EP1556698A1 - Elisa-kits zum nachweis von kollagenase 3 als proenzym und in aktivierter form in körperflüssigkeiten und zellkulturüberständen - Google Patents

Elisa-kits zum nachweis von kollagenase 3 als proenzym und in aktivierter form in körperflüssigkeiten und zellkulturüberständen

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Publication number
EP1556698A1
EP1556698A1 EP03753260A EP03753260A EP1556698A1 EP 1556698 A1 EP1556698 A1 EP 1556698A1 EP 03753260 A EP03753260 A EP 03753260A EP 03753260 A EP03753260 A EP 03753260A EP 1556698 A1 EP1556698 A1 EP 1556698A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
collagenase
procollagenase
monoclonal antibodies
activated
elisa kit
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03753260A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Matthias Dettloff
Thorsten Stroh
Peter Sveshnikov
Peter Bendzko
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Original Assignee
Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
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Publication date
Priority claimed from DE20213551U external-priority patent/DE20213551U1/de
Application filed by Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH filed Critical Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Publication of EP1556698A1 publication Critical patent/EP1556698A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the invention relates to ELISA kits for the detection of collagenase 3 as a proenzyme and in activated form in body fluids, in particular in human serum and synovial fluid as well as in cell culture supernatants, and monoclonal antibodies that specifically recognize collagenase 3 in latent and activated form.
  • Areas of application are medicine and here in particular diagnostics, in particular the nerlauf diagnosis of inflammatory rheumatic diseases (rheumatoid arthritis), systemic lupus erythematosus (sLE) with organ involvement and tissue proliferation as well as tumor diseases (e.g. breast and colorectal carcinomas).
  • the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique is the current technology standard in clinical laboratories. With this technology i.a. Marker proteins for certain diseases can be determined in patient body fluids.
  • MMPs Matrix metalloprotemases
  • ⁇ agase, H. and Woessner, F. Jr., J. Biol. Chem. 1999, 274, 21491-21494 Based on their preferred substrates and structural features, MMPs can be classified into collagenases, gelatinases, stromelysins and membrane-type metalloproteases.
  • Collagenase 3 (MMP-13) is released by cells as an inactive proenzyme (Prokollagenase 3, Pro-MMP-13) and converted extracellularly into the activated form by the cleavage of a propeptide.
  • procollagenase 3 and activated collagenase 3 are typically undetectable in the differentiated, adult tissue. However, their occurrence is described in connection with a whole series of destructive clinical pictures: In the development of breast carcinomas (Nielsen BS et al., Cancer Res. 2001 61: 7091-7100), rheumatoid arthritis (Westhoff CS et al., Arthritis Rheum. 1999 42: 1517-1527) and osteoarthritis (Shlopov BN et al. Arthritis Rheum. 1997 40: 2065-2074) are the levels of procollagenase 3-mR ⁇ A strongly upregulated in the affected tissue types. These findings make it clear that collagenase 3 is a marker protein of great interest for medical diagnostics.
  • the first test the Biotrak Matrix Metalloproteinase-13 ELISA system, has been validated for the body fluids serum and plasma.
  • the problem with the test is the very low sensitivity.
  • the test is not validated for joint fluid testing and therefore cannot be used for this purpose.
  • the second test system on the market is only intended for use in cell culture and can therefore not be used for the investigation of procollagenase 3 in body fluids.
  • the invention was therefore based on the object of providing an ELISA kit which, in contrast to the tests on the market, is distinguished by a high sensitivity and both for the detection of procollagenase 3 and the activated form of this enzyme in body fluids, is particularly suitable in human serum and synovial fluid, as well as in cell culture supernatants.
  • the invention should also offer the possibility for the first time in Cell culture supernatants and body fluids to determine the quantitative relationship between latent and activated form of this enzyme in a highly specific manner.
  • the ELISA kits according to the invention for the detection of procollagenase 3 and activated collagenase 3 comprise at least: a) a solid support with attached monoclonal antibodies, the sensitive and specific human procollagenase 3 or activated collagenase
  • Collagenase 3 d) a buffer for diluting the samples to be examined; e) a detectably labeled conjugate that binds to collagenase 3; and f) a substrate which permits the detection of the detectably labeled conjugate, the monoclonal antibodies mentioned under a) either preferably being anti-MMP-13 clone M34 (mouse), and particularly preferably monoclonal antibodies which are of the hybridoma with the deposit number
  • PSM ACC 2572 be formed, or preferably anti-MMP-13 clone EE1 (mouse).
  • Either a combination of two components is used as the detectably labeled conjugate, the first component being biotinylated antibodies which bind to collagenase 3; and as a second component around a highly polymeric streptavidin conjugate that binds to the biotinylated antibodies.
  • conjugated antibodies that bind to collagenase 3 can also be used.
  • the antibodies, which act as a conjugate, can be monoclonal and / or polyclonal antibodies.
  • Human recombinant procollagenase 3 which was expressed in eukaryotic cells (Sf9 cells), is used as a standard for the quantitative determination of procollagenase 3 in body fluids and cell culture supernatants. It is either in solution or in freeze-dried form, in which it can be kept for several months without loss of quality. If they are in freeze-dried form, the recombinant procollagenase 3 must first be reconstituted by adding distilled water before use. Human recombinant activated collagenase 3 is made from procollagenase 3 mentioned above with the addition of acetaminophenyl-mercury-acetate (APMA). manufactured and used in the same way.
  • APMA acetaminophenyl-mercury-acetate
  • the buffer provided for the dilution of samples to be examined contains, in addition to blocking and stabilizing substances, sodium citrate among others. Surprisingly, it was found that this reagent is particularly well suited for the preparation of human serum for measuring collagenase 3.
