course of the test statistics ( ⁇ 2 ) and the probability of error ( ⁇ - comparisonwise) along the positions in cM of chromosome 3
  • Figure 11 Course of the test statistics ( ⁇ 2 ) and the probability of error ( ⁇ - comparisonwise) along the positions in cM of chromosome 5
  • Figure 12 Course of the test statistics ( ⁇ 2 ) and the probability of error ( ⁇ - comparisonwise) along the positions in cM of chromosome 11
  • Example 1 Gender determination and typing results of the microsatellites
  • tissue samples of the sows were in the form of a piece of the ear cartilage with a total weight of approx. 30 mg each. Approx. 1.5 cm long, cropped tail ends were present from the spreader offspring, from which 20 to 30 mg each were separated.
  • the tissue samples were stored in 1.5 ml Eppendorf reaction vessels at 23 ° C.
  • the genomic DNA was extracted from the ear cartilages and tail ends according to a protocol and with the Puregene application package (Gentra Systems). For this purpose, approximately 30 mg of tissue were separated off with a sterile scalpel and 600 ⁇ l of extraction buffer (Gentra Systems) and 1 ⁇ l of proteinase K solution were added to digest the cell membrane and shaken up. The samples were then incubated at 55 ° C. overnight.
  • RNA was eliminated by adding 1 ⁇ l RNAse (10 mg / ⁇ l) with subsequent shaking and a further incubation at 37 ° C. for 30 min.
  • RNAse 10 mg / ⁇ l
  • the supernatant was decanted and swirled into 600 ⁇ l isopropanol (100%) until a DNA pellet became visible.
  • the DNA obtained was assessed qualitatively on a 0.8% agarose gel.
  • the electrophoretic separation was carried out for approx. 30 min at 10 V / cm.
  • the gels were then photographed under UV light and compared with one another.
  • the quality of the DNA isolated was determined by the degree of fragmentation of the bands obtained.
  • the concentration and purity of the DNA was determined photometrically at 260 nm and 280 nm (SAMBROOK et al., 1989). Before the measurement, the DNA was bidistilled. Diluted water 1:50. The concentration was determined using the formula: [(OD260 x 50 ⁇ g / ml) x dilution factor] and the purity using the formula: [OD260 / OD280].
  • the DNA dissolved in Tris-HCl was adjusted to a uniform 100 ng / ⁇ l.
  • the dissolved DNA was stored at 23 ° C. in 1.5 ml Eppendorf reaction vessels.
  • aliquots of the samples were transferred into 96 deepwell plates using a pipetting robot, corresponding to the organization of the samples on the gels, and diluted with Tris-HCl, so that a DNA concentration of 8 ng / ⁇ l was reached.
  • 5 ⁇ l, corresponding to 40 ng DNA were aliquoted per sample from the Deepwell plates into 96-well PCR reaction vessels. This was followed by a desiccation of the dissolved DNA thus presented for about 3 hours at 50 ° C. in a drying cabinet.
  • the dehydrated DNA was stored for about 6 weeks at room temperature.
  • the multiplex PCR for the amplification of the gene products was carried out with 5 ⁇ l of DNA (6 ng / ⁇ l) dissolved in buffer (Tris-HCl, pH 8.5).
  • the reaction started consists in detail of 50 mM KCI, 1, 5 mM MgC ⁇ 2, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 200 ⁇ M dNTP, 0.1 ⁇ M per primer and 0.8 U Taq polymerase.
  • the PCR was started at 3 ° C at 94 ° C, followed by 35 cycles consisting of 20 seconds at 94 ° C, 40 seconds at 61 ° C and 45 seconds at 72 ° C. An extension was carried out for 10 min at 72 ° C.
  • the fragments were displayed in a 3% agarose gel with 0.5 ⁇ TBE buffer. 10 ⁇ l of the mixture of 10 ⁇ l PCR product and 2 ⁇ l loading buffer were pipetted into each gel pocket. The electrophoresis at 10 V / cm took 35 to 40 minutes. The agarose gels were then photographed on a transilluminator in UV light. The fragment lengths were classified by comparison with a simultaneously separated standard marker (0X174 / H / nfl). Two bands (163 and 445 bp) were seen in each male tested, only the control band (445 bp) in females.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the standard reaction batch for the PCR was 10 ⁇ l and consisted of:
  • the indices A, B and C stand for the quantity ratios that are kept variable in the standardized approach.
  • the components contained in the PCR buffer (Pharmacia, USA) are shown under A in simple concentration.
  • the amount of primer (B) and the units of Taq polymerase (C) used also varied; the concentrations and amounts selected are listed in Tables 2 and 3.
  • the optimal PCR conditions with regard to the annealing temperature, the number of cycles, the amount of primer, the amount of PCR buffer used and the required units of Taq polymerase were determined via primer optimization. This was usually done using a test in which three microsatellites were selected with regard to their reaction conditions and each microsatellite was amplified separately. In parallel, these were combined in three duplex reactions and in one triplex reaction. This resulted in a number of seven PCR batches that were processed at the same time, distributed over four DNA templates each and simultaneously amplified in the thermal cycler.
  • Table 2 Multiplex groups and PCR conditions of the microsatellite loci used.
  • Table 3 PCR conditions of separately amplified microsatellite loci
  • urea 18 g were dissolved in 17 ml of water, 12 ml of 5 ⁇ TBE buffer and 7.5 ml of acrylamide / bis solution 30% (29: 1). The solution was then filtered in a cellulose acetate filter and degassed using a water jet pump. The gel was poured immediately after the addition of 20 ⁇ l TEMED and 300 ⁇ l 10% ammonium peroxodisulfate solution, free of air bubbles using a syringe. This was followed by a polymerization time of at least one hour, after which the gel was installed in the sequencer and the buffer chambers were filled with 1 ⁇ TBE buffer.
  • the gels were 0.2 mm thick, the distance between the pockets into which the samples were applied and the detection unit was 36 cm. Before pouring the gel, a gel pocket comb with 96 shark teeth was placed between the glass plates. Thus there were 96 pockets per gel for the application of the samples. PREPARATION OF THE SAMPLES Depending on the combinability of the microsatellites, the products of up to four PCRs, corresponding to up to seven microsatellites, were applied simultaneously. From the PCR products to be determined, 1 to 4 ul with 10 ul loading buffer, which was mixed with internal length standards, mixed and denatured for 4 min at 95 ° C. After the mixture had cooled (RT), the gel was loaded with 1 ⁇ l of the samples per lane with a special eight-fold pipette.
  • the PCR products were separated electrophoretically in denatured form in vertically attached polyacrylamide gels and detected automatically.
  • the ABI PRISM 377 DNA Sequencer was used. If a fluorescence-labeled DNA fragment hits the area of the laser, it is excited to emit fluorescent radiation.
  • the light signals generated are prismatically split in a concave mirror, recorded by a camera and stored as a digital signal.
  • the sequencer offered the possibility to change the temperature control, as well as variable separation systems with different separation distances and running speeds.
  • the parameters used for the electrophoresis were 3000 V, 50 W and 60 mA at a gel temperature of 51 ° C.
  • microsatellite fragments were detected with a laser strength of the argon laser of 40 mW.
  • Four dyes were analyzed simultaneously per lane: 6Fam-, Tet- and Hex-labeled primers.
  • a primer labeled with Tamra was used for the internal standard fragments.
  • the odd gel pockets were first loaded, the electrophoresis was started for 5 min so that the samples could run into the gel, then the even pockets were loaded and the run started.
  • the duration of the electrophoresis varied between 3 and 5 hours depending on the expected size of the fragments.
  • An internal length standard was used to determine the fragment lengths of the applied PCR products. This standard was produced by amplifying fragments of the vector pGEM-4Z at defined lengths by means of the PCR. An external standard was given by an animal that remained unchanged on all gels and was typed with the same markers as the examined population. This so-called - Golden Standardie was used to compare the four family gels with each other.
  • the polyacrylamide gels were evaluated using the GeneScan 3.0 and Genotyper 2.1 (Applied Biosystems) evaluation programs. The GeneScan program made it possible to analyze the entire gel image. It was checked manually whether the detected fragments were assigned to the correct lanes, if necessary a correction was made. Furthermore, traces that run into one another could be excluded from further analysis at an early stage. Electropherograms were generated with the Genotyper 2.1 software and visually evaluated in the form of a table after the data had been output.
  • the sex of the spreading piglets was determined genetically by means of a multiplex-PCR.
  • a Y chromosome-specific product of the SRYB gene was detected in 173 of 246 piglets examined.
  • the gender was subsequently changed from male to female. This was done against the background that when analyzing microsatellites in the non-pseudoautosomal region of the sex chromosomes it was expected a priori that male animals would behave as if they had a zero allele because they only have one X chromosome.
  • For the two offspring from six non-pseudoautosomal markers each four times - a heterozygous genotype was determined at different loci. The change occurred on the basis of this observation.
  • Table 4 Number of typed microsatellites and heterozygous loci per family
  • microsatellites Two microsatellites were typed, for which all eight boars were homozygous. These were Sw749 on Sscr 9 and S0355 on Sscr 15. At nine genotyped microsatellites were excluded from the analysis due to typing errors. No null alleles have appeared on the autosomes in this study. In all six microsatellites in the non-pseudoautosomal region, the males were, as expected, homozygous. Accordingly, the X-chromosomal microsatellites Sw707, Sw980, Sw2470, Sw2476, Sw2534 and Sw2588 were assigned an allele marked by - 10, which was therefore considered to be undetectable. A pedigree check was carried out successively taking into account all typing results. Only seven piglets were identified, which could not be assigned to any of the examined boars and were excluded from further analysis.
  • the fragment lengths were determined partially automatically. After the electronic output in the form of a table, each allele was visually checked. The fragment lengths of the microsatellites were between 71 and 326 bp. The smallest distance between the alleles was 1 bp. The number of alleles on the 133 loci of the autosomes varied between 2 and 11, with an average of 5.2 per microsatellite. Nine microsatellites were typed on the gonosomes, three in the pseudoautosomal region, with an average of 5.3 alleles per locus. The six microsatellites in the non-pseudoautosomal region had an average of 3.1 alleles. The observed degrees of heterozygosity (total Hb, boar, sows), the underlying number of genotyped parents and the number of alleles per locus are shown in Table 5.
  • Table 5 Number of typed parent animals (n), number of alleles and observed degree of heterozygosity (Hb) (Hb boar, sows, total) of the examined microsatellite loci
  • Example 2 Marker cards and information content of the marker loci
  • CRI-MAP uses a maximum likelihood approach and the Kosambi-
  • the co-informative meiosis was derived with the Fortran program - futurejr.
  • the co-informative meiosis always refer to the interval between two neighboring markers.
  • the genetic maps for the chromosomes Sscr 7 and 16 were created approximately because it was not possible to use the CRI-MAP 2.4 program (GREEN et al., 1990) to mark all of these
  • a coupling card for Sscr 7 and 16 was then created from these cards.
  • the eight boars were assigned a hypothetical genotype that corresponded to two non-detectable alleles.
  • the paternal allele was defined as if it behaved like a null allele.
  • the male offspring remained unchanged, since only the maternal allele was detectable anyway.
  • the typified sows also remained unchanged.
  • FIGS. 1, 2 and 3 show the female, combined and male coupling cards of the chromosomes Sscr 3, 5 and 11.
  • Table 6- position (cM) (comb.) Of microsatellites on the combined, which we i bl i chen (female.) And male (male).
  • the information content lies between the values zero and one.
  • the value one implies that the boar of the family under consideration is heterozygous and that the derivation of the paternal allele is clear for all offspring. This ideal case can hardly be achieved under practical conditions.
  • the number of coinformative meiosis shows a dependency of the information content on the number of typed microsatellites, this is particularly reflected in markers that are arranged on the edges of the chromosomes. In these, the number of coinformative meiosis to neighboring markers is lower than for centrally placed markers, so that the information content of the first and last markers on a chromosome is usually lower.
  • Table 7 Chromosome-wide mean, minimum and maximum of the information content on the coupling map
  • a non-parametric maximum likelihood method was used for the analysis of characteristic-associated haplotypes, without assumptions about the inheritance of the characteristic (REINSCH, 2002). The principle of the evaluation is explained in the following. Assuming a paternal half-sibling family and a boar heterozygous at the disease locus (alleles D, d) with two flanking markers, a distinction can be made between four different types of offspring (types 1 to 4), assuming that all offspring are informative. If only a single marker is considered under otherwise identical conditions, two types of offspring (types 5 and 6) can also be distinguished.
  • the probability of error increased continuously on both sides of the region shown for chromosome Sscr 5 in FIG. 7 (positions 25 to 95 cM), the course of the test statistics decreasing.
  • the flanking microsatellites are Sw1468 at position 74.1 cM and Sw1200 mapped at position 88.2 cM of the combined map.
  • the interval between the flanking markers was 19.5 cM.
  • the flanking markers at this position are S0182 at position 18.7 cM and S0071 at position 25.0 cM on the combined map.
  • the flanking marker interval was 6.3 cM.
  • the markers are shown below: Sw1468, Sw1200 for chromosome 5 and S0182, S0071 and S0230 for chromosome 11.
  • the identified alleles are each identified by the letters N, G and R.
  • N neutral
  • H neutral
  • G (healthy) stands for alleles that are more likely not to be affected by the spreader syndrome.
  • R (risk) stands for alleles from which there is an increased risk of being affected by the spreading syndrome.
  • chromosome 5 On chromosome 5, a total of 5 alleles (141, 145, 147, 149 and 153 bp) could be identified for the microsatellite Sw1468 in the examined population. For allele 5 (153 bp), an increased risk of contracting the spreading syndrome can be represented.
  • N neutral allele
  • R risk allele On chromosome 5, a total of 6 alleles (142, 150, 152, 154, 156 and 158 bp) for the microsatellite Sw1200 could be identified in the examined population. For the allele 154 bp, an increased risk of contracting the spreading syndrome can be represented.
  • Chromosome 11 identified a total of 4 alleles (184, 186, 188 and 191 bp) for the microsatellite S0071 in the examined population. Piglets with the first allele (184 bp) carry an increased risk of being affected by the disease "spreader".
  • N : neutral allele
  • R risk parallel
  • Table 9 Multiplex groups and PCR conditions of separately amplified microsatellite loci
  • Table 10 shows the primer sequences used for the 21 microsatellite loci examined. According to the results presented so far, the primers were fluorescently labeled at the 5 'end of the forward primer. The respective marking can be found in Table 9. Table 10: Primer sequences of the examined microsatellite loci
  • Sw310 5 cagaaggatgaatatgcaaaatg gtctttcaggcttggaggg
  • Swr426 5 cctacatatg ccg caggtg gtgtcttgagaagtggggaagggactc
  • Table 12 Chromosome, maximum of the test statistic ( ⁇ 2 ), point-by-point probability of error ( ⁇ -comparisonwise), position (cM) and derived LOD score
  • flanking chromosome area around the marker Sw1200 has a significant influence even after the inclusion of the new typing results.

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Abstract

Verwendung einer ersten Nukleinsäure zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des Phänotypus "Spreizbeinigkeit" in einem Säuger/Geflügeltiere, wobei die erste Nukleinsäure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsäure, die vorkommt, auf Chromosom 5 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder auf Chromosom 11 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071, Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des 20 Merkmals "Spreizbeinigkeit" in Säuger/Geflügeltieren, vorzugsweise in Haus-, Zucht- oder Nutztieren, wobei man die Säuger/Geflügeltieren.

Description

Genetische Marker für die Diagnose der Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" bei Haus-, Zucht- und Nutztieren
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer ersten Nukleinsaure zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des Phänotypus „Spreizbeinigkeit" in einem Säuger/Geflügeltiere, wobei die erste Nukleinsaure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsaure, die vorkommt auf Chromosom 5 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder auf Chromosom 11 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 , Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des Merkmals „Spreizbeinigkeit" in Säugern/Geflügeltieren, vorzugsweise in Haus-, Zucht- oder Nutztieren, wobei man die Säuger/Geflügeltiere, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, oder deren Sperma auf die Anwesenheit, Beschaffenheit oder Ausprägung der oben genannten zweiten Nukleinsaure testet. Schließlich betrifft die Erfindung ein Kit, mindestens enthaltend ein Primerpaar zur Amplifikation einer der oben genannten zweiten Nukleinsaure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang der Nukleinsaure bindet, oder eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden die an eine der oben genannten zweiten Nukleinsäuren bindet, oder einen spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment, das an die zweite vorstehend offenbarte Nukleinsaure bindet.
Erblich bedingte Anomalien stellen einen ökonomischen Verlust bei der Produktion von Zuchtschweinen sowie bei der Ferkelproduktion dar. Der ökonomische Schaden einzelner Geburtsfehler ist abhängig von der Häufigkeit der Merkmalsträger in der Population sowie den durch Erbfehler entstehenden Behandlungskosten und geringeren Zunahmen (STIGLER et al., 1991). Innerhalb der Gruppe der Geburtsfehler und erblichen Anomalien wird das kongenitale Ausgrätschen beim neugeborenen Ferkel (nachfolgend als Spreizersyndrom bezeichnet) als die am häufigsten auftretende Funktionsstörung beschrieben (PARTLOW et al:, 1993). Die Anomalie äußert sich über eine eingeschränkte Beweglichkeit der betroffenen Tiere und einer charakteristischen gespreizten Stellung zumeist der Hinterextremitäten, was dazu führt, daß die Ferkel die Zitzen nur schwer erreichen können und Fluchtreaktionen verzögert sind.
Die Entwicklung molekulargenetischer Methoden, besonders die Entdeckung der Mikrosatelliten als polymorphe Marker, hat es ermöglicht, die molekulargenetischen Grundlagen vieler wirtschaftlich wichtiger Merkmale und Erbdefekte zu identifizieren. Die Zahl der genetisch kartierten Loci beim Schwein beträgt zur Zeit (Rothschild, 2001) ungefähr 2000 Marker und Gene. Dies ermöglicht eine genomweite Suche nach Genomregionen, die Einfluss auf das betrachtete Merkmal ausüben. Eine große Anzahl von Untersuchungen wurden und werden im Hinblick auf Merkmale wie Reproduktionsleistung, Mastleistung und Schlachtkörperwert, Fleischqualität, Krankheitsresistenz, Immunantwort und andere Merkmale durchgeführt.
In den "letzten zehn Jahren hat sich die Genkartierung beim Schwein rasch entwickelt. Dies war hauptsächlich die Leistung von drei Forschergruppen, nämlich in Europa das PiGMaP-Programm (Archibald et al. 1991; Archibald et al. 1995; Yerle et al. 1997) und das nordische Konsortium (Ellegren et al. 1994; Marklund et al. 1996) und in den USA das Meat Animal Research Center des US Department of Agriculture (USDA) (Rohrer et al. 1994). Genetische Karten werden durch Kopplungsanalysen erstellt (Matise, T.C., Perlin, M. and Chakravarti, 1994: Automated construction of genetic linkage maps using an expert System (MultiMap): a human genome linkage map. Nature Genetics, 6:384-389). Dafür sind zwei Voraussetzungen erforderlich, nämlich eine Tierpopulation mit bekannter Abstammung (Familienstruktur) und zahlreiche polymorphe Loci (Archibald and Haley 1998). Als polymorphe Loci kommen molekulargenetische Marker in Frage (Jarne and Lagoda 1996; Hui Liu 1998; Luikart and England 1999). Ein molekulargenetischer Marker kann definiert werden als ein Abschnitt des Erbmaterials, der eine bestimmte Eigenschaft hat oder hervorruft. Es handelt sich dabei um einen gekennzeichneten Locus, der von Generation zu Generation vererbt wird (Nagel 1996; CTBrien et al. 1999). Dass man die molekulargenetischen Marker relativ einfach identifizieren kann und dass sie zahlreich zur Verfügung stehen, sind Vorteile gegenüber anderen Markersystemen wie biochemischen oder immunologischen Markern. Die Genomanalyse beim Hausschwein wird hauptsächlich von zwei molekularen Markertypen dominiert. Diese Markertypen sind Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) und Mikrosatelliten (Jarne and Lagoda 1996; Montaldo and Herrera-Meza 1998). Die meisten RFLPs sind diallelisch und haben nach Hui Liu (1998) im Vergleich mit Mikrosatelliten niedrige PIC-Werte (Polymorphism Information Content). Darüber hinaus ist die Darstellung von RFLPs zeit- und kostenaufwendig (Botstein et al. 1980; Winter et al,1992; Yue 1999). Mikrosatelliten dagegen sind zahlreich vorhanden und haben hohe PIC- Werte. Etwa 65.000 bis 100.000 Mikrosatellitenloci sind im Schweinegenom gleichmäßig verteilt (Ellegren 1993; Schlötterer 1997; Dounavi 2000). Die Identifizierung von Mikrosatelliten wird von verschiedenen Labors durchgeführt, die Zahl von identifizierten Mikrosatelliten beträgt 1286 (Stand 05.03.2001).
