EP1603409A2 - Gesundheitsfördernde zusammensetzungen aus lipidhaltigen pilzen und thiocyanaten - Google Patents

Gesundheitsfördernde zusammensetzungen aus lipidhaltigen pilzen und thiocyanaten

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EP1603409A2
EP1603409A2 EP04715255A EP04715255A EP1603409A2 EP 1603409 A2 EP1603409 A2 EP 1603409A2 EP 04715255 A EP04715255 A EP 04715255A EP 04715255 A EP04715255 A EP 04715255A EP 1603409 A2 EP1603409 A2 EP 1603409A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compositions according
thiocyanates
biomass
nanoparticles
mushrooms
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04715255A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolf-Dieter Juelich
Gerold Lukowski
Ulrike Lindequist
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Greifswald
Original Assignee
Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald filed Critical Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Publication of EP1603409A2 publication Critical patent/EP1603409A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L31/00—Edible extracts or preparations of fungi; Preparation or treatment thereof
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    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A61K36/074—Ganoderma
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants

Definitions

  • the invention relates to health-promoting compositions which consist of biomasses of lipid-containing fungi and thiocyanates and may contain additional active ingredients.
  • the biomass of the mushrooms can be cultivated in the presence of thiocyanates.
  • micro and nanoparticles are obtained, which preferably have an average diameter of 10 nm - 10 ⁇ m.
  • Possible areas of application are medicine, food production, prophylactic use in humans and animals and the therapy of infectious diseases.
  • mushrooms there are several options for the use of mushrooms as food or nutritional supplements. The most common is the use of the fruiting body as a food or seasoning. Large-scale production of mushroom mycelium using biotechnological processes is also practiced.
  • An example of a biotechnologically obtained product is a health food product made of Fusarium graminearum, which due to its low energy and high fiber values as well as a favorable lipid profile is used directly for human nutrition (Moore-Landecker, E .: Fundamentals of the fungi, fourth edition, 545, Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey 07458 (1996); Abbey, CD.V .: Fungi as source of food; Nutriations and. Food Science, 85, 2-9 (1983).
  • Mushroom fat contains all types of lipids such as free fatty acids (mainly unsaturated fatty acids), mono-, di- and triglycerides, sterols (especially ergosterol), sterol esters and phospholipids (Chang, ST; Miles, PG: The nutritional attributes and medicinal value of edible mushrooms. In Edible mushrooms and their cultivation, 27-40, CRC Press, BocaRaton (1989); Garcha, HS, Klianna, PK, Soni, GL: Nutritional importance of mushrooms. In: Mushroom Biology and Mushroom Products, ed.
  • Thiocyanates are almost ubiquitous in nature. Thiocyanates are Mammal organism formed and therefore constantly ingested by humans with plant and animal food. In the following situations, an additional intake of thiocyanates was recommended as a health-promoting measure for humans and farm animals (medical and biological significance of thiocyanates (rhodanides) ed. W, Weuffen, VEB Verlag Volk und Pass Berlin 1982):
  • the expected immune response should start earlier and be stronger. Increase in the non-specific defense against infections. In phases of increased stress (e.g. premature babies, increased risk of infection in the event of frequent respiratory infections or in the case of virus flu, in the keeping period of animals), the optimization of the immune response with thiocyanates should be promising. Use in diseases with involvement of the immune system. With such diseases, e.g. of rheumatic forms, asthmatic diseases, allergic skin diseases and possibly neoplasms may have therapeutic consequences.
  • the encapsulation of active ingredients allows a high active ingredient loading and a uniform release of the active ingredient (Eva. J. Pharm and Biopharm 52 (2001) 159-163).
  • the encapsulation of the model drug enabled an in vivo release in a period of 8 hours.
  • Various manufacturing processes based on lipids are already known for the production of nano- and microparticles. Processes for the production of lipid microparticles based on phospholipids have already been described which have antifungal properties and can be used in the pharmaceutical or cosmetic field (DE 69 00 2905 T2). Other processes describe lipid nanoparticles based on extracted mono-, di- and triglycerides, oils or waxes.
  • lipid nanoparticles also describe substances based on lipids for parenteral use (WO 98/56362 AI). Special techniques for the production of lipid nanoparticles are also presented (eg EP 0 526 666 A).
  • the object of the present invention is therefore to provide new active ingredients and active ingredient carriers with improved properties over the prior art for various purposes.
  • the object was achieved by health-promoting compositions consisting of lipid-containing terrestrial fungi on the one hand and inorganic thiocyanates or thiocyanates of organic bases on the other.
  • the biomasses of the mycelium and / or the fruiting body have been implemented in a cost-effective, direct way with the thiocyanates to give novel substances with special effects.
  • the compositions according to the invention can contain further additional active ingredients. It has surprisingly been found that it has been possible to use the health-promoting ingredients of the lipid-containing marine organisms particularly efficiently and to enable various applications which cannot be achieved with the native biomass.
  • An advantageous embodiment of the invention consists in using terrestrial mushrooms cultivated as biomass, the cultivation taking place in the presence of inorganic thiocyanates or thiocyanates of organic bases. During cultivation, it is possible to achieve an enrichment with active ingredients by adding to the culture medium. It is thus possible to provide active substance carriers with improved properties for thiocyanates, vitamins and other active substances for various purposes compared to the prior art, which use the natural ingredients in a special way.
  • the biomass of the fungi after conversion into micro and nanoparticles, can serve as an active substance carrier for the minerals and / or free radical scavengers and / or vitamins and / or nutritional supplements and other active substances.
  • the invention thus also relates to a composition of biomasses of lipid-containing fungi and minerals and / or radical scavengers and / or nutritional supplements and / or vitamins, in particular vitamin C.
  • the conversion into micro and nanoparticles can advantageously be carried out from the mycelium of the fungi after the biotechnological extraction, the enrichment with active substances being carried out by additions to the culture medium during the bioteclinological extraction. It is also possible to enrich with active ingredients during further processing. In particular, it has been possible to develop medicinal feed that does not contain antibiotics.
  • fruiting bodies and / or mycelium from one of the fungi listed below: a) Auricularia auricula-judae - Judas ear b) Ganoderma lucidum - shiny lacquer porcelain c) Grifola frondosa - Maitake d) Hericium erinaceus - hedgehog goatee e) Lentinula edodes - Shii-take
  • High-pressure homogenizer 1 1 drug-laden fungal biomass particles
  • the lipid-containing fungi are first heated so that the fatty acids contained therein are liquefied.
  • One or more active substances solid or liquid
  • the active ingredient is suspended, dispersed or adsorbed in the fatty acids of the lipid-containing fungi.
  • a surfactant-water mixture is produced in parallel. This surfactant-water mixture is heated to a temperature above the melting temperature of the fatty acids. The two phases are combined at the selected temperature. Then use a stirrer
  • a pre-suspension is produced.
  • the pre-suspension is then homogenized with the aid of a high-pressure liomogenizer, the number of homogenization cycles and the working pressure being selected according to the desired particle size and stability of the preparation. Between the individual cycles, it must be ensured that the manufacturing temperature is set again and again.
  • the surfactant is used to stabilize the suspension. If there are problems with the level of the temperature (for example sensitive active substances) during production, it is possible to carry out the entire process even at room temperature. In this case, the process is carried out in the same manner as described above, the active ingredient being adsorbed on the lipid-containing marine microorganisms or being dispersed when a small amount of water is added.
  • the lipid-containing fungi and the active ingredient are suspended in an evaporable organic solvent.
  • This mixture is then predispersed (stator-rotor principle or ultrasound), homogenized (high-pressure homogenizer) and then spray-dried or freeze-dried (Scheme 2).
  • suitable cryoprotectors are used.
  • suitable evaporator e.g. a rotary evaporator.
  • the particles from fungi can then be redispersed in suitable aqueous surfactant solutions. After this, redispersion (stator-rotor principle or ultrasound) and homogenization (high-pressure homogenizer) is necessary.
  • Solvents evaporate vacuum rotary evaporators containing mushroom biomass particles loaded with active substances This method is based on the preparation of an emulsion of water and a solution of the biomass from fungus active ingredient in a suitable organic solvent (Scheme 3).
  • An emulsifier is used to disperse the active biomass substance.
  • the emulsifier and biomass are dissolved in a suitable organic solvent.
  • An aqueous phase containing a water-soluble cosurfactant is added to this solution.
  • This mixture is then predispersed (stator-rotor principle or ultrasound). After a homogenization step using a high-pressure homogenizer, the organic solvent is removed by evaporation, the biomass containing the active ingredient precipitating in the form of solid particles.
  • compositions according to the invention are also effective without the addition of an additional active ingredient, because the valuable ingredients of the mushrooms are made more readily available by the method according to the invention.
  • mushroom ingredients such as proteins, minerals and vitamins, polyunsaturated fatty acids, products of secondary metabolism as well as aromatic and flavoring substances in a particularly favorable form.
  • the principles presented are also suitable for storing various health-promoting components and / or minerals and / or radical scavengers and / or vitamins and / or nutritional supplements in the biomass.
  • ultrafine solid particles in the colloidal size range of approximately 15-1000 nm are produced.
  • the biologically active material or the active substance molecule can be enclosed, encased, adsorbed or adhered in the solid matrix (nano-pellet) or shell (nanocapsule) in the dissolved or highly dispersed state.
  • one or more active pharmaceutical ingredients can be incorporated into the micro- and nanoparticles.
  • compositions of biomasses of lipid-containing fungi in combination with thiocyanates and / or hydrothiocyanates of organic bases can also be used without the conversion into micro and nanoparticles are used and used as health-promoting agents or serve to produce health-promoting agents.
  • the preparation according to the invention has the advantage that the release of the incorporated substances can be controlled by choosing the temperature, the active ingredients and the surfactants.
  • it is advantageous to disperse the particles in distilled water or in an aqueous medium with additives such as electrolytes, polyons, mono-, di- and polysaccharides, isotonizing agents, buffer substances.
  • additives such as electrolytes, polyons, mono-, di- and polysaccharides, isotonizing agents, buffer substances.
  • An advantageous embodiment is characterized in that one or more active substances, vitamins or nutritional supplements are added to the biomass in solid and / or liquid form. It is expedient to suspend, disperse or adsorb the added active substances in the fatty acids of the biomass.
  • the biomass is combined with a surfactant-water mixture in a further production step. It is advisable to first prepare a pre-suspension with the aid of a stirrer (rotor-stator principle) or with the aid of ultrasound. According to the invention, this pre-suspension is then homogenized with the aid of a high-pressure homogenizer, the number of homogenization cycles and the working pressure being selected according to the particle size and stability of the preparation corresponding to the inventive purpose.
  • biomass and active ingredients are suspended in an evaporable organic solvent.
  • This mixture is then predispersed (stator-rotor principle or ultrasound) and homogenized (high-pressure homogenizer).
  • the solvent is then removed by spray drying or freeze drying or using a rotary evaporator.
  • the biomass can be redispersed in suitable aqueous surfactant solutions and then redispersed (stator-rotor principle or ultrasound) and then homogenized (high-pressure homogenizer).
  • a coemulsifier or an emulsifier can be used to disperse the biomass / active substance mixture.
  • the micro and nanoparticles produced by the processes described enable use in a wide variety of fields. Surprisingly, the bioavailability of the new substances compared to the pure substances was significantly better.
  • the present invention allows for the first time the use of lipid-containing terrestrial mushrooms as active ingredient carriers, for example for antibiotics.
  • the invention allows the use of compositions from biomasses of lipid-containing fungi in combination with thiocyanates as health-promoting agents and as food, feed, food supplements and feed supplements. Use in diet products is also possible. A combination with medicinal products is also practicable. It can also be used as a nutritional feed. Further uses according to the invention are the improvement of the rearing results and for the prophylaxis and therapy of infectious diseases in animal husbandry and animal breeding.
  • the health-promoting agents can be used in the form of oils, sprays and / ointments and in capsules.
  • lipid-containing fungi contain substances which can act as non-specific immunostimulants, ie. H. they stimulate leukocytes and act as activators of the reticoloendothelial system. After the conversion of the biomass of these organisms into micro- or nanoparticles according to the invention, these ingredients enable further applications. For example, use in cover materials for wound care is advantageous.
  • Micro- and nanoparticles doped with antibiotics according to the invention allow a controlled release of the antimicrobial active substances and a simultaneous immune stimulation.
  • These micro- and nanoparticles can advantageously also be doped with inorganic thiocyanates or hydrothiocyanates with organic bases.
  • the invention enables use for the targeted substitution of deficiency states.
  • the use of the products produced according to the invention for immune stimulation and for the targeted substitution of the thiocyanate deficiency in dialysis patients is particularly advantageous.
  • the particles can be produced by means of agitators (rotor-stator principle) and high-pressure homogenization, which have been used for decades for the production of fat emulsions for parenteral nutrition and are therefore available for the production of biomass particles on an industrial scale. You are from the State authorities for the production of parenterals are accepted and therefore do not require any new, complex approval procedures.