  • the buffer for making a standard series of recombinant procollagenase 3 or activated collagenase 3 for measuring these markers in serum contains human serum.
  • Microtite plates to which the monoclonal antibodies according to the invention are bound are preferably used as solid supports. These microtitre plates are produced so that they can be stored for several months without loss of quality.
  • the invention also relates to monoclonal antibodies which specifically recognize and bind collagenase 3 as a proenzyme or activated enzyme, these monoclonal antibodies from hybridoma cell lines with the deposit number
  • DSM deposit number
  • ACC 2572 are produced or properties such as the monoclonal antibodies from the hybridoma cell line with the accession number [DSM ACC 2572
  • Antibodies from the hybridoma cell line with the accession number [DSM ACC 2572] have, which, however, can be biochemically or molecular biologically modified or synthetic, with the antibody possibly missing parts or parts that are not necessary for the recognition of procollagenase 3, or these parts are replaced by others.
  • procollagenase 3 and of activated collagenase 3 in body fluids is made possible with high sensitivity by the ELISA kits according to the invention and thus makes these potential disease markers more accessible to medical diagnosis.
  • the lower detection limit of the ELIS As is 4 pg procollagenase 3 or 6 pg activated collagenase 3 / ml sample.
  • the standard curve determined during the measurement by examining a human recombinant procollagenase 3 or the activated collagenase 3 allows a rapid calculation of the collagenase content in samples with the aid of the regression function on which the standard course is based.
  • Another decisive advantage is that the ELISA kits can be stored in the refrigerator, which significantly improves handling and user friendliness.
  • the ELISA kits according to the invention for the detection of procollagenase 3 or activated collagenase 3 have an overall shelf life of at least one month for the end user. Production takes place in accordance with the standards of EN 46001 and EN ISO 9001. For the first time, the ELISA kits offer the opportunity to examine synovial fluid.
  • the ELISA kits according to the invention show for the first time that collagenase 3 is a marker for monitoring the course of rheumatoid arthritis, but also of severe cases with organ involvement and tissue proliferation of systemic lupus erythematosus.
  • collagenase 3 is a marker for monitoring the course of rheumatoid arthritis, but also of severe cases with organ involvement and tissue proliferation of systemic lupus erythematosus.
  • an increase in the level of MMP-13 in the serum as demonstrated by the ELISA kit according to the invention, precedes an acute clinical deterioration of the clinical picture.
  • the enzyme cannot be detected in the serum at all times, which is why this marker is primarily suitable for the prognosis of selected diseases, especially for a preventive start of therapy before the patient becomes clinically noticeable
  • the invention also relates to the use of collagenase 3 - as a serological marker for diagnosis and in particular for monitoring the course of inflammatory rheumatic diseases, in particular rheumatoid arthritis and - as a serological marker for diagnostics and in particular for monitoring the course of systemic lupus erythematosus, in particular for prognosis with simultaneous tissue proliferation (tumor formation).
  • Collagenase 3 can also be used as a serological marker for the diagnosis and monitoring of other tumor diseases, in particular of breast carcinomas and colorectal carcinomas. Collagenase 3 can also be used as a serological marker for the diagnosis and monitoring of further diseases in which an increase in collagenase 3 is described.
  • mice were used for immunization.
  • the antigen was prepared as follows: 50 ⁇ g MMP-13 in 100 ⁇ l PBS + 100 ⁇ l 6M urea were presented. 100 ⁇ l of CFA or IFA were added to this solution. The injection was carried out according to the following scheme: Day 0: 50 ⁇ g MMP-13 intraperitoneally in CFA Day 13: 50 ⁇ g intraperitoneally in IFA Day 41: 50 ⁇ g intravenously in 1 ml PBS Day 44: Hybridization of pre-lymphocytes with spleen and SP 2/0 myeloma cells.
  • the plate was washed three times and 100 ⁇ l of anti-mouse IgG (H + L) -POD conjugate was added for a further hour (37 ° C.). After a further five washes, the POD content in the wells was detected with 100 ⁇ l of TMB substrate (20 min, RT). The reaction was stopped with 50 ⁇ l 2 MH 2 SO and the absorption was measured at 450 nm. The hybridoma supernatants positive in the ELISA were cloned and recloned to monoclonality. 5 independent monoclonal antibodies were obtained, from which a total of 12 subclones with partially changed affinities were obtained.
  • a hybridoma cell line which produces the monoclonal antibodies anti-MMP-13 clone M34 (mouse) according to the invention (IgGl), was in the German collection of Microorganisms and cell cultures GmbH (DSM ACC 2572Z) in Braunschweig under the number pSM ACC 2572 [filed on 08.28.02,
  • FIG. 1 The principle of the ELISAs is shown in Figure 1.
  • a series of dilutions is created from the human recombinant collagenase 3 as standard, which contains the recombinant procollagenase 3 (or activated collagenase 3) in the following concentrations: 1000 pg / ml, 500 pg / ml, 250 pg / ml, 125 pg / ml, 63 pg / ml, 32 pg / ml, 16 pg / ml, 0 pg / ml (start of the dilution series to determine activated collagenase 3: 2000 pg / ml).