Bei Genotypisierungen oder Genomscreening-Verfahren wird festgestellt, ob das Vorhandensein bestimmter polymorpher Abschnitte der DNA oder spezifischer
Allele eines Gens mit der Vererbung oder Ausprägung eines Phänotyps korreliert
(Assoziation). Hierbei kann man davon ausgehen, dass mit dem Merkmal assoziierte polymorphe DNA in Nachbarschaft des für den Phänotyp verantwortlichen Gens gelegen ist und dadurch, mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit, gemeinsam mit diesem vererbt wird. Werden zwei oder mehrere polymorphe Marker mit hoher Frequenz gemeinsam vererbt, so definieren sie einen quasi-stabilen genetischen „Haplotyp". Die Assoziation eines spezifischen
Haplotyps mit einem Phänotyp (z.B. dem der „Spreizbeinigkeit") kann als diagnostischer oder prognostischer Marker Verwendung finden, der es ermöglicht, Aussagen über die Wahrscheinlichkeit des Auftretens oder über die Vererbung eines Phänotyps zu treffen. Hierbei gilt zu bedenken, dass solche prognostischen oder diagnostischen Nachweisverfahren unabhängig sind von der Identifizierung des Phänotyp-verursachenden Gens. Dies ist bedeutend, da die Etablierung der molekularen Grundlagen eines Phänotyps oft sehr schwierig und arbeitsaufwendig ist, insbesondere im Zusammenhang mit multifaktoriell-bedingten Phänotypen. Eine geringe Anzahl von Merkmalen von Schweinen und anderen Säugern oder Geflügeltieren können mit Hilfe von genetischen Markern vorhergesagt werden. Es gibt bis heute allerdings keine Möglichkeit, eine Prädisposition zur Vererbung oder Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" nachzuweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Methoden und Verfahren zur Verfügung zu stellen, durch die Tiere identifiziert werden können, die zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" prädisponiert sind oder eine solche Prädisposition vererben. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung die Verwendung einer ersten Nukleinsaure zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des Phänotypus
„Spreizbeinigkeit" in einem Säuger/Geflügeltiere, wobei die erste Nukleinsaure eine
Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsaure, die vorkommt auf Chromosom 5 des
Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2,
Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1 , S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310,
Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder auf Chromosom 11 des
Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer
-Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 , Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486.
Die oben offenbarte zweite Nukleinsaure ist vorzugsweise genomische DNA oder cDNA, kann aber auch ein RNA Transkript dieser DNA sein. Genomische DNA und cDNA sind meist doppelsträngig, die erfindungsgemäße Verwendung umfasst aber auch einzelsträngige DNA Moleküle. Die erste Nukleinsaure ist bevorzugt ein Oligonukleötid, kann aber in bestimmten Ausführungen auch ein Polynukleotid sein. Sie ist bevorzugt DNA, kann aber auch RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat wie z.B. PNA sein. Als Primer in PCR- oder Sequenzierreaktionen hat die genannte erste Nukleinsaure üblicherweise eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 18 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt mindestens 21 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt mindestens 25 Nukleotiden. Bei einer Verwendung als Hybridisierungssonde z.B. im Southern Blot kann die erste Nukleinsaure aber auch bis zu 50 Nukleotide, stärker bevorzugt bis zu 100 Nukleotide, noch stärker bevorzugt bis zu 1000 Nukleotide und am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotide lang oder länger sein. In manchen Fällen umfasst die erste oder zweite Nukleinsaure ganze Gene oder sogar Gruppen von Genen. In diesen Fällen hat die erste oder zweite Nukleinsaure eine Länge von bis zu 1000 Nukleotiden, vorzugsweise bis zu 5000 Nukleotide, beispielsweise bis zu 25000 Nukleotide, wie bis zu 150000 Nukleotide.
Als Hybridisierungssonde sind solche Nukleinsäuren zu verstehen, die in einer Hybridisierung verwendet werden und hierbei an homologe Nukleinsäuren binden. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssonde eine radioaktiv-markierte Nukleinsaure oder sie enthält modifizierte Nukleotide. Die Erfindung umfasst auch solche Abwandlungen der vorliegend beanspruchten Nukleinsäuren,
Hybridisierungssonden und Primer, die mit den zweiten Nukleinsäuren, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, hybridisieren. Unter höher- oder hochstringenten Hybridisierungsbedingungen werden im Sinne dieser Erfindung beispielsweise 0,2- 0,5 x SSC (0,03 M NaCI, 0,003M Natriumeitrat, pH 7) bei 65°C verstanden. Bei kürzeren Fragmenten, beispielsweise Nukleinsäuremoleküle aus bis zu 20 Nukleotiden, liegt die Hybridisierungstemperatur unter 65°C, beispielsweise bei über 55°C, bevorzugt über 50°C. Stringente Hybridisierungstemperaturen sind abhängig von der Größe bzw. Länge der Nukleinsaure und ihrer Nukleotidzusammensetzung und sind vom Fachmann durch Handversuche zu ermitteln. Üblicherweise enthält die zur Hybridisierung verwendete Lösung ein Detergenz wie z.B. SDS in einer Konzentration von 0.1 % bis 0.5% und eine Sammlung unspezifischer Nukleinsäuren zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen. Die Grundprinzipien der Hybridisierung und die Anforderungen an eine Hybridisierungssonde sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Beispielsweise sei hier auf Maniatis, et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982 oder Harnes und Higgins, Nucleic acid hybridisation: a practical approach, IRL Press, Oxford 1985 verwiesen.
Als „Prädisposition" bezeichnet man das Vorhandensein einer Erbanlage, die gegebenenfalls in einer Vererbung der Erbanlage und/oder einer Ausprägung eines
Merkmals resultieren kann. Unter dem Merkmal "Spreizbeinigkeit" und den
Synonymen wie „Spreizer" versteht der Fachmann die angeborene Unfähigkeit von
Tieren, stehen und laufen zu können. Das Spreizen neugeborener Tiere manifestiert sich als eine graduell unterschiedliche, zeitlich begrenzte Parese der Extremitäten, zumeist der Hinterextremitäten mit Adduktionsschwäche, die zum seitlichen
Abspreizen führt. Aufstehen und Laufen ist somit bei den betroffenen Tieren erschwert oder nicht möglich. Von der Krankheit sind ausschließlich neugeborene
Tiere betroffen. Die Symptome dieser Stellungsanomalie zeigen sich während des ersten Lebenstages bzw. die betroffenen Tiere werden hiermit geboren (BOLLWAHN und KRUDEWIG, 1972).
Bezogen auf die Kopplungskarte des US Meat and Animal Center (Rohrer et al., 1996 Genome Research 6: 371-391 , http://www.genome.iastate.edu/ maps/index.html), die anhand von über die Geschlechter gemittelten Rekombinationsraten erstellt wurde, ist Mikrosatellit SW1468 an Position 97,5cM gelegen, SW2 an Position 78,7cM auf Sscr 5 gelegen, SW1200 an Position 114,3cM auf Sscr 5 gelegen, SW2425 an Position 72,3cM auf Sscr 5 gelegen, SW995 an Position 125,0cM auf Sscr 5 gelegen oder IGF1 an Position 118,7cM auf Sscr 5 gelegen. Zur Erweiterung der Untersuchung wurden zusätzliche Mikrosatelliten-Loci bestimmt, die auf den Chromosomen 5 und 11 gelegen sind; hierzu wurde eine kombinierte Länge der nicht-pseudoautosomalen Marker mit dem Programm CRI-MAP (Green et al., 1990) für das untersuchte Genom ermittelt. Die integrierten Positionen (cM) der neu untersuchten Markerloci, entlang der kombinierten Karten sind in Beispiel 5 und Spalte 3 von Tabelle 11 dargestellt und sind wie folgt: S0005 an Position 64,4cM auf Sscr 5, Sw963 an Position 68,6cM auf Sscr 5, Sw1987 an Position 75,2cM auf Sscr 5, S0018 an Position 79,5cM auf Sscr 5, Sw904 an Position 81 ,8cM auf Sscr 5, Sw310 an Position 83,3cM auf Sscr 5, Swr1974 an Position 83,9cM auf Sscr 5, Swr426 an Position 84,4cM auf Sscr 5, Sw1094 an Position 85,5cM auf Sscr 5, Sw986 an Position 105,3cM auf Sscr 5 und Sw1982 an Position 107, 1cM auf Sscr 5. Die folgenden Positionsangaben beziehen sich auf die Karte von US Meat and Animal Center (Rohrer et al., 1996 Genome Research 6: 371-391): S0182 ist an Position 33,0cM auf Sscr 11 gelegen, S0071 ist an Position 43,7cM auf Sscr 11 gelegen, SW2008 ist an Position 14,1 cM auf Sscr 11 gelegen, SW435 ist an Position 53,3cM auf Sscr 11 gelegen, S0009 ist an Position 60,3cM auf Sscr 11 gelegen, undS0230 ist an Position 56,4cM auf Sscr 11. Zusätzlich wurde die Position von Sw486 an Position 40,3cM auf Sscr 11 ermittelt, wie in Beispiel 5 dargestellt. Da genetische Kartierungspositionen populationsabhängig sind, ist diese Positionsangabe Schwankungen unterworfen, die den Fachmann jedoch in Kenntnis der erfindungsgemäßen Lehre ohne weiteres zur Umsetzung derselben , befähigen. Der Bereich „Mikrosatellit SW1468 auf Chromosom 5 des Schweins" bezeichnet eine für eine Population spezifische Position auf Chromosom 5 und umfasst DNA-Abschnitte 5cM stromaufwärts und/oder stromabwärts der angegebenen Position, vorzugsweise bis zu 10cM stromaufwärts und/oder stromabwärts, stärker bevorzugt bis zu 20cM stromaufwärts und/oder stromabwärts und am meisten bevorzugt bis zu 30cM stromaufwärts und/oder stromabwärts der angegebenen Position auf dem Chromosom. Entsprechendes gilt für die weiteren genannten Mikrosatelliten. Ist der Mikrosatellit entständig, d.h. am Ende des Chromosom gelegen, insbesondere weniger als 30cM vom Ende entfernt, so kann der stromaufwärts oder stromabwärts gelegene Bereich auch kürzer als 5cM sein.
Die vergleichenden Genomkarten zwischen verschiedenen Spezies beruhen auf der Kartierung eines oder mehrer Loci im Genom der betreffenden Spezies. „Homologe Position" bezeichnet Nukleinsäureabschnitte im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, die über die gesamte Sequenzlänge oder in spezifischen hierin gelegenen Genen oder an einem oder mehreren Loci oder Teilen davon mit mindestens 100 Nukleotiden Länge eine Sequenzidentität mit der oben offenbarten zweiten Nukleinsaure, von mindestens bevorzugt 40%, stärker bevorzugt mindestens 50%, noch stärker bevorzugt mindestens 75% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität aufweisen. Die Sequenzidentität wird vorzugsweise durch die FASTA, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) oder Bestfit Algorithmen des GCG-Sequenzanalyseprogramms bestimmt (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Madison, Wl 53711). Bei der Verwendung von Bestfit werden die Parameter vorzugsweise so eingestellt, dass der prozentuale Anteil der Identität über die gesamte Länge der Referenzsequenz berechnet wird und Homologielücken („gaps") von bis zu 5% der Gesamtzahl der Nukleotide erlaubt sind. Bei der Verwendung von Bestfit werden die sogenannten optionalen Parameter vorzugsweise bei ihren voreingestellten Werten belassen.
Der Begriff „im wesentlichen identisch" bedeutet im Sinne dieser Erfindung, dass beispielsweise in einem Bereich von 8 Nukleotiden 7 Nukleotide identisch sind. Allerdings schließt die Erfindung auch solche Ausführungsformen ein, bei denen 4, 5 oder 6 der 8 Nukleotide mit der entsprechenden Sequenz der zweiten Nukleinsaure identisch sind. Dabei kann die erste Nukleinsaure mit dem + Strang oder dem - Strang identisch oder im wesentlichen identisch sein.
Der Begriff „einer ersten Nukleinsaure" schließt im Sinne der Erfindung auch ein, dass mehr als eine (erste) Nukleinsaure in der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden kann. Dies können zum Beispiel zwei, drei oder vier Nukleinsäuren sein. Ferner kann der Begriff „zweite Nukleinsaure" sowohl den + Strang wie auch den -Strang bedeuten. Sofern zwei erste Nukleinsäuren mit der zweiten Nukleinsaure identisch oder im wesentlichen identisch sind, kann die eine erste Nukleinsaure mit dem + Strang identisch oder im wesentlichen identisch sein während die andere ersten Nukleinsaure mit dem - Strang identisch oder im wesentlichen identisch sein kann. In diesem Fall ist bevorzugt, dass die „Ausrichtung" der ersten Nukleinsaure gegenläufig ist, was die Durchführung einer PCR ermöglicht.
Anomalien wie die der Spreizbeinigkeit können, je nach Population, einen deutlich negativen Einfluss auf das betriebsökonomische Ergebnis in der Tierzucht- und Produktion haben, da sie in der Regel zum Ausschluss einer Zuchtsau führen. Mit der Erfindung werden erstmals Nukleinsäuren bereitgestellt, die eine gezielte molekularbiologische Diagnosestellung der Prädisposition zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" erlauben. Durch die hier offenbarte Erfindung kann der Zeitpunkt der Selektion deutlich nach vorne verlagert werden, so dass nicht mehr auf die phänotypische Ausprägung des Merkmals gewartet werden muss. Zusätzlich kann die Einführung von molekularbiologischen Markern eine deutliche Effizienzsteigung des Selektionsprozesses bewirken. Dabei beinhaltet dieser Selektionsprozess die Bestimmung des Genotypen des Probanden/Säugers an einem oder mehreren Loci in einem Bereich der oben genannten zweiten Nukleinsäuren, bevorzugt in zwei Bereichen, mehr bevorzugt drei, noch mehr bevorzugt vier, stärker bevorzugt fünf, am stärksten bevorzugt in sechs Bereichen und die Bewertung eines Individuums als zur Zucht geeignet oder nicht geeignet unter Einbeziehung von Informationen über die Kopplungsphase zwischen dem genotypisierten Markerlocus und den für die Defektausprägung verantwortlichen Genen. Beispielsweise können sich die Genotypen von geeigneten und ungeeigneten Säugern/Geflügeltieren durch eine unterschiedliche Kopienanzahl einer repetitiven Nukleotidsequenz innerhalb des betrachteten Mikrosatellitenlocus unterscheiden. Diese unterschiedliche Beschaffenheit der Nukleinsaure kann mit Hilfe von geeigneten Primern in einer PCR Reaktion dargestellt werden und schlägt sich in unterschiedlichen PCR-Produktgrößen und/oder unterschiedlichen Restriktionsfragmentlängen nieder. Die Tests werden üblicherweise an Gewebeproben des Säugers oder der Geflügeltiere, an Eizellen, oder an Proben von Körperflüssigkeiten wie Sperma, Urin, Milch, Blut, Tränenflüssigkeit und weiteren Sekreten durchgeführt. Diese können dem Tier vor der Diagnose entnommen werden.
Selbstverständlich kann eine molekularbiologische Charakterisierung der Prädisposition zur Vererbung oder Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" auch für den Menschen von besonderem Interesse sein. So ist vorstellbar, dass die Identifizierung einer Prädisposition zur Vererbung oder Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" zu neuen therapeutischen Ansätzen gegen diesen Defekt führt.
Als charakteristische Symptome der Erkrankung können nach derzeitigem
Kenntnisstand eine Anreicherung des extramyofibrillären Raums mit Glykogen anstelle von kontraktilen Elementen, ein erhöhter Gehalt an Kalzium in dem
Muskeln der Hinterextremitäten und des Rückenmarks, eine gesteigerte Permeabilität der Muskelzellmembran sowie eine Störung des Cholinmetabolismus angesehen werden. Diese Beobachtungen resultieren in einer Unreife der Muskulatur zum geburtsnahen Zeitpunkt sowie einer neuromuskulären Funktionsstörung betroffener Ferkel. Die Ätiologie des Merkmals kann hinsichtlich der teilweise widersprüchlichen Befunde noch nicht als geklärt angesehen werden.
Die Erblichkeit des Merkmals sowie existierende Rassenunterschiede wurden mehrfach nachgewiesen. Als besonders anfällig können die Landrasse und Pietrain angesehen werden; zwei Rassen, die in der Vergangenheit stark züchterisch bearbeitet wurden, die Landrasse überwiegend als Mutterlinie auf Fruchtbarkeit und Pietrain als typische Vaterrasse auf einen hohen Fleischanteil. Aus dieser Beobachtung wurde gefolgert, daß indirekt eine Kontraselektion im Hinblick auf das Syndrom praktiziert wurde (MAASS und SCHULZE, 1979; KOLB, 2002). Trotz einer Vielzahl von Untersuchungen ist es bislang nicht gelungen, den Erbgang und die Pathogenese des Syndroms Spreizer aufzuklären. Das Merkmal ist vermutlich stark geschlechtsbeeinflußt (SELLIER und OLLIVIER, 1982), ohne daß eine Geschlechtskopplung vorliegt. Neuere Ergebnisse von Untersuchungen zum Erbgang STIGLER et al., 1991 ; THALLER et al., 1996) sind widersprüchlich und basieren auf Analysen ohne Berücksichtigung eines Geschlechtseffektes. Als gesichert kann nur gelten, daß der Erkrankung kein einfacher mendelscher Erbgang zugrunde liegt.
Aufgrund der gesichteten nicht-genetischen und morphologischen Befunde in der Literatur kann das Syndrom Spreizer als ein Paradebeispiel für eine komplexe genetische Erkrankung betrachtet werden. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Patentanmeldung ein Genomscan an Ferkeln, die an dem Syndrom Spreizer erkrankt sind, beschrieben. Es wurden somit, aufgrund der berechneten Positionen bekannter Markerloci, die unbekannten Krankheitsloci auf einen möglichst kleinen chromosomalen Bereich eingegrenzt. Hierfür wurden eine Reihe von molekularbiologischen aber insbesondere auch statistischen Methoden verwendet. Da der Erbgang bisher nicht bekannt ist, wurde für die statistische Analyse eine nicht-parametrische Auswertung durchgeführt, d. h. es wurden keine Annahmen über den Erbgang des Merkmals gemacht. Das Ziel von statistischen Methoden ist der Nachweis von Kosegregation eines Markerallels mit dem Merkmal in einer Familie. Dabei lassen sich die dafür verwendeten Verfahren, die zur Kartierung von Krankheiten korrelierten Genen eingesetzt werden, grundsätzlich in zwei Kategorien gliedern:
Diese Verfahren unterstellen die genaue Kenntnis des vorliegenden Erbgangs, die Frequenz des Krankheitsalleis und der Penetranz des Merkmals. Die parametrische
Kopplungsanalyse stellt das klassische Verfahren zur Kopplungsanalyse dar. In der ursprünglichen Form basiert dieses Verfahren auf der Beobachtung und
Bestimmung von rekombinanten und nicht-rekombinanten Nachkommen innerhalb einer Familie, zur Schätzung der Rekombinationsrate . zwischen Marker und Phänotyp. Die Rekombinationsrate ergibt sich dabei aus dem Quotient der Anzahl beobachteter Rekombinanten dividiert durch die Zahl der möglichen Meiosen. Der statistische Test prüft im folgenden ob die Rekombinationsfrequenz signifikant kleiner ist als 0,5 (Eiston, 1998, Ott, 1999). Dagegen unterstellen Nicht-parametrische Verfahren zur Kopplungsanalyse kein spezifisches Vererbungsmodell und werden daher auch oft als modellfreie Verfahren bezeichnet. Für die Analyse merkmals-assoziierter Haplotypen wurde eine nicht-parametrische Maximum-Likelihood-Methode angewendet (Reinsch, N. (2002): A general likelihood approach to trait-based multipoint linkage analysis in large groups of half-sibs and super sisters. Genetics, 162: 413-424). Die Wahrscheinlichkeit, das bestimmte väterliche Markerhaplotypen in den Nachkommen beobachtet werden, wurde analysiert. Der Unterschied zu klassischen QTL-Analysen besteht darin, dass in diesem Verfahren die Frequenz der väterlichen Haplotypen in den Nachkommen die abhängige Variable ist. Die Markerhaplotypen hängen ab von der Rekombinationsrate zwischen Marker und Risikogen sowie vom Parameter c. Parameter c ist der relative Anstieg in der Erkrankungswahrscheinlichkeit, in dem die Penetranz des Merkmals ihren Ausdruck findet. Unter der Nullhypothese entspricht c=1. Für die Halbgeschwisteranalyse bekam jede Familie zwei c-Werte, je einen für männliche und weibliche Nachkommen. Von der Erfindung umfasst werden weiterhin bevorzugte Ausführungsformen, wobei die oben offenbarte zweite Nukleinsaure ein Mikrosatellit ist oder eine diesen Mikrosatelliten flankierende Sequenz. In besonders bevorzugten Ausführungsformen liegt die Nukleinsaure im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1 , S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder auf Chromosom 11 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 , Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486. Die flankierende Sequenz liegt außerhalb der für den Mikrosatelliten typischen repetitiven Sequenzen und umfasst vorzugsweise einen Bereich von 1kB stromaufwärts bzw. stromabwärts der repetitiven Sequenzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt der Nachweis von zumindest einem Allel, wobei der Nachweis von zumindest einem Allel mit einer Länge von 153bp im Bereich von SW1468 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:5 und 6; 154bp im Bereich von SW1200 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:7 und 8; 141 bp im Bereich von S0182 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:23 und 24; 184bp im Bereich von S0071 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 15 und 16; 300bp im Bereich von S0230 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:19 und 20; oder 311 bp im Bereich von S0230 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 19 und 20; in Schweinen der Deutschen Landrasse auf ein Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit" hinweist. Unter dem Begriff „Allel" versteht der Fachmann eine Serie von zwei und mehr Varianten eines spezifischen chromosomalen Genabschnitts. Einen weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft die Verwendung der oben genannten Nukleinsäuren, wobei zwei oder mehr Allele nachgewiesen werden. Selbstverständlich kann der Nachweis auch mit einem oder mehreren Primerpaare von SEQ ID 25/26, SEQ ID 27/28, SEQ ID 29/30, SEQ ID 31/32, SEQ ID 33/34, SEQ ID 35/36, SEQ ID 37/38, SEQ ID 39/40, SEQ ID 41/42, SEQ ID 43/44, SEQ ID 45/46, SEQ ID 47/48. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von zwei Primern, wobei die Primer in bezug auf die komplementäre DNA-Region gegenläufig orientiert sind und so, z.B., eine PCR-Amplifizierung ermöglichen.