  • the essence of the invention consists of a combination of known (health-promoting and healing effects of certain fungi, health-promoting properties of vitamins and thiocyanates) and new elements (cultivation in thiocyanate-containing nutrient solutions, conversion of biomasses into micro or nanoparticles with inco ⁇ eration of Vitamins and other active ingredients, in particular thiocyanates), which mutually influence one another and, in their new overall effect, result in a benefit in use and the desired success, which lies in the fact that active ingredient carriers were able to be made available which make the incorporated active ingredients particularly bioavailable.
  • Example 1 Cultivation of various mushrooms of the Ganoderma genus with and without the addition of thiocyanate
  • the cultures of G. pfeifferi, G. resinaceum, G. applanatum and G. adspersum were homogenized as finely as possible and then transferred to a sterile 500 ml Erlmeyer flask and pH 5.4 to 300 ml with malt medium refilled.
  • 10 ml of homogenate were filled up with 200 ml of malt medium in sterile 500 ml flasks.
  • the flasks of the mixture were cultivated at room temperature (20 ° C) under natural light conditions. On days 6, 8, 12, 14, 15, 17, 20, 22 and 30, 3 to 5 pistons were harvested in each case.
  • the pH was determined, the mycelium and medium were separated from one another by filtration. The mycelium was transferred to crystallization dishes, lyophilized and then the dry weight was determined.
  • the mycelium suspension of 100 ml of filled homogenisate was required, which was introduced into a sterile fermenter and made up to 1000 ml with malt medium. This was operated without air supply on a magnetic stirrer, so that the medium was continuously mixed here as well. The cultivation period was 6-18 days.
  • NaSCN NaSCN was added to the malt medium in a concentration of 1 ⁇ 10 -3 mol / l.
  • the culture was carried out and the products worked up as in the control.
  • Example 2 Extracts obtainable from the mycelium of the species Ganoderma pfeifferi after cultivation in fermenters
  • the mycelium was separated from the medium by filtration, transferred to tared crystallization dishes, lyophilized analogously to example 2 and the dry weight determined on a precision balance (Sartorius, Göttingen, G).
  • the dried mycelia were filled into extraction thimbles and extracted with dichloromethane (E. Merck, Darmstadt) in a Soxhlet apparatus for 24 hours. After evaporation of dichloromethane residues, the mycelium residue was extracted 3 times for 2 h with 80% ethanol (E. Merck, Darmstadt) with constant shaking at room temperature. The mycelial residue was separated with a Büchner funnel and air dried.
  • the mixture was then shaken three times for 2 hours at room temperature with distilled water, and the fungal residue was again separated off by means of a Buchner funnel.
  • the residue of the cold-water extract was extracted 3 times with distilled water at 70 ° C. and then filtered.
  • a cultivation in a 10 1 fermenter allows the production of mycelium in larger quantities.
  • Example 3 Methodology: Carrying out the experiments according to Example 2, but with the addition of 0.1-1%
  • Example 4 Extracts obtained by extracting the fruiting body or mycelium with a lipophilic solvent
  • dichloromethane is best suited to obtain a high yield of biologically active extracts.
  • Example 5 Extracts obtained by extracting the culture medium with ethyl acetate
  • the medium of the mushroom culture was concentrated in a vacuum rotary evaporator (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland) to about 50 ml and then extracted by repeated shaking with ethyl acetate. The process was repeated until the ethyl acetate phase had no color.
  • Extracts are obtained which make up about 6% of the total mycelium mass. The extracts are separated if the extraction is carried out in stages. Tab. 2 Yields of aqueous extracts and share in the total mass of the mycelium
  • Example 7 Production of micro- and nanoparticles from mycelium of Shii-take mushrooms Shii-take (Lentinula edodes were used
  • the biomass is heated to a temperature of 50 ° C.
  • an aqueous emulsifier solution is heated to the appropriate temperature (50 ° C).
  • both phases are combined at the desired homogenization temperature.
  • the mixture is processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • AAV-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • Example 8 Production of micro- and nanoparticles from mycelium Shii-take (Lentinula edodes -Vitamin C combinations
  • the mycelium of the Shii-take fungus (Lentinula edodes) was used.
  • Example 9 Production of Micro and Nanoparticles from the Fruit Body of the Mushroom Judas Ear (Auricularia auricula-judae The fruiting bodies of the Judas ear mushroom were used.
  • the biomass is dispersed at a temperature of 25 ° C in an aqueous emulsifier solution.
  • the mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • API-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • the biomass is dispersed at a temperature of 25 ° C in an aqueous emulsifier solution.
  • the mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension will then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • API-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • Example 11 Production of micro and nanoparticles from Mvcel of the Maitake mushroom (Grifola frondosa)
  • the mycelium of the mushroom Maitakev (Grifola frondosa) was processed into micro and nanoparticles.
  • the biomass is dispersed at a temperature of 25 ° C in an aqueous emulsifier solution.
  • the mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • API-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • Example 12 Production of micro- and nanoparticles from fruiting bodies of Mai-take (Grifola frondosa with vitamin C according to the solvent method
  • the biomass is dissolved in n-hexane, the lipids being dissolved from the biomass.
  • the biomass is stirred in the solvent for about 3 hours.
  • the solvent is then removed using a rotary evaporator.
  • a lipid layer forms on the piston surface.
  • a solution containing vitamin C is required for redispersion: vitamin C is placed in a Plantacare solution and homogenized four times after a 90-second dispersion process.
  • the resulting vitamin C-containing solution is placed in the flask with the lipid layer.
  • the lipid layer loosens during the subsequent rotation of the piston and thereby forms encapsulated micro and nanoparticles.
  • the rotation takes about 10 hours at a temperature of 40 ° C.
  • the biomass is heated to a temperature of 50 ° C. and then the marine active ingredient norlichexanthone used is dispersed or dissolved therein. Separately, an aqueous emulsifier solution is heated to the appropriate temperature (50 ° C). The two phases are then combined at the desired homogenization temperature.
  • the mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • API-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • Example 14 Production of micro- and nanoparticles from fruiting bodies of the mushroom Maitake - Vitamin E
  • the vitamin E is dispersed in the biomass.
  • An aqueous emulsifier solution is prepared separately.
  • the mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • API-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • the provitamin Q10 is dispersed in the biomass.
  • An aqueous emulsifier solution is prepared separately.
  • the mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then mixed with a Micron piston gap high-pressure homogenizer Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) homogenized four times at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • API-Gaulin, Lübeck Micron piston gap high-pressure homogenizer Lab 40
  • Example 16 Testing of micro- and nanoparticles from mycelium of Shii-take mushrooms / vitamin C "produced according to Examples 7 and 8 on an animal model (cow udder teat)
  • the udder teats were processed 1 hour after killing the cow.
  • the teat was removed from the fat layer.
  • the teats were then placed on metal rods of the appropriate size and fastened with clamps.
  • the teats were rubbed with 70% alcohol.
  • 20 ⁇ l of test substance was pipetted on and triturated with a glass spatula and dried at room temperature for 30-45 minutes.
  • the contamination was carried out with 10 ⁇ l of the North German strain, MF 0.5 diluted 1:10. After incubation at 30 ° C for 1.5 hours, the skin areas were spread on Müller-Hinton plates and incubated at 37 ° C.
  • Example 17 Testing of micro- and nanoparticles from Mvcel of Shii-take mushrooms / vitamin C "produced according to Examples 7 and 8 on the animal model mouse ear
  • Mouse ears were used as the test model.
  • the donor animals as a source of infection remained untreated.
  • Accepted animals were treated for 3 days once a day with “Shii-take mushrooms / vitamin C” prepared in accordance with Example 8.
  • 10 ⁇ l of test substance were pipetted on and ground with a glass spatula and dried at room temperature
  • the donor animals were contaminated with 5 ⁇ l of the North German strain, MF 0.5 diluted 1:10, for which an untreated ear was contaminated and then incubated for 90 minutes at 30 ° C.
  • the ears treated with biomass were stamped accordingly The contaminated ears were pressed onto the untreated ears for 10 seconds with pressure.
  • the testing of the micro- and nanoparticles, produced according to Examples 7 and 8, also showed a significant reduction in the number of transmitted germs in the donor-acceptor test, with which the transmission of infection by means of skin contact was simulated.
  • the number of repetitions on the mouse ear was 163 for the untreated controls, germ growth was detected on skin areas.
  • Example 18 Testing of micro- and nanoparticles "Mycelium of Shii-take mushrooms / Vitamin C" produced according to Examples 7 and 8 on the pot-bellied pig Methodology: A pot-bellied pig was available for testing. 2 hours after killing the animal, skin was cut out from the underside of the belly, near the teats, the fat layer was largely removed and cut into pieces. This was stretched over devices so that approx. 1 cm 2 was available for processing. These skin areas were shaved or the bristles cut with scissors and then rubbed twice with 70% ethanol. 20 ul test substance was applied and incubated for 45 min. The contamination was carried out with 10 ⁇ l of the North German strain, MF 0.5 diluted 1:10. After incubation at 30 ° C for 1.5 hours, the skin areas were spread on Müller Hinton plates and incubated at 37 ° C. After the incubation, the germs were counted.
  • Example 19 Testing of micro and nanoparticles from Mvcel of Shii-take mushroom / vitamin C produced according to Example 8 on the skin model according to Example 17
  • the number of repetitions on the cow udder teat was 158 for the untreated controls.
  • the number of skin areas with germ detection was 2 after application of the microparticles and nanoparticles and without germ detection 4. This means that after treatment with the preparation according to the invention according to Example 8 on average only 0.4 germs / cm 2 are to be expected.
  • the microbial count reduction is highly significant in the chi-square test.
  • Example 20 Testing of micro and nanoparticles from the fruiting body of Maitake (Grifolina frondosa) / Vitamin C "produced according to Example 12 on the skin model according to Example 17
  • Results The testing of the micro- and nanoparticles, produced according to Example 12, showed a significant reduction in the number of transmitted germs in the donor-acceptor test, which was used to simulate the transmission of infection by skin contact.
  • the number of skin areas with germ detection was 1 and without germ detection 5. It follows that after the pretreatment according to the invention, on average only 0.18 germs are observed. The reduction of the transmitted germs is highly significant in the chi-square test.
  • Example 21 Testing of micro- and nanoparticles, produced according to the examples on the skin model according to example 9
  • Example 13 The micro and nanoparticles Norlichexathon- Vitamin E-Q10 (solvent method) were prepared according to Example 13, 14, 15 and mixed in a ratio of 1: 1: 1. The test was carried out according to the method shown in Example 16.
  • the number of preparations tested with the Norlichexanthon was 22.
  • the number of skin areas with germ detection was 19 and without germ detection 3.
  • 2 germs are expected after pretreatment with preparations according to the invention according to Example 14.
  • the biomass (maitake) is heated to a temperature of 50 ° C. and then ubiquinone Q1 is dispersed or dissolved therein. Separately, an aqueous emulsifier solution is heated to the appropriate temperature (50 ° C). Then both phases are combined at the desired homogenization temperature. The mixture is then processed using an Ultra Turrax T25 from Janke and Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Germany) in an emulsification process at 8000 revolutions per minute and a duration of 30 seconds.
  • the suspension is then homogenized four times with a Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer (APV-Gaulin, Lübeck) at a pressure of 500 bar and a temperature of 50 ° C.
  • AMV-Gaulin, Lübeck Micron Lab 40 piston gap high-pressure homogenizer
  • Example 23 Prevention of the transmission of MRSA in skin contact with the preparation according to Example 22
  • Tails of aseptic mice were used for the experiments. In order to rule out any foreign contamination, it was soaked in 70% alcohol for 5 min before the start of the experiment and then dried under the laminar box.
  • the donor mouse tails as a source of infection were contaminated by placing (30 s to 4 min) in a diluted MRSA culture (North German strain, MF standard 0.5 or 0.3) and then incubated at 37 ° C. for 24 h. With smears from these donors, bacterial counts> 100,000 were detected.
  • MRSA culture North German strain, MF standard 0.5 or 0.3
  • test substances were massaged into the mouse tails, which simulate the receptive organism (acceptors), twice a day.
  • the infection was transmitted from the donor to the acceptor by skin contact with the donors for 30 s to 1 min on the shaker at 600 rpm. 2 hours and 24 hours after contamination, the donors were smeared on blood Müller-Hinton aga plates. After incubating the Aga ⁇ latten at 37 ° C for 24 h, the colonies were counted.
  • Example 24 Particle size determination of the micro and nanoparticles, produced according to Example 8
  • Example 25 Detection of the radical scavenging property of the extracts by means of chemiluminescence
  • the detection was carried out as follows:
  • Example 26 Testing the radical trapping properties of fungi using the ⁇ . ⁇ -Diphenyl-ß-picrylhydrazyl radical scavening effect (DPPH assay)
  • the DPPH assay was used to test the radical scavenger properties of the mushroom / vitamin combinations.
  • the DPPH radical (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl) has its absorption maximum at 517 nm and a violet coloration, which is due to the unpaired electron on the nitrogen atom.
  • the color changes from violet to yellow when the radical bonds with a hydrogen atom of a radical scavenger and the reduced DPPH-H (2,2-diphenyl-ß-picrylhydrazyl) is formed.