  • the standard dilution is prepared using a special buffer system which contains 10% human serum. In each case 100 ⁇ l of these standard dilutions are duplicated in the wells of the microtiter plate, to the monoclonal antibodies from the hybridoma cell line with the
  • the samples to be measured are diluted with the buffer provided for sample preparation. 100 ⁇ l of the diluted samples are then also applied in duplicate. After 120 minutes of incubation on a shaker at room temperature, the microtitre plate is washed four times with the wash buffer and then the remaining liquid is removed by knocking out on paper towels. This is followed by the entry of 100 ⁇ l detection solution 1, which contains biotinylated antibodies, in all wells used on the microtiter plate. These are either polyclonal antibodies or a monoclonal antibody or a cocktail of several monoclonal antibodies.
  • the microtitre plate is again washed four times and knocked out on a paper towel.
  • the detection solution 2 consisting of a streptavidin-peroxidase conjugate and a dilution buffer, is prepared according to the instructions and in turn pipetted 100 ⁇ l into the corresponding wells of the microtiter plate.
  • Another 30 minute incubation follows. The microtiter plate is then washed and knocked out five times, provided with 100 ⁇ l per well of substrate solution (tetramethylbenzidine) and incubated in the dark for 15 minutes.
  • Example 3 Examination of body fluids with the ELISA kit
  • Table 1 Measurement of Pro-MMP-13 and activated MMP-13 with the two InviLISA MMP-13 kits. The table shows the size of the sample population and the number of positive samples (in the respective tests and in total).
  • RA rheumatoid arthritis
  • pSS primary Sjogren's syndrome
  • sLE systemic lupus erythematosus.
  • Table 1 shows the results of these measurements: While in a control group of blood donors only about 2% reacted positively in the tests, 20% of the sera from patients with rheumatoid arthritis showed positive signals.
  • Fig. 2 shows significantly increased active MMP-13 values immediately before the onset of clinical deterioration, which is accompanied by a massive swelling of the right knee joint. The slow clinical improvement follows a decrease in the MMP-13 titer.
  • Fig. 3 like Fig. 2, shows the particular suitability of activated collagenase 3 as a marker for rheumatoid arthritis.
  • the measured MMP-13 values were not increased or are below the defined cut-off of 300 pg / ml MMP-13.
  • the patient in question was X-rayed in November 1998, with the wrists classified as Grade 1 by Larsen.
  • the patient suffered a massive flare-up which was accompanied by measured, greatly increased MMP-13 values.
  • control x-rays showed a progressive destruction of the wrists (Larsen grade 2) and an beginning destruction of the ankles (Larsen grade 1).
  • Fig. 4 shows two exemplary course measurements of patients with systemic lupus erythematosus (sLE). While even sera from patients with severe disease courses showed no or only marginally increased MMP-13 values (Fig. 4 A, sLE with renal involvement, very severe symptoms), sera from sLE patients with tissue proliferation showed increased values of activated MMP-13 (Fig. 4 B, sLE with renal involvement, mebran proliferating glomerulo-nephritis type IV a, severe symptoms). These measurements indicate that MMP-13 can be an indicator of tumor growth.
  • Step 1 Incubation of standards or samples on the titre plate. specific
  • Step 2 Detection of the bound collagenase 3 (MMP-13) with biotinylated antibody (duration: 90 minutes)
  • Step 3 addition of streptavidin-peroxidase conjugate (duration: 30 minutes)
  • Step 4 color development after addition of TMB substrate (duration : 15 minutes)
  • FIG. 2 Measurement of activated MMP-13 in the serum of a patient with rheumatoid arthritis (Larsen III, DAS score> 3.8). No elevated Pro-MMP-13 values were detectable in the samples. The increase in the MMP-13 values in the serum immediately at the time of a relapse and the subsequent decrease in the values during the remission is evident (arrows).
  • Figure 3 Measurement of Pro-MMP-13 (black bars) and activated MMP-13 (gray bars) in the serum of a patient with rheumatoid arthritis.
  • RA rheumatoid arthritis
  • St. stage
  • HG wrist
  • FG ankle.
  • Figure 4 Measurement of Pro-MMP-13 black bars) or activated MMP-13 (gray bars) in sera from two patients with sLE.
  • A sLE patient with renal involvement, neplirotic syndrome, very severe symptoms.
  • B sLE patient with renal involvement, severe symptoms, proliferating glomerulo-nephritis type IV a. Explanations in the text.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ELISA-Kits zum Nachweis von Prokollagenase 3 und aktivierter Kollagenase 3 in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen sowie in Zellkulturüberständen, und monoklonale Antikörper, die diese Antigene spezifisch erkennen. Der ELISA-Kit umfaßt in separater Verpackung wenigstens: a) einen festen Träger mit daran gebundenen monoklonalen Antikörpern, die sensitiv und spezifisch humane Prokollagenase 3 oder aktivierte Kollagenase 3 binden; b) humane rekombinante Prokollagenase 3 oder aktivierte Kollagenase 3 als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms; c) ein Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten Kollagenase 3; d) ein Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Körperflüssigkeiten; e) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Kollagenase 3 bindet; und f) ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt, wobei es sich bei den unter a) genannten monoklonalen Antikörpern vorzugsweise um monoklonale Antikörper handelt, die von dem Hybridom mit der Hinterlegungs­nummer DSM ACC 2572 gebildet werden. Anwendungsgebiete sind die Medizin und hier besonders die medizinische Diagnostik, insbesondere die Verlaufskontrolle von Rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus Erythematosus sowie von Tumorerkrankungen.