Einzelne oder mehrere in der Nachbarschaft der oben aufgeführten Mikrosatelliten gelegenen Gene sind wahrscheinlich von entscheidender Bedeutung für die Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit". Dementsprechend ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die zweite Nukleinsaure ein spezifisches Gen oder ein Teil eines Gens. Hierbei sind bevorzugt die Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IGF1 , MYF5, MYF6, MYOD1 ,. SGC, Dystrophin (DMD), a-Dystroglykan, ß-Dystroglykan, , ß, γ, δ, und ε-Sarkoglykan, α1~, ß1- und ß2-Syntrophine, Dystrobrevin, Merosin, Sarkospan anzuführen, sowie alle weiteren in den oben offenbarten Nukleinsäuren gelegenen, hier aber nicht einzeln aufgeführten Gene. Gene oder Teile von Genen im Sinne der Erfindung können die kodierenden wie auch die nicht-kodierenden Abschnitte der DNA umfassen, also Introns, Exons und regulatorische Bereiche wie z.B. Promotoren oder andere Steuerungselemente der Genexpression. Darüber hinaus können erfindungsgemäß auch derartige Gene von flankierenden Sequenzen umgeben werden, die vorzugsweise einen Bereich von 1kB stromaufwärts bzw. stromabwärts von den Genen umfassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung weist die erste Nukleinsaure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden auf und ist identisch oder im wesentlichen identisch mit einer zweiten Nukleinsaure.
Hierbei entspricht die zweite Nukleinsaure einem Abschnitt von Chromosom 5 oder
Chromosom 11 des Schweins oder einer homologen Position im Genom anderer
Säuger/Geflügeltiere. Beim Schwein liegt die genannte Nukleinsaure auf Chromosom 5 im Bereich der Mikrosatelliten SW1468 oder SW1200 und auf
Chromosom 11 im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 oder S0230.
Auf Chromosom 5 des Schweins wurden erfindungsgemäß bei der untersuchten
Population der Deutschen Landrasse 5 Allele des Mikrosatelliten SW1468 identifiziert. Diese Allele sind charakterisiert durch ihre spezifische Länge von 141 , 145, 147, 149 und 153 bp. Ein Nachweis des Alleis mit 153bp korreliert mit einem erhöhten Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit". Des weiteren wurden in der untersuchten Population 6 Allele vom Mikrosatelliten SW1200 identifiziert. Diese Allele sind charakterisiert durch ihre spezifische Länge von 142, 150, 152, 154, 156 und 158 bp. Ein Nachweis des Allels mit 154bp korreliert mit einem Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit". Des weiteren wurden in der untersuchten Population 5 Allele vom Mikrosatelliten S0182 identifiziert. Diese Allele sind charakterisiert durch ihre spezifische Länge von 119, 132, 134, 139 und 141 bp. Ein Nachweis des Allels mit 141 korreliert mit einem Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit". Des weiteren wurden in der untersuchten Population 4 Allele vom Mikrosatelliten S0071 identifiziert. Diese Allele sind charakterisiert durch ihre spezifische Länge von 184, 186, 188 und 191 bp. Ein Nachweis des Allels mit 184bp korreliert mit einem Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit". Des weiteren wurden in der untersuchten Population 9 Allele vom Mikrosatelliten S0071 identifiziert. Diese Allele sind charakterisiert durch ihre spezifische Länge von 297, 300, 307, 309, 311 , 313, 315, 323 und 326 bp. Ein Nachweis des Allels mit 300bp oder 311bp korreliert mit einem Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit". Die hier aufgeführten Längenangaben beziehen sich auf Tiere der untersuchten Reinzuchtlinie der Deutschen Landrasse. In anderen Populationen können die Fragmentlängen jedoch von den genannten Fragmentlängen abweichen. Der Fachmann kennt jedoch Techniken die, ohne unzumutbaren Aufwand, zur Identifizierung homologer Allele in anderen Populationen des Schweins und anderer Säuge- und Geflügeltiere führen. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass auch diese Allele von der Offenbarung der vorliegenden Erfindung umfasst werden.
Dementsprechend erfolgt in einer weiteren besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ein Nachweis von zumindest einem Allel mit einer Länge von 153bp im Bereich von SW1468 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:5 und 6; 154bp im Bereich von SW1200 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:7 und 8; 141 bp im Bereich von S0182 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:23 und 24; 184bp im Bereich von S0071 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:15 und 16; 300bp im Bereich von S0230 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 19 und 20; oder 311bp im Bereich von S0230 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 19 und 20 und deutet in Schweinen der Deutschen Landrasse auf ein Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit". In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt der Nachweis von zwei, bevorzugt drei, stärker bevorzugt vier, noch stärker bevorzugt fünf und am stärksten bevorzugt sechs Allelen. Der Nachweis kann in separaten Reaktionen oder in sogenannten Multiplex-Reaktionen, die den gleichzeitigen Nachweis von Allel umfassen, stattfinden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft erfindungsgemäße Verwendung den Nachweis der offenbarten ersten oder zweiten Nukleinsäuren zur Selektion von Haus-, Zucht- oder Nutztieren mit fehlendem Merkmal „Spreizbeinigkeit". In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung sind die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Rind, Hund, Katze, Kaninchen, Büffel, Kamel, Alpaka, Nerz, Schwein, Huhn, Ente, Gans, Truthahn, Strauss, Ziege, Schaf, Pferd, Esel, Ratte oder Maus.
Es sei an dieser Stelle erneut darauf hingewiesen, dass sich die oben aufgeführten Längenangaben auf Tiere der untersuchten Reinzuchtlinie der Deutschen Landrasse beziehen. In anderen Populationen, bei anderen Spezies, können die Mikrosatelliten andere Allele aufweisen, die entweder kürzer oder länger sind. Mit der Angabe des Locus der mit der Vererbung und/oder Ausprägung des Merkmals „Spreizbeinigkeit" korreliert hat der Fachmann jedoch die Möglichkeit ohne unzumutbaren Aufwand die in einer Population vorhandenen Allele der hier offenbarten Mikrosatellitenmarker zu identifizieren. Darüber hinaus zeigt die hier vorliegende Erfindung auf welchem Wege solche Markerallele identifiziert werden, die mit einer Ausprägung oder Vererbung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" korrelieren. Diese können dann in Untersuchungen von Tieren aus anderen Populationen als Marker des Phänotyps eingesetzt werden. So kann der Fachmann mit Hilfe von Sequenzanalyse-Programmen solche Nukleinsäure-Abschnitte im Genom von anderen Tierpopulationen identifizieren, die einen Nukleinsäureabschnitt enthält, der homolog zu der oben genannten zweiten Nukleinsaure ist. Der so identifizierte homologe Lokus kann dann als Grundlage für weitere Untersuchungen dienen, mit deren Hilfe dann, an diesem Lokus gelegene, spezifische Allele identifiziert werden können, die mit dem Phänotyp „Spreizbeinigkeit" assoziieren, d.h. an diesen Phänotyp gekoppelt vererbt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Genomscreen an mehreren Säugern/Geflügeltieren einer Population durchgeführt. Der Begriff „mehrere Säuger/Geflügeltiere" umfasst mindestens zwei Tiere einer Population, bevorzugt mindestens 5 Tiere, stärker bevorzugt mindestens 10 Tiere, noch stärker bevorzugt mindestens 20 Tiere, stärker bevorzugt mindestens 50 Tiere, noch stärker bevorzugt mindestens 250 Tiere, am stärksten bevorzugt mindestens 1500 Tiere. Bei dem Genomscreen wird untersucht, ob eine Nukleinsaure von bis zu 5000 Nukleotiden Länge, bevorzugt bis zu 1000 Nukleotiden, mehr bevorzugt bis zu 350 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt bis zu 50 Nukleotiden, am meisten bevorzugt von mindestens 8 Nukleotiden Länge gemeinsam mit dem Merkmal „Spreizbeinigkeit" vererbt wird. Insbesondere wird hierbei geklärt, beispielsweise mit Hilfe von Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren, welches Markerallel gemeinsam mit dem Merkmal „Spreizbeinigkeit" vererbt wird. Eine gemeinsame Vererbung von Nukleinsäuren mit der phänotypischen Ausprägung des Merkmals „Spreizbeinigkeit" impliziert eine genetische Kopplung der Nukleinsaure an das Merkmal. Bevorzugte Marker sind Mikrosatelliten auf Chromosom 5 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1, S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder auf Chromosom 11 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 , Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486. Neben den genannten Mikrosatelliten können auch andere Nukleinsäuresequenzen als Marker verwendet werden, sofern sie im Sinne der Erfindung identisch oder im wesentlichen identisch sind mit der zweiten, in der Erfindung offenbarten Nukleinsaure oder in einem der oben genannten Nukleinsäurebereiche liegen.
Ausgehend von den in der Erfindung offenbarten Nukleinsäureabschnitten kann der Fachmann Nachweisverfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" ohne weiteres anwenden oder entwickeln. Die Erfindung offenbart auch Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" in Haus-, Zucht-, oder Nutztieren, wobei man die Tiere, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, deren Sperma, Gewebeproben oder Proben von Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Milch und Urin, auf die Anwesenheit, Ausprägung oder Beschaffenheit einer der oben genannten zweiten Nukleinsaure testet. Diese Testverfahren sind bevorzugt in vitro Testverfahren. Unterschiedliche „Ausprägungen oder Beschaffenheiten" von Nukleinsäuren können z.B. aufgrund von Insertionen, Duplikationen, Deletionen, Substitutionen oder Translokationen hervorgerufen werden. Insertionen oder Deletionen resultieren beispielsweise in einer geänderten Nukleinsäurelänge. Duplikationen sind ein üblicherweise bei der Generierung von Mikrosatelliten beobachtetes Phänomen. Dieser Längenpolymorphismus kann z.B. in einer PCR Reaktion dargestellt werden und schlägt sich bei Verwendung von geeigneten flankierenden Primern z.B. im Falle der Insertion in einem längeren PCR-Produkt nieder. Die unterschiedliche „Ausprägung oder Beschaffenheit" kann weiterhin auch z.B. eine nah verwandte Genvariante sein, die sich im Extremfall lediglich durch einen einzelnen Nukleotidaustausch von der verwandten Gensequenz unterscheidet. Derartige unterschiedliche „Ausprägungen oder Beschaffenheiten" der Nukleinsaure können gegebenenfalls mit Hilfe von RFLP-Analysen (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) oder durch
Nukleinsäuresequenzierung dargestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Rind, Hund, Katze, Kaninchen, Büffel, Kamel, Alpaka, Nerz, Schwein, Huhn, Ente, Gans, Truthahn, Strauss, Ziege, Schaf, Pferd, Esel, Ratte oder Maus. Neben den hier explizit aufgeführten Haus-, Zucht-, oder Nutztieren betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren aber auch andere Säugetiere, insbesondere den Menschen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine PCR Amplifikation mit komplementären Primern mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden durchgeführt, wobei ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer in entgegengesetzter Orientierung an den - Strang der zweiten Nukleinsaure bindet, oder es wird eine Hybridisierung durchgeführt, wobei eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden an die zweite Nukleinsaure bindet, oder es wird eine Sequenzierung der zweiten Nukleinsaure durchführt, oder es wird eine Detektion mit eine spezifischen Antikörper oder Antikörperfragment oder Antikörperderivat oder einem Aptamer durchführt, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat oder das Aptamer spezifisch gegen die zweite Nukleinsaure gerichtet ist. Im Speziellen wird hierbei zum Beispiel ein Antikörper verwendet, der gegen eine spezifische, erste Nukleinsäuresequenz gerichtet ist, eine zweite Nukleinsäuresequenz die sich von der ersten lediglich durch mindestens eine Mutation unterscheidet aber nicht bindet. Die spezifische, erste Nukleinsaure kann also, z.B. nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembran, mit Hilfe dieses Antikörpers nachgewiesen werden indem dieser Antikörper entweder selbst markiert ist oder mit Hilfe eines zweiten, markierten Antikörpers auf der Membran sichtbar gemacht wird. Eine ausbleibende Bindung an die Membran würde auf die Abwesenheit der ersten Nukleinsäuresequenz hinweisen.
In der PCR Reaktion bindet ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer in entgegengesetzter Orientierung an den - Strang der oben offenbarten zweiten Nukleinsaure. Im Reaktionsgemisch sind neben der oben genannten Nukleinsaure und einem Überschuss an Primern weiterhin vorhanden ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten sowie eine DNA Polymerase, z.B. Taq Polymerase. Bei geeigneten Puffer- und Reaktionsbedingungen binden die Primer an die Nukleinsaure und die DNA Polymerase verlängert die Primer anhand der in der Nukleinsaure vorgegebenen Nukleotidsequenz. Durch Anheben und Absenken der Reaktionstemperatur lösen sich die Polymerisationsprodukte von der Nukleinsaure, so dass andere Nukleinsäuren, meist die im Überschuss vorhandenen Primer, an die Nukleinsaure binden können. Eine zyklische Wiederholung dieser Temperaturbedingungen resultiert konsequenterweise in einer Amplifikation der Nukleinsäuresequenz. Die Annealingtemperatur eines Primers wird von seinem -Adenin + Tymin sowie Cytosin + Guanin Gehalt beeinflusst. Für jedes Adenin und Tymin werden 2 °C gerechnet, während für jedes Cytosin und Guanin 4 °C berechnet wird. Die Qualität einer PCR-Reaktion wird von der Primer-Konzentration, der wechselnden dNTP-Menge im PCR-Mix und der Qualität der Taq-DNA- Polymerase direkt beeinflusst. Ein typisches Reaktionsgemisch von 12,5μl ist z.B. wie folgt zusammengesetzt: 0,20μM Primer, 200μM dNTPs, 0,50 U Taq- Polymerase, 1 ,25μl 10 x Buffer, 1,50 μl DNA (50ng/μl) und mit H20 auf 12,5 μl aufgefüllt. Bevorzugt werden die im Methodenteil dieser Anmeldung aufgeführten Reaktionsbedingungen gewählt.
Als Primer werden solche Nukleinsäuren- verstanden, die mindestens eine Länge von 8 Nukleotiden aufweisen und an eine der oben offenbarten zweite Nukleinsäuren binden. Bevorzugte Primer haben eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 20 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 30 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 50 Nukleotiden. Die Nukleotidsequenzen der Primer können beliebig aus den oben offenbarten zweiten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 8 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Alternativ dazu kann es (bei Identität) bei der Hybridisierung der Primer mit der Zielsequenz innerhalb der zweiten Nukleinsaure auch zu Basenfehlpaarungen kommen, sofern unter den gewählten Reaktionsbedingungen eine Hybridisierung zustande kommt, die zu einer Elongationsreaktion führen kann. Ein Primer sollte innerhalb von 8 benachbarten Nukleotiden 7 identische Nukleotide aufweisen. Allerdings schließt die Erfindung auch solche Ausführungsformen ein, bei denen 4, 5 oder 6 der 8 Nukleotide mit der entsprechenden Sequenz der zweiten Nukleinsaure identisch sind. Selbstverständlich sind die Grundprinzipien der PCR-Methodik einzuhalten, deren Verfahrensschritte und Reaktionsbedingungen Stand der Technik sind. Im Einzelnen können die Verfahrensschritte aber dennoch einer Anpassung durch den Fachmann bedürfen. Insbesondere ist sicherzustellen, dass die Spezifität der Reaktion erhalten bleibt, was im Einzelnen gegebenenfalls durch Von/ersuche ausgetestet werden muss. Nur beispielsweise sei hier auf dem Fachmann bekannte Laborbücher verwiesen, die diese Methodik beschreiben, beispielsweise auf Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor und alle nachfolgenden Auflagen. PCR-Verfahren sind z.B. beschrieben in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994, und nachfolgende Auflagen. Neben der PCR-Amplifikation ist aber auch die Reverse Polymerase Kettenreaktion (RT- PCR) ein bevorzugtes Nachweisverfahren. Neben den genannten
Amplifikationsmethoden sind in den vergangenen Jahren weitere Amplifikationsverfahren entwickelt worden, die ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen. Weitere Amplifikationsverfahren sind beispielsweise die „Ligase Chain Reaction" (LCR, EP-A 320308), „Cyclic Probe Reaction" (CPR, ), „Strand Displacement Amplification" (SDA, Walker et al., Nukleic Acids Res. 1992 (7):1691-6.) oder „Transciption-based amplification Systems" (TAS, Kwoh et al Proc. Nat. Acad Sei. USA 86:1173 (1989), Gingeras et al., PCT Application WO 88/10315).
Ein anderes bevorzugtes Nachweisverfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" umfasst die Hybridisierung mit einer Hybridisierungssonde. Hierbei versteht man unter der Hybridisierungssonde eine Nukleinsaure mit einer Länge von bis zu 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt bis zu 100 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt bis zu 200, 300, 400, 500 oder 1000 Nukleotiden und am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotiden, die an eine der oben offenbarten zweiten Nukleinsäuren bindet. Hierbei muss die Spezifität des Nachweises in Vorversuchen ausgetestet werden, was eine für den Fachmann gängige Praxis darstellt. Vorzugsweise ist die erste Nukleinsaure mit einer detektierbaren Markierung, wie einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung versehen. Beispiele für Hybridisierungsverfahren sind Dot Blot, Northern Blot, Reverse Northern Blot, in situ Hybridisierung oder Southern Blot (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor und alle nachfolgenden Auflagen).
Ein anderes bevorzugtes Nachweisverfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" ist die Sequenzierung einer der oben offenbarten zweiten Nukleinsaure. Sequenzierverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und bedürfen für den Fachmann keiner weiteren Erläuterung. Beispielsweise sei hier auf Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (und alle nachfolgenden Auflagen verwiesen), worin die Verfahren ,τιach Sanger und Maxam/Gilbert dargestellt sind. Als Primer werden erfindungsgemäß solche Nukleinsäuren verstanden die eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 18 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt mindestens 21 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 25 Nukleotiden aufweisen. Für Sequenzierprimer gelten die für die PCR-Primer dargestellten Eigenschaften entsprechend.
Ausgehend von den vorstehend offenbarten Nukleinsäuren kann der Fachmann ohne unzumutbaren Aufwand durch Austesten feststellen, welche Primer oder Hybndisierungssonden, die aus den oben genannte zweiten Nukleinsäuren abgeleitet sind, zu speziellen Nachweisverfahren, beispielsweise PCR-Verfahren, Sequenzierung oder Hypridisierungsverfahren geeignet und welche nicht, oder weniger geeignet sind. Die Primer oder Hybndisierungssonden zum Einsatz in der Erfindung können auch beispielsweise in größeren DNA- oder RNA-Sequenzen vorliegen, z.B. flankiert von Restriktionsschnittstellen, darüber hinaus können Nukleinsäuren, Hybndisierungssonden und Primer auch aus Basenderivaten aufgebaut sein. Eine Reihe von Modifikationen ändern die Chemie des Phosphdiester-Rückrats der DNA bzw. der RNA, der Zucker oder heterocyklischen Basen. Untern den nützlichen Modifikationen befinden sich unter anderem Phosphorthioate; Phosphordithioate, bei denen , beide, nicht an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligten Sauerstoff-Atome durch Schwefel, Phosphoramide, Alkylphosphotriester und/oder Boranophosphate ersetzt sind. Achirale Phosphat-Derivate umfassen S'-O'-δ'-S-Phosphorthioate, 3'-S-5'-0- Phosphorthioate, 3'-CH2-5'-0-Phosphonate and 3'-NH-5'-0-Phosphoroamidate. Bei Peptid-Nukleinsäuren kann das gesamte Phosphodiester-Rückrat durch peptidische Bindungen ersetzt sein. Zucker-Modifikationen werden verwendet, um die Stabilität oder Affinität zu verändern. Das A-Anomer von Desoxyribose kann verwendet werden, wobei die Base in Bezug auf das natürliche B-Anomer invertiert ist. Die 2'- OH Gruppe der Ribose kann zum entsprechenden 2'-0-Methyl oder 2'-0-Allyl Zucker verändert werden, wodurch ein Stabilitätsgewinn erzielt wird, ohne Beeinträchtigung der Bindungsaffinität. Einige weitere nützliche Substitutionen umfassen Desoxyuridin anstatt von Desoxythymidin; 5-methyl-2'~Desoxycytidin und 5-Bromo-2'-Desoxycytidin anstatt von Desoxycytidin. 5-Propyyl-2'-Desoxyuridin und 5-Propyyl-2'-Desoxycytidin können Desoxythymidin und Desoxycytidin ersetzen und somit die Affinität und biologische Aktivität steigern.