  • the absorption is also reduced, which can be measured with a photometer.
  • the comparison substance is dissolved in ethanol and the following dilutions are made: 10 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, 100 ⁇ g / ml, 500 ⁇ g / ml.
  • ImM DPPH dissolved in ethanol corresponds to 294 ⁇ g / ml. 4 mg of the mushroom / vitamin combinations are dissolved in 4 ml of ethanol and the following dilution is made: 10 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, 100 ⁇ g / ml, 500 ⁇ g / ml. Test procedure:
  • Example 28 Use of the extracts to inhibit the activity of proteases
  • proteases are involved in numerous post-translational processes of regulating the function of the macroorganism. If the proteases are inhibited, a variety of pharmacological effects can be expected.
  • An enzyme inhibition by aqueous and ethanolic extracts according to Examples 2 and 3 was demonstrated using the example of the angiotensin converting enzyme according to Melzig et al., Pharmazie 51 (1996), 501-503. Result: The aqueous and alcoholic extracts have an inhibition of the angiotensin converting enzyme in concentrations of 100-200 ⁇ g / ml.
  • Example 29 Use as a vitalizing and germ-reducing additive for pharmaceutical preparations which protects against free radicals
  • the addition of the extracts prevents oxidative decomposition, has a preservative effect due to its antibacterial properties and, due to its radical trapping properties, provides protection against free radical damage to the skin.
  • the Ganoderma extracts have an anti-inflammatory effect.
  • the combination of these properties offers good prerequisites for use as an additive for pharmaceutical preparations.
  • Example 30 Use of alcoholic and aqueous extracts from the Mvcel of G. pfeifferi as vitalizing. pain-relieving and germ-reducing nutritional supplements
  • the protection of the cells against toxic radicals can also be of nutritional significance when using nanoparticles obtained from fungi of the genera Auricularia, Ganoderma, Grifola, Hericium and Lentinu la and supplemented with cofactors of antioxidative systems such as thiocyanate and vitamins C and E and trace elements can be important as food supplements.
  • This effect which is specific for nanopaticles and is obtained from the biomass of fungi, is supplemented very advantageously by the immunostimulation by thiocyanates, which has been demonstrated by many examples. Immune stimulation is also well documented, particularly in the case of fungi of the genus. So there is a synergistic effect.
  • the specific inhibitory effect of the extracts from G. pfeifferi on the neutral endopeptidase can be used for pain relief, since after they interfere in the sense of inhibiting the enkephalinase with the breakdown of neuropeptides and endo ⁇ hins that attack the opiate receptors.
  • Example 31 Use as a health care product and nutritional supplement
  • the neutral endopeptidase and the angiotensin converting enzyme detected in Example G cascade-like functions of the acid organism are interfered with.
  • Thiocyanates lead to a higher polarization of the cell membranes.
  • the proven inhibition of neutral endopeptidase inhibition according to Melzig et al., Pharmazie 51 (1996), 501-503, causes an increase in renal sodium excretion and thus a reduction in blood pressure.
  • Example F The inhibition of the angiotensin converting enzyme demonstrated in Example F also leads, according to Graefe (biochemistry of antibiotics, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, New York, 1992), to a reduction in blood pressure. Thiocyanate has been used extensively to lower blood pressure. Result: Since in many patients with metabolic syndrome an increased cholesterol level is combined with an increased blood pressure, the known effects of fungi of the genus Ganoderma in G. pfeifferi are very advantageously supplemented by the hypotensive effect. An inhibition of the serum-mediated lipopylysaccharide binding by 40-60% was achieved by ethanolic extracts mycelium according to Examples 2 and 3 in concentrations between 0.1 and 0.2%.
  • lipopolysaccharides When infected with Gram-negative bacteria, lipopolysaccharides are released from their cell wall. After binding to the lipopolysaccharide-binding protein, they can stimulate macrophages and mononuclear cells to release endogenous mediators and thus lead to fever, changes in the white blood count and abnormal widening of the vessels in the periphery of the body.
  • Figure 1 Growth curves of the biomass Ganoderma Pfeifferi in the SCN-containing medium
  • Figure 5 Effect of micro- and nanoparticles from Shii-take mushrooms (produced according to Examples 7 and 8) in comparison to the synergistic combination of Shii-take mushrooms with vitamin C.
  • Figure 6 Evidence of the interruption of infection chains, simulated in the donor-acceptor model, by the preparation according to the invention according to Examples 7 and 8
  • Figure 7 Effect of micro- and nanoparticles from Shii-take produced according to Example 8
  • Figure 8 Detection of the interruption of infection chains, simulated in the donor-acceptor model, by the preparation according to the invention according to Example 12
  • Figure 9 Particle size distribution of micro and nanoparticles produced according to Example 8.

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Abstract

Die Erfindung betrifft gesundheitsfördernde Zusammensetzungen, die aus Biomassen lipidhaltiger Pilze und Thiocyanaten bestehen und zusätzliche Wirkstoffe enthalten können. Die Biomassen können in Gegenwart von Thiocyanaten kultiviert werden. Durch Umwand­lung der Biomassen werden Mikro- und Nanopartikel gewonnen, die vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von 10 nm - 10 µm besitzen. Mögliche Anwendungsgebiete sind die Medizin, die Nahrungsmittelherstellung, die prophylaktische Anwendung bei Mensch und Tier und die Therapie von Infektionskrankheiten.

Description

Gesundheitsfördernde Zusammensetzungen aus Iipidhaltigen Pilzen und Thiocyanaten
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft gesundheitsfördernde Zusammensetzungen, die aus Biomassen lipidhaltiger Pilze und Thiocyanaten bestehen und zusätzliche Wirkstoffe enthalten können. Die Biomassen der Pilze können in Gegenwart von Thiocyanaten kultiviert werden. Durch Umwandlung der Biomassen werden Mikro- und Nanopartikel gewonnen, die vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von 10 nm - 10 μm besitzen. Mögliche Anwendungsgebiete sind die Medizin, die Nahrungsmittelherstellung, die prophylaktische Anwendung bei Mensch und Tier und die Therapie von Infektionskrankheiten.
[0002] Für den Einsatz von Pilzen als Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel gibt es mehrere Möglichkeiten. Am häufigsten ist die Verwendung der Fruchtkörper als Speise- oder Würzmittel. Ebenfalls praktiziert wird die großtechnische Produktion von Pilzmycel mit biotechnologischen Verfahren. Ein Beispiel für ein biotechnologisches gewonnenes Produkt ist ein Health Food-Produkt aus Fusarium graminearum, das durch seine niedrigen Energie und hohen Ballaststoffwerte sowie ein günstiges Lipidprofil direkt für die menschliche Ernährung genutzt wird (Moore-Landecker, E.: Fundamentals of the fungi, fourth edition, 545, Prentice Hall, Upper Saddle River, NewJersey 07458 (1996); Abbey, CD. V.: Fungi as source of food; Nutriations and. Food Science, 85 , 2-9 (1983).
[0003] Der Lipidgehalt von Pilzen kann von weniger als 1 % bis zu 15- 20 % des Trockengewichtes schwanken. Im Mittel kann mit etwa 2 bis 8 % gerechnet werden. Pilzfett enthält alle Arten von Lipiden wie freie Fettsäuren (überwiegend ungesättigte Fettsäuren), Mono-, Di-, und Triglyceride, Sterole (speziell Ergosterol), Sterolester sowie Phospolipide (Chang, S. T.; Miles, P.G.: The nutritional attributes and medicinal value of edible mushrooms. In Edible mushrooms and their cultivation, 27-40, CRC Press, BocaRaton (1989); Garcha, H.S., Klian- na, P.K., Soni, G.L.: Nutritional importance of mushrooms. In: Mushroom Biology and Mush- room Products, ed. Chang, S.T., Buswell, J.A., Chiu, S. W.: The Chinese University Press, JonKong, 227-236 (1993); Breene, W. M.: Nutritional and medicinal value of speciality mushrooms, Journal of Food Protection 53, 883-894(1990); Bötticher, W.: Technologie der Pilzverwertung, Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart 21-55, (1974).
[0004] Thiocyanate sind in der Natur nahezu ubiquität verbreitet. Thiocyanate werden im Sau- Säugetierorganismus gebildet und daher vom Menschen mit der pflanzlichen und tierischen Nahrung ständig aufgenommen. In folgenden Situationen wurde eine zusätzliche Zufuhr von Thiocyanaten als gesundheitsfördernde Maßnahme bei Mensch und Nutztier empfohlen (Medizinische und biologische Bedeutung der Thiocyanate (Rhodanide) Hrsg. W, Weuffen, VEB Verlag Volk und Gesundheit Berlin 1982):
> Impfprophylaxe. Wird während der Antigenzufuhr der Thiocyanat-Haushalt optimiert, dürfte die zu erwartende Immunantwort früher einsetzen und stärker ausfallen Steigerung der unspezifischen Infektabwehr. In Phasen erhöhter Belastung (z.B. Frühgeborene, erhöhte Infektionsgefährdung bei gehäuft auftretenden respitaratorischen Infekten oder bei Virusgrippe, in der Tierhaltung Aufstellungsperiode) dürfte die Optimierung der Immunantwort mit Thiocyanaten aussichtsreich sein. Anwendung bei Erkrankungen mit Beteiligung des Immunsystems. Bei derarti- gen Erkrankungen, z.B. des rheumatischen Formenkreises, asthmatischen Erkrankungen, allergischen Hauterkrankungen und evtl. Neoplasmen ergeben sich möglicherweise therapeutische Konsequenzen.
> Schutzeffekt bei toxischen Belastungen.
[0005] Für die grundsätzliche Bedeutung einer ausreichenden Ttaocyanatzufuhr mit der Nahrung bzw. dem Futter wurden zahlreiche Belege erbracht (Bredereck, G., W.-D.Jülich, W. Weuffen und W. Schindler: Anwendung von anorganischen Rhodaniden bei der Ferkelaufzucht. Arch. exp. Vet. med. 1977; 31: 665 - 670) Rotermund, L., W. Weuffen, W. Kurzweg, A. Kramer und W.-D. Jülich: Das protektive Sys- tem in der industriemäßigen Tierproduktion. Mh. Vet. med. 1978; 33: 524 - 531
Weuffen, W., W.-D. Jülich, B. Thürkow, H. Blohm, E. Uecker, I. Böning und E. Schüne- mann: Untersuchungen zum Einfluß von Thiocyanat (Rhodanid) auf die Serumeiweiße von Rindern und Schweinen, Mh. Vet. med. 1982; 37: 887 - 889 Jülich, W.-D., und W. Weuffen: Relevanz und Segreganz der Thiocyanat- Serumspiegelbestimmung bei Tumoφatienten in Abhängigkeit von der Prävalenz. Wiss. Z. Ernst-Moritz-.Arndt-Univ. Greifswald, Med. R. 1984; 32: 37 - 39
Kramer, W., W. Weuffen, H. Schroeder, W.-D. Jülich, U. Grimm, S. Hecht, K. Schirdewan, W. Schwenke, V. Bauernhorst und E. Stark: Thiocyanatspiegel im Serum und Erythrocyten bei Patienten mit endogenem bzw. Kontaktekzem und cutan-vaskulärer Allergie. Wiss. Z.
Ernst-Moritz-Arndt-Univ. Greifswald, Med. R. 1984; 33: 40 - 42
Hübner, G., und W.-D. Jülich: Zum Einfluß von Thiocyanat auf die Schilddrüse.Wiss. Z.
Ernst-Moritz-Arndt-Univ. Greifswald, Med. R. 1984; 32: 26 - 27 Kramer, A., W. Weuffen, A. Apitzsch und W.-D. Jülich: Stimulation of Antibodies and Liver
Protection with Thiocyanate during Rabies Vaccination Annais of Allergy. 1985; 55: 405
Weuffen, W., A. Kramer, H. Ambrosius, V. Adrian, H. Below, W.-D. Jülich, St. Koch, B.
Thürkow und F. Verbeck: Zur Bedeutung des endogenen Wirkstoffs und Umweltfaktors Thiocyanat. Zbl. für Hygiene und Umweltmedizin 1990; 423: 615 - 652 Weuffen, W., A. Kramer, H. Below, H. Böhland, W.-D. Jülich, B. Thürkow und U. Burth:
Das Thiocyanation als physiologisch bedeutsamer Wirkstoff in der belebten Natur. Pharmazie
1990; 45: 16 - 30
Kramer, A., W.-D. Jülich und A. Schulz: Alimentäre Bedeutung von Thiocyanat.Hyg. Med.
1993; 18: 56 Jülich, W.-D., A. Kramer, V. Hingst, H.-G. Sonntag, A. Schulz, M. Daut, G. Bahlmann: Zum
Einfluß einer thiocyanatreichen Ernährung auf die Hepatitis-B-Schutzimpfung, insbesondere bei Problempatienten in der Hämodialyse. Hyg. Med. 1996; 21 : 34-35
Kramer, A., M. Völzke, N. Völzke, B. Thürkow, T. Hiepe, W.-D. Jülich, A. Weber und W.