Description

ELISA-Kits zum Nachweis von Kollagenase 3 als Proenzym und in aktivierter Form in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen
Die Erfindung betrifft ELISA-Kits zum Nachweis der von Kollagenase 3 als Proenzym und in aktivierter Form in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen sowie in Zellkulturüberständen, und monoklonale Antikörper, die Kollagenase 3 in latenter und aktivierter Form spezifisch erkennen. Anwendungsgebiete sind die Medizin und hier besonders die Diagnostik, insbesondere die Nerlaufsdiagnostik von entzündlichen rheumatischen Erkrankungen (rheumatoide Arthritis), systemischem Lupus Erythematosus (sLE) mit Organbeteiligungen und Gewebeproliferation sowie von Tumorerkrankungen (z.B. Mamma- und colorectale Carcinome).
Die enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-Technik ist gegenwärtiger Technologiestandard in klinischen Labors. Mit dieser Technologie können u.a. Markerproteine für bestimmte Krankheiten in Körperflüssigkeiten von Patienten bestimmt werden.
Matrix Metalloprotemasen (MMPs) bilden eine Familie aus sezemierten und membrangebundenen Endoproteinasen, die extrazelluläre Matrixproteine hydrolisieren (Νagase, H. and Woessner, F. Jr., J. Biol. Chem. 1999, 274, 21491-21494). Auf der Grundlage ihrer bevorzugten Substrate und struktureller Merkmale kann man MMPs in Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und Membran-Typ Metalloproteasen einteilen.
Kollagenase 3 (MMP-13) wird von Zellen als inaktives Proenzym (Prokollagenase 3, Pro-MMP-13) freigesetzt und extrazellulär durch die Abspaltung eines Propeptids in die aktivierte Form überfuhrt.
Sowohl Prokollagenase 3 als auch die aktivierte Kollagenase 3 sind typischerweise im ausdifferenzierten, adulten Gewebe nicht nachweisbar. Ihr Vorkommen ist jedoch im Zusammenhang mit einer ganzen Reihe von destruktiven Krankheitsbildern beschrieben: Bei der Ausbildung von Brustcarcinomen (Nielsen BS et al., Cancer Res. 2001 61:7091-7100), Rheumatoider Arthritis (Westhoff CS et al., Arthritis Rheum. 1999 42:1517-1527) und Osteoarthrose (Shlopov BN et al. Arthritis Rheum. 1997 40:2065-2074) ist der Gehalt an Prokollagenase 3-mRΝA in den betroffenen Gewebetypen stark hochreguliert. Diese Erkenntnisse machen deutlich, dass Kollagenase 3 ein für die medizinische Diagnostik hochinteressantes Markerprotein ist.
Bisher existieren jedoch für keinen Krankheitsverlauf, auch nicht für Rheumatoide -Arthritis, Untersuchungen zum tatsächlichen Gehalt von Prokollagenase 3 oder aktivierter Kollagenase 3 in Körperflüssigkeiten wie Serum oder Gelenkflüssigkeit, da bis dato keine zufriedenstellende technologische Lösung auf dem Markt verfügbar war, die solche Messungen erlaubt hätte.
Zur Zeit werden zwei Produkte angeboten, mit denen prinzipiell der Gehalt an Prokollagenase 3 bestimmt werden kann. Beide Tests unterscheiden jedoch nicht zwischen dem Proenzym und der aktivierten Kollagenase 3.
1. Biotrak® Matrix Metalloproteinase- 13 ELISA ystem
Der erste Test, das Biotrak Matrix Metalloproteinase- 13 ELISA System, ist für die Körperflüssigkeiten Serum und Plasma validiert. Das Problem des Testes ist die sehr geringe Sensitivität. Außerdem ist der Test nicht für Untersuchungen von Gelenkflüssigkeit validiert und kann somit für diesen Zweck nicht verwendet werden.
2. Quantikine pro-MMP-13 Immunoassay
Das zweite Testsystem auf dem Markt ist ausschließlich für den Gebrauch in der Zellkultur bestimmt und kann somit nicht für Untersuchungen von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten eingesetzt werden.
Der Erfindung lag demzufolge die Aufgabe zugrunde, einen ELISA-Kit zur Verfügung zu stellen, der sich im Gegensatz zu den auf dem Markt befindlichen Tests durch eine hohe Sensitivität auszeichnet und sowohl für den Nachweis der Prokollagenase 3 und der aktivierten Form dieses Enzyms in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen, als auch in Zellkulturüberständen geeignet ist. Die Erfindung sollte darüber hinaus auch erstmals die Möglichkeit bieten, in Zellkulturüberständen und Körperflüssigkeiten hochspezifisch das quantitative Verhältnis zwischen latenter und aktivierter Form dieses Enzyms zu bestimmen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Die erfindungsgemäßen ELISA-Kits zum Nachweis von Prokollagenase 3 und aktivierter Kollagenase 3 umfassen in separater Verpackung wenigstens: a) einen festen Träger mit daran gebundenen monoklonalen Antikörpern, die sensitiv und spezifisch humane Prokollagenase 3 oder aktivierte Kollagenase
3 binden; b) humane rekombinante Prokollagenase 3 oder aktivierte Kollagenase 3 als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen; c) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten
Kollagenase 3; d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Proben; e) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Kollagenase 3 bindet; und f) ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt, wobei es sich bei den unter a) genannten monoklonalen Antikörpern entweder vorzugsweise um Anti-MMP-13 Klon M34 (Maus) handelt, und besonders bevorzugt um monoklonale Antikörper, die von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer
PSM ACC 2572| gebildet werden, oder vorzugsweise um Anti-MMP-13 Klon EE1 (Maus) handelt.
Als detektierbar markiertes Konjugat wird entweder eine Kombination von zwei Komponenten eingesetzt, wobei es sich bei der ersten Komponente um biotinylierte Antiköφer handelt, die an Kollagenase 3 binden; und als zweite Komponente um ein hochpolymeres Streptavidin-Konjugat, das an die biotinylierten Antiköφer bindet.