Zur Detektion können die Nukleinsäuren eine Markierung aufweisen. Beispiele hierfür sind eine radioaktive Markierung z.B. mit 35S, 32P oder 3H, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Markierung mit einer alkalischen Phosphatase. Die in der Hybridisations- oder Amplifikationsreaktion verwendeten Nukleinsäuren können weiterhin mit verschiedenen geeigneten Markern versehen sein. Geeignete Marker umfassen Fluorochrome, z.B. Fluorescein Isothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas Red, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2', 7'- Dimethoxy-4',5'-Dichloro-6-Carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-Rhodamine (ROX), δ-Carboxy^' ' '^ -Hexachlorofluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) oder N,N,N',N'-Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine (TAMRA). Die Markierung kann weiterhin Teil eines mehrstufigen Systems sein, wobei die Nukleinsaure mit Biotin konjugiert ist, oder mit einem Hapten oder einem ähnlichen Stoff der einen hochaffinen Bindungspartner hat, z.B. Avidin, spezifische Antikörper etc., wobei in diesem Fall der Bindungspartner mit einer detektierbaren Verbindung konjugiert ist. Im Fall der Amplifikationsreaktion kann die Markierung mit einem Primer konjugiert und/oder die Nukleotide im Pool der Amplifikationsreaktion mit einer geeigneten Markierung versehen sein, so dass die Markierung in das neu entstehende Amplifikationsprodukt eingebaut wird. Alternativ können Doppelstränge, die in einer Hybridisierungsreaktion neu entstanden sind, aber auch durch DNA-Doppelstrang spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Besagte Antikörper sind dadurch charakterisiert, dass sie lediglich an doppelsträngige DNA binden, nicht aber an einzelsträngige DNA.
Ein anderes bevorzugtes Nachweisverfahren ist die Detektion der ersten oder zweiten Nukleinsaure mit einem spezifischen Antikörper oder Antiköperfragment oder Antikörperderivat oder einem Aptamer. Bei diesem Verfahren werden spezifische Antiköper generiert, die die ersten oder zweiten Nukleinsäuren erkennen. Fragmente von Antikörpern sind z.B. Fv, Fab- oder F(ab')2 - Fragmente Derivate schließen scFvs, chimäre oder humanisierte Antikörper mit ein. Aptamere sind Nukleinsäuren, die aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur spezifisch an ein Zielmolekül binden. Verfahren zur Generierung spezifischer Antikörper sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Spezifität der Bindung an die genomische Nukleinsaure kann z.B. durch Kompetitionsexperimente mit radioaktiv markierter gewünschter Zielnukleinsäure und nicht gewünschter, z.B. zufällig ausgewählter Nukleinsaure getestet werden. Übliche Nachweisverfahren, in denen Antikörper Verwendung finden, sind z.B. ELISA oder RIPA aber auch Immunfluoreszenz und andere Nachweisverfahren. Die Antikörper binden hierbei spezifisch die ersten oder zweiten Nukleinsäuren. Die Antikörper-Bindung kann z.B. durch Markierung der primären Antikörper sichtbar gemacht werden oder wird mit Hilfe von Antiköper- bindenden zweiten Antikörper detektiert, die dann ihrerseits markiert sind. Die Antikörper können z.B. mit fluoreszierenden Substanzen, durch radioaktive Markierung oder eine enzymatische Markierung modifiziert sein. Immunologische Nachweisverfahren unter Verwendung von spezifischen Antikörpern, wie auch die Generierung von Antikörpern und Fragmenten oder Derivaten davon sind, wie bereits erwähnt, aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise sei hier genannt Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press und alle nachfolgenden Auflagen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens" wird ein Genomscreen an mehreren Säugern und/oder Geflügeltieren einer Population durchgeführt. Der Begriff „mehreren Säuger/Geflügeltiere" umfasst mindestens zwei Tiere einer Population, bevorzugt mindestens 5 Tiere, stärker bevorzugt mindestens 10 Tiere, noch stärker bevorzugt mindestens 20 Tiere, stärker bevorzugt mindestens 50 Tiere, noch stärker bevorzugt mindestens 250 Tiere, am stärksten bevorzugt mindestens 1500 Tiere. Bei dem Genomscreen wird untersucht, ob eine Nukleinsaure von bis zu 5000 Nukleotiden Länge, bevorzugt bis zu 1000 Nukleotiden, mehr bevorzugt bis zu 350 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt bis zu 1000 Nukleotiden, am meisten bevorzugt bis zu 50 Nukleotiden Länge gemeinsam mit dem Merkmal „Spreizbeinigkeit" vererbt wird. Insbesondere wird hierbei geklärt, beispielsweise mit Hilfe von Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren, welches Markerallel gemeinsam mit dem Merkmal „Spreizbeinigkeit" vererbt wird. Eine gemeinsame Vererbung von Nukleinsäuren mit der phänotypischen Ausprägung der „Spreizbeinigkeit" impliziert eine genetische Kopplung der Nukleinsaure an das das Merkmal steuernde Gen und kennzeichnet darüber hinaus welches Markerallel sich auf demselben Chromosom befindet wie das an der phänotypischen Ausprägung der „Spreizbeinigkeit" beteiligte Allel am Defektgen, d.h. in welcher Kopplungsphase sich Markerlocus und Defektlocus befinden. Bevorzugte Marker sind Mikrosatteliten auf Chromosom 5 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1 , S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder auf Chromosom 11 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger/Geflügeltiere, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 , Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486: Neben den genannten Mikrosatelliten können auch andere Nukleinsäuresequenzen als Marker verwendet werden, sofern sie im Sinne der Erfindung identisch oder im wesentlichen identisch sind mit der zweiten, in der Erfindung offenbarten Nukleinsaure oder in einem der oben genannten Nukleinsäurebereiche liegen. Wie bereits vorstehend erwähnt, können auch die Mikrosatelliten flankierenden Sequenzen, beispielsweise als Targetsequenzen für die PCR-Primer, in die Analyse mit einbezogen werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, mindestens enthaltend ein Primerpaar zur Amplifikation der zweiten Nukleinsaure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang dieser Nukleinsaure bindet; oder eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden die an die zweite Nukleinsaure bindet; oder einen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein Antikörperderivat oder ein Aptamer, das die erste oder zweite Nukleinsaure spezifisch bindet.
PCR basierende Kits enthalten ein Primerpaar zur Amplifikation einer der oben genannten zweiten Nukleinsaure. Als Primer werden solche Nukleinsäuren verstanden, die mindestens eine Länge von 8 Nukleotiden aufweisen und an eine der oben offenbarten zweite Nukleinsäuren binden. Bevorzugte Primer haben eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 20 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 30 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 50 Nukleotiden. Die Nukleotidsequenzen der Primer können beliebig aus den oben offenbarten zweiten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 8 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Ein Primer sollte innerhalb von 8 benachbarten Nukleotiden mindestens 7 mit der Zielsequenz identische Nukleotide aufweisen. Allerdings schließt die Erfindung auch solche Ausführungsformen ein, bei denen 4, 5 oder 6 der 8 Nukleotide mit der entsprechenden Sequenz der zweiten Nukleinsaure identisch sind.
Auf Hybridisierungverfahren basierende Kits enthalten eine Hybridisierungssonde. Die Hybridisierungssonde kann bis zu 50 Nukleotide lang sein, stärker bevorzugt bis zu 100 Nukleotide, noch stärker bevorzugt bis zu 1000 Nukleotide und am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotide oder länger sein. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssonde eine radioaktiv-markierte Nukleinsaure oder sie enthält modifizierte Nukleotide.
Kits zum Nachweis von Nukleinsäuren auf ELISA, RIA, RIPA oder ähnlicher Basis enthalten einen spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein Antikörperderivat oder ein Aptamer. Antikörper oder Antikörperfragment oder Antikörperderivat oder Aptamer sind spezifisch gegen die erste oder zweite Nukleinsaure gerichtet. Übliche Nachweisverfahren in denen die Kits Verwendung finden sind z.B. ELISA oder RIPA aber auch Immunfluoreszenz und andere Nachweisverfahren. Immunologische Nachweisverfahren und Verfahren zur Generierung von spezifischen Antikörpern sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Komponenten des Kits können in Behältern verpackt sein wie z.B. Fläschchen, optional auch in Puffern und /oder Lösungen. Gegebenenfalls können einer oder mehrere der Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich oder alternativ können eine oder mehrere Komponenten an einen festen Träger absorbiert sein, wie z.B. an Nitrozellulosefilter, Nylonmembranen, oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
In der Beschreibung sind eine Reihe von Dokumenten zitiert. Der Offenbarungsgehalt dieser Dokumente inklusive von Gebrauchsanweisungen von Herstellern ist hiermit per Referenz inkorporiert. Die Figuren zeigen:
Figur 1 :Weibliche, kombinierte und männliche Kopplungskarte des Chromosoms 3. Die Abstände zwischen den Loci sind in cM (Kosambi) angegeben.
Figur 2:Weibliche, kombinierte und männliche Kopplungskarte des Chromosoms 5. Die Abstände zwischen den Loci sind in cM (Kosambi) angegeben.
Figur 3:Weibliche, kombinierte und männliche Kopplungskarte des Chromosoms 11. Die Abstände zwischen den Loci sind in cM (Kosambi) angegeben.
Figur 4:lnformationsgehalt der Markerloci auf Chromosom Sscr 3.
Figur 5:lnformationsgehalt der Markerloci auf Chromosom Sscr 5.
Figur 6:lnformationsgehalt der Markerloci auf Chromosom Sscr 11.
Figur 7:Verlauf der Teststatistik (%2 ) und der Irrtumswahrscheinlichkeit (α- comparisonwise) entlang der Positionen in cM (Kosambi) des Chromosoms Sscr 3.
Figur 8:Verlauf der Teststatistik (χ 2 ) und der Irrtumswahrscheinlichkeit (α - comparisonwise) entlang der Positionen 25 bis 95 cM (Kosambi) des
Chromosoms Sscr 5.
Figur 9:Verlauf der Teststatistik (χ 2 ) und der Irrtumswahrscheinlichkeit (α - comparisonwise) entlang der Positionen in cM (Kosambi) des Chromosoms
Sscr 11.
Figur 10:Verlauf der Teststatistik (χ2) und der Irrtumswahrscheinlichkeit (α- comparisonwise) entlang der Positionen in cM des Chromosoms 3 Figur 11 : Verlauf der Teststatistik (χ2) und der Irrtumswahrscheinlichkeit (α- comparisonwise) entlang der Positionen in cM des Chromosoms 5
Figur 12: Verlauf der Teststatistik (χ2) und der Irrtumswahrscheinlichkeit (α- comparisonwise) entlang der Positionen in cM des Chromosoms 11
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 : Geschlechtsbestimmung und Typisierungsergebnisse der Mikrosatelliten
Material und Methoden:
EXTRAKTION DER DNA AUS GEWEBEPROBEN
Die Gewebeproben der Sauen lagen in Form eines Stückes des Ohrknorpels mit einem Gesamtgewicht von je ca. 30 mg vor. Von den Spreizernachkommen lagen ca. 1 ,5 cm lange, kupierte Schwanzenden vor, von denen je 20 bis 30 mg abgetrennt wurden. Die Lagerung der Gewebeproben erfolgte in 1 ,5-ml-Eppendorf- Reaktionsgefäßen bei 23° C. Die Extraktion der genomischen DNA aus den Ohrknorpeln und Schwanzenden erfolgte nach einem Protokoll und mit dem Anwendungspaket Puregene (Gentra Systems). Hierzu wurden mit einem sterilen Skalpell ca. 30 mg Gewebe abgetrennt und mit 600 μl Extraktionspuffer (Gentra Systems) sowie 1 μl Proteinase-K-Lösung zum Verdau der Zellkernmembran versetzt und aufgeschüttelt. Anschließend wurden die Proben über Nacht bei 55° C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Eliminierung der RNA durch Zugabe von 1 μl RNAse (10 mg/μl) mit anschließendem Aufschütteln und einer weiteren Inkubation bei 37° C für 30 min. Zur Proteinfällung wurden die Proben in einem weiteren Schritt mit 200 μl Protein-Fällungslösung (Gentra Systems) versetzt, aufgeschüttelt und für 3 min bei 13.000 x g (Raumtemperatur = RT) zentrifugiert. Zum Ausfällen der DNA wurde der Überstand dekantiert und in 600 μl Isopropanol (100 %) geschwenkt, bis ein DNA-Pellet sichtbar wurde. Nachdem die so gelöste DNA für 1 min zentrifugiert wurde (13.000 x g, RT) und der Überstand abgegossen wurde, schloß sich eine Reinigung mit 600 μl 70%igem Ethanol sowie ein wiederholtes Zentrifugieren (1 min, 13.000 x g, RT) an. Das überschüssige Ethanol wurde abpipettiert und die Pellets im geöffneten Gefäß für 20 min an der Luft getrocknet und dann in jeweils 200 μl Puffer (Tris-HCI, pH 8,5) resuspendiert. Zur optimalen Lösung der DNA wurden die gelösten Proben für 4-6 h bei 40° C in einer langsamen Rotation bewegt. Die Aufbewahrung der Proben erfolgte kurzfristig bei 4° C, die langfristige Lagerung fand bei 23° C statt.
EXTRAKTION DER DNA AUS SPERMA
Als Ausgangsmaterial für die DNA-Extraktion der acht im Experiment betrachteten Eber standen ca. 2 ml tiefgefrorenes Sperma zur Verfügung. Die Isolierung der DNA erfolgte in Anlehnung an das bei xu (1997) beschriebene Protokoll. In einem ersten Reinigungsschritt wurde 500 μl Sperma in 1 ,7 ml PBS-Lösung aufgeschüttelt und anschließend für 5 min (4000 x g, RT) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und dieser Schritt einmal wiederholt. Im Folgenden wurden dem Pellet 600 μl Extraktionspuffer und 66,7 μl 0,5 M DTT sowie 30 μl Proteinase K (20 mg/ml) zugegeben und aufgeschüttelt, es folgte eine Inkubation bei 65° C über Nacht. Zum Ausfällen der DNA wurde diese Lösung am folgenden Tag mit 220 μl gesättigter NaCI-Lösung (ca. 6 M) versetzt und aufgeschüttelt, danach wurde die Probe für 10 min bei 17.860 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde in 1680 μl 100%iges Isopropanol überführt und gemischt. Zur Reinigung wurde die DNA mit einer Pipettenspitzeentnommen und in 1680 μl Ethanol (70 %) aufgenommen. Im letzten Schritt wurde das Pellet wiederholt entnommen, kurz angetrocknet und in 200 μl Puffer (Tris-HCI, pH 8,5) resuspendiert. Die Lagerung erfolgte analog zu den oben beschriebenen Gewebeproben.
QUALITATIVE UND QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER EXTRAHIERTEN DNA
Die qualitative Beurteilung der gewonnenen DNA erfolgte auf einem 0,8%igen Agarosegel. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte für ca. 30 min bei 10 V/cm. Nachfolgend wurden die Gele unter UV-Licht fotografiert und untereinander verglichen. Die Qualität der isolierten DNA ergab sich aus dem Grad der Fragmentierung der erhaltenen Banden. Die Konzentration und Reinheit der DNA wurde photometrisch bei 260 nm und 280 nm bestimmt (SAMBROOK et al., 1989). Vor der Messung wurde die DNA mit bidest. Wasser 1 :50 verdünnt. Die Konzentration wurde nach der Formel: [(OD260 x 50 μg/ml) x Verdünnungsfaktor] und die Reinheit nach der Formel: [OD260/OD280] ermittelt. Je nach gemessener Konzentration wurde die in Tris-HCI gelöste DNA auf einheitlich 100 ng/μl eingestellt. Die Lagerung der gelösten DNA erfolgte bei 23° C in 1 ,5-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäßen. Als Vorbereitung für die Vorlage der DNA in PCR-Reaktionsgefäßen wurden Aliquots der Proben mit Hilfe eines Pipettierroboters, entsprechend der Organisation der Proben auf den Gelen, in 96er-Deepwell-Platten überführt und mit Tris-HCI verdünnt, so daß eine DNA- Konzentration von 8 ng/μl erreicht wurde. In einem zweiten Schritt wurden je 5 μl, entsprechend 40 ng DNA, pro Probe aus den Deepwell-Platten in 96er-PCR-Reaktionsgefäße aliquotiert. Es schloß sich eine Exsikkation der so vorgelegten, gelösten DNA für ca. 3 h bei 50° C in einem Trockenschrank an. Die Lagerung der dehydrierten DNA fand für jeweils ca. 6 Wochen bei Raumtemperatur statt.
GESCHLECHTSBESTIMMUNG Da das Geschlecht der Ferkel bei der Probenahme nicht verzeichnet wurde, erfolgte eine Bestimmung im Labor. Die gendiagnostische Bestimmung des Geschlechts wurde nach Angaben von LOCKLEY et al. (1997) durchgeführt. Mittels einer Multiplex- PCR wurden geschlechtsspezifische Amplifikationsprodukte dargestellt, die bei Anwesenheit des auf dem Y-Chromosom lokalisierten SRYB-Gens ein Produkt von 163 bp ergeben. Simultan wurde eine Kontrollsequenz mit einer Fragmentgröße von 445 bp, aus dem ZFX/ZFY-Gen, das auf beiden Geschlechtschromosomen vorhanden ist, amplifiziert. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 : Primersequenzen für die Geschlechtsbestimmung
Chr. Locus forward primer (5'-3') reverse primer (5 '-3') Ref.
Y SRYB tga acg ctt tca ttg tgt ggt c gcc agt agt ctc tgt gcc tcc t 1
XY ZFXIZFY ata acc acc tgg aga gcc aca agc t gca ctt ctt tgg tat ctg aga aag t 2
Ref. = Referenz: 1 = POMP et al. (1995), 2 = AASEN und MED ANO (1990) Chπ = Chromosom
Die Multiplex-PCR für die Amplifikation der Genprodukte wurde mit 5 μl in Puffer (Tris-HCI, pH 8,5) gelöster DNA (6 ng/μl) durchgeführt. Der Reaktionsansatz setzte sich im einzelnen zusammen aus 50 mM KCI, 1 ,5 mM MgCι2, 10 mM Tris-HCI (pH 9,0), 200 μM dNTP, 0,1 μM je Primer und 0,8 U Taq-Polymerase. Die PCR wurde mit 3 min bei 94° C gestartet, gefolgt von 35 Zyklen, die aus 20 sec bei 94° C, 40 sec bei 61° C und 45 sec bei 72° C bestanden. Eine Extension erfolgte für 10 min bei 72° C. Die Darstellung der Fragmente erfolgte im 3%igen Agarosegel mit 0,5x TBE-Puffer. Pro Geltasche wurden 10 μl des Gemisches aus 10 μl PCR-Produkt und 2 μl Ladepuffer pipettiert. Die Elektrophorese bei 10 V/cm dauerte 35 bis 40 min. Anschließend wurden die Agarosegele auf einem Transilluminator im UV-Licht fotografiert. Die Klassifizierung der Fragmentlängen erfolgte über einen Vergleich mit einem simultan getrennten Standard-Marker (0X174/H/nfl). Pro getestetem Individuum waren bei männlichen Tieren zwei Banden (163 und 445 bp) ersichtlich, bei weiblichen nur die Kontrollbande (445 bp).