Weuffen: Förderung der Wollbildung und Körpermasseentwicklung beim Schaf durch alimen- täre Thiocyanatsupplementierung.Berliner Münchner Tierärztl. Wschr., 1996; 109: 419-428
Kramer,A., M. Kühn, W.-D. Jülich: Verminderung der durch Cyclophosphamid induzierten
Leukopoesesuppression durch Thiocyanat. Hyg. Med. 1996; 21: 34
Jülich, W.-D., A. Kramer, V. Hingst, H.-G. Sonntag, C, Schürt, M. Daut, A. Schulz, G.
Bahlmann, H. Zöllner, R. Hampel, E. Panzig: Untersuchungen zur Stimmulierung der Im- munantwort bei der Hepatitis-B-Schutzimpfung durch eine alimentäre bei Thiocyanatsupple- mentierung bei gesunden Probanden und bei Dialysepatienten. Umweltmed Forsch Prax
1997; 2: 71-83
[0006] Die Anwendung der Thiocyanate zu den von Weuffen empfohlenen Zielstellungen hat sich bisher trotz der gut dokumentierten positiven Effekte nicht durchgesetzt. Ein wesentlicher Grund dürfte daher die Schwierigkeit sein, eine geeignete Applikationsform für die Thiocyanate zu finden. Man hat deshalb sogar versucht, eine Anreicherung von Thiocyanat zu erreichen und entsprechende Produkte für diätetische Zwecke einzusetzen (Zöllner, H., W.-D. Jülich, Ch. Bimek, A. Kramer: Einfluss von an polykationische Träger gebundenem Thiocyanat auf den Ernteertrag von Dinkel und den Thiocyanatgehalt im Korn. Deutsche Lebensmittel- Rundschau 96 (2000), 103-107; Zöllner, H., A. Kramer, W.-D. Jülich, Ch. Bimek: Increasing the yield and improving the quality of speit after fertilization with thiocyanate. J. Plant Nutr. Soil Sei. 164 (2001), 105-106).
[0007] Die Verkapselung von Wirkstoffen gestattet eine hohe Wirkstoffbeladung und eine gleichmäßige Abgabe des Wirkstoffes (Eva. J. Pharm and Biopharm 52(2001) 159-163). Die Verkapselung des Modellwirkstoffes ermöglichte eine in vivo Freigabe in einem Zeitraum 8 Stunden. Bei der Herstellung von Nano- und Mikropartikeln sind verschiedene Herstellungs- verfahren auf Basis von Lipiden bereits bekannt. So wurden bereits Verfahren zur Herstellung von Lipid-Mikropartikeln auf Basis von Phospholipiden beschrieben, die antimykotische Eigenschaften haben und im pharmazeutischen oder kosmetischen Bereich eingesetzt werden können (DE 69 00 2905 T2). Andere Verfahren beschreiben Lipidnanopartikel auf Basis von extrahierten Mono-, Di und Triglyceriden, Ölen oder Wachsen. Mit Hilfe dieser gewonnenen Lipide werden ebenfalls pharmazeutische Wirkstoffe verkapselt (WO 94/20072 AI). Weitere Lipidnanopartikel beschreiben Substanzen ebenfalls auf Basis von Lipiden zur parenteralen Anwendung (WO 98/56362 AI). Auch werden spezielle Techniken zur Herstellung von Li- pidnanopartikeln vorgestellt (z. B. EP 0 526 666 A).
Nachteile des Standes der Technik
[0008] Insbesondere die Verwendung von Antibiotika, die auch in der Humanmedizin verwendet werden, als Medizinalfuttermittel ist zu Recht zunehmend in die Kritik geraten. [0009] Kein bisher verwendetes Futterergänzungsmittel erfüllt alle Anforderungen der Tier- zucht in Bezug auf Wirksamkeit und Vermeidung von Nebenwirkungen.
[0010] Auch im Bereich der menschlichen Ernährung ist es bisher nicht im ausreichenden Maß gelungen, die vitalisierenden Wirkungen physiologischer Wirkstoffe wie dem Thiocyanat und natürliche Inhaltstoffen zu nutzen.
[0011] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Wirkstoffe und Wirkstoffträger mit gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Eigenschaften für verschiedene Zwecke bereitzustellen.
[0012] Die Aufgabe wurde durch gesundheitsfördernde Zusammensetzungen, die aus lipidhal- tigen terrestrischen Pilzen einerseits und anorganischen Thiocyanaten oder Thiocyanaten organischer Basen andererseits, gelöst. [0013] Erfindungsgemäß wurden die Biomassen des Mycels und/oder des Fruchtkörpers auf kostengünstigem direktem Weg mit den Thiocyanaten zu den neuartigen Substanzen mit speziellen Wirkungen umgesetzt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können weitere zusätzliche Wirkstoffe enthalten. [0014] Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass es gelungen ist, die gesundheitsfördernden Inhaltsstoffe der lipidhaltigen marinen Organismen besonders effizient zu nutzen und verschiedene Anwendungen zu ermöglichen, die mit den nativen Biomassen nicht erreicht werden können. [0015] Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, als Biomasse kulti- vierte terrestrische Pilze einzusetzen, wobei die Kultivierung in Gegenwart von anorganischen Thiocyanaten oder Thiocyanaten organischer Basen erfolgt. Während der Kultivierung ist es möglich, eine Anreicherung mit Wirkstoffen durch Zusätze zum Kulturmedium zu erreichen. [0016] So ist es möglich, Wirkstoffträger mit gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Eigenschaften für Thiocyanate, Vitamine und andere Wirkstoffe für verschiedene Zwecke bereitzustellen, die die natürlichen Inhaltstoffe in besonderer Weise nutzen.
[0017] Auf diese Weise ist es gelungen, die gesundheitsfördernden Inl altsstoffe der Pilze besonders effizient zu nutzen. Gleichzeitig kann die Biomasse der Pilze nach Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel als Wirkstoffträger für die Mineralstoffe und/oder Radikalfanger und/oder Vitamine und/oder Nahrungsergänzungsstoffe und andere Wirkstoffe dienen. Da- durch werden verschiedene Anwendungen ermöglicht, die mit den Einzelkomponenten nicht erreicht werden können. Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine Zusammensetzung aus Biomassen lipidhaltiger Pilze und Mineralstoffen und/oder Radikalfängern und/oder Nah- rungsergänzungsstoffen und/oder Vitaminen, insbesondere Vitamin C
[0018] Die Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel kann vorteilhaft aus dem Mycel der Pilze im Anschluss an die biotechnologische Gewinnung vorgenommen werden, wobei die Anreicherung mit Wirkstoffen durch Zusätze zum Kulturmedium während der bioteclinologi- schen Gewinnung erfolgt. Ebenso ist es möglich, die Anreicherung mit Wirkstoffen während der weiteren Verarbeitung vorzunehmen. [0019] Insbesondere ist es gelungen, Medizinalfuttermittel zu entwickeln, die keine Antibiotika enthalten.
[0020] Für verschiedene Anwendungen ist es vorteilhaft, Fruchtkörper und/oder Mycel von einem der nachfolgend aufgeführten Pilze zu verwenden: a) Auricularia auricula-judae - Judasohr b) Ganoderma lucidum - Glänzender Lackporling c) Grifola frondosa - Maitake d) Hericium erinaceus - Igelstachelbart e) Lentinula edodes - Shii-take
[0021] Die Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel führt zu neuen, wertvollen Produkten, die auf bekannten Wegen nicht erreicht werden können und enthält drei Alternativen:
1. Homogenisationsverfahren
Schema 1 : Herstellungsprozess von wirkstoffbeladenen Pilzbiomassepartikeln (Homogenisa- tionsprinzip)
Pilzbiomasse Wirkstoff
Lösen o der Suspend ieren
Schmelze wässrige Tensidlösung
Rühren (Ro tor-Stator) ode Ultraschall
Dispersion
Hochdruckhomogenisator 1 1 wirkstoffbeladene Pilzbiomassepartikel
[0022] Die lipidhaltigen Pilze werden zunächst erwärmt, so dass eine Verflüssigung der darin enthaltenen Fettsäuren erreicht wird. In diese Biomasse werden ein oder mehrere Wirkstoffe (fest oder flüssig) hinzugegeben (Schema 1). Der Wirkstoff wird in den Fettsäuren der lipidhaltigen Pilze suspendiert, dispergiert bzw. adsorbiert. Parallel dazu wird ein Tensid- Wasser-Gemisch hergestellt. Dieses Tensid- Wasser-Gemisch wird auf eine Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur der Fettsäuren erwärmt. Die beiden Phasen wer- den bei der gewählten Temperatur vereint. Anschließend wird mit Hilfe eines Rührers
(Rotor- Stator-Prinzip) oder mit Hilfe von Ultraschall eine Vorsuspension hergestellt. Die Vorsuspension wird danach mit Hilfe eines Hochdruckliomogenisators homogenisiert, wobei die Zahl der Homogenisationszyklen und der Arbeitsdruck nach der erwünschten Partikelgröße und Stabilität der Zubereitung gewählt werden. Zwischen den einzelnen Zyklen ist darauf zu achten, dass die Herstellungstemperatur immer wieder eingestellt wird. Das Tensid dient zur Stabilisierung der Suspension. [0023] Sollte es bei der Herstellung Probleme mit der Höhe der Temperatur (z. B. empfindliche Wirkstoffe) geben, so besteht die Möglichkeit, das gesamte Verfahren auch bei Raumtemperatur durclizufuhren. In diesem Falle wird das Verfahren in gleicher Weise, wie zuvor beschrieben, durchgeführt, wobei der Wirkstoff an den lipidhaltigen marinen Mikroorganismen adsorbiert oder bei Zusatz einer geringen Wassermenge dispergiert wird.
Schema 2: Herstellungsprozess von Biomassenpartikeln (Lösungsmittel-Homogenisations- Verfahren)
Pilzbiomasse Wirkstoff
Lösen oder Suspendieren
Gemisch aus Wirkstoff und Pilzbiomasse in Lösungsmittel
Vordispergierung
Hochdruckhomogenisator
Redispergierung der Pilzbiomassepartikel in wässriger Tensidlösung
Rühren oder Ultraschall
Nachdispergierungsverfahren
Hochdruckhomogenisator
&
Enddispergierungsverfahren
Wirkstoffbela Udene Biomassepartikel 2. Lösungsmittel-Homogenisations-Verfahren
[0024] Die lipidhaltigen Pilze und der Wirkstoff werden in einem verdampfbaren organischen Lösungsmittel suspendiert. Danach wird dieses Gemisch vordispergiert (Stator-Rotor- Prinzip oder Ultraschall), homogenisiert (Hochdruckhomogenisator) und anschließend sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet (Schema 2). Beim Gefriertrocknen ist zu beachten, dass geeignete Kryoprotektoren eingesetzt werden. Es besteht darüber hinaus auch die Möglichkeit, das organische Lösungsmittel durch geeignete Verdampfer (z. B. Rotationsverdampfer) zu entfernen. Anschließend können die Partikel aus Pilzen in geeigneten wässrigen Tensid-Lösungen redispergiert werden. Danach ist eine erneute Dispergierung (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall) und Homogenisierung (Hochdruckhomogenisator) notwendig.
3. Lösungsmittel-Emulsions- Verfahren
Schema 3: Herstellungsprozess nach dem Lösungsmittel-Emulsions- Verfahren
Pilzbiomasse + Wirkstoff Emulgator
Cotensid org. Lösungsmittel
JJ Losen
Lösung wässrige Tensidlösung
Rotor-Stator oder Ultraschall
Emulsion
Hochdruckhomogenisator
&
Emulsion
Lösungsmittel verdampfen Vakuumrotations-Verdampfer wirkstoffbeladene Pilzbiomassepartikel [0025] Dieses Verfahren basiert auf der Bereitung einer Emulsion aus Wasser und einer Lösung der Biomasse aus Pilzen -Wirkstoff in einem geeigneten organischen Lösungsmittel (Schema 3). Dazu wird ein Emulgator zur Dispergierung des Biomasse- Wirkstoffes eingesetzt. Emulgator und Biomasse werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst. Zu dieser Lösung wird eine wässrige Phase, die ein wasserlösliches Cotensid enthält, hinzugefügt. Danach wird dieses Gemisch vordispergiert (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall). Nach einem Homogenisationsschritt mit Hilfe eines Hochdruckhomogenisators wird das organische Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt, wobei die Wirkstoff enthaltende Biomasse in Form von festen Partikeln ausfällt.
[0026] Die Anwendung dieser Verfahren führt zu neuartigen Biomasse- Wirkstoff - Partikeln mit einem mittleren Durchmesser, der je nach Herstellungsart zwischen 10 nm und 10 μm liegt.
[0027] Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind auch ohne die Zugabe von einem zusätzlichen Wirkstoff wirksam, weil durch das erfindungsgemäße Verfahren die wertvollen Inhaltstoffe der Pilze besser verfügbar gemacht werden. Auf diese Weise ist es möglich, Inhaltsstoffe der Pilze wie Proteine, Mineralien und Vitaminen, mehrfach ungesättigte Fettsäuren, Produkte des Sekundärstoffwechsels sowie Aroma- und Geschmacksstoffe in besonders günstiger Form zu nutzen.