Alternativ dazu können auch konjugierte Antiköφer eingesetzt werden, die an Kollagenase 3 binden. Die Antiköφer, die als Konjugat fungieren, können monoklonale und/oder polyklonale Antiköφer sein.
Humane rekombinante Prokollagenase 3, die in eukaryontischen Zellen (Sf9-Zellen) exprimiert wurde, wird als Standard zur quantitativen Bestimmung der Prokollagenase 3 in Köφerflüssigkeiten und Zellkulturüberständen eingesetzt. Sie liegt entweder in Lösung oder in gefriergetrockneter Form vor, in der sie mehrere Monate ohne Qualitätsverlust haltbar ist. Bei Vorliegen in gefriergetrockneter Form muß die rekombinante Prokollagenase 3 vor Benutzung zunächst durch Zugabe von destilliertem Wasser rekonstituiert werden. Humane rekombinante aktivierte Kollagenase 3 wird aus oben genannter Prokollagenase 3 unter Zugabe von Acetamino-phenyl-mercury-acetate (APMA). hergestellt und in gleicher Weise verwendet.
Der für die Verdünnung von zu untersuchenden Proben vorgesehene Puffer enthält neben blockierenden und stabilisierenden Substanzen unter anderem Natriumeitrat. Es zeigte sich überraschenderweise, dass dieses Reagenz für die Vorbereitung von Serum des Menschen zur Messung von Kollagenase 3 besonders gut geeignet ist.
Der Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten Prokollagenase 3 oder der aktivierten Kollagenase 3 zur Messung dieser Marker in Serum enthält humanes Serum.
Als feste Träger werden vorzugsweise Mikrotiteφlatten verwendet, an welche die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer gebunden sind. Diese Mikrotiteφlatten werden so produziert, dass sie mehrere Monate ohne Qualitätsverlust gelagert werden können.
Gegenstand der Erfindung sind auch monoklonale Antiköφer, die Kollagenase 3 als Proenzym oder aktiviertes Enzym spezifisch erkennen und binden, wobei diese monoklonalen Antiköφer von Hybridomzelllinien mit der Hinterlegungsnummer |DSM|
[ACC 2572| produziert werden bzw. Eigenschaften wie die monoklonalen Antiköφer aus der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer [DSM ACC 2572| aufweisen Zur Erfindung gehören ebenso Antiköφer, die Eigenschaften wie die monoklonalen
Antiköφer aus der Hybridomzelllinien mit der Hinterlegungsnummer [DSM ACC 2572| aufweisen, die jedoch biochemisch oder molekularbiologisch verändert oder synthetisch sein können, wobei dem Antiköφer ggf. Teile, die für die Erkennung der Prokollagenase 3 nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind.
Durch die erfindungsgemäßen ELISA-Kits werden der Nachweis von Prokollagenase 3 und von aktivierter Kollagenase 3 in Köφerflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen, sowie in Zellkulturüberständen mit hoher Sensitivität ermöglicht und damit dieser potentielle Krankheitsmarker der medizinischen Diagnostik besser zugänglich gemacht.
Im Vergleich zu dem Biotrak® Matrix Metalloproteinase- 13 ELISA system ist die
Sensitivität der erfindungsgemäßen ELISA-Kits um den Faktor zehn höher. In Zahlen ausgedrückt liegt die untere Nachweisgrenze der ELIS As bei 4 pg Prokollagenase 3 bzw. bei 6 pg aktivierter Kollagenase 3 / ml Probe.
Die bei der Messung ermittelte Standardkurve durch Untersuchung einer mitgeführten humanen rekombinanten Prokollagenase 3 bzw. der aktivierten Kollagenase 3 erlaubt eine schnelle Berechnung des Kollagenasegehaltes in Proben mit Hilfe der dem Standardverlauf zugrunde liegenden Regressionsfunktion. Ein weiterer entscheidender Vorteil ist, dass die ELISA-Kits im Kühlschrank gelagert werden können, was die Handhabbarkeit und Verbraucherfreundlichkeit wesentlich verbessert.
Die erfindungsgemäßen ELISA-Kits zum Nachweis von Prokollagenase 3 bzw. aktivierter Kollagenase 3 weisen insgesamt für den Endverbraucher eine mindestens einmonatige Haltbarkeit auf. Die Produktion erfolgt nach Standards der EN 46001 und EN ISO 9001. Die ELISA-Kits bieten erstmals die Möglichkeit zur Untersuchung von Gelenkflüssigkeit.
In einer Studie mit Patientenseren wird mit den erfindungsgemäßen ELISA Kits erstmalig gezeigt, dass Kollagenase 3 ein Marker zur Verlaufskontrolle von Rheumatoider Arthritis, aber auch von schweren Fällen mit Organbeteiligung und Gewebeproliferation von systemischem Lupus Erythematosus ist. Eine mit den erfindungsgemäßen ELISA Kits nachgewiesene Erhöhung des Gehaltes an MMP-13 im Serum geht bei schweren Verlaufsformen von Rheumatoider Arthritis einer akuten klinischen Verschlechterung des Krankheitsbildes voraus. Das Enzym ist nicht zu jeder Zeit im Serum nachweisbar, daher ist dieser Marker vorrangig für die Verlaufsprognostik ausgewählter Erkrankungen geeignet, insbesondere für einen präventiven Therapiebeginn, bevor sich beim Patienten Beschwerden klinisch bemerkbar machen
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Kollagenase 3 - als serologischer Marker für die Diagnostik und insbesondere die Verlaufskontrolle von entzündlichen rheumatischen Erkrankungen, insbesondere von Rheumatoider Arthritis und - als serologischer Marker für die Diagnostik und insbesondere die Verlaufskontrolle von systemischem Lupus Erythematosus, insbesondere zur Verlaufsprognose bei gleichzeitiger Gewebeproliferation (Tumorbildung).