AUSGEWÄHLTE MIKROSATELLITEN- ARKER
Im Rahmen dieses Experiments wurde ein Scan der Autosomen sowie der Geschlechtschromosomen beim Schwein mit 142 Mikrosatelliten-Markern, fluoreszenzmarkiert am 5™-Ende des forward primer, durchgeführt. Im autosomalen Bereich, Sscr 1 bis 18, wurden 133 Mikrosatelliten typisiert, auf dem pseudoautosomalen Bereich der Chromosomen X und Y drei sowie sechs im nicht- pseudoautosomalen Bereich. Grundsätzlich bestand die Forderung, einen maximalen Abstand zwischen den Mikrosatelliten-Loci von ca. 25 cM einzuhalten. Neben der Lage der Mikrosatelliten galten als weitere Auswahlkriterien ein möglichst hoher Polymorphiegrad sowie die Fragmentgröße und die Art der Fluoreszenzmarkierung, welche entscheidend für die Zusammenstellung von Multiplex-Reaktionen sind. Maßgebend für die endgültige Auswahl und Positionierung der Marker war hierbei der Informationsgehalt innerhalb der acht definierten Familien.
OPTIMIERUNG DER POLYMERASE-KETTENREAKTION
Die Fragmente der Mikrosatelliten wurden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, diese beruht auf einem von MULLIS und FALOONA (1987) entwickelten Prinzip der Amplifikation definierter DNA-Abschnitte unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase. Die PCR wurde mit zwei UNO-ll-96- Thermocyclern durchgeführt. Das PCR- Programm variierte hinsichtlich der
Annealingtemperatur und der Anzahl gewählter Zyklen. Unverändert blieb eine
Initialdenaturierung von 94° C für 3 min und innerhalb eines jeden Zyklus eine
Denaturierung bei 94° C für 20 sec, gefolgt von einer primerspezifischen
Annealingtemperatur sowie einer Extension für 30 sec bei 72° C. Nach Durchlaufen der Zyklen wurde eine Schlußextension von 5 min bei 72° C gewählt. Die Vorlage der DNA für die PCR erfolgte im dehydrierten Zustand. Der
Standardreaktionsansatz für die PCR betrug 10 μl und setzte sich im einzelnen zusammen aus:
40 ng genomische DNA 50 mM KCIA
1 ,5 mM MgCI2 A
10 mM Tris-HCI (pH 9,0) A 0,1-0,5 μM je Primer B 200 μM dNTP 0,2-0,4 U Taq-Polymerase c
Die Indizes A, B und C stehen für die im Standardansatz variabel gehaltenen Mengenverhältnisse. Unter A dargestellt sind die im PCR-Puffer (Pharmacia, USA) enthaltenen Komponenten in einfacher Konzentration. Die Menge eingesetzter Primer (B) und der Units Taq-Polymerase (C) variierte ebenfalls, die gewählten Konzentrationen und Mengen sind in Tabelle 2 und 3 aufgeführt.
OPTIMIERUNG DER PCR-BEDINGUNGEN
Über eine Primeroptimierung wurden die optimalen PCR-Bedingungen hinsichtlich derAnnealingtemperatur, Anzahl Zyklen, der Primermenge, Menge eingesetzten PCR-Puffers und der erforderlichen Units Taq-Polymerase ermittelt. Dies erfolgte in der Regel über einen Test, in dem drei Mikrosatelliten hinsichtlich ihrer Reaktionsbedingungen ausgewählt wurden und jeder Mikrosatellit separat amplifiziert wurde. Parallel wurden diese in drei Duplex-Reaktionen sowie in einer Triplex-Reaktion kombiniert. Somit ergab sich eine Anzahl von sieben PCR- Ansätzen, die zeitgleich bearbeitet, auf je vier DNA-Templates verteilt und simultan im Thermocycler amplifiziert wurden. Nach der Elektrophorese konnte über einen direkten Vergleich der amplifizierten Produkte nach einem Ausschlußprinzip, bei definierter DNA, festgestellt werden, welche Fragmente welchem Mikrosatelliten zuzuordnen waren und ob weiterer Optimierungsbedarf vorlag. Eine schnelle und eindeutige Beurteilung der Multiplexfähigkeit der verwendeten Mikrosatelliten und somit eine Rationalisierung des Testaufwandes war somit möglich. Zum Testen der Mikrosatelliten wurde pro Reaktionsansatz jeweils die DNA von vier der im Projekt untersuchten Eber eingesetzt. Auf diese Weise konnte anhand der Testergebnisse abgesehen werden, ob die Größe der Fragmente in Basenpaaren denen in frei zugänglichen Datenbanken entsprachen (URL 2 und 3). Im weiteren konnte auf diesem Weg frühzeitig abgesehen werden, welchen Heterozygotiegrad die Eber für die getesteten Mikrosatelliten aufwiesen. Die ermittelten und optimierten Multiplex- PCR-Bedingungen hinsichtlich der Pufferkonzentration, der Units Taq-Polymerase, der Primerkonzentration, der Annealingtemperatur und der Anzahl Zyklen sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Multiplex-Gruppen und PCR-Bedingungen der verwendeten Mikrosatelliten-Loci.
Multiplex-Set Locus Chr. Dye1 μl Primer2 XJ Tag3 Puffer TA (°C)4 Am. Zyklen"
Sw707 XY F 0,25
Sw2588 XY F 0,30 0,40 1,0 58 34
Swc27 14 F 0,27
Sw81 16 F 0,25
S 2431 17 F 0,32 0,35 1,0 58 34
S0355 15 F 0,20
Swrl533 15 T 0,50
S0148 15 T 0,16 0,30 1,0 58 33
Sw262 16 T 0,45
Swl626 10 T 0,30
S cl9 10 T 0,16 0,40 1,0 58 32
S0068 13 T 0,50 Fortsetzung
Multiplex-Set Locus Chr. Dye1 μl Primer2 U Taq3 Puffer TA (°C)4 Anz. Zyklen5
S l031 17 F 0,14
Swl325 XY F 0,15 0,20 1,0 58 36
Swr982 1 F 0,33
Sw951 10 H 0,30
S 2491 10 H 0,35 0,20 ' 1,0 58 38
S0070 10 H 0,22
7 Sw245 14 T 0,30 0,4 1,0 58 "34 Sw949 XY T 0,25
8 Sw328 14 F 0,23 0,30 1,0 58 34 S 210 14 F 0,40
9 S0120 18 F 0,25 0,25 0,7 55 34 S0230 11 F 0,30
10 Swl808 18 H 0,32 0,28 1,3 58 38 Sw742' 16 H 0,20
11 Swl29 13 F 0,25 0,20 1,0 58 38 S0090 12 F 0,30
12 S l68 12 T • 0,16 0,22 1,2 58 30 Sw2490 12 T 0,25
13 Swl564 2 F . 0,30 0,22 1,0 58 32 Swl'301 1 F 0,18
14 Sw749 9 T 0,30 0,20 1,0 58 34 S 2419 6 T 0,32
15 Sw983 9 H 0,28 0,20 1,2 58 34 - Sw2564 7 H 0,25
16 Sw961 XY H 0,12 0,22 1,2 62 36 Sw2443 2 H 0,35
17 Sw2570 3 T 0,16 0,20 1,3 56 33 Swl201 2 T 0,26
18 S rl004 17 F 0,28 0,22 1,0. 60 36 S0071 11 F 0,17
19 S0036 2 H 0,27 0,20 1,2 58 38 Sw995 5 F 0,25
20 S0101 7 F 0,19 0,20 1,0 58 40 Sw964 15 H 0,28
21 S0298 16 T 0,28 0,20 1,2 60 38
Swrl941 13 T 0,30 Fortsetzung
Multiplex-Set Locus Chr. Dye1 μl Primer2 O Taq3 Puffer TA (°C)4 Anz. Zyklen5
22 Sw344 13 T 0,25 0,20 1,0 ' 55 34 Sw398 13 H 0,25
23 Sw77 14 H 0,22 0,22 1,2 58 40 Sw874 12 H 0,30
24 S 2401 9 F 0,25 0,20 1,2 58 34 S0144 8 F 0,25
25 Sw957 12 H 0,20 0,22 1,2 58 34
Swl460 11 F 0,21
26 Swl354 7 T 0,14 0,23 1,2 58 34 Sw920 10 T 0,35
27 Sw2618 3 H 0,30 0,20 1,1 58 40 Swl027 14 H 0,33
28 S rl343 7 F 0,12 0,20 1,0 58 33 S 2517 16 F 0,22
29 Sw752 4 F 0,30 0,22 1,0 58 42 Sw2441 17 F 0,23
30 S 72 3 T 0,28 0,20 1,2 58 34 Swl551 8 T 0,18
31 Sw2098 6 F 0,33 0,20 1,0 58 34 Sw2406 6 F 0,16
32 S0067 4 H 0,30 0,20 1,2 65 40 S0106 12 H 0,27
33 Sw2425 5 T 0,30 ' 0,25 1,2 58 42
S0087 6 T 0,36 -
34 Swl200 5 F 0,35 0,25 1,0 58 42 IGF1 5 . F 0,30
35 Swl75 7 H 0,27 0,24 1,5 58 40 Swl841 6 H 0,33
36 " S0073 4 F . 0,25 0,20 1,0 58 36 S0097 4 F 0,25
37 Swl902 1 F 0,25 0,20 1,2 60 34 S l408 2 F 0,25
38 Sw21 • 9 H 0,30 0,20 1,2 58 42 Sw413 5 H 0,25
39 Swl22 6 F 0,30 0,25 1,2 58 36 ACR 5 F 0,18 Fortsetzung
Multiplex-Set Locus Chr. Dye1 μl Primer2 V Taq3 Puffer TA (°C)4 Anz. Zyklen5
40 Sw2521 8 F 0,20 0,20 1,0 62 33 S0289 13 F 0,20
41 S0081 9 F 0,20 0,30 1,2 58 38 Swl894 10 F 0,25
42 S l327 3 F 0,20 0,20 1,0 58 34 S0332 17 T 0,10
43 Swl514 1 F 0,12 0,30 1,0 55 36
S0118 15 F 0,27 -
44 S l621 1 T 0,17 0,25 1,4 58 39 S0320 1 T 0,32
45 Sw2534 XY H 0,30 0,40 1,2 60 35
Insgesamt ergaben sich sechs Multiplex-Reaktionen, in denen drei Mikrosatelliten gleichzeitig in einer PCR amplifiziert wurden, und 39, in denen zwei Mikrosatelliten simultan amplifiziert wurden. Neben den Multiplex-Gruppen wurden 46 Mikrosatelliten separat amplifiziert. In Tabelle 3 sind die ermittelten PCR- Bedingungen der einzeln amplifizierten Mikrosatelliten wiedergegeben.
Tabelle 3: PCR-Bedingungen separat amplifizierter Mikrosatelliten-Loci
Lfd. Nr. Locus Chr. Dye1 μl Primer2 υ Taq3 Puffer TA (° C)4 Anz. Zyklen5
1 S0001 4 F 0,25 0,20 1 2 50 38
2 S0009 11 T 0,27 0,30 1,3 62 37
3 S0038 10 H 0,25 0,30 1,4 62 39
4 S0105 16 H 0,30 0,25 1.2 59 38
5 S0111 16 H 0,40 0,40 1,3 56 38
6 S0141 2 H 0,20 0,20 1,4 58 34
7 S0178 8 T 0,30 0,20 1,2 65 42
8 S0182 11 F 0,30 0,20 1,0 55 38
9 S0282 13 F 0,17 0,20 1,0 60 34
10 S0292 • 17 H 0,22 0,23 1,2 58 40
11 S0295 9 F 0,23 0,30 1,2 58 38
12 S0296 17 T 0.23 0,20 1,0 50 34
13 S0301 4 F 0,25* 0,20 1,0 58 36
1 S 2 5 F 0,25 0,20 1,2 55 36
15 Sw29 8 H 0.25 0,20 1,1 62 40
16 Sw64 1 T 0,33 0,22 1,4 58 44
17 Swl20 15 F 0,27 0,25 1,0 60 36
18 Sw274 3 F 0,32 0,20 1,0 58 35
19 S 335 17 H 0,35 0,25 1,2 52 38
20 Sw378 5 T 0,22 0,20 1,0 60 35
21 Sw435 11 T 0,20 0,20 1,0 60 34
22 Sw632 7 T 0,23 0,20 1,0 58 34
23 Sw703 11 H 0,35 0,25 1,2 58 38
24 S 764 7 T 0,30 0,25 1,0 60 34
25 Sw787 18 H 0,40 0,40 1,2 60 37
26 Sw856 4 T 0,28 0,20 1,0 62 38
27 Sw864 13 T 0,25 0,20 1,0 58 39
28 Sw911 9 F 0,25 0,20 1,0 60 34
29 S 980 XY F 0,25 0,30 1,0 55 36
30 Swl026 2 T 0,25 0,20 1,0 58 41
31 Swl468 5 T 0,35 0,20 1,4 55 36
32 Swl482 5 T 0,30 0,25 1,0 55 36
33 S l515 1 H 0,35 0,30 1,3 58 43
34 S l557 14 T 0,18 0,22 1,0 58 30
35 Swl851 1. T 0,30 0,20 1,2 62 36
36 S l983 15 H 0,26 0,22 1,4 55 36
37 Sw2008 11 H 0,20 0,30 1,0 58 31 Fortsetzung
Lfd. Nr. Locus Chr. Dye1 μl Primer2 XJ Taq3 Puffer TA (° C)4 Anz. Zyklen3
38 Sw2404 4 H 0,30 0,20 1,2 65 42
39 Sw2408 3 F 0,16 0,20 1,0 58 32
40 Sw2410 8 H 0,25 0,20 1,1 55 34
41 S 2470 Y H 0,35 0,40 1,0 58 36
42 Swc9 2 H 0,16 0,20 1,0 58 34
43 Swr773 7 H 0,25 0,20 1,2 50 38
44 SwrllOl 8 T 0,27 0,20 1,2 62 38
45 Swrl637 3 T 0,26 0,20 1,0 65 40
DARSTELLUNG DER MIKROSATELLITEN IN DER AUTOMATISCHEN SEQUENZIEREINRICHTUNG HERSTELLUNG DER POLYACRYLAMIDGELE
Zur Herstellung eines Gels wurden 18 g Harnstoff in 17 ml Wasser, 12 ml 5x TBE- Puffer und 7,5 ml Acrylamid/Bis-Lösung 30 % (29:1) gelöst. Nachfolgend wurde die Lösung in einem Cellulose-Acetat-Filter filtriert und mittels einer Wasserstrahlpumpe entgast. Gegossen wurde das Gel umgehend nach Zugabe von 20 μl TEMED und 300 μl 10 %iger Ammoniumperoxodisulfat-Lösung, luftblasenfrei mittels einer Spritze. Es schloß sich eine Polymerisationszeit von mindestens einer Stunde an, wonach das Gel in die Sequenziereinrichtung eingebaut wurde und die Pufferkammern mit 1x TBE-Puffer gefüllt wurden. Die Gele wiesen eine Stärke von 0,2 mm auf, die Distanz zwischen den Taschen, in die die Proben aufgetragen wurden, und der Detektionseinheit betrug 36 cm. Vor dem Gießen des Gels wurde ein Geltaschenkamm mit 96 Haifischzähnen zwischen die Glasplatten eingebracht. Somit waren pro Gel 96 Taschen für das Auftragen der Proben vorhanden. VORBEREITUNG DER PROBEN Je nach Kombinationsfähigkeit der Mikrosatelliten wurden die Produkte von bis zu vier PCRs, entsprechend bis zu sieben Mikrosatelliten, gleichzeitig aufgetragen. Von den zu bestimmenden PCR-Produkten wurden 1 bis 4 μl mit 10 μl Ladepuffer, welcher mit internen Längenstandards versetzt war, gemischt und für 4 min bei 95° C denaturiert. Nach erfolgter Abkühlung (RT) des Gemischs wurde das Gel mit je 1 μl der Proben pro Bahn mit einer speziellen Achtfach-Pipette beladen.
GEL-ELEKTROPHORESE Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch in denaturierter Form in vertikal angebrachten Polyacrylamidgelen aufgetrennt und automatisch detektiert. Verwendet wurde die Sequenziereinrichtung ABI PRISM 377 DNA Sequencer. Trifft ein fluoreszenz-markiertes DNA-Fragment den Bereich des Lasers, so wird dieses zur Aussendung von Fluoreszenzstrahlung angeregt. Diese erzeugten Lichtsignale werden in einem Hohlspiegel prismatisch aufgespalten, von einer Kamera aufgenommen und als digitales Signal gespeichert. Die Sequenziereinrichtung bot die Möglichkeit, die Temperaturkontrolle zu ändern, sowie variable Trennsysteme mit verschiedenen Trennstrecken und Laufgeschwindigkeiten. Die angewandten Parameter für die Elektrophorese waren 3000 V, 50 W und 60 mA bei einer Geltemperatur von 51° C. Die Detektion der Mikrosatelliten-Fragmente erfolgte bei einer Laserstärke des Argonlasers von 40 mW. Analysiert wurden vier Farbstoffe gleichzeitig pro Bahn: 6Fam-, Tet- und Hex-markierte Primer. Ein mit Tamra markierter Primer wurde für die internen Standard-Fragmente genutzt. Geladen wurden zuerst die ungeraden Geltaschen, die Elektrophorese wurde für 5 min gestartet, damit die Proben in das Gel einlaufen konnten, anschließend wurden die geraden Taschen beladen und der Lauf gestartet. Die Laufzeit der Elektrophorese variierte je nach erwarteter Größe der Fragmente zwischen 3 bis 5 Stunden. Über eine doppelte Nutzung der Gele wurde erreicht, daß sich der zeit- und kostenintensive Aufwand zur Herstellung der Gele halbierte.
ORGANISATION DER PROBEN IN DEN POLYACRYLAMIDGELEN
Auf jedem Gel waren 96 Bahnen vorhanden, von denen , zwei mit einem Standardtier, das über alle Gele nicht ausgetauscht wurde, besetzt waren. Zum Test auf verunreinigte PCR-Reaktionsgefäße lief eine Bahn pro Gel ohne aufgetragene Produkte, entsprechend durften in dieser Bahn keine Fragmente erscheinen. Somit konnten maximal 93 Proben auf jedes Gel aufgetragen werden. Die Anordnung der Proben erfolgte auf Familiengelen nach einem konstant vorgegebenen Muster. Die Typisierungsergebnisse der Nachkommen konnten auf diesem Wege innerhalb eines Gels mit denen der Eltern verglichen werden. Zur Organisation der Gele wurden vier Protokolle erstellt. Die für die PCR erforderlichen dehydrierten DNA- Proben waren analog organisiert.
BESTIMMUNG DER FRAGMENTLÄNGE
Ein interner Längenstandard diente zur Bestimmung der Fragmentlängen der aufgetragenen PCR-Produkte. Dieser Standard wurde hergestellt, indem Fragmente des Vektors pGEM-4Z bei definierten Längen mittels der PCR amplifiziert wurden. Ein externer Standard wurde durch ein Tier gegeben, das auf allen Gelen unverändert blieb und jeweils mit den gleichen Markern typisiert wurde wie die untersuchte Population. Dieser sogenannte — Goldene Standardie diente dem Vergleich der vier Familiengele untereinander. Die Auswertung der Polyacrylamidgele wurde mit den Auswertungsprogrammen GeneScan 3.0 und Genotyper 2.1 (Applied Biosystems) durchgeführt. Das Programm GeneScan ermöglichte eine Analyse des kompletten Gelbildes. Manuell wurde überprüft, ob die detektierten Fragmente den jeweils korrekten Bahnen zugeordnet waren, gegebenenfalls erfolgte eine Korrektur. Weiterhin konnten ineinander verlaufene Spuren frühzeitig von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Elektropherogramme wurden mit der Software Genotyper 2.1 erzeugt und nach der Ausgabe der Daten in Form einer Tabelle visuell ausgewertet.
Ergebnisse:
GESCHLECHTSBESTIMMUNG UND TYPISIERUNGSERGEBNISSE Das Geschlecht der Spreizferkel wurde gendiagnostisch mittels einer Multiplex-PCR bestimmt. Ein Y-Chromosom spezifisches Produkt des SRYB-Gens konnte bei 173 von 246 untersuchten Ferkeln nachgewiesen werden. Bei zwei Ferkeln wurde nachträglich das Geschlecht von männlich in weiblich geändert. Dies geschah vor dem Hintergrund, daß bei der Analyse von Mikrosatelliten im nicht- pseudoautosomalen Bereich der Geschlechtschromosomen a priori erwartet wurde, daß männliche Tiere sich so verhalten, als wenn sie ein Nullallel aufweisen, da sie nur ein X-Chromosom besitzen. Für die zwei Nachkommen wurden anhand von sechs nicht-pseudoautosomalen Markern je viermal -an unterschiedlichen Loci ein heterozygoter Genotyp ermittelt. Aufgrund dieser Beobachtung geschah die Änderung.
Es wurden somit 73 Ferkel dem weiblichen Geschlecht und 173 Ferkel dem männlichen zugeordnet. Dies entspricht einem Verhältnis von männlich zu weiblich von 2,369 : 1. Die Anzahl der männlichen Nachkommen war in sieben von acht Familien höher als die Anzahl der weiblichen. Lediglich für Familie 7 konnte ein höherer Anteil weiblicher Spreizferkel dargestellt werden.