[0028] Die vorgestellten Prinzipien sind darüber hinaus geeignet, verschiedene gesundheitsfördernde Komponenten und/oder Mineralstoffe und/oder Radikalfänger und/oder Vitamine und/oder Nahrungsergänzungsstoffe in die Biomassen einzulagern. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ultrafeine feste Partikel im kolloidalen Größenbereich von etwa 15- 1000 nm hergestellt. Das biologisch aktive Material bzw. das Wirkstoffmolekül kann sich in der festen Matrix (Nano-pellet) oder Hülle (Nanokapsel) im gelösten oder hochdispersen Zustand eingeschlossen, umhüllt, an den Randzonen adsorbiert oder adhäriert befinden.
[0029] Zusätzlich können erfindungsgemäß ein oder mehrere pharmazeutische Wirkstoffe in die Mikro- und Nanopartikel inkorporiert werden.
[0030] Erfindungsgemäß können die Zusammensetzungen aus Biomassen lipidhaltiger Pilze in Kombination mit Thiocyanaten und/oder Hydrothiocyanaten organischer Basen auch ohne die Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel eingesetzt und als gesundheitsfördernde Mittel verwendet werden oder aber zur Herstellung gesundheitsfördernder Mittel dienen.
[0031] Die erfindungsgemäße Herstellung hat den Vorteil, dass die Freisetzung der inkorporierten Substanzen durch Wahl der Temperatur, der Wirkstoffe und der Tenside gesteuert werden kann. Erfindungsgemäß ist es vorteilhaft, die Teilchen in destilliertem Wasser oder in einem wässrigen Medium mit Zusätzen wie Elektrolyten, Polyonen, Mono-, Di- und Polysacchariden, Isotonisierungsmitteln, Puffersubstanzen, zu dispergieren. Um den erfindungsgemäßen Zweck zu erreichen, kann ein Zusatz von einem oder mehreren dispersionsstabüisierenden Substanzen notwendig sein. Eine vorteilhafte Ausführungsförm ist dadurch gekennzeichnet, dass der Biomasse ein oder mehre Wirkstoffe, Vitamine oder Nahrungsergänzungsstoffe in fester und/ oder flüssiger Form zugesetzt werden. Zweckmäßig ist es, die zugesetzten Wirkstoffe in den Fettsäuren der Biomasse zu suspendieren, zu dispergieren oder zu adsorbieren. Erfindungsgemäß wird die Biomasse in einem weiteren Herstellungsschritt mit einem Tensid- Wasser-Gemisch vereinigt. Zweckmäßig ist es, zunächst mit Hilfe eines Rührers (Rotor-Stator- Prinzip) oder mit Hilfe von Ultraschall eine Vorsuspension herzustellen. Erfindungsgemäß wird diese Vorsuspension danach mit Hilfe eines Hochdruckhomogenisators homogenisiert, wobei die Zahl der Homogenisationszyklen und der Arbeitsdruck nach der dem erfinderischen Zweck entsprechenden Partikelgröße und Stabilität der Zubereitung gewählt werden.
[0032] Bei einem anderen, ebenfalls erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden Biomasse und Wirkstoffe in einem verdampfbaren organischen Lösungsmittel suspendiert. Danach wird dieses Gemisch vordispergiert (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall) und homoge- nisiert (Hochdruckhomogenisator).Anschließend wird das Lösungsmittel durch Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung oder mittels Rotationsverdampfer entfernt. Falls erforderlich, kann die Biomasse in geeigneten wässrigen Tensid-Lösungen redispergiert und danach nach- dispergiert (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall) und anschließend homogenisiert (Hochdruckhomogenisator) werden. Falls erforderlich, kann ein Coemulgator bzw. ein Emul- gator zur Dispergierung der Biomasse- Wirkstoffes-Mischung eingesetzt werden.
[0033] Die nach den beschriebenen Verfahren hergestellten Mikro und Nanopartikel ermöglichen eine Verwendung auf den verschiedensten Gebieten. Überraschenderweise zeigte sich eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit der neuartigen Substanzen gegenüber den reinen Stof- fen. [0034] Die vorliegende Erfindung ermöglicht erstmals die Verwendung lipidhaltiger terrestrischer Pilze als Wirkstoffträger, z.B. für Antibiotika.
[0035] Die Erfindung erlaubt die Verwendung von Zusammensetzungen aus Biomassen lipidhaltiger Pilze in Kombination mit Thiocyanaten als gesundheitsfördernde Mittel sowie als Nahrungs-, Futtermittel, Nahrungsergänzungs- und Futterergänzungsmittel. Die Verwendung in diätischen Erzeugnissen ist ebenfalls möglich. Eine Kombination mit Arzneimitteln ist e- benfalls praktikabel. Eine Verwendung als nutritives Futtermittel ist gleichfalls möglich. [0036] Weitere erfindungsgemäße Verwendungen sind die Verbesserung der Aufzuchtergebnisse sowie zur Prophylaxe und Therapie von Infektionskrankheiten in der Tierhaltung und Tierzucht.
[0037] Die Verwendung der gesundheitsfördernden Mittel kann in Form von Ölen, Sprays und/Salben sowie in Kapseln erfolgen.
[0038] Zahlreiche lipidhaltige Pilze enthalten Substanzen, die als unspezifische Immunstimu- lantien wirken können, d. h. sie stimulieren Leukozyten und wirken als Aktivatoren des reti- koloendothelialen Systems. Nach der erfindungsgemäßen Umwandlung der Biomasse dieser Organismen in Mikro- oder Nanopartikel ermöglichen diese Inhaltstoffe weitere Anwendungen. Vorteilhaft ist beispielsweise ein Einsatz in Abdeckmaterialien zur Wundversorgung. Erfindungsgemäß mit Antibiotika dotierte Mikro- und Nanopartikel erlauben eine gesteuerte Freisetzung der antimikrobiellen Wirkstoffe und eine gleichzeitige Immunstimulation. Vorteilhafterweise können diese Mikro- und Nanopartikel zusätzlich mit anorganischen Thiocya- naten oder Hydrothiocyanaten organischer Basen dotiert werden.
[0039] Die Erfindung ermöglicht den Einsatz zur gezielten Substituierung von Mangelzuständen. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Produkte zur Immunstimulation sowie zur gezielten Substituierung des Thiocyanatmangels bei Dialyse- patienten.
[0040] Besonders vorteilhaft ist, dass die Partikel mittels Rührwerken (Rotor-Stator-Prinzip) und Hochdruckhomogenisation hergestellt werden können, die seit Jahrzehnten zur Herstellung von Fettemulsionen zur parenteralen Ernährung genutzt und daher für eine Produktion von Biomassepartikeln in industriellem Maßstab zur Verfügung stehen. Sie sind von den staatlichen Behörden zur Herstellung von Parenteralia akzeptiert und bedürfen daher keiner neuen aufwendigen Zulassungsverfahren.
[0041] Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird.
[0042] Das Wesen der Erfindung besteht aus einer Kombination aus bekannten (gesundheitsfördernde und heilende Wirkung bestimmter Pilze, gesundheitsfördernde Eigenschaften von Vitaminen und von Thiocyanaten) und neuen Elementen (Kultivierung in thiocyanathaltigen Nährlösungen, Umwandlung der Biomassen in Mikro- bzw. Nanopartikel mit Inkoφeration von Vitaminen und anderen Wirkstoffen insbesondere der Thiocyanate), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass Wirkstoffträger bereitgestellt werden konnten, die die inkoφorierten Wirkstoffe in besonderer Weise bioverfügbar machen.
[0043] Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Kultivierung verschiedener Pilze der Gattung Ganoderma mit und ohne Zusatz von Thiocyanat
[0044] Es wurde das Wachstum von G. pfeifferi, G. resinaceum, G. applanatum bzw. G. adspersum mit und ohne Thiocyanatzusatz vergleichend untersucht. Bei allen Pilzen wurden die gleichen Kulturbedingungen eingehalten. [0045] Alle Schritte der Kultivierung wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Vorkultur wurde auf festem und später in flüssigem Hagem-Medium ausgeführt. Dafür wurden aus einem Schrägagarröhrchen mittels steriler Impfose kleine Stücke auf den Hagem- Agar überführt und ausgestrichen. Nach einer Wachstumszeit von ca. 3 Wochen bei natürlichem Tag-Nacht-Rhythmus wurden wiederum Stücke aus diesem Agar herausgestanzt, in sterile 100-ml-Erlmeyerkolben überführt und mit 50 ml Flüssig-Hagem-Medium pH 5,4 inku- biert. Die Standkultur konnte nach 2-3 Wochen für die folgenden Versuche verwendet werden. Schüttelkultur und Fermenterkultur
[0046] Mit einem Homogenisator wurden die Kulturen von G. pfeifferi, G. resinaceum, G. applanatum bzw. G. adspersum möglichst fein homogenisiert und dann in einen sterilen 500- ml-Erlmeyerkolben überführt und mit Malzmedium pH 5,4 zu 300 ml aufgefüllt. Für einen Schüttelkulturansatz mit 10 Kolben wurden jeweils in sterile 500-ml-Kolben 10 ml Homogenisat mit Malzmedium zu 200 ml aufgefüllt. Die Kolben des Ansatzes wurden bei Raumtemperatur (20°C) bei natürlichen Lichtbedingungen kultiviert. [0047] An den Tagen 6, 8, 12, 14, 15, 17, 20, 22 und 30 wurden jeweils 3 bis 5 Kolben geern- tet. Nach der Bestimmung des pH- Wertes wurden Mycel und Medium durch Filtration voneinander getrennt. Das Mycel wurde in Kristallisierschalen überführt, lyophilisiert und anschließend das Trockengewicht bestimmt.
[0048] Um eine Fermenterkultur herzustellen, benötigte man die Mycelsuspension von 100 ml aufgefüllten Homogenisats, das in einen sterilen Fermenter eingebracht und mit Malzmedium auf 1000 ml aufgefüllt wurde. Dieser wurde ohne Luftzufuhr auf einer Magnetrührvorrichtung betrieben, so dass auch hierbei das Medium kontinuierlich durchmischt wurde. Die Kulturdauer betrug 6-18 Tage.
Kultivierung unter Zusatz von Thiocyanat
[0049] Dem Malzmedium wurde NaSCN in einer Konzentration von 1 x 10"3 mol/1 zugesetzt. Durchführung der Kultur und Aufarbeitung der Produkte wie bei der Kontrolle.
Ergebnis [0050] Eine Kultivierung in einem SCN'haltigem Medium ist möglich, das Wachstum wird positiv beeinfiusst. Eine SCN"- Anreicherung in der Biomasse kann auf diese Weise gewährleistet werden.
Beispiel 2 : Extrakte, erhältlich aus dem Mycel der Spezies Ganoderma pfeifferi nach An- zucht in Fermentern
[0051] Methodik: Frisch geerntete junge Fruchtköφern der Spezies G. pfeifferi wurden gereinigt und unter sterilen Bedingungen aufgebrochen. Aus dem Bereich des Übergangs vom Hut zum Stiel wurden mit einer sterilen Pinzette Gewebestücke entnommen und bei Zimmertem- peratur auf Hagem-Agar kultiviert. Nachdem der Pilz sichtbares Wachstum zeigte, wurden einige Mycelstücke ausgestanzt und mit einem Hagem-Flüssigmediu n im Bühler- Homogenisator (Edmund Bühler, Tübingen, G) zerkleinert. Anschließend erfolge die weitere Kultur in 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Hagem-Flüssigmedium nach H. Kreisel und F. Schauer (Methoden des ykologischen Laboratoriums, Fischer- Verlag Jena 1987). Jeweils 100 ml Kulturmedium wurden mit 10 ml der wie oben beschreiben hergestellten Impfsuspension versetzt. Die Kultivierung erfolgte bei Raumtemperatur und konstanten Lichtverhältnissen für 30 Tage, wobei eine kontinuierliche Durchmischung mittels einer Schüttelmaschine (Innova 2100, New Brunswick Scientific Co, INC. EDISON, New Jersey, USA) mit einer Geschwindigkeit von 125 U/min erreicht wurde. Die weitere Maßstabsvergrößerung erfolgte durch Überführung in einen Bioreaktor von 10 1 Volumen. Der Fermenter wurde mit 6 1 au- toklaviertem HAGEM-Medium (flüssig) versetzt. Dieses wurde mit 60 ml Impfsuspension versetzt. Die Kultivierung im Fermenter erfolgte bei Raumtemperatur unter ständiger Begasung mit steriler Luft, kontinuierlichem Rühren und im Tag-Nacht-Rhythmus. [0052] Zur Bestimmung des Myceltrockengewichtes wurde das Mycel durch Filtration vom Medium getrennt, in tarierte Kristallisierschalen überführt, analog Beispiel 2 lyophilisiert und das Trockengewicht auf einer Feinwaage (Sartorius, Göttingen, G) ermittelt. Die getrockneten Mycele wurden in Extraktionshülsen gefüllt und mit Dichlormethan (E. Merck, Darmstadt) in einer Soxhlet-Apparatur 24 h extrahiert. Der Mycelrückstand wurde nach Verdunsten von Dichlormethan-Resten 3mal je 2 h mit 80%igem Ethanol (E. Merck, Darmstadt) unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur extrahiert. Der Mycelrückstand wurde mit einem Büchnertrichter abgetrennt und an der Luft getrocknet. Anschließend wurde mit destilliertem Wasser 3mal je 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt, die Abtrennung des Pilzrückstandes erfolgte wiederum mittels Büchner-Trichter. Der Rückstand des kaltwässrigen Extraktes wurde 3mal mit destilliertem Wasser bei 70°C extrahiert und anschließend filtriert.