Kollagenase 3 kann weiterhin auch als serologischer Marker für die Diagnostik und Verlaufskontrolle anderer Tumor-Erkrankungen, insbesondere von Mamma-Carcinomen und Colorectalcarcinomen verwendet werden. Auch für die Diagnostik und Verlaufskontrolle weiterer Erkrankungen, bei denen eine Erhöhung von Kollagenase 3 beschrieben ist, kann Kollagenase 3 als serologischer Marker eingesetzt werden.
Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele und Abbildungen näher erläutert werden.
Beispiel 1 : Herstellung und Screening der monoklonalen Antiköφer
Zur Immunisierung wurden Mäuse verwendet. Als Antigen diente humane rekombinante Prokollagenase 3, die in Sf9-Zellen exprimiert wurde. Das Antigen wurde folgendermaßen vorbereitet: 50 μg MMP-13 in 100 μl PBS + 100 μl 6M Harnstoff wurden vorgelegt. Zu dieser Lösung wurden 100 μl CFA oder IFA gegeben. Die Injektion wurde nach folgendem Schema durchgeführt: Tag 0: 50 μg MMP-13 intraperitoneal in CFA Tag 13: 50 μg intraperitoneal in IFA Tag 41: 50 μg intravenös in 1 ml PBS Tag 44: Hybridisierung von Pre-Lymphozyten mit Milz- und SP 2/0 Myelomzellen.
Es wurden drei Hybridisierungen aus ein und derselben Milz mit verschiedenen Lymphozytenmengen durchgeführt. Die dritte Hybridisierung war erfolgreich. Überstände der ausgewachsenen Hybridome wurden im ELISA getestet. Dazu wurden 100 μl rekombinante humane Prokollagenase 3 (1 μg/ml in PBS) in den Näpfen einer Titeφlatte über Nacht bei 4 °C immobilisiert und nach 3 Wasch-Schritten (PBS mit 0,05 % Tween® 20) mit einem Blockierungspuffer (1 % BSA in PBS) zwei Stunden blockiert. Jeweils 50 μl der Zellkulturüberstände sowie Positiv- und Negativkontrollen wurden für eine Stunde (37 °C) in die Näpfe gegeben. Nach dieser Inkubation wurde die Platte dreimal gewaschen und für eine weitere Stunde (37 °C) 100 μl Anti-Maus IgG(H+L)-POD-Konjugat zugegeben. Nach weiteren fünf Waschungen wurde der POD-Gehalt in den Näpfen mit je 100 μl TMB Substrat (20 min, RT) detektiert. Die Reaktion wurde mit 50 μl 2 M H2SO gestoppt und die Absoφtion bei 450 nm gemessen. Die im ELISA positiven Hybridomüberstände wurden bis zur Monoklonalität kloniert und rekloniert. Es wurden 5 unabhängige monoklonale Antiköφer erhalten, aus denen insgesamt 12 Subklone mit teilweise veränderten Affinitäten gewonnen wurden. Eine Hybridomzellinie, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer Anti-MMP-13 Klon M34 (Maus) produziert (IgGl), wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM ACC 2572Z) in Braunschweig unter der Nummer pSM ACC 2572[ am 27. 08. 02 hinterlegt,
Beispiel 2: Durchführung der ELIS As
Das Prinzip der ELISAs ist in Abbildung 1 dargestellt. Zur Durchführung der ELISAs wird aus der humanen rekombinanten Kollagenase 3 eine Verdünnungsreihe als Standard erstellt, welche die rekombinante Prokollagenase 3 (bzw. aktivierte Kollagenase 3) in folgenden Konzentrationen enthält: 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 63 pg/ml, 32 pg/ml, 16 pg/ml, 0 pg/ml (Start der Verdünnungsreihe zur Bestimmung aktivierter Kollagenase 3: 2000 pg/ml). Wenn der Kollagenase 3 Gehalt in Serum bestimmt werden soll, wird die Standardverdünnung mit einem speziellen Puffersystem hergestellt, das 10 % humanes Serum enthält. Jeweils 100 μl dieser Standardverdünnungen werden in Doppelbestimmung in die Vertiefungen der Mikrotiteφlatte, an die monoklonale Antiköφer aus der Hybridomzelllinie mit der
Hinterlegungsnummer [DSM ACC 2572[ gebunden sind, pipettiert. Die zu messenden Proben (Zellkulturmedium, Gelenkflüssigkeit oder Serum) werden mit dem für die Probenvorbereitung vorgesehenen Puffer verdünnt. Von den verdünnten Proben werden dann ebenfalls jeweils 100 μl in Doppelbestimmung aufgetragen. Nach 120 Minuten Inkubation auf einem Schüttler bei Raumtemperatur wird die Mikrotiteφlatte mit dem Waschpuffer vier Mal gewaschen und danach durch Ausschlagen auf Papierhandtüchern die verbliebene Flüssigkeit entfernt. Es folgt der Eintrag von jeweils 100 μl Detektionslösung 1, die biotinylierte Antiköφer enthält, in alle benutzten Wells der Mikrotiteφlatte. Hierbei handelt es sich entweder um polyklonale Antiköφer oder aber um einen monoklonalen Antiköφer oder einen Cocktail aus mehreren monoklonalen Antiköφern. Nach weiteren 90 Minuten Inkubation wird die Mikrotiteφlatte wiederum vier Mal gewaschen und auf einem Papiertuch ausgeschlagen. Die Detektionslösung 2, bestehend aus einem Streptavidin- Peroxidasekonjugat und einem Verdünnungspuffer, wird gemäß Anweisung hergestellt und wiederum jeweils 100 μl in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiteφlatte pipettiert. Es folgt eine weitere Inkubation von 30 Minuten. Danach wird die Mikrotiteφlatte fünf Mal gewaschen und ausgeschlagen, mit 100 μl pro Vertiefung Substratlösung (Tetramethylbenzidin) versehen und im Dunkeln für 15 Minuten inkubiert. Nach Ablauf der Zeit werden 100 μl Stopplösung (0,5 M Schwefelsäure) den Vertiefungen zugesetzt und die Mikrotiteφlatte bei 450 nm in einem Mikrotiteφlattenreader gemessen. Die Intensität der optischen Dichte entspricht dem Gehalt an Kollagenase 3.