Für die Identifizierung chromosomaler Spreizer-Loci wurden 136 autosomale und pseudoautosomale Mikrosatelliten ausgewählt. Hieraus ergab sich eine kombinierte Größe des untersuchten Genoms von ca. 1.934 cM mit einem durchschnittlichen Abstand zwischen den Loci von annähernd 14 cM. Im weiteren wurden sechs X- chromosomale Marker typisiert. Insgesamt wurden etwa 52.000 Genotypen bestimmt. Bedingt durch den teilweisen Ausschluß homozygoter Eber variierte die Anzahl genotypisierter Mikrosatelliten innerhalb der acht Familien von 136 bis 140. Die Anzahl typisierter Mikrosatelliten und die Anzahl heterozygoter Loci der Eber sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Anzahl typisierter Mikrosatelliten und heterozygoter Loci je Familie
Anzahl Familie
1 2 3 4 5 6 7 8 typisierter MS 140 138 136 137 137 137 140 140 ' heterozygoter Loci 71 79 81 80 84 89 80 78
MS = Mikrosatelliten
Es wurden zwei Mikrosatelliten typisiert, für die sich alle acht Eber homozygot zeigten. Dies waren Sw749 auf Sscr 9 und S0355 auf Sscr 15. Bei neun genotypisierten Mikrosatelliten wurden aufgrund von Typisierungsfehlern einzelne Familien von der Analyse ausgeschlossen. In dieser Untersuchung sind keine Nullallele auf den Autosomen aufgetreten. Bei allen sechs Mikrosatelliten des nicht- pseudoautosomalen Bereichs zeigten sich, entsprechend der Erwartung, die männlichen Tiere homozygot. Demzufolge wurde den X-chromosomalen Mikrosatelliten Sw707, Sw980, Sw2470, Sw2476, Sw2534 und Sw2588 ein durch - 10 gekennzeichnetes Allel zugeordnet welches damit als nicht detektierbar galt. Eine Abstammungskontrolle erfolgte sukzessive unter Berücksichtigung sämtlicher Typisierungsergebnisse. Lediglich sieben Ferkel wurden identifiziert, die keinem der untersuchten Eber zuzuordnen waren und von der weiteren Analyse ausgeschlossen worden sind.
Die Bestimmung der Fragmentlängen erfolgte teilautomatisiert. Nach der elektronischen Ausgabe in Form einer Tabelle erfolgte eine visuelle Kontrolle eines jeden Allels. Die Fragmentlängen der Mikrosatelliten lagen zwischen 71 und 326 bp. Der geringste Abstand zwischen den Allelen betrug 1 bp. Die Anzahl der Allele auf den 133 Loci der Autosomen variierte zwischen 2 und 11 , durchschnittlich waren es 5,2 pro Mikrosatellit. Auf den Gonosomen wurden neun Mikrosatelliten typisiert, drei in dem pseudoautosomalen Bereich, mit durchschnittlich 5,3 Allelen pro Locus. Die sechs Mikrosatelliten des nicht- pseudoautosomalen Bereichs wiesen durchschnittlich 3,1 Allele auf. Die beobachteten Heterozygotiegrade (Hb-Gesamt, - Eber, -Sauen), die zugrundeliegende Anzahl genotypisierter Elterntiere sowie die Anzahl der Allele pro Locus sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5: Anzahl typisierter Elterntiere (n), Anzahl Allele und beobachteter Heterozygotiegrad (Hb) (Hb-Eber, -Sauen, -Gesamt) der untersuchten Mikrosatelliten-Loci
Locus n Anzahl Allele Hb-Gesamt Hb-Eber Hb- Sauen j
ACR 94 7 0,72 0,50 (8) 0,74 (86) .
IGF1 100 5 0,62 0,75 (8) 0,61 (92)
S0001 97 4 0,56 0,38 (8) 0,57 (89)
S0009 52 ■ -> 0,31 0,33 (6) 0,30 (46)
S0036 99 7 0,72 0,63 (8) - 0,73 (9.1)
S0038 93 11 0,68 0,63 (8) 0,68 (85)
S0067 97 4 0,29 0,38 (8) 0,28 (89)
S0068 95 7 0,75 0,86 (7) 0,74 (88)
S0070 96 7 0,80 0,88 (8) 0,80 (88) \
S0071 100 4 0,59 0,50 (8) 0,60 (92)
S0073 96 6 0,74 0,63 (8) 0,75 (88)
S0081 99 6 0,49 0,38 (8) 0,51 (91) '
S0087 100 3 0,63 0,63 (8) 0,63 (92)
S0090 91 4 0,44 0,38 (8) 0,45 (83)
S0097 95 • 8 0,83 0,88 (8) 0,83 (87)
S0101 97 3 0,67 0,63 (8) 0,67 (89) '
SOI 05 , 100 6 0,76 0,88 (8) 0,75 (92)
S0106 98 6' 0,72 0,75 (8) 0,72 (90)
S0111 98 8 0,84 0,86 (8) 0,83 (90) '
S0118 100 4 . 0,29 0,38 (8) 0,28 (92)
S0120 99 6 0,60 0,38 (8) 0,62 (91) '•
S0141 99 7 0,69 0,71 (7) 0,68 (92) '
S0144 99 5 0,66 0,88 (8) 0,64 (91) ■
S0148 95 5 0,56 0,63 (8) 0,54 (87)
S0178 99 7 . 0,74 0,88 (8) 0,73 (91)
S0182 97 5 0,73 1,00 (8) 0,71 (89)
S0230 60 9 0,83 0,86 (7) 0,83 (53)
S0282 99 5 0,65 0,38 (8) 0,67 (91)
S0289 99 5 0,61 0,88 (8) 0,58 (91)
S0292 98 3 0,20 0,25 (8) 0,20 (90)
S0295 95 6 0,75 0,38 (8) 0,78 (87)
S0296 100 4 0,46 . . 0,25 (8) 0,48 (92) Locus n Anzahl Allele Hb-Gesamt Hb-Eber Hb-Sauen
S0298 100 3 0,57 0,75 (8) 0,55 (92)
S0301 86 5 0,70 0,63 (8) 0,71 (78)
S0320 97 3 0,44 0,25 (8) 0,46 (89)
S0332 98 6 0,74 0,63 (8) 0,76 (90)
S0355 94 3 0,26 0,00 (8) 0,28 (86)
Sw2 100 4 0,73 0,88 (8) 0,72 (92)
Sw21 98 3 0,48 0,88 (8)" 0,44 (90)
Sw29 71 6 0,23 0,14 (7) 0,23 (64)
Sw64 96 4 0,32 0,13 (8) 0,34 (88)
S 72 100 3 0,54 0,63 (8) 0,53 (92)
Sw77 97 8 0,70 0,75 (8) 0,70 (89)
Sw81 98 4 0,58 0,50 (8) 0,59 (90)
Swl20 99 6 0,49 0,50 (8) 0,49 (91)
Swl22 93 7 0,69 1,00 (8) 0,66 (85)
Swl29 98 8 0,85 1,00 (8) 0,83 (90)
Swl68 99 4 0,63 0,38 (8) 0,65 (91)
S l75 100 4 0,65 0,75 (8) 0,64 (92)
S 210 49 4 0,63 0,71 (7) 0,62 (42)
Sw245 • 99 7 0,73 0,75 (8) 0,73 (91)
Sw262 93 4 0,17 0,25 (8) 0,16 (85)
S 274 98 6 0,58 0,63 (8) 0,58 (90)
S 328 97 3 0,42 0,38 (8) - 0,43 (89)
Sw335 99 3 0,57 0,88 (8) 0,54 (91)
Sw344 100 7 0,80 0,88 (8) 0,79 (92)
Sw378 67 3 0,34 0,50 (6) 0,33 (61)
Sw398 99 6 0,78 0,88 (8) 0,77 (91)
Sw413 97 4 0,65 0,75 (8) 0,64 (89)
Sw435 62 6 0,53 0,29 (7) 0,56 (55)
S 632 93 8 0,76 0,75 (8) 0,76 (85)
Sw703 100 0,46 0,25 (8) 0,48 (92)
Sw707 - 3 - - 0,48 (91)
S 742 95 9 0,79 0,63 (8) 0,80 (87)
Sw749 50 3 0,16 0,00 (4) 0,17 (46)
S 752 100 3 0.50 0,50 (8) 0,50 (92) Locus n Anzahl Allele Hb-Gesamt Hb-Eber Hb- Sauen
Sw764 71 4 0,30 0,43 (7) 0,28 (64)
Sw787 76 6 0,79 . 0,75 (8) 0,79 (68)
Sw856 22 11 0,95 1,00 (1) 0,95 (21)
Sw864 98 4 0,56 0,63 (8) 0,56 (90)
Sw874 99 5 0,71 0,88 (8) 0,69 (91)
Sw911 98 2 0,53 0,38 (8) 0,54 (90)
Sw920 90 2 0,36 0,29 (7) 0,36 (83)
Sw949 98 5 0,31 0,38 (8) " 0,30 (90)
S 951 97 3 0,46 0,50 (8) 0,46 (89)
Sw957 99 3 0,23 0,38 (8) 0,22 (91)
Sw96l 98 4 0,55 0,25 (8) 0,58 (90)
Sw964 99 7 0,67 0,63 (8) 0,67 (91)
Sw980 - 6 - - 0,54 (92)
Sw983 100 6 0,76 0,63 (8) 0,77 (92)
Sw995 99 5 0,78 0,63 (8) 0,79 (91)
S l026 99 3 0,47 0,63 (8) 0,46 (91)
Swl027 98 4 0,47 0,63 (8) 0,46 (90)
Swl031 99 2 0,06 0,13 (8) 0,05 (91)
S l200 96 6 0,82 1,00 (8) 0,81 (88)
Swl201 ■. 98 6 0,67 0,63 (8) 0,68 (90)
Swl301 97 7 0,70 0,75 (8) 0,70 (89)
Swl325 97 7 0,69 0,50 (8) 0,71 (89)
Swl327 98 3 0,68 0,75 (8) .0,68 (90)
Swl354 99 5 0,72 0,63 (8) 0,73 (91)
S l408 99 6 0,51 0,88 (8) 0,47 (91)
Swl460 99 4 0,64 0,63 (8) 0,64 (91)
S l468 99 5 0,58 0,38 (8) 0,59 (91)
Swl482 89 7 0,78 0,88 (8) 0,77 (81)
Swl514 100 6 0,76 0,75 (8) 0,76 (92)
Swl515 ■ 95 5 0,62 0,62 (8) 0,62 (87)
Swl551 100 5 0,74 0,75 (8) 0,74 (92)
Swl557 94 5 0,70 0,75 (8) 0,70 (86)
Swl564 99 n J 0,14 0,25 (8) 0,13 (91)
Swl621 99 2 0,42 0,88 (8) 0,38 (91) Locus n Anzahl Allele Hb-Gesamt Hb-Eber Hb-Sauen
Swl626 96 10 0,68 0,88 (8) 0,66 (88)
Swl808 96 10 0,89 1,00 (8) 0,88 (88)
S l841 99 11 0,69 0,63 (8) 0,69 (91)
Swl851 99 5 0,69 0,50 (8) 0,70 (91)
Swl894 97 3 0,73 0,75 (8) 0,73 (89)
Swl902 99 3 0,40 0,25 (8) 0,42 (91)
Swl983 100 7 0,83 0,75 (8) 0,84 (92)
Sw2008 77 4 0,48 0,25 (8) 0,51 (69)
Sw2098 99 5 0,62 0,50 (8) 0,63 (57)
Sw2401 98 6 0,79 0,75 (8) 0,79 (90)
Sw2404 96 6 0,61 0,63 (8) 0,61 (88)
S 2406 99 4 0,63 0,75 (8) 0,62 (91)
S 2408 98 6 0,71 0,75 (8) 0,71 (90)
S 2410 99 4 0,25 0,13 (8) 0,26 (91)
Sw2419 99 6 0,80 0,38 (8) 0,84 (91)
Sw2425 99 5 0,73 0,75 (8) 0,73 (91)
Sw2431 98 6 0,71 0,63 (8) 0,72 (90)
Sw2441 100 7 0,81 0,88 (8) 0,80 (92)
Sw2443 97 6 0,65 0,88 (8) 0,63 (89)
Sw2470 - 3 - - 0,45 (91)
Sw2476 - 4 - - 0,33 (92)
S 2490 99 6 0,68 0,38 (8) 0,70 (91)
S 2491 96 7 0,70 0,63 (8) 0,70 (88)
S 2517 100 7 0,70 0,75 (8) 0,70 (92)
S 2521 99 4 0,67 0,63 (8) 0,67 (91)
Sw2534 - 5 - - 0,63 (89)
Sw2564 100 3 0,33 0,25 (8) 0,34 (92)
Sw2570 99 6 0,70 0,63 (8) 0,70 (91)
Sw2588 - 4 - - 0,47 (92)
Sw2618 99 6 0,71 0,75 (8) 0,70 (91)
Swc9 99 7 0,48 0,50 (8) 0,48 (91)
Swcl9 96 2 0,18 0,25 (8) 0,17 (88)
Swc27 98 3 0,56 0,50 (8) 0,57 (90)
S r773 98 2 0,48 0,86 (8) 0,44 (90) Fortsetzung
Locus n Anzahl Allele Hb-Gesamt Hb-Eber Hb-Sauen
Swr982 51 4 0,47 0,50 (6) 0,47 (45)
S rl004 100 5 0,75 0,75 (8) 0,75 (92)
Swrl lOl 68 11 0,76 1,00 (5) 0,75 (63)
Swrl343 100 4 0,63 0,50 (8) 0,64 (92)
Swrl533 94 3 0,43 0,50 (8) 0,42 (86)
S rl637 74 4 0,41 0,75 (8) - 0,36 (66)
Swrl941 100 6 0,71 0,88 (8) 0,70 (92)
Swr2516 98 7 0,66 0,88 (8) 0,64 (90)
Ziffer in Klammern = Anzahl genotypisierter Eber bzw. Sauen. Maximal 8 Eber und 92 Sauen - = nicht-pseudoautosomale Marker, männliche Tiere erscheinen a priori wie homozygot
Der Gesamt-Heterozygotiegrad variierte erwartungsgemäß stark. Die ermittelten Werte in Tabelle 5 müssen immer in Hinblick auf die zugrundeliegenden Tierzahlen interpretiert werden, da nicht immer alle Familien mit jedem Mikrosatelliten typisiert wurden. Über alle autosomalen- sowie den nicht-pseudoautosomalen Loci betrug der Hb-Gesamt = 0,59. Der Marker mit dem niedrigsten Gesamt-Heterozygotiegrad war Sw1031 mit Hb = 0,06 (n = 99) der höchste Heterozygotiegrad wurde für den Marker Sw1808 mit Hb = 0,89 ermittelt (n = 96). Innerhalb der Eber ist der geringste Heterozygotiegrad an den Markern Sw64, Sw1031 und Sw2410 mit Hb = 0,13 beobachtet worden. Das Maximum von Hb = 1 und damit Heterozygotie bei allen acht Ebern wurde lediglich bei fünf untersuchten Mikrosatelliten ermittelt (S0182, Sw122, Sw129, Sw1200 und Sw1808). Unter den Sauen wurden die höchsten Heterozygotiegrade für die Marker Sw2419 und Sw1983 mit H = 0,84 (n = 91 und 92) sowie Sw1808 mit Hb = 0,88 (n = 88) ermittelt. Der Hb-Sauen am Locus Sw856 mit 0,95 wurde z. B. an lediglich 21 Sauen ermittelt. Entsprechend dem Gesamt- Heterozygotiegrad und dem innerhalb der Eber wurde, für die Sauen am Locus Sw1031 mit Hb = 0,05 der geringste Wert dargestellt. Beispiel 2: Markerkarten und Informationsgehalt der Markerloci
Aufgrund der Ergebnisse der merkmalsgestützten Mehrpunkt-Kopplungsanalyse (vide infra) werden im folgenden nur die Chromosomen graphisch dargestellt, die sich kopplungsrelevant zeigten, d. h. auf denen Markerintervalle identifiziert wurden, die eine höhere Teststatistik im Vergleich zu anderen Bereichen des untersuchten Genoms oder einen LOD-Score > 3 aufwiesen.
STATISTISCHE METHODEN ZUR ERSTELLUNG VON MARKERKARTEN
Aus den Typisierungsergebnissen und dem Pedigree wurden eigene genetische Karten mit dem Programm CRI-MAP 2.4 (GREEN et al., 1990), mit den Optionen
Twopoint, Build und Flips berechnet. Die dazu benötigte Input-Datei wurde mit dem
Fortran-Programm — einfachrir generiert. CRI-MAP benutzt zur Kopplungsanalyse genetischer Loci einen Maximum- Likelihood-Ansatz sowie die Kosambi-
Kartierungsfunktion. Die Ableitung der co- informativen Meiosen erfolgte mit dem Fortran-Programm — futurejr. Die co-informativen Meiosen beziehen sich immer auf das Intervall zwei er benachbarter Marker. Für die Chromosomen Sscr 7 und 16 wurden die genetischen Karten approximativ erstellt, da es nicht möglich war, mit dem Programm CRI-MAP 2.4 (GREEN et al., 1990) alle Markerloci dieser
Chromosomen simultan einordnen zu lassen. Durch sukzessives Vorgehen wurde, zuerst die maximale Anzahl Markerloci bestimmt, die sich simultan anordnen ließen.
Aus diesen Karten wurde anschließend je eine Kopplungskarte für Sscr 7 und 16 erstellt.
Für die X-chromosomalen, nicht-pseudoautosomalen Marker wurde den acht Ebern ein hypothetischer Genotyp zugeordnet, der zwei nicht detektierbaren Allelen entsprach. Bei den weiblichen Nachkommen wurde das väterliche Allel entsprechend definiert, als ob es sich wie ein Nullallel verhalten würde. Die männlichen Nachkommen blieben unverändert, da bei diesen ohnehin nur das mütterliche Allel nachweisbar war. Ebenso blieben die typisierten Sauen unverändert. Diese Änderungen erfolgten vor dem Hintergrund, daß der berechnete Informationsgehalt der Halbgeschwisterfamilien ohne diese Modifikation zu hoch eingeschätzt wurde, da die Anzahl informativer Meiosen verfälscht war. Da männliche Individuen nur ein X-Chromosom besitzen, kann im Normalfall keine Rekombination während der Meiose stattfinden. Dementsprechend wurde für die sechs nicht- pseudoautosomalen Marker nur die weibliche Kopplungskarte erstellt. Für die Bestimmung der Anzahlen der Allele und des Heterozygotiegrades wurde dieser hypothetische Genotyp nicht mitgezählt.