[0053] Alle Extrakte wurden im Vakuumrotationsverdampfer (Büchi Labortechnik AG, Fla- wil, Schweiz) bei 40°C eingeengt und anschließend lyophilisiert (Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, G). [0054] Ergebnis: Die Kultivierung von G. pfeifferi ist mit Flüssig-Medium möglich. [0055] Die Ausbeute beträgt durchschnittlich 5 g Mycel/1.
[0056] Eine Kultivierung im 10 1-Fermenter erlaubt die Gewinnung von Mycel in größeren Mengen.
Beispiel 3 [0057] Methodik: Durchführung der Versuche nach Beispiel 2, aber unter Zusatz von 0,1-1%
Kaliumthiocyanat.
[0058] Ergebnis: Steigerung der Ausbeute an Mycel von 0,34 + 0,0568 g /100 ml auf 0,691 +
0,048 g/100 ml durch Zusatz von 0,5% Kaliumthiocyanat.
Beispiel 4: Extrakte, erhalten durch eine Extraktion des Fruchtkörpers oder des Mycels mit einem liphophilen Lösungsmittel
[0059] Methodik: Lyophilisiertes Mycel wurde in Extraktionshülsen gefüllt und mit verschie- denen lipophilen Lösungsmittel in einer Soxhlet-Apparatur für 24 h extrahiert. Alle Extrakte wurden im Vakuumrotationsverdampfer (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Schweiz) bei 40°C eingeengt, lyophilisiert (Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, G) und anschließend das
Trockengewicht ermittelt.
[0060] Ergebnis: Dichlormethan ist am besten geeignet, um eine hohe Ausbeute biologisch aktiver Extrakte zu erhalten.
Beispiel 5 : Extrakte, erhalten durch eine Extraktion des Kulturmediums mit Ethylacetat
[0061] Methodik: Das Medium der Pilzkultur wurde im Vakuumrotationsverdampfer (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Schweiz) auf ca. 50 ml eingeengt und anschließend durch mehrfaches Schütteln mit Ethylacetat extrahiert. Der Vorgang wurde wiederholt, bis die Ethylacetat- phase keine Färbung aufwies.
[0062] Ergebnis: Es wurden Ausbeuten zwischen 0,1 und 0,5% erhalten. Die Extrakte, gewonnen aus Pilzkulturen ohne SCN-Zusatz zeigten im Agardiffusionstest eine Hemmwirkung gegen S. aureus mit Hemmhöfen bis 18 und 20 mm, solche aus Pilzkulturen mit SCN-Zusatz von 23 und 20 mm.
Tab. 1 Hemmwirkung gegen S. aureus
Beispiel 6 : Extraktion von Kulturmycel mit Wasser
[0063] Methodik: Kulturmycel nach Beispiel 2 und 3 wurden mit Wasser von 70°C, in einem weiteren Versuch zunächst mit Wasser von 20°C und anschließend mit Wasser von 70°C extrahiert.
[0064] Ergebnisse: Es werden Extrakte erhalten, die etwa 6% der Mycelgesamtmasse ausmachen. Eine Auftrennung der Extrakte wird erreicht, wenn die Extraktion stufenweise durchgeführt wird Tab. 2 Ausbeuten wässriger Extrakte und Anteil an der Gesamtmasse des. des Mycels
Beispiel 7 : Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus Mycel von Shii-take -Pilzen Es wurden Shii-take (Lentinula edodes eingesetzt
Tabelle 3: Rezeptur der - Shii-take— Mikro- und Nanopartikeln
[0065] Die Biomasse wird auf eine Temperatur von 50°C erwärmt. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung auf die entsprechende Temperatur (50°C) erwärmt. Danach werden beide Phasen bei der gewünschten Homogenisierungstemperatur vereint. Dann wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt- Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C vier mal homogenisiert.
Beispiel 8 : Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus Mycel Shii-take (Lentinula edodes -Vitamin C-Kombinationen
[0066] Es wurde das Mycel des Pilzes Shii-take (Lentinula edodes) eingesetzt.
Tabelle 4: Rezeptur der Shii-take (Lentinula edodes) - Mikro- und Nanopartikeln
[0067] Anschließend wurden in die Biomasse 5 g Vitamin C eingearbeitet. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung auf die entsprechende Temperatur (50°C) erwärmt. Danach werden beide Phasen bei der gewünschten Homogenisierungstemperatur vereint. Das Gemisch wird mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C vier mal homogenisiert. [0068] Die beiden Mikro- und Nanopartikeln B30 und Vitamin C wurden miteinander gemischt.
Beispiel 9 Herstellung von Mikro-und Nanopartikeln aus dem Fruchtköφer des Pilzes Judasohr (Auricularia auricula-judae [0069] Es wurden Fruchtköφer des Judasohr-Pilzes eingesetzt.
[0070] Die Biomasse wird bei einer Temperatur von 25°C in eine wässrige Emulgatorlösung dispergiert. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt - Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C vier mal homogenisiert.
Tabelle 5: Rezeptur des Judasohr (Auricularia auricula-judae) -Pilzes - Mikro-und Nanopartikeln
Beispiel 10 Herstellung von Mikro-und Nanopartikeln aus dem Fruchtköφer des Pilzes Ga- noderma lucidum - (Glänzender Lackporling
[0071] Es wurden Fruchtköφer der Ganoderma lucidum -Pilze eingesetzt.
Tabelle 6: Rezeptur der Ganoderma lucidum -Pilze - Partikel
[0072] Die Biomasse wird bei einer Temperatur von 25°C in eine wässrige Emulgatorlösung dispergiert. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C viermal homogenisiert.
Beispiel 11 : Herstellung von Mikro-und nanopartikeln aus Mvcel des Pilzes Maitake(Grifola frondosa)
[0073] Das Mycel des Pilzes Maitakev(Grifola frondosa) wurde zu Mikro-und nanopartikeln verarbeitet.
[0074] Die Biomasse wird bei einer Temperatur von 25°C in eine wässrige Emulgatorlösung dispergiert. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C viermal homogenisiert.
Tabelle 7: Rezeptur der Nostocales - Mikro- und Nanopartikeln
Beispiel 12 : Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus Fruchtkörpern des Mai- take(Grifola frondosa mit Vitamin C nach dem Lösungsmittelverfahren
[0075] Es wurden Fruchtköφer des Maitake(Grifola frondosa)-Pilzes eingesetzt.
Tabelle 8: (Lösungsmittelverfahren)
[0076] Zunächst wird die Biomasse in n-Hexan gelöst, wobei die Lipide aus der Biomasse gelöst werden. Die Biomasse wird ca. 3 Stunden in dem Lösungsmittel gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel mittels eines Rotationsverdampfer abgezogen. Dabei bildet sich eine Lipidschicht an der Kolbenoberfläche. Zur Redispergierung wird eine Vitamin C- haltige Lösung benötigt: Vitamin C wird in eine Plantacare-Lösung gebacht und nach einem 90 sekundigen Dispergiervorgang viermal homogenisiert. Die entstehende Vitamin C-haltige Lösung wird in den Kolben mit der Lipidschicht gebracht. Die Lipidschicht löst sich bei der anschließenden Rotation des Kolbens und bildet dadurch verkapselte Mikro- und Nanoparti- kein. Die Rotation dauert zirka 10 Stunden bei einer Temperatur von 40 ° C.
Beispiel 13 Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus Fruchtköφer des Pilzes Maitake - Norlichexanthon
Tabelle 9: Rezeptur der Biomasse- Norlichexanthon- Mikro- und Nanopartikeln
[0077] Die Biomasse wird auf eine Temperatur von 50°C erwärmt und anschließend der verwendete marine Wirkstoff Norlichexanthon darin dispergiert bzw. gelöst. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung auf die entsprechende Temperatur (50°C) erwärmt. Da- nach werden beide Phasen bei der gewünschten Homogenisierungstemperatur vereint. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C viermal homogenisiert.
Beispiel 14 : Herstellung Mikro- und Nanopartikeln aus Fruchtköφer des Pilzes Maitake - Vitamin E [0078] In die Biomasse wird das Vitamin E dispergiert. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung hergestellt. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgie- rungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C vier mal homogenisiert.
Tabelle 10: Rezeptur der Biomasse- Vitamin E- Mikro- und Nanopartikeln
Beispiel 15 Herstellung Mikro- und Nanopartikeln aus Fruchtköφer des Pilzes Mai- take(Grifola frondosa)- Provitamin Q10
Tabelle 11 Rezeptur der Biomasse-Pro vitamin Q10- Mikro- und Nanopartikeln
[0079] In die Biomasse wird das Provitamin Q10_dispergiert. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung hergestellt. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50°C viermal homogenisiert.
Beispiel 16 : Testung von Mikro- und Nanopartikeln aus Mycel von Shii-take-Pilzen /Vitamin C" hergestellt nach Beispiel 7 und 8 am Tiermodell (Kuheuterzitze)
[0080] Die beiden Substanzen wurden 1 : 1 miteinander gemischt.
Methodik:
[0081] 1 Stunde nach Tötung der Kuh wurden die Euterzitzen verarbeitet. Die Zitzen wurden von der Fettschicht befreit. Danach wurden die Zitzen auf Metallstäbe entsprechender Größe gesteckt und mit Schellen befestigt. Die Zitzen wurden mit 70%igem Alkohol abgerieben. 20 μl Testsubstanz wurde aufpipettiert und mit einem Glasspatel verrieben, und bei Raumtemperatur 30-45 Minuten getrocknet. Die Kontamination erfolgte mit 10 μl des Norddeutschen Stammes, MF 0,5 1:10 verdünnt. Nach Bebrütung bei 30°C für 1,5 Stunden wurden die Hautareale auf Müller-Hinton Platten ausgestrichen und bei 37°C inkubiert.
[0082] Bei den Kontrollen wurden ausschließlich Keimzahlen > 100 gefunden. Daraus wurden die mittlere Keimzahl n und die Streuung berechnet.
[0083] Bei der Untersuchung der Zubereitungen wurden Keimzahlen zwischen 0 und 100 gefunden. Daraus wurde die mittlere Keimzahl m auf der Basis der Poisson- Verteilung nach folgender Formel berechnet: m = In (Zahl der Proben ohne Keimnachweis/Gesamtzahl der Proben).
[0084] Statistische Auswertung: Die Anzahl der Hautareale mit und ohne Keimnachweis für die Kontrolle ohne Behandlung und nach Behandlung mit dem Testprodukt wurde mit Hilfe des Chi-Quadrat-Testes auf Signifikanz geprüft. Ergebnisse
[0085] Die Testung der Mikro- und Nanopartikeln, herstellt nach Beispiel 8 bewirkte am Hautmodell (Kuheuterzitze) eine ausgeprägte Reduktion der übertragen Kontamination mit MRSA. Die Zahl der Wiederholungen am Kuheuterzitze betrug für die unbehandelten Kon- trollen 163. Bei allen 163 Proben war S. aureus nachweisbar. Die mittlere Keimzahl ... Auch bei allen Proben, die mit Wollwachsalkoholsalbe behandelt waren, wurde S. aureus nachgewiesen. Nach Anwendung des Testproduktes waren 11 Hautareale mit Keimnachweis und 11 ohne Keimnachweis. Daraus errechnet sich eine im Mittel zu erwartende Keimzahl von 0,7 (Abb. 5). Die Keimzahlreduktion ist hoch sig—'fikant. Beispiel 17 : Testung von Mikro- und Nanopartikeln aus Mvcel von Shii-take-Pilzen /Vitamin C" hergestellt nach Beispiel 7 und 8 am Tiermodell Mäuseohr
Methodik
[0086] Als Testmodell wurden Mäuseohren verwendet. Die Donator-Tiere als Infektionsquelle blieben unbehandelt. Akzeptortiere wurde 3 Tage einmal täglich mit „Shii-take-Pilze /Vitamin C" hergestellt nach Beispiel 8 behandelt. [0087] Dazu wurden 10 μl Testsubstanz wurde aufpipettiert und mit einem Glasspatel verrie- ben, und bei Raumtemperatur getrocknet. Die Tiere wurden nach vier Tagen getötet. Die Kontamination der Donatortiere erfolgte mit 5 μl des Norddeutschen Stammes, MF 0,5 1:10 verdünnt. Dazu wurde ein unbehandeltes Ohr kontaminiert und danach 90 Minuten bei 30 °C bebrütet. Die mit Biomasse behandelten Ohren wurden auf entsprechende Stempel aufgezogen. Mit Druck wurden die kontaminierten Ohren auf die auf die unbehandelten Ohren 10 Sekunden gepresst.