Beispiel 3: Untersuchung von Köφerflüssigkeiten mit dem ELISA-Kit
Es wurde eine größere Anzahl von Patientenseren mit unterschiedlichen Erkrankungsbildern mithilfe der ELISA-Kits gemessen.
Tabelle 1: Messung von Pro-MMP-13 und aktivierter MMP-13 mit den beiden InviLISA MMP-13 Kits. Die Tabelle gibt die Größe des Probenkollektivs sowie die Anzahl der positiven Proben (in den jeweiligen Tests und insgesamt) an. RA = Rheumatoide Arthritis; pSS = primäres Sjögren Syndrom; sLE = systemischer Lupus Erythematosus.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen: Während in einem Kontrollkollektiv von Blutspendern nur etwa 2 % positiv in den Tests reagierten, zeigten 20 % der Seren von Patienten mit Rheumatoider Arthritis positive Signale.
Seren von Patienten mit anderen Erkrankungen (systemischer Lupus Erythematosus, Myositis, Sklerodermie, Vaskulitis, Fibromyalgie) waren mit dem Kontrollkollektiv vergleichbar. Es wurden außerdem Serumproben von Patienten mit Rheumatoider Arthritis gemessen, die im Verlauf von zwei bis drei Jahren erhoben worden waren. Es sind exemplarisch zwei Verläufe dargestellt (Abb. 2 und 3). Abb. 2 zeigt deutlich erhöhte aktive MMP-13 Werte unmittelbar vor Einsetzen einer klinischen Verschlechterung, die mit einem massiven Anschwellen des rechten Kniegelenkes einhergeht. Der langsam einsetzenden klinischen Besserung folgt ein Absinken des MMP-13 Titers.
Abb. 3 zeigt ebenso wie Abb. 2 die besondere Eignung der aktivierten Kollagenase 3 als Verlaufsmarker für Rheumatoide Arthritis. In den ersten sechs Monaten des Untersuchungszeitraumes sind die gemessenen MMP-13 Werte nicht erhöht bzw. liegen unterhalb des definierten Cut-Off von 300 pg/ml MMP-13. Der betreffende Patient wurde im November 1998 geröntgt, wobei die Handgelenke als Grad 1 nach Larsen klassifiziert wurden. Im Dezember 1998 erlitt der Patient einen massiven Schub, der mit gemessenen stark erhöhten MMP-13 Werten einherging. Im Juni 1999 belegten Kontroll-Röntgenaufnahmen eine progrediente Destruktion der Handgelenke (Larsen Grad 2) sowie eine beginnende Destruktion der Fußgelenke (Larsen Grad 1). Als Kontrolle wurden Verlaufsmessungen in Seren von Patienten mit Sjögren Syndrom durchgeführt. Diese zeigten zu keinem Zeitpunkt erhöhte MMP-13 Werte. (Daten nicht gezeigt). In Abb. 4 sind zwei exemplarische Verlaufsmessungen von Patienten mit systemischem Lupus Erythematosus (sLE) dargestellt. Während selbst Seren von Patienten mit schweren -Krankheitsverläufen keine oder nur marginal erhöhte MMP-13 Werte aufwiesen (Abb. 4 A, sLE mit renaler Beteiligung, sehr schwere Symptomatik), zeigten Seren von sLE-Patienten mit Gewebeproliferation erhöhte Werte an aktivierter MMP- 13 (Abb. 4 B, sLE mit renaler Beteiligung, mebran-proliferierende Glomerulo-Nephritis Typ IV a, schwere Symptomatik). Diese Messungen weisen darauf hin, dass MMP-13 ein Indikator für Tumorwachstum sein kann. Legende zu den Abbildungen
Abbildung 1 : Prinzip des Nachweisverfahrens Schritt 1: Inkubation von Standards oder Proben auf der Titeφlatte. Spezifische
Bindung von Kollagenase 3 (MMP-13) als Proenzym oder in aktivierter Form (Dauer: 120 Minuten)
Schritt 2: Detektion der gebundenen Kollagenase 3 (MMP-13) mit biotinyliertem Antiköφer (Dauer: 90 Minuten) Schritt 3: Zugabe von Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Dauer: 30 Minuten) Schritt 4: Farbentwicklung nach Zugabe von TMB-Substrat (Dauer: 15 Minuten)
Abbildung 2: Messung von aktiverter MMP-13 im Serum eines Patienten mit Rheumatoider Arhtritis (Larsen III, DAS-Score > 3,8). In den Proben waren keine erhöhten Pro-MMP-13 Werte nachweisbar. Deutlich ist die Erhöhung der MMP-13 Werte im Serum unmittelbar zum Zeitpunkt eines Schubes sowie das anschließende Absinken der Werte während der Remission (Pfeile).