MARKERKARTEN Anhand der untersuchten Mikrosatelliten-Loci wurde eine kombinierte Länge, inklusive der nicht-pseudoautosomalen Marker von 2.126 cM mit dem Programm CRI-MAP (GREEN et al., 1990) für das Genom ermittelt. Alle Angaben beziehen sich auf die Kartierungsfunktion Kosambi (KOSAMBI, 1944). Die Chromosomen des autosomalen Bereichs (Sscr 1 bis 18) umspannten eine Länge von 1.929 cM, für den pseudoautosomalen Bereich der Geschlechtschromosomen wurde eine kombinierte Größe von 5,1 cM und für den X- chromosomalen nicht- pseudoautosomalen Bereich von 187,5 cM dargestellt. Die Positionen der Mikrosatelliten (cM) entlang der kombinierten und nach Geschlechtern getrennten Karten, der LOD-Score (Zweipunkt, Twopoint) sowie die Anzahl der informativen und coinformativen Meiosen sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
Anhand der eigenen Typisierungsergebnisse wurde für die weibliche Kopplungskarte eine Länge von 2.398,5 cM und für die männliche eine Länge von 1.723,7 cM, basierend auf den Chromosomen Sscr 1 bis 18, geschätzt. Dies entspricht einem Verhältnis von 1 ,39 : 1 (weiblich : männlich). Die entsprechende kombinierte Karte wies eine Länge von 1.929,0 cM auf. Die Reihenfolge der Markerloci entsprach der Reihenfolge der in den frei zugänglicher Datenbanken notierten Markerloci. In den Figuren 1 , 2 und 3 sind die weiblichen, kombinierten und männlichen Kopplungskarten der Chromosomen Sscr 3, 5 und 11 wiedergegeben. Tabelle 6- Positionen (cM) der Mikrosatelliten auf der kombinierten (komb.), der weiblichen (weibl.) und männlichen (männl.) Kopplungskarte (Multipoint), LOD-Score und Rekombinationsrate ( ) (Twopoint) und Anzahl informativer Meiosen unbekannter Phase der Marker sowie der coinformativen Meiosen
Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) θ LOD- inf. coinf. Score komb. weibl. männl. (Twopoint) Meiosen Meiosen
Swl514 0,0 • 0,0 0,0 - - 364" -
Swl515 21,6 17,3 23,9 0,18 10,10 223 185
Sw64 28,8 24,0 33,2 0,07 3,14 130 37
Swl851 47,3 38,1 55,1 0,19 5,31 248 95
Swl621 81,5 56,1 99,8 0,30 1,49 241 115
Swl902 81,7 56,1 99,8 0,00 5,12 148 27
Swr982 83,4 56,8 102,1 0,00 2,71 75 15
S0320 122,7 104,6 140,8 0,13 0,51 108 ' 13
Swl301 150,4 150,5 159,7 0,27 1,14 319 67
2 S r2516 0,0 0,0 0,0 - - 365 -
2 Sw2443 0,0 0,0 0,0 0,00 89,10 358 352
2 S c9 0,5 0,0 0,8 0,01 44,55 219 193
2 SO 14.1 25,1 36,9 21,9 0,26 4,56 337 149
2 Swl201 39,4 . 52,4 34,9 0,12 16,11 250 175 "
2 S l564 55,8 68,8 51,9 0,16 1,47 97 25
2 Swl026 59,4 68,9 56,4 0,04 12,90 260 . 59
2 Swl408 84,0 85,3 83,0 0,23 7,89 308 165
2 S0036 121,2 115,7 122,3 0,32 1,87 259 175
3 Sw274 0,0 0,0 0,0 — - 287 -
3 S 72 41,2 37,9 " 44,4 0,30 0,77 203 90
3 Swrl637 44,0 45,4 44,4 0,03 14,38 188 72
3 Sw2618 63,2 77,4 57,0 0,15 5,66 275 69
3 Sw2570 82,7 96,6 78,5 0,18 10,25 259 182
3 Sw2408 104,2 143,9 87,1 0,21 5,73 234 147
3 S l327 118,7 164,1 100,9 0,14 7,26 325 103 Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) θ ' LOD- inf. co-inf. Score kornb. weibl. männl. (Twopoint) Meiosen Meiosen
4 Sw2404 0,0 0,0 0,0 - - 295' -
4 S0301 30,4 60,7 25,2 0,27 5,51 315 177 ,
4 S0001 47,4 72,6 46,3 0,13 12,60 218 142
4 Sw752 49,3 75,9 46,3 0,01 17,18 240 78
4 S0073 70,7 104,8 65,9 0,19 6,48 272 115
4 S0067 99,4 204,& 84,5 0,21 . 5,17 ,134 95
4 S0097 121,5 233,2 106,3 0,19 7,78 373 121
4 Sw856 134,2 246,5 118,5 0,12 7,84 93 76
5 ACR 0,0 0,0 0,0 - - 233 —
5 Sw413 0,6 1,3 0*,0 0,01 36,18 276 162
5 Swl482 18,3 15,9 19,9 0,17 11,91 305 189
5 Sw2425 45,7 66,4 41,8 0,24 9,78 334 233
5 Sw2 52,8 72,0 50,4 0,07 31,17 304 217
5 Swl468 74,1 124,8 59,1 0,23 4,54 170 126
5 Swl200 88,2 148,6 73,0 0,16 6,38 372 122
5 IGF1 100,0 155,4 87,4 0,13 22,20 310 235
5 Sw995 105,3 160,7 92,5 0,06 20,35 275 149
5 Sw378 115,3 176,9 99,1 0,13 4,78 83 61
6 Sw2406 0,0 0,0 0,0 - ' - 305 —
6 Swl841 16,5 4,3 25,0 0,14 10,66 249 146
6 S0087 40,2 28,2 48,0 0,22 6,52 282 ■ 159
6 Swl22 51,9 48,9 56,9 0,12 21,58 333 197
6 Sw2098 - 78,9 71,6 86,1 0,25 6,41 310 210
6 Sw2419 112,4 115,6 108,5 0,28 2,54 231 179
7 Sw2564 0,0 0,0 0,0 - - 161 —
7 Swrl343 24,2 17,9 27,9 0,21 1,94 234 69
7 Swl354 29,8 23,6 33,3 0,05 23,03 323 157
7 Swl75 74,1 54,3 81,4 0,36 1,24 329 213
7 Sw632 94,9 79,6 101,2 0,22 4,91 263 140
7 Swr773 110,3 99,1 114,7 0,18 . 5,37 250 93
7 S0101 121,5 112,8 124,6 0,11 12,39 237 112
7 Sw764 145,9 138,6 149,0 0,21 4,00 124 76 Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) θ LOD- inf. co-inf. Score komb. weibl. männl. (Twopoint) Meiosen Meiosen
8 Sw2410 0,0 0,0 0,0 - - 72 —
8 Sw2521 23,1 23,1 23,1 0,46 0,00 314 49
8 SwrllOl 103,0 91,2 113,1 0,48 0,00 270 177
8 Sw29 125,5 146,8 131,6 0,20 4,46 82 60
8 S0144 137,5 156,4 144,0 0,13 5,78 332 55
8 Swl551 148,4 169,7 ' 153,3 0,10 19,93 302 174
8 S0178 175,2 195,0 181,1 0,23 9,13 366 229
9 Sw983 0,0 0,0 0,0 - - 229 —
9 Sw21 6,1 5,1 6,6 0,05 15,37 297 107
9 Sw911 27,4 34,3 26,2 0,19 5,63 199 92
9 Sw2401 40,0 48,4 38,0 0,12 15,89 314 168
9 S0081 68,2 83,6 56,2 0,22 2,92 198 104
9 S0295 86,6 101,5 75,0 0,17 9,76 233 155
9 Sw749 162,3 185,0 75,0 0,49 0,00 16 19
10 S0038 0,0 0,0 0,0 _ - 319 —
10 Swl894 26,2 23,1 27,3 0,23 9,81 343 248
10 Sw2491 38,2 43,3 35,5 0,12 23,07 308 222
10 Swcl9 44,8 54,7 39,7 0,03 26,07 139 115
10 S0070 50,8 77,1 39,7 0,02 26,99 354 111
10 Sw920 78,1 108,7 64,1 0,23 1,54 83 68
10 Sw951 108,4 124,5 106,5 0,28 0,20. 155 27
10 Swl626 111,6 129,3 108,0 0,03 21,85 346 128
Swl460 0,0 0,0 0,0 - - 256 -
Sw2008 3,6 2,7 4,4 0,03 17,01 193 88
S0182 18,7 39,9 9,9 0,11 19,23 382 144
S0071 25,0 48,0 15,1 0,07 21,96 224 152
S0230 33,1 64,8 18,8 0,07 17,59 251 119
Sw435 39,9 76,5 18,8 0,02 7,89 99 44
S0009 39,9 82,4 23,0 0,00 2,41 103 16
Sw703 62,1 96,8 45,8 0,18 4,02 167 53 Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) θ LOD- inf. co-inf. Score komb. weibl. männl. (Twopoint) Meiosen Meiosen
12 Sw2490 0,0 0,0 0.0 - - 186 -
12 Sw957 24,9 22,9 26,5 0,29 0,10 185 22
12 Sw874 38,1 35,9 39,4 0,13 17,70 351 150
12 Swl68 42,5 45,3 40,6 0,05 27,18 234 163
12 S0090 52,6 57,2 51,3 0,10 13,91 177 115
12 S0106 68,8 86,2 58,9 0,17 5,31 298 96
13 S0282 0,0 0,0 0,0 - - 163 -
13 Swrl941 15,2 15,0 14,5 0,14 8,82 295 141
13 Sw344 41,5 81,6 34,1 0,23 10,09 377 253
13 Sw864 43,7 81,6 37,5 0,02 44,85 268 204
13 S0068 65,3 92,0 6ό ) 0,22 8,68 347 191
13 Swl29 71,6 93,6 75,3 0,07 46,83 398 309
13 Sw398 79,4 98,0 85,7 0,07 37,63 311 284
13 S0289 100,8 132,1 104,1 0,18 14,25 332 216
14 Swl027 0,0 0,0 0,0 - - 220 —
14 sw245 14,6 8,7 17,5 0,15 11,79 331 154
14 Sw210 28,3 19,1 32.2 0,18 4,27 132 85
14 Sw328 43,1 45,4 43,6 0,23 0,70 237 33
14 Sw77 54,6 48,9 58,4 0,11 19,00 321 159
14 Swl557 72,2 74,1 72,6 0,18 15,34 321 218
14 Swc27 94,9 114,2 89,5 0,21 6,27 200 126
15 S0355 0,0 0,0 0,0 - - 65 —
15 S0148 16,1 14,4 0,0 0,12 2,56 292 38
15 Sw964 30,1 35,7 10,8 0,12 21,64 293 203
15 S0118 33,9 38,7 14,2 0,04 13,40 101 86
15 Swrl533 44,6 60,2 21,4 0,13 1,31 237 18
15 Swl20 51,6 68,5 27,2 0,08 12,49 221 89
15 Swl983 68,0 89.4 41,5 0,18 11.57 348 185 Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) θ LOD- i inf. co-inf. Score . 1 komb. weibl. männl. (Twopoint) Meiosen Meiosen '
16 SOI 1 1 0,0 0,0 0,0 - - 364 -
16 Sw742 11,0 13,0 9,9 0.11 21,37 291 242
16 S0298 29,8 40,6 25,1 0,18 9,01 304 149
16 Sw81 38,6 50,0 34,1 0,11 10,91 217 95 ,
16 Sw262 45,9 61,8 39,3 0,08 11,41 97 77
16 Sw2517 55,5 75,3 47,1 0,10 10,71 339 83
16 SOI 05 72,9 90,8 65,7 0,15 16,59 314 225
17 Sw335 0,0 0,0 0,0 - — 301 -
17 Swrl004 13,0 8,8 14,7 0,13 21,37 341 206
17 S0296 25,2 35,2 20;4 0,11 9,24 141 99
17 Sw2441 30,9 42,8 26,0 0,06 18,08 370 135
17 S0292 46,0 61,9 38,6 0,12 12,76 132 109
17 Swl031 52,2 63,2 52,8 0,04 4,80 38 25
17 S0332 70,8 95,9 62,1 0,19 5,64 328 11
17 Sw2431 74,6 103,6 62,1 0,04 30,38 259 188
18 Swl808 0,0 0,0 0,0 - - 400 -
18 Sw787 28,1 59,2 21,3 0,25 8,51 275 244
18 S0120 39,7 68,2 34,0 0,11 16,13 205 154
XY Sw949 0,0 0,0 0,0 - - 147 -
XY Sw961 5,1 5,6 3,9 0,04 6,93 155 48
XY Swl325 5,1 5,6 3,9 0,00 27,09 225 ' 129
X Sw980 — 19,4 — 0,15 4,26 114 —
X Sw2534 — 43,9 — 0,22 1,58 115 71
X Sw2476 ~ 66,7 — 0,22 1,00 77 52
X Sw2470 — 98,9 — 0,33 0,14 93 40
X Sw707 ~ 183,7 — 0,50 0,00 97 58
X Sw2588 — 193,1 — 0,09 3,51 84 50
Chr. = Chromosom inf. Meiosen = informative Meiosen coinf. Meiosen = co-informative Meiosen
- = nicht besetzt, da immer das Intervall zum folgenden Locus betrachtet wird
— = genetische Karte wurde nur für das X-Chromosom gerechnet INFORMATIONSGEHALT DER MARKERLOCI
Der Informationsgehalt liegt zwischen den Werten Null und Eins. Der Wert Eins impliziert, daß der Eber der betrachteten Familie heterozygot ist und bei allen Nachkommen die Ableitung des väterlichen Allels eindeutig ist. Dieser Idealfall ist unter praktischen Bedingungen kaum zu erreichen. Über die Anzahl der coinformativen Meiosen ist eine Abhängigkeit des Informationsgehalts von der Anzahl typisierter Mikrosatelliten gegeben, dies spiegelt sich insbesondere bei Markern wider, die auf den Chromosomen randständig angeordnet sind. Bei diesen ist die Anzahl der coinformativen Meiosen zu benachbarten Markern niedriger als bei zentral platzierten, so daß der Informationsgehalt des ersten und letzten Markers auf einem Chromosomen meist niedriger ist.
Tabelle 7: Chromosomenweiter Mittelwert, Minimum und Maximum des Informationsgehaltes auf der Kopplungskarte
Chromosom Mittelwert Minimum Maximum
1 0,66 0,44 0,86
2 0,75 0,55 0,91
3 0,70 0,56 0,81
4 0,72 0,62 0,87
5 • 0,81 0,71 0,93
6 0,74 0,48 0,92
7 0,70 0,52 0,86
8 0,60 0,29 0,94
9 0,49 0,05 0,88
10 0,75 0,50 0,93
11 0,81 0,61 0,93
12 0,79 0,57 0,95
13 0,66 0,44 0,86
14 0,79 0,64 0,90
15 0,77 0,56 0,84
16 0,85 0,79 0,93
17 0,82 0,70 0,92
18 0,76 0,68 0,94
XY* 0,53 . 0,52 0,53
Genomweit 0,71 0,05 0,95
■ pseudoautosomaler Bereich Der durchschnittliche Informationsgehalt der untersuchten Population lag bei 0,71. Die erzielten chromosomalen Mittelwerte sowie die Angabe der Minima und Maxima des Informationsgehaltes sind in Tabelle 7 dargestellt. Eine graphische Darstellung des Informationsgehaltes der Chromosomen 3, 5 und 11 ist in den Figuren 4, 5 und 6 gegeben..
Beispiel 3: Ergebnisse der merkmalsgestützten Mehrpunkt-Kopplungsanalyse
Für die Analyse merkmalsassoziierter Haplotypen wurde eine nichtparametrische Maximum-Likelihood-Methode angewendet, ohne Annahmen über den Erbgang des Merkmals (REINSCH, 2002). Das Prinzip der Auswertung wird im folgenden erläutert. Unter der Annahme einer väterlichen Halbgeschwisterfamilie und einem am Krankheitslocus heterozygoten Eber (Allele D, d) mit zwei flankierenden Markern kann zwischen vier verschiedenen Typen von Nachkommen (Typ 1 bis 4) unterschieden werden, unter der Annahme, daß alle Nachkommen informativ sind. Wird unter sonst gleichen Voraussetzungen nur ein einzelner Marker betrachtet, können zusätzlich zwei Typen von Nachkommen (Typ 5 und 6) unterschieden werden.
Basierend auf den im Genomscan erhobenen Daten konnten drei kopplungsrelevante chromosomale Regionen identifiziert werden. Die erzielten Ergebnisse des autosomalen Genomscans mit chromosomaler Lokalisation der erreichten Maxima in cM (Kosambi), der Teststatistik ( 2 ) sowie der punktweisen Irrtumswahrscheinlichkeit ( -comparisonwise) sind in Tabelle 8 dargestellt. Um die erzielten Ergebnisse nach ihrer Relevanz einordnen zu können, ist der punktweise LOD-Score mit einem Freiheitsgrad angegeben, der zu der gleichen Irrtumswahrscheinlichkeit führt wie der durchgeführte Test mit 16 Freiheitsgraden. Anhand der Teststatistik und der Irrtumswahrscheinlichkeit ließen sich drei chromosomale Regionen deutlich von den verbleibenden untersuchten Bereichen abgrenzen. Auf Chromosom Sscr 3 wurde an der Position 64 cM (Kosambi) ein LOD-Score von 2,05 erreicht, womit eine Kopplung zwischen den benachbarten Mikrosatelliten und einem hypothetischen Locus möglich erscheint. Tabelle 8: Chromosom, Maximum der Teststatistik ( 2 ), punktweise Irrtumswahrscheinlichkeit ( -comparisonwise), Position (cM-Kosambi) und abgeleiteter LOD-Score
Chromosom χ2 α-comparisonwise Position (cM) . LOD-Score*
1 22,3364 0,13265670 21 0,49
2 32,2780 0,00919854 0 1,47
3 36,9975 0,00209880 64 2,05
4 31,9323 0,01020457 104 1,43
5 50,6759 0,00001788 81 >3,00
6 24,1541 0,08619232 52 0,63
7 32,2227 0,00935301 74 1,46
8 22,7457 0,12070424 103 0,52
9 22,1318 0,13898629 6 0,47
10 19,5267 0,24229950 86 0,29
11 48,1073 0,00004569 19 >3,00
12 27,8898 0,03259102 42 0,99
13 22,0985 0,14003884 70 0,47
14 24,1689 0,08587954 5 0,64
15 28,6930 0,02609050 16 1,07
16 32,1187 0,00964996 23 1,45
17 - 20,7239 0,18937064 74 0,37
18 28,0193 0,03145245 28 1,00
XY 27,0209 0,04125170 5 0,90
* = es ist derjenige LOD-Score mit einem Freiheitsgrad angegeben, der zu der gleichen punktweisen Irrtums Wahrscheinlichkeit führt wie der durchgeführte Test mit 16 Freiheitsgraden
Für die Chromosomen Sscr 5 und 11 wurden mit LOD-Score- Werten > 3 chromosomale Bereiche eingegrenzt, bei denen eine statistisch gesicherte Kopplung vorliegt. Der Verlauf der Teststatistik und der zugehörigen Irrtumswahrscheinlichkeit ist für die Chromosomen Sscr 3, 5 und 11 in den Figuren 7, 8 und 9 verzeichnet.
Der Maximalwert der Teststatistik wurde an Position 64 cM mit einem χ 2 -Wert von rund 37 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0,00209 erreicht. Flankiert von den Mikrosatelliten Sw2618 an Position 63,2 cM sowie Sw2570 an 82,7 cM der kombinierten Karte. Das Intervall zwischen den flankierenden Markern betrug 14, 1 cM.
I RTUMSWAHRSCHEIN ICHKEIT
Beiderseits des für Chromosom Sscr 5 in Figur 7 dargestellten Bereichs (Positionen 25 bis 95 cM) stieg die Irrtumswahrscheinlichkeit kontinuierlich an, wobei der Verlauf der Teststatistik abgenommen hat. Das Maximum erreichte die Teststatistik an der Position 81 cM mit einem χ z -Wert von rund 51 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als α = 0,00002. Die flankierenden Mikrosatelliten sind Sw1468 an der Position 74,1 cM sowie Sw1200 kartiert an Position 88,2 cM der kombinierten Karte. Das Intervall zwischen den flankierenden Markern betrug 19,5 cM.
Auf Chromosom Sscr 11 erreichte die Teststatistik ihren maximalen Wert an Position 19 cM mit % 2 = 48 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit an dieser Position von weniger als α = 0,00005. Die flankierenden Marker an dieser Position sind S0182 auf der Position 18,7 cM sowie S0071 an der Position 25,0 cM kartiert auf der kombinierten Karte. Das Intervall der flankierenden Marker betrug 6,3 cM. Für die Chromosomen Sscr 2, 4, 7 und 16 konnten im Vergleich zu den verbleibenden Chromosomen des Genoms erhöhte χ 2 -Werte der Teststatistik entlang der Positionen in cM geschätzt werden (Tabelle 8). Die Irrtumswahrscheinlichkeit entsprach für diese vier Chromosomen einem abgeleiteten LOD-Score zwischen 1 ,43 und 1 ,47. Entlang der Positionen in cM der Chromosomen Sscr 1 , 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 18 sowie des pseudoautosomalen Bereichs der Geschlechtschromosomen wurde ein abgeleiteter LOD-Score geschätzt, der zwischen 0,29 und 1 ,07 lag (Tabelle 8). Beispiel 4: Allele die ein erhöhtes Risiko zur Ausprägung des Phänotyps „Spreizbeinigkeit" aufweisen
Dargestellt sind im folgenden die Marker: Sw1468, Sw1200 für Chromosom 5 und S0182, S0071 und S0230 für Chromosom 11. Die identifizierten Allele sind jeweils mit den Buchstaben N, G und R gekennzeichnet.
N (neutral) steht für Allele die sich neutral verhalten haben, d. h. es war keinerlei Effekt auf die Ausprägung des untersuchten Merkmals im Datensatz erkennbar.
G (gesund) steht für Allele von denen eine höhere Wahrscheinlichkeit ausgeht nicht von dem Spreizersyndrom betroffen zu werden.
R (Risiko) steht für Allele von denen ein erhöhtes Risiko ausgeht von dem Spreizersyndrom betroffen zu werden.
Auf Chromosom 5 konnten für den Mikrosatelliten Sw1468 insgesamt 5 Allele (141, 145, 147, 149 und 153 bp) in der untersuchten Population identifiziert werden. Für das Allel 5 (153 bp) kann ein erhöhtes Risiko an dem Spreizersyndrom zu erkranken dargestellt werden.
Allel 141 145 147 149 153
Sw1468 N N N N R
N = neutrales Allel R = Risikoallel Auf Chromosom 5 konnten für den Mikrosatelliten Sw1200 insgesamt 6 Allele (142, 150, 152, 154, 156 und 158 bp) in der untersuchten Population identifiziert werden. Für Das Allel 154 bp kann ein erhöhtes Risiko an dem Spreizersyndrom zu erkranken dargestellt werden.