[0088] Nach Bebrütung bei 30°C für 1,5 Stunden wurden die Hautareale der Akzeptor-Ohren auf Müller- Hinton Platten ausgestrichen und bei 37°C inkubiert.
[0089] Auswertung: Die Auswertung und statistische Sicherung erfolgte wie im Beispiel 9 beschrieben.
Ergebnisse:
[0090] Die Testung der Mikro- und Nanopartikeln, hergestellt nach Beispiel 7 und 8, zeigte auch im Donator-Akzeptor- Versuch, mit dem die Infektionsübertragung mittels Hautkontakt simuliert wurde , eine signifikante Reduktion der übertragenen Keime. [0091] Die Zahl der Wiederholungen am Mäuseohr betrug für die unbehandelten Kontrollen 163, dabei wurde auf Hautarealen Keimwachstum nachgewiesen. Bei Vorbehandlung mit der Zubereitung nach Beispiel 7 und 8 wurden 12 Hautareale mit und 5 ohne Keimnachweis. Daraus ergibt sich, dass nach einer entsprechenden Vorbehandlung im Mittel nur noch 1,2 Keime/cm2 zu erwarten sind (Abb. 6).
Beispiel 18 ; Testung von Mikro- und Nanopartikeln „Mycel von Shii-take-Pilzen /Vitamin C" hergestellt nach Beispiel 7 und 8 am Hängebauchschwein [0092] Methodik: Für die Testung stand ein Hängebauchschwein zur Verfügung. 2 Stunden nach Tötung des Tieres wurde von den Bauchunterseiten, in Nähe der Zitzen Haut herausgeschnitten, die Fettschicht weitestgehend entfernt und in Stücke geschnitten. Diese wurde auf Vorrichtungen gespannt, so dass ca. 1cm2 zur Bearbeitung zur Verfügung stand. Diese Haut- flächen wurden rasiert bzw. die Borsten mit der Schere abgeschnitten und anschließend 2 x mit 70% Ethanol abgerieben. 20 μl Testsubstanz wurden aufgebracht und 45 min inkubiert. Die Kontamination erfolgte mit 10 μl des Norddeutschen Stammes, MF 0,5 1:10 verdünnt. Nach Bebrütung bei 30°C für 1,5 Stunden wurden die Hautareale auf Müller Hinton Platten ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Nach der Bebrütung erfolgte die Auszählung der Kei- me.
Ergebnis
[0093] Trotz der vorgenommenen Hautdesinfektion waren auf dem Abstrich zahlreiche koa- gulasenegative apathogene Staphylokokken der normalen Hautflora des Schweins nachweis- bar. Die koagulase positiven aureus-Stämme, mit denen die Kontamination vorgenommen worden war, waren bei der unbehandelten Kontrolle zahlreich neben S. epidermidis nachweisbar, bei der erfindungsgemäß behandelten Tieren waren alle untersuchten Kolonien koagulase negativ.
Beispiel 19 : Testung von Mikro- und Nanopartikeln aus Mvcel von Shii-take-Pilz /Vitamin C hergestellt nach Beispiel 8 am Hautmodell nach Beispiel 17
Ergebnis
[0094] Die Zahl der Wiederholungen an der Kuheuterzitze betrug für die unbehandelten Kontrollen 158. Die Zahl der Hautareale mit Keimnachweis betrug nach Anwendung der Mikro- und Nanopartikel 2 und ohne Keimnachweis 4. Das bedeutet, dass nach Behandlung mit der erfindungsgemäßen Zubereitung nach Beispiel 8 im Mittel nur noch 0,4 Keime/cm2 zu erwarten sind. Die Keimzahlreduktion ist im Chi-Quadrat-Test hoch signifikant.
Beispiel 20 : Testung von Mikro- und Nanopartikeln aus dem Fruchtköφer von Maitake (Gri- fola frondosa)/ Vitamin C" hergestellt nach Beispiel 12 am Hautmodell nach Beispiel 17
Ergebnisse: [0095] Die Testung der Mikro- und Nanopartikeln, hergestellt nach Beispiel 12, zeigte im Donator-Akzeptor- Versuch, mit dem die Infektionsübertragung mittels Hautkontakt simuliert wurde , eine signifikante Reduktion der übertragenen Keime. Die Zahl der Hautareale mit Keimnachweis betrug 1 und ohne Keimnachweis 5. Daraus ergibt sich, dass nach der erfindungsgemäßen Vorbehandlung im Mittel nur noch 0,18 Keime beobachtet werden. Die Reduktion der übertragenen Keime ist im Chi-Quadrat-Test hoch signifikant.
Beispiel 21 :Prüfung von Mikro- und Nanopartikeln, hergestellt nach den Beispielen am Hautmodell nach Beispiel 9
Ergebnisse
[0096] Die Mikro- und Nanopartikeln Norlichexathon- Vitamin E-Q10 (Lösungsmittelverfahren) wurden nach Beispiel 13,14,15 hergestellt und im Verhältnis 1 : 1 : 1 gemischt. Die Testung erfolgte nach dem in Beispiel 16 dargestellten Verfahren.
Ergebnis
[0097] Die Anzahl der getesteten Zubereitungen mit der Norlichexanthon betrug 22. Die Zahl der Hautareale mit Keimnachweis betrug 19 und ohne Keimnachweis 3. Im Mittel sind nach Vorbehandlung mit erfindungsgemäßen Zubereitungen nach Beispiel 14 noch 2 Keime zu erwarten.
Beispiel 22 : Herstellung von Ubichinon Ql -Biomasse - Partikeln
[0098] Die Biomasse (Maitake) wird auf eine Temperatur von 50 °C erwärmt und anschlie- ßend Ubichinon Ql darin dispergiert bzw. gelöst. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung auf die entsprechende Temperatur (50 °C) erwärmt. Danach werden beide Phasen bei der gewünschten Homogenisierungstemperatur vereint. Anschließend wird das Gemisch mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet.
[0099] Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 50 °C vier mal homogenisiert. Tab. 12 Rezeptur der Ubichinon - Biomasse - Partikeln
Beispiel 23 : Verhinderung der Übertragung von MRSA bei Hautkontakten mit der Zuberei- tung nach Beispiel 22
Methodik
[0100] Für die Versuche wurden Schwänze von Mäusen aus keimfreier Haltung verwendet. Um jede Fremdkontamination auszuschließen, wurde sie vor Versuchsbeginn für 5 min in 70 %igen Alkohol eingelegt und danach unter der Laminarbox getrocknet.
[0101] Die Donatormäuseschwänze als Infektionsquelle wurden durch Einlegen (30 s bis 4 min) in eine verdünnte MRSA.Kultur (Norddeutscher Stamm, MF-Standard 0,5 bzw. 0,3) kontaminiert und danach 24 h bei 37 °C bebrütet. Bei Abstrichen von diesen Donatoren wurden Keimzahlen > 100.000 nachgewiesen.
[0102] In die Mäuseschwänze, die den emfänglichen Organismus simulieren (Akzeptoren) wurden die Versuchssubstanzen zweimal täglich einmassiert.
[0103] Die Infektionsübertragung vom Donator zum Akzeptor erfolgte durch Hautkontakt mit den Donatoren für 30 s bis 1 min auf der Schüttelmaschine bei 600 U/min. 2 h bzw. 24 h nach der Kontamination wurden die Donatoren auf Blut-Müller-Hinton- Agaφlatten ausgesti- chen. Nach 24 h Bebrütung der Agaφlatten bei 37 °C wurden die Kolonien ausgezählt.
Ergebnisse:
[0104] Beim Ausstreichen der Akzeptoren unmittelbar nach dem Hautkontakt sind die Platten vollständig bewachsen (Keimzahl > 10 000). Das gilt gleicherweise für vorbehandelte wie für Kontrollen ohne Vorbehandlung. Das bedeutet, das eine massive Übertragung der MRSA in diesem Modell gut simuliert werden kann. Bei Versuchs- und Kontrollgruppe wird die gleiche Keimzahl übertragen.
[0105] 2 h bzw.24 h sind dagegen nur noch geringen Keimzahlen bei den vorbehandelten Aktzeptoren nachzuweisen, während die Keimzahlen bei den unbehandelten Kontrollen unverändert hoch sind. (Tab. 1). Auch mit diesem Versuchsmodell kann also die Unterbrechung der Infektionswege durch eine Vorbehandlung mit den erfindungsgemäßen Formulierungen nachgewiesen werden.
Tab. 13 Keimzahlen auf Mäuseschwänzen (Akzeptoren) in Abhängigkeit von der Vorbehandlung nach Kontakt mit mit MRSA kolonisierten Mäuseschwänzen (Donatoren).
[0106] Diese Tests wurden mit weiteren Vitaminen und antioxdativen Wirkstoffen durchgeführt. Sowohl am Mäuseohrtiermodell als auch am Kuheuterzitzenmodell konnten Reduk- tionen im Fall der Kombination Norlichexanthon und Pro vitamin Q10 beobachtet werden. Die stärkste Keimminderung von Anflugkeimen gelang jedoch bei der Kombination Vitamin E, Norlichexanthon und Pro vitamin Q10. Beispiel 24 Teilchengrößenbestimmung der Mikro-und nanopartikeln, hergestellt nach Beispiel 8
Methodik [0107] Die Teilchengröße durch Photonenkorrelationsspektroskopie wurde mit Hilfe eines Zetasizer III (Malvern, UK) bestimmt.
Beispiel 25 :Nachweis der Radikalfängereigenschaft der Extrakte mittels Chemilumineszenz
[0108] Der Nachweis wurde wie folgt geführt:
[0109] A: 30 ml humanes Blut wurden mit 170 ml PBS + Luminol (0,33 mM final) 20 min bei 37°C vorinkubiert.
[0110] B: 30 μl humanes Blut wurden mit 170 ml PBS + Luminol (0,33 mM final) und 20 ml Substanzverdünnung 20 min bei 37°C vorinkubiert. [Olli] Zu A wurden je 20 μl eine 1:100 Verdünnung des Extraktes nach Beispiel B und C und 20 μl Zymosan (10 mg/ml) pipettiert. [0112] Zu B wurden 20 μl Zymosan (10 mg/ml) pipettiert.
[0113] Als Kontrolle verwendeten wir PBS statt Zymosan als Stimulator mit und ohne Substanz in den Ansätzen A und B. Nach intensivem Mischen wurde die Kinetik der Lumines- zenz über 60 min gemessen. Die Untersuchungen erfolgten an zwei unterschiedlichen Tagen mit Blut von zwei verschiedenen Blutspendern.
[0114] Ergebnis: Die Extrakte hemmen eindeutig die durch Luminol induzierte und die spontane Sauerstoffradikalfreisetzung oder fangen die freigesetzten Radikale ab. Durch den Thiocyanatzusatz wird dieser Effekt verstärkt.
Beispiel 26 : Testung der Radikalfangereigenschaften von Pilzen mit Hilfe des α. α-Diphenyl- ß-picrylhydrazyl radical scavening effect (DPPH-Assay)
[0115] Zur Testung der Radikalfangereigenschaften der Pilz/Vitamin-Kombinationen wurde der DPPH-Assay verwendet. Prinzip [0116] Das DPPH-Radikal (2,2Diphenyl-l-picrylhydrazyl) hat sein Absoφtionsmaximum bei 517 nm und eine violette Färbung, die auf das ungepaarte Elektron am Stickstoffatom zurückzuführen ist. Die Farbe ändert sich von violett zu gelb, wenn das Radikal eine Bindung mit einem Wasserstoffatom eines Radikalfängers eingeht und das reduzierte DPPH-H(2,2- Diphenyl-ß-picrylhydrazyl) entsteht. Dabei verringert sich auch die Absoφtion was mit einem Photometer messbar ist.
Methode
[0117] Die Vergleichssubstanz wird in Ethanol gelöst und folgende Verdünnungen hergestellt: 10 μg/ml, 50 μg/ml, lOOμg/ml, 500 μg/ml.
[0118] ImM DPPH in Ethanol gelöst entspricht 294 μg/ml. 4 mg der Pilz/Vitamin- Kombinationen werden in 4 ml Ethanol gelöst und folgende Verdünnung wird hergestellt: 10 μg/ml, 50 μg/ml, lOOμg/ml, 500 μg/ml. Versuchsablauf:
[0119] 500μl der Probe werden in ein Eppendorfgefaß pipettiert. Dazu wird 375μl Ethanol und 125 μl DPPH-Lösung gegeben. Die Lösung wird geschüttelt und 30 min bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Absoφtion bei 517 nm im Photometer gemessen. Die gemessenen Absoφtionen werden dann in % Radikalfängeraktivität im Vergleich zum Leerwert (875 μg/ml Ethanol + 125 μg/ml DPPH ausgedrückt.