Abbildung 3: Messung von Pro-MMP-13 (schwarze Balken) und aktivierter MMP-13 (graue Balken) im Serum eines Patienten mit Rheumatoider Arthritis.
Erläuterungen im Text. RA = Rheumatoide Arthritis; St. = Stadium; HG = Handgelenk, FG = Fußgelenk.
Abbildung 4: Messung von Pro-MMP-13 schwarze Balken) bzw. aktivierter MMP-13 (graue Balken) in Seren von zwei Patienten mit sLE.
A: sLE-Patient mit renaler Beteiligung, neplirotisches Syndrom, sehr schwere Symptomatik. B: sLE-Patient mit renaler Beteiligung, schwere Symptomatik, proliferierende Glomerulo-Nephritis Typ IV a. Erläuterungen im Text.

Claims

Patentansprüche
1. ELISA-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 bzw. aktivierte Kollagenase 3 in Köφerflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen, sowie in Zellkulturüberständen, umfassend in separater Veφackung wenigstens: a) einen festen Träger mit daran gebundenen monoklonalen Antiköφern, die sensitiv und spezifisch humane Prokollagenase 3 bzw. aktivierte Kollagenase 3 binden; b) humane rekombinante Prokollagenase 3 bzw. aktivierte Kollagenase 3 als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in
Köφerflüssigkeiten; c) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten Prokollagenase 3 bzw. aktivierten Kollagenase 3; d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe; e) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Kollagenase 3 bindet; f) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt.
2. ELISA-Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den monoklonalen Antiköφern, die an den festen Träger gebunden sind, vorzugsweise um monoklonale Antiköφer handelt, die von dem Hybridom mit der
Hinterlegungsnummer [DSM ACC 2572| gebildet werden,
3. ELISA-Kit nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbar markiertes Konjugat eine Kombination von zwei Komponenten eingesetzt wird, wobei es sich bei der ersten Komponente um einen biotinylierten Antiköφer handelt, der an Prokollagenase 3 bzw. an aktivierte Kollagenase 3 bindet; und als zweite Komponente ein hochpolymeres Streptavidin-Konjugat eingesetzt wird, das an die biotinylierten Antiköφer bindet.
4. ELISA-Kit nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbar markiertes Konjugat ein konjugierter Antiköφer eingesetzt wird, der an Kollagenase 3 bindet.
5. ELISA-Kit nach Anspruch 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Antiköφer, die als Konjugat fungieren, monoklonale und/oder polyklonale Antiköφer sind.
6. ELISA-Kit nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die als Konjugate eingesetzten Substanzen mit allen üblichen Substanzen konjugiert werden können, vorzugsweise mit:
- Meerrettichperoxidase
- alkalischer Phosphatase.
7. ELISA-Kit nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die als Standard eingesetzte humane rekombinante Kollagenase 3 in eukaryontischen Zellen exprimiert wurde und in Lösung oder lyophilisiert vorliegt.
8. ELISA-Kit nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Köφerflüssigkeiten und Zellkulturüberstände Natriumeitrat enthält.
9. ELISA-Kit nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Träger Mikrotiteφlatten oder gängige Proteinchip-Technologien eingesetzt werden.
10. Monoklonale Antiköφer, die Prokollagenase 3 spezifisch erkennen und binden, wobei diese monoklonalen Antiköφer Eigenschaften wie die monoklonalen Antiköφer aus der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer |DSM ACC 2572| aufweisen
11. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 10, wobei die monoklonalen Antiköφer biochemisch oder molekularbiologisch verändert oder synthetisch sein können, wobei den Antiköφern ggf. Teile, die für die Erkennung der Prokollagenase 3 nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind.
12. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 10-11, die von der Hybridomzelllinie mit der
Hinterlegungsnummer |DSM ACC 2572[ produziert werden.
13. Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer |DSM ACC 2572[
14. Monoklonale Antiköφer, die aktivierte Kollagenase 3 spezifisch und sensitiv erkennen und binden, wobei diese Antiköφer keine Affinität zu Prokollagenase aufweisen
15. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 10, wobei die monoklonalen Antiköφer biochemisch oder molekularbiologisch verändert oder synthetisch sein können, wobei den Antiköφern ggf. Teile, die für die Erkennung der aktivierten Kollagenase 3 nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind.
16. Verwendung von Kollagenase 3 als serologischen Marker für die Diagnostik und insbesondere die Verlaufskontrolle von entzündlichen rheumatischen Erkrankungen, insbesondere von Rheumatoider Arthritis.
17. Verwendung von Kollagenase 3 als serologischer Marker für die Diagnostik und insbesondere die Verlaufskontrolle von systemischem Lupus Erythematosus, insbesondere zur Verlaufsprognose bei gleichzeitiger Gewebeproliferation (Tumorbildung).
18. Verwendung von Kollagenase 3 als serologischer Marker für die Diagnostik und Verlaufskontrolle anderer Tumor-Erkrankungen, insbesondere von Mamma- Carcinomen und Colorectalcarcinomen.
19. Verwendung von Kollagenase 3 als serologischer Marker für die Diagnostik und Verlaufskontrolle weiterer Erkrankungen, bei denen in der wissenschaftlichen Literatur eine Erhöhung von Kollagenase 3 beschrieben ist.
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