Allel 142 150 152 154 156 158
Sw1200 N ■ G G R N N N = neutrales Allel
G = kein Gesundheitsrisiko R = Risikoallel
Auf Chromosom 11 konnten für den Mikrosatelliten S0182 insgesamt 5 Allele (119, 132, 134, 139 und 141 bp) in der untersuchten Population identifiziert werden. Für das Allel 141 bp kann ein deutliches Kopplungsungleichgewicht dahingehend dargestellt werden, daß Tiere, die dieses Allel erhalten haben ein erhöhtes Risiko aufweisen an dem Spreizersyndrom zu erkranken.
Allel 119 132 134 139 141
S0182 R G G N R
N = neutrales Allel
G = kein Gesundheitsrisiko
R = Risikoallel
Auf Chromosom 11 konnten für den Mikrosatelliten S0071 insgesamt 4 Allele (184, 186, 188 und 191 bp) in der untersuchten Population identifiziert werden. Ferkel mit dem ersten Allel (184 bp) tragen ein erhöhtes Risiko von der Erkrankung „Spreizer" betroffen zu werden.
Allel 184 186 188 191
S0071 R N N N
N = : neutrales Allel
R = : Risikoallel
Auf Chromosom 11 konnten für den Mikrosatelliten S0230 insgesamt 9 Allele (297, 300, 307, 309, 311 , 313, 315, 323 und 326 bp)in der untersuchten Population identifiziert werden. Ferkel, die die Allele 300 und 311 bp geerbt haben tragen ein erhöhtes Risiko von dem Spreizersyndrom betroffen zu werden.
Allel 297 300 307 309 311 313 315 323 326
S0230 N R G N R N N N N
N = neutrales Allel
G = kein Gesundheitsrisiko
R = Risikoallel Beispiel 5: Verifizierung der Primärergebnisse
VORARBEITEN UND ANSCHLUBVORHABEN
Zur Erweiterung der bisher bestehenden Ergebnisse, beschrieben bei Schwarz (2003) die Grundlage für die prioritätsbegründende EP-Patentanmeldung Nr. 02 02 2810.2 waren, wurden insgesamt 21 weitere Mikrosatelliten-Loci untersucht. Lokalisiert auf den porcinen Chromosomen (Sscr) 3, 5 und 11. Im einzelnen waren es für Sscr 3: Sw2021, Sw2597, Sw902, S0164, ACTG2 und Swr2096. Für Sscr 5 waren es: S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 und Sw1982. Für Sscr 11 wurden die Marker: S0385, Sw486, Sw1465 und Sw2413 typisiert. Die untersuchten Marker für Sscr 3 dienten der Überprüfung der im Vergleich zum verbleibenden Genom erhöhten Teststatistik. Die neu untersuchten Marker für die Chromosomen 5 und 11 dienten der Verfeinerung und Absicherung der Ergebnisse, für die bereits eine signifikante Kopplung dargestellt wurde.
ANGEWANDTE AMPLIFIKATIONSBEDINGUNGEN
Die gewählten Amplifikationsbedingungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie die Kombination in Multiplex-Gruppen und die Bedingungen separat amplifizierter Mikrosatelliten sind in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9: Multiplex-Gruppen und PCR-Bedingungen separat amplifizierter Mikrosatelliten- Loci
Multiple* -Set Locus Chr. Dye1 μl Primer2 U Tag3 Puffer TA (°C)4 Anz. Zyklen5
A ACTG2 3 F 0,22 0,30 1 ,0 58 36 Sw902 3 F 0,20
B Sw904 ' 5 T 0,30 0,30 1 ,2 58 40 S0005 5 T 0,30
Sw1465 11 T 0,20 0,30 1 ,0 55 34 Sw486 11 H 0,30
D Sw2021 3 T 0,17 0,30 1 ,0 62 32 S0164 3 T 0,35
E Sw1982 . 5 F 0,18 0,30 0,8 58 37 Sw986 5 H 0,16
Separat Swr2096 3 H 0,30 0,30 1 ,0 58 33
Separat Sw963 5 T 0,30 0,30 1 ,0 58 36
Separat Sw2413 11 F 0,15 Q,20 1 ,2 62 29
Separat Sw310 5 H 0,30 0,40 1 ,2 62 37
Separat S0018 5 T 0,25 0,30 1 ,0 58 36
Separat SW1987 5 F 0,20 0,30 1 ,0 58 34
Separat S0385 .11 H 0,37 0,40 1 ,3 55 43
Separat Sw2597 3 T 0,15 0,20 1 ,0 55 31
Separat Sw1094 5 T 0,18 0,30 1 ,0 58 34
Separat Swr1974 5 F . 0,14 0,30 1 ,0 55 32
Separat Swr426 5 T 0,18 0,30 1 ,0 58 36
1 = Fluoreszenzmarkierung der Primer: F = Farn, H = Hex, T = Tet
2 = Konzentration 10 μmol/l je Primer
3 = Units Tag-PIoymerase
4 = Annealingtemperatur der PCR
5 = Anzahl der Zyklen
SEQUENZEN
In Tabelle 10 sind die verwendeten Primersequenzen der 21 untersuchten Mikrosatelliten-Loci verzeichnet. Entsprechend den bisher vorgelegten Ergebnissen waren die Primer fluoreszenzmarkiert am 5'-Ende des forward primer. Die jeweilige Markierung ist Tabelle 9 zu entnehmen. Tabelle 10: Primersequenzen der untersuchten Mikrosatelliten-Loci
Locus Chr. forward primer (5'-3') reverse primer (5'-3')
Sw2021 3 gcgacacatgagataaaactgc aatccacaggcttactcagatg
Sw2597 3 aatggataaacaaaacgtggtc gtgtctttatggtggaatgatattcaacg
Sw902 3 atcagttggaaatgatggcc cttgcctcaaagagttgtaagg
S0164 3 tatgccgtttgcgcagtccta aggccaccagggaactccatt
ACTG2 3 catcttcctcttcccttccc tgtggactcaaggctgtaagc •
Swr2096 3 aggtgtgggcctctgtacac gatcttccctcccctccc
S0005 5 tccttccctcctggtaacta g cacttcctg attctgggta
Sw963 5 tctgttgtttcccaccagc tgtgcacctgacacatagactc
Sw1987 5 tgagcagataggcagacttctg tttaaggggcatgtttgagg
S0018 5 g cacagttgatg cttcatg c gatcaaaagtccccaattcc
Sw904 5 cccctttcagaagaatgaaaa cctagtggccaacaccaagt
Sw310 5 cagaaggatgaatatgcaaaatg gtctttcaggcttggaggg
Swr1974 5 acgggaaccccaggatatac gtgtcttaaattaaattgccattaccaagag
Swr426 5 cctacatatg ccg caggtg gtgtcttgagaagtggggaagggactc
Sw1094 5 gatcatggtgtaccatcctttata gtgtcttattcttgatgttggtacatggtg
Sw986 5 aggaagcaaaatcttaagaggc gtgtcttggtgagccaggaacaagtatg
Sw1982 5 cattatcagcgacttcaaggc gtgtctttggcgcttctattggagtg
S0385 11 ctattaggctggagggttg agttcagaagctgttgct
Sw486 11 gcaaatacttggtggccg tccatttgctaataaagagctga
Sw1465 11 ctg cttctgg caataatg aac tgtgtcgtagctgctgttcc
Sw2413 11 aaagaccgggtcctcctg cattccatccg ccctacc
MARKERKARTEN
Über die Erweiterung der Untersuchung auf 21 Mikrosatelliten-Loci, lokalisiert auf den Chromosomen 3, 5 und 11 wurde eine kombinierte Länge inklusive der nicht- pseudoautosomalen Marker von 2.164,9 cM Kosambi mit dem Programm CRI-MAP (Green et al., 1990) für das untersuchte Genom ermittelt. Die integrierten Positionen (cM) der neu untersuchten Markerloci, entlang der kombinierten und nach Geschlechtern getrennten Karten, der LOD-Score (Twopoint) sowie die Anzahl der informativen und coinformativen Meiosen sind in Tabelle 11 wiedergegeben.
Tabelle 11 Positionen (cM) der Mikrosatelliten entlang der kombinierten (komb.), der weiblichen (weibl.) und männlichen Kopplungskarte (Multipoint), LOD-Score und Rekombinationsrate (Θ) (Twopoint) und Anzahl informativer Meiosen unbekannter Phase der Marker sowie der coinformativen Meiosen ■
Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) Θ LOD- inf. coinf. Score komb. weibl. männl. (Twopoint) Meiose Meiose n n
3 Sw274 0,0 0,0 0,0 — — 287 —
3 23,0 22,0 23,1 0,21 13,07 322 236
Sw2021
3 Sw72 37,0 33,4 40,6 0,13 9,19 203 123
3 Swr1637 40,9 46,1 40,6 0,03 14,38 188 72
3 Sw2618 59,0 73,0 53,0 0,15 5,66 275 69
3 62,4 74,7 58,0 0,04 38,79 258 215
Sw2597
65,2 76,3 61 ,7 0,03 35,45 329 184
Sw902
3 S0164 67,4 77,7 64,5 0,02 54,60 332 279
3 ACTG2 71 ,0 80,4 68,5 0,04 44,31 316 242
3 Sw2570 78,8 91 ,7 74,3 0,07 25,45 259 183
3 Sw2408 99,8 128,1 89,0 0,21 5,73 234 147
3 Sw1327 113,6 146,5 100,7 0,14 7,26 325 103
3 Swr2096 132,6 176,4 116,7 0,17 12,88 311 188 Chr. Marker Position (cM) (Multipoint) θ LOD- inf. coinf. Score komb. weibl. männl. (Twopoint) Meiose Meiose n n
5 ACR 0,0 0,0 0,0 — — 233 —
5 Sw413 0,6 1,3 0,0 0,01 36,18 276 162
5 Sw1482 18,3 15,8 20,0 0,17 11 ,91 305 189
5 Sw2425 45,0 64,4 41 ,3 0,24 9,78 334 233
5 Sw2 52,3 71 ,3 49,7 0,07 31 ,17 304 217
5 S0005 64,4 93,5 55,9 0,11 31,53 391 276
5 Sw963 68,6 101 ,0 58,0 0,05 33,42 239 214
5 Sw1468 72,2 108,2 58,8 0,07 9,71 170 90
5 Sw1987 75,2 114,3 59,4 0,04 17,31 181 119
5 S0018 79,5 120,8 63,0 0,05 21 ,82 271 154
5 Sw904 81 ,8 126,5 63,0 0,02 40,45 346 195
5 Sw310 83,3 127,6 64,7 0,02 25,86 192 145
5 Swr1974 83,9 127,6 65,3 0,01 14,29 103 72
5 Swr426 84,4 128,7 65,8 0,01 18,11 137 82
5 Sw1094 85,8 129,6 67,7 0,05 13,66 317 91
5 Sw1200 95,8 133,0 81 ,8 0,12 22,39 372 230
5 Sw986 105,3 137,8 94,4 0,22 3,94 125 91
5 Sw1982 107,1 140,0 96,4 0,04 17,89 342 88
5 IGF1 107,9 142,3 96,4 0,01 61 ,58 310 252
5 Sw995 113,4 147,1 102,3 0,06 20,35 275 149
5 Sw378 123,5 163,4 108,9 0,13 4,78 83 61
S0385 0,0 0,0 0,0 170
Sw1460 8,7 7,5 9,9 0,08 10,40 256 96
Sw2008 13,0 10,8 14,8 0,03 17,01 193 88
S0182 26,9 47,9 19,8 0,11 19,23 382 144
S0071 33,4 56,8 25,2 0,07 21 ,96 224 152
Sw486 40,3 70,1 28,2 0,07 18,14 303 127
Sw435 44,7 80,3 29,5 0,07 8,35 99 65 11 S0230 45,7 84,5 29,5 0,02 7,89 251 44
11 S0009 48,3 94,3 30,7 0,05 3,39 103 22
11 Sw703 67,1 104,9 50,8 0,18 4,02 167 53
11 Sw1465 71 ,0 107,9 55,5 0,05 15,89 346 94
11 Sw2413 78,9 115,8 63,5 0,10 8,21 175 91
Chr. = Chromosom inf. Meiosen = Anzahl informativer Meiosen coinf. Meisosen = Anzahl coinformativer Meiosen
ERGEBNISSE Basierend auf den gesamten Markerdaten, d.h. den bisher bestehenden sowie den neu hinzugefügten, wurde eine merkmalsgestützte Mehrpunkt-Kopplungsanalyse (Reinsch, 2002) auf Grundlage der kombinierten Marker-Kopplungskarte durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse für Sscr 3, 5 und 11 , mit chromosomaler Lokalisation der erreichten Maxime in cM, der Teststatistik (χ2) sowie der punktweisen Irrtumswahrscheinlichkeit (α-comparisonwise) sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12:Chromosom, Maximum der Teststatistik (χ2), punktweise Irrtumswahrscheinlichkeit (α-comparisonwise), Position (cM) und abgeleiteter LOD-Score
Chromosom χ2 α- Position (cM) LOD-Score* comparisonwise
3 30,9854 0,013514 59 1 ,33
5 55,2304 0,000003 96 > 3,00
11 44,0326 0,000195 54 > 3,00
* = es ist derjenige LOD-Score mit einem Freiheitsgrad angegeben, der zu der gleichen punktweisen Irrtumswahrscheinlichkeit führt wie der durchgeführte Test mit 16 Freiheitsgraden Der Verlauf der Teststatistik entlang der Positionen (χ2) und der Verlauf der Irrtumswahrscheinlichkeit (α-comparisonwise), für die Chromosomen 3, 5 und 11 sind in den Figuren 10 bis 12 verzeichnet.
Das Maximum der Teststatistik für Sscr 3 wurde an der Position 59 cM, bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α-comparisonwise = 0,013514 erreicht und entspricht somit exakt der Lage des Markers Sw2618. Flankiert wird dieser Bereich von den Mikrosatelliten-Loci Swr1637 (40,9 cM) und Sw2597 (62,4 cM).
Aufgrund des Informationsgewinns über die neu typisierten Mikrosatelliten-Loci, kann für Sscr 3 nicht länger von einer Kopplung zwischen flankierenden Markern und putativen Spreizergenen ausgegangen werden.
Für Sscr 5 wurde das Maximum der Teststatistik an der Position 96 cM mit χ2 = 55,23 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit α-comparisonwise = 0,000003 geschätzt. Dies entspricht der Lage des Markers Sw1200 (95,8 cM). Flankiert wird der Marker sw1200 von den Mikrosatelliten-Loci Sw1094 (85,8 cM) und Sw986 (105,3 cM).
Ein signifikanter Einfluß des flankierenden Chromosomenbereichs um den Marker Sw1200 ist auch nach dem Einbezug der neuen Typisierungsergebnisse gegeben.
Entlang der Positionen des Chromosoms 11 wurde das Maximum der Teststatistik an der Position 54 cM mit χ2 = 44,03 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α- comparisonwise = 0,0002 erreicht. Flankiert wird dieser Bereich von den Markern S0009 (48,3 cM) und Sw703 (67,1 cM). Ein signifikanter Einfluß des genannten chromosomalen Bereiches ist auch unter Berücksichtigung der neuen Ergebnisse gegeben.
Bei Betrachtung des Verlaufs der Teststatistik und der Irrtumswahrscheinlichkeit wird deutlich, daß von der Position 15 cM bis zu der Position 60 cM ein nahezu einheitlich hohes Niveau erreicht wurde. Es wird (statistisch abgesichert) davon ausgegangen, dass in diesem Bereich putative Spreizergene lokalisiert sind. Literatur
Green, P., K. Falls und S. Crooks (1990): Documentation for CRI-MAP (Version 2.4). Washington University School of Medicine, St. Louis
Reinsch, N. (2002): A general likelihood approach to trait-based multipoint linkage analysis in large groups of half-sibs and super sisters. Genetics,
162: 413-424
Schwarz, S. (2003): Kartierung von Loci für kongenitales Ausgrätschen beim neugeborenen Ferkel. Schriftenreihe des Instituts für Tierzucht und Tierhaltung der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Heft 135

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer ersten Nukleinsaure zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des Phänotypus „Spreizbeinigkeit" in einem Säuger/Geflügeltier, wobei die erste Nukleinsaure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsaure, die vorkommt,
(a) auf Chromosom 5 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten Sw1468, Sw2, Sw1200, Sw2425, Sw995, IGF1 , S0005, Sw963, Sw1987, S0018, Sw904, Sw310, Swr1974, Swr426, Sw1094, Sw986 oder Sw1982; oder
(b) auf Chromosom 11 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger, und zwar im Bereich der Mikrosatelliten S0182, S0071 , Sw2008, Sw435, S0009, S0230 oder Sw486;
2. Verwendung einer Kombinationen von mindestens zwei oder mehr der in Anspruch 1 genannten Nukleinsäuren zur Bestimmung der Ausprägung oder Vererbung des Phänotypus „Spreizbeinigkeit".
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die zweite Nukleinsaure ein Mikrosatellit oder eine den Mikrosatelliten flankierende Sequenz ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Nachweis von zumindest einem Allel mit einer Länge von:
(a) 153bp im Bereich von SW1468 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:5 und 6;
(b) 154bp im Bereich von SW1200 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:7 und 8; (c) 141 bp im Bereich von S0182 unter Verwendung von Primern mit den
Sequenzen der SEQ ID NO:23 und 24; (d) 184bp im Bereich von S0071 unter Verwendung von Primern mit den
Sequenzen der SEQ ID NO:15 und 16;
(e) 300bp im Bereich von S0230 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:19 und 20; oder
(f) 311 bp im Bereich von S0230 unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen der SEQ ID NO:19 und 20; in Schweinen der Deutschen Landrasse auf ein Risiko zur Ausprägung und/oder Vererbung des Phänotyps "Spreizbeinigkeit" hinweist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei zwei oder mehr Allele nachgewiesen werden.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zweite Nukleinsaure abgeleitet ist von einem Gen aus der Gruppe bestehend aus IGF1 , MYF5, MYF6, MYOD1 , SGC, Dystrophin (DMD), a-Dystroglykan, ß- Dystroglykan, α, ß, γ, δ, und ε-Sarkoglykan, α1-, ß1- und ß2-Syntrophine,
Dystrobrevin, Merosin, Sarkospan.
7. Verwendung einer in einem der Ansprüche 1 bis 6 genannten zweiten Nukleinsaure zur Selektion von Haus-, Zucht-, oder Nutztieren ohne Phänotypus „Spreizbeinigkeit".
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Tiere sind aus der Gruppe bestehend aus Rind, Hund, Katze, Kaninchen, Büffel, Kamel, Alpaka, Nerz, Schwein, Huhn, Ente, Gans, Truthahn, Strauss, Ziege, Schaf, Pferd, Esel, Ratte oder Maus.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei ein Genomscreen an mehreren Säugern einer Population durchgeführt wird.
10. In vitro Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition zur Ausprägung oder Vererbung des Phänotypus „Spreizbeinigkeit" in Säugern, vorzugsweise in Haus-, Zucht-, oder Nutztieren, wobei man die Tiere, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, oder deren Sperma auf die Anwesenheit, Beschaffenheit oder Ausprägung einer in einem der Ansprüche 1 bis 6 genannten zweiten Nukleinsaure testet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Tiere sind aus der Gruppe bestehend aus Rind, Hund, Katze, Kaninchen, Büffel, Kamel, Alpaka, Nerz, Schwein, Huhn, Ente, Gans, Truthahn, Strauss, Ziege, Schaf, Pferd, Esel, Ratte oder Maus.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , wobei man
(a) eine PCR Amplifikation mit komplementären Primern mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden durchführt, wobei ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer in entgegengesetzter Orientierung den - Strang der in einem der Ansprüchen 1 bis 6 genannte zweiten Nukleinsaure bindet; oder
(b) eine Hybridisierung durchführt, wobei eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden an die in einem der Ansprüchen 1 bis 6 genannte zweite Nukleinsaure bindet; oder
(c) eine Sequenzierung der in einem der Ansprüchen 1 bis 4 genannte zweiten Nukleinsaure durchführt; oder
(d) eine Detektion mit einem spezifischen Antikörper oder Antikörperfragment oder Antikörperderivat oder Aptamer durchführt, wobei der Antikörper oder das Antiköperfragment oder das Antikörperderivat oder der Aptamer spezifisch gegen eine in einem der Ansprüchen 1 bis 6 genannte erste oder zweite Nukleinsaure gerichtet ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei ein Genomscreen an mehreren Säugern einer Population durchgeführt wird.
4. Kit mindestens enthaltend
(a) ein Primerpaar zur Amplifikation der in den Ansprüchen 1 bis 6 genannten zweiten Nukleinsaure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang dieser Nukleinsaure bindet; oder (b) eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8
Nukleotiden die an die in einem der Ansprüchen 1 bis 6 genannte zweite Nukleinsaure bindet; oder (c) einen spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein Antikörperderivat oder ein Aptamer das an die in einem der Ansprüchen 1 bis 6 genannte erste oder zweite Nukleinsaure bindet; in einem oder mehreren Behältern.
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