100
Menge in %= 100 - [4 sample control
Tab. 14 Ergebnis Auricularia auricula-judae - Judasohr-Mycel / Ascorbinsäure
Tab. 15 Ergebnis Ganoderma lucidum - Glänzender Lackporling-Mycel/ Ascorbinsäure
Tab. 16 Ergebnis Grifola frondosa - Maitake-Mycel/ Ascorbinsäure
Tab. 17 Ergebnis Hericium erinaceus - Igelstachelbart-Mycel/ Ascorbinsäure
Tab. 18 Ergebnis Lentinula edodes - Shii-take-Mycel/ Ascorbinsäure
Beispiel 27 : Hemmung der neutralen Endopeptidase
[0120] Methodik: Der Nachweis der spezifischen Hemmung der neutralen Endopeptidase erfolgte nach Melzig et. al., Pharmazie 51 (1996) 501-503.
[0121] Ergebnis: Durch den Extrakt des Mycels nach Beispiel B mit 80%igem Alkohol wird bei einer Konzentration von 100 μg/ml eine Hemmung um 68%, bei 200 μg/ml um 84% erreicht. [0122] Bei dem entsprechenden ethanolischen Extrakt des Kulturmycels mit SCN-Zusatz nach Beispiel C wurde die Aktivität des Enzyms schon bei einer Konzentration von 50 μg/ml um 70% gehemmt.
[0123] Die wässrigen Extrakte aus dem Mycel sind ebenfalls wirksam. Nach Inkubation mit 50 μg/ml des kaltwässrigen Extraktes wurde eine Hemmung der Enzymaktivität um 65% gefunden. Ein Einfluss des SCN" war nicht zu erkennen.
Beispiel 28 : Verwendung der Extrakte zur Hemmung der Aktivität von Proteasen
[0124] Proteasen sind an zahlreichen posttranslationalen Prozessen der Funktionsregulation des Makroorganismus beteiligt. Bei einer Hemmung der Proteasen sind vielfältige pharmako- logische Wirkungen zu erwarten. Der Nachweis einer Enzyminhibition durch wässrige und ethanoloische Extrakte gemäß Beispiel 2 und 3 erfolgte am Beispiel des Angiotensin- Konverting-Enzyms nach Melzig et al., Pharmazie 51 (1996), 501-503. [0125] Ergebnis: Die wässrigen und alkoholischen Extrakte weisen in Konzentrationen von 100-200 μg/ml eine Hemmung des Angiotensin-Konverting Enzyms auf.
Beispiel 29 : Anwendung als vor freien Radikalen schützender vitalisierender und keimmindernder Zusatzstoff für pharmazeutische Zubereitungen
[0126] Der Zusatz der Extrakte verhindert oxidative Zersetzungen, wirkt auf Grund seiner antibakteriellen Eigenschaften konservierend und bewirkt aufgrund seiner Radikalfangereigenschaften einen Schutz vor hautschädigenden Radikalbildnern.
[0127] Darüber hinaus wirken die Ganoderma-Extrakte entzündungshemmend. Die Kombina- tion dieser Eigenschaften bietet gute Voraussetzungen für eine Anwendung als Zusatzstoff für pharmazeutische Zubereitungen.
Beispiel 30 : Verwendung von alkoholischen und wässrigen Extrakten aus dem Mvcel von G. pfeifferi als vitalisierende. schmerzlindernde und keimmindernde Nahrungsergänzungsmittel
[0128] Methodik: Der Schutz der Zellen vor toxischen Radikalen, nachgewiesen nach Beispiel E, kann auch als ernährungsphysiologisch bedeutsam bei dem Einsatz von Nanopartikel gewonnen aus Pilzen der Gattungen Auricularia , Ganoderma, Grifola, Hericium und Lentinu- la und supplementiert mit Kofaktoren antioxidativer Systeme wie Thiocyanat und Vitamin C und E und Spurenelemente als Nahrungsergänzungsmittel bedeutsam sein. [0129] Dieser für Nanopatikel gewonnen aus der Biomasse von Pilzen spezifische Effekt wird sowie durch die mit der durch viele Beispiele belegten Immunstimulation durch Thiocyanate sehr vorteilhaft ergänzt. Insbesondere bei Pilzen der Gattung ist ebenfalls eine Immunstimulation gut belegt. Es kommt also zu einem synergistischen Effekt. Andererseits kann die spezifisch inhibierende Wirkung der Extrakte aus G. pfeifferi auf die neutrale Endopeptidase zur Schmerzlinderung genutzt werden, da nach sie im Sinne einer Hemmung der Enkephalinase mit dem Abbau von Neuropeptiden und Endoφhinen, die an den Opiat-Rezeptoren angreifen, interferieren.
[0130] Ergebnis: Die Kombination von Radikalfangereigenschaften, immunstimulierender Wirkung, schmerzlindernder Wirkung und gegen mikrobiellen Verderb konservierenden Eigenschaften schafft sehr günstige Voraussetzungen für eine Anwendung als Nahrungsergän- zungsstoff.
Beispiel 31 : Verwendung als Gesundheitspflegemittel und Nahrungsergänzungsstoff
[0131] Methodik: Wässrige und alkoholische Extrakte sowie aus der Biomasse gewonnene Nanopartikel aus Pilzen der Gattung Ganoderma hemmen die Cholesterolakkumulation in kultivierten humanen Aortenintimazellen. Durch Hemmung der neutralen Endopeptidase und des Angiotensin-Konverting-Enzyms nachgewiesen im Beispiel G wird in kaskadenartig organisierte Funktionen des Säureorganismus eingegriffen. Thiocyanate führen zu einer höheren Polarisierung der Zellmembranen. Durch die nachgewiesene Hemmung der neutralen Endopeptidase Hemmung wird nach Melzig et al., Pharmazie 51 (1996), 501-503 eine Steigerung der renalen Natriumausscheidung und damit eine Blutdrucksenkung bewirkt. Die im Beispiel F nachgewiesene Hemmung des Angiotensin-Konverting-Enzyms führt nach Gräfe (Biochemie der Antibiotika, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin New York, 1992) ebenfalls zu einer Blutdrucksenkung. Thiocyanat ist früher in großem Umfang zur Blutdrucksenkung eingesetzt worden. [0132] Ergebnis: Da bei vielen Patienten mit metabolischem Syndrom ein erhöhter Choleste- rinspiegel mit einem erhöhten Blutdruck kombiniert ist, werden die bekannten Wirkungen von Pilzen der Gattung Ganoderma bei G. pfeifferi sehr vorteilhaft durch die blutdrucksenkende Wirkung ergänzt. [0133] Durch ethanolische Extrakte Mycel nach Beispiel 2 und 3 in Konzentrationen zwischen 0,1 und 0,2% wurde eine Hemmung der serumvermittelten Lipopylysacharid-Bindung um 40-60% erreicht.
[0134] Lipopolysacharide werden bei einer Infektion mit gramnegativen Bakterien aus deren Zellwand freigesetzt. Nach Bindung an das Lipopolysacharid-bindende Protein können sie Makrophagen sowie mononukleäre Zellen zur Freisetzung endogene Mediatoren anregen und so zu Fieber, Veränderungen im weißen Blutbild sowie zur abnormen Weitstellung der Gefäße in der Köφeφeripherie führen.
Legende zu den Figuren
Figur 1 : Wachstumskurven der Biomasse Ganoderma Pfeifferi im SCN-haltigen Medium
Figur 2: Wachstumskurven der Biomasse Ganoderma resinaceum im SCN-haltigen Medi- um
Figur 3 Wachstumskurven der Biomasse Ganoderma applanatum im SCN-haltigen Medium
Figur 4: Wachstumskurven der Biomasse Ganoderma adspesum im SCN-haltigen Medium
Figur 5 : Wirkung von Mikro- und Nanopartikeln aus Shii-take-Pilzen (hergestellt nach Bei- spiel 7 und 8) im Vergleich zur synergistischen Kombination von Shii-take-Pilzen mit Vitamin C
Figur 6: Nachweis der Unterbrechung von Infektketten, simuliert im Donator- Akzeptor- Modell, durch die erfindungsgemäße Zubereitung nach Beispiel 7 und 8
Figur 7: Wirkung von Mikro- und Nanopartikeln aus Shii-take hergestellt nach Beispiel 8 Figur 8: Nachweis der Unterbrechung von Infektketten, simuliert im Donator- Akzeptor- Modell, durch die erfindungsgemäße Zubereitung nach Beispiel 12
Figur 9: Teilchengrößenverteilung Mikro- und Nanopartikeln hergestellt nach Beispiel 8

Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzungen, bestehend aus Biomassen terrestrischer Pilze einerseits und anorganischen Thiocyanaten oder Thiocyanaten organischer Basen andererseits.
2. Zusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein oder mehrere Wirkstoffe enthalten.
3. Zusammensetzungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein oder mehrere Mineralstoffe und/oder Radikalfänger und/oder Nahrungsergänzungsstoffe und/oder Vitamine, insbesondere Vitamin C, enthalten.
4. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich eine oder mehrere dispersionsstabilisierende Substanzen enthalten.
5. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als lipidhaltige terrestrische Pilze
a) Auricularia auricula-judae - Judasohr b) Ganoderma lucidum - Glänzender Lackporling c) Grifola frondosa - Maitake d) Hericium erinaceus - Igelstachelbart e) Lentinula edodes - Shii-take eingesetzt werden.
6. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomassen der in Pilze in Mikro- und Nanopartikel umgewandelt werden.
7. Zusammensetzungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikro- und Nanopartikel einen mittleren Durchmesser von 10 nm - 10 μm besitzen.
8. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Kultivierung der Pilze in Gegenwart von anorganischen Thiocyanaten oder Thiocyanaten organischer Basen erfolgt oder b) der Biomasse des Mycels und/oder des Fruchtköφers der Pilze anorganische Thiocy- anate oder Thiocyanate organischer Basen zugesetzt werden.
9. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Kultivierung der Pilze in Gegenwart von anorganischen Thiocyanaten oder Thiocyanaten organischer Basen und eine Anreicherung mit Wirkstoffen durch Zusätze zum Kulturmedium während der Kultivierung erfolgt oder b) der Biomasse des Mycels und/oder des Fruchtköφers der Pilze anorganische Thiocyanate oder Thiocyanate organischer Basen und zusätzlich ein oder mehrere Wirkstoffe zugesetzt werden.
10. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomassen oder die kultivierten Biomassen durch Homogenisierung oder Emulsionsbildung in Mikro- und Nanopartikel mit einem Durchmesser von 10 nm - 10 μm umgewandelt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
Erwärmen der Biomassen Pilze bis zur Verflüssigung der darin enthaltenen Lipide ggf. Zusetzen eines oder mehrerer Wirkstoffe oder Zusätze
Versetzen der Biomasse oder der beladenen Biomasse mit einem auf oberhalb der Schmelztemperatur der Fettsäuren erwärmten Tensid- Wasser-Gemisch und Vereinigung der beiden Phasen Herstellen einer Vorsuspension Hochdruckhomogenisierung in einem oder mehreren Homogenisationszyklen
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Erwärmens der Mikroorganismen und des Tensid- Wasser-Gemischs entfällt und die Wirkstoffe bei Raumtemperatur an den lipidhaltigen Pilze adsorbiert oder bei Zusatz einer geringen Wassermenge dispergiert werden.
13. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
Suspendieren der Biomasse der Pilze und ggf. der Zusätze in einem organischen Lösungsmittel und Vordispergieren dieses Gemischs Hochdruckhomogenisierung und anschließende Sprüh- oder Gefriertrocknung
Redispergierung in einer wässrigen Tensidlösung erneute Dispergierung und Hochdruckhomogenisierung in einem oder mehreren
Homogenisationszyklen
14. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
Emulsionsbildung aus Wasser und Biomasse sowie ggf. mit den Zusätzen Lösen der Emulsion in einem geeigneten organischen Lösungsmittel Hinzufügen eines wasserlöslichen Co-Tensids und Vordispergierung Hochdruckhomogenisierung und Entfernung des Lösungsmittels.
15. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 als Wirkstoffträger.
16. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 als gesundheitsfördernde Mittel.
17. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung gesundheitsfördernder Mittel.
18. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 für therapeutische und prophylaktische Anwendungen bei Mensch und/oder Tier.
19. Verwendung der Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 als
a) Nahrungsmittel b) Futtermittel c) Nahrungsergänzungsmittel d) Futterergänzungsmittel
20. Verwendung nach Anspruch 19 als nutritive Futtermittel.
21. Verwendung nach Anspruch 18 und 19 zur Verbesserung der Aufzuchtergebnisse sowie zur Prophylaxe und Therapie von Infektionskrankheiten in der Tierhaltung und Tierzucht
22. Verwendung nach Anspruch 21 in Kombination mit anderen Arzneimitteln.
23. Verwendung nach Anspruch 15 als Antibiotikaträger.
24. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 in Form von Ölen, Sprays und/Salben sowie in Kapseln.
25. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zur gezielten Substituierung von Mangelzuständen.
26. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zur Immunstimulation.
27. Verwendung von Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zur gezielten Sub- stituierung des Thiocyanatmangels bei Dialysepatienten.